Tipificación genética. Análisis genéticos de ... - Interreg Bionatura

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOMEMORIA FINAL“ASISTENCIA TÉCNICA PARA LA REALIZACIÓN DE LA TIPIFICACIÓN DE ESPECIESAMENAZADAS MEDIANTE TÉCNICAS GENÉTICAS DE IDENTIFICACIÓN ESPECÍFICA”,INTEGRADA EN EL PROYECTO INTERREG III-B AZORES MADEIRA CANARIAS(BIONATURA)Juli Caujapé Castells y Ruth Jaén MolinaDepartamento de Biodiversidad Molecular y Banco de ADNJardín Botánico Canario “Viera y Clavijo”Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOPara cumplir con los objetivos contemplados dentro de la asistencia técnica adjudicada alDepartamento de Biodiversidad Molecular y Banco de ADN del Jardín Botánico Canario “Viera yClavijo” (JBCVC) para la caracterización molecular de especies amenazadas, se han desarrollado lassiguientes actividades:- Muestreo de especimenesDe las especies incluidas en la asistencia técnica se localizaron aquellos taxones de los quedisponíamos material en el Banco de ADN del Jardín Canario para en caso contrario, planificar lassalidas al campo requeridas para llevar a cabo las recolecciones pertinentes en sus poblacionesnaturales.Además, debido al escaso margen de tiempo con el que contábamos para finalizar todas lasactividades necesarias para la caracterización de las distintas especies, se llevaron a caborecolecciones en los Viveros e instalaciones del JBCVC. En este último caso, se eligieron especimenesde los que se conocían todos los datos de su procedencia, y por lo tanto, podíamos saber que habíansido recolectados en poblaciones naturales o que procedían de semillas recolectadas en poblacionesnaturales y siempre teniendo en cuenta que mantenían las características propias de la especie en suspoblaciones naturales.Tabla 1. Taxones incluidos en la asistencia técnica. Los asteriscos después del nombre señalanaquellas especies de las que no se disponía ADN en el Banco de ADN del JBCVC (**=materialcedido por el Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias del Mar de la ULPGC).ESPECIESLotus kunkeliiLotus arinagensisLotus lancerottensisLotus glaucus*Lotus mascaensis*Lotus berthelotiiLotus pyranthusParolinia glabriuscula*Parolinia filifoliaParolinia intermedia*Parolinia playpetala*Parolinia schyzogynoides*Parolinia ornataDracaena dracoDracaena tamaranaeLimonium spectabileLimonium arborescens*Limonium sventeniiLimonium brassicifoliumLimonium bourgeauiLimonium macrophyllum*Limonium preauxiLimonium benmageci*ESPECIESConvolvulus perraudieriConvolvulus subaruriculatusConvolvulus glandulosusConvolvulus canariensisConvolvulus lopez-socasi*Dendriopoterium menendeziDendriopoterium pulidoiPolygonum maritimum**Polygonum balansae var. tectifolium**Bencomia brachystachya*Bencomia caudata**Bencomia exstipulata**Bencomia sphaerocarpaCamino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

- Extracción, cuantificación y purificación del ADNCONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOEl ADN de todos los especimenes muestreados (ver Tabla 2 para detalles) se aisló a partir dehojas frescas o mantenidas en gel de sílice siguiendo el protocolo CTAB 2X (Doyle and Doyle, 1987;Palmer et al., 1989) con las modificaciones descritas en el Manual de laboratorio del Departamento deBiodiversidad Molecular del JBCVC.Tras la extracción, para evaluar la cantidad y calidad del ADN extraído y diluido en tampón TE(Tris-Edta) se realizaron mediciones con el espectrofotómetro (Eppendorf Biophotometer) y sellevaron a cabo electroforesis en geles de agarosa al 0.8%.Siguiendo el protocolo rutinario de todas las investigaciones que desarrolla este Departamento, elmaterial genético extraído ha sido depositado en las instalaciones del Banco de ADN de la floraCanaria, residente en esta institución, asignándose a cada una de ellas un código de identificación(véase "Vial code" en