OPTICKÉ BIOSENZORY.pdf - FBMI

fbmi.cvut.cz

OPTICKÉ BIOSENZORY.pdf - FBMI

BIOSENZORY

Zpracováno s využitím : Pradas, Biofototonika, Willey,

U.E.Spichinger- Keller, Chemical Sensors and Biosensors…., Willey

L. Cudzik, Diplomová práce FJFI ČVUT, 2006

F.S.Liegler, Optical Biosensors, Elsevier,

KPO www – inteferometrické biosenzory

Biosenzory jsou analytická zařízení, která mohou detekovat chemické nebo

biologické látky či mikroorganizmy. Používají k detekci vybrané typy molekul nebo

organizmů.

Biosenzor se skládá v zásadě ze dvou částí:

bioreceptoru a

převodníku.

Bioreceptory jsou molekuly, které rozpoznávají analytický cíl (tj. látku, která má být

analyzována), ale jejich informaci nám zprostředkuje až

převodník, který analytický cíl převede na měřitelný signál.

A pak je tu ještě třetí prvek, který zdánlivě nevstupuje do hry - nosič bioreceptoru.

V odborném jazyce se mu říká substrát (analyt).


OPTICKÉ BIOSENZORY

Rozpoznání molekul je převedeno na optickou změnu (absorpce,

luminiscence, index lomu)

Optické biosenzory :

biosenzory s vláknovou optikou, planární vlnovodné biosenzory,

biosenzory s evanescenční vlnou, interferometrické biosenzory,

biosenzory na povrchové plazmonové rezonanci,……..

OWLS- optical waveguide lightmode spectroscopy (mřížkové, rez.

zrcadlo)

SERS- surface enhanced Raman spectroscopy

SPR - surface plasmon resonance

EWF –evanescent wave fluorescence (TIRF), etc.


OPTICKÉ BIOSENZORY

Metody navázání světla do vlnovodu: a) přímé navázání – endfiring; b)

navazování optickým hranolem; c) navazování optickou mřížkou


OPTICKÉ BIOSENZORY

1. INTERFEROMETRICKÉ (v.t. www stránky KPO)

2. MŘÍŽKOVÉ

3. REZONANČNÍ ZRCADLO

4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU

5. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence = fluorescence

daná úplným vnitřním odrazem)


1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY

Interferometrie je optická metoda, která sleduje rozdíly mezi dvěma

optickými svazky, jež uběhly podobné dráhy. Pozorování

biokonjugované reakce, která se odehrává v dráze jednoho ze svazků,

tvoří základ biosensoru.

Nejoblíbenější platformou interferometrických senzorů jsou planární

vlnovody.

Ty jsou preferovány z důvodu delší interakční dráhy.

Evanescentní pole planárního vlnovodu je citlivé na změny indexu

lomu materiálu, který je nad vlnovodem.

Toto pole je schopné proniknout až do vzdálenosti 500 nm nad povrch

vlnovodu.

Pokud nad povrch umístíme chemicky aktivní vrstvu, chemická reakce

se odehraje v tomto poli.

Chemické i fyzikální interakce mění index lomu a tím ovlivňují rychlost

šíření a fázi optického svazku (větší index lomu pak sníží rychlost šíření

a naopak).


1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY


1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY

Abychom mohli měřit tuto změnu (indexu lomu), je potřeba umístit

do blízkosti citlivého vlnovodu (citlivého na danou reakci), vlnovod

referenční.

Svazky z těchto dvou kanálů jsou pak opticky zkombinovány a

vytvoří charakteristické interferenční proužky.

Chemická, nebo fyzikální změna v senzorické části interferometru

vede k posuvu interferenčních proužků.


1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY

Při šíření světla optickým vlnovodem dochází k periodicky se opakujícím totálním

odrazům vlny na rozhraní vlnovodné vrstvy a vrstev okolních. Změna fáze způsobená

tímto odrazem je závislá na indexech lomu obou těchto vrstev.

Pokud se tedy nad vlnovodnou vrstvou změní (třeba v důsledku chemické, či

biologické reakce) index lomu, dojde k fázovému posunu.

Tuto změnu samu o sobě nerozeznáme, potřebujeme k tomu nějaký druh reference.

Často se využívají směrové odbočnice, které rozdělí výkon do dvou kanálů. Jeden

slouží jako referenční a druhý jako citlivý kanál. Reakce probíhá pouze nad citlivým

kanálem, referenční naopak musí být od ní co nejlépe izolován.

Oba kanály jsou poté opět spojeny a lze pozorovat změny interferenčních proužků.

