Estación Experimental de Aula Dei - CSIC - Consejo Superior de ...

Estación Experimental de Aula Dei
Consejo Superior de Investigaciones Científicas
(CSIC)
Zaragoza
Tesis Doctoral
CARACTERIZACIÓN Y REGULACIÓN DE LA CHAPERONA DE
COBRE PARA LA CuZn SUPERÓXIDO DISMUTASA
CLOROPLÁSTICA DE SOJA
Memoria presentada por Dña. Sara Sagasti Escalona,
Licenciada en Bioquímica, para optar al grado de Doctor en Ciencias
Zaragoza, Julio 2009

D. RAFAEL PICOREL CASTAÑO, Profesor de Investigación del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas (CSIC), adscrito a la Estación Experimental de Aula Dei de
Zaragoza
CERTIFICA:
Que la Tesis Doctoral titulada “Caracterización y regulación de la chaperona de cobre
para la CuZn superóxido dismutasa cloroplástica de soja”, ha sido realizada por la
licenciada Dña. SARA SAGASTI ESCALONA en el Departamento de Nutrición
Vegetal de la Estación Experimental de Aula Dei (CSIC) bajo su dirección, y que reúne,
a su juicio, las condiciones requeridas para optar al grado de Doctor en Ciencias.
Zaragoza, Julio de 2009
Fdo.: Dr. Rafael Picorel Castaño

A mi familia

“La verdadera ciencia enseña, por encima de todo, a dudar y a ser ignorante”
Miguel de Unamuno (1864-1936) Filósofo y escritor español.

AGRADECIMIENTOS
Me gustaría aprovechar estas líneas para agradecer a las personas que, de algún
modo u otro, han contribuido a la realización de esta Tesis Doctoral.
En primer lugar, quiero dar las gracias a mi director de Tesis, el Dr. Rafael
Picorel, por brindarme la oportunidad y confianza de trabajar en su laboratorio. Por
formarme, por su dedicación, su conocimiento y transmitirme su interés científico.
A la Dra. Inmaculada Yruela, por ponerme en contacto con el grupo y por la
ayuda que me ha prestado siempre que la he necesitado.
A las Dras. Milagros Medina y Susana Frago de la Universidad de Zaragoza, por
la colaboración recibida en algunos experimentos de espectroscopia, su profesionalidad
y amabilidad.
A la Fundación Ramón Areces, por la beca predoctoral que me ha permitido
realizar este trabajo.
A mis compañeros de la Estación Experimental de Aula Dei, Sofía, Rut, María
S., Irene, Aurora, Ade, Rubén, Jorge R., Hamdi, Ana Flor, Ana A., Fermín, Victoria,
Víctor, Saúl, Laura, Sergio, Celia, Jorge L., Loreto, MC, María C., Javier, Pilar, Manu,
Carmen P., Joaquín, María M., Merche, Natalia, Ana C., Carmen, Concha, Tere, Mariví
L., Jorge A., Manuel, Leticia, David, Nines, Nuria, Mª Ángeles, Azahara y Sara, por
todos los momentos compartidos dentro y fuera de Aula Dei. Por las charlas y risas que
hemos vivido en las comidas del “tupperware” y las celebraciones.
Por supuesto, no me puedo olvidar de mis “compis del labo”, María B. y Marian
(mis maestras), Raquel, Vanesa, Beatriz, Sara L., Miren, Maya, Miguel, Mariví R. y
Patricia. Han sido muchos años juntos llenos de buenos y malos momentos, pero el
compañerismo y la amistad prevalecen ante todo. Me siento afortunada de haber tenido
unos compañeros tan estupendos como vosotros.
A mis amigos, por estar siempre ahí, por ayudarme a desconectar del trabajo y
vuestras palabras en los momentos difíciles.
Son muchas las cosas que he recibido de mis padres, Adolfo y Mª Pilar, como mi
educación, la libertad de elegir, su fortaleza, sacrificio y sobre todo, su apoyo,
comprensión y amor incondicionales. A mi hermana, María, porque sé que siempre está
cuando la necesito, por hacerme reir y ver la vida con otros ojos. Por último, a mis
abuelos, Juan Luis, Lola, Mario y Mercedes, por vuestro cariño infinito. Una parte de
esta Tesis también es vuestra.

ABREVIATURAS
AO Ascorbato oxidasa
APS Persulfato amónico
APX Ascorbato peroxidasa
AS “Splicing” alternativo
ATP Trifosfato de adenosina
ATX Proteína antioxidante
Ax Absorbancia a una longitud de onda determinada
BCB Dominio de unión a cobre
BCIP 5-bromo-4-cloro-indolilfosfato
BSA Seroalbúmina bovina
CAO Amino oxidasa de cobre
CCH Chaperona de cobre
CCS Chaperona de cobre para la superóxido dismutasa
cDNA DNA complementario
Chl Clorofila
Cit Citocromo
COPT Transportador de cobre
COX Citocromo c oxidasa
CSD1 CuZnSOD citosólica
CSD2 CuZnSOD cloroplástica
CSD3 CuZnSOD peroxisomal
CuRE Elemento de respuesta a Cu
D1 Polipéptido del centro de reacción del fotosistema II
D2 Polipéptido del centro de reacción del fotosistema II
DC Dicroísmo circular
DEAE Dietil-aminoetil
DEPC Dietilpirocarbonato
DHAR Dehidroascorbato reductasa
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNAsa Desoxirribonucleasa I
D.O.x Densidad óptica a una longitud de onda determinada
DTT Ditiotreitol

EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
εx Coeficiente de extinción a una longitud de onda determinada
Fd Ferredoxina
FNR Ferredoxina-NADP + oxidorreductasa
FRO Óxido reductasa de hierro
GFP Proteína de fluorescencia verde
GR Glutatión reductasa
HEPES N-2-(hidroxi-etil) piperazine-N’-(ácido 2-etanosulfónico)
His6 Cola de seis histidinas
HMA ATPasa de metales pesados
ICP-MS Espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo
IMAC Cromatografía de afinidad por unión a metal
IPTG Isopropil-β-tio-D-galactopiranósido
Kd Constante de disociación
λ Longitud de onda
LB Medio Luria
LC Lacasa
LHCII Complejo de antena mayoritaria del fotosistema II
MALDI-TOF “Matrix-assisted laser desorption-time of flight”
MBP Proteína de unión a maltosa
MCO Oxidasas multicobre
MDHAR Monodehidroascorbato reductasa
MES Ácido 2-(N-morfolino) etano sulfónico
MRE Elemento de respuesta al metal
mRNA RNA mensajero
MT Metalotioneína
MWCO Límite de tamaño de poro de membranas de diálisis en Da
NA Nicotianamina
NADP + 2’-Fosfodinucleótido de nicotinamida y adenina oxidado
NADPH 2’-Fosfodinucleótido de nicotinamida y adenina reducido
NBT Azul de nitrotetrazolio
NRAMP “Natural resistance associated macrophage proteins”
NSP No “splicing”
ORF Marco abierto de lectura

PAA ATPasa para Arabidopsis tipo P
PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida
Pb Pares de bases
PC Fitoquelatina
Pc Plastocianina
Pheo Feofitina
Pi Fosfato inorgánico
PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
PPO Polifenol oxidasa
PS I Fotosistema I
PS II Fotosistema II
PsbA Gen que codifica a D1
PVDF Fluoruro de polivinilideno
QA Primera quinona aceptora de electrones del fotosistema II
QB Segunda quinona aceptora de electrones del fotosistema II
RbcL Gen que codifica la subunidad L de la Rubisco
RC Centro de reacción del fotosistema II
RNA Ácido ribonucleico
RNAsa H Ribonucleasa H
ROS Especies reactivas de oxígeno
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa reversa
SBP Promotor de unión a squamosa
SDS Dodecil sulfato de sodio
SOD Superóxido dismutasa
TEMED N, N, N’, N’-tetrametil-etil-N-diamina
Tm Temperatura de hibridación
Tricina N-tris(hidroximetil) metil glicina
Tris (tris)-hidroximetil-amino metano
UTR Región del mRNA que no se traduce
UV-Vis Ultravioleta-visible
YSL “Yellow stripe like”
YZ Tirosina Z de la proteína D1
YD Tirosina D de la proteína D2
ZIP “Zrt1-irt1-like proteins”

ÍNDICE
1 INTRODUCCIÓN.................................................................................................. 3
1.1 LA BIOQUÍMICA DEL COBRE .................................................................... 3
1.2 FUNCIÓN DEL COBRE EN PLANTAS........................................................ 5
1.2.1 PROTEÍNAS DE COBRE O CUPROPROTEÍNAS ............................... 5
1.2.1.1 Cuproproteínas que participan en el transporte de electrones .............. 5
1.2.1.1.1 Proteínas azules de cobre o cuprodoxinas ...................................... 5
1.2.1.1.2 Oxidasas azules o multicobre oxidasas (MCOs) ............................ 7
1.2.1.2 Cuproproteínas involucradas en el transporte electrónico, reducción
del oxígeno molecular y reducción de compuestos inorgánicos .......................... 7
1.2.1.3 Cuproproteínas con diversas funciones ................................................ 8
1.3 DEFICIENCIA DE COBRE EN PLANTAS ................................................. 12
1.4 TOXICIDAD DE COBRE EN PLANTAS.................................................... 13
1.4.1 Toxicidad de cobre en el cloroplasto...................................................... 14
1.4.2 Tolerancia al exceso de cobre................................................................. 19
1.5 HOMEOSTASIS DE COBRE EN PLANTAS .............................................. 22
1.5.1 Movilización y adquisición de cobre por la raíz..................................... 23
1.5.2 Transporte de cobre a través de la planta ............................................... 24
1.5.3 Distribución intracelular de cobre .......................................................... 26
1.5.3.1 COPT.................................................................................................. 29
1.5.3.2 YSL..................................................................................................... 29
1.5.3.3 ZIP ...................................................................................................... 30
1.5.3.4 NRAMP.............................................................................................. 30
1.5.3.5 P1B-ATPasas ....................................................................................... 31
1.5.3.6 Metalotioneínas .................................................................................. 33
1.5.3.7 Chaperonas de cobre o cuprochaperonas............................................ 34
1.5.4 Regulación.............................................................................................. 41
1.6 OBJETIVOS................................................................................................... 47
2 MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................ 51
2.1 MATERIAL BIOLÓGICO VEGETAL ......................................................... 51
2.1.1 Suspensiones celulares de soja (Glycine max) ....................................... 51
2.1.1.1 Cultivo en medio líquido .................................................................... 51

2.1.1.2 Cultivo en medio sólido...................................................................... 52
2.1.2 Plantas de soja ........................................................................................ 54
2.1.3 Tratamientos de suspensiones celulares de soja..................................... 55
2.1.4 Tratamientos de plantas de soja.............................................................. 56
2.2 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR ................................................ 56
2.2.1 Extracción del RNA de suspensiones celulares de soja ......................... 56
2.2.2 Extracción del RNA de plantas de soja .................................................. 57
2.2.3 RT-PCR semicuantitativa....................................................................... 57
2.2.3.1 Síntesis de cDNA ............................................................................... 57
2.2.3.2 Condiciones de PCR........................................................................... 58
2.2.4 Electroforesis de DNA en geles de agarosa............................................ 61
2.2.5 Clonación de los productos de PCR ....................................................... 62
2.2.5.1 Extracción de los productos de PCR de geles de agarosa mediante lana
de vidrio .………………………………………………………………………62
2.2.5.2 Ligación de los productos de PCR ..................................................... 63
2.2.5.3 Preparación de células competentes ................................................... 63
2.2.5.4 Transformación de Escherichia coli................................................... 64
2.2.5.5 Aislamiento de DNA plasmídico........................................................ 64
2.3 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR ...................................................... 65
2.3.1 Aislamiento de cloroplastos, tilacoides y estroma a partir de
suspensiones celulares y plantas de soja................................................................. 65
2.3.2 Aislamiento de cloroplastos intactos a partir de suspensiones celulares y
plantas de soja......................................................................................................... 66
2.3.3 Aislamiento de estroma y tilacoides a partir de cloroplastos intactos de
suspensiones celulares y plantas de soja................................................................. 68
2.4 TÉCNICAS BIOQUÍMICAS......................................................................... 69
2.4.1 Extracción de clorofila............................................................................ 69
2.4.2 Electroforesis SDS-PAGE de proteínas ................................................. 69
2.4.3 Ensayo de actividad SOD....................................................................... 71
2.5 TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS ............................................................... 74
2.5.1 Western Blot........................................................................................... 74
2.5.2 Desarrollo de anticuerpos contra GmCCS y GmCuZnSOD................... 77
2.6 OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA GmCCS RECOMBINANTE ................ 78
2.6.1 Clonación................................................................................................ 78

2.6.2 Inducción de la expresión en Escherichia coli ....................................... 81
2.6.3 Purificación............................................................................................. 81
2.7 SERVICIOS ................................................................................................... 84
2.7.1 Análisis MALDI-TOF ............................................................................ 84
2.7.2 Determinación de la secuencia N-terminal............................................. 84
2.7.3 ICP-MS................................................................................................... 85
2.8 TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS ............................................................ 85
2.8.1 Absorción UV-Vis.................................................................................. 86
2.8.2 Fluorescencia.......................................................................................... 87
2.8.3 Dicroísmo circular .................................................................................. 87
2.9 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO .................................................................. 88
2.9.1 Análisis de secuencias ............................................................................ 88
2.9.2 Modelado molecular............................................................................... 88
3 RESULTADOS ..................................................................................................... 91
3.1 REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GmCCS.................................... 91
3.1.1 Regulación por “splicing” alternativo .................................................... 91
3.1.2 Regulación por cobre.............................................................................. 97
3.2 REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GmCSD2 ................................. 99
3.2.1 Regulación por “splicing” alternativo .................................................... 99
3.2.2 Regulación por cobre............................................................................ 103
3.3 IDENTIFICACIÓN, LOCALIZACIÓN Y REGULACIÓN DE GmCCS Y
GmCSD2................................................................................................................... 104
3.3.1 Calidad del fraccionamiento subcelular ............................................... 105
3.3.2 Western blot anti-GmCCS.................................................................... 107
3.3.3 Western blot anti-GmCSD2 y ensayo de actividad SOD ..................... 112
3.4 CLONACIÓN, SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE GmCCS .... 115
3.4.1 Clonación.............................................................................................. 115
3.4.2 Inducción de la expresión en Escherichia coli ..................................... 116
3.4.3 Purificación........................................................................................... 119
3.5 CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE LA GmCCS
RECOMBINANTE PURIFICADA ......................................................................... 125
3.5.1 Absorción UV-Vis................................................................................ 125
3.5.2 Fluorescencia........................................................................................ 129

