ESTRATEGIAS PARA DIFERENCIAR Xanthomonas campestris pv ...

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topatógenas e influyen en la dinámica de las comunidades
microbianas. Xanthomonas es una bacteria saprófita
facultativa por lo que los cambios ambientales pueden
afectar directamente su sobrevivencia y provocar
cambios genéticos permanentes. El estrés bajo condiciones
de sobrevivencia puede afectar adversamente la
viabilidad de las bacterias, lo que ha estimulado la investigación
al respecto. Algunos investigadores recomiendan
para medir viabilidad el que se use actividad
metabólica en vez de crecimiento bacteriano (división o
crecimiento de colonias). Roslev y King (1993) encontraron
que el tetrazolio se puede usar con éxito como indicador
del sistema de transporte de electrones y de viabilidad.
Las sales de tetrazolio se han utilizado como
aceptores de electrones de hidrógeno para evaluar el
efecto de sustancias anticancerosas en células eucariotas
(Vistica et al., 1991). Se asume que sólo las células
vivas pueden reducir las sales de tetrazolio a derivados
de formazan. En adición se ha utilizado la reducción
metabólica de sales solubles de tetrazolio a formas insolubles
de formazan para localizar enzimas. Thom et
al. (1993) determinaron que la adición de glucosa y la
permeabilidad de la célula se relacionan a la deposición
de formazan.
Debido a lo controversial del tema relacionado a la
clasificación de Xanthomonas y a la necesidad de mantener
un sistema que ayude al fitopatólogo a identificar
con mayor precisión las bacterias fitopatógenas, se estudiaron
los parámetros de utilización de sales inorgánicas,
azúcares y viabilidad de bacterias asociadas a tejidos
enfermos, en especial las del género
Xanthomonas. Estos criterios se utilizan para diferenciar
entre las especies campestris y axonopodis. Se estudiaron
las características de las variantes de Xcp y de
las bacterias patógenas y no patógenas en medios suplementados
con sales, con el fin de diferenciarlas en
medio de cultivo simplificando la selección de bacterias
a probar en condiciones de invernadero.
El objetivo de este estudio fue determinar si las
variantes de Xcp y de otras bacterias asociadas a plantas
como patógenas y no patógenas muestran diferencias
en medio de crecimiento suplementado con cloruro
de tetrazolio, cloruro de sodio y azúcares
diferenciales.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se escogieron para el estudio bacterias provenientes
de dos géneros de plantas representando un cultivo
(P. vulgaris) y una ornamental (A. andreanum) de importancia
económica en Puerto Rico atacados por la
AGRONOMÍA MESOAMERICANA
bacteria Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Xcp) y
dieffenbachiae (Xcd), respectivamente.
Estas se coleccionaron de hojas de frijol que mostraban
síntomas del tizón común en Costa Rica, México,
Honduras, Guatemala, Puerto Rico y República Dominicana
mientras que las de anturio se recolectaron en
Puerto Rico. Se aislaron e identificaron las bacterias
asociadas a los tejidos foliares enfermos de ambos
húespedes. Las hojas de frijol mostraban síntomas de
la enfermedad conocida como tizón común causado por
Xcp y las de anturio síntomas parecidos a la bacteriosis
causada por Xcd. Se utilizaron métodos ordinarios
de aislamiento e incubación a 28°C, para la identificación
se utilizó el sistema computarizado Biolog. Las
colonias se caracterizaron por su pigmentación, bordes,
y forma en medio de agar nutritivo a las 72 y 120 horas.
Cada aislado fue caracterizado mediante la prueba
de KOH al 3% antes de realizar el procedimiento de
identificación mediante el sistema de Biolog.
La patogenicidad de las bacterias aisladas se determinó
bajo condiciones de invernadero en sus respectivos
húespedes. En frijol se inoculó la hoja trifoliada en
plantas de 21 días de sembradas y en anturio la segunda
hoja desarrollada desde el ápice de plantas de cuatro
meses de sembradas. Cada bacteria se inoculó por
triplicado utilizando presillas planas impregnadas con
la bacteria a probar lacerando sin perforar en tres puntos
del haz de la hoja. Los testigos se inocularon de
igual forma utilizando agar nutritivo. Se tomaron datos
de los síntomas a los siete, 14, 21, y 28 días después de
la inoculación. De esta manera se diferenciaron los patógenos
aislados de los que no lo eran. Se empleó un
sistema de riego por goteo para irrigar las plantas.
Se utilizaron 64 cultivos bacterianos aislados según
descripción previa para estudiar las características
de las colonias que crecieron en medios suplementados
con sales inorgánicas. El estudio se realizó en dos etapas
con las sales: trifenil cloruro de tetrazolio (TTC) y
cloruro de sodio. Se preparó una solución stock de
TTC al 5% y se esterilizó en autoclave por 15 min a
121°C y 15 psi. La solución de TTC fue añadida según
la concentración deseada al medio esterilizado que contenía
5,0 g de peptona, 0,5 g de caseína hidrolizada, 2,5
g de glucosa y 8,5g de agar por 500 ml de agua (Kelman,
1954). En la primera fase se estudiaron 64 cultivos
bacterianos e incluyó concentraciones de TTC de
0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0% y cloruro de sodio al 1,0, 2,0,
3,0, 4,0, y 5,0%. En la segunda fase se seleccionaron
21 cultivos y se le dio más énfasis a los cultivos de Xcp.
Esta fase incluyó TTC al 1,0, 1,2, 1,4, y 1,8 % y NaCl
al 4,0, 5,0, 6,0 y 7,0%. El cloruro de sodio fue suplementado
al medio de agar nutritivo utilizando 2,3 g de