Tamara Zulim_diplomski rad - Sveučilišni odjel za forenzične ...

SVEUČILIŠTE U SPLITUDIPLOMSKI SVEUČILIŠNI STUDIJ FORENZIKE(FORENZIČNA KEMIJA I MOLEKULARNA BIOLOGIJA)TAMARA ZULIMPRIMJENA FIZIKALNO-KEMIJSKIH ANALIZA U OPTIMIZACIJI BROJAUZORAKA KOSTIJU ZA DNA ANALIZU31/2009.Split, listopad, 2011

Rad je izrañen na odjelu sudske medicine Zavoda za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBCSplit, pod nadzorom doc.dr.sc. Davorke Sutlović, u vremenskom razdoblju od srpnja do rujna 2011.godine.Žig:Datum predaje diplomskog rada: __________________Datum prihvaćanja rada: __________________Datum usmenog polaganja: __________________Povjerenstvo:1. _________________________2. _________________________3. _________________________

ZahvalaZahvaljujem Zavodu za patologiju, sudsku medicinu i citologiju te voditelju zavodaprof.dr.sc. Šimunu Anñelinoviću na omogućavanju korištenja njihovih laboratorija.Posebno zahvaljujem mentorici doc.dr.sc. Davorki Sutlović na pomoći tijekom cjelokupneizrade ovog rada.Hvala i dragim kolegama koji su bili tu ove dvije godine diplomskog studija, na ovaj ili onajnačin.

Sadržaj1. UVOD .................................................................................................................................... 11.1. Metode identifikacije ..................................................................................................... 11.2. Identifikacija skeletnih ostataka iz masovnih grobnica ................................................. 11.2.1. Postupak i metode ekshumacije i identifikacije ............................................. 21.2.2. Identifikacija ljudskih ostataka DNA-analizom ............................................. 21.3. Identifikacija žrtava iz masovnih grobnica ................................................................... 32. CILJ RADA ............................................................................................................................ 53. MATERIJALI I METODE ................................................................................................... 63.1. Prethodna obrada koštanih ostataka i njezini rezultati .................................................. 63.1.1. Rad na terenu ................................................................................................. 63.1.2. Prethodna antropološka analiza koštanog materijala i rezultati analize ........ 73.1.3. Prethodna DNA-analiza i rezultati analize .................................................... 83.2. Fizikalno-kemijske analize ........................................................................................... 93.2.1. Mjerenje vanjskog promjera krajnjih dijelova fragmenata natkoljeničnihkostiju pomičnom mjerkom .................................................................................. 143.2.2. Mjerenje mase fragmenata natkoljeničnih kostiju....................................... 143.2.3. Mjerenje gustoće fragmenata natkoljeničnih kostiju denzitometrijom ........ 153.2.4. Mjerenje volumena fragmenata natkoljeničnih kostiju ................................ 153.2.5. Odreñivanje prosječne gustoće fragmenata natkoljeničnih kostiju na temeljuizmjerenih vrijednosti mase i volumena ................................................................. 163.3. Formiranje parova fragmenata natkoljeničnih kostiju................................................ 164. REZULTATI ...................................................................................................................... 184.1. Formiranje parova lijevih i desnih fragmenata natkoljeničnih kostiju na temeljurezultata DNA-analize ....................................................................................................... 184.2. Formiranje parova lijevih i desnih fragmenata natkoljeničnih kostiju na temeljurezultata fizikalno-kemijske analize ................................................................................... 204.3. Uspješnost uparivanja fragmenata fizikalno-kemijskom analizom............................. 235. RASPRAVA ....................................................................................................................... 276. ZAKLJUČAK ...................................................................................................................... 297. LITERATURA .................................................................................................................... 308. Sažetak ................................................................................................................................ 319. Životopis .............................................................................................................................. 33

1. UVODBrzim razvojem genetike i molekularne biologije, primjena DNA analiza zauzima sve većuulogu u postupcima identifikacije osoba. Ipak, uloga klasičnih, prirodnih disciplina, usvakodnevnoj praksi još uvijek je neupitna, a glavni razlog tomu su njihove pristupačnost icijena. Stoga, znanost nastoji iskoristit prednosti „novih“ i postojećih „klasičnih“ metoda te ihu svrhu što uspješnije identifikacije, povezati.1.1. Metode identifikacijeIdentifikacija predstavlja utvrñivanje istinitosti osoba, dijelova tijela, tragova i predmeta ucilju otkrivanja pojedinih obilježja koja omogućuju nesumnjivo i nesporno prepoznavanje.Proces identifikacije temelji se na dvama osnovnim postupcima: prvi je traženje i bilježenjekarakterističnih osobina objekta ispitivanja, a drugi je usporeñivanje ustanovljenih značajki sveć ranije poznatim podacima o objektu za koji se identitet pretpostavlja. [1]Ovisno o okolnostima slučaja i stanju posmrtnih promjena tijela, primjenjuju se različitemetode identifikacija ljudskih ostataka; od subjektivnog prepoznavanja osobe koju prepoznajeobitelj na temelju izgleda ili odjevnih i osobnih predmeta, do objektivnih rezultatadaktiloskopije i obdukcijskog nalaza. Takav pristup moguć je ako govorimo o identifikacijisvježeg i održanog leša. Nerijetki su slučajevi gdje se identifikacija mora provesti na značajnopromijenjenim tijelima nastradalih u masovnim nesrećama, izmijenjenim klimatskim uvjetimaili poduljim postmortalnim intervalom. [2]Identifikacije ljudskih ostataka često su vrlo dugotrajni i složeni postupci. U svakom procesuprepoznavanja nužna je suradnja svih relevantnih službi, a metodama identifikacije potrebnoje služiti se planski, primjenjujući različite metode koje će meñusobnim upotpunjavanjempovećati uspješnost identifikacije i zadovoljiti osnovni cilj: iskazivanje poštovanja premapreminulima na način da ih se vrati njihovim obiteljima, čime se podupire zaštita ljudskihprava, i živih i umrlih. [1]1.2. Identifikacija skeletnih ostataka iz masovnih grobnicaKada je riječ o identifikaciji poginulih u ratu, potreba ekshumacija i identifikacija žrtavapostavlja se kao neupitna obveza zajednice. Osim toga, značajna administrativna i sudskapitanja, a koja se tiču statusa nestalih osoba i njihovih obitelji, zahtijevaju svoje rješenje. Uratu i nakon njega proces identifikacije znatno je složeniji zbog višestrukih razloga; migracijacivilnog stanovništva i vojne pokretljivosti, prekida evidencije stanovništva, istovjetne vojneodjeće i obuće, namjernog uništavanja osobnih dokumenata, velikog broja mrtvih uzajedničkim grobnicama, neodgovarajućeg pokapanja i iskapanja, premještanja tijela u tzv.sekundarne grobnice, dugog razdoblja od trenutka smrti do iskapanja sa znatnom truležnomizmijenjenošću tijela ili skeletizacijom, postojanja samo pojedinih dijelova tijela ili samofragmenata kostiju te nepostojanja zaživotnih podataka. [1]1

Uspjeh bilo koje sudske identifikacije u velikoj mjeri ovisi o opsegu i uščuvanosti materijalakoji je prikupljen na terenu. [3] U svrhu prikrivanja ratnih zločina, odnosno prikrivanja mjestaukopa tijela, zaraćene strane koriste se različitim metodama kao što su iskapanje ipremještanje ostataka iz jednog u drugo ukopno mjesto, daljnje premještanje na tercijarnelokacije, rastavljanje i miješanje dijelova tijela, stješnjavanje i drobljenje, što dodatno otežavaili onemogućava odreñivanja broja tijela, njihovo sastavljanje i identifikaciju. [4]1.2.1. Postupak i metode ekshumacije i identifikacijeEkshumacija posmrtnih ostataka zahtijeva profesionalan pristup uz vodstvo specijalistasudske medicine. Prije početka ekshumacije potrebno je prikupiti relevantne podatake odogañaju i osobama za čije se ostatke pretpostavlja da bi mogli biti pronañeni. Za pronalazakvelike većine masovnih grobnica potrebno je mnogo vremena i strpljenja. Ekshumacijazapočinje fotografiranjem šireg i užeg područja, čišćenjem površinske vegetacije,obilježavanjem granica ukopnoga mjesta kopanjem probnih jama te pretragom površine usvrhu pronalaženja mogućih dokaza. Važno je točno lociranje svakog pojedinačnog groba,kao i cijelog grobnog polja. Isto se može obaviti prostoručnim crtanjem skice položaja imeñusobnih odnosa grobova i karakterističnih okolnih detalja, ili ucrtavanjem grobnih polja idetalja unutar pravilne mreže kvadrata ili, najpouzdanijom metodom, geodetskim snimanjemu lokalnom ili državnom koordinatnom sustavu. [1,3]Prilikom iskopavanja masovne grobnice najprije se moraju iskopati sva tijela i treba ihprikazati u cijelosti. Otkriveni posmrtni ostaci, dijagnosticirani kao ljudski, označuju sebrojevima, fotografiraju, skiciraju u svom položaju, te se bilježi stanje tijela i svega što senalazi uz njega ili na njemu. Ostaci se zatim, zajedno s pripadajućim predmetima, stavljaju uobilježene vreće te se transportiraju na mjesto sudskomedicinske obradbe, u baze na terenu iliu najbliži zavod za sudsku medicinu. [1,3]Kada je riječ o skeletnim ostatcima, koriste se različite antropološke metode i mjerenja nakostima koje su prethodno očišćene i oprane. Najprije treba utvrditi jesu li pronañeni ostatciljudski, a zatim koliko je osoba u prikupljenom uzorku. Za svaku osobu zatim treba odreditispol, dob u trenutku smrti, visinu, rasnu pripadnost, postojanje zaživotnih trauma ilipatoloških stanja. Prijesmrtna medicinska dokumentacija o preboljenim bolestima, traumama,kirurškim zahvatima, rentgenološke snimke načinjene za života i prijesmrtni zubni kartonivrlo su korisni u procesu identifikacije, ali rijetko dostupni. Ako identitet nije utvrñenprimjenom standardnih metoda identifikacije, potrebno je primijeniti DNA-analizu. [1,3]1.2.2. Identifikacija ljudskih ostataka DNA-analizomAnaliza molekule DNA potencijalno je vrlo korisna i svakako najtočnija metodaidentifikacije. Zasniva se na usporedbi genomske ili mitohondrijske DNA izolirane iz uzorakakosti ili zuba ekshumiranih posmrtnih ostataka s DNA izoliranom iz uzorka krvipretpostavljene uže rodbine. [1]2