3.5.3 Dicroísmo circular ................................................................................ 131
3.6 BÚSQUEDA DE UNA HIPOTÉTICA cpCCS EN SOJA........................... 132
4 DISCUSIÓN........................................................................................................ 137
4.1 REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GmCCS Y GmCSD2 ............. 137
4.1.1 Regulación por “splicing” alternativo .................................................. 137
4.1.2 Regulación por cobre............................................................................ 140
4.2 IDENTIFICACIÓN, LOCALIZACIÓN Y REGULACIÓN DE GmCCS Y
GmCSD2................................................................................................................... 142
4.2.1 GmCCS................................................................................................. 142
4.2.2 GmCSD2............................................................................................... 143
4.3 SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE GmCCS.............................. 148
4.4 CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE LA GmCCS
RECOMBINANTE PURIFICADA ......................................................................... 149
4.5 BÚSQUEDA DE UNA HIPOTÉTICA cpCCS EN SOJA........................... 150
5 CONCLUSIONES .............................................................................................. 153
6 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 157
7 PUBLICACIONES............................................................................................. 179

INTRODUCCIÓN

1 INTRODUCCIÓN
1.1 LA BIOQUÍMICA DEL COBRE
3
Introducción
El cobre (Cu) es un metal de transición que pertenece a la posición 29 y al
subgrupo IB de la tabla periódica de los elementos. Este metal es abundante en la
corteza terrestre, su concentración es de 55 ppm (Mason y Moore, 1982). Se encuentra
presente principalmente en forma de minerales como la calcopirita (CuFeS2), calcocita
(Cu2S), cuprita (Cu2O) y malaquita [Cu2CO3(OH)2].
En estado fundamental su estructura electrónica es [Ar]3d 10 4s 1 . El bajo potencial
de ionización del electrón 4s 1 da por resultado una remoción fácil del mismo para
obtener el cobre(I) o ión cuproso, Cu + , y el cobre(II) o ión cúprico, Cu 2+ , se forma sin
dificultad por remoción de un electrón de la capa 3d. La especie Cu 3+ también se conoce
pero es muy inusual (Cotton y col., 1999). En la naturaleza, el Cu 2+ es bastante soluble
mientras que la solubilidad del Cu + se encuentra en el rango submicromolar. En los
seres vivos, el Cu se encuentra principalmente en forma de Cu 2+ , ya que la presencia de
oxígeno u otros aceptores de electrones oxidan fácilmente el Cu + a Cu 2+ . La oxidación
del Cu es reversible puesto que el Cu 2+ puede aceptar un electrón de reductores como el
ascorbato o el glutatión. Por otro lado, el Cu + es susceptible a la desproporción dando
como productos Cu 2+ y Cu 0 , como consecuencia de este proceso, es difícil obtener
soluciones estables de Cu + .
Los cationes de la serie de elementos d, como el Cu, presentan alta afinidad para
formar complejos de coordinación. Debido a su elevada afinidad electrónica, los
cationes mono y divalentes de Cu son los iones más efectivos para la unión a moléculas
orgánicas. La geometría, estequiometría y estabilidad de los centros de coordinación en
las moléculas orgánicas depende de la naturaleza de los ligandos y del estado de
oxidación del metal. En el estado de oxidación +1, el ión cuproso tiene todos los
orbitales d ocupados, por tanto es diamagnético, y los números de coordinación más
habituales son 2, 3 y 4 con geometría lineal, tetraédrica o trigonal. En el estado de
oxidación +2, el ión cúprico posee un electrón desapareado en el orbital d, por tanto es
paramagnético y los números de coordinación más habituales son 4, 5 y 6 con geometría
cuadrada plana, piramidal u octaedral tetragonalmente distorsionada (Koch y col.,
1997).

Introducción
La clasificación clásica de los centros de Cu en las cuproproteínas es la
siguiente:
− Centros de tipo I: Este tipo de centro se encuentra principalmente en las
cuproproteínas azules como la plastocianina. Su color azul se debe a que el espectro de
absorción presenta una intensa banda a 600 nm. La geometría de coordinación en estos
centros es tetraédrica distorsionada.
− Centros de tipo II: Las proteínas que tienen este tipo de centro como la CuZn
superóxido dismutasa (CuZnSOD), poseen propiedades espectroscópicas similares a las
de otros muchos complejos ordinarios de Cu. Su geometría de coordinación es cuadrada
distorsionada.
− Centros de tipo III: El sitio activo de estas proteínas contiene dos átomos de Cu
coordinados piramidalmente y próximos entre sí, acoplados antiferromagnéticamente.
Debido al incremento de estructuras que hay disponibles actualmente se han
encontrado otros tres centros de Cu adicionales, que no pueden ser incluidos en los tres
grupos anteriores. Por tanto, además de los centros tipo I, II y III, existen centros
trinucleares (tipo II + tipo III), centros CuA y/o CuB y centros tipo metalotioneína
(Falconi y Desideri, 2002; Kaim y Rall, 1996) (Tabla 1-1).
Tipo I
Trinuclear
Tipo II
Cu A
Tabla 1-1: Tipos de centros de Cu en las cuproproteínas.
4
Tipo III
Cu B

1.2 FUNCIÓN DEL COBRE EN PLANTAS
5
Introducción
Cuando la atmósfera de la tierra cambió de ser anaerobia a aerobia, hace unos
tres mil millones de años, la disponibilidad de Cu en el suelo aumentó notablemente al
mismo tiempo que disminuyó la disponibilidad de Fe (Kaim y Rall, 1996). Inicialmente
la evolución de los sistemas de detoxificación fue dominante y más tarde se desarrolló
su uso en funciones bioquímicas. La utilización de metales de transición como el Cu
para realizar funciones bioquímicas alcanzó un gran éxito y una tercera parte de las
estructuras de proteínas caracterizadas resultaron ser metaloproteínas (Finney y
O`Halloran, 2003).
Actualmente, se sabe que el Cu es un micronutriente esencial para el correcto
crecimiento y desarrollo de las plantas. El Cu actúa como un elemento estructural en
proteínas reguladoras y participa en el transporte electrónico fotosintético, la respiración
mitocondrial, la respuesta al estrés oxidativo, el metabolismo de la pared celular y la
señalización hormonal. Los iones de Cu actúan como cofactores de muchas enzimas
como la CuZnSOD, plastocianina (Pc), citocromo c oxidasa, lacasa, receptores de
etileno y para las oxidasas apoplásticas: ascorbato oxidasa, diamino oxidasa y polifenol
oxidasa. A nivel celular, el Cu también juega un papel importante en la señalización de
la transcripción y en la maquinaria del tráfico de proteínas, la fosforilación oxidativa y
la movilización del hierro (Marschner, 1995; Raven y col., 1999; Yruela, 2005).
Recientemente, se ha descrito otro papel del Cu en la biosíntesis del cofactor de
molibdeno (Kuper y col., 2004). Este hecho permite relacionar el metabolismo del Cu
con la asimilación de nitrógeno y la biosíntesis de fitohormonas (Mendel, 2005).
1.2.1 PROTEÍNAS DE COBRE O CUPROPROTEÍNAS
Las cuproproteínas se pueden clasificar en tres grupos según su función (De
Rienzo y col., 2000; Halcrow y col., 2001; Lindley, 2001a; Vila y Fernández, 2001):
1.2.1.1 Cuproproteínas que participan en el transporte de electrones
1.2.1.1.1 Proteínas azules de cobre o cuprodoxinas
− Plastocianina (Pc): Esta cuproproteína es clave para la fotosíntesis. Se
encuentra en los organismos fotosintéticos: cianobacterias, algas y plantas superiores.
Más del 50% del contenido de Cu en el cloroplasto está unido a esta proteína. Se
caracteriza por tener en su secuencia un solo dominio BCB (“blue-copper binding

Introducción
domain”) (Nerssisian y Shipp, 2002). La Pc es una óxido-reductasa de pequeño tamaño
(10 kDa) que se asocia extrínsecamente a la membrana tilacoidal en el lumen y actúa de
puente redox entre el citocromo (Cit) b6f y el fotosistema I (PSI). El grupo prostético de
esta proteína es un átomo de Cu ligado a cuatro aminoácidos (dos histidinas, una
cisteína y una metionina) con una geometría casi tetraédrica y está clasificado como
centro de Cu tipo I, que en su forma oxidada exhibe el típico color azul de las proteínas
de este grupo (azulina, amicianina, pseudoazurina y estelacianina) (Bonilla, 2000). La
Pc está codificada por un gen nuclear (petE) de manera que se sintetiza como
preapoproteína en el citoplasma para ser posteriormente transportada a través de la
membrana del cloroplasto (en plantas superiores o algas) y después hacia el lumen del
tilacoide, donde se une al Cu para formar la holoproteína. En cianobacterias y algunas
algas, la biosíntesis de la Pc está controlada por la disponibilidad de Cu en el medio de
cultivo. Si el contenido de Cu en el medio es inferior a la cantidad requerida para
mantener la concentración necesaria de Pc, se inicia la transcripción del gen petJ que
codifica para el Cit c6. En estas condiciones, este citocromo sustituye a la Pc en la
cadena de transporte electrónico fotosintético (Merchant, 1998; Molina-Heredia y col.,
2003). En plantas superiores se ha identificado una proteína homóloga (Cit c6A) al Cit c6
de cianobacterias y algas (Wastl y col., 2002, 2004; Weigel y col., 2003a; Howe y col.,
2006; Schlarb-Ridley y col., 2006), pero se ha demostrado que no realiza la misma
función (Weigel y col., 2003b). Se ha descrito que el exceso de Cu disminuye los
niveles de transcrito de la Pc en Arabidopsis (Schiavon y col., 2007) y arroz (Sudo y
col., 2008). Por el contrario, el exceso de Cu incrementa los niveles de la proteína en
Arabidopsis, lo que sugiere una regulación postranscripcional de la Pc (Abdel-Ghany y
Pilon, 2008). Por otro lado, se ha descrito que en Arabidopsis existen dos genes que
codifican para la Pc, PETE1 y PETE2. Recientemente, se ha publicado que PETE2 es la
isoforma más abundante y se acumula en respuesta al aumento de Cu en el medio
actuando como tampón del exceso de este metal, además de transportar electrones. Por
el contrario, PETE1 transporta los electrones en condiciones de deficiencia de Cu y su
expresión no se modifica en respuesta a la adición de Cu (Abdel-Ghany, 2009).
− Plantacianina: Pertenece a la familia de las fitocianinas. Tiene un tamaño de
10 kDa, aproximadamente. Se caracteriza por tener en su secuencia un solo dominio
BCB (Nerssisian y Shipp, 2002). Recientemente, se ha demostrado que esta proteína
desempeña un papel importante en el desarrollo de la antera y en la polinización en A.
thaliana (Dong y col., 2005).
6

1.2.1.1.2 Oxidasas azules o multicobre oxidasas (MCOs)
7
Introducción
− Ascorbato Oxidasa (AO): Es una glicoproteína que posee tres dominios
BCB. Cataliza la oxidación del ácido ascórbico a ácido dehidroascórbico. Esta enzima
contiene ocho átomos de Cu por molécula que se asignan a dos centros de Cu tipo I, dos
tipo II y dos tipo III. Se encuentra en tallos, flores, frutos y semillas tanto en etapas
tempranas como tardías del desarrollo y en células diferenciadas y no diferenciadas
(Chichiricco y col., 1989; Hayashi y Morohashi, 1993). A nivel celular, se ha localizado
en la pared celular y en el citoplasma (Nerssisian y Shipp, 2002). Puede actuar como
oxidasa terminal de la cadena respiratoria o en combinación con la enzima polifenol
oxidasa. La expresión de la AO se induce por la luz y por la aparición de heridas por lo
que se cree que actúa en los mecanismos de defensa frente a oxidantes relacionados con
el ascorbato o vitamina C (Nakamura y Go, 2005).
− Lacasa (LC): Esta enzima posee tres dominios BCB y contiene ocho
átomos de Cu por molécula que se asignan a dos sitios de Cu tipo I, dos tipo II y dos
tipo III. Cataliza la oxidación de diversas sustancias fenólicas e inorgánicas. En plantas,
participa en mecanismos de respuesta a la herida y en la síntesis de lignina (Nerssisian y
Shipp, 2002; Nakamura y Go, 2005).
1.2.1.2 Cuproproteínas involucradas en el transporte electrónico, reducción del
oxígeno molecular y reducción de compuestos inorgánicos
− Citocromo c oxidasa (COX): Es una oxidasa terminal de la cadena de
transporte electrónico mitocondrial que cataliza la transferencia de electrones. La
energía que se produce tras este proceso es utilizada para bombear protones hacia el
exterior de la membrana mitocondrial y sintetizar ATP. Contiene dos átomos de Cu y
dos átomos de Fe (hemo). Cuando esta enzima se inhibe existe otra oxidasa llamada
“oxidasa alternativa” que proporciona una ruta de oxidación alternativa en la
mitocondria. En esta vía no se produce el bombeo de protones al exterior por lo que
toda la energía producida se pierde en forma de calor. Esta oxidasa alternativa contiene
Cu pero no contiene Fe (Marschner, 1995).
− Diamino oxidasa (CAOs): Es una flavoproteína que pertenece a la
familia de las amino oxidasas que contienen Cu en su estructura (CAO, “copper
containing amine oxidases”). Su función consiste en catalizar la oxidación aeróbica de
poliaminas a aldehídos. Esta familia de proteínas se ha descrito en un amplio rango de

Introducción
organismos (bacterias, levaduras, plantas y mamíferos). Todas las CAOs caracterizadas
son proteínas homodiméricas, cada subunidad tiene un peso molecular de 70-95 kDa y
un átomo de Cu y un grupo carbonilo como cofactor (Halcrow y col., 2001). En plantas,
la enzima diamino oxidasa se encuentra localizada en el apoplasto de la epidermis y en
el xilema de tejidos maduros donde se ha propuesto que funciona como sistema
liberador de peróxido de hidrógeno (H2O2), necesario para la actividad peroxidasa en el
proceso de lignificación y suberización (Marschner, 1995). En general, las amino
oxidasas de plantas participan en el crecimiento y desarrollo de la planta, y en los
mecanismos de defensa a través de la formación de metabolitos secundarios (Cona y
col., 2006).
− Polifenol oxidasa (PPO): Es una metaloenzima que contiene un centro de
unión de Cu tipo III y es homóloga a la enzima hemocianina encontrada en moluscos.
La PPO puede tener actividad cresolasa utilizando el oxígeno molecular para catalizar la
oxidación de varios monofenoles a o-difenoles y actividad catecolasa (oxidación de odifenoles
a o-quinonas). El sitio activo de todas las PPO es un centro dinuclear formado
por dos átomos de Cu, cada uno de ellos coordinado a tres histidinas (Gerdemann y col.,
2002). Las PPOs de plantas están codificadas por genes nucleares y contienen un
péptido señal que dirige la proteína al lumen tilacoidal donde se encuentra en forma
soluble o débilmente unida a la membrana tilacoidal (Sommer y col., 1994). El peso
molecular de la preproteína está en torno a 55-70 kDa y la proteína madura se obtiene
tras la ruptura proteolítica de un fragmento de 15-20 kDa del extremo C-terminal
(Marusek y col., 2006). Las PPOs son abundantes en la pared celular, donde participan
en la biosíntesis de lignina, y en las membranas tilacoidales donde se ha propuesto que
se requieren para la síntesis de pigmentos (betalaínas) y para la detoxificación de
especies reactivas de oxígeno (Marschner, 1995; Marusek y col., 2006).
1.2.1.3 Cuproproteínas con diversas funciones
Las proteínas que pertenecen a esta familia en las plantas son: la CuZnSOD, las
Cu-ATPasas (ver 1.5.3.5), las metalotioneínas (ver 1.5.3.6) y las cuprochaperonas (ver
1.5.3.7) (Lindley, 2001b).
− CuZnSOD: Se conocen tres clases de SODs en plantas según el metal
que contienen como cofactor: la MnSOD (mitocondria), la FeSOD (cloroplasto) y la
CuZnSOD, esta última se detallará a continuación dado que ha sido objeto de estudio en
8