Toto uspořádaní (Mach-Zenderovo) je citlivější, než ostatní druhy biosenzorů (až

10x), ale je obtížněji vyrobitelné, dražší a je problém rozlišit vliv detekované události

od ostatních vlivů (teploty,lokálních variací indexu lomu apod).

Pro kompenzaci těchto efektů se interferometrické senzory provozují na více

vlnových délkách, nicméně celá konstrukce se tímto komplikuje.


1. INTERFEROMETRICKÉ SENZORY

Schéma dvou typů kanálkového Mach-

Zenderova interferometru

Schéma Youngova interferometru


2. MŘÍŽKOVÝ SENZOR (1. varianta)


2. MŘÍŽKOVÝ SENZOR

Tyto senzory si získaly asi největší popularitu, protože je u nich největší

naděje na širší praktické aplikace. Nevýhodou je nutnost zařazení mřížky

do vlnovodu, pozitivem je zase snadná integrovatelnost a možnost využití

méně náročných depozičních metod (např. Sol-gel).

Teoretický základ byl rozpracován v pracech Lukosze a Tiefenthalera

publikovaných v 80. tých let minulého století.

V dielektrickém vlnovodu je vytvořena mřížka, jež slouží k zavedení

světla do vlnovodu. Ta má řádově 2000 čar/mm.

Na povrchu vlnovodu je imobilizována látka biokonjugovaná k

detekované. Aktivní zóna je omezena na oblast navázání světla

(incoupling area).

Má rozměry zhruba 0.5 mm 2 - 10 mm 2 . Světlo se zavádí do vlnovodu ze

strany substrátu.


2. MŘÍŽKOVÝ SENZOR

Detektor je umístěn na konci vlnovodu. Laser je namířen na mřížku a

celý čip se v průběhu měření postupně otáčí v rozsahu cca. 7° na obě

strany od ideálního vazebního úhlu. Ten se mění v závislosti na indexu

lomu svrchního prostředí (a tedy na koncentraci detekované látky).

Podle umístění detektoru rozlišujeme dvě experimentální uspořádání

(výše uvedené a …...

Druhou možností umístit detektor pod čip a sledovat intenzitu světla

vyvázaného z vlnovodu v závislosti na úhlu. Uspořádání laseru a

detektoru je tedy přesně obrácené.


2. MŘÍŽKOVÉ SENZORY (2. varianta)


3. REZONANČNÍ ZRCADLO


3. REZONANČNÍ ZRCADLO

Optical Biosensors, F. S. Ligler, C. A. R. Taitt (ELSEVIER 2002)


3. REZONANČNÍ ZRCADLO

Tento druh senzoru pracuje na podobném principu, jako mřížkový

odrazný vazebný člen (reflection coupler).

Místo mřížky je v tomto uspořádání použita optická prizma.

To výrobu na jednu stranu zjednoduší, protože leptání mřížky není

úplně snadnou záležitostí.

To je ovšem vykompenzováno složitějším postupem při depozici.

Zatímco v prvním případě stačilo na podložku s připravenou mřížkou

nadeponovat vlnovodnou vrstvu, zde je situace komplikovanější.

Horní strana vlnovodu je již rezervována pro transduktor a zkoumaný

vzorek a světlo je tedy třeba zavádět ze strany podložky. Aby došlo k

navázání světla do vlnovodu, je nutné, aby mezi prizmou a vrstvou

byla tenká vrstva z materiálu o nižším indexu lomu, než má vlnovodná

vrstva a prizma. To lze vyřešit dvěma způsoby.


3. REZONANČNÍ ZRCADLO

Buď se přímo na optickou prizmu nadeponuje dielektrická vrstva

s nízkým indexem lomu a na ní vlnovodná vrstva. Musí platit, že

spodní vrstva (tzv. buffer vrstva n b) má nejnižší index lomu

n b >= n g > n b.

Rovněž tloušťka vrstvy je omezena na několik desítek nm, aby

se světlo z prizmy mohlo protunelovat do vlnovodné vrstvy.

Tento postup má tu nevýhodu, že depozice probíhá přímo na

prizmu, tím ovšem dochází k jejímu znehodnocení.

Druhou variantou je vlnovodnou a buffer vrstvu deponovat na

podložku z materiálu shodného s materiálem prizmy.

Podložky musí být dobře vyleštěny, aby na rozhraní prizmapodložka

došlo k co nejmenším energetickým ztrátám. Prizma v

tomto případě zůstává mimo depoziční proces a je tedy

ušetřena.