potvrñena kao metoda izbora u identifikaciji nestalih osoba za vrijeme Domovinskog rata uHrvatskoj (1991.-1995.).Nužnost suradnje ovih metoda je ono što im danas omogućuje daljnji i nesmetan razvoj, anjihova kvalitetna i korisna primjena dokazana je u praksi na primjeru masovnih grobnica naotoku Daksa.Ulaskom partizanskih jedinica u Dubrovnik 18. listopada 1944. godine, zatvoreni su istaknutiDubrovčani, mahom intelektualci, te su na nenaseljenoj Daksi bez suñenja strijeljani,uglavnom 24. i 25. listopada. Prema nalogu istražnog suca Županijskog suda u Dubrovniku,24. rujna 2009. godine na Daksi je započela ekshumacija posmrtnih ostataka žrtava Drugogsvjetskog rata. Antropološka analiza skeletnih ostataka izvršena je na Odjelu za patologijudubrovačke Opće bolnice, a DNA-analiza koštanih ostataka provedena je na Odjelu za sudskumedicinu KBC Split. Nakon provedene obrade, do danas, uporabom DNA-analize iz ovihmasovnih grobnica uspješno je identificirano 18 osoba. [10]Hrvatska, nažalost, predstavlja bogat izvor koštanih ostataka koji podliježu procesuidentifikacije. Isključujući arheološke, to su skeletni ostaci koji datiraju iz perioda Drugogsvjetskog rata kao i Domovinskog rata.4

2. CILJ RADACilj ovoga rada je:⋅ Optimizirati broj koštanih uzoraka za DNA analizu.⋅ Provjeriti iskoristivost i mogućnosti koje nude fizikalno-kemijske analize, kao predstavnici„klasičnih“ metoda, u procesu formiranja parova fragmenata lijevih i desnih natkoljeničnihkostiju (lat. femur) koje pripadaju koštanim ostacima ekshumiranim u rujnu 2009. godine umasovnim grobnicama na otoku Daksa u blizini Dubrovnika.⋅ Statistički izraziti nepodudarnost izmeñu koštanih fragmenata (za sve uspješno uparenekoštane fragmente) kao mjerilo uspjeha fizikalno-kemijskih analiza u svrhu formiranjaparova.5

3. MATERIJALI I METODEFizikalno-kemijskim analizama fragmenata natkoljeničnih kostiju prethodila je sveobuhvatnaobrada ekshumiranih koštanih ostataka. Iskapanje lokacije provedeno je u skladu sastandardnim arheološkim postupcima. Osnovna arheološka ispitivanja napravljena su da bi seodredio minimalan broj žrtava, njihov spol, dob u vrijeme smrti i visina. Identificirane sukosti s patološkim i traumatskim promjenama. DNA je ekstrahirana iz smrvljenih kostiju i izuzoraka krvi roñaka. Za odreñivanje povezanosti izmeñu žrtava i potencijalnih roñakakorišteni su autosomalni i Y-kromosomski kratki udvojeni sljedovi. [10]3.1. Prethodna obrada koštanih ostataka i njezini rezultati3.1.1. Rad na terenuPrema povijesnim izvorima, pretpostavljeno je da je mjesto masovne grobnice u ruševinamapodruma bivše poljoprivredne zadruge. Takoñer se vjerovalo da je u neposrednoj blizini jošjedna masovna grobnica. Druga lokacija otkrivena je na oko 15 metara udaljenosti od prvelokacije. Teren je markiran, iskopane su probne jame, te su obje lokacije, površine veće od 80m 2 , obrañene. Prostor okružen ostacima zidina označen je kao Polje 1 te je podijeljen mrežnona 55 jednakih kvadranata površina 1 × 1 m (Slika 1). [10]Slika 1. Shematski prikaz pronalazaka na lokaciji Polje 1. Izvor: Borić I, Ljubković J,Sutlović D. Discovering the 60 years old secret: identification of the World War II mass gravevictims from the island of Daksa near Dubrovnik, Croatia. Croatian Medical Journal. 2011.6

Površinski sloj tla Polja 1 debljine otprilike 1 metar uklonjen je buldožerima nakon čega su napovršinu počeli izbijati koštani ostaci. [10]Druga lokacija, označena kao Polje 2, nije omeñena mrežom već je oblikovana tijekomprocesa iskopavanja. Iskopana su tri paralelna rova označena oznakama 2, 3 i 4 te supodijeljena u 9 jednakih kvadranata površina 1 × 1 m (Slika 2). [10]Slika 2. Shematski prikaz pronalazaka na lokaciji Polje 2. Izvor: Borić I, Ljubković J,Sutlović D. Discovering the 60 years old secret: identification of the World War II mass gravevictims from the island of Daksa near Dubrovnik, Croatia. Croatian Medical Journal. 2011.3.1.2. Prethodna antropološka analiza koštanog materijala i rezultati analizeOko 10 000 kostiju i koštanih fragmenata te brojni predmeti su otkriveni, upakirani itransportirani. U takvim okolnostima, kao i u većini slučajeva, nije bilo moguće sa sigurnošćuutvrditi položaj tijela i njihove meñusobne odnose. Ostaci su prebačeni na Odjel za patologijudubrovačke Opće bolnice, gdje su očišćeni i sortirani. [10]U slučajevima u kojima je to bilo moguće, kosti su postavljene u anatomski položaj ipregledane kako bi se utvrdila dob, spol, visina i promjene koje su se dogodile tijekom životaili nakon smrti te su fotografirane. Naknadno su uzeti uzorci za DNA analizu. [10]Skeletni ostaci su razvrstani te su im dodijeljene oznake prema makro-lokaciji (Polje 1 i Polje2) i mikro-lokaciji (označeni kvadranti unutar polja) u kojoj su pronañeni. Izrañen jeshematski prikaz položaja za kojeg se pretpostavilo da ga je zauzelo pojedino tijelo u odnosuna druga tijela i njihova prostorna orijentacija unutar označenih kvadranata (Slika 1 i 2). [10]7

