Scarica n. 1/2011 - Società Italiana di Tabaccologia

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Original Article
stimolazione dell’escrezione
salivare. I campioni di saliva
sono stati analizzati entro le
due ore successive la raccolta
a temperatura di 4 o C. I campioni
sono stati preparati ed è
stata analizzata la composizione
cellulare degli immunociti
presenti nella saliva utilizzando
un citofluorometro a flusso
BD FACSCanto II (Becton
Dickinson, USA), secondo le
procedure certificate, Patenta
No. 2008120724 as of 23.05.08
(Teplova S.N., Kochengina S.A.,
et al.). La procedura della preparazione
dei campione è stata
basata sulla tecnologia del risciacquo
on con RPMI e bicarbonato.
La composizione delle
cellule immunitarie nella saliva
è stata analizzata utilizzando i
kit basati su anticorpi monoclonali
(MAK) caratterizzati da
quattro coloranti fluorescenti,
la Fluoresceina isotiocianato (FITC), la Ficoeritrina (PE),
la Proteina Peridina-Clorofilla (PerCP), l’Alloficocianina
(APC) dai MultiTest (fabbricati da Beston Dickinson, USA)
e un colorante vitale, il 7-AAD. L’analisi citofluorometrica
della composizione cellulare della saliva ha individuato
almeno 10,000 eventi. Il numero delle cellule vitali che
esprimevano un antigene leucocitario comune, CD45+,
incluse le popolazioni di immunociti come i granulociti
(CD45+CD13+CD14-), i monociti (CD45+CD14+CD13–),
i linfociti T citotossici (CD45+CD3+CD8+), i T-helpers
(CD45+CD3+CD4+), le cellule NK (CD45+CD56+16+), è
stato rilevato usando il 7-AAD. Le cellule sono state distinte
in base all’espressione di un marker di differenziazione,
il CD45. Il rapporto CD45+/CD45- delle cellule e
dei pellet cellulari presenti nella saliva sono illustrati nella
Figura 1. Le cellule vitali con un marker di differenziazione
lineare, CD45+, è mostrato nella Figura 2. I livelli
di IL-17 nella saliva sono stati misurati utilizzando l’immunoassay
enzimatico con un sistema di test, il Human
IL-17A ELISA BMS2017 e BMS2017TEN (Bender MedSystems,
Vienna, Austria), per le analisi dei fluidi biologici,
con un fotometro, Multiscan plus (Labsystems, Finlanda),
450 nm. La sensitività del test-system era di 1 pg/mL. Sono
stati misurati nella saliva i livelli di IL-17 prodotta da una
relativamente nuova linea di cellule T, Th17, correlati ai
linfociti CD+ [8]. Lo studio è stato approvato dalla commisione
etica del Dipartimento Sanitario Centrale No.71
dell’FMBA Russia. Il consenso informato è stato ottenuto
da ogni partecipante e lo studio è stato eseguito secondo
la Dichiarazione di Helsinki sui Principi Etici per la Ricerca
Medica che Coinvolge Soggetti Umani.
Bronco normale in non fumatore
BPCO in fumatore
Altynbaeva E I et al, Tabaccologia 2011; 1: 23-29
water, in dry glass flasks without
stimulation of salivary discharge.
Saliva specimens were analyzed
within 2 hrs after collection at the
maintained at 40C. Saliva specimens
were prepared and cellular
composition of immunocytes in
saliva was analyzed using a flow
cytofluorometer, BD FACSCanto II
(Becton Dickinson, USA), in accordance
with the certified procedure,
Patent No. 2008120724
as of 23.05.08 (Teplova S.N., Kochengina
S.A., et al.).
The procedure of samples preparation
was based on the rinse
technology with RPMI and bicarbonate.
The population composition
of immune cells in saliva
was analyzed using the monoclonal
antibody-based kits (MAK)
labeled with four fluorescent
dyes, Fluorescein Isothiocyanate
(FITC), Phycoerythrin (PE), Peridin-Chlorophyll
Protein (PerCP),
Allophycocyanin (APC) from the MultiTest series (manufactured
by Becton Dickinson, USA), and a vital dye,
7-AAD.
The cytofluorometric analysis of the cellular composition
of saliva accounted for at least 10,000 events. The
number of viable cells expressing a leukocyte common
antigen, CD45+, was accounted for using 7-AAD, including
populations of immunocytes such as granulocytes
(CD45+CD13+CD14-), monocytes (CD45+CD14+CD13–),
T-cytotoxic lymphocytes (CD45+CD3+CD8+), T-helpers
(CD45+CD3+CD4+), NK-cells (CD45+CD56+16+).
Cells were separated based on the expression of a differentiation
marker, CD45. CD45+/CD45- ratio of cells and
cell pellets in saliva is illustrated in Figure 1. The gate of
viable cells with a linear differentiation marker, CD45+, is
shown on Figure 2.
Levels of IL-17 in saliva were measured using enzyme
immunoassay with a test-system, Human IL-17A ELISA
BMS2017 and BMS2017TEN (Bender MedSystems, Vienna,
Austria), for analyses of biological fluids, with a plate
photometer, Multiscan plus (Labsystems, Finland), 450
nm. The test-system sensitivity was 1 pg/mL. The levels
of IL-17 produced by a relatively new line of T-cells, Th17,
related to CD+ lymphocytes, were measured in saliva [8] [8].
The study was approved by the Ethical Committee of
the Central Medical Sanitary Department No. 71 of the
FMBA Russia.
The informed consent was obtained from each participant,
and the study was performed in accordance with the
Declaration of Helsinki on Ethical Principles for Medical
Research Involving Human Subjects.