Tabla2).Tabla 2. Muestras de las que se ha extraído, purificado y cuantificado su ADN para llevar acabo laasistencia técnica. Se indica la procedencia de cada una de ellas, así como la concentración de ADN y el código(vial code) del Banco de ADN del JBCVC. Las siglas en la columna de Procedencia se corresponden con C= GranCanaria, T=Tenerife; G=Gomera, P=Palma; H= Hierro; L=Lanzarote y CV= Cabo Verde. Para aquellas que serecolectaron en las instalaciones del JBCVC se incluye el código asignado para las mismas en la Base de datos"Planta Viva " de este Centro y que permite acceder a todos los datos relacionados con su origen."Vial code" Taxon Procedencia [μg/ml]651 Lotus arinagensis Barranco Viejo, Arinaga, C 172,9652 Lotus arinagensis Cerca Faro, Arinaga, C 123,5653 Lotus berthelotii Tafira, C 119,63832 Lotus berthelotii Barranco del Rio. Arico, T 97659 Lotus mascaensis 214/03 cultivado JBCVC, C 100,53844 Lotus mascaensis Masca. T 170,92244 Lotus cf. glaucus Altavista. C 128,13845 Lotus cf. glaucus Costa Ayala. C 1081,4661 Lotus pyranthus 210/99 cultivado JBCVC, C 105,53843 Lotus pyranthus La Orotava, T 171,83804 Lotus kunkelii Barranco de Jinamar, C 2963805 Lotus kunkelii Barranco de Jinamar, C 211,83823 Lotus lancerottensis Femés, L 541,83825 Lotus lancerottensis El GolFo, L 209,4130 Parolinia glabriuscula Caldera de Bandama, C 1.289,6130.3 Parolinia glabriuscula Caldera de Bandama, C 151,3182 Parolinia filifolia Inagua, C 760,4141 Parolinia filifolia La Aldea, C 687,8132 Parolinia intermedia Adeje, T 700,0187 Parolinia intermedia Guaza, T 1.164,2134 Parolinia playpetala Guayadeque, C 534,4134.3 Parolinia playpetala Guayadeque, C 294,4137 Parolinia ornata Mogán, C 755,0180 Parolinia ornata Veneguera, C 280,0140 Parolinia schyzoginoides Barranco de Argaga, G 415,5.140.3 Parolinia schyzoginoides Barranco de Argaga, G 197,13660 Dracaena draco Plaza Fdo Navarro, JBCVC, C 18,1973 Dracaena draco Santo Antao; CV 137,53666 Dracaena tamaranae Jardín de Islas, JBCVC, C 23,83669 Dracaena tamaranae Tagoror, JBCVC,.C 543,0714 Limonium sventenii 2162/B. Güigüi. C. 26,51645 Limonium sventenii Almagro. C 35,8713 Limonium brassicifolium 480/04 cultivado JBCVC, C 16,22512 Limonium brassicifolium El Cepo, G 132,9692 Limonium bourgeaui 95/04 Riscos de Jandía, F 84,02218 Limonium bourgeaui Pico del Fraile, F 58,0716 Limonium preauxi 504/vc cultivado JBCVC, C 51,01138 Limonium preauxi Bco. de los Gallegos, C 30,8715 Limonium benmageci 455/vc cultivado JBCVC, C 26,13847 Limonium benmageci La Aldea, C 359,13846 Limonium arborescens Barranco Ruiz, T 96,93846.2 Limonium arborescens Barranco Ruiz, T 41,83848 Limonium macrophyllum Anaga, T 57,63848.2 Limonium macrophyllum Anaga, T 73,2459 Limonium spectabile Morro de La Galera, T 26,4Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOVial code Taxon Population [μg/ml]470 Limonium spectabile Morro de La Galera. T665 Convolvulus perraudieri 316/04 cultivado JBCVC, C 62,22337 Convolvulus perraudieri Arguineguín, C 459,4490 Convolvulus baruriculatus Aluce, Gomera 222,0474 Convolvulus subaruriculatus Cañada Cabrera-Agulo, La 24,9664 Convolvulus glandulosus 2163/B/02 cultivado JBCVC, C 238,01144 Convolvulus glandulosus Amurga, C 28,42506 Convolvulus canariensis Centro Visitantes Garajonay,G 380,082614 Convolvulus canariensis Ancón Negro, G 368,0717 Convolvulus lopez-socasi 56/04 cultivado JBCVC, C 92,23868 Convolvulus lopez-socasi .Famara, L 1024,21333 Dendriopoterium Guayedra, C 5.294,01626 Dendriopoterium menendezi Aldea San Nicolás, C 49,71586 Dendriopoterium pulidoi Bco. de Tejeda, C 87,71584 Dendriopoterium pulidoi Bco. de Tejeda. C 540,22632 Bencomia exstipulata Tiro del Guanche, T 374,52634 Bencomia exstipulata Tiro del Guanche, T 1337,02023 Bencomia sphaerocarpa Fuente de Tincos, H 1223,32025 Bencomia sphaerocarpa Tabanos, H 1181,93867 Bencomia