west nile e usutu - Spacs.unina.it

Virosi Aviari Emergenti:
Rischio Zoonosico
Prof. Alessandro FIORETTI
Facoltà di Medicina Veterinaria
Univesità di Napoli Federico II

West Nile Disease
Prof. Alessandro FIORETTI
Facoltà di Medicina Veterinaria
Univesità di Napoli Federico II

Flaviviridae
Flavivirus
Singolo filamento di RNA
Correlato a:
- encefalite Saint Louis,
- encefalite giapponese,
- encefalite Murray Valley,
- Kunjin virus
Infetta uomini, uccelli,
zanzare, cavalli,
altri mammiferi
L’agente

Storia
1937: West Nile District, Uganda
1950
− Egitto
Ecology studied
Disease varies
− Israele
1951-54
1957
- Meningoencefalite negli anziani

Storia
1962, 2000: Francia
1973-74: Sud Africa
1996: Romania
Prima epidemia in
area urbana industrializzata
1998: Italia
1999
Russia
Stati Uniti, New York
- Prima segnalazione nell’emisfero ovest

Stati Uniti - 1999
New York
− 62 casi
− 7 morti
− Uccelli da zoo, corvi,
cavalli
St. Louis Encephalitis virus
primo sospettato
Simile al ceppo virale
trovato in Israele

Modi possibili di introduzione del West
Nile Virus negli USA
Ospiti infetti (uomo)
Ospite vertebrato trasportato dall’uomo
- Legale
- Illegale
Vettore(i) trasportato dall’uomo
Ospite vertebrato (uccelli) trasportato dalle
tempeste
Introduzione intenzionale

Diffusione di WNV negli USA: 1999-2002

Distribuzione mensile di WNV: 1999-2001

Distribuzione dei casi di WNV in base
all’età : 1999-2001

WNV negli USA, Uomini
Anno Casi Morti
1999 62 7
2000 21 2
2001 66 9
2002 4156 284
2003 9862 264

WNV negli USA: 2003

WNV negli USA: 2010

WNV Equini: 2002

WNV Equini: 2010

WNV Animali positivi, 2003
Casi USA
− 4,554 equini
− 30 cani
− 17 scoiattoli
− 1 gatto
− 32 specie animali
non identificate

Ecologia e Trasmissione

Ospiti amplificatori
Uccelli
Vettori
Culex sp., Aedes sp.,
Ochlerotatus sp.
Trasmissione
Ospiti occasionali
Uomo, cavallo, e
altri mammiferi

Ecologia e Trasmissione
Vettore primario
Culex spp.
− 43 specie
Ma anche Aede spp.
Isolato
sporadicamente dalle
zecche
− Asia, Russia
− Ruolo non chiaro nella
trasmissione

Culex pipiens

Culex restuans

Culex salinarius

Aedes vexans

In Italia nell’estate 2009
2 pool di zanzare sono risultate
positive sia a WND e USUV
Aedes albopictus

Ecologia e Trasmissione
Zanzare infette nel
periodo invernale
Trasmissione
transovarica
Uccelli
− Contatto
− Migrazione

Trasmissione nell’Uomo
In laboratorio
− Lacerazioni durante necroscopie
− Punture con aghi
Emotrasfusioni
− 23 casi in 2002
− Monitoraggio implementato nel 2003
737 presunti donatori viremici di West Nile
2 casi associati a trasfusioni

Trasmissione nell’Uomo
Trapianti d’organo
− 4 casi documentati da 1 donatore d’organo
− Un donatore d’organo ha ricevuto sangue da
un donatore viremico
Trasmissione transplacentare
− WNV 27a settimana di gravidanza
Allattamento
− Una madre ha ricevuto sangue infetto
− Neonato positivo a WNV

Malattia nell’uomo

Malattia nell’uomo
Incubazione: 3-14 giorni
− 80% asintomatica o simil-influenzale
− 20% febbre, debolezza, emicrania, mialgia,
nausea, vomito
Sintomi ultimi 3-6 giorni
Rash maculo-papulare
Frequente nei bambini
Recenti epidemie: menigoencefaliti