4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU


4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU

(Surface Plasmon Resonance)

SPR senzory se skládají z tenké kovové vrstvy o tloušťce cca. 50 nm

deponované na skleněném povrchu.

Do tohoto povrchu je poté zavedeno světlo (obvykle prizmou), načež

se při určitém úhlu dopadu na rozhraní metalické vrstvy a vrstvy

zkoumaného materiálu generuje zvláštní druh vlny, tzv. povrchový

plazmon.

Při tomto úhlu dojde k rezonanční vazbě mezi příchozím světlem a

povrchovým plazmonem a můžeme pozorovat dip v grafu závislosti

odražené energie na úhlu dopadajícího světla.

Jeho přesná poloha je závislá také na indexu lomu svrchní vrstvy, kde

se odehrává biologická reakce.


4. REZONANCE POVRCHOVÉHO PLAZMONU

Monitorováním úhlu, kdy dochází k rezonanci lze pozorovat změny

indexu lomu svrchní vrstvy.

Pro generaci povrchového plazmonu je potřeba světlo s p-polarizací.

Nejčastěji se používají vrstvičky ze stříbra, nebo zlata. Stříbro nabízí

užší minimum dipu, tedy větší rozlišení, na druhou stranu zlato je

stabilnější a má lepší adhezi ke skleněné podložce.


4. Optické biosenzory - SPR

L: light source, D: photodiode array, P: prism, S: sensor surface, F: flow cell.

Dvě černé čáry v odraženém svazku symbolizují pokles intenzity světla v důsledku

rezonančního jevu v čase t 1 a t 2.

Čára t 1 znázorňuje situaci před navázáním antigenu na protilátky na povrchu vrstvy a

t 2 znázorňuje pozici po navázání.


4. Optické biosenzory - SPR


4. Optické biosenzory - SPR

SPR – je jev nastávající po odrazu světla od tenké kovové vrstvy. Část

energie záření dopadajícího pod definovaným úhlem může interagovat s

delokalizovanými elektrony v tenké kovové vrstvě (plasmony) a tím se

sníží intenzita světla odraženého.

Tento úhel dopadu lze přesně určit.

Záleží na změně indexu lomu v místech „zadní“ strany tenké kovové

vrstvy – tj. v místě kde jsou zachycovány detekované molekuly na

ligandech.

Dojde- li k navázání detekovaných molekul, tak se změní index lomu,

což vede ke změně úhlu pro vznik SPR – a tím dojde ke změně intenzity

odraženého světla.


4. Optické biosenzory -

SPR


5. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence)


5. TIRF

Optical Biosensors, F. S. Ligler, C. A. R. Taitt (ELSEVIER 2002)


5. TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence =

fluorescence daná úplným vnitřním odrazem)

Metoda byla teoreticky objevena zhruba v polovině 70.tých let minulého

století.

Jako v ostatních druzích senzoru je jeden z reaktantů imobilizován na

povrchu vlnovodu, do kterého je laserem zavedeno světlo.

V případě TIRF může být interakční oblast větší - nejsme omezeni jen na

oblast vazebního členu. Druhý reaktant ovšem musí být v tomto případě

označkován nějakou fluorescenční látkou.

Pokud se tyto molekuly naváží na imobilizované látky na povrchu

vlnovodu, dostanou se do dosahu evanescentního pole a toto pole budí

fluorescenci daného labelu (značkovače).Ta je poté detekována CCD

kamerou, nebo konfokálním mikroskopem.

Výhodou tohoto uspořádání je, že nejsme omezení při detekci na úzkou

část senzoru.

Nevýhodou je nutnost použití fluorescenčních značkovačů, které zužují

možnost praktického použití.


Aplikace biosenzorů

Aplikací je celá řada - detektory plynů, měřiče vlhkosti, pro

charakterizaci tenkých vrstev apod.

Klíčová je schopnost monitorovat chemické a biologické reakce a to

téměř v reálném čase. Při nalezení vhodných biokonjugovaných látek

se dají použít také pro detekci neznámých látek, kdy známé vhodné

kandidáty.

Doposud jsme tvrdili, že proměny na povrchu vlnovodu se odrazí ve

změně efektivního indexu lomu. Nicméně tato veličina sama o sobě

neříká nic o množství adsorbovaného materiálu na povrchu.

K tomu slouží veličina pokrytí povrchu (surface coverage) Г [pg.mm -2 ].

Citlivost se udává jako hmotnost detekované látky schopné vyvolat

dostatečný signál na jednotku plochy citlivého povrchu.

Běžně udávaná citlivost těchto zařízení se pohybuje mezi 5-10 pg mm -2 ,

interferometry jsou zhruba 10x citlivější.