brachystachya Barranco de Tirajana, C 1377,63867.2 Bencomia brachystachya Barranco de Tirajana, C 976,9BCA16 Bencomia caudata Barranco Añavingo, T 58,7BSUP12 Bencomia caudata Barranco Seco, P 47,5Pb154 Poligonum maritimum Lobos, F 73,9Pb158 Poligonum maritimum Lobos, F 123,8Pb58 Poligonum balansae El Médano, T 60Pb59 Poligonum balansae El Médano, T 56,5- Optimización de los protocolos de amplificación y secuenciación.Según convenio, las amplificaciones se han desarrollado para tres regiones codificantes del ADNcloroplástico (rpoB, rpoC1 y matK) utilizando los cebadores universales para estas regiones aceptadospor el “Consortium for the Barcoding of Life” (CBOL de aquí en adelante). El CBOL todavía no hallegado a un consenso en cuanto a las regiones definitivas que van a utilizarse para plantas, aunqueen la reciente reunión de Nueva York, en la que el Departamento de Biodiversidad Molecular delJBCVC estuvo representado, se estableció un plazo máximo de cuatro semanas (finales de mayoprincipiosde junio de 2008) para consensuar las regiones definitivas, entre las que probablemente seencuentren al menos dos de las que se han incluido en este estudio. La relación de nuestroDepartamento con la iniciativa del código de barras de la vida y el hecho de que los ADN de estasmuestras se hallan depositados en el Banco de ADN de la Flora Canaria van a hacer posible secuenciarestas mismas muestras para cualquier otra región que se incluya en la propuesta final para plantas.Para aquellas muestras con una concentración y pureza adecuadas se montaron reacciones deamplificación (PCR) para un volumen final de 25µl y con las condiciones (nº de ciclos y tiempos)recomendadas por el CBOL, en el termociclador “Mastercycler Gradient” de la casa comercialEppendorf. En todos los casos, se utilizó el kit REDDY MIX TM PCR MASTER MIX (Abgene) y se añadióBSA al 0.4% como componente adicional del cóctel de reacción. El ADN de aquellos especimenes paralos que se obtuvo una amplificación exitosa, fue purificado con las columnas “GENELUTE PCR CLEAN-UP” (Sigma-Aldrich, C.O). Las muestras purificadas se secuenciaron con "BIG DYE V·3.1" (AppliedBiosystems, California, USA) en el secuenciador automático ABI 3100 del laboratorio de GenéticaForense de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria.Tanto para las reacciones de PCR como para las de secuenciación fue necesario realizar algunasmodificaciones (Newmaster, et al. 2007) respecto a los protocolos propuestos y recomendados porCBOL (Kress, et al, 2005; Chase et al, 2007). Algunas de estas modificaciones supusieron variacionesde la temperatura de anillamiento (Ta), de la concentración final de magnesio, del número de ciclosen el termociclador o la adición de DMSO en un 0.8%.Una vez optimizada la s condiciones de amplificación se cuantificó la concentración del productode PCR y según el tamaño de la región a secuenciar se estimó la concentración del ADN necesario aañadir al cóctel de reacción.Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOAunque las primeras amplificaciones parecían exitosas, especialmente para las regiones rpoB yrpoC (ya que daban lugar a bandas brillantes y únicas en el gel después de electroforesis), seencontraron numerosos problemas (ruido de fondo, presencia de subproductos, secuencias queacaban repentinamente, etc) para la obtención de secuencias válidas (ver Fig 1). En consecuencia, semodificaron las concentraciones de ADN inicial en la reacción de secuenciación y se realizaron reamplificacionesde los amplicones a distintas diluciones (1/50 y 1/100), así como, se establecieronunas condiciones de amplificación más restrictivas, manteniéndose la Ta por encima de 55ºc y elnúmero de ciclos igual o por debajo de 30 ciclos para evitar la amplificación de subproductos por launión de los cebadores a distintas dianas dentro de las