9
Introducción
esta Tesis. La MnSOD y la FeSOD están estructuralmente relacionadas, sin embargo, la
CuZnSOD no muestra ninguna relación estructural con las anteriores (Harris y col.,
1980), por lo que se cree que pudo evolucionar independientemente en respuesta a la
producción de oxígeno (O2) por los organismos fotosintéticos (Asada y Takahashi,
1987). Esta hipótesis está avalada por la distribución filogenética de los tres tipos de
enzimas, ya que los procariotas contienen MnSOD, FeSOD o ambas, mientras que no
contienen CuZnSOD excepto algunas bacterias. Las tres SODs son de origen nuclear.
La CuZnSOD es una enzima ubicua en todos los organismos eucariotas aerobios,
aunque también está presente en el espacio periplásmico de algunas bacterias y
constituye una de sus defensas primarias frente a las especies reactivas de oxígeno. Esta
enzima cataliza la dismutación del radical superóxido (O2 - ), producido como
consecuencia de la fotoreducción del O2 en el PSI, a peróxido de hidrógeno (H2O2) y
O2. El H2O2 generado como producto de la reacción es eliminado por la catalasa o por la
ascorbato peroxidasa (APX) en el ciclo ascorbato-glutatión y es reducido a H2O en el
ciclo H2O-H2O (W-W) (Asada, 1999) (Fig. 1-1). Mediante la eliminación del radical O2 -
, la CuZnSOD disminuye el riesgo de formación de radical hidroxilo (⋅OH) a través de
la reacción de Haber-Weiss. La enzima CuZnSOD es junto a la Pc, la mayor receptora
de Cu en el cloroplasto. El Zn 2+ tiene principalmente una función estructural y el Cu 2+
se encuentra en el sitio activo de la enzima y tiene una función principalmente catalítica,
involucrado directamente en los mecanismos de detoxificación de los radicales O2 -
generados durante la fotosíntesis (McCord y Fridowich, 1969). Existen actualmente
estructuras tridimensionales resueltas disponibles de la proteína CuZnSOD (Djinovic y
col., 1992; Banci y col., 2003).
La CuZnSOD de plantas está formada generalmente por homodímeros de 30-33 kDa. Se
localiza en el apoplasto, citosol, cloroplasto, glioxisoma, núcleo, espacio intermembrana
mitocondrial y vacuola. En Arabidopsis se han identificado siete genes que codifican
para las SODs: tres para la CuZnSOD, tres para la FeSOD y uno para la MnSOD. La
enzima CuZnSOD consta de la isoenzima citosólica codificada por el gen CSD1, la
cloroplástica codificada por el gen CSD2 y la peroxisomal codificada por el gen CSD3
(Kliebenstein y col., 1998). Las dos isoenzimas mayoritarias en el tejido verde son la
citosólica y la cloroplástica, esta última se encuentra en el estroma tanto en forma
soluble como asociada de forma periférica a las membranas tilacoidales (Ogawa y col.,
1995). Las isoformas de la CuZnSOD identificadas hasta ahora son: cinco en Pinus
sylvestris de las cuales cuatro son citosólicas y una es cloroplástica (Streller y col.,

Introducción
1994), siete en arroz de las cuales dos son cloroplásticas (http://www.gramene.org), dos
en cebada (Mascher y col., 2005), una en Olea europaea (Butteroni y col., 2005), una
en Radix lethospermi (Haddad y Yuan, 2005), tres en remolacha (Pradedova y col.,
2009), tres citosólicas en tabaco (Sheng y col., 2004) y una cloroplástica en algodón
(Hu y col., 2007). Se han identificado tres isoformas citosólicas y una isoforma
cloroplástica de CuZnSOD en maíz que se inducen por Cu (Ruzsa y Scandalios, 2003),
aunque otros autores han identificado cuatro isoformas cloroplásticas de CuZnSOD en
esta misma planta (Mauro y col., 2005). Esta variabilidad en el número de isoformas de
la enzima CuZnSOD de plantas puede ser causada por variaciones fisiológicas debidas a
diferencias en las condiciones de cultivo o a diferencias genéticas entre variedades. La
existencia de varias isoformas de la CuZnSOD en plantas puede deberse a la existencia
de múltiples genes o a la existencia de modificaciones postraduccionales. Son
numerosos los trabajos publicados donde estudian el efecto del Cu en la expresión de la
CuZnSOD. Se ha descrito en tabaco que el exceso de Cu induce el nivel de mRNA pero
no la actividad de la CuZnSOD cloroplástica (Kurepa y col., 1997). Se ha demostrado
que el exceso de Cu induce la actividad de la CuZnSOD citosólica en raíz de soja
(Chongpraditnun y col., 1992). También se ha descrito un aumento de la actividad
CuZnSOD en cultivos celulares de tabaco tratados con Cu (Bueno y Piqueras, 2002), sin
embargo, el Cu no afectó a la actividad CuZnSOD en hojas de Pisum sativum (Palma y
col., 1987). Se ha estudiado el efecto del exceso de Cu en hojas de A. thaliana y se ha
observado un aumento de la actividad SOD en respuesta a Cu (Drazkiewicz y col.,
2004, 2007). Otras cuproproteínas de este grupo se mencionan más adelante.
10

ESTROMA
Fotones
Oxidasa alternativa
11
Fotones
Introducción
Figura 1-1: Localización y función de la CuZnSOD en la eliminación de radicales
superóxido producidos en el PSI del cloroplasto (Adaptada de Asada, 2006).
PROTEÍNA
Plastocianina
Plantacianina
Ascorbato oxidasa
Lacasa
Citocromo c oxidasa
Diamino oxidasa
Polifenol oxidasa
CuZnSOD
Cuprochaperonas
Metalotioneínas
Cu-ATPasas
TIPO DE CENTRO
I
I
II + III
II + III
Cu A + Cu B
II
III
II
Tipo metalotioneína
Tipo metalotioneína
Tipo metalotioneína
FUNCIÓN
Fotosíntesis
Desarrollo de la antera y
polinización
Metabolismo de la pared celular
Defensa antioxidante
Lignificación
Respiración aerobia
Lignificación
Defensa
Síntesis de pigmentos
Defensa antioxidante
Lignificación
Defensa antioxidante
Distribución intracelular de Cu
Detoxificación
Distribución intracelular de Cu
Detoxificación
Tabla 1-2: Resumen de las principales características de las cuproproteínas en plantas.

Introducción
1.3 DEFICIENCIA DE COBRE EN PLANTAS
Es necesario que la concentración de Cu libre se mantenga a bajos niveles en las
células puesto que este elemento es extremadamente tóxico debido a sus propiedades
redox. El contenido medio de Cu en el tejido de la planta es 10 μg.g -1 de tejido seco
(Baker y Senef, 1995). La concentración crítica de Cu libre en el medio de nutrientes
(por debajo de la cual hay deficiencia) se encuentra en el rango de 10 -14 a 10 -16 M. Las
plantas encuentran un suministro variable de Cu en el suelo aunque las concentraciones
típicas están en el rango de 10 -6 a 10 -9 M, sin embargo, todavía necesitan solubilizar y
reducir este metal. Actualmente, no se han caracterizado transportadores específicos que
incorporen el Cu del ambiente, pero existe la evidencia de que el Cu es reducido. Las
plantas con deficiencia de Cu muestran cambios en la expresión de varios genes y la
activación de cambios morfológicos en la raíz, en la hoja y en los órganos
reproductivos. Los síntomas típicos de la deficiencia de Cu aparecen primero en las
puntas de las hojas jóvenes y se extienden posteriormente a lo largo de los márgenes de
las hojas. Las hojas pueden sufrir también giros o malformaciones y presentar clorosis e
incluso necrosis (Marschner, 1995). Se ha descrito que la deficiencia de Cu reduce el
transporte fotosintético en el PSI debido a una disminución en la concentración de la Pc
(Baszynski y col., 1978; Shikanai y col., 2003), que es la mayor diana de la deficiencia
de Cu en la fotosíntesis. Se ha observado una disminución de la actividad del PSII en
cloroplastos deficientes en Cu (Droppa y col., 1987; Henriques, 1989). Droppa y col.
(1987) concluyeron que la deficiencia severa de Cu provoca cambios en las membranas
tilacoidales y modifica el ambiente del lado aceptor del PSII. Estos autores detectaron la
ausencia de un polipéptido de 29 kDa, una proteína de la antena minoritaria del PSII.
Las plantas deficientes de Cu muestran las membranas tilacoidales desorganizadas
(Baszynski y col., 1978; Henriques, 1989) así como una disminución en el contenido de
pigmentos (clorofilas y carotenoides), una reducción en la síntesis de plastoquinona y
un menor contenido de ácidos grasos insaturados C18 (Barón y col., 1992). La
regulación de los genes dirigidos a estos eventos envuelve una serie de mecanismos
moleculares que comienzan con sensores de la deficiencia de Cu y, a continuación,
transmiten la señal a través de vías de transducción del sistema vascular de la planta.
Las señales entre las partes aéreas de la planta, incluyendo el meristemo apical y la raíz,
da lugar a la activación o inactivación de factores de transcripción que influyen en la
expresión de genes específicos. Actualmente, no está del todo claro cómo las plantas
12

13
Introducción
detectan y responden a la deficiencia de Cu u otros micronutrientes esenciales (Yruela,
2005).
1.4 TOXICIDAD DE COBRE EN PLANTAS
Algunos suelos presentan altas concentraciones de Cu naturalmente, mientras
que otros contienen niveles tóxicos de Cu como consecuencia de la participación
humana en forma de minas, industria, desecho de aguas contaminadas y el uso de
fertilizantes y abonos orgánicos en la agricultura (He y col., 2005). El Cu en
concentraciones superiores a la requerida, inhibe el crecimiento de la planta e interfiere
en importantes procesos celulares como la fotosíntesis y la respiración (Marschner,
1995; Prasad y Strzalka, 1999). En estas condiciones, las plantas presentan una
reducción de su biomasa, una inhibición del crecimiento de la raíz, un descenso en el
número y tamaño de las hojas, defectos en la floración, descenso en el índice de
germinación y síntomas de clorosis (Marschner, 2002).
Las propiedades redox que hacen al Cu esencial contribuyen también a su
toxicidad. El Cu puede cambiar cíclicamente su estado de oxidación en la célula cuando
entra en contacto con productos intermediarios del metabolismo aerobio, llamados
especies reactivas de oxígeno: radical superóxido (O2 - ), anión peróxido (O2 2- ), peróxido
de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (⋅OH). Estas especies reactivas se generan por
la reducción incompleta del oxígeno molecular durante la fotosíntesis y la respiración.
De esta forma, el Cu + puede generar radicales ⋅OH (reacción de Fenton) y el Cu 2+
resultante se puede volver a reducir en presencia del radical superóxido:
Cu + + H2O2 → Cu 2+ + OH - + ⋅OH
Cu 2+ + O2 - → Cu + + O2
El balance neto de estas dos reacciones se conoce como reacción de Haber-
Weiss, en la cual el Cu cataliza la producción de radical ⋅OH a partir de O2 - y de H2O2.
Estos radicales son altamente tóxicos y dañan al ADN, lípidos, proteínas y otras
biomoléculas (Halliwell y Gutteridge, 1984). A nivel celular, la toxicidad por Cu puede
ser debida a: la unión a grupos sulfidrilo de proteínas inhibiendo su función o actividad
enzimática, la inducción de la deficiencia de otros iones esenciales, el daño al proceso

Introducción
de transporte celular y el daño oxidativo (van Assche y Clijsters, 1990; Meharg, 1994).
El daño oxidativo que provoca el exceso de Cu en las plantas induce cambios en la
actividad y el contenido de algunos componentes de las vías antioxidantes tales como
son la ascorbato peroxidasa (APX), la monodehidroascorbato reductasa (MDHAR), la
dehidroascorbato reductasa (DHAR), la glutatión reductasa (GR), la superóxido
dismutasa (SOD) y la guiacol peroxidasa (De Vos y col., 1992; Luna y col., 1994; Stohs
y Bagchi, 1995; Navari-Izzo y col., 1998; Gupta y col., 1999; Drazkiewicz y col., 2003;
Wang y col., 2004). Se ha observado respuesta antioxidante en hojas y raíz, siendo
ambas dependientes de la concentración de Cu y del tiempo de exposición. Por otro
lado, se ha descrito que el ciclo ascorbato-glutatión está envuelto en la respuesta al
exceso de Cu (Gupta y col., 1999; Drazkiewicz y col., 2003).
1.4.1 Toxicidad de cobre en el cloroplasto
En eucariotas, la fotosíntesis tiene lugar en el cloroplasto que es un orgánulo
especializado de la familia de los plastidios. Estos orgánulos se localizan principalmente
en las células del mesófilo, tejido interior de la hoja. El cloroplasto está rodeado por una
doble membrana, la membrana externa y la membrana interna. El espacio entre ambas
membranas se denomina espacio intermembranal. La región acuosa encerrada por la
membrana interna se denomina estroma y contiene las enzimas requeridas para las
reacciones de fijación de carbono. Suspendida en el estroma existe una membrana
continua llamada membrana tilacoidal, la cual encierra un espacio interno conocido
como lumen. La membrana tilacoidal está muy plegada en un entramado de vesículas
aplastadas, con forma de saco, pudiendo disponerse en apilamientos denominados grana
(Fig. 1-2). Las porciones de la membrana tilacoidal que se localizan dentro de los grana
se llaman lamelas granales, mientras que las porciones de la membrana tilacoidal
expuestas al estroma se conocen como lamelas estromales. En A. thaliana se ha descrito
que una tercera parte del Cu de las plantas se encuentra en los cloroplastos de las células
del tejido verde (Shikanai y col., 2003), y la mitad de esta parte se encuentra en los
tilacoides, asociado probablemente a la Pc.
14

Figura 1-2: Estructura del cloroplasto.
15
Introducción
La fotosíntesis se define como el proceso de captura y conversión de la energía
de la luz solar en energía química o en biomasa por los organismos fotosintéticos
(plantas, algas y bacterias fotosintéticas) y puede resumirse en la siguiente ecuación
química:
luz
CO2 + H2O (CH2O) + O2 Donde (CH2O) representa a los carbohidratos. Los procesos que ocurren en la
fotosíntesis se clasifican en dos grupos: procesos unidos a membrana y procesos no
unidos a membrana, tradicionalmente conocidos como reacciones luminosas y
reacciones oscuras, respectivamente. En los primeros, la energía solar es transformada
en energía química; los pigmentos de las células fotosintéticas absorben la energía solar
y la transforman para dar finalmente lugar a ATP y NADPH después de múltiples
reacciones, a la vez que se desprende oxígeno. En los procesos no unidos a membrana,
el ATP y el NADPH son las fuentes de energía requeridas para convertir el dióxido de
carbono atmosférico en hidratos de carbono lo que se conoce como fijación de carbono
o ciclo de Benson-Calvin. Los productos de las reacciones unidas a membrana de la
fotosíntesis también se utilizan para otras muchas reacciones que tienen lugar en el
cloroplasto.