Malattia nell’uomo
Meno dell’1% (1:150) infetto
− Sviluppa grave malattia
Con segni neurologici
− Encefalite (meningoencefalite)
Febbre, disorientamento, atassia, tremori,
rigidità cervicale, ± coma
− Debolezza muscolare fino a paralisi flaccida
delle estremità

Diagnosi nell’uomo
Monitoraggio anticorpale
− Siero o Liquido cerebro-spinale
− IgM capture ELISA (MAC-ELISA)
Entro 8 gg.
− Aumento del titolo Ac di 4 volte o superiore
Acuto/convalescente – a distanza di 3 settimane
Forte evidenza dell’infezione
− IgM in LCS suggerisce l’infezione del SNC
− Cross-reattività con altri virus

Diagnosi nell’uomo
Plaque reduction neutralization test
− Per differenziare le cross-reattività
− CDC test per indentificare gli stadi iniziali
− Test negativi
Raccolta entro 14 gg dall’esordio della malattia
Riconferma
Durata dell’immunità
− IgM possono persistere nel sangue 6 mesi o più
− Fino a 16 mesi nel LCS

Trattamento nell’uomo
No terapia specifica
Cure di supporto
Ribavirina?
Interferone alfa-2b?
Vaccino in fase di prova
è stato dimostrato che la somministrazione passiva di
anticorpi prodotti da donatori selezionati ha dato
risultati promettenti nei modelli animali.

WNV negli Animali
Cavalli (*) Orso bruno Pipistrelli
Capre (*) Lupo (*) Lama (*)
Pecore (*) Alpaca (*) Bovino (*)
Cane (*) Capra delle montagne Foca (*)
rocciose
Coniglio Alligatore (*) Gatto (*)
Scoiattolo
striato
Puzzola
Coccodrillo (*)
Scoiattolo grigio (*) Cervo

Segni clinici nella fauna selvatica
Uccelli
− Solitamente trovati morti (es. Corvidi)
Pipistrelli, scoiattoli striati, puzzole e
conigli domestici
− La maggioranza non sviluppa segni clinici
Scoiattolo grigio
− Letargia, vocalizzazioni, atassia, movimenti
di maneggio, encefalite, miocardite

Segni clinici nei grandi animali
Bovino
− Progressiva atassia fino alla paralisi
Alpaca, pecora, capra
− Febbre, nistagmo, torcicollo, atassia
− Vocalizzazioni
− L’alpaca presenta moderata
meningoencefalite non-suppurativa

Segni clinici nei piccoli animali
Cani e gatti
―Raramente mostrano segni di malattia
• Febbre, depressione
• Debolezza muscolare, spasmi
• Paralisi, miocarditi
Lupo - 1 caso
− 3 mesi di età, animale da zoo, segni nervosi
Sospetto di WNV negli animali che
mostrano segni neurologici e cardiaci

Segni clinici nei piccoli animali
Cani e gatti infettati sperimentalmente
− Puntura di zanzara: cani
Tutti i cani mostravano viremia, no segni clinici
− Puntura di zanzara: gatti
Tutti i gatti mostravano viremia
Quasi tutti mostravano moderati segni clinici
− Predazione: gatti
Tutti i gatti sviluppavano viremia
Nessuno mostrava segni clinici
Conclusioni: si infettano rapidamente,
ma non sono ospiti amplificatori

Segni clinici nei cavalli
Paralisi delle labbra,
muscoli facciali, o
lingua
Torcicolo, difficoltà
deglutizione
Alterata mentazione
Iperacusia
Cecità
Depressione
Simil-influenzale,
anoressia,
depressione
Contrazione
muscolare e cutanea
Iperestesia
Debolezza, atassia
Decubito

Diagnosi e Trattamento nei cavalli
Diagnosi
− Sierologia
Sieropositivo e non vaccinati =
infezione da WNV
Immunità
− Molti mesi
Effettuare necroscopie con dovute
precauzioni
Terapia di supporto