regiones estudiadas.Por último, se solicitaron nuevos cebadores para asegurarnos de que los problemas no se debíana un mal diseño de los que se venían utilizando o a un exceso de inespecificidad de los mismos. Estaúltima acción solucionó la mayoría de problemas que interferían con la obtención de secuenciaslimpias.Fig. 1 Diferentes cromatogramas de secuencias analizadas en esta asistencia técnica. En el cromatogramasuperior se muestra una secuencia que disminuye su señal repentinamente. En el cromatograma del centro semuestra una secuencia que presenta problemas de lectura por la presencia de subproductos. En elcromatograma de la parte inferior se muestra una secuencia limpia obtenida tras paliar los problemascomentados anteriormente.Los cromatogramas resultantes de la edición de cada una de las secuencias analizadas no losincluimos en esta Memoria final porque ocuparían muchísimo espacio pero quedan a disposición paracualquier consulta que se quiera realizar.Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOUna vez obtenidas las secuencias limpias, y como paso previo al análisis de datos, se realizaronbúsquedas en GENBANK, la base de datos más conocida de secuencias de ADN públicamentedisponibles, utilizando el algoritmo BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) paracomprobar si las secuencias generadas eran similares o iguales a otras identificadas anteriormentepara la misma especie y/o región analizada.Las secuencias de GENBANK se utilizaron también para delimitar el tamaño de cada una de lastres regiones incluidas en este proyecto.Las secuencias sentido y antisentido ("forward" y "reverse") fueron editadas con el programaBIOEDIT v.5.0.6 (Hall, 1999) y alineadas con la opción CLUSTAL W (Thompson et al, 1994) de dichoprograma. La edición de los cromatogramas es importantísima para paliar posibles errores en lalectura de las bases nitrogenadas de la secuencia de ADN analizada. La edición es manual y consisteen la corroboración visual de la correspondencia de picos de diferentes colores (a cada base se leasigna un pico de color distinto) con la secuencia de bases que aparece en la parte superior delcromatograma, y la correción de la misma en los casos en que esto sea necesario. La edición esespecialmente dificultosa tanto al principio como al final de la lectura cuando los picos no estánperfectamente definidos (por saturación de la señal al principio y por debilitamiento de la señal alfinal).Una vez editadas las secuencias y para poder realizar comparaciones entre las misma, esnecesario alinearlas. Esta alineación puede realizarse también de forma manual o alternativamentecon la ayuda de un programa específico de alineamiento como el paquete informático BIOEDIT(http://www.mcbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html), de utilización gratuita y disponible en la red.Algunas indicaciones básicas para el manejo del programa BIOEDIT se incluyen como Anexo deesta Memoria.Para facilitar la alineación de cada bloque de secuencias, se incluyó como secuencia prototipo, lassecuencias de la base de datos del GENBANK que mayor porcentaje de similitud presentaba con“nuestras secuencias” tras llevar a cabo las búsquedas BLAST para cada uno de los casos.Una vez que las secuencias estaban alineadas, se procedió al cálculo de las distancias genéticas ode disimilitud, como valor orientativo de la fracción de posiciones en que las secuencias comparadasdifieren.Para cada región y género, las secuencias obtenidas se transformaron en matrices de distanciasentre pares de especies (Kress et al, 2007) utilizando el programa DNADIST que calcula distanciasentre secuencias de nucleótidos según el modelo de “Kimura-2” (Kimura, 1980).Los resultados se presentan y discuten en base a estas matrices de distancias, dado que:1. No existe todavía un protocolo de determinación