Utvrñeno je sa sigurnošću da su skeletni ostaci ljudskog porijekla i da pripadaju najmanje 53osoba te da su stari više od 50 godina što vremenski odgovara razdoblju Drugog svjetskograta. Ukupni broj kostura veći je od onog koji se očekivao budući da je s poznatoga javnogpopisa “osuñenih” iz listopada 1944. ubijeno 35 osoba, meñu kojima i sedam svećenika.Pretpostavlja se da su partizani još neke od Dubrovčana, čija imena nisu stavljena na taj popis,prebacili na Daksu i tamo smaknuli. Skeletni ostaci posjeduju karakteristična muškaantropomorfna svojstva. Zbog oštećenja na kostima, u odreñenog broja osoba nije bilomoguće utvrditi dob. [10]3.1.3. Prethodna DNA-analiza i rezultati analizeDNA-analiza koštanih ostataka obavljena je na Odjelu za sudsku medicinu KBC Split premavažećem laboratorijskom protokolu. DNA profili koštanih ostataka analizirani su i usporeñenis DNA profilima potencijalnih živih roñaka. [10]DNA je uspješno izolirana iz skeletnih ostataka 49, od ukupno 53, osoba. Provedeno jenekoliko DNA ekstrakcija iz uzoraka kostiju i zuba. Uporabom AmpFiSTR Yfiler PCRamplifikacijskog kita izrañeno je 34 od 49 profila, od kojih su 32 bili puni profili, a 2 profilasu bila parcijalna. MiniFiler PCR amplifikacijskim kitom izrañeno je 40 od 49 DNK profila isamo su 2 bila parcijalna. Identifiler PCR amplifikacijski kit korišten je u 4 slučaja, pri čemusu dobivena 2 puna i 2 parcijalna profila. DNA je takoñer izolirana iz 23 uzorka krvi živihsrodnika. [10]Nakon provedene obrade, do danas, iz ove masovne grobnice uspješno je identificirano 18osoba, dok se identitet preostalih 35 osoba nije mogao utvrditi. [10]3.2. Fizikalno-kemijske analizeUkupan broj natkoljeničnih kostiju otkopanih iz obaju grobnica iznosio je 104, od čega 64natkoljenične kosti potječu s lokacije Polje 1, a njih 40 s lokacije Polje 2.Od ukupno 104 natkoljenične kosti, fizikalno-kemijskim analizama obuhvaćena su 94 koštanafragmenta koja su na Odjelu za patologiju dubrovačke Opće bolnice prethodno obrañena.Koštani fragmenti očišćeni su i obrañeni standardnim laboratorijskim postupcima te odrezanina isti način; na 20% od visine natkoljenične kosti, a duljine 10% ukupne duljinenatkoljenične kosti (Slika 3).8

Slika 3. Prikaz duljine analiziranog fragmenta natkoljenične kosti.Fizikalno-kemijske analize započete su brojanjem fragmenta natkoljeničnih kostiju pri čemusu im dodijeljeni redni brojevi od 1 do 94. Takoñer, svi koštani fragmenti nosili su iodgovarajuću papirnatu oznaku koja im je dodijeljena na Odjelu za patologiju dubrovačkeOpće bolnice, a koja je sadržavala slijedeće podatke: oznaku makro-lokacije, odnosno Polje 1(1) ili Polje 2 (2); oznaku mikro-lokacije, odnosno odgovarajućeg markiranog kvadrantaunutar polja, koja ujedno odgovara oznaci kutije u koju je natkoljenična kost upakirana; rednibroj natkoljenične kosti unutar kutije; laboratorijski broj i oznaku lijeva (L) ili desna (D)natkoljenična kost (Slika 4 i 5).Podaci koje su sadržavale papirnate oznake uz svaki pojedinačni fragment pohranjeni su ubazu podataka pomoću Microsoft Office Excel 2007 software-a.9

Slika 4. i 5. Prikaz fragmenta natkoljenične kosti i odgovarajuće oznake.Od ukupno 94 obrañena fragmenata natkoljeničnih kostiju, s makro-lokacije Polje 1 potječe57 fragmenata, rednih brojeva od 1 do 57 te laboratorijskih brojeva od 1 do 64 (s nedostatkombrojeva 21, 22, 23, 31, 34, 38, 46). Ukupno je 28 lijevih (L) fragmenata, 27 desnih (D) te 2fragmenta za koje oznaka L ili D nije odreñena (Slika 6) (Tablica 1). Fragmentinatkoljeničnih kostiju su unutar lokacije Polje 1 bili rasporeñeni u ukupno 14 markiranihkvadranata; Da, Ea, Ga, Ha, Ia, Ja, Jb, Fc, Hc, Fd, Gd, Hd, Id, Jd.Slika 6. Prikaz koštanih fragmenata s lokacije Polje 1.10

Tablica 1. Razvrstavanje fragmenata natkoljeničnih kostiju s lokacije Polje 1Redni Polje¹ Lab. Oznaka³ Red.br. femura Strana 4brojbroj²u kutiji1 1 42 Gd 4 D2 1 19 Fc 1 L3 1 62 Jd 10 D4 1 64 Jd 12 D5 1 59 Jd 7 L6 1 58 Jd 6 D7 1 41 Gd 3 L8 1 55 Jd 3 L9 1 63 Jd 11 L10 1 51 Id 2 L11 1 45 Gd 7 D12 1 47 Hd 1 L13 1 56 Jd 4 D14 1 52 Id 3 D15 1 53 Jd 1 L16 1 36 Fd 2 L17 1 54 Jd 2 D18 1 11 Ha 3 L19 1 40 Gd 2 D20 1 39 Gd 1 L21 1 8 Ga 2 D22 1 29 Hc 6 L23 1 9 Ha 1 L24 1 57 Jd 5 L25 1 32 Hc 9 D26 1 26 Hc 3 D27 1 50 Id 1 L28 1 61 Jd 9 L29 1 60 Jd 8 D30 1 43 Gd 5 L31 1 28 Hc 5 L32 1 44 Gd 6 D33 1 24 Hc 1 D34 1 37 Fd 3 D35 1 18 Jb 1 L36 1 25 Hc 2 L37 1 35 Fd 1 L38 1 5 Ea 4 L39 1 17 Ja 1 D40 1 7 Ga 1 L41 1 49 Hd 3 L11

Redni Polje¹ Lab. Oznaka³ Red.br. femura Strana 4brojbroj²u kutiji42 1 30 Hc 7 L43 1 20 Fc 2 ?44 1 10 Ha 2 D45 1 12 Ha 4 D46 1 48 Hd 2 D47 1 6 Ea 5 D48 1 1 Da 1 ?49 1 3 Ea 2 L50 1 27 Hc 4 D51 1 33 Hc 10 D52 1 4 Ea 3 D53 1 14 Ha 6 D54 1 2 Ea 1 D55 1 13 Ha 5 L56 1 16 Ia 2 D57 1 15 Ia 1 L¹ Oznaka Polja; oznaka makro-lokacije s koje fragment potječe.² Laboratorijski broj fragmenta; dodijeljen fragmentima obzirom na njihov raspored i meñuodnos unutar makrolokacijei mikro-lokacije.³ Oznaka mikro-lokacije, odnosno kvadranta unutar makro-lokacije, s koje fragment potječe.4 Strana; lijevi ili desni fragment.S makro-lokacije Polje 2 potječe 37 fragmenata natkoljeničnih kostiju, rednih brojeva od 58do 94 te laboratorijskih brojeva od 65 do 104 ( s nedostatkom brojeva 82, 86, 100 ). Ukupnoje 19 lijevih (L) i 18 desnih (D) fragmenata (Slika 7) (Tablica 2). Fragmenti natkoljeničnihkostiju su unutar lokacije Polje 2 bili rasporeñeni u ukupno 10 markiranih kvadranata; 2, 2a,2c, 2d, 2f, 3, 3a, 3b, 4, 4a.Slika 7. Prikaz koštanih fragmenata s lokacije Polje 2.12

Tablica 2. Razvrstavanje fragmenata natkoljeničnih kostiju s lokacije Polje 2Redni Polje¹ Lab. Oznaka³ Red.br. femura u Strana 4brojbroj²kutiji58 2 72 2a 5 D59 2 70 2a 3 L60 2 69 2a 2 L61 2 79 2d 3 D62 2 96 3b 3 D63 2 66 2 2 D64 2 98 3b 5 D65 2 67 2 3 D66 2 83 2f 1 L67 2 80 2d 4 L68 2 84 2f 2 D69 2 73 2c 1 D70 2 88 3a 2 L71 2 94 3b 1 L72 2 92 3a 6 L73 2 75 2c 3 D74 2 77 2d 1 D75 2 104 4a 2 D76 2 78 2d 2 L77 2 81 2d 5 L78 2 90 3a 4 L79 2 101 4 3 L80 2 89 3a 3 D81 2 68 2a 1 L82 2 85 3 1 D83 2 76 2c 4 L84 2 87 3a 1 D85 2 65 2 1 D86 2 95 3b 2 L87 2 99 4 1 D88 2 71 2a 4 L89 2 91 3a 5 D90 2 93 3a 7 L91 2 102 4 4 D92 2 74 2c 2 L93 2 103 4a 1 L94 2 97 3b 4 L¹ Oznaka Polja; oznaka makro-lokacije s koje fragment potječe.² Laboratorijski broj fragmenta; dodijeljen fragmentima obzirom na njihov raspored i meñuodnos unutar makrolokacijei mikro-lokacije.³ Oznaka mikro-lokacije, odnosno kvadranta unutar makro-lokacije, s koje fragment potječe.4 Strana; lijevi ili desni fragment.13