Vaccino nei cavalli
Vaccino pienamente approvato
−Novembre 2002
−Vaccino spento
−2 dosi
Distanziato di 3-6
−Richiamo annuale
−Ristretto uso veterinario

WEST NILE DISEASE NEL BACINO DEL
MEDITERRANEO 2010
La West Nile Disease è stata segnalata tra luglio e novembre 2010
in diversi paesi del Bacino del Mediterraneo sia negli animali sia
nell’uomo.
Gli Stati coinvolti dai focolai sono:
Bulgaria, Grecia, Israele, Italia,
Marocco, Portogallo, Romania,
Russia, Spagna, Turchia, Ungheria.

Situazione Bacino delMeditarraneo
Il ciclo di trasmissione della WND è intimamente legato:
componenti biotiche dell'ecosistema (uccelli selvatici, zanzare,
animali domestici)
componenti abiotiche (variabili climatiche, tipologia di suolo ecc.),
che influenzano la distribuzione e l'andamento dell'infezione.
La malattia ha un chiaro trend stagionale nei Paesi del Bacino del
Mediterraneo ed i focolai si verificano generalmente in prossimità
di aree umide (per es. delta dei fiumi) dove spesso una maggiore
densità di uccelli coesiste con una elevata abbondanza di vettori.

Situazione epidemiologica in Italia
Sorveglianza
La WND è ricomparsa in Italia per il terzo anno consecutivo
interessando sia territori coinvolti dalla circolazione virale nel
2008–2009 (Veneto, Emilia Romagna, Molise), sia territori in
precedenza non colpiti (Sicilia).

Sorveglianza
Ai sensi del Decreto Dirigenziale 15 settembre 2009 la
sorveglianza nei confronti della West Nile Disease (WND) si
basa sulle seguenti componenti:
sorveglianza su uccelli stanziali di specie “sinantropiche”.
In caso di mancato raggiungimento del 50% delle attività
previste, è possibile, in alternativa, attuare la sorveglianza su
allevamenti avicoli rurali o all’aperto o tramite il posizionamento
di gruppi di polli sentinella;
sorveglianza negli equidi;
sorveglianza entomologica;
sorveglianza dell’avifauna selvatica di specie migratorie.

Sorveglianza
Per il 2010 sono state individuate 3 aree
geografiche distinte (Fig. 1):
A. area con circolazione virale (ACV); è
l’area che è stata interessata dalla
circolazione del West Nile virus (WNV) nel
corso del 2009;
B. area di sorveglianza esterna alla ACV
(AE), estesa per un raggio di 20 km intorno
ai casi verificatisi nelle zone più esterne
dell’ACV;
C. undici aree a rischio (AR).

Situazione epidemiologica in Italia
Sorveglianza
Ad oggi, sono stati confermati dal Centro di Referenza
Nazionale per lo Studio delle Malattie Esotiche (CESME):
una positività alla PCR su organi di un esemplare di ghiandaia
(Garrulus glandarius) catturato in provincia di Modena;
nove positività alla PCR di altrettanti pool di zanzare
catturate in provincia di Venezia, di Rovigo e di Modena;
quarantacinque focolai di WND negli equidi distribuiti nelle
province di Trapani, Venezia, Campobasso (primo in Molise),
Bologna.

Situazione epidemiologica in Italia
Sorveglianza
La sorveglianza negli equidi viene effettuata tramite l’esame
periodico di equidi sentinella e la verifica di casi sospetti di WND.
Tali attività di sorveglianza hanno permesso
di confermare 45 focolai di WND negli equidi
41 in provincia di Trapani;
2 in provincia di Venezia;
1 in provincia di Campobasso;
1 in provincia di Bologna.
Equidi

Situazione epidemiologica in Italia
Sorveglianza
La sorveglianza su uccelli stanziali appartenenti a specie
sinantropiche è effettuata per evidenziare precocemente la
circolazione virale.
Ad oggi, una ghiandaia (Garrulus
glandarius) catturata in provincia di
Modena il 4 agosto 2010 è risultata
positiva alla PCR
Uccelli

Situazione epidemiologica in Italia
Sorveglianza
Specie Avicole
La sorveglianza sugli avicoli è effettuata come alternativa alla
sorveglianza sulle specie sinantropiche.