de “código de barras” o un consenso deanálisis de datos para este fin, ni en animales ni en plantas.2. Los “códigos de barras” moleculares no tienen por qué estar basados en árboles, ya que lainformación útil para diferenciar especies (los caracteres exclusivos o autoapomorfías) no puede serutilizada para construir árboles (que se basan en los caracteres compartidos o sinapomorfías)-ResultadosTodas las secuencias obtenidas se suministran alineadas en formato digital en la carpeta“SECUENCIAS”, separadas en ocho sub-carpetas (una para cada género evaluado) que contienen lassecuencias para todas las especies y cada una de las tres regiones secuenciadas. Además lascorrespondientes matrices de distancia se incluyen en la caperta “MATRICES” y se reparten de igualmanera en ocho sub-carpetas para cada género y por región secuenciada. El programa necesario paravisualizar los archivos y matrices se incluye también en la carpeta BIOEDIT.Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOEn los archivos de secuencias alineadas (.bio), se marcan con sombreado las similitudesencontradas entre las secuencias, de forma que las diferencias de cambios de nucleótidos se puedena su vez identificar en las zonas que no quedan sombreadas (Fig.2)Para cada especie se secuenciaron 2 muestras pero debido a que cada par de secuencias eraidéntico entre sí, salvo excepciones puntuales más debidas a "errores" en la lectura por superposiciónde picos, que a diferencias reales entre las mismas, tanto en los alineamientos como en las matricesde distancia se incluye una única secuencia por especie.Todas las secuencias obtenidas en el desarrollo de este estudio, serán depositadas en la web deGENBANK para que tras su homologación, aparezcan etiquetadas como códigos de barras no basadosen CoxI.Fig.2 Archivo del programa BioEdit con secuencias alineadas del género Parolinia, en las que se muestran lassimilitudes (sombreadas) y diferencias (sin sombrear) encontradas al comparar las mismas.Matrices de distancia de Kimura-2Género ConvolvulusRegión matK1 2 3 4 51. C.subauriculatus 0.0000 0.0090 0.0000 0.0030 0.01052. C.glandulosus 0.0090 0.0000 0.0090 0.0121 0.01983. C.perraudieri 0.0000 0.0090 0.0000 0.0030 0.01054. C.canariensis 0.0030 0.0121 0.0030 0.0000 0.01365. C.lopez-socasi 0.0105 0.0198 0.0105 0.0136 0.0000Región rpoB1 2 3 4 51. C.subauriculatus 0.0000 0.0180 0.1538 0.0036 0.00362. C.glandulosus 0.0180 0.0000 0.1410 0.0143 0.01433. C.perraudieri 0.1538 0.1410 0.0000 0.1585 0.15854. C.canariensis 0.0036 0.0143 0.1585 0.0000 0.00005. C.lopez-socasi 0.0036 0.0143 0.1585 0.0000 0.0000Región rpoC1 2 3 4 51. C.subauriculatus 0.0000 0.0074 0.0037 0.0112 0.00742. C.glandulosus 0.0074 0.0000 0.0074 0.0150 0.01113. C.perraudieri 0.0037 0.0074 0.0000 0.0112 0.00744. C.canariensis 0.0112 0.0150 0.0112 0.0000 0.01315. C.lopez-socasi 0.0074 0.0111 0.0074 0.0131 0.0000Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOGénero DendriopoteriumRegión matK1 21. D.menedezi 0.0000 0.00152. D.pulidoi 0.0015 0.0000Región rpoB1 21. D.menedezi 0.0000 0.00002. D.pulidoi 0.0000 0.0000Región rpoc1 21. D.menedezi 0.0000 0.00002. D.pulidoi 0.0000 0.0000Género ParoliniaRegión matK1 2 3 4 5 61. P.ornata 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.0000 0.00002. P.filifolia 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.0000 0.00003. P.schyzogynoides 0.0032 0.0032 0.0000 0.0032 0.0032 0.00324. P.intermedia 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.0000 0.00005. P.platypetala 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.0000 0.00006. P.glabriuscula 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.0000 0.0000Región rpoB1 2 3 4 5 61. P.ornata 0.0000 0.0027 0.0000 0.0000 0.0000 0.00002. P.filifolia 0.0027 0.0000 0.0027 0.0027 0.0027 0.00273. P.schyzogynoides 0.0000 0.0027 0.0000 0.0000 0.0000 