Neuroscience 2fin - copie 1

PHYSIQUE CELLULAIREIntroduction à la Neurobiologie-2-Potentiel d’action et canaux ioniquesJean-Pierre HENRY18 Février 2010

Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003

Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963Travaux commencés à Cambridge en 1930et publiés en 1952Andrew Huxley est le demi-frère d’AldousHuxley (Le meilleur des mondes)• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003

Un matériel d’étude privilégié:l’axone de calmar• Le calmar possède une axonegéant impliqué dans le réflexede fuite• Le diamètre est de 0,5 mm• Plus le diamètre est grand, plusla conduction de l’influx estrapide

La préparation utilisée• A l’aide d’un rouleau encaoutchouc, on peutextruder le milieuintracellulaire, puisperfuser avec un milieusalin• On peut introduire uneélectrode dans leneurone; la préparationest équipotentielle (pasde propagation)• Par dépolarisation, onobtient des centainesde potentiels d’action,identiques à ceux duneurone initial(Kuffler et Nicholls (1976)

IonOrigine du potentiel de reposCytoplasmemMMilieuexternemMPotentieldeNernstmVK +400 20 -75Na + 50 440 +55Cl - 52 560 -60A - 385•Le potentiel de repos (V i - V o ) est de - 70 mV, voisin du potentiel deNernst de K +•Le potentiel de repos est fixé par la perméabilité aux ions de lamembrane•La perméabilité à K + est dominante

Origine du potentiel de repos• Si on varie laconcentration de K +extracellulaire, le potentielde repos varie• Mais il s’écarte de la loi deNernst à bassesconcentrations

Origine du potentiel de repos• La membrane n’est pas seulement perméable à K +• Il y a un courant entrant faible, associé à une faibleperméabilité à Na+• A l’équilibre, le courant sortant I K+ est égal aucourant entrant I Na+• Les ions Cl - se répartissent en fonction du potentielcréé par les cations• Le potentiel réel est donné par l’équation de!Goldman, Hodgkin et KatzE = 59log[ ] + PNa[ Nao] + PCl[ Cli][ ] + PNa[ Nai] + PCl[ Clo]Pk KoPk Ki!

La pompe à sodium• L’existence de courants I Na+ et I K+ impose la présence d’unepompe• Dans la membrane, une ATPase utilise l’ATP intracellulaire pourexpulser 3 ions Na +• La deuxième partie du cycle est le pompage de 2 ions K +• La pompe polarise négativement l’intérieur de la cellule• Il n’y a jamais de correspondance intérieur:extérieur

La pompe à sodium• Son activité est nécessaire pour maintenir les cellulesà un potentiel négatif• Elle est présente dans toutes les cellules, nerveusesou non• Son inhibition conduit à la mort cellulaire• Des substances végétales sont des inhibiteurs de lapompe: ouabaïne et digitaline• Ces poisons ont été utilisés à petites doses commestimulants cardiaques• Le « découvreur » de la Na,K ATPase, JC Skou areçu le Prix Nobel en 1997

Le potentiel d’action:hypothèse de base (1)• Un potentiel d’action estobtenu par dépolarisation• Au delà d’un seuil, lepotentiel monte rapidement àdes valeurs positives, puisdiminue• Les valeurs atteintes sontproches du potentiel deNernst de Na +• On peut faire l’hypothèsed’une augmentation de laperméabilité au Na + , induitepar la dépolarisation (B)

Le potentiel d’action:hypothèse de base (2)• L’augmentation de laperméabilité à Na + induit uncourant entrant• Ce courant entrant augmentela dépolarisation• En C, un deuxièmeévénement augmente laperméabilité relative au K + etpermet la restauration desconditions initiales• Ceci nécessite que lesgradients ioniques ont étépeu modifiés pendant lepotentiel d’action

Circuit électrique équivalent à un élémentde membrane• Les perméabilités sontéquivalentes à un générateur(gradient ionique) et uneconductance en série• La membrane a une capacitéC• V m est le potentielmembranaire• Les conductances g K et g Nasont variables avec lepotentiel V m

Formulation électrique du potentield’action• Les éléments de basesont:• Une augmentationexplosive de laconductance Na +• Une augmentationdécalée de laconductance K +

Mesures expérimentales:le voltage-clamp• La difficulté vient du lienentre conductance etpotentiel• On impose un potentiel etun amplificateur mesure ladifférence entre ce potentielet V m• Il injecte un courant pourque cette différencedisparaisse(Hodgkin et al(1952) JPhysiol,116, 424)

