Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Innhold<br />
• Hva sier regelverket<br />
• Vekstkrav – bakterier<br />
• <strong>Enterobacteriaceae</strong><br />
• Metodene<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong><br />
Heidi Camilla Sagen<br />
Eurofins Food and Agro Testing Norway AS<br />
www.eurofins.no<br />
14/10/2012<br />
1
Hva sier regelverket?<br />
• Mikrobiologiske retningslinjer – familien <strong>Enterobacteriaceae</strong> ikke nevnt<br />
• Forordning (EF) 2073/2005 krever <strong>Enterobacteriaceae</strong> og E. coli<br />
• Kreves spesifikke metoder<br />
• <strong>Enterobacteriaceae</strong>: referansemetoden er ISO 21528-2:2004<br />
• I artikkel nr. 5 i (EF) 2073/2005, åpnes det også for at andre metoder<br />
kan benyttes:<br />
Bruk av alternative analysemetoder er tillatt når metodene er validert i<br />
forhold til referansemetoden, og dersom det benyttes en<br />
opphavsrettslig metode som er sertifisert av en tredjepart i samsvar<br />
med protokollen i EN/ISO-standard 16140 eller andre lignende<br />
internasjonalt anerkjente protokoller.<br />
14.10.2012<br />
Regulativ (EF) 2073/2005<br />
To kriterier:<br />
1. Kriterier for næringsmiddeltrygghet<br />
2. Hygienekriterier for prosessen<br />
14.10.2012<br />
1) Kjøtt og kjøttprodukter<br />
2) Melk og melkeprodukter<br />
3) Eggprodukter<br />
4) Fiskerivarer<br />
5) Grønnsaker, frukt og produkter av grønnsaker og frukt<br />
14/10/2012<br />
2
Kjøtt og kjøttprodukter<br />
14.10.2012<br />
Melk og melkeprodukter<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
3
Melk og melkeprodukter<br />
14.10.2012<br />
Eggprodukter<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
4
Vekstkrav - Temperatur<br />
Psykrofile<br />
• Kuldetolerante bakterier<br />
• Min:-5-5°C Opt:15-18°C Max:20-25°C<br />
Mesofile<br />
• Mellomtemp.krevende bakterier<br />
• Min:10-15°C Opt:25-45°C Max:35-47°C<br />
Grunnleggende<br />
Gram negative bakterier<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
5
Gruppering av indikatorbakterier innen<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong><br />
14.10.2012<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong><br />
• Mer enn 40 slekter og 180 arter<br />
• Gram neg.<br />
• Mesofile, dvs temperatur optimum mellom 20 - 42°C<br />
• Mange <strong>Enterobacteriaceae</strong> finnes normalt i tarmen<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong><br />
Koliforme bakterie<br />
Termotolerante<br />
koliforme bakterier<br />
Escherichia coli<br />
• Mange genera og arter har også reservoar utenfor tarmsystemet<br />
• <strong>Enterobacteriaceae</strong> er dermed ikke nødvendigvis en indikator på<br />
fekal forurensning – det er en indikator på sviktende hygiene<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
6
<strong>Enterobacteriaceae</strong><br />
• Danner ikke sporer<br />
• Både strikt patogene, opportunistiske patogene og apatogene<br />
genera og arter<br />
• Salt % på under 5 og aw høyere enn 0,94 så kan disse overleve<br />
• Temperaturer under 10°C er ikke disse av bekymring<br />
14.10.2012<br />
Patogene <strong>Enterobacteriaceae</strong><br />
• De fleste <strong>Enterobacteriaceae</strong> er ikke sykdomsfremkallende<br />
• Noen <strong>Enterobacteriaceae</strong> kan gi matbåren sykdom:<br />
� Enkelte E. coli (eks. STEC 0157, O103, O111)<br />
� Salmonella spp<br />
� Shigella spp.<br />
� Yersinia enterocolitica<br />
• Patogene <strong>Enterobacteriaceae</strong> opptrer i næringsmidler som ett<br />
resultat av forurensning fra dyre/menneske reservoar.<br />
• Kan av og til påvises i næringsmidler som har vært vannet med<br />
fekalt forurenset vann<br />
• Påvises sjelden i varmebehandlede produkter – i tilfelle er det en<br />
krysskontaminering<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
7
Hvorfor har det vært fornuftig å innføre<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong> som hygieneindikator<br />
• Først og fremst – det er krav i det nye hygieneregelverket<br />
• <strong>Enterobacteriaceae</strong> regnes som en bedre hygieneindikator og en<br />
bedre «patogenindikator» enn koliforme bakterier<br />
• Koliforme bakterier er ingen godt definert gruppe<br />
� Mange varianter og stammer med atypiske egenskaper<br />
� De biokjemiske egenskapene kan også være ustabile<br />
• Enkelte patogene <strong>Enterobacteriaceae</strong> er ikke koliforme (for<br />
eksempel Salmonella)<br />
14.10.2012<br />
Forhold som påvirker mikroorganismenes<br />
evne til å tåle varme<br />
Mye vann Drepes lett<br />
Fett Beskytter<br />
Salt Drepes lett<br />
Karbohydrat Beskytter<br />
pH Drepes lett ved høy og lav<br />
Proteiner Beskytter<br />