Aplikace biosenzorů

Další význačnou charakteristikou je tzv. detekční limit, neboli minimální

koncentrace látky v roztoku,kdy je schopen ji senzor detekovat.

Tento limit závisí na konkrétní úloze.

Např. pro reakce typu receptor - protilátka se udává běžně detekční limit

200μg/l., metoda TIRF je schopna dosáhnout až 0.5 μg/l

Prvním impulzem pro vývoj optických biosenzorů byl výzkum interakcí

mezi proteiny a toto zůstalo nejdůležitější oblastí aplikace.

Z biologických aplikací je třeba také zmínit monitorování kinetiky

adheze a růstu buněk na povrchu.


Aplikace biosenzorů

Optické vlnovodné biosenzory jsou ideální pro monitorování těch

interakcí kde reakce mají obvykle velkou molekulární hmotnost (od

1000u = daltonů) a tedy produkují silnou odezvu.

Biosenzory jsou schopny detekovat molekuly od hmotností několika set

daltonů

1u = 1 / {1000N a} =1.66.10 -27 [kg],

Pro porovnání hmotnost m : m (H 2O) = 18 u,

m(hemoglobinu) = 10 5 u,

m(viru) = 10 7 u.

Důležitým krokem při konstrukci biosenzoru je imobilizace jednoho z

reaktantů na jeho povrch. Pro usnadnění tohoto úkolu se v systémech

rezonančního zrcadla často imobilizuje na povrch vlnovodu vrstva

karboxymethylového dextranu (carboxymethylated dextran - CMD).

Tato vrstva tvoří trojrozměrnou matrici, která velmi ulehčuje navázání

molekul obsahující aminy. Zároveň jim zabraňuje v přímém kontaktu s

vlnovodem, které by mohlo způsobit zvýšenou odezvu senzoru.


Optické biosenzory- OWLS

OWLS – Optical Waveguide Lightmode

Spectroscopy (Brusatori – ITO film,

10 nm, coated onto SrTiO

waveguding film, serves as the

working sensing electrode.

Adsorption is detected by monitoring

changes in the effective refractive

index of the waveguide- ITO film

plus adsorbed layer (indium tin

oxide).

Fig. 1. A schematic of the ITO coated OW 2400

sensor chip (Micro Vacuum Ltd., Budapest).

Fig. . A schematic of the sensor chip as a four-layer

optical waveguide. Monochromatic light penetrates a

glass substrate (S) at an angle and is coupled into a

waveguiding film (F) via a grating. A second film (F′),

representing either a conducting layer or adsorbed

species, may separate the waveguiding layer from the

cover (C) solution. A guided mode is detected when the

phase shift of one complete period of total internal

reflection equals an integral multiple of 2 . The guided

mode is characterized by propagation angles F and F′.


Optické biosenzory- OWLS

OWLS je založena na navázání svazku He- NE laseru do planárního

vlnovodu přes difrakční mřížku. K tomuto navázání dochází pouze při

dvou diskétních úhlech – pro polarizaci dopadajícího svazku TE a TM.

Úhel navázání je indikován fotodiodou umístěnou na konci vlnovodu.

Na rozhraní vzniká při navázání svazku evanescenční pole, které proniká

do roztoku do vzdálenosti asi 100 – 200 nm. Měřením změn vazebního

úhlu umožní on- line monitorování změni indexu lomu v blízkosti

povrchu. Změna indexu lomu může být korelována s adsorpčním

procesem.


Optické biosenzory


Biosenzory- EWF

(evanescent wave fluorescence

(TIRF)

Array biosenzors–

detection multiple

targets on the surface

of single waveguide.

Rapid detection and

monitoring of toxins.

The analyte/biorecognition

element/optical probe at the

interface between the

biomedium and the guiding

medium can interact with

evanescent field and produce an

optical response (phase,

amplitude)

Change in fluorescence

properties as a result of the

analyte binding with the

biorecognition element.

Obr.9.17 Biofotonika


Otázky

1. Princip biosenzoru, optické biosenzory, druhy- členění

2. Navázání světla do optických biosenzorů

3. Interferpmetrické biosenzory

4. Mřížkové biosenzory

5. Biosenzory na rezonančním zrcadle

6. Biosenzory na povrchovém plazmonu (SPR)

7. Biosenzory na fluorescenci s totálním vnitřním odrazem

(TIRF)

8. Aplikace biosenzorů, citlivost biosenzorů, detekční limit

9. Biosenzory QWLS

10. Biosenzory EWF

More magazines by this user
Similar magazines