Situazione epidemiologica in Italia
Sorveglianza
L’attività entomologica ha lo scopo di determinare la
composizione della fauna culicidica, di individuare le specie di
zanzare responsabili della trasmissione del WNV sia nel ciclo
enzootico che epizootico della malattia.
I pool di zanzare sono
analizzati tramite PCR
Zanzare

Riduzione dei vettori
Protezione del personale
Controllo biologico
Larvicidi
Adulticidi
Controllo zanzare

Riduzione delle fonti
Eliminare i siti larvali
Controllo zanzare
− Vasche, pozzanghere, piscine abbandonate

Riduzione delle fonti
Rendere i siti inospitali per la
replicazione larvale
Educazione pubblica
Controllo pozzanghere
− Scarichi fognari, drenaggio
Controllo zanzare

Protezioni per il personale
Controllo zanzare
Ridurre i tempi all’aria aperta
- Specialmente nelle ore serali
Indossare pantaloni e maniche
Usare repellenti per zanzare
Non impiegare insetticidi sugli animali
Assicurarsi che i vetri delle finestre siano intatti
Usare luci antizanzara all’esterno

Controllo zanzare
Controllo biologico
Utilizzare predatori che si nutrono di larve e pupe
- Gambusia
- Gambusia affinis, G. holbrooki
Altri agenti sono stati usati ma non sono facili da
reperire
- Funghi, protozoi, nematodi
Copepodi

Larvicidi
Controllo zanzare
Impiegare quando è impossibile usare il controllo
biologico e/o la riduzione delle fonti
Più efficaci e target-specifici
Applicare a piccole aree geografiche
Adulticidi
Quando altre misure di controllo non
hanno successo
Meno efficaci

Sorveglianza
Necroscopie uccelli morti
Gruppi di polli sentinella
Raccolta zanzare
−Test di isolamento virale
−Campioni per specie
Larve ed adulti di zanzare
−Mappatura
−Registrazione delle catture

Biosicurezza
Precauzioni per zanzare
- repellenti, maniche lunghe, etc
Indossare guanti per raccogliere uccelli morti
Lavare le mani dopo manipolazioni
Quando possibile manipolare le carcasse sotto cappe
di biosicurezza durante le necroscopie

Quindi..
L'aumento dei casi di WND rilevati in Europa e nel bacino
del Mediterraneo sia nell'uomo sia negli equidi testimonia
la grande capacità di diffusione del virus della WND, in
grado di coinvolgere nuovi territori e popolazioni di ospiti
recettivi.
Data l'importanza di tale Zoonosi, ulteriori
approfondimenti sono necessari per chiarire i motivi
ecologici ed epidemiologici che sono alla base della
comparsa/ricomparsa dell'infezione in questi territori.
È inoltre necessario incrementare le attività di
sorveglianza al fine di monitorare la diffusione del WNV e
adottare adeguate e tempestive misure per la salvaguardia
della salute pubblica.

USUTU

Definizione
USUTU
Malattia trasmessa da zanzare sostenuta da
un virus identificato come USUTU virus
(USUV), membro del sierogruppo del virus
dell’encefalite giapponese (JEV) entro la
famiglia FLAVIVIRIDAE

Eziologia
Flavivirus
Sferici
Provvisti di envelope
40-60 nm di diametro
Singolo filamento di RNA
Virione con 3 proteine strutturali:
- del capside (C)
- di membrana (M)
- dell’envelope (E)
USUTU

Eziologia
USUTU
Mediante studi di cross-neutralizzazione con antisieri
policlonali i Flavivirus sono stati suddivisi in 8 complessi
antigenici.
In base alle omologie nucleotidiche e all’albero
filogenetico il genere Flavivirus è stato segregato in 14
clades appartenenti a 3 cluster.
USUTU virus è stato classificato nel gruppo del virus
dell’encefalite Giapponese del cluster mosquito-borne.

