EKSPRESI PROTEIN FUSI TRIVALENSI YANG ... - Insentif Ristek

More documents

Recommendations

Info

0041: Wien Kusharyoto dkk. mengurangi tingkat kolonisasi dan pembuangan E. coli O157:H7 dapat pula berpotensi dalam menurunkan insiden dari penyakit-penyakit pada manusia yang disebabkan oleh E. coli O157:H7. Intimin merupakan salah satu protein membran dari sel E. coli O157:H7; sebuah protein adhesin, yang diperlukan untuk proses pelekatan dan pemisahan, maupun dalam pengikatan sel bakteri pada sel mamalia dan mucosa usus dari ternak [3]. Intimin merupakan produk dari gen eae (E. coli attaching and effacing) yang terkandung dalam sebuah pulau pathogenisitas (pathogenicity island) yang disebut sebagai locus of enterocyte effacement (LEE) [4]. Bagian Cterminal dari intimin berikatan dengan protein reseptor yang berasal dari bakteri tersebut, yaitu Tir (translocated intimin receptor), sehingga menciptakan pengikatan yang erat antara sel bakteri dengan permukaan sel mamalia. Dengan demikian, intimin dianggap sebagai salah satu kandidat potential dalam pembentukan vaksin untuk mencegah transmisi dari E. coli O157:H7. Telah ditunjukkan oleh beberapa studi bahwa antibodi yang spesifik terhadap intimin berperan penting dalam mencegah pengikatan bakteri pada sel inang dan melindungi sel inang dari penyakit yang ditularkan oleh E. coli O157:H7. EspA (E. coli secreted protein A), faktor virulensi lainnya dari EHEC, merupakan protein yang disekresikan oleh E. coli dan membentuk struktur filamen pada permukaan sel EHEC. EspA adalah salah satu dari sistem sekresi tipe III (type III secretion system atau TTSS) dan mentrans-lokasikan Tir ke sel epithel dari inang. Protein EspA juga dianggap sebagai kandidat potensial dalam pengem-bangan vaksin terhadap EHEC [5]. Melalui TTSS, Tir ditranslokasikan ke dalam plasma membran dari sel inang, dan kemudian berfungsi sebagai sebuah reseptor bagi intimin. Interaksi intimin-Tir menyebabkan akumulasi skeletal di bawah area pengikatan bakteri dengan sel inang. Dalam serum dari hewan yang terinfeksi oleh EHEC terkandung antibodi yang spesifik terhadap Tir. Dengan demikian pengenalan Tir oleh antibodi dapat pula berperan penting dalam mencegah pengikatan bakteri pada sel inang melalui pencegahan interaksi antara Tir dengan intimin [6]. Sebelumnya, vaksinasi untuk mencegah kolonisasi EHEC terutama dikembangkan dengan menggunakan protein intimin atau fragmennya sebagai komponen utama vaksin. Intimin digunakan sebagai protein tunggal dalam vaksinasi [2,7] atau dikombinasikan dengan protein lain yang disekresikan oleh E. coli ( E. coli secreted proteins atau Esp) ]8]. Percobaan terakhir dalam vaksinasi terhadap EHEC telah menggunakan protein rekombinan trivalensi yang terdiri dari EspA, intimin and Stx2 [9]. Respon kekebalan humoral yang kuat pada mencit menunjukkan bahwa vaksin multivalensi dapat lebih efektif digunakan sebagai vaksin terhadap EHEC daripada vaksin yang hanya terdiri dari KO-157 protein tunggal. Protein trivalensi tersebut diekspresikan di E. coli sebagai inang. Dalam kegiatan penelitian ini dikembangkan protein fusi rekombinan yang tersusun dari fragmen immunogenik EspA, Intimin dan Tir untuk digunakan sebagai antigen untuk vaksinasi. Pertimbangan utama dari pembentukan protein fusi trivalensi tersebut adalah untuk meningkatkan sifat immunogenik dari antigen/vaksin dalam menginduksi respon kekebalan pada hewan model, di samping untuk menghindari pembentukan protein antigen secara terpisah agar dapat menghemat biaya dan mempermudah proses produksi. II. METODOLOGI A. Konstruksi vektor ekspresi pJE-IncentA Sekuen gen yang menyandi protein Intimin, EspA dan Tir diperoleh dari GenBank berdasarkan pada sekuen genom E. coli