Les résultats (1)• On dépolarise depuis- 65 mV de 56 mV• On observe 3 phases• Courant capacitatifrapide• Courant entranttransient• Courant sortantretardé

Les résultats (2)• La même expérience (A)est faite en supprimant lesions Na + dans le milieuextérieur• Le courant entrant estsupprimé et seul subsiste lecourant K + (B)• Par différence, on obtient lecourant Na + (C )

Les toxines, des outils pharmacologiquesprécieux• Le Fugu (tétrodon) est un poissonconsommé au Japon• Mal préparé, il est mortel (plusieursdizaines des cas/an)• Il contient une toxine,tétrodotoxine, bloquant les canauxNa +

Séparation pharmacologique• Courants obtenus pardépolarisations à différentesvaleurs• A, courants complexes• B, traitement par latétrodotoxine: seuls les courantssortants (K + ) sont visibles• C, Lavage• D, traitement par le TEA, unbloquant des canaux Na +

Exploitation des résultats• Les conductances Na + et K +ont été mesurées à toutevaleur du potentiel imposé• On remarque quel’augmentation de laconductance Na + esttransitoire: elle est suivied’une inactivation• Des équations empiriquesdécrivant ces comportementsont été établies

Exploitation des résultats• A partir des équations empiriques, il est possible de retrouverla forme du potentiel d’action avec une bonne exactitude

Le Modèle Hodgkin-Huxley décrit bien lepotentiel d’action• L’existence d’un seuil critique correspond au point oùles courants entrants l’emportent sur les courantssortants• L’existence d’une valeur maximale correspond àl’ouverture différée des canaux K +• Après un potentiel d’action, il y a une périoderéfractaire où une dépolarisation est inefficace• Cette période réfractaire est due à la conductance g Ktoujours ouverte

Propagation du potentiel d’action• Les charges positivesentrantes (Na + ) déchargentla capacité membranaire, depart et d’autre• Cela induit unedépolarisation qui au seuilamorce le potentiel d’action• Propagation dans les deuxsens

Vitesse de propagation• Elle dépend des propriétés de cable de l’axone:résistances axiale et membranaire, capacité de lamembrane• La vitesse augmente si le diamètre augmente(diminution de la résistance axiale)• La vitesse de propagation varie de 1 à 100 m/s.• Les vitesses élevées s’observent dans les neuronesde fort diamètre• Dans les neurones myélinisés, l’axone est « isolé » etla conduction est rapide et saltatoire.

Neurone myélinisé• Une cellule, dite gliale,s’enroule autour de l’axone• Cette cellule a unemembrane riche en uneprotéine hydrophobe, lamyéline• Le long de l’axone la gainede myéline s’interrompt àdes points réguliers, lesnœuds de Ranvier

Conduction saltatoire• La gaine de myeline agit comme un isolant limitant lesmouvements de charge• La dépolarisation progresse par saut jusqu’auxnœuds de Ranvier où le potentiel d’action apparait

Conclusions• Les potentiels de repos sont dus à:– l’existence de gradients ioniques et pompes– des différences de perméabilité entre les ions• Le potentiel d’action est dû à:– La variation de conductance/perméabilité avec le potentiel– Na+ et K+ sont des « canaux excitables »• La conductance Na + augmente avec la dépolarisationet s’inactive très rapidement• La conductance K + augmente avec la dépolarisation• La théorie de Hodgkin-Huxley ne préjuge pas desmécanismes: transporteurs ou canaux

Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003

Un exemple de transport d’ion partransporteur: la valinomycineValinomycinVal-K + Val-K + K +OOK +OK +OOOValValHydrophobicmembrane• La valinomycine est un peptide cyclique extrait de champignons• Sa couronne (résidus hydrophobes) lui permet de s’insérer dansune bicouche• Les radicaux cabonyl chélatent spécifiquement un ion K+• La vitesse de passage est de l’ordre de 10 4 ions/s

Le « patch-clamp » permet de mesurerl’activité d’un canal unique• Le principe est d’isoler àl’extrémité d’une micropipetteun fragment de membraneportant des canaux ioniques• Plusieurs solutions existent• Le scellement entre lamembrane cellulaire et lapipette a une résistance del’ordre du Gigaohm• On mesure le courantpassant à travers le fragmentmembranaire à V constant(Hamill et al (1981) Pfugers Arch,391, 85)