Eziologia USUTU
Tale cluster comprende inoltre:
Cacipacore virus (CPCV), Koutango virus (KOUV), JEV,
Murray Valley encephalitis virus (MVEV), Alfuy virus
(ALFV), St Luis encephalitis virus (SLEV), WNV, Kunjin
virus (KUNV), Yaounde virus (YAOV)

Storia
USUTU
Il primo isolamento di USUV è avvenuto nel 1959 da un
pool di zanzare (Culex univittatus) in sud Africa.
Il virus isolato venne registrato sotto il numero di
referenza SA Ar 1776.
Il virus era strettamente correlato al virus West Nile
ma antigenicamente distinto e il nome USUTU venne
dato in relazione al nome del fiume presso il quale
vennero raccolte le zanzare.

Storia
In seguito il virus venne isolato anche da altre
specie di zanzare:
Coquillettidia aurites, Culex spp., Culex perfuscus,
Aedes minutus, Mansonia africana.
Recentemente è stato isolato da Aedes albopictus o
zanzara tigre
USUTU

Storia
Oltre alle zanzare, il virus venne isolato da almeno 3
specie di uccelli stanziali africani:
Tordo del Kurrichane
Little greenbul
Bucero fischiatore
USUTU

Storia
USUTU
Il primo isolamento da mammiferi avvenne in un ratto
africano del genere Praomy spp.
Successivamente da un uomo con febbre e rash
cutanei nell’Africa centrale.

Primo isolamento di Usutu
virus associato a mortalità
in uccelli in Austria
Nel periodo Agosto/Settembre 2001, si osservò in
Austria, la morte di un notevole numero di merli.
Contemporaneamente 5 allocchi vennero trovati morti
nello zoo di Vienna.
Questa mortalità inusuale di varie specie di uccelli
ricordò l’epidemia da WNV che avvenne negli USA.
Indagini patologiche e virologiche sull’episodio austriaco
dimostrarono USUV come agente causale.
Primo episodio di USUV fuori dai confini africani.
USUTU

Primo isolamento di Usutu
virus associato a mortalità
in uccelli in Austria
Nell’anno seguente su 72 uccelli analizzati vennero
trovati positivi ad USUV:
28 merli
1 cinciarella
1 passero domestico
Contemporaneamente si osservò una
drastica diminuzione della popolazione
di merli a Vienna ed aree circostanti.
USUTU

Analisi genomica e
caratterizzazione del ceppo
USUV austriaco
Mediante RT-PCR e sequenziamento del genoma virale si
è ottenuta la completa sequenza genomica di USUV
isolato in Austria.
La sequenza genomica venne comparata con il ceppo di
referenza africano SA Ar 1776:
Omologia nucleotidica del 97%
Omologia aminoacidica del 99%
Comparato con gli altri Flavivirus la più alta omologia si ebbe
con i virus del gruppo JEV:
MVEV (73%), JEV (71%), WNV (68%)
USUTU

Albero
filogenetico
basato sulla correlazione
della sequenza genomica tra
Flavivirus
USUTU

Trasmissione L'USUTU virus è trasmesso dalle zanzare
(principalmente complesso Culex pipiens)
e infetta soprattutto gli uccelli selvatici

Sintomatologia
Malattia clinica solo in alcune specie di uccelli selvatici
Di solito si ha morte improvvisa
Quando presenti:
- Apatia
- Piumaggio arruffato
- Incoordinazione dei movimenti
- Incapacità al volo
- Morte entro 2-24 ore
USUTU

Mortalità
USUTU
L'USUTU virus può portare elevata mortalità
negli ucceli, specialmente nei merli
(Turdus merula)

Necroscopia
H = cuore L = fegato
Epatomegalia
Lesioni miocardiche

Necroscopia
Enterite sieromucosa
Splenomegalia
Stomaco repleto
S = milza L = polmoni P = stomaco ghiandolare I = intestino