O157:H7 galur Sakai dengan nomor akses NC_002695.1. Sekuen asam amino dari fragmen immunogenik Intimin (Intimin282), EspA (EspA128) dan Tir (Tir103) ditentukan berdasarkan data yang terdapat di literatur [3]. Gen penyandi ketiga fragmen tersebut dioptimisasi penggunaan codonnya untuk ekspresi di E. coli dengan perangkat lunak GeneDesigner (DNA2.0). Gen penyandi EspA128 dan Intimin282 digunakan untuk mengkonstruksi gen penyandi protein divalensi EspA128/Intimin282 dengan rantai peptida penghubung (linker) LA(EAAAK)4AAA di antaranya [10]. Gen penyandi protein EspA128/ Intimin282 disintesis oleh DNA2.0 (Menlo Park, CA) dan diklon ke dalam vektor ekspresi pJExpress404, sehingga diperoleh vektor pJE-IncentA. Gen penyandi protein Tir103 yang telah dioptimisasi penggunaan codonnya untuk ekspresi di E. coli disintesis oleh ShineGene (Shanghai, China). Gen penyandi Tir103 kemudian diklon ke dalam vektor pJE-IncentA dengan menggunakan situs restriksi NotI dan XhoI yang tersedia, sehingga diperoleh vektor pJEIncentA yang mengandung gen EspA128/Intimin282/ Tir103. Di ujung 5’ dari gen tersebut terdapat sekuen penyandi peptida sinyal pelB dari Erwinia carotovora, sedangkan pada ujung 3’ terdapat sekuen penyandi His6-tag. Hasil kloning tersebut diverifikasi dengan sekuensing DNA serta pemotongan secara enzimatik yang dilanjutkan dengan agarose-elektroforesis. B. Ekspresi protein fusi EspA128/ Intimin282/Tir103 di E. coli Vektor ekspresi pJE-IncentA yang mengandung gen penyandi EspA128/ Intimin282/Tir103 ditransformasikan ke dalam E. coli JM109 dengan kejut panas (heat-shock). Satu koloni bakteri yang mengandung pJE-IncentA diinokulasikan ke dalam 3 mL SB (Super-Broth)-medium (dengan 100 μg/ml ampicillin), lalu diinkubasi selama 18 jam pada suhu 37°C dan 200 rpm. Komposisi SB-Medium adalah
KO-158 0041: Wien Kusharyoto dkk. sebagai berikut (dalam g/l): 20 g Trypton; 10 g ekstrak ragi; 10 g NaCl; 33 ml 1,5 M K2HPO4; 5 ml 1 M MgSO4 dan 10 ml glukosa 50%. Sebanyak 2 ml kultur bakteri tersebut diinokulasikan ke dalam 100 ml SB- medium yang mengandung 100 μg/ml ampicillin, lalu diinkubasi pada suhu 37°C dan 200 rpm selama 3 jam (OD600nm = 0,5–0,7). Ekspresi protein EspA128/Intimin282/Tir103 dalam sel E.coli JM109 diinduksi dengan penambahan 100 μl IPTG, dan kultur sel diinkubasi lebih lanjut selama 4 jam. Setelah sentrifugasi pada 5000×g selama 15 menit, pellet sel yang diperoleh disimpan pada suhu –35°C. C. Purifikasi protein fusi EspA128/ Intimin282/Tir103 Setelah penyimpanan selama semalam pada suhu −35ºC, sel beku tersebut dicairkan pada suhu 4°C, lalu disuspensikan ke dalam 10 ml larutan natriumfosfat (50 mM, 300 mM NaCl, pH 7,2). Ke dalam suspensi sel tersebut kemudian ditambahkan larutan lysozyme (konsentrasi akhir 0,2 mg/ml) dan diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit. Setelah itu suspensi sel disonifikasi 4 × 30 detik pada suhu 0ºC (dalam es). Dengan kondisi tersebut membran terluar E. coli dapat terbuka untuk membebaskan protein EspA128/Intimin282/Tir103 dan komponen protein lainnya dari periplasma E. coli. Suspensi tersebut disentrifugasi pada suhu 4°C dan 10.000×g selama 15 menit. Kolom kromatografi untuk purifikasi protein disiapkan dengan memasukkan 2 ml resin TALON (Clontech) ke dalam kolom PD-10 (GE-Bioscience). Resin TALON dalam kolom PD-10 tersebut mampu mengikat sekitar 4 mg protein yang mengandung His6-tag. Resin tersebut diekuilibrasi dengan 12 ml larutan ekulibrasi (50 mM, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7,2). Sebanyak 10 ml ekstrak sel E. coli diaplikasikan ke dalam IMAC dan kemudian dicuci dengan 2 x 12 ml larutan ekuilibrasi yang mengandung 40 mM imidazole. Protein EspA128/ Intimin282 yang terikat pada matriks