Introducción
En las membranas tilacoidales están embebidos los complejos multiproteicos: PSI, PSII,
Cit b6f y ATP sintasa (Fig. 1-3). Los fotosistemas (PS) I y II son complejos de
pigmentos-proteínas que contienen aproximadamente 200-250 moléculas de clorofila y
50 moléculas de carotenoides, aproximadamente, cada uno. Cada PS está constituido
por un centro de reacción (RC) y un complejo “antena”. El complejo “antena” capta la
energía lumínica y transfiere la energía de excitación al RC donde se produce la
separación de cargas entre pigmentos que actúan como donador y aceptor de electrones.
Esta separación de cargas se estabiliza a través de aceptores secundarios de electrones y
cataliza un transporte electrónico a través de la membrana fosfolipídica que conducirá,
finalmente, a la formación de NADPH en el lado aceptor del PSI. Como consecuencia
de estos procesos, se establece un gradiente de pH a través de la membrana que dará
lugar a la formación de ATP, catalizada por la ATP sintasa. Ambos PS se encuentran
conectados por medio del Cit b6f mediante un transporte electrónico no cíclico
denominado esquema Z. Además de estos complejos de membrana, también intervienen
en este transporte electrónico proteínas solubles como la Pc, que actúa como donador de
electrones al PSI una vez reducida por el Cit b6f, y la ferredoxina (Fd) que acepta
electrones del PSI y reduce a la ferredoxina-NADP reductasa (FNR), la cual reducirá a
su vez al NADP + .
Figura 1-3: Transporte electrónico fotosintético.
Las hojas de las plantas crecidas a elevadas concentraciones de Cu presentan un
contenido menor de clorofila y alteraciones en la estructura del cloroplasto y en la
16

17
Introducción
composición de la membrana tilacoidal (Baszynski y col., 1988; Lidon y Henriques,
1991; 1993; Ciscato y col., 1997; Pätsikkä y col., 1998; Quartacci y col., 2000). En
concreto, se ha observado una desorganización de las zonas apiladas y no apiladas de
los cloroplastos, un incremento en el número y tamaño de las plastoglobulinas y la
aparición de inclusiones intratilacoidales.
Se ha propuesto que el cobre interfiere en la biosíntesis de la maquinaria
fotosintética modificando la composición de los pigmentos y las proteínas de las
membranas fotosintéticas (Lidon y Henriques, 1991; Maksymiec y col., 1994). Además,
se han observado peroxidación de lípidos, descenso del contenido lipídico y cambios en
la composición de ácidos grasos de las membranas tilacoidales (Sandmann y Böger,
1980; Luna y col., 1994; Maksymiec y col., 1994). Como consecuencia de estas
modificaciones, la fluidez de la membrana del PSII es alterada (Quartacci y col., 2000).
Por otro lado, el descenso de la actividad fotoquímica provocado por el Cu se
acompaña in vivo por una alteración de la estructura y composición de las membranas
tilacoidales, lo cual influye en la conformación y función de los fotosistemas (Baszynski
y col., 1988; Ouzounidou y col., 1992; Lidon y col., 1993). En suspensiones celulares
fotosintéticas de soja se ha descrito una ausencia de efectos tóxicos por altas
concentraciones de Cu, al contrario de lo que ocurre en las plantas. Estas células
presentan incrementos de: acumulación de Cu en su interior, actividad de
desprendimiento de oxígeno, número de cloroplastos por célula aunque de menor
tamaño, grado de apilamiento de los tilacoides (grana) (Fig. 1-4), emisión de
fluorescencia de los complejos antena del PSII y síntesis de Pc (Bernal y col., 2006).
A B
Figura 1-4: Efecto del Cu en la ultraestructura del cloroplasto. Microscopía electrónica
de transmisión en células de soja control (A) y adaptadas a 10 μM de Cu (B) (Adaptada
de Bernal y col., 2006).

Introducción
Numerosos estudios in vitro han demostrado que la cadena de transporte
electrónico fotosintético es muy sensible a la acción tóxica del Cu y en particular el PSII
(Droppa y Horváth, 1990; Barón y col., 1995). El lado donador y el lado aceptor de
electrones del PSII han sido propuestos como lugares de acción tóxica del Cu. En el
lado aceptor del PSII, el sitio de QB (Mohanty y col., 1989) y el dominio feofitina
(Pheo)-Fe-QA (Yruela y col., 1991, 1992, 1993, 1996a) se han mostrado como los sitios
más sensibles a la acción tóxica del Cu (Fig. 1-5). En el lado donador del PSII, la
tirosina Z (YZ) de la proteína D1 (Arellano y col., 1995), la tirosina D (YD) de la
proteína D2 (Sersen y col., 1997), el complejo de manganeso y las proteínas extrínsecas
que estabilizan el complejo de manganeso, son los sitios propuestos de acción tóxica del
Cu. Los diferentes lugares de acción del ión Cu descritos en la literatura dependen de la
cantidad de Cu aplicada por unidad de centro de reacción (RC). A concentraciones de
Cu bajas (Cu/RC ≤ 250) se produce un descenso del 50% en la actividad fotosintética y
en la fluorescencia variable de la clorofila a, sin observarse cambios en la composición
polipeptídica del PSII. Sin embargo, a concentraciones de Cu altas (Cu/RC > 250), se
desprenden las proteínas extrínsecas de 33, 23 y 17 kDa que estabilizan el complejo de
manganeso que cataliza la oxidación del agua. Por el contrario, el complejo antena
LHCII y la proteína D1 del PSII no se ven afectados por el Cu incluso a altas
concentraciones (Yruela y col., 2000).
18

19
Introducción
Figura 1-5: Sitios de acción del ión Cu en el fotosistema II de plantas (Adaptada de
Yruela, 2005).
Respecto al Cit b559, asociado al RC del PSII, se ha descrito que el Cu afecta a
sus propiedades redox (Jegerschöld y col., 1995; Yruela y col., 1996b, 2000; Roncel y
col., 2001; Burda y col., 2003; Bernal y col., 2004). Por otro lado, se ha demostrado que
el Cu estimula los efectos adversos generados por la fotoinhibición (Aro y col., 1993).
Esta estimulación puede ser debida a un efecto directo del Cu en el PSII (Yruela y col.,
1996b) o a la disminución del contenido de clorofila en hoja debido a una competición
entre el transporte de Fe y Cu en la raíz (Pätsikkä y col., 2001, 2002).
1.4.2 Tolerancia al exceso de cobre
Todas las plantas poseen mecanismos de tolerancia para evitar la toxicidad de
los metales que contiene el suelo. A nivel celular, los mecanismos que utilizan son los
siguientes: reducción de la adquisición del metal por acción de micorrizas o de
exudados extracelulares, estimulación de la salida del metal a través de la membrana
plasmática, formación de complejos con ácidos orgánicos, metalotioneínas,
fitoquelatinas, compartimentalización en la vacuola, etc. (Hall, 2002).

Introducción
Los ácidos orgánicos como el citrato, el malato y el oxalato son excretados por
las plantas para defenderse de la toxicidad provocada por los metales. En el caso del Cu,
se ha descrito su papel como inductor de la exudación de ácidos orgánicos por la raíz
(Yang y col., 2001), principalmente de citrato (Murphy y col., 1999). Además, se ha
demostrado que la aplicación exógena de malonato, malato (Parker y col., 2001) y
succinato (Doncheva y col., 2006) aumenta la resistencia de la planta a la toxicidad
provocada por un exceso de Cu.
Una vez que los metales se encuentran dentro de las células de la raíz, son
translocados por transportadores de membrana, proteínas y otras moléculas de unión a
metal hasta su destino final. Las metalotioneínas (MT) y posiblemente las fitoquelatinas
(PC) juegan un importante papel en la tolerancia a Cu (Cobbet y Goldsbrough, 2002).
Las metalotioneínas son polipéptidos ricos en cisteína codificados por una familia de
genes. Por el contrario, las fitoquelatinas son una familia de péptidos ricos en cisteína
sintetizados enzimáticamente a partir de glutatión. Existen evidencias claras de la
participación de las metalotioneínas en el mecanismo de tolerancia a Cu: el nivel de
expresión de las metalotioneínas de tipo II está estrechamente relacionado con la
tolerancia a Cu en un grupo de ecotipos de A. thaliana (Murphy y Taiz, 1995) y
aumenta en el mutante cup1-1 de A. thaliana que se caracteriza por acumular de 2 a 3
veces más de Cu (van Vliet y col., 1995); la tolerancia a Cu de la planta metalófila
Silene vulgaris está relacionada con el aumento de expresión de las metalotioneínas de
tipo II (Van Hoof y col., 2001); la transformación de plantas transgénicas de tabaco con
el gen de la metalotioneína MT CUP1 de levaduras contribuye a la fitoextracción de Cu
de suelos contaminados (Thomas y col., 2003); MT1a juega un papel importante en la
acumulación de Cu en la raíz de Arabidopsis (Guo y col., 2008); MT3 de la planta
hiperacumuladora Thlaspi caerulescens favorece la unión a Cu, probablemente para
asegurar una adecuada homeostasis de este metal y muestra importantes diferencias
respecto a su homóloga en Arabidopsis (Roosens y col., 2004). Sin embargo, no se ha
encontrado un papel claro de las PCs en la detoxificación del Cu. Se sabe que el Cu
activa la síntesis de las PCs, pero mutantes deficientes en estas proteínas no muestran
sensibilidad a este metal. Recientemente, se ha demostrado que las MTs y las PCs
funcionan cooperativamente en la protección de las plantas frente al efecto tóxico del
Cu y Cd (Guo y col., 2008).
Actualmente, se propone que tanto los transportadores de membrana como las
cuprochaperonas podrían participar en el mecanismo de tolerancia a Cu. En concreto, la
20

21
Introducción
planta Silene vulgaris tolerante a Cu, bombea Cu a través de una ATPasa de tipo P en la
membrana plasmática de la raíz (Van Hoof y col., 2001). Además, la inactivación del
gen ActP que codifica para una ATPasa de tipo P, provoca hipersensibilidad a Cu en
Rhizobium leguminosarum y en Sinorhizobium meliloti (Reeve y col., 2002). En A.
thaliana se ha descrito que HMA5 interacciona con cuprochaperonas jugando un papel
en la compartimentalización y la detoxificación del Cu en la raíz (Andrés-Colás y col.,
2006). Además, se ha encontrado la secuencia de aminoácidos concreta responsable de
esta función en varios dominios conservados del transportador (Kobayashi y col., 2008).
Se ha estudiado la tolerancia a Cu en tres variedades diferentes de A. thaliana
analizando los transcritos de las cuprochaperonas ATX1, CCS y CpCCP (Schiavon y
col., 2007). Por otro lado, se ha observado que la sobreexpresión del gen de la
CuZnSOD cloroplástica (CSD2) resistente a miR398 (Sunkar y col., 2006) y la
sobreexpresión conjunta de los genes que codifican a la CuZnSOD y la acorbato
peroxidasa cloroplásticas (Lee y col., 2007) dan lugar a plantas más tolerantes a estreses
abióticos como el que genera el Cu.
El exceso de metal debe ser almacenado en un lugar donde no interfiera ni dañe
los procesos celulares. El principal compartimento que utilizan las plantas es la vacuola
aunque también existen otros lugares donde pueden secuestrar los metales como son el
apoplasto o en células especializadas como las células epidérmicas o los tricomas.
La utilización de plantas para descontaminar ambientes como los suelos y el
agua (fitoremediación), ha emergido como una atractiva y económica tecnología en las
últimas dos décadas (Krämer, 2005). Estas plantas han desarrollado mecanismos de
tolerancia específicos que están controlados por un número escaso de genes. Estos
mecanismos actúan tanto a nivel externo (movilización y absorción) como a nivel
interno (distribución y compartimentalización) (Macnair, 1993). La descontaminación
de metales pesados del suelo, consistiría en la fitoextracción a través de plantas
hiperacumuladoras de metales, las cuales son tolerantes al metal y capaces de
transportar y acumular más de 100-1000 veces la concentración del metal del suelo en el
interior de sus tejidos para procesarlos y cosecharlos posteriormente con facilidad.
Elsholtzia splendens es una hierba procedente de China de la familia de las Labiata que
tolera y acumula Cu en su interior adquiriendo, así, un uso potencial para la
fitoremediación (Jiang y col., 2004; Weng y col., 2005). E. splendens o también llamada
“flor del cobre”, crece principalmente en depósitos de minas de Cu y se ha utilizado
como un indicador de Cu.

Introducción
A pesar de que se han identificado más de 25 especies de plantas
hiperacumuladoras de Cu, se desconocen los mecanismos moleculares implicados. El
desarrollo de estrategias eficaces para la fitoremediación requiere la identificación de
características importantes y genes responsables de la acumulación de Cu en las plantas,
la caracterización de sus mecanismos funcionales y el ensayo de estrategias
biotecnológicas. Los posibles candidatos para mejorar la fitoremediación de Cu son las
reductasas y los transportadores de Cu en la raíz, las NA sintasas y tres proteínas
detoxificadoras de Cu: ATPasas de tipo P, cuprochaperonas y metalotioneínas. El
diseño óptimo de aplicaciones tecnológicas requerirá la caracterización molecular de los
mecanismos de la homeostasis del Cu en plantas (Salt y col., 1998; Pilon-Smits y Pilon,
2002; Puig y col., 2007a).
1.5 HOMEOSTASIS DE COBRE EN PLANTAS
Tanto en exceso como en deficiencia, el Cu puede causar desórdenes en el
crecimiento y desarrollo de la planta afectando a importantes procesos fisiológicos
como el transporte electrónico fotosintético. Por tanto, para que la planta crezca y se
desarrolle sana, es preciso que el Cu sea adquirido del suelo, transportado a través de la
planta, distribuido y compartimentalizado en diferentes tejidos y su contenido
estrictamente regulado en todas las células y orgánulos (Fig. 1-6). Para ello, las plantas
como otros seres vivos, tienen mecanismos para mantener la concentración adecuada de
Cu (Clemens, 2001; Clemens y col., 2002). El creciente interés por la homeostasis del
Cu en plantas se refleja en el gran número de revisiones publicadas sobre este tema
recientemente (Krämer y Clemens, 2005; Yruela, 2005; Colangelo y Guerinot, 2006;
Grotz y Guerinot, 2006; Pilon y col., 2006; Puig y col., 2007a; Burkhead y col., 2009;
Yruela, 2009; Puig y Peñarrubia, 2009; Pilon y col., 2009; Palmer y Guerinot, 2009).
22