Metodi diagnostici
Esame necroscopico
- Spleno ed epatomegalia, stomaco repleto ed enterite
sieromucosa
Esame istologico
- Necrosi neuronale multifocale, noduli gliali nel cervello,
degenerazione miocardica, splenite ed epatite necrotica
USUTU
Isolamento virale
- Colture cellulari (VERO PK-15, fibroblasti di oca) non umane
- Inoculazione sacco allantoideo di uova embrionate di oca
- Inoculazione intracerebrale di topi lattanti
- Immunoistochimica
- Ibridazione in situ
- RT-PCR

Metodi diagnostici
Sierologia
ELISA
Immunofluorescenza indiretta
Immunoperossidasi indiretta
Test di neutralizzazione riduzione placche (PRNT)
Inibizione dell’emoagglutinazione (HI)
USUTU
Poco utilizzati per la scarsa
disponibilità di anticorpi
per uccelli selvatici
Gold
standard

Diffusione di USUV in Europa
Prima del 2001: isolato solo in zone dell’Africa
tropicale e subtropicale
Dal 2001: Segnalato in Europa centrale (Austria)
poi in Ungheria e nelle zanzare in Catalogna
(Spagna), e in Italia
• Portato dall’avifauna migratoria ?
• Adattato alle specie vettore europee ?

Diffusione di USUV in Europa
2005-2006
Agosto 2005 – Budapest (Ungheria)
- 7 merli positivi a USUV
Estate 2006 – Zoo di Zurigo (Svizzera)
- su 105 uccelli (passeriformi e strigiformi) trovati morti il
maggior numero era positivo a USUV
Estate 2006 – Allevamento strigiformi Nord Italia
- 1 allocco positivo a USUV
La sequenza genomica dei ceppi ungheresi, svizzeri ed italiani,
mostrava una omologia del 99%
Stessa percentuale di similarità si otteneva
comparandoli con il ceppo austriaco.

Infezione in altre specie animali
La malattia clinica si evidenzia solo in alcune specie di
uccelli selvatici
Inoculazione intraperitoneale in topi di 1 settimana
determina depressione, paraplegia, paralisi e coma 6-11 gg. p.i.
Topi adulti sono refrattari
Polli domestici non sviluppano la malattia clinica ma
producono risposta sierologica sentinelle nei programmi di
sorveglianza
Nelle oche il virus replica ma non da malattia clinica
né viremia

Infezione in uomo e mammiferi
USUTU
L’infezione di mammiferi e dell’uomo è un evento molto
raro, anche se le prove in vitro dimostrano la
moltiplicazione virale anche in cellule di mammifero
(Bakonyi T. et al, Emerging Infectious Diseases 2005)
Effetto Citopatico (CPE) di Vero cells causato
dall’infezione di Usutu virus i, 4 giorni
postinfezione

Infezione nell’uomo
USUTU
USUV è in grado di infettare l’uomo senza provocare
malattia grave.
Talvolta, sono stati descritti rash cutanei transitori

Infezione nell’uomo
Nel 2007 e nell’estate del 2008 la presenza del virus Usutu
viene svelata attraverso il controllo sierologico di polli
sentinella senza mortalità apparente nelle specie selvatiche.
Hanno fatto seguito due isolamenti virali in due pazienti
donne, una sessantenne in Emilia Romagna, dove nello stesso
periodo era in corso una importante epidemia di West Nile, ed
una quarantenne di ritorno da un viaggio in Egitto, colpite
rispettivamente da meningoencefalite ed encefalite gravi.

Infezione nell’uomo
Entrambe le pazienti avevano il sistema immunitario compromesso
da patologie concomitanti e questo potrebbe aver amplificato
l’effetto patogeno del virus che nell’uomo non aveva mai in passato
provocato sintomatologia grave.
In uno dei due casi, la sintomatologia nervosa si è evidenziata dopo
un trapianto di fegato.
“First human case of Usutu virus neuroinvasive infection, Italy”
Pecorari M, Longo G, Gennari W, Grottola A, Sabbatini AM, Tagliazucchi S. et al.
August-September 2009. Euro Surveill