TALON dielusi dengan larutan elusi (50 mM, 300 mM NaCl dan 150 mM imidazole, pH 7,2). Fraksi elusi ditampung setiap 1 (satu) ml. D. SDS-PAGE dan Western blot Ekspresi dan purifikasi protein EspA128/Intimin282/Tir103 diverifikasi dengan SDS-PAGE [11]. Protein yang telah dipurifikasi kemudian dianalisis lebih lanjut dengan Western blot dengan menggunakan HisDetector Western Blot Kit, HRP Colorimetric (KPL, Gaithersburg, MD) berdasarkan instruksi yang diberikan. III. HASIL DAN PEMBAHASAN Berbagai tipe vaksin untuk mencegah kolonisasi dan pelepasan bakteri penyebab diare berdarah E. coli O157:H7 sebelumnya telah diproduksi dan dievaluasi pada mencit maupun hewan ternak sebagai kandidat vaksin. Vaksinvaksin yang terbentuk terutama berbasis pada protein- protein yang disandi oleh gen yang terdapat dalam locus spesifik yang disebut sebagai LEE yang memegang peran kunci dalam kolonisasi oleh E. coli O157:H7 di usus hewan ternak [12]. Sebelumnya telah ditunjukkan, bahwa immunisasi dengan kombinasi dari protein tunggal EspA, Intimin dan Tir mampu membentuk respon kekebalan terhadap E. coli O157:H7 [13]. Dalam penelitian ini dibentuk protein fusi rekombinan trivalensi EspA128/ Intimin282/Tir103 yang dapat dimanfaatkan sebagai kandidat vaksin untuk pencegahan. Berdasarkan penjajaran sekuen asam amino penyusun protein EspA, Intimin dan Tir, dengan ClustalX (data tidak ditampilkan), terdapat derajat konservasi sekuen yang tinggi dari berbagai galur E. coli O157:H7, sehingga dipilih sekuen asam amino penyusun ketiga protein tersebut dari E. coli O157:H7 galur Sakai sebagai acuan untuk mengkonstruksi sekuen protein fusi. Dalam mendisain gen sintetik penyandi protein fusi, fragmen pertama dari protein fusi adalah fragmen dari EspA yang terdiri atas 128 asam amino C-terminal dari EspA, dan disebut sebagai EspA128. EspA128 tersebut terletak di bagian luar dari permukaan sel bakteri serta menunjukkan respon immunogenik yang tinggi [14]. Dalam mendisain fragmen kedua, hanya 282 asam amino C-terminal dari Intimin yang digunakan (Tir282), karena 282 asam amino tersebut terlibat langsung dalam pengikatan oleh reseptor intimin Tir (translocated intimin receptor) [15]. Bagian dari Tir yang terlibat dalam pengikatan intimin juga telah dipetakan, yaitu asam amino 258 sampai dengan 361 dan disebut sebagai Tir103 [16]. Berdasarkan karakteristik struktur dari ketiga fragmen protein tersebut, diputuskan bahwa Intimin282 akan dikonjugasikan dengan C-terminal dari EspA128, sedangkan Tir103 dihubungkan dengan Cterminal dari Intimin282. Agar fragmen EspA128 Intimin282 dan Tir103 dalam konstruksi protein fusi tetap terpisah satu sama lain secara efektif sehingga fungsi immunogenik masing-masing tetap terjaga, maka di antara ketiga fragmen tersebut ditambahkan rantai peptida penghubung (peptide linker) yang membentuk rangkaian struktur α-Helix, seperti ditunjukkan oleh rantai A(EAAAK)nA [17]. Sebelumnya telah ditunjukkan bahwa rantai peptida penghubung LA(EAAAK)nAAA dapat secara efektif memisahkan protein fusi antara EGFP (enhanced green fluorescent protein) dan EBFP (enhanced blue fluorescent protein) [10]. Oleh karena itu, rantai peptida LA(EAAAK)4AAA dipilih sebagai rantai penghubung antara EspA128, Intimin282 dan Tir103. Gambar 1: Diagram vektor ekspresi pJE-IncentA untuk ekspresi protein fusi EspA128/Intimin282/Tir103 di E. coli Gen penyandi protein fusi tersebut dioptimisasi penggunaan codonnya untuk ekspresi di E. coli, disintesis dan diklon ke dalam vektor pJExpress404 untuk
Page 1: KO-156 0041: Wien Kusharyoto dkk. E
Page 5: KO-160 0041: Wien Kusharyoto dkk. P

EKSPRESI PROTEIN FUSI TRIVALENSI YANG ... - Insentif Ristek

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?