Transporte en el floema
Transporte en el xilema
Biodisponibilidad y movilización en el suelo
23
Introducción
Figura 1-6: Transporte de Cu a larga distancia (Adaptada de Clemens y col., 2002).
1.5.1 Movilización y adquisición de cobre por la raíz
Transporte al interior de las hojas
Adquisición y transporte por la raíz
El Cu aparece en el suelo casi exclusivamente en forma divalente y está
adsorbido a materia orgánica o formando parte de óxidos de Fe y Mn, arcillas y otros
silicatos. La concentración de este metal en el suelo está entre el rango nanomolar y
micromolar. Así como los mecanismos de adquisición de Fe por la raíz son los más
conocidos a nivel fisiológico (estrategia II en gramíneas y estrategia I en
monocotiledóneas no gramíneas y dicotiledóneas), en el caso del Cu se desconocen tales
mecanismos de adquisición (Marschner, 1995). Los iones de Cu 2+ se unen fuertemente a
las partículas del suelo debido a su tendencia a formar complejos estables con grupos
carboxilo o fenol. A la vista de la posible reducción de Cu 2+ a Cu + , se ha propuesto que
la liberación de Cu + a la superficie de la raíz podría ser una forma de desestabilizar los
complejos que forma el Cu 2+ en la rizosfera del suelo, de la misma manera que ocurre
tras la liberación de Fe 2+ (Bienfait, 1988). La reducción del Cu se realiza antes de entrar
a la célula por unas reductasas. Se identificó en A. thaliana el primer gen de plantas que
codifica para la reductasa férrica FRO2 (“ferric reductase oxidase”). Este gen también
ha sido identificado en tomate (Li y col., 2004), guisante (Waters y col., 2002) y
Medicago truncatula (López-Millán y col., 2005). Se han identificado siete miembros

Introducción
más de esta familia de reductasas (FRO1-8) en A. thaliana (Mukherjee y col., 2006).
Todos estos genes también parecen estar involucrados en la homeostasis del Cu a lo
largo de toda la planta. Sin embargo, existen datos experimentales que sugieren que la
reducción de Cu no es necesaria para la absorción de este metal por la raíz (Bell y col.,
1991). Los resultados indicaron que la especie absorbida por la raíz era Cu 2+ , ya que
Cu + se absorbía con una eficiencia muy baja. Por lo tanto, no está claro que la reducción
de Cu sea fisiológicamente relevante y es posible que las reductasas férricas sean
capaces de reducir Cu 2+ pero que esta función no sea importante para el transporte de
este elemento a las células vegetales. Por otro lado, existen evidencias experimentales
de que la deficiencia de Cu estimula la extrusión de protones provocando la
acidificación de la rizosfera. Esta acidificación varía con el tratamiento y no siempre
está correlacionada con el aumento de la actividad de la reductasa férrica (Grusak y
Pezeshgi, 1996). Las raíces también pueden liberar compuestos orgánicos a la rizosfera
que solubilizan el Cu, aumentando, así, su disponibilidad para las plantas (Mench y col.,
1988, 1990; Treeby y col., 1989).
Una vez que los iones son movilizados y alcanzan la zona de absorción de la raíz
por difusión a través de la solución salina del suelo, son arrastrados por el movimiento
del agua hacia la raíz o entran en contacto con las zonas de absorción de la raíz a
medida que ésta crece (Fernández y Maldonado, 2000).
1.5.2 Transporte de cobre a través de la planta
En el interior de las raíces, los nutrientes se distribuyen por toda la planta a
través del xilema, impulsados por la corriente ascendente de agua que genera el flujo de
transpiración. Así, de la misma manera que el agua, los iones se transportan radialmente
en la raíz para alcanzar el xilema a través de dos vías: vía apoplástica y vía simplástica.
Recientemente, se ha descrito que el transporte de Cu en la raíz de A. thaliana se
realiza a través de un transportador de Cu de alta afinidad llamado COPT1 (Sancenón y
col., 2004) que está localizado en la membrana plasmática de la zona apical de la raíz.
Posiblemente como ocurre en levaduras (Puig y Thiele, 2002), existe también un
sistema de transporte de baja afinidad mediado también por un transportador de esta
familia (Sancenón y col., 2004). Otros transportadores que podrían intervenir en la
adquisición de Cu en la raíz de A. thaliana son ZIP2 y ZIP4 que pertenecen a la familia
24

25
Introducción
de transportadores ZIP y se ha descrito que los genes que los codifican están regulados
positivamente en deficiencia de Cu (Wintz y col., 2003; Mukherjee y col., 2006).
Una vez en el interior de las células de la raíz, se ha propuesto que el Cu es
transportado radialmente por vía simplástica unido a nicotianamina (NA) formando el
complejo Cu 2+ -NA (Pich y col., 1994). NA es un quelante de metales presente en todas
las plantas y se sintetiza a partir de S-adenosil-L-metionina por la enzima nicotianamina
sintasa (NAS). Cuando este complejo Cu 2+ -NA llega al cilindro vascular de la raíz se
descarga a los vasos del xilema (Sancenón y col., 2004). El xilema se encarga del
transporte ascendente de agua e iones desde la raíz. La forma por la que el Cu es
transportado al interior del xilema aún se desconoce, pero probablemente se realiza a
través de un transportador llamado OPT3 (Wintz y col., 2003). En el interior del xilema,
el Cu se transporta como complejo Cu 2+ -NA desde la raíz hasta la parte aérea de la
planta.
El mecanismo de transporte de Cu desde la savia del xilema hasta las hojas
todavía no se conoce en profundidad. En A. thaliana se ha propuesto que el
transportador implicado en esta descarga sea YSL2, pero son necesarios más estudios
para confirmar esta hipótesis (Didonato y col., 2004). Cuando el Cu llega al apoplasto,
entra en la célula y se distribuye a los diferentes orgánulos subcelulares, a través de
diversos mecanismos de homeostasis intracelular.
El exceso de Cu, al igual que el de Zn, Ni y Mn, se acumula principalmente en
las vacuolas de las raíces de forma acomplejada con ácidos orgánicos. Sin embargo,
tanto en condiciones de exceso de Cu como en el caso de plantas hiperacumuladoras, el
Cu se acumula en la base de los tricomas y en las vacuolas de células de la epidermis de
la hoja, unido a diversos quelantes mayoritariamente ácidos orgánicos. Esta localización
preferencial en células de la epidermis minimiza su efecto tóxico manteniendo el metal
lo más alejado posible de las células del mesófilo, donde se realiza la fotosíntesis. De la
misma manera que existe controversia con la necesidad de reducir el Cu 2+ a Cu + antes
de ser incorporado por la raíz, no se sabe si el Cu se reduce en el apoplasto antes de
entrar a la célula del mesófilo. En A. thaliana se ha propuesto que una reductasa (FRO6)
podría reducir el Cu 2+ a Cu + en la membrana plasmática de las células del mesófilo
(Mukherjee y col., 2006).
El floema es el tejido vegetal encargado del transporte a larga distancia, desde
los órganos de producción, principalmente hojas maduras, hasta los tejidos en
crecimiento y órganos reproductivos o de almacenamiento. Existen evidencias de que el

Introducción
Cu se transporta en el floema unido a NA (Pich y col., 1994; Haydon y Cobbett, 2007).
Se considera que el Cu es un elemento de movilidad intermedia en la planta.
Generalmente, este elemento está inmóvil en el floema a menos que esté asociado al
proceso de senescencia donde es móvil (Loneragan, 1981). Para explicar este fenómeno
se ha propuesto que cuando el Cu entra en la hoja se une a proteínas y deja de estar
disponible para su retranslocación vía floema incluso en deficiencia de Cu, hasta que la
hoja senesce y estas proteínas se hidrolizan. En este momento el Cu sale de la hoja
unido a complejos nitrogenados provenientes de la hidrólisis proteica. Además, se ha
observado en Arabidopsis que en condiciones de senescencia el Cu puede transportarse
en el floema unido a distintas metalotioneínas (Guo y col., 2003) y a las chaperonas de
Cu CCH (Mira y col., 2001a) y CCS (Abdel-Ghany y col., 2005a).
1.5.3 Distribución intracelular de cobre
El uso de la levadura Saccharomyces cerevisae como herramienta genética y
bioquímica ha permitido investigar los mecanismos moleculares implicados en la
homeostasis del Cu en las células eucariotas (Puig y Thiele, 2002). En la tabla 1-3 se
resumen las principales proteínas que participan en la homeostasis de Cu en plantas. En
la Fig. 1-7 se presenta un esquema de la distribución intracelular de Cu en una célula del
mesófilo. Es de señalar que la mayor parte de los estudios realizados actualmente en
plantas se restringen principalmente a la especie A. thaliana (Pilon y col., 2006; Puig y
col., 2007a).
26

GRUPO PROTEÍNA LOCALIZACIÓN
METALOTIONEÍNAS
MT1-4
Citoplasma
Vaculoa
CCH
ATX1
Citoplasma
METALOCHAPERONAS
TRANSPORTADORES
DE MEMBRANA
COPT
YSL
ZIP
NRAMP
P 1B-ATPasa
SCO1
COX11
COX17
CCS
COPT1-6
OPT3
YSL2
ZIP2
ZIP4
NRAMP1-5
HMA1-9
27
Citoplasma
Citoplasma
Cloroplasto
Membrana plasmática
Membrana plasmática
Membrana plasmática
Tonoplasto
Tilacoide?
MP, AG, RE
Tilacoide
Cloroplasto
Introducción
FUNCIÓN
Detoxificación de Cu
Tolerancia a Cu
Ruta secretora
Transporte de Cu a la
COX de la cadena de
transporte electrónico
mitocondrial
Transporte de Cu a la
CuZnSOD
Transporte de Cu a
través de las MP de
diferentes tejidos y
orgánulos subcelulares
Transporte de Cu a
través de las MP de
diferentes tejidos y
orgánulos subcelulares
Absorción de metales
del medio extracelular
Conexión entre los
cationes metálicos y la
señalización
intercelular
Transporte de metales
pesados a través de las
membranas biológicas
Tabla 1-3: Proteínas que participan en la homeostasis de Cu en plantas. MP =
membrana plasmática, AG = aparato de Golgi y RE = retículo endoplasmático.

Introducción
Cu 2+
FRO?
Cu +
Cu +
?
Cu
COPT1
HMA6/PAA1
?
Cu 2+
CCS
ZIP?
OPT?
HMA8/PAA2
Cloroplasto
CSD2
Pc
?
Apoplasto
Mitocondria
COX17 COX11
SCO1
CCH
CCS
ATX1
Figura 1-7: Distribución intracelular de Cu en una célula del mesófilo. El cobre
extracelular es transportado al interior celular por el transportador COPT1 donde se
distribuye a través de las cuprochaperonas COX17, COX11, SCO1, CCH, ATX1 y CCS
y de transportadores de membrana específicos, como las P1B-ATPasas HMA1, HMA5,
HMA6 (PAA1), HMA7 (RAN1), HMA8 (PAA2) y los transportadores de alta afinidad
de la familia COPT, hasta llegar a las diferentes cuproproteínas diana que son: la
citocromo c oxidasa (COX); las enzimas CuZnSOD citosólica, cloroplástica y
peroxisomal (CSD1, CSD2, CSD3); la plastocianina (Pc); el receptor de etileno (ETR) y
las oxidasas apoplásticas. La flecha discontinua indica la participación de la chaperona
CCH en el transporte de Cu a larga distancia. El Cu se muestra con un círculo azul, los
transportadores de membrana aparecen marcados en naranja, las cuprochaperonas en
rosa y las cuproproteínas diana en verde. Los interrogantes indican mecanismos que
permanecen todavía sin identificar. Este modelo se ha realizado en base al conocimiento
actual de la homeostasis de Cu en A. thaliana.
28
CSD1
CSD3
COX
Peroxisoma
HMA1
HMA7/RAN1
Cu 2+
Cu +
HMA5
CSD3
ETR
RE
COPT?
Vacuola
HMA5
Núcleo
Golgi
OXIDASAS

1.5.3.1 COPT
29
Introducción
Los transportadores COPT (“copper transporter family”) son homólogos a los
transportadores de Cu CTR de levaduras. Estructuralmente, poseen tres hélices
transmembrana y la mayoría posee un alto contenido en metioninas en su extremo Nterminal
que podrían participar en el proceso de translocación del Cu (Puig y Thiele,
2002). Todavía no está claro cómo funcionan estos transportadores, pero es probable
que el Cu sea incorporado al citosol celular como Cu + . El K + extracelular estimula este
transporte. En Arabidopsis se han identificado seis miembros de esta familia (COPT1-6)
que se encargan de transportar el Cu a través de las membranas plasmáticas de
diferentes tejidos y compartimentos subcelulares (Sancenón y col., 2003).
En concreto, COPT1 de Arabidopsis es un transportador de Cu de alta afinidad
que se localiza en la membrana plasmática de la raíz, estomas, tricomas, polen y
embriones por lo que participa en: la adquisición de Cu del suelo, el desarrollo del polen
y los mecanismos de elongación de la raíz (Kampfenkel y col., 1995; Sancenón y col.,
2004). El gen COPT1 está regulado por Cu de forma negativa. En Arabidopsis se ha
demostrado que COPT2 y COPT6 están en la membrana plasmática mientras que
COPT3 y COPT5 están localizados en la membrana cloroplástica y en la ruta secretora,
respectivamente. Por otro lado, no se conoce una relación directa entre COPT4 y el
transporte de Cu (Sancenón y col., 2003).
1.5.3.2 YSL
Los transportadores de membrana YSL (“yellow stripe like”) pertenecen a una
familia de transportadores oligopeptídicos OPT (Yen y col., 2001). Recientemente, se
ha descrito un transportador de esta familia en A. thaliana, YSL2, que podría transportar
el complejo Cu 2+ -NA desde la savia del xilema al apoplasto de las hojas (Didonato y
col., 2004), aunque todavía se desconoce su relevancia fisiológica. Otro transportador
de esta familia es OPT3 que participa en el transporte de Cu 2+ desde la raíz hasta los
vasos del xilema en A. thaliana (Wintz y col., 2003). En esta planta se ha descrito que
estos transportadores podrían participar en la remobilización de Cu y Zn a partir de
hojas senescentes, en la formación del polen y en la acumulación de Fe, Zn y Cu en las
semillas (Curie y col., 2009).