Exemples d’enregistrement de canauxuniques• On observe des transitions entre 2 niveaux, représentant lecanal ouvert ou fermé (en D, canal double)• A et B sont des canaux K + , C un canal Na + et D un canal Cl -

Exploitation des donnéesexemple d’un canal dimérique• Tracé à différents potentiels• Mesure de la conductance• Mesure de la probabilitédes états en fonction dupotentiel imposé(Thieffry et al (1988) EMBO J,7, 1449)

Canal Na + de l’axone de calmar• En haut, canaux unitaires enréponse à une dépolarisation• Remarquez l’inactivation rapide• En bas, les enregistrementsd’une centaine de canaux ontété moyennés• L’enregistrement moyennécorrespond au courant entrantobservé macroscopiquement• Un courant de 1 pA correspondà 6 x 10 6 ions/s

Canal K + de l’axone de calmar• En haut, enregistrement decanaux individuels• En bas, moyennage d’unecentaine de canaux,analogue au courantmacroscopique• On n’observe pasd’inactivation dans l’échellede temps observée• Remarquez l’ouverture lentedu courant moyenné

Conductance des canaux Na +• Les mesures permettent d’obtenir la conductance ducanal et sa densité surfacique• D’autres canaux Na + ont été analysés• Pour le canal K + de neurone de calmar, γ = 6 pS avecune densité de 70

Sélectivité des canaux Na +• La perméabilité relativepar rapport au Na + a étémesurée pour unensemble d’ions pour lesdifférents canaux• D’une manière générale,la sélectivité est voisinede 20• Pour les canaux K + , lasélectivité est de 100

Questions et réponses• L’étude des canaux uniques permet de retrouver lespropriétés macroscopiques (activation par lepotentiel, inhibition, sélectivité)• Comment expliquer l’efficacité du transfert (voisin deslimites de la diffusion) et la grande sélectivité?• Les différents canaux Na + et surtout K + (plusieursdizaines, avec des propriétés différentes)correspondent-ils à des espèces moléculairesdifférentes?• Nécessité de caractériser biochimiquement lescanaux

Clonage des canaux Na + et K + :Isolement des gènes et production de la protéine• Canal Na + :– Purification de la protéine à l’aide des toxines (TTX)– Isolement du gène chez la torpille (laboratoire de ShosakuNuma, 1984)• Canal K + :– Analyse de mutants chez la drosophile– Le mutant shaker correspond à un canal K + (laboratoire deJan,1987)

Le canal Na + (sous-unité α)• Une très grosse chaîne polypeptidique (plus de 2000résidus)• Nombreuses traversées de la membrane cellulaire (24)• Un domaine répété 4 fois, contenant 6 hélices transmembranaires

Les canaux K +• La canal shaker possède 6hélices transmembranaires• Les 6 hélices sont organiséescomme un domaine du canal Na• Le canal K est composé de 4sous-unités identiques• D’autres canaux K ont 2, 3, 4, 5hélices dans leurs sous-unités• Les 2 hélices blanches (5 et 6)représentent la structureminimum des canaux de cettefamille (sensible au potentiel)

La famille des canaux sensible aupotentiel• Plus de 140 membres (Yu et al, 2005, PharmacolRev, 57, 387)

Propriétés moléculaires des canauxexcitables• Les canaux appartiennent à une même grandefamille• La structure minimale est composée de 4 sous-unitéscomportant chacune 2 hélices trans-membranaire• Le canal Na est vraisemblablement plus jeune,résultant d’une fusion de gènes• Tous les canaux K possèdent une séquencecommune de 8 acides aminés, placée entre leshélices 5 et 6: c’est la signature des canaux K

Propriétés fonctionnelles des protéinesrecombinantes• Le « truc » le plus populaire estd’introduire le « gène » (ARN)dans un ovocyte de grenouille(Xenopus)• Cette cellule exprime la protéine(canal) dans sa membrane• On peut alors mesurer l’activitéélectrique par « patch-clamp »ou « voltage-clamp »• Le gène peut être manipulé pourtester des protéines mutantes ouchimérique• Par exemple, le changementd’un acide aminé donne un canalNa résistant à la TTX

Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003

Roderick MacKinnon• Initialement formé comme électrophysiologiste,MacKinnon, après 10 ans de recherche, décide à 42ans, sans expérience de s’intéresser à la structureatomique des canaux K, avec une petite équipe• Chez les bactéries, des protéines membranairesportent la signature des canaux K.• Il entreprend la cristallisation du canal KcsA, deStreptomyces lividans, dont la sous-unité necomporte que 2 segment trans-membranaires

L’hypothèse initiale• D’après des expériences demutagénèse faites sur lecanal à 6 segments transmembranaires,la boucleentre les segments 5 et 6 estimportante pour la sélectivité• Cette boucle serait repliée àl’intérieur du pore

Structure atomique de KcsAExtérieur de la cellule• Le canal est vu de côté, lamembrane est coupée• Seules les hélices 6(extérieure) et 5 (intérieure)de 2 sous-unités sontmontrées• Les densités dans l’axe sontdes ions K +• Le canal est fermé; letroisième K + est dans unecavité centraleCytoplasme(Doyle et al, 1998, Science,280, 69)

Le problème de la sélectivité est résoluVue du canal en coupe: extérieur• Analyse plus fine des cations dansla protéine• 4 cations deshydratés sont visiblesà l’intérieur du canal• Un cinquième est rehydraté dans lacavité• La deshydratation est possible carles 4 ions sont coordinés à descarbonyl de la protéine• La coordination du Na+ deshydratéest impossible• Le Na + , bien que plus petit, nepasse pas(Zhou and MacKinnon, 2004, Biochemistry,338, 839)

Structure d’un canal K + bactérien ouvertAC• Canal de Methanobacterthermoautotrophicum (MthK)• A, MthK, Transmembranaires 5 et6 de deux sous-unités; le canalouvert est au milieu• B, KcsA : même échelle, le canalest fermé• C, Superposition de A et B: lafermeture est due à undéplacement de la partiecytosolique de l’hélice6• D, vue du dessus; le canal est lapartie centraleBD(Jiang et al, 2002,Nature,417, 523)

Le canal ouvert possède une cavitécentrale importante• Le canal MthK est vu depuisle cytoplasme• Le point vert est un ion K +engagé dans le filtre desélectivité• La cavité peut accueillir desmolécules de grande taille• Ces molécules sont desbloquants

Potentiel électrique à travers lamembrane• Le potentiel électrique a étécalculé pour KcsA (fermé) etMthK (ouvert)• L’ouverture du canal diminueénormément la dépenseénergétique requise pour lefranchissement de lamembrane

Conclusion sur les canaux à 2 hélices:sélectivité et perméabilité• 1- la cavité du canal ouvertdiminue l’épaisseur hydrophobeà franchir• 3- la disposition des O descarbonyl permet unecomplexation sélective de K +• 4- plusieurs ions en lignepeuvent occuper le filtre desélectivité• 2- les charges négatives àl’extrémité de l’hélice stabilise lecation dans la cavité

Le problème de la sensibilité au potentiel• Les canaux K + sont sensibles au potentiel: ilspassent de fermés à ouverts en 50 mV• Cela suppose un senseur de potentiel très chargé: aumoins 12 charges positives par canal• Les canaux à 4 x 2 hélices sont insensibles• L’hélice 4 porte au moins 4 charges (Arg) selon letype de canal: c’est un candidat senseur• En fait, les hélices 1 à 4 sont structuralementindépendantes de 5 et 6 (pore)• On peut faire des chimères en échangeant ces 2parties

Structure d’un canal K + à 6 hélicestransmembranairesExtérieurIntérieur• Ce canal est une chimèreentre deux canaux deneurones de rat• Vue en coupe: le pore estdans la partie centrale• Les charges positives(portées principalement parl’hélice 4) sont en rouge• Les domaines H 1 à H 4 etH 5 H 6 sont clairementindépendants(Long et al, 2007, Nature, 450, 376)

Modèle de sensibilité au potentiel• La structure obtenue est uncanal ouvert (a et c), b et dreprésentent la structurefermée hypothétique• On postule un basculementde S 4 , portant les chargespositives• Le mouvement transmis parl’hélice jaune appuie surl’hélice bleue S 6 qui decoudée devient droite• Le mouvement de S 6 fermele pore

Résumé de la potentiel-dépendance• Le modèle est en pagaïe (paddle): la pagaïe est l’hélice S 4qui passe d’un côté à l’autre de la membrane; cemouvement est transmis au pore qui se ferme• Le canal a les propriétés d’un transistor (F. Sigworth)