Nakon pregleda koštanih fragmenata i kreiranja baze podataka, izmjerene su i zabilježeneslijedeće vrijednosti: vanjski promjer krajnjih dijelova koštanih fragmenata, fizikalne veličine;masa, volumen i gustoća, te površinska gustoća koštanih fragmenata.3.2.1. Mjerenje vanjskog promjera krajnjih dijelova fragmenata natkoljeničnih kostijupomičnom mjerkomMjerenja su izvršena pomičnom kliznom mjerkom s preciznošću od 0,1 mm i rasponommjerenja od 0-40 mm (Slika 8). Svim fragmentima natkoljeničnih kostiju izmjerene suslijedeće varijable izražene u milimetrima (mm): promjer gornjeg, šireg dijela koštanogfragmenta (D1), promjer gornjeg, užeg dijela koštanog fragmenta (D2), promjer donjeg, širegdijela koštanog fragmenta (D3) te promjer donjeg, užeg dijela koštanog fragmenta (D4).Izmjerene vrijednosti upisane su u bazu podataka.Slika 8. Prikaz mjerenja promjera krajnjih dijelova fragmenata pomoću pomične mjerke.3.2.2. Mjerenje mase fragmenata natkoljeničnih kostijuSvim fragmentima natkoljeničnih kostiju izmjerena je masa izražena u gramima (g) uporabomanalitičke vage preciznosti 0,1 mg. Izmjerene vrijednosti upisane su u bazu podataka.14

3.2.3. Mjerenje gustoće fragmenata natkoljeničnih kostiju denzitometrijomSvim fragmentima natkoljeničnih kostiju kvantitativnom metodom, denzitometrijom, naOdjelu za endokrinologiju KBC Split, izmjerena je površinska gustoća kosti (engl. bonemineral density - BMD) izražena u gramima po centimetru kvadratnom (g/cm²). U tu je svrhukorišten ureñaj denzitometar model QDR 4500 C (S/N 48034), a izmjerene vrijednostiupisane su u bazu podataka.3.2.4. Mjerenje volumena fragmenata natkoljeničnih kostijuSvim fragmentima natkoljeničnih kostiju izmjeren je volumen izražen u centimetrimakubičnim (cm3) uporabom laboratorijske menzure s rasponom mjerenja do 250 ml (Slika 9).Izmjerene vrijednosti upisane su u bazu podataka.Slika 9. Prikaz mjerenje volumena fragmenata uporabom menzure.15

3.2.5. Odreñivanje prosječne gustoće fragmenata natkoljeničnih kostiju na temelju izmjerenihvrijednosti mase i volumenaSvim fragmentima natkoljeničnih kostiju izračunate su vrijednosti prosječne gustoće izraženeu gramima po centimetru kubičnom (g/cm3) na temelju izmjerenih vrijednosti mase ivolumena pomoću matematičkog izraza za računanje gustoće: ρ = m / V (ρ - gustoća, m -masa, V - volumen), uporabom softverskog programa Microsoft Office Excel 2007. Izmjerenevrijednosti upisane su u bazu podataka.3.3. Formiranje parova fragmenata natkoljeničnih kostijuNakon mjerenja i izračunavanja svih parametara, uslijedilo je formiranje parova fragmenatanatkoljeničnih kostiju na temelju svih vrijednosti zabilježenih u bazu podataka; točne lokacijes koje fragmenti potječu, vanjskog promjera krajnjih dijelova koštanih fragmenata, mase,volumena i gustoće fragmenata, te površinske gustoće koštanih fragmenata (Slika 10 i 11).Slika 10. Primjer formiranja parova koštanih fragmenata laboratorijskih brojeva 7 i 8 slokacije Polje 1.16

Slika 11. Primjer formiranja parova koštanih fragmenata laboratorijskih brojeva 7 i 8 slokacije Polje 1.Rezultati formiranja parova fizikalno-kemijskim analizama upisani su u bazu podataka teusporeñeni su s rezultatima formiranja parova na temelju prethodno obavljene DNA-analize.Za sve uspješno formirane parove koštanih fragmenata, statističkim izračunom izraženo jeodstupanje od podudarnosti u vrijednostima za mjerene parametre izmeñu koštanihfragmenata koji čine jedan par. Statistička analiza podataka obuhvaćala je izračun razlikeizmeñu dvaju brojeva, odnosno dviju izmjerenih vrijednosti za svaki od fragmenata koji činepar, u obliku postotka.17

4. REZULTATI4.1. Formiranje parova lijevih i desnih fragmenata natkoljeničnih kostiju na temeljurezultata DNA-analizeTablica 3. 36 parova natkoljeničnih kostiju formiranih na temelju rezultata prethodne DNAanalize.Rezultatima DNA-analize pridodane su i vrijednosti izmjerene tijekom prethodneantropološke analize:Lab. Oznaka Red.br.f. Strana l femura¹ Ø glave²broj u kutiji (cm) f. (cm)1 Da 1 ? 40,8 4,82 Ea 1 D 40,7 5,13 Ea 2 L 43,9 4,64 Ea 3 D 44,1 4,75 Ea 4 L 46,3 5,16 Ea 5 D 45,5 5,07 Ga 1 L 46,0 5,28 Ga 2 D 45,5 5,29 Ha 1 L 51,5 5,110 Ha 2 D 51,5 5,111 Ha 3 L 46,5 4,912 Ha 4 D 46,4 4,913 Ha 5 L 50,0 5,014 Ha 6 D 50,0 5,015 Ia 1 L 47,0 5,016 Ia 2 D 46,7 5,017 Ja 1 D 47,4 4,918 Jb 1 L 45,9 4,919 Fc 1 L 43,0 4,620 Fc 2 D 43,5 4,739 Gd 1 L 47,2 5,340 Gd 2 D 47,1 5,341 Gd 3 L 45,9 4,942 Gd 4 D 46,4 4,947 Hd 1 L 41,7 4,748 Hd 2 D 42,0 4,751 Id 2 L 40,5 4,252 Id 3 D oštećen 4,253 Jd 1 L 48,0 4,854 Jd 2 D 48,5 4,855 Jd 3 L 48,0 5,356 Jd 4 D 48,0 5,357 Jd 5 L 45,0 4,858 Jd 6 D 45,0 4,918

Lab. Oznaka Red.br.f. Strana l femura¹ Ø glave²broj u kutiji (cm) f. (cm)59 Jd 7 L 46,5 5,160 Jd 8 D 46,8 5,161 Jd 9 L 44,6 5,062 Jd 10 D 44,7 4,963 Jd 11 L 47,5 5,064 Jd 12 D oštećen 5,165 2 1 D 47,9 5,266 2 2 D 48,5 4,867 2 3 D 44,2 4,968 2a 1 L 44,7 5,071 2a 4 L 46,2 4,772 2a 5 D 46,2 4,974 2c 2 L 47,9 5,275 2c 3 D 48,1 5,176 2c 4 L 43,6 4,977 2d 1 D 43,5 5,078 2d 2 L 47,6 5,379 2d 3 D 47,6 5,283 2f 1 L 46,0 4,984 2f 2 D 46,0 4,985 3 1 D 44,0 4,686 3 2 L oštećen 4,787 3a 1 D 45,5 4,388 3a 2 L 45,0 4,389 3a 3 D 47,8 4,990 3a 4 L 47,2 4,891 3a 5 D 45,0 5,092 3a 6 L 43,4 4,995 3b 2 L 50,2 5,396 3b 3 D 49,3 5,597 3b 4 L 46,1 5,598 3b 5 D 46,0 5,599 4 1 D 46,7 5,1100 4 2 L oštećen 5,2101 4 3 L 42,9 4,4102 4 4 D 43,0 4,4103 4a 1 L 46,0 4,6104 4a 2 D 45,2 4,8¹ Duljina natkoljenične kosti (l femura);² promjer glave natkoljenične kosti (Ø glave femura), izražene u centimetrima za svaku od kostiju koja čini par.19