Introducción
1.5.3.3 ZIP
Los transportadores de esta familia (“zrt1-irt1-like proteins”) deben su nombre a
los dos primeros miembros descritos de la misma: IRT1 (“iron regulated transporter 1”)
de A. thaliana (Eide y col., 1996) y ZRT1 (“zinc regulated transporter 1”) de S.
cerevisiae (Zhao y Eide, 1996). Actualmente, se conocen varias decenas de estos
transportadores de membrana que se encuentran ampliamente distribuidos en los
organismos eucariotas (Guerinot, 2000). En concreto, se han identificado 14 miembros
de esta familia en A. thaliana (Maser y col., 2001). Todos los ZIPs que se han
identificado hasta la fecha se caracterizan por transportar cationes divalentes al
citoplasma (Zn, Mn, Fe, Co, Cd). La función que realizan estos transportadores está
relacionada con la absorción de los metales del medio extracelular. Recientemente, se
ha propuesto en A. thaliana que dos de ellos, ZIP2 y ZIP4, podrían intervenir en el
proceso de adquisición de Cu por la raíz (Wintz y col., 2003).
1.5.3.4 NRAMP
La familia NRAMP (“natural resistance associated macrophage proteins”) de
transportadores de metales divalentes se han conservado durante la evolución y se han
encontrado homólogos en diferentes y numerosos organismos vivos. Como otros
miembros de esta familia, las proteínas NRAMP de plantas tienen 12 dominios
transmembrana, sin embargo, sólo poseen una larga cola intracelular C-terminal que es
única en este tipo de proteínas. En plantas, se han identificado al menos tres miembros
en arroz (NRAMP1-3) y cinco miembros en Arabidopsis (NRAMP1-5) (Williams y
col., 2000). Se ha propuesto que el NRAMP1 de Arabidopsis confiere tolerancia a
concentraciones tóxicas de Fe 2+ (Curie y col., 2000) y podría transportar Cu 2+ a través
de la membrana tilacoidal, sin embargo, son necesarios más estudios para poder
corroborar esta función. Homólogos de esta familia NRAMP han sido identificados
también en soja y se ha propuesto que están involucrados en el transporte de Fe 2+ y en la
homeostasis del Fe localizada en el nódulo donde se produce la fijación simbiótica de
nitrógeno (Kaiser y col., 2003). De todos modos, se ha demostrado en levaduras que
estos transportadores también median la adquisición de otros metales como el Cu. Por
tanto, no se puede descartar que tengan una función parecida en plantas.
Las proteínas de esta familia constituyen una conexión entre los cationes
metálicos y la señalización intercelular. El gen EIN2 (“ethylene-insensitive 2”), que
30

31
Introducción
participa en la transducción de la señal de etileno, codifica para una proteína con un
dominio N-terminal hidrofóbico que presenta homología con los transportadores de la
familia NRAMP y con un dominio C-terminal hidrofílico que estimula la expresión de
genes involucrados en la respuesta frente al estrés oxidativo, jasmonato y etileno
(Alonso y col., 1999). Se piensa que el dominio N-terminal podría actuar como sensor
de metales divalentes mientras que el dominio C-terminal actuaría en la transducción de
la señal.
1.5.3.5 P1B-ATPasas
Los transportadores P1B-ATPasas, también conocidos como ATPasas de tipo P o
HMAs (“heavy metal ATPasas”), utilizan la hidrólisis de ATP para bombear metales
cargados positivamente del citoplasma a través de las membranas biológicas.
Estructuralmente, las P1B-ATPasas poseen 8 hélices transmembrana y tienen
características comunes a las P-ATPasas, como el dominio de unión a ATP
(GDxxNDxP) o el dominio de fosforilación (DKTGT), y características específicas. El
genoma de Arabidopsis codifica para 8 proteínas HMA que se clasifican en 2 grupos:
HMA1-HMA4, implicadas en el transporte de cationes divalentes, incluyendo Zn 2+ ,
Cd 2+ y Cu 2+ ; y HMA5-HMA8, implicadas en el transporte de iones monovalentes de
Cu + . Las proteínas HMA5-HMA8 exhiben 2 características particulares: un dominio de
transducción del ión (CPC) en el sexto dominio transmembrana y dominios de unión a
Cu + (MxCxxC) en la región N-terminal del transportador (Axelsen y Palmgrem, 2001;
Williams y Mills, 2005).
La primera P1B-ATPasa que se caracterizó funcionalmente en plantas fue HMA7
o RAN1 (“responsive-to-antagonist 1”) de Arabidopsis (Hirayama y col., 1999). Se ha
propuesto que HMA7 (RAN1) transporta Cu al receptor de etileno en el retículo
endoplásmico y participa en: la activación de los receptores de etileno (ETR1 “ethylene
response”) (Hirayama y col., 1999; Rodríguez y col., 1999), la interrupción de la
liberación de Cu a otra cuproenzima apoplástica (la ascorbato oxidasa), implicada en la
expansión celular (Woeste y Kieber, 2000) y la movilización de Cu durante el proceso
de senescencia (Himelblau y Amasino, 2001).
Recientemente, se ha identificado y caracterizado el transportador HMA5 de
Arabidopsis que se expresa principalmente en raíz y flor (Andrés-Colás y col., 2006).
Estos autores han demostrado su especificidad por Cu y han propuesto dos funciones

Introducción
para este transportador según el nivel de Cu existente en el medio de crecimiento. A
concentraciones bajas, este transportador estaría localizado en el aparato de Golgi, y a
concentraciones altas, cambiaría de localización y actuaría en el mecanismo de
detoxificación de Cu del citoplasma celular. Mediante la técnica de doble híbrido, se ha
descrito que HMA5 interacciona con dos chaperonas, ATX1 (“antioxidante”) y CCH
(“copper chaperone”) sin el dominio C-terminal específico de las plantas. Por otro lado,
HMA5 también podría intervenir en la expansión celular como ocurre con HMA7
(RAN1) (Andrés-Colás y col., 2006).
El transporte de Cu en el cloroplasto depende de las proteínas P1B-ATPasas
PAA1 (“P-type ATPase for Arabidopsis”) o HMA6 y PAA2 o HMA8. Ambos genes se
aislaron mediante una búsqueda con mutantes de Arabidopsis que mostraban un
fenotipo con una alta fluorescencia de la clorofila como consecuencia de la reducción de
la actividad del transporte fotosintético, que se restauraba añadiendo Cu (Shikanai y
col., 2003; Abdel-Ghany y col., 2005b). Tanto HMA6 como HMA8 poseen secuencias
de tránsito en sus extremos N-terminal que fusionadas con GFP se localizan en el
cloroplasto. Mientras que la fusión del gen entero de HMA6 con GFP está localizada en
la periferia del cloroplasto, una porción del extremo N-terminal de HMA8 que incluye
los cuatro primeros dominios transmembrana, está localizada en las membranas
tilacoidales. Se ha identificado el transportador HMA8 de soja y se ha confirmado su
localización en las membranas tilacoidales mediante la técnica de inmuno-oro (Bernal y
col., 2007). El análisis con mutantes de estas proteínas cloroplásticas demostró que
ambas ATPasas son necesarias para liberar Cu a la proteína tilacoidal Pc, mientras que
solamente el mutante de HMA6 muestra un descenso en la liberación de Cu a la enzima
estromática CuZnSOD. En Arabidopsis, HMA6 se expresa tanto en raíz como en tejido
verde mientras que HMA8 sólo se detecta en el tejido verde (Abdel-Ghany y col.,
2005b). El doble mutante HMA6/HMA8 es letal para la planta y muestra un fenotipo
severo como el observado en plantas deficientes en los dos genes de Pc (Weigel y col.,
2003a, Abdel-Ghany y col., 2005b), esto sugiere que las proteínas HMA juegan papeles
adicionales como el transporte de Cu a la CuZnSOD. En Arabidopsis se ha descrito que
el exceso de Cu regula negativamente la transcripción de HMA6 y HMA8 (Schiavon y
col., 2007). Sin embargo, en soja se ha observado que el exceso de Cu regula
positivamente la transcripción de HMA8 (nuestros resultados no publicados).
El transporte de Cu al cloroplasto no está totalmente inhibido en los mutantes de
HMA6. HMA1 es un nuevo miembro de la familia P1B-ATPasas, localizado en la
32

33
Introducción
envuelta del cloroplasto, y está implicado en el transporte de Cu al cloroplasto. Los
mutantes de este transportador muestran un descenso en la actividad de la CuZnSOD
cloroplástica y un contenido normal de la Pc. Estos datos podrían sugerir que HMA1
libera Cu a la CuZnSOD preferencialmente. HMA1 no contiene el típico dominio de
unión a Cu + MxCxxM en su extremo N-terminal, en su lugar, es rico en histidinas lo
que sugiere una preferencia a transportar Cu 2+ en lugar de Cu + (Seigneurin-Berny y col.,
2006). Recientemente, se ha descrito que AtHMA1 transporta también Ca 2+ (Moreno y
col., 2008). Otro transportador de esta familia que se ha caracterizado recientemente es
HMA9 de arroz, se sugiere que participa en el bombeo de los metales Cu, Zn y Pb a
través de la membrana plasmática de las células, y la expresión de su transcrito se
induce por Cu, Zn y Cd (Lee y col., 2007).
1.5.3.6 Metalotioneínas
Las metalotioneínas (MT) son proteínas solubles de bajo peso molecular (4-14
kDa) que tienen un alto contenido en cisteínas. Se encargan de acomplejar el Cu (y otros
metales pesados, principalmente Cd) cuando se encuentran en exceso en la célula e
intervienen en su detoxificación. Atendiendo a su secuencia de aminoácidos se
clasifican en dos grupos: Clase I (en mamíferos) y clase II (en plantas, hongos e
invertebrados).
En plantas, las MT de clase II se subclasifican en 4 grupos según la organización
de las cisteínas conservadas: MT1, MT2, MT3 y MT4. La MT1 se expresa
principalmente en la raíz, la MT2 en hojas, la MT3 en frutos y la MT4 en semillas. Guo
y col. (2003) estudiaron las MTs en Arabidopsis y confirmaron la localización descrita
anteriormente excepto para la MT3 que se expresaba principalmente en las células del
mesófilo de las hojas, además muestran que la MT1a y la MT2b se expresan
notablemente en los tejidos del floema. Las diferencias en su expresión y localización
hacen pensar que estas proteínas tienen distintas funciones en las plantas.
Recientemente, se ha descrito que la MT1a desempeña un papel en la acumulación de
Cu en la raíz (Guo y col., 2008) y la MT2b en el secuestro de especies reactivas de
oxígeno y en la señalización (Wong y col., 2004). Actualmente, hay identificados siete
genes que codifican para las MTs en Arabidopsis. Las metalotioneínas actúan en los
mecanismos de tolerancia a Cu, en el proceso de senescencia y se sobreexpresan en los
tricomas cuando hay exceso de Cu (Clemens, 2001; Cobbet y Goldsbrough, 2002).

Introducción
1.5.3.7 Chaperonas de cobre o cuprochaperonas
La solubilidad del Cu + en el interior de la célula es baja, sin embargo, su
reactividad es alta, por lo que es necesaria la participación de unas proteínas
especializadas denominadas chaperonas de Cu o cuprochaperonas para immobilizarlo.
Las chaperonas de Cu pertenecen a una familia de pequeñas proteínas solubles
encargadas de la distribución intracelular de Cu a los diferentes compartimentos
subcelulares y a proteínas específicas que requieren Cu en su grupo prostético. Así,
estas proteínas evitan que el Cu se una indebidamente a otros componentes celulares.
Esta familia de proteínas se encuentra en un amplio rango de organismos, desde
bacterias hasta humanos, aunque son mayoritarias en organismos eucariotas
(O´Halloran y Culotta, 2000; Huffman y O´Halloran, 2001). Las cuprochaperonas
identificadas en bacterias han sido Atx1 (al final de este apartado se detalla su función)
(Tottey y col., 2002) y CopZ que transfiere dos átomos de Cu + al factor de transcripción
CopY (Harrison y col., 2000).
Las cuprochaperonas están bastante conservadas en la mayor parte de los
eucariotas, sin embargo, en plantas han desarrollado características únicas. En plantas se
han identificado las siguientes chaperonas de Cu (Wintz y Vulpe, 2002):
• CCH (“copper chaperone”): Fue la primera chaperona identificada en plantas (A.
thaliana) y es homóloga a la chaperona ATX1 (“antioxidant protein 1”) de levaduras
(Himmelblau y col., 1998). A pesar de que su expresión es constitutiva, se induce en
hojas senescentes (Himmelblau y col., 1998). CCH se ha identificado en otras plantas
como arroz y soja (Puig y col., 2007b). Su extremo N-terminal muestra un plegamiento
con estructura βαββαβ y un dominio de unión a Cu + MxCxxC, típicos de las proteínas
de esta familia (metalochaperonas de tipo ATX1) (Rosenzweig, 1999). Sin embargo,
CCH posee un extremo C-terminal exclusivo de plantas con características estructurales
especiales (Mira y col., 2001a, 2001b, 2004; Puig y col., 2007b). Este dominio adopta
una conformación extendida en solución y forma fibras de tipo amiloide bien ordenadas.
Además, este dominio C-terminal posee una movilidad electroforética alterada en
presencia de detergentes aniónicos (Mira y col., 2004) y se ha propuesto que tiene una
función en el transporte de Cu a larga distancia por el simplasto del floema a través de
los plasmodesmos durante la movilización de nutrientes desde las hojas viejas en estado
de senescencia hasta las hojas jóvenes. La baja expresión de CCH en las células sin
plasmodesmos funcionales como es el polen, corrobora esta posible función de su
34

35
Introducción
dominio C-terminal (Mira y col., 2001a). La chaperona CCH sólo interacciona
débilmente con RAN1 (HMA7) y HMA5 cuando se elimina el extremo C-terminal.
Estos datos sugieren que el extremo C-terminal de CCH podría desempeñar un papel
regulador en la interacción de la misma con ambas ATPasas (Andrés-Colás y col., 2006;
Puig y col., 2007b).
• ATX1: Esta chaperona es similar a la chaperona CCH, sin embargo, tiene una
secuencia más corta en la que le falta el dominio C-terminal. Se ha identificado a la
chaperona CCH sin el dominio C-terminal en arroz (Agrawal y col., 2002), en
suspensiones celulares de Populus cuya expresión disminuye en respuesta a
concentraciones altas de Cu (Lee y col., 2005) y en tomate (Company y González-
Bosch, 2003). La CCH de tomate se identificó mediante la técnica “differential display”
cuya expresión disminuye en respuesta a la infección por el hongo patógeno Botrytis
cinerea (Company y González-Bosch, 2003), lo que sugiere una relación interesante
entre la homeostasis del Cu y la respuesta de defensa en las plantas frente al estrés
oxidativo. En Arabidopsis se ha descrito que ATX1 está localizada en el citosol (Puig y
col., 2007b). Mediante la técnica de doble híbrido, se ha demostrado que esta chaperona
ATX1 interviene en el transporte de Cu en la ruta secretora interaccionando con HMA5
(Andrés-Colás y col., 2006) y RAN1 (HMA7) (Puig y col., 2007b), activando, así, la
síntesis de los receptores de etileno (Hirayama y col., 1999).
• SCO1, COX11 y COX17 (“cytochrome oxidase”): Estas tres chaperonas han
sido identificadas en A. thaliana y son homólogas a las chaperonas SCO1, COX11 y
COX17 de levaduras. Estas chaperonas unen el Cu a través de tioles. El transporte de
Cu a la citocromo c oxidasa (COX) de la cadena de transporte electrónico mitocondrial
se realiza en el espacio intermembrana de la siguiente manera: COX17 transporta el Cu
a las proteínas SCO1 y COX11 localizadas en la membrana interior, posteriormente
estas chaperonas lo transportan a los sitios CuA y CuB de la enzima COX (Cobine y
col., 2006). La enzima COX es una proteína localizada en la membrana interior de la
mitocondria y contiene tres átomos de Cu como cofactores aparte del cofactor hemo
(Carr y Winge, 2003). La matriz de la mitocondria, lugar donde probablemente se
almacena el Cu de forma soluble, accesible y con un peso molecular bajo, es la fuente
de Cu para COX17 (Cobine y col., 2004). La expresión del gen COX17 de Arabidopsis
se activa preferencialmente en la raíz (Attallah y col., 2007a) y por niveles tóxicos de
Cu, ácido salicílico, infecciones y tratamientos que generen óxido nítrico y peróxido de
hidrogeno que inhiben la respiración mitocondrial. Así, se ha propuesto que esta