0.00004. P.intermedia 0.0000 0.0027 0.0000 0.0000 0.0000 0.00005. P.platypetala 0.0000 0.0027 0.0000 0.0000 0.0000 0.00006. P.glabriuscula 0.0000 0.0027 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000Región rpoC1 2 3 4 5 61. P.ornata 0.0000 0.0018 0.0000 0.0018 0.0000 0.00182. P.filifolifolia 0.0018 0.0000 0.0018 0.0037 0.0018 0.00373. P.schyzogynoides 0.0000 0.0018 0.0000 0.0018 0.0000 0.00184. P.intermedia 0.0018 0.0037 0.0018 0.0000 0.0018 0.00375. P.platypetala 0.0000 0.0018 0.0000 0.0018 0.0000 0.00186. P.glabriuscula 0.0018 0.0037 0.0018 0.0037 0.0018 0.0000Género PoligonumRegión matK1 21. P.balansae 0.0000 0.00002. P.maritimum 0.0000 0.0000Región rpoB1 21. P.balansae 0.0000 0.00002. P.maritimum 0.0000 0.0000Región rpoc1 21. P.balansae 0.0000 0.00002. P.maritimum 0.0000 0.0000Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOGénero LimoniumRegión matK1 2 3 4 5 6 7 81. L.benmageci 0.0000 0.0100 0.0099 0.0167 0.0066 0.0067 0.0291 0.01842. L.bourgueaui 0.0100 0.0000 0.0168 0.0169 0.0100 0.0067 0.0256 0.01513. L.preauxii 0.0099 0.0168 0.0000 0.0235 0.0133 0.0134 0.0361 0.02354. L.arborescens 0.0167 0.0169 0.0235 0.0000 0.0133 0.0134 0.0327 0.02535. L.sventenii 0.0066 0.0100 0.0133 0.0133 0.0000 0.0067 0.0291 0.01846. L.brassicifolium 0.0067 0.0067 0.0134 0.0134 0.0067 0.0000 0.0255 0.01177. L.macrophyllum 0.0291 0.0256 0.0361 0.0327 0.0291 0.0255 0.0000 0.03448. L.spectabile 0.0184 0.0151 0.0235 0.0253 0.0184 0.0117 0.0344 0.0000Región rpoB1 2 3 4 5 6 7 81. L.benmageci 0.0000 0.0032 0.0032 0.0064 0.0032 0.1250 0.0064 0.18232. L.bourgeaui 0.0032 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.1210 0.0032 0.17783. L.preauxii 0.0032 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.1210 0.0032 0.17784. L.arborescens 0.0064 0.0032 0.0032 0.0000 0.0032 0.1247 0.0064 0.18185. L.sventenii 0.0032 0.0000 0.0000 0.0032 0.0000 0.1210 0.0032 0.17786. L.brassicifolium 0.1250 0.1210 0.1210 0.1247 0.1210 0.0000 0.1247 0.04667. L.macrophyllum 0.0064 0.0032 0.0032 0.0064 0.0032 0.1247 0.0000 0.17398. L.spectabile 0.1823 0.1778 0.1778 0.1818 0.1778 0.0466 0.1739 0.0000Región rpoC1 2 3 4 5 6 7 81. L.benmageci 0.0000 0.0477 0.0452 0.1187 0.1232 0.0727 0.0799 0.05022. L.bourgeaui 0.0477 0.0000 0.0023 0.1326 0.1282 0.0750 0.0930 0.00233. L.preauxii 0.0452 0.0023 0.0000 0.1324 0.1280 0.0777 0.0929 0.00464. L.arborescens 0.1187 0.1326 0.1324 0.0000 0.1411 0.1109 0.0722 0.13535. L.sventenii 0.1232 0.1282 0.1280 0.1411 0.0000 0.0805 0.0984 0.13096. L.brassicifolium 0.0727 0.0750 0.0777 0.1109 0.0805 0.0000 0.0646 0.07767. L.macrophyllum 0.0799 0.0930 0.0929 0.0722 0.0984 0.0646 0.0000 0.09568. L.spectabile 0.0502 0.0023 0.0046 0.1353 0.1309 0.0776 0.0956 0.0000Género BencomiaRegión matK1 2 3 41. B.caudata 0.0000 0.0000 0.0093 0.01572. B.exstipulata 0.0000 0.0000 0.0093 0.01573. B.sphaerocarpa 0.0093 0.0093 0.0000 0.02214. B.brachystachya 0.0157 0.0157 0.0221 0.0000Región rpoB1 2 3 41. B.caudata 0.0000 0.0000 0.0000 0.01252. B.exstipulata 0.0000 0.0000 0.0000 0.01243. B.sphaerocarpa 0.0000 0.0000 0.0000 0.01244. B.brachystachya 0.0125 0.0124 0.0124 0.0000Región rpoC1 2 3 41. B.caudata 0.0000 0.0000 0.0015 0.00302. B.exstipulata 0.0000 0.0000 0.0015 0.00303. B.sphaerocarpa 0.0015 0.0015 0.0000 0.00454. B.brachystachya 0.0030 0.0030 0.0045 0.0000Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJOGénero DracaenaRegión matK1 21. D.draco 0.0000 0.01832. D.tamaranae 0.0183 0.0000Región rpoB1 21. D.draco 0.0000 0.00632. D.tamaranae 0.0063 0.0000Región rpoC1 21. D.draco 0.0000 0.00182. D.tamaranae 0.0018 0.0000Género LotusRegión matK1 2 3 4 5 6 71. L.pyranthus 0.0000 0.0034 0.0103 0.0854 0.0138 0.0103 0.01392. L.mascaensis 0.0034 0.0000 0.0069 0.0814 0.0103 0.0069 0.01043. L.berthelotii 0.0103 0.0069 0.0000 0.0815 0.0174 0.0138 0.01744. L.arinagen 0.0854 0.0814 0.0815 0.0000 0.0935 