Congélation du sperme de verrat en paillettes fines de 0,25 ml

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INTRODUCTION
Au cours des dernières décennies, la conservation du sperme
de verrat à basse température a fait l’objet de nombreuses
recherches (POLGE et al., 1970; PURSEL et JOHNSON 1971,
1975; CRABO et EINARSSON, 1971; PAQUIGNON et al.,
1974; LARSSON et EINARSSON, 1976; WESTENDORF et
al., 1975; HAMMITT et al., 1989a, b). Celles-ci ont porté sur
la composition du dilueur, la nature et la concentration du
cryopréservateur ainsi que sur la méthode de congélation en
pastilles, en pailles (PAQUIGNON et al., 1986) et, plus
récemment, en paillettes (FISER et FAIRFULL, 1990) ou en
pochettes (BWANGA et al., 1991; RODRIGUEZ-MARTINEZ et
al., 1996). Bien que des progrès considérables aient été enregistrés
(ALMID et HOFMO, 1996), les résultats de fertilité et
de prolificité restaient encore souvent à la limite de la rentabilité
en raison des dommages encourus par les spermatozoïdes
pendant le processus de congélation-décongélation
(COURTENS et PAQUIGNON, 1985).
C’est pourquoi, en nous inspirant des résultats de ces
recherches déjà publiées, nous avons mis au point une technique
de congélation en paillettes françaises (IMV) médium de
0,5 ml qui soit réalisable sur le terrain avec un taux de réussite
proche de celui de la semence fraîche (THILMANT, 1997).
Les premières inséminations ont été réalisées en exploitations
durant les années 1995 et 1996 (THILMANT, 1999).
Pour rappel, le processus de décongélation des paillettes
médium doit s’effectuer par l’immersion de celles-ci (au
nombre de 5 pour l’obtention d’une dose) dans un bain-marie
à 55°C pendant 12 secondes en vue d’arriver le plus rapidement
possible à la température de 38°C (1170°C /min). Cette
façon d’agir permet de supprimer au maximum la stagnation
de la température pendant la période de fusion et d’éviter
ainsi le phénomène de recristallisation. Passé ce délai, le
contenu des paillettes est versé dans le BTS (95 ml pour
1 dose, milieu de décongélation) à 38°C. L’insémination est
alors réalisée le plus rapidement possible après la décongélation
et durant la période d’immobilité de la truie.
Ce processus de décongélation est relativement lourd et fastidieux
car il nécessite un chronométrage précis du temps de
l’immersion et la présence de 2 niveaux différents de températures
au même moment (55°C pour la température du
bain-marie et 38°C pour celle du BTS).
En vue de simplifier cette technique, nous proposons l’utilisation
des paillettes fines de capacité de 0,25 ml comme nouveau
conditionnement. La décongélation de la semence
serait facilitée car ces paillettes permettent une décongélation
tout aussi rapide dans un bain-marie à 38°C pendant un
temps indéterminé (au-dessus de 10 secondes) sans risquer
de donner une température excessive à la semence (comme
c’est le cas avec les paillettes médium de 0,5 ml si on procède
pendant un temps d’immersion trop long).
Il est donc nécessaire d’étudier l’efficacité du conditionnement
de la semence en paillettes fines qui simplifie le protocole de
décongélation assurant, ainsi, une pénétration plus rapide de
l’usage de la semence congelée au sein des exploitations.
1. MATÉRIEL ET MÉTHODES
1.1. Protocole de congélation-décongélation de
la semence en paillettes médium et fines
Celui-ci est effectué suivant la méthode du C.I.A.P. (THIL-
MANT, 1997). 28 éjaculats issus de 5 verrats différents de
race Piétrain Belge sont utilisés pour cette expérimentation.
Chaque éjaculat est conditionné en paillettes (IMV) médium
(0,5 ml) et fines (0,25 ml). Les deux modes de conditionnement
sont donc refroidis et congelés de façon identique. La
décongélation des paillettes moyennes est réalisée par l’immersion
de celles-ci dans un bain-marie à 55°C pendant
12 secondes (méthode 1, témoin). La décongélation des
paillettes fines est, quant à elle, effectuée dans un bain-marie
à 38°C pendant 1 minute (méthode 2). Le contenu de
1 paillette est ensuite directement redilué dans 10 ml de BTS
à 38° pour les paillettes médium et dans 5 ml pour les fines.
Nous avons étudié en outre et uniquement dans le cadre de
l’examen in vitro, les effets de la décongélation dans un
bain-marie à 38°C de la semence conditionnée en paillettes
médium (méthode 3).
1.2. Contrôle in vitro, par opérateur et après
décongélation, de la qualité de la semence
rediluée
Ont été réalisées :
• Une évaluation de la motilité et du pourcentage de spermatozoïdes
mobiles de la semence diluée à 38°C juste
après décongélation (grossissement 100 fois sur fond noir)
et après 1 heure.
Les spermatozoïdes ont été classés en 5 catégories:
5 = spermatozoïdes fléchants
4 = déplacements rapides et rectilignes des spermatozoïdes
3 = trajectoires curvilignes et/ou déplacements lents
2 = spermatozoïdes vibrants faibles déplacements
1 = spermatozoïdes vibrants en rotation sur euxmêmes
• Une coloration à l’éosine-nigrosine et examen microscopique
sur fond noir de 200 spermatozoïdes au grossissement
1000x en vue d’évaluer l’intégrité acrosomiale et le
pourcentage de spermatozoïdes vivants.
Nous avons aussi réparti les spermatozoïdes en 4 classes
(BAMBA, 1988):
classe 1 : non teintés et acrosomes normaux
classe 2 : teintés et acrosomes normaux
classe 3 : non teintés et acrosomes anormaux
classe 4 : teintés et acrosomes anormaux
1.3. Contrôle in vitro, par analyseur d’images
(computer assisted semen analysis - CASA)
Par la suite, d’autres essais comparatifs furent effectués avec l’aide
d’un analyseur d’images ou computer-assisted semen analysis
- CASA (Hamilton Thorne Research) visant à donner plus