Introducción
chaperona participaría en la estabilización del complejo COX restringiendo la
producción de ROS (Balandín y Castresana, 2002). De todas maneras, harían falta más
investigaciones para determinar su papel en plantas. Estudios estructurales con la
proteína COX17 recombinante sugieren que forma un complejo en equilibrio entre un
dímero y un tetrámero, el cual une tres iones de Cu + por monómero (Heaton y col.,
2001).
• CCS (“copper chaperone for superoxide dismutase”): Esta chaperona fue
identificada y caracterizada primeramente en S. cerevisiae denominándose LYS7
(porque inicialmente se identificó como un gen involucrado en la biosíntesis de lisina)
(Bhattacharjee y col., 1968). A continuación, este gen se clonó y se caracterizó llegando
a la conclusión de que no participaba en la síntesis de lisina (Horecka y col., 1995).
Después se identificó en humano un gen que codificaba para la misma proteína y se
demostró que su verdadera función era transportar Cu + al centro activo de la enzima
CuZnSOD citosólica (Culotta y col., 1997). Se han identificado varios homólogos de
CCS en mamíferos, insectos y plantas.
Se han encontrado varias secuencias que codifican para la chaperona CCS en plantas:
tomate (Lycopersicom esculentum; LeCCS) (Zhu y col., 2000), patata (Solanum
tuberosum; StCCS) (Trindade y col., 2003), maíz (Zea mays; ZmCCS) (Ruzsa y
Scandalios, 2003), A. thaliana (AtCCS) (Wintz y Vulpe, 2002) y soja (Glycine max;
GmCCS), esta última ha sido el objetivo principal de estudio en esta Tesis. Su función
es la de suministrar Cu + a la enzima CuZnSOD, sin embargo, no se descartan otras
funciones. Estudios bioquímicos y cristalográficos realizados en levadura y humano han
permitido aclarar aspectos estructurales y funcionales de CCS (Casareno y col., 1998;
Lamb y col., 1999, 2000; Schmidt y col., 1999a, 1999b; Hall y col., 2000; Eisses y col.,
2000; Rae y col., 1999, 2001; Stasser y col., 2007). Esta chaperona tiene un peso
molecular de 30-35 kDa y está formada por tres dominios: el dominio I o extremo Nterminal,
homólogo a ATX1, donde se encuentra un sitio de unión a Cu + , MxCxxC; el
dominio II que es homólogo a la CuZnSOD sin los residuos catalíticos; y el dominio III
o extremo C-terminal que incluye otro sitio de unión a Cu + , CxC, y es el más flexible.
Este dominio III está ampliamente conservado en las CCS de diversas especies. El
dominio I de CCS capta el Cu y es necesario principalmente cuando la concentración de
Cu es limitante en la célula (Schmidt y col., 1999a), además experimentos con mutantes
de Arabidopsis muestran que el dominio I de la chaperona es imprescindible para
realizar su función (Chu y col., 2005). Se ha descrito que el dominio II está envuelto en
36

37
Introducción
el reconocimiento y la unión a CuZnSOD (Casareno y col., 1998; Lamb y col., 2000,
2001; Schmidt y col., 2000). Por otro lado, el dominio III puede interaccionar con el
dominio I de la chaperona y es imprescindible para liberar el Cu a la enzima receptora
CuZnSOD (Zhu y col., 2000; Eisses y col., 2000). Trabajos en la CCS recombinante de
levadura muestran que la chaperona en forma apo-CCS se encuentra como monómero
mientras que la holoproteína Cu-CCS existe en un equilibro entre monómero y dímero
(Schmidt y col., 1999a). Se propone también un modelo en levadura donde el
homodímero de CCS interacciona con el homodímero de CuZnSOD (Hall y col., 2000).
Estudios estructurales realizados en humano sugieren la existencia de un “cluster” de Cu
formado por dímeros o tetrámeros de la proteína CCS (Stasser y col., 2005, 2007).
A pesar de la existencia de estructuras cristalinas disponibles para CCS (Lamb y col.,
1999, 2000), CuZnSOD (Djinovic y col., 1992; Banci y col., 2003) y el heterodímero
CCS-CuZnSOD (Lamb y col., 2001) (Fig. 1-9), todavía no se conocen en detalle los
mecanismos funcionales del reconocimiento y la transferencia de Cu entre ambas
proteínas (Stasser y col., 2007). CCS oxida un puente disulfuro en la CuZnSOD
mediante un proceso dependiente de oxígeno necesario para la dimerización de la
enzima en su forma catalíticamente activa (Culotta y col., 2006). Se ha demostrado en
levadura que el Cu juega un papel en la estabilización del complejo CCS-CuZnSOD,
donde el lado rico en cisteínas de CCS se une al lado rico en histidinas de la CuZnSOD
(Torres y col., 2001). Se ha descrito que la CuZnSOD de mamíferos y Caenorhabditis
elegans puede adquirir Cu a través de un mecanismo independiente de CCS y oxígeno
que utiliza glutatión (Carroll y col., 2004; Jensen y Culotta, 2005). Este mecanismo
explicaría la actividad basal de la CuZnSOD, así como la falta de un fenotipo severo en
los mutantes sin CCS de Arabidopsis (Chu y col., 2005). El requerimiento de CCS por
parte de la CuZnSOD está relacionado con la presencia de dos prolinas en el dominio
PRP (aminoácidos 142-144) de la CuZnSOD (Carroll y col., 2004; Leitch y col., 2009).
Los dominios correspondientes a esta posición en Arabidopsis son GRV (para CSD1) y
GRL (para CSD2). En plantas, no hay datos estructurales disponibles actualmente, sin
embargo, se han publicado algunas propiedades bioquímicas de la CCS en tomate (Zhu
y col., 2000).
Se ha demostrado que en el genoma de A. thaliana sólo existe una copia del gen CCS
localizada en el cromosoma 1 (Wintz y Vulpe, 2002), sin embargo, en patata se han
encontrado dos copias de este gen (Trindade y col., 2003). En ambas plantas, se
describe que el gen CCS está compuesto por seis exones y cinco intrones. Por otro lado,

Introducción
se ha propuesto en Arabidopsis que dentro del marco de lectura (ORF) de este gen
existen dos ATGs que podrían generar dos sitios de inicio de la traducción produciendo
dos formas de la chaperona CCS, una citosólica con 254 aminoácidos y otra
cloroplástica, con un péptido señal adicional de 66 aminoácidos. Este tipo de sistema de
inicio de la traducción alternativo se ha descrito también para otros genes de
Arabidopsis (Duchene y col., 2001; Souciet y col., 1999). Así, un solo gen, AtCCS, es el
responsable de suministrar Cu a las tres isoformas de la enzima CuZnSOD: citosólica,
cloroplástica y peroxisomal (Abdel-Ghany y col., 2005a; Chu y col., 2005). En levadura
se ha descrito que una parte de la enzima CuZnSOD y su chaperona CCS se localizan en
el espacio intermembrana de la mitocondria además del citosol, a pesar de no contener
el típico extremo N-terminal de importación a la mitocondria (Sturtz y col., 2001;
Reddehase y col., 2009). Es posible que este péptido señal sólo sea necesario para
atravesar la envuelta interna de la mitocondria que, como en otros orgánulos, es más
selectiva.
En patata, la expresión de este gen se induce por el tratamiento con auxinas y se inhibe
con concentraciones altas de Cu (Trindade y col., 2003). En maíz, la expresión de CCS
a nivel de mensajero y de proteína no cambia apenas por el exceso de Cu (Ruzsa y
Scandalios, 2003). En A. thaliana, la expresión de este gen se induce por exceso de Cu
y en la senescencia (Abdel-Ghany y col., 2005a).
38

GmCCS -MAFLRSIAT---TAIATIPAALAFSSS--SSSS--FPRSSQ--------SPNPQNRLGL 44
LeCCS --AFLRSIVTAKTTAIAAAIPAAAFAVSSISSSS-QFERPLKNLKFGSISSSNSILQLSF 57
StCCS -MAFFRSIVTAKTTAIAAAIPAAAFAASSISSSSSQFERPSKNIKFGSISSSNPIFQLSF 59
OsCCS MVGFLRALTAASAVPAAAAVAAVALSTNSSSSSRLRLPSPASLPSLSSAYAAAPASGSAR 60
AtCCS MASILRSVATTSAVVAAASAIPIAIAFSSSSSSS-STNPKSQSLNFSFLSRSSPR-LLGL 58
ScCCS ------------------------------------------------------------ 1
HsCCS ------------------------------------------------------------ 1
39
Introducción
GmCCS VKTLA--TPPSALHMD-----HKLSSQPDAVLPELLTEFMVDMKCEGCVNAVKNKLNEIN 97
LeCCS AKNLQKKSPPSALHMETHSSNHQTSSDNGVVLPELLTEFMVDMSCQGCVSAVKSKLQTVE 117
StCCS AKNLQKTSPPSALHMETPSSNHQTSSDNEVVLPELLTEFMVDMSCQGCVNAVKSKLQTVE 119
OsCCS KPNAVPPMAAAAATAD-----LSAAADKGAALPELMTEFMVDMKCDGCVTAVKNKFQTLE 115
AtCCS SRSFVSSPMATALTSD------RNLHQEDRAMPQLLTEFMVDMTCEGCVNAVKNKLETIE 112
ScCCS ----------------------------MTTNDTYEATYAIPMHCENCVNDIKACLKNVP 32
HsCCS -----------------------MASDSGNQGTLCTLEFAVQMTCQSCVDAVRKSLQGVA 37
MXCXXC
GmCCS GVKNVEVDLSNQVVRILGSTPVKTMTEALEQTGRKARLIGQGVPEDFLISAAVSEFKGP- 156
LeCCS GVKNVDVDLDNQVVRILGSSPVKTMTEALEQTGRKARLIGQGVPDDFLISAAVAEFKGP- 176
StCCS GVKNVDVDLDNQVVRILGSSPVKTMTEALEQTGRKARLIGQGVPDDFLISAAVAEFKGP- 178
OsCCS GIKNIEVDLNNQVVRVLGSLPVNTMLDTLHQTGRDARLIGQGNPNDFLVSAAVAEFKGP- 174
AtCCS GIEKVEVDLSNQVVRILGSSPVKAMTQALEQTGRKARLIGQGVPQDFLVSAAVAEFKGP- 171
ScCCS GINSLNFDIEQQIMSVESSVAPSTIINTLRNCGKDAIIRGAGKPNSSAVAILETFQKYTI 92
HsCCS GVQDVEVHLEDQMVLVHTTLPSQEVQALLEGTGRQAVLKGMGSGQLQNLGAAVAILGGPG 97
GmCCS ------DIFGVVRLAQVNMELARIEANFSGLSPG-KHGWSINEFGDLTRGAASTGKMFNP 209
LeCCS ------DIFGVVRLAQVNMELTRIEANFSGLSPG-KHAWSINEFGDLTRGAASTGKLYS- 228
StCCS ------DIFGVVRLAQVNMELTRIEANFSGLSPG-KHAWSINEFGDLTRGAASTGKLYS- 230
OsCCS ------VIFGVVRLAQVNMELAIVEATFSGLSPG-KHGWSINEFGDLTRGAESTGKVYNP 227
AtCCS ------DIFGVVRFAQVSMELARIEANFTGLSPG-THSWCINEYGDLTNGAASTGSLYNP 224
ScCCS DQKKDTAVRGLARIVQVGENKTLFDITVNGVPEAGNYHASIHEKGDVSKGVESTGKVWHK 152
HsCCS ------TVQGVVRFLQLTPERCLIDGTIDGLEPG-LHGLHVHQYGDLTNNCNSCGNHFNP 150
GmCCS V-----NEENSKEPLGDLGTLEANEKGEAFYSGVKEKLRVADLIGRSVVVYATED----- 259
LeCCS ------------LPLGDLGTLDVDEKGEAFYSGPKEKLRVADLIGRAIAVYATED----- 271
StCCS ------------PPLGDLVTLEVDEKGEAFYTGPKEKVRVADLIGRAIAVYATED----- 273
OsCCS ------SDYRSNKPLGDLGTLEAGEKGEAQFSASKEKLKVVDLIGRSIALYATED----- 276
AtCCS F-----QDQTGTEPLGDLGTLEADKNGEAFYSGKKEKLKVADLIGRAVVVYKTDDN---- 275
ScCCS F----------DEPIECFNESDLGKNLYSGKTFLSAPLPTWQLIGRSFVISKSLNHP--- 199
HsCCS DGASHGGPQDSDRHRGDLGNVRADADGRAIFRMEDEQLKVWDVIGRSLIIDEGEDDLGRG 210
GmCCS ---------KSEHGITAAVIARSAGVGENYKKLCTCDGTTIWEATDTDFVTSKV------ 304
LeCCS ---------KSDPGLTAAVIARSAGVGENYKKLCTCDGTTIWEATS------KI------ 310
StCCS ---------KTDPGLTAAVIARSAGVGENYKKICACDGTTIWEATN------KL------ 312
OsCCS ---------RSDPGIAAAVIARSAGVGENYKKLCTCDGVTIWESS--------------- 312
AtCCS ---------KSGPGLTAAVIARSAGVGENYKKLCSCDGTVIWEATNSDFVASKV------ 320
ScCCS ----ENEPSSVKDYSFLGVIARSAGVWENNKQVCACTGKTVWEERKDALANNIK------ 249
HsCCS GHPLSKITGNSGERLACGIIARSAGLFQNPKQICSCDGLTIWEERGRPIAGKGRKESAQP 270
CXC
GmCCS ---- 304
LeCCS ---- 310
StCCS ---- 312
OsCCS ---- 312
AtCCS ---- 320
ScCCS ---- 249
HsCCS PAHL 274
Figura 1-8: Alineamiento de las proteínas CCS de soja (GmCCS), tomate (LeCCS),
patata (StCCS), arroz (OsCCS), Arabidopsis (AtCCS), levadura (ScCCS) y humano
(HsCCS). El péptido señal de tránsito al cloroplasto está subrayado, los dominios
conservados de unión a metal se indican con cajas donde están las secuencias consenso
correspondientes escritas en la parte inferior. Las barras verticales separan los tres
dominios identificados en la proteína CCS.