4.2. Formiranje parova lijevih i desnih fragmenata natkoljeničnih kostiju na temelju rezultata fizikalno-kemijske analizeTablica 4. 43 para fragmenata natkoljeničnih kostiju formiranih na temelju rezultata fizikalno-kemijske analize. Izmjereni parametri: promjergornjeg, šireg dijela fragmenta (D1, mm); promjer gornjeg, užeg dijela fragmenta (D2); promjer donjeg, šireg dijela fragmenta (D3); promjerdonjeg, užeg dijela fragmenta (D4); površinska gustoća kosti (BMD, g/cm²); masa (g); volumen (cm³); gustoća (g/cm³).Redni Polje Lab. Oznaka Red.br.f. Strana D1 D2 D3 D4 BMD Masa Volumen Gustoćabroj broj u kutiji (mm) (mm) (mm) (mm) g/cm² (g) (cm³) g/cm³48 1 1 Da 1 ? 38,40 27,40 35,30 28,80 1,314 31,15 20 1,5654 1 2 Ea 1 D 37,10 27,00 35,20 27,40 1,316 30,73 20 1,5449 1 3 Ea 2 L 34,50 25,50 29,10 25,20 1,498 39,25 23 1,7152 1 4 Ea 3 D 32,80 26,50 30,30 25,40 1,527 40,82 23 1,7738 1 5 Ea 4 L 34,40 31,30 31,60 29,20 1,260 31,62 20 1,5847 1 6 Ea 5 D 33,50 26,60 33,20 25,50 1,210 30,68 21 1,4640 1 7 Ga 1 L 33,90 27,90 30,60 29,80 1,470 39,82 22 1,8121 1 8 Ga 2 D 33,70 29,90 32,20 31,40 1,456 34,72 22 1,5823 1 9 Ha 1 L 31,90 28,90 31,50 28,50 1,789 41,59 28 1,4944 1 10 Ha 2 D 31,90 28,50 30,80 27,30 1,531 39,83 24 1,6618 1 11 Ha 3 L 32,00 27,50 28,50 27,90 1,687 40,81 18 2,2745 1 12 Ha 4 D 31,10 28,50 29,40 27,50 1,641 38,12 24 1,5955 1 13 Ha 5 L 32,20 31,80 31,50 27,40 1,609 39,04 26 1,5053 1 14 Ha 6 D 32,40 31,30 31,00 28,60 1,396 40,45 27 1,5057 1 15 Ia 1 L 31,50 29,00 30,60 26,40 1,507 38,33 24 1,6056 1 16 Ia 2 D 31,60 28,00 30,80 25,80 1,394 31,92 19 1,6835 1 18 Jb 1 L 31,40 27,30 30,30 27,90 1,344 29,82 20 1,4939 1 17 Ja 1 D 32,30 26,80 29,20 25,80 1,412 33,83 20 1,692 1 19 Fc 1 L 27,70 27,50 28,60 25,30 1,480 29,39 18 1,6343 1 20 Fc 2 ? 28,40 26,40 30,20 24,40 1,409 34,52 20 1,7336 1 25 Hc 2 L 29,60 27,80 31,80 25,10 1,464 40,33 24 1,6826 1 26 Hc 3 D 30,60 28,40 26,80 25,80 1,249 27,67 20 1,3850 1 27 Hc 4 D 30,30 24,80 28,20 24,70 1,337 26,07 17 1,5331 1 28 Hc 5 L 30,00 28,60 28,90 27,20 1,325 30,62 20 1,5351 1 33 Hc 10 D 30,40 28,60 29,70 26,50 1,192 28,46 20 1,4222 1 29 Hc 6 L 29,30 24,40 27,50 24,40 1,484 30,98 20 1,5533 1 24 Hc 1 D 27,60 24,80 25,70 24,80 1,542 31,91 21 1,5242 1 30 Hc 7 L 32,50 26,00 30,90 27,10 1,376 38,77 23 1,6925 1 32 Hc 9 D 31,60 25,00 28,80 27,90 1,394 32,87 23 1,4337 1 35 Fd 1 L 31,70 29,40 30,00 27,40 1,575 37,35 24 1,5620

Redni Polje Lab. Oznaka Red.br.f. Strana D1 D2 D3 D4 BMD Masa Volumen Gustoćabroj broj u kutiji (mm) (mm) (mm) (mm) g/cm² (g) (cm³) g/cm³16 1 36 Fd 2 L 28,30 24,90 25,40 24,50 1,381 25,70 16 1,6134 1 37 Fd 3 D 27,30 25,00 25,30 24,80 1,511 34,59 19 1,8220 1 39 Gd 1 L 33,30 29,40 31,50 30,30 1,543 39,29 25 1,5732 1 44 Gd 6 D 34,90 28,90 30,70 30,40 1,359 32,39 21 1,547 1 41 Gd 3 L 36,30 30,80 33,50 29,50 1,315 28,78 20 1,4411 1 45 Gd 7 D 35,50 29,30 32,30 28,80 1,331 30,16 21 1,441 1 42 Gd 4 D 29,40 27,20 27,50 25,80 1,340 29,39 19 1,5527 1 50 Id 1 L 29,50 26,00 27,40 25,80 1,266 27,95 18 1,5530 1 43 Gd 5 L 32,00 30,00 28,40 27,40 1,598 35,59 20 1,7819 1 40 Gd 2 D 31,50 30,30 28,30 27,60 1,507 32,17 19 1,6912 1 47 Hd 1 L 30,40 28,50 29,00 26,30 1,500 30,26 19 1,5946 1 48 Hd 2 D 28,80 28,10 28,50 25,80 1,469 30,94 19 1,6341 1 49 Hd 3 L 28,30 25,40 27,50 23,50 1,340 30,18 17 1,7810 1 51 Id 2 L 27,20 26,60 26,20 25,50 1,307 23,08 25 0,9214 1 52 Id 3 D 27,50 26,30 26,00 25,50 1,297 24,35 15 1,6215 1 53 Jd 1 L 31,00 27,00 27,40 25,70 1,473 35,75 20 1,7917 1 54 Jd 2 D 31,10 25,50 29,40 26,30 1,538 35,97 20 1,808 1 55 Jd 3 L 33,40 27,40 30,20 27,00 1,725 46,55 26 1,7913 1 56 Jd 4 D 31,40 26,70 27,50 26,30 1,741 41,47 24 1,7324 1 57 Jd 5 L 28,60 oštećeno 26,40 26,30 1,450 29,72 18 1,656 1 58 Jd 6 D 31,50 26,80 28,80 25,30 1,516 26,77 17 1,575 1 59 Jd 7 L 36,40 27,80 32,80 26,50 1,376 31,88 20 1,5929 1 60 Jd 8 D 33,80 29,10 29,60 26,40 1,248 29,15 20 1,4628 1 61 Jd 9 L 29,80 28,60 27,40 27,30 1,519 31,62 20 1,583 1 62 Jd 10 D 28,30 26,80 27,30 25,50 1,468 31,75 16 1,989 1 63 Jd 11 L 31,30 27,50 29,40 27,50 1,279 30,70 18 1,714 1 64 Jd 12 D 30,20 27,70 29,70 27,40 1,299 26,10 18 1,4560 2 69 2a 2 L 33,10 32,80 31,90 30,30 1,248 30,96 25 1,2485 2 65 2 1 D 33,40 30,50 32,80 29,60 1,245 34,15 23 1,4881 2 68 2a 1 L 36,00 27,40 34,40 25,70 1,285 33,49 20 1,6763 2 66 2 2 D 34,10 25,70 32,50 25,80 1,387 35,10 19 1,8559 2 70 2a 3 L 31,30 29,60 29,90 26,80 1,339 35,62 20 1,7865 2 67 2 3 D 30,80 28,50 28,70 25,80 1,336 34,89 17 2,0588 2 71 2a 4 L 30,20 28,40 29,60 25,80 1,554 41,51 21 1,9858 2 72 2a 5 D 28,40 25,90 26,60 25,80 1,563 43,08 22 1,9692 2 74 2c 2 L 31,30 30,20 30,80 28,50 1,675 48,82 17 2,8773 2 75 2c 3 D 32,30 30,00 30,50 28,20 1,575 46,12 17 2,7121

Redni Polje Lab. Oznaka Red.br.f. Strana D1 D2 D3 D4 BMD Masa Volumen Gustoćabroj broj u kutiji (mm) (mm) (mm) (mm) g/cm² (g) (cm³) g/cm³83 2 76 2c 4 L 35,50 28,50 30,50 26,60 1,360 34,80 20 1,7474 2 77 2d 1 D 31,40 30,80 31,30 26,60 1,338 34,31 21 1,6376 2 78 2d 2 L 33,30 31,30 32,20 26,90 1,551 46,33 17 2,7361 2 79 2d 3 D 32,40 32,30 32,30 27,20 1,518 45,23 26 1,7467 2 80 2d 4 L 30,40 27,40 27,50 26,70 1,403 42,68 22 1,9469 2 73 2c 1 D 31,60 27,40 27,50 26,60 1,545 43,70 23 1,9077 2 81 2d 5 L 29,80 26,30 27,50 26,10 1,431 35,53 18 1,9766 2 83 2f 1 L 29,60 27,00 28,70 24,70 1,677 37,27 22 1,6968 2 84 2f 2 D 28,50 25,70 26,00 24,10 1,776 37,49 22 1,7070 2 88 3a 2 L 27,60 24,00 27,20 23,70 1,412 26,75 27 0,9984 2 87 3a 1 D 27,80 24,40 27,40 23,80 1,355 28,00 27 1,0478 2 90 3a 4 L 29,10 28,40 27,40 26,30 1,464 33,66 21 1,6080 2 89 3a 3 D 31,10 26,80 29,90 25,50 1,440 36,25 19 1,9172 2 92 3a 6 L 32,00 26,00 28,90 24,00 1,424 31,45 17 1,8582 2 85 3 1 D 30,80 26,20 28,40 24,40 1,380 34,08 17 2,0090 2 93 3a 7 L 29,80 28,00 27,20 25,40 1,276 28,80 19 1,5271 2 94 3b 1 L 31,00 27,70 29,80 28,50 1,558 36,43 22 1,6689 2 91 3a 5 D 31,50 28,40 31,00 29,70 1,439 32,83 21 1,5686 2 95 3b 2 L 33,30 32,10 31,20 30,80 1,513 40,02 15 2,6762 2 96 3b 3 D 32,80 30,50 30,40 30,20 1,521 40,55 19 2,1394 2 97 3b 4 L 35,80 29,40 32,10 29,20 1,339 31,22 17 1,8464 2 98 3b 5 D 35,80 29,20 31,80 28,80 1,383 32,36 21 1,5487 2 99 4 1 D 30,30 27,90 28,40 27,40 1,365 33,31 20 1,6779 2 101 4 3 L 33,10 25,00 29,60 24,40 1,382 34,69 18 1,9391 2 102 4 4 D 33,10 24,90 28,60 26,00 1,445 32,32 18 1,8093 2 103 4a 1 L 35,00 26,00 33,70 26,90 1,619 46,09 23 2,0075 2 104 4a 2 D 35,00 26,40 33,00 26,00 1,594 41,40 24 1,73parparfragment bez para22