0.0814 0.08955. L.lancerottensis 0.0138 0.0103 0.0174 0.0935 0.0000 0.0173 0.02096. L.cf.glaucus 0.0103 0.0069 0.0138 0.0814 0.0173 0.0000 0.01047. L.kunkelii 0.0139 0.0104 0.0174 0.0895 0.0209 0.0104 0.0000Región rpoB1 2 3 4 5 6 71. L.pyranthus 0.0000 0.0000 0.0000 0.1678 0.1637 0.1591 0.16372. L.mascaensis 0.0000 0.0000 0.0000 0.1678 0.1637 0.1591 0.16373. L.berthelotii 0.0000 0.0000 0.0000 0.1678 0.1637 0.1591 0.16374. L.arinagensis 0.1678 0.1678 0.1678 0.0000 0.0034 0.0069 0.00345. L.lancerottensis 0.1637 0.1637 0.1637 0.0034 0.0000 0.0035 0.00006. L.cf.glaucus 0.1591 0.1591 0.1591 0.0069 0.0035 0.0000 0.00357. L.kunkelii 0.1637 0.1637 0.1637 0.0034 0.0000 0.0035 0.0000Región rpoC1 2 3 4 5 6 71 L.pyranthus 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0074 0.0130 0.00182. L.mascaensis 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0074 0.0130 0.00183. L.berthelotii 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0074 0.0130 0.00184. L.arinagensis 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0074 0.0130 0.00185. L.lancerottensis 0.0074 0.0074 0.0074 0.0074 0.0000 0.0205 0.00926. L. cf.glaucus 0.0130 0.0130 0.0130 0.0130 0.0205 0.0000 0.01497. L.kunkelii 0.0018 0.0018 0.0018 0.0018 0.0092 0.0149 0.0000Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJO- CONCLUSIONES1. El examen de la diferenciación obtenida revela que, en general, existen pocas diferencias interespecíficasen los taxones objeto de investigación para las secuencias de cualquiera de las tresregiones utilizadas (en ocasiones, incluso para las tres regiones combinadas). Este resultado escoherente con la mayoría de filogenias moleculares publicadas para la flora canaria, que muestran unaescasa diferenciación inter-específica.2. La diferenciación intra-específica obtenida en las secuencias utilizadas es en la mayoría de casosmenor o mucho menor que la diferenciación inter-específica, lo cual favorece la identificacióntaxonómica que es el objetivo final de estas técnicas. No obstante, este resultado podría estar influidopor el bajo número de muestras con-específicas incluidas en el proyecto para cada taxón (solamentedos), y podría ser necesario realizar evaluaciones más exhaustivas.3. En sintonía con los resultados de otros grupos de investigación participantes en la reciente reunióndel Plant Working Group del CBOL en Nueva York (1 y 2 de mayo de 2008), el poder de discriminaciónde las tres secuencias utilizadas depende de los linajes investigados y, dentro de éstos, de los paresde especies comparadas. Sin menoscabo de que en el futuro pueda encontrarse una única región delADN vegetal que sea resolutiva en un elevado porcentaje de casos, la identificación taxonómica de laflora endémica macaronésica mediante la utilización de secuencias de ADN debe basarse en laactualidad en la combinación de la información proveniente de varias regiones codificantes de lamolécula de ADN. (Cowan et al, 2006; Ratnasingham, et al, 2007; Hajibabaei, et al, 2007)4. No obstante, los resultados obtenidos en este proyecto muestran que, independientemente de lasregiones de ADN que los miembros del CBOL consensuemos finalmente, sería factible la utilización deuna aproximación multi-locus (partiendo de las tres regiones secuenciadas en este proyecto) paraidentificar muestras de origen desconocido en la mayoría de taxones incluidos en la memoria. Unaprueba relevante a realizar en el futuro consistiría en el suministro de muestras “ciegas” (simplementecon un código numérico, sin ninguna referencia a la taxonomía) para evaluar el grado de precisióncon el que la información de las secuencias de estas regiones recupera la circunscripción taxonómicacorrecta de las muestras.5. La universalidad de los cebadores y de los protocolos de amplificación utilizados en los taxones dela flora canaria incluidos en este proyecto, los