Introducción
Dominio I
Dominio III
Figura 1-9: Estructura del heterodímero CuZnSOD-CCS de S. cerevisiae (2´9 Å).
Código del PDB: 1JK9 (Adaptada de Lamb y col., 2001). SOD1 es un mutante donde la
His 48 de unión a Cu es reemplazada por una Phe lo que explica que sólo se visualice el
átomo de Zn.
Figura 1-10: Posible modelo del mecanismo de transferencia de Cu entre los
homodímeros de yCCS y yCuZnSOD mediante la formación de un heterodímero.
CuZnSOD está en color verde y CCS en color rosa (DI), morado (DII) y amarillo (DIII)
(Lamb y col., 2001).
40
Dominio II

41
Introducción
Además de estas seis cuprochaperonas, se cree que pueden existir más debido a
la especialización de las células vegetales. La función en la homeostasis de Cu de la
cuproproteína CUTA de Arabidopsis que se sugiere que está localizada en el espacio
intermembrana del cloroplasto, que une Cu 2+ y que su mRNA sufre “splicing”
alternativo, está todavía por averiguar (Burkhead y col., 2003). Por otro lado, las
cuproproteínas presentes en el lumen tilacoidal como Pc y PPO necesitarán que una
cuprochaperona les suministre el Cu necesario para formar la holoproteína y ser
funcionalmente activas. A este respecto, Tottey y col. (2002) identificaron y
caracterizaron una chaperona Atx en la cianobacteria Synechocystis PCC 6803 que
transporta Cu desde la Cu-ATPasa, CtaA, a la Cu-ATPasa, PacS, y que, posteriormente,
lo transporta a la Pc. Esta chaperona contiene el dominio de unión a metal CxxC y se ha
intentado buscar su homólogo en Arabidopsis. Sin embargo, todavía no se ha
identificado la chaperona que realiza la función de transportar Cu desde HMA6
(envuelta) hasta HMA8 (tilacoide) en los cloroplastos de las plantas (Abdel-Ghany y
col., 2005b).
1.5.4 Regulación
La regulación de la concentración de Cu a nivel intracelular es crucial para el
crecimiento y desarrollo normal de la planta. Por este motivo, es necesaria una
maquinaria de regulación que asegure un control eficaz de los niveles intracelulares de
este metal y garantice una distribución adecuada que prevenga su acumulación.
En la levadura S. cerevisiae se ha descrito que esta regulación se produce a dos
niveles. El primero de ellos es una regulación a nivel transcripcional que se caracteriza
por actuar directamente sobre la expresión de los genes que controlan la adquisición,
transporte y detoxificación del Cu, mientras que el segundo es una regulación a nivel
postranscripcional que actúa sobre la localización y estabilidad de las proteínas
implicadas. En la regulación a nivel transcripcional, se han descrito dos factores de
transcripción Ace1 y Mac1 (Jungmann y col., 1993). En condiciones tóxicas de Cu, la
proteína Ace1 une cuatro iones de Cu + e induce la expresión de genes implicados en la
detoxificación de Cu (MTs y CuZnSOD) tras unirse a los elementos de respuesta a
metales (MREs, “metal response elements”) localizados en los promotores de estos
genes, mientras que en condiciones de deficiencia de Cu, la proteína Mac1 activa la
transcripción de los transportadores de Cu + de alta afinidad (Ctr1 y Ctr3) y la reductasa

Introducción
de Cu 2+ (Fre1) tras unirse en forma homodimérica a los elementos cis de respuesta a Cu
(CuREs, “Cu-responsive elements”) localizados en los promotores de estos genes.
Recientemente, se ha demostrado en S. cerevisiae que la enzima CuZnSOD y su
chaperona CCS activan a Mac1 bajo condiciones de deficiencia de Cu (Wood y Thiele,
2009). También es posible que las metalochaperonas actúen como factores de
transcripción. En este sentido, se ha publicado recientemente que la chaperona Atox1 de
mamíferos funciona como un regulador transcripcional sensible a Cu envuelto en los
efectos que genera este metal en la proliferación celular (Itoh y col., 2008).
De forma análoga, en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii se ha descrito un
mecanismo de regulación transcripcional a través de un factor de transcripción llamado
Crr1 (“copper-responsive regulator 1”) que induce la expresión de genes implicados en
la deficiencia de Cu, como por ejemplo el Cit c6, tras unirse a un elemento CuRE
localizado en su promotor que contiene la secuencia GTAC. La unión del Cu al dominio
C-terminal rico en cisteínas de Crr1 provoca que este factor de transcripción se separe
del elemento CuRE (Moseley y col., 2000; Merchant y col., 2004).
La regulación de la homeostasis de Cu en plantas superiores es un área de
investigación que ha empezado a desarrollarse en los últimos años. Tanto los factores de
transcripción como los elementos cis y trans implicados en esta regulación
transcripcional son prácticamente desconocidos. Se han identificado las secuencias
homólogas de los factores de transcripción Ace1 (S. cerevisae) y Amt1 (Candida
glabrata) en los promotores de tres genes que codifican para la CuZnSOD de maíz
(Ruzsa y Scandalios, 2003). Además, se ha identificado el elemento cis negativo de
respuesta a Cu, GTACT, donde el factor de transcripción PpSBP2 (“squamosa
promoter-binding protein”) se une y reprime la expresión del gen que codifica para la
FeSOD cloroplástica en la planta Barbula unguiculata (Nagae y col., 2008). Del mismo
modo, los mecanismos de regulación postranscripcional también son prácticamente
desconocidos. A este respecto, se ha especulado que podrían ser similares a los que
tienen lugar en levaduras. A nivel postranscripcional, se ha observado la degradación de
CTR1 en condiciones tóxicas de Cu (De Freitas y col., 2003).
Se ha postulado que las plantas pueden contener sensores específicos para
metales que detectan cambios en el nivel de metal como la deficiencia o el exceso, y
provocan cascadas de señalización que activan la respuesta apropiada. En plantas no se
han identificado todavía las vías de transducción de la señal. Se ha descrito la activación
de diferentes vías de proteínas kinasas activadas por mitógeno de M. sativa en respuesta
42

43
Introducción
a concentraciones tóxicas de Cu o Cd (Jonak y col., 2004). Queda por esclarecer si la
activación de la cascada de las MAP kinasas es dependiente del metal o de un efecto
causado por el estrés oxidativo y la reactividad del grupo tiol provocados ambos por la
concentración elevada de Cu y Cd.
A día de hoy se conoce la regulación por Cu a nivel transcripcional de algunos
genes involucrados en la homeostasis de Cu en plantas superiores. Se han identificado
varios genes que se inducen en respuesta a concentraciones altas de Cu: HMA5, HMA9,
CuZnSOD, MTs, COX17, CCS (Andrés-Colás y col., 2006; Lee y col., 2007; Kurepa y
col., 1997; Schiavon y col., 2007; Guo y col., 2003; Balandin y Castresana, 2002;
Abdel-Ghany y col., 2005a) y otros genes que se reprimen en respuesta a
concentraciones altas de Cu: HMA6, HMA8, FeSOD, Pc y CCH (Schiavon y col., 2007;
Abdel-Ghany y col., 2005b; Lee y col., 2005). Recientemente, se ha observado que el
transportador HMA8 de soja está regulado por Cu y por “splicing” alternativo (Bernal
M., 2006, Tesis Doctoral, Universidad de Zaragoza). Actualmente existen datos con
microarrays de expresión génica en hojas de arroz donde identifican 305 genes que se
inducen (genes relacionados con la defensa frente al estrés) o reprimen (genes
relacionados con la fotosíntesis y el transporte) en respuesta al exceso de Cu (Sudo y
col., 2008). Además, existen datos de caracterización proteómica en raíces de Cannabis
sativa (Bona y col., 2007), embriones en germinación de arroz (Zhang y col., 2009) y
raíces y hojas de Elsholtzia splendens (Li y col., 2009), donde identifican las proteínas
que se suprimen, reprimen e inducen en respuesta al exceso de Cu.
A pesar de la ausencia de datos con microarrays, se han identificado varios
genes en Arabidopsis que se inducen en respuesta a una baja disponibilidad de Cu: los
transportadores COPT1, COPT2 y ZIP2; la reductasa FRO3; la cuprochaperona CCH;
la enzima FeSOD cloroplástica (Himelblau y col., 1998; Sancenón y col., 2003; Wintz y
col., 2003; Abdel-Ghany y col., 2005b; Mukherjee y col., 2006). Las plantas no
sustituyen la Pc por el Cit c6 como hacen las cianobacterias y algunas algas en
condiciones de deficiencia de Cu, sin embargo, sustituyen la enzima CuZnSOD por la
FeSOD con el objetivo de economizar el Cu para liberarlo a la Pc que es esencial para
realizar la fotosíntesis (Fig. 1-11), función absolutamente fundamental en las plantas.
De esta forma, cuando la concentración de Cu es baja, los niveles de mRNA, proteína y
actividad de la FeSOD aumentan notablemente, mientras que los niveles de las
CuZnSOD cloroplástica y citosólica son prácticamente indetectables, lo que provoca, a
su vez, un descenso en la expresión de su chaperona CCS (Abdel-Ghany y col., 2005b).

Introducción
Esta regulación coordinada de genes nucleares se dirige probablemente al uso óptimo de
Cu en el cloroplasto y sugiere que los niveles de Cu en el estroma regulan la expresión
nuclear a través de vías de señalización desconocidas actualmente (Pilon y col., 2006).
Exceso de Cu
Deficiencia de Cu
Figura 1-11: Sustitución de las SODs cloroplásticas en función de la disponibilidad de
Cu en Arabidopsis (Adaptada de Puig y col., 2007a).
Recientemente, se ha descubierto un microRNA, miR398, que media esta
regulación en A. thaliana, incorporándose al RISC (“RNA-induced silencing complex”)
y degradando el mRNA de las CuZnSOD citosólica y cloroplástica cuando la
concentración de Cu es limitante (0´2-0´5 μM) (Yamasaki y col., 2007). La expresión
de miR398 se reprime transcripcionalmente por estreses oxidativos como el generado
por el Cu, lo que conlleva a una acumulación de los transcritos de las CuZnSOD
cloroplástica y citosólica incrementando, así, la tolerancia de la planta a este metal
(Sunkar y col., 2006). El mRNA de CSD1 pero no el de CSD2 fue correlacionado
negativamente con el nivel de miR398 durante el estrés con ozono, salinidad y P.
syringae, lo que sugiere que la regulación de CSD2 no está estrictamente bajo el control
de miR398 durante algunos estreses (Jagadeeswaran y col., 2009). La sacarosa (Dugas y
Bartel, 2008) y la luz (Siré y col., 2009) inducen la expresión de miR398 lo que provoca
44

45
Introducción
una disminución de los mensajeros de las CuZnSOD cloroplástica y citosólica así como
la acumulación de las proteínas correspondientes. Otros tres miroRNAs adicionales han
sido descritos en Arabidopsis, miR397, miR408 y miR857, que reconocen y degradan
los transcritos de las cuproproteínas plantacianina y varias lacasas (Abdel-Ghany y
Pilon, 2008). En general, se propone a los miRNAs como reguladores importantes de la
respuesta frente al estrés abiótico (Lu y Huang, 2008) y la homeostasis de Cu y Cd
(Ding y Zhu, 2009) en plantas. Recientemente, se ha descrito en Arabidopsis la
existencia de la proteína SPL7 (squamosa promoter binding protein-like-7), homóloga
al factor de transcripción Crr1 en Chlamydomonas (Kropat y col., 2005), la cual tiene
un dominio SBP (squamosa promoter-binding) con el que se une al dominio GTAC del
promotor de miR398 activando, así, la transcripción de este miRNA. SPL7 también
activa la transcripción de otros miRNAs (miR397, miR408 y miR857), transportadores
de Cu (COPT1, COPT2, ZIP2, FRO3 y YSL2) y la chaperona CCH, jugando un papel
central en la regulación de la homeostasis de Cu en Arabidopsis, principalmente en
respuesta a la deficiencia de Cu (Yamasaki y col., 2009). Además de estos CumicroRNAs,
se han descrito otros microRNAs cuya expresión está regulada por la
disponibilidad de nutrientes diferentes al Cu como el azufre y el fósforo.
Se ha estudiado el uso potencial como marcadores del status de Cu en las plantas
de los transcritos y las proteínas Pc, FeSOD, CuZnSOD cloroplástica y CuZnSOD
citosólica, los cuales son sensibles a la disponibilidad de Cu (Cohu y Pilon, 2007).
Recientemente, se ha descrito un papel como marcador del status de Cu para el
transcrito de CCS en humano (Olivares y col., 2008) y la proteína de esta chaperona en
ganado (Hepburn y col., 2009).
El “splicing” alternativo (AS, “alternative splicing”) es un mecanismo por el
cual se generan dos o más tipos diferentes de mRNA maduros a partir de un único premRNA.
Es bien conocido que este mecanismo contribuye a la regulación
postranscripcional génica, a la estabilidad del mRNA y al aumento de la diversidad
proteómica en animales, mientras que el estudio de su importancia en plantas está en
proceso de desarrollo. Sin embargo, la disponibilidad actual de los genomas y las
secuencias de los transcritos permite analizar el AS de forma global en muchas especies
de plantas (Ner-Gaon y col., 2007). El resultado de estos análisis ha sido que la
frecuencia de AS en las plantas es diferente a la frecuencia en los animales. Más del
20% de los genes sufren AS en plantas lo que corresponde a cerca de 4700 genes en A.
thaliana (dicotiledónea) y 6500 genes en arroz (monocotiledónea) (Wang y Brendel,

Introducción
2004). Esta proporción indica que el AS en plantas no es raro aunque supone una tercera
parte del observado en humano. La mayor parte de los casos de AS no han sido
caracterizados funcionalmente en plantas, pero se sugiere su participación en
importantes funciones como la respuesta a estreses entre los que se encuentra el estrés
abiótico (Mazzucotelli y col., 2008). Existen estudios recientes del AS en los genomas
de maíz, musgo (Rensing y col., 2008) y tres especies de leguminosas (Wang y col.,
2008).
Se han definido cuatro tipos de AS según la isoforma de transcrito que
predomine: salto de exón (ExonS, “exon skipping”), sitio del donador alternativo (AltD,
“alternative donor site”), sitio del aceptor alternativo (AltA, “alternative aceptor site”) y
retención de intrón (IntronR, “intron retention”). Se ha demostrado que la retención de
intrón es el tipo de AS más frecuente en Arabidopsis y arroz, y que los transcritos
resultantes están implicados principalmente en funciones como la fotosíntesis y la
respuesta frente al estrés (Ner-Gaon y col., 2004; Wang y Brendel, 2006; Campbell y
col., 2006). Por el contrario, el salto de exón es el tipo de AS más frecuente en humano,
sin embargo, este tipo de AS es precisamente muy poco frecuente en plantas. Los
intrones de las plantas tienen un tamaño menor (100 – 200 pb), unos límites menos
definidos y unas secuencias más ricas en uridina y adenosina que los intrones de los
animales. Además, las plantas tienen una familia de factores de serina y arginina
asociados al spliceosoma más compleja que los animales, y al menos un 9% de los
genes de Arabidopsis tienen intrones en sus secuencias UTRs. Estas diferencias
sugieren que el mecanismo de reconocimiento de los sitios de “splicing” puede ser
diferente entre plantas y animales. A pesar de que el spliceosoma de plantas no ha sido
aislado y por tanto se desconoce su composición exacta, se sugiere que es bastante
similar al spliceosoma de animales.
En Arabidopsis y arroz se proponen las secuencias C(A)AG/GTAA y
TGCAG/G como secuencias consenso para los sitios del donador y del aceptor de
“splicing”, respectivamente. La especificidad se consigue a través de la interacción
entre las proteínas reguladoras del “splicing” y los elementos en cis adicionales. Estos
elementos, potenciadores del “splicing” exónico e intrónico (ESEs o ISEs, “exonic or
intronic splicing enhancers”) y silenciadores del “splicing” exónico e intrónico (ESSs o
ISSs, “exonic or intronic splicing suppressors”), están localizados en los exones o en los
intrones adyacentes a distancias variables del sitio de “splicing”. Estos elementos has
46

47
Introducción
sido identificados en varios genes de mamíferos y, recientemente, se ha descrito una
colección de posibles secuencias ESE en Arabidopsis (