4.3. Uspješnost uparivanja fragmenata fizikalno-kemijskom analizomTablica 5. 29 parova fragmenata natkoljeničnih kostiju formiranih fizikalno-kemijskimanalizama koji su potvrñeni DNA-analizomPar Redni Polje Lab. Oznaka Red.br.f. Stranabroj broj u kutiji1 48 1 1 Da 1 ?54 1 2 Ea 1 D2 49 1 3 Ea 2 L52 1 4 Ea 3 D3 38 1 5 Ea 4 L47 1 6 Ea 5 D4 40 1 7 Ga 1 L21 1 8 Ga 2 D5 23 1 9 Ha 1 L44 1 10 Ha 2 D6 18 1 11 Ha 3 L45 1 12 Ha 4 D7 55 1 13 Ha 5 L53 1 14 Ha 6 D8 57 1 15 Ia 1 L56 1 16 Ia 2 D9 35 1 18 Jb 1 L39 1 17 Ja 1 D10 2 1 19 Fc 1 L43 1 20 Fc 2 ?11 12 1 47 Hd 1 L46 1 48 Hd 2 D12 10 1 51 Id 2 L14 1 52 Id 3 D13 15 1 53 Jd 1 L17 1 54 Jd 2 D14 8 1 55 Jd 3 L13 1 56 Jd 4 D15 24 1 57 Jd 5 L6 1 58 Jd 6 D16 5 1 59 Jd 7 L29 1 60 Jd 8 D17 28 1 61 Jd 9 L3 1 62 Jd 10 D18 9 1 63 Jd 11 L4 1 64 Jd 12 D19 88 2 71 2a 4 L58 2 72 2a 5 D23

Par Redni Polje Lab. Oznaka Red.br.f. Stranabroj broj u kutiji20 92 2 74 2c 2 L73 2 75 2c 3 D21 83 2 76 2c 4 L74 2 77 2d 1 D22 76 2 78 2d 2 L61 2 79 2d 3 D23 66 2 83 2f 1 L68 2 84 2f 2 D24 70 2 88 3a 2 L84 2 87 3a 1 D25 78 2 90 3a 4 L80 2 89 3a 3 D26 86 2 95 3b 2 L62 2 96 3b 3 D27 94 2 97 3b 4 L64 2 98 3b 5 D28 79 2 101 4 3 L91 2 102 4 4 D29 93 2 103 4a 1 L75 2 104 4a 2 DNa temelju rezultata DNA-analize uspješno je formirano 36 parova natkoljeničnih kostiju.Rezultatima DNA-analize pridodane su i izmjerene vrijednosti duljine natkoljeničnih kostiju(uz iznimke natkoljeničnih kostiju laboratorijskih brojeva 52, 64, 86 i 100 kojima zbogoštećenja nije izmjerena duljina) te promjera glava natkoljeničnih kostiju (Tablica 3). Tamjerenja su provedena u sklopu antropološke analize koja je prethodila fizikalno-kemijskimanalizama.94 fragmenta natkoljeničnih kostiju obrañena su fizikalno-kemijskim analizama koje suuključivale mjerenje slijedećih parametara; četiriju vanjskih promjera krajnjih dijelovakoštanih fragmenata; površinske gustoće koštanih fragmenata; mase; volumena; gustoćekoštanih fragmenata na temelju izmjerenih vrijednosti mase i volumena (m/V); uz iznimkufragmenta rednog broja 24 kojemu zbog oštećenja nije izmjeren vanjski promjer gornjeg, užegdijela fragmenta - D2 (Tablica 4).Od mogućih 36 parova, za koje je DNA-analizom utvrñeno da se pouzdano radi o parovima,fizikalno-kemijskim analizama formirano je 29 parova. Dakle riječ je o parovima koji suformirani i potvrñeni objema analizama (Tablica 5). Odstupanje u podudarnosti u rezultatimadviju provedenih analiza iznosi 24,14%, odnosno, uspješnost formiranja parova na temeljurezultata fizikalno-kemijskih analiza iznosi 75,86%.24

Tablica 6. Prikaz razlika u izmjerenim vrijednostima izraženih postotkom odstupanja meñuparovima (jednog od drugog)Odstupanje od podudarnosti (%)Par Lab. Strana l femura Ø glave f. D1 D2 D3 D4 BMD Masa Volumen Gustoćabroj (cm) (cm) (mm) (mm) (mm) (mm) (g/cm²) (g) (cm³) (g/cm³)1 1 ? 0,25 6,25 3,50 1,48 0,28 5,11 0,15 1,37 0,00 1,302 D2 3 L 0,46 2,17 5,18 3,92 4,12 0,79 1,94 4,00 0,00 3,514 D3 5 L 1,76 2,00 2,69 17,67 5,06 14,51 4,13 3,06 5,00 8,226 D4 7 L 1,10 0,00 0,59 7,17 5,23 5,37 0,96 14,69 0,00 14,568 D5 9 L 0,00 0,00 0,00 1,40 2,27 4,40 16,85 4,42 16,67 11,4110 D6 11 L 0,22 0,00 2,89 3,64 3,16 1,45 2,80 7,06 33,33 42,7712 D7 13 L 0,00 0,00 0,62 1,60 1,61 4,38 15,26 3,61 3,85 0,0014 D8 15 L 0,64 0,00 0,32 3,57 0,65 2,33 8,11 20,08 26,32 5,0016 D9 18 L 3,27 0,00 2,87 1,87 3,77 8,14 5,06 13,45 0,00 13,4217 D10 19 L 1,15 2,17 2,53 4,17 5,59 3,69 5,04 17,45 11,11 6,1320 ?11 47 L 0,72 0,00 5,56 1,42 1,75 1,94 2,11 2,25 0,00 2,5248 D12 51 L / 0,00 1,10 1,14 0,77 0,00 0,77 5,50 66,67 76,0952 D13 53 L 1,04 0,00 0,32 5,88 7,30 2,33 4,41 0,62 0,00 0,5654 D14 55 L 0,00 0,00 6,37 2,62 9,82 2,66 0,93 12,25 8,33 3,4756 D15 57 L 0,00 2,08 10,14 / 9,09 3,95 4,55 11,02 5,88 5,1058 D16 59 L 0,65 0,00 7,69 4,68 10,81 0,38 10,26 9,37 0,00 8,9060 D17 61 L 0,22 2,04 5,30 6,72 0,37 7,06 3,47 0,41 25,00 25,3262 D18 63 L / 2,00 3,64 0,73 1,02 0,36 1,56 17,62 0,00 17,9364 D19 71 L 0,00 4,26 6,34 9,65 11,28 0,00 0,58 3,78 4,76 1,0272 D20 74 L 0,42 1,96 3,19 0,67 0,98 1,06 6,35 5,85 0,00 5,9075 D21 76 L 0,23 2,04 13,06 8,07 2,62 0,00 1,64 1,43 5,00 6,7577 D22 78 L 0,00 1,92 2,78 3,19 0,31 1,12 2,17 2,43 52,94 56,9079 D23 83 L 0,00 0,00 3,86 5,06 10,38 2,49 5,90 0,59 0,00 0,5984 D24 88 L 1,11 0,00 0,72 1,67 0,74 0,42 4,21 4,67 0,00 5,0587 D25 90 L 1,27 2,08 6,87 5,97 9,12 3,14 1,67 7,69 10,53 19,3889 D26 95 L 1,83 3,77 1,52 5,25 2,63 1,99 0,53 1,32 26,67 25,3596 D27 97 L 0,22 0,00 0,00 0,68 0,94 1,39 3,29 3,65 23,53 19,4898 D28 101 L 0,23 0,00 0,00 0,40 3,50 6,56 4,56 7,33 0,00 7,22102 D29 103 L 1,77 4,35 0,00 1,54 2,12 3,46 1,57 11,33 4,35 15,61104 Dpodudarnostodstupanje od podudarnosti ≤ 5%> 5% odstupanje od podudarnosti ≤ 15%odstupanje od podudarnosti > 15%25

U svrhu provjeravanja uspješnosti fizikalno-kemijskih analiza u formiranju parova koštanihfragmenata, za 29 uspješno formiranih parova fragmenata natkoljenične kosti izračunate surazlike izmeñu lijevog i desnog koštanog fragmenta, koji zajedno čine jedan par, u svimizmjerenih vrijednostima za sve parametre (duljina natkoljenične kosti, promjer glavenatkoljenične kosti, vanjski promjeri krajnjih dijelova koštanih fragmenata, površinskagustoća kosti, masa, volumen, gustoća). Razlike u izmjerenim vrijednostima izražene supostotkom kao „odstupanje od podudarnosti“ izmeñu dvije vrijednosti, odnosno, izmeñuvrijednosti izmjerene za jedan fragment u odnosu na njegov par. Radi lakšeg tumačenjarazlika meñu vrijednostima, rezultati su, obzirom na odstupanje od podudarnosti meñuvrijednostima, razvrstani u četiri kategorije; podudarnost (odstupanje od podudarnosti = 0%);odstupanje od podudarnosti ≤ 5%; > 5% odstupanje od podudarnosti ≤ 15%; odstupanje odpodudarnosti > 15% (Tablica 6).Odstupanje od podudarnosti izmeñu fragmenata natkoljeničnih kostiju obuhvaća usporedbedeset različitih mjerenih vrijednosti.Tablica 7. Tablični prikaz rasporeda parova fragmenata unutar kategorija koje odgovarajuodreñenom rasponu postotka odstupanja od podudarnosti meñu fragmentima u 10 mjerenihparametaraOdstupanje od podudarnosti (%) l femura Ø glave f. D1 D2 D3 D4 BMD Masa Volumen Gustoća(cm) (cm) (mm) (mm) (mm) (mm) (g/cm²) (g) (cm³) (g/cm³)podudarnost 25,9 51,7 13,8 6,9 41,4 3,4odstupanje od podudarnosti ≤ 5% 74,1 44,8 58,6 65,5 65,5 72,4 69,0 51,7 17,2 27,6> 5% odstupanje od podudarnosti ≤ 15% 3,4 27,6 27,6 34,5 20,7 27,6 37,9 13,8 37,9odstupanje od podudarnosti > 15% 3,4 3,4 10,3 27,6 31,0⋅ podudarnost (potpuna podudarnost; odstupanje od podudarnosti = 0%)⋅ odstupanje od podudarnosti ≤ 5%⋅ > 5% odstupanje od podudarnosti ≤ 15%⋅ odstupanje od podudarnosti >15%Ukupan broj parova u pojedinoj kategoriji izražen je postotkom koji predstavlja udio parova utoj kategoriji u odnosu na ukupan broj analiziranih parova.26

5. RASPRAVAPostupak koji je uključivao fizikalno-kemijske analize fragmenata lijevih i desnihnatkoljeničnih kostiju u svrhu formiranja parova i time reduciranja broja uzoraka za DNAanalizukoja slijedi, nije se u potpunosti pokazao uspješnim u optimiziranju konačnog brojauzoraka koštanih fragmenata. Iako je kod najvećeg broja parova (54,5%), meñu fragmentimazabilježeno odstupanje od podudarnosti manje od 5% za izmjerene vrijednosti, u trećineparova odstupanja od podudarnosti u izmjerenim vrijednostima iznosila su više od 5%.Obzirom da su fragmenti obrañeni na identičan način te su im izmjerene vrijednosti za 10parametara, očekivala se i veća podudarnost meñu izmjerenim vrijednostima. Meñutim,rezultati o meñusobnoj podudarnosti, odnosno odstupanju od podudarnosti, fragmenatadobiveni statističkom obradom podataka zasigurno bi bili reprezentativniji da je postojalamogućnost analize izmjerenih vrijednosti za sva 43 para fragmenata natkoljeničnih kostijuformiranih na temelju rezultata fizikalno-kemijske analize, a ne isključivo 29 koliko ih jepotvrñeno na temelju rezultata DNA-analize.Najmanje razlike u izmjerenim vrijednostima za fragmente koji čine par zabilježene su kodmjerenja duljine natkoljeničnih kostiju te promjera glava natkoljeničnih kostiju. Potpunapodudarnost u mjerenju duljine natkoljenične kosti uočena je kod 25,9% parova, dok je tapodudarnost u okviru 5% greške bila 100%. Potpuna podudarnost u mjerenju promjera glavenatkoljenične kosti uočena je kod 51,7% parova, dok je ta podudarnost u okviru 5% greškeiznosila 96,6%. Dakle, najpouzdanijima su se pokazala upravo ona mjerenja koja su izvedenana čitavim natkoljeničnim kostima, za razliku od mjerenja koja su izvedena na fragmentimanatkoljeničnih kostiju. Iz navedenog proizlazi mogućnost da bi odreñivanje više različitihparametara na čitavim natkoljeničnim kostima vjerojatno rezultiralo manjim razlikama uizmjerenim vrijednostima meñu pretpostavljenim parovima kostiju. Pri tomu bimorfometrijski postupci koji se temelje na mjerenjima, trebali biti usmjereni na odreñivanjenajrelevantnijih parametara, a prikupljeni podaci obrañeni postojećim deskriptivnim istatističkim analizama. U Hrvatskoj je obavljeno nekoliko istraživanja koja su se koristiladugim kostima ili njihovim dijelovima kako bi se dobili specifični populacijski standardi zaodreñivanje spola. Do sada su u tu svrhu analizirani femur i tibija iz hrvatskihsrednjovjekovnih nalazišta. [11] Ipak, očuvanost kostura ovisna je o brojnim okolišnim iostalim čimbenicima, stoga su kosti nerijetko djelomično uništene i usitnjene što otežavapostupak identifikacije.Natkoljenična kost je najčešće proučavana duga kost jer je spolni dimorfizam u dimenzijamanatkoljenične kosti već odavno zamijećen. Osim toga, natkoljenična kost je najrobusnija inajveća kost u ljudskom kosturu, te je tako vrlo često uščuvana u arheološkim i forenzičnimslučajevima pa zbog svoje uščuvanosti predstavlja i najbolji izvor uzoraka za DNA-analizu.[3] Najveća duljina natkoljenične kosti kao i najveći promjer glave natkoljenične kosti,predstavljaju standardne varijable koje se koriste u diskriminantno-funkcijskim analizamafemura za odreñivanje spola i visine osobe u sklopu fizikalno-antropoloških i bioarheološkihanaliza. [11] Forenzična antropologija, kao grana fizikalne antropologije, zasebna je znanostkoja već duže vrijeme ima svoju primjenu u identifikaciji ljudskih ostataka.27

Današnji pristup forenzične antropologije u analizi i obradi koštanih uzoraka, populacijski jeorijentiran i uzima u obzir biokulturološke faktore koji utječu na koštanu morfologiju skeletarazličitih naroda, te je usmjeren na razvoj tehnika i metoda za analizu parametara kao što sutraumatske koštane promjene ili poslijesmrtne promjene. [2]Jedna od najvažnijih karakteristika DNA tehnologije jest njezina originalnost i vrijednost.Metoda analize DNA usporeñuje se s analizom otiska prsta jer je riječ o jedinstvenom,genetičkom otisku (profilu), koji je specifičan za svakoga od nas. [1] Obzirom na pouzdanosti uporabljivost rezultata DNA-analize, od postupaka i metoda koji joj prethode, fizikalnokemijskihanaliza u kontekstu ovog istraživanja, takoñer se očekuje pouzdanost i preciznost.Važna primjena DNA-analize u postupcima identifikacije nameće potrebu zadovoljavanjanajviših standarda od trenutka ulaska uzorka u laboratorij do obrade i prezentacije rezultatačlanovima obitelji stradalih. Podrazumijeva se da i svi postupci koji prethode samoj DNAanalizibudu u mogućnosti zadovoljiti te najviše standarde.Postoji potreba za razvojem svrhovitih fizikalno-kemijskih metoda baziranih na znanjima izpodručja antropologije s ciljem optimiziranja broja uzoraka za skupu DNA-analizu.Komplementarnost ovih metoda zasigurno pridonosi bržem i boljem razvoju forenzike teolakšava rješavanje slučajeva čija bi uspješnost bila upitna u slučaju iskorištavanja samojedne od dviju metoda.28

6. ZAKLJUČAKNajveći udio parova čiji se fragmenti meñusobno podudaraju u izmjerenim vrijednostimazabilježen je kod odreñivanja parametra promjera glave i dužine natkoljenične kosti (25,9%dužina te 51,7% promjer glave natkoljenične kosti). Podudarnost u okviru 5% greške mjerenjaiznosila je 96,6%.Prema ovom istraživanju, ti se parametri mogu smatrati najrelevantnijima u postupkuformiranja parova natkoljeničnih kostiju, odnosno njihovih fragmenata.Odstupanje od podudarnosti veće od 15%, zabilježeno je kod odreñivanja gustoće kosti(31,0%), koja je odreñena matematički omjerom mase i volumena pojedinog fragmenta.Osobe ne posjeduju jednake promjere natkoljeničnih kostiju, gustoće kostiju i površinskegustoće kostiju (BMD), izmjerene na sličnim pozicijama fragmenata lijevih i desnihnatkoljeničnih kostiju.Primjenom fizikalno-kemijskih analiza nije moguće sa sigurnošću formirati takve parovenatkoljeničnih kostiju da bi samo jednu od natkoljeničnih kostiju analizirali DNA metodom.29

7. LITERATURA1 Primorac D. Analiza DNA u sudskoj medicini i pravosuñu. Zagreb: Pravo, Nakladni zavodMatice hrvatske; 2001.2 Petaros A, Čengija M, Bosnar A. Primjena i uloga osteologije u praksi: forenzičnaantropologija. Medicina 2010;46(1)19-28.3 Zečević D. i suradnici. Sudska medicina i deontologija. 4. obnovljeno i dopunjeno izd.Zagreb: Medicinska naklada; 2004.4 Williams E. D., Crews J. D. From Dust to Dust: Ethical and Practical Issues Involved inthe Location, Exhumation, and Identification of Bodies from Mass Graves. Croatian MedicalJournal. 2003;44(3):251-2585 Primorac D, Primorac D, Butorac S-S, Adamović M. Analiza DNA u sudskoj medicini.Hrvatski ljetopis za kazneno pravo i praksu. 2009;16(1):3-26.6 Primorac D. The role of DNA technology in identification of skeletal remains discoveredin mass graves. Forensic Science International. 2004;S163–S164.7 Alonso A, Anñelinović Š, Martin P, Sutlović D, Erceg I, Huffine E, de Simon LF, et al.DNA Typing from Skeletal Remains: Evaluation of Multiplex and Megaplex STR Systems onDNA Isolated from Bone and Teeth Samples. Croatian Medical Journal. 2001;42(3):502-8.8 Marjanović D, Primorac D. Molekularna forenzična genetika. Sarajevo; 2009.9 Anñelinović Š, Sutlović D, Erceg Ivkošić I, Škaro V, Ivkošić A, Paić F, Režić B, Definis-Gojanović M, Primorac D. Twelve-year experience in identification of skeletal remains frommass graves. Croatian Medical Journal. 2005;46(4):530-9.10 Borić I, Ljubković J, Sutlović D. Discovering the 60 years old secret: identification of theWorld War II mass grave victims from the island of Daksa near Dubrovnik, Croatia. CroatianMedical Journal. 2011;52(3)327-35. doi: 10.3325/cmj.2011.52.327.11 Šlaus M. Bioarheologija - Demografija, zdravlje, traume i prehrana starohrvatskihpopulacija. Zagreb: Školska knjiga; 2006.30

ZULIM, T.: Primjena fizikalno-kemijskih analiza u optimizaciji broja uzoraka kostiju zaDNA analizu. Diplomski rad8. SažetakU slučajevima kada je DNA-analizom potrebno utvrditi identitet velikog broja koštanihostataka, zbog visoke cijene same analize, kao i mogućnosti neuspjeha analize zbogkontaminacije i degradacije DNA, potrebno je prethodnim postupcima i analizamaoptimizirati broj koštanih uzoraka. Cilj ovoga rada bio je provjeriti iskoristivost i mogućnostikoje nude fizikalno-kemijske analize, kao predstavnici „klasičnih“ metoda, u procesuformiranja parova fragmenata lijevih i desnih natkoljeničnih kostiju koje pripadaju koštanimostacima ekshumiranim u rujnu 2009. godine u masovnim grobnicama na otoku Daksa ublizini Dubrovnika. Pri tomu su za provjeru uspješnosti fizikalno-kemijskih analiza iskorištenirezultati prethodno obavljene DNA-analize tih istih koštanih fragmenata kao nezaobilaznapotvrda/opovrgnuće rezultata formiranja parova uporabljenim fizikalno-kemijskim analizama.Fizikalno-kemijske analize su uključivale; mjerenje vanjskog promjera krajnjih dijelovafragmenata natkoljeničnih kostiju pomičnom mjerkom; mjerenje gustoće fragmenatadenzitometrijom; mjerenje mase i volumena fragmenata; odreñivanje prosječne gustoćefragmenata natkoljeničnih kostiju na temelju izmjerenih vrijednosti mase i volumena.Rezultati formiranja parova fragmenata na temelju fizikalno-kemijskih analiza usporeñeni sus rezultatima formiranja parova natkoljeničnih kostiju na temelju prethodno obavljene DNAanalize.Za sve uspješno formirane parove fragmenata, statističkim izračunom odreñeno jeodstupanje od podudarnosti izmeñu koštanih fragmenata koji čine jedan par u izmjerenimvrijednostima za sve parametre.Na temelju rezultata DNA-analize uspješno je formirano 36 parova natkoljeničnih kostiju.Fizikalno-kemijskim analizama formirano je 29 parova pri čemu je uspješnost formiranjaparova na temelju rezultata fizikalno-kemijskih analiza iznosila 75,86%. Najveći udio parovačiji se fragmenti meñusobno podudaraju u izmjerenim vrijednostima zabilježen je kododreñivanja parametra dužine natkoljenične kosti (25,9%) i parametra promjera glavenatkoljenične kosti (51,7%).Postupak koji je uključivao fizikalno-kemijske analize fragmenata lijevih i desnihnatkoljeničnih kostiju u svrhu formiranja parova i time reduciranja broja uzoraka za DNAanalizukoja slijedi, nije se u potpunosti pokazao uspješnim u optimiziranju konačnog brojauzoraka koštanih fragmenata.Ključne riječi: identifikacija, skeletni ostaci, DNA-analiza, fizikalno-kemijske analize,natkoljenična kost (lat. femur)31

ZULIM, T.: Application of physico-chemical analyses in optimization of bone samplesnumber for DNA analysis. Graduate thesisAbstractIn cases where it is necessary to determine the identity of a large number of skeletal remainsusing DNA typing techniques, due to the high cost of the analysis as well as the possibility offailure because of contamination and degradation of DNA, prior proceedings and analysis arerequired to optimize the number of bone samples for DNA analysis. The aim of this studywas to verify the usability and features offered by physico-chemical analyses, asrepresentatives of "classical" methods, in the process of matching fragments of left and rightfemurs belonging to skeletal remains exhumed in September 2009. from two mass graves onthe island Daksa near Dubrovnik. At the same time the performance of these analyses wasverified by the results of previously conducted DNA analysis of bone fragments thereof as aninevitable confirmation/denial of pairing results obtained by physico-chemical analyses.Physico-chemical analyses of 94 bone fragments included; measurement of the outer diameterof bone fragments; densitometry of the fragments; measurement of mass and volume offragments; determination of average bone density on the basis of measured values of the massand volume. The results of fragment matching by physico-chemical analyses were comparedwith the pairing results obtained by previously conducted DNA analysis. A deviation inmeasured values from matching bone fragments that make a pair was calculated for allsuccessfully matched fragments.36 pairs of femurs were successfully matched by DNA analysis. 29 pairs of femurs weresuccessfully matched based on the results of physico-chemical analyses. Success of theanalyses was expressed as a percentage with a value of 75.86%. The largest proportion ofmatched femur fragments were matched according to the measured values of theseparameters; femur lengths (25.9%) and diameter of femur heads (51.7%).Optimization of the number of bone fragment samples by physico-chemical analyses used inthe procedure of matching left and right femur fragments and thereby reducing the number ofsamples for DNA analysis that follows, was not proven fully successful.Keywords: identification, skeletal remains, DNA analysis, physico-chemical analyses, thethigh bone (lat. femur)32

9. ŽivotopisOsobni podaciIme i prezime Tamara ZulimDatum i mjesto roñenjaAdresa08. svibnja 1984. SplitStarčevićeva 25, 21000 Splite-mail tams8up@gmail.comObrazovanjelistopad 2009. - Sveučilište u Splitu, Sveučilišni studijski Centar za forenzične znanosti;Forenzična kemija i molekularna biologija2002.-2007.1998.-2002.Studij Biologija i ekologija mora, Sveučilišni studijski centar za studijemora Sveučilišta u Splitu- zvanje: dipl. ing. biologije i ekologije moraII. Gimnazija, SplitKongresi7. ISABS konferencija forenzičke, antropološke i medicinske genetike,Bol 201133