resultados que nuestro grupo de investigación estáobteniendo en otros proyectos de caracterización molecular con otros taxones canarios, el próximoconsenso sobre las regiones de ADN a utilizar como “código de barras”, y el hecho de que elDepartamento de Biodiversidad Molecular del JBCVC sea el responsable de la creación y crecimientodel Banco de ADN de la Flora Canaria (que contiene en la actualidad más de 5.000 muestras), y seatambién el único representante oficial de nuestro país en el CBOL, motivan la búsqueda de los mediosadecuados para dotar a este Departamento de investigación de los medios humanos y materialesnecesarios para llevar a cabo el proyecto de la caracterización molecular de la Flora Canaria con finesde investigación taxonómica, gestión y referenciación de la Biodiversidad vegetal endémica alArchipiélago.6. La difusión de los resultados a la comunidad científica es imprescindible para garantizar, no sólo,una mayor accesibilidad de los datos obtenidos por parte de otros especialistas en este tipo deestudios, sino además, para facilitar una más profunda discusión de los mismos.Por ello, se contempla la elaboración de una próxima publicación que incluya un análisis y discusiónmás detallados de los resultados, que se someterá a las revistas de mayor impacto en la utilización dedatos moleculares de secuencias de ADN para la caracterización de especies.Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581

CONSEJERIA DE MEDIO AMBIENTEJARDÍN BOTÁNICO CANARIO VIERA Y CLAVIJO- BIBLIOGRAFÍAHall TA (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis programfor Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.Kress, W.J. et al. (2005). Use of DNA barcotes to identify flowering plants. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA 102 (23): 8369-8374Caujapé-Castells, J., Jaén Molina, R., Cabrera-García, N. (2006) Manual del Banco de DNA delJardín Botánico Canario “Viera y Clavijo”. Distribuido por los autores.Caujapé-Castells, J., Jaén Molina, R., Cabrera-García, N. (2006) El Banco de ADN de La FloraCanaria: Creación, Progresos y Líneas Futuras de Desarrollo. Bot. Macaronesica 26: 3-16.Caujape-Castells, J, Jaén Molina R, Cabrera García N. (2006).The DNA Bank of the Canarianendemic Flora. BOTANY 2006: Meeting of the American Society of Plant Taxonomists celebrada enChico, California, (USA).Caujape-Castells, J, Jaén Molina R, Cabrera García N. (2006). La información Molecular, lamultidisciplinariedad y la conservación de la flora Canaria. Jornadas Científico-Técnicas de la Redde Bancos de Biodiversidad de la Flora Macaronésica. Las Palmas de Gran CanariChase MW, Cowan RS, Hollingsworth PM, van den Berg C, Madriñán S, Petersen G, SebergO, Jørgsensen T, Cameron KM, Carine M, Pedersen N, Hedderson TAJ, Conrad F, SalazarGA, Richardson JE, Hollingsworth ML, Barraclough TG, Kelly L, Wilkinson M (2007)A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants. Taxon 56 (2): 295–299.Newmaster SG, Fazekas AJ, Steeves RAD and Janovec J. (2007) Testing candidate plantbarcode regions in the Myristicaceae. Molecular Ecology NotesCowan RS, Chase MW, Kress WJ, Savolainen V. (2006) 300,000 species to identify: problems,progress, and prospects in DNA barcoding of land plants. Taxon. 2006; 55:611–616.Ratnasingham S, Hebert PDN.. (2007) BOLD: The Barcode of Life Data System( www.barcodinglife.org). Mol Ecol NotesHajibabaei M, Singer GAC, Hebert PDN, Hickey DA. (2007) DNA barcoding: how itcomplements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. Trends Genet.Kress, WJ and Erickson, DL (2008) DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics. PNAS,vol.105, n8.Bob Grant (2008) Barcoding the world's trees. The Scientist.com. http://www.thescientist.com/daily/2008/05/06/Camino del Palmeral 1535017 Las Palmas de Gran CanariaTel.: 928 219580 Fax: 928 219581