Høgt antall Beskytter<br />
Godt renhold er viktig!!<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
8
<strong>Enterobacteriaceae</strong> – Petrifilm<br />
PRINSIPP<br />
• Metoden benytter filmer med næringsmedie som inneholder<br />
Fiolett Rød Galle Glucose (VRBG).<br />
• <strong>Enterobacteriaceae</strong> er oksidase negative, gram negative staver<br />
som fermenterer glucose.<br />
• Kolonier som produserer syre og eller gass er<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong>.<br />
Mikrobiologiske analysemetoder<br />
Utførelse alle petrifilm metoder:<br />
• Ved sure el alk prod - juster pH til mellom 6 - 8<br />
• Løft opp overfilmen<br />
• Avsett av 1 ml av aktuelle fortynninger på midten av filmen<br />
• Rull overfilmen over prøven<br />
• Plasser sprederen på overfilmen og trykk forsiktig<br />
• La filmene ligge i 1 min til gelen har stivnet<br />
• Inkuberes vannrett med plastfilmen opp<br />
• Maks 20 filmer inkuberes i høyden<br />
• Petrifilm pakkene:<br />
14.10.2012<br />
• Uåpnede pakker skal ligge kjølig<br />
• Åpnede pakker skal oppbevares svalt og tørt (ikke kjøleskap).<br />
• Holdbare i max.1mnd etter åpning.<br />
14/10/2012<br />
9
<strong>Enterobacteriaceae</strong> - Petrifilm<br />
METODEUTFØRELSE<br />
• Inkuber filmene ved: 30/37 ± 1°C i 24 ± 2 timer<br />
• En rød indikator i indikator i filmen farger alle kolonier, og toppfilmen fanger opp<br />
gassbobler som koloniene produserer.<br />
• De syreproduserende bakteriene viser seg som røde kolonier omgitt av en gul sone.<br />
Sonen fremkommer ved syreproduksjonen som synliggjøres ved hjelp av en pH-indikator<br />
i mediet.<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong> kan enten danne:<br />
• Røde kolonier med bare gassbobler tilknyttet,<br />
• Bare røde kolonier med gul sone.<br />
• Bakterien kan også produsere røde kolonier som både har gul sone og<br />
gassbobler.<br />
• Tell filmer med 10-100 kolonier. Må leses av samme dag.<br />
• Alle kolonier som tilfredsstiller betingelsene, uansett størrelse, skal telles.<br />
14.10.2012<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong> – NMKL 144<br />
PRINSIPP<br />
• En kjent mengde av prøven støpes inn i krystallfiolett nøytralrød<br />
galle glukose agar (VRBG).<br />
• Bakterier som tilhører familien <strong>Enterobacteriaceae</strong> danner svakt<br />
rosa til røde kolonier med eller uten utfellingssone – fermenterer<br />
glukose.<br />
• Etter inkubering ved 37°C i 24 ±2 t konfirmeres et anta ll kolonier<br />
med oksidasetest.<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
10
<strong>Enterobacteriaceae</strong> – NMKL 144<br />
METODEUTFØRELSE<br />
• Innstøpning av 1 ml i VRBG-agar. Når skålene er stivnet overhelles<br />
de med dekkagar av VRBG.<br />
• Inkuber skålene ved 37°C ± 1°C i ca 24 timer ± 2 timer<br />
• Tell , hvis mulig, skåler med 15-150 kolonier.<br />
14.10.2012<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong> – NMKL 144<br />
Avlesning:<br />
• Alle røde kolonier telles.<br />
• Koloniene er fra rosa til dyp rød og kan være både med og uten<br />
utfellingssone.<br />
Konfirmering må foretas for å skille ut f. eks. Pseudomonas og Aeromonas som<br />
kan vokse på VRBD.<br />
Konfirmering<br />
• Plukk ut minst 5 representative kolonier.<br />
• Så koloniene ut på en ikke-selektiv agar som PGA eller Nutrient agar.<br />
• Inkuber skålene ved 37°C ± 1°C i ca. 24 timer.<br />
• Undersøk koloniene på skålen med oksydasetest.<br />
<strong>Enterobacteriaceae</strong> skal være oksidase negative<br />
14.10.2012<br />
14/10/2012<br />
11
Violet red bile glucose (VRBG) agar<br />
Pepton Næringsstoff<br />
Gjærekstrakt Næringsstoff<br />
Gallesalt nr 3 Selektiv komponent (hemmer G+)<br />
Krystallviolett Selektiv komponent (hemmer G+)<br />
Glukose Energi<br />
NaCl Makro-komponenter<br />
Nøytralrødt Indikator for endring av pH<br />
Agar Geldannelse<br />
Destillert vann<br />
14.10.2012<br />
Inkubering<br />
• Snarest mulig<br />
• Riktig temperatur<br />
• Skålene skal vanligvis ligge opp ned<br />
• Skålene legges i en plastpose<br />
• Ikke for mange i høyden<br />
14/10/2012<br />
12
Tid fra primærfortynning til<br />
sammenblanding av substrat / prøve<br />
NB!<br />
• Det skal gå maks 20 min fra primærfort til fremstilling av<br />
etterfølgende fortynninger<br />
• Det skal gå maks 45 min fra primærfortynning til<br />
sammenblanding med substrat<br />
14.10.2012<br />
Takk for meg!<br />
Heidi Camilla Sagen<br />
”Jeg skulle ønske du kunne lære deg å sette på lokket på petriskålen,<br />
Harry !<br />
Når vi flyttet inn hadde vi fire unger, nå ser det ut som vi har over<br />
20 millioner !!..”<br />
14/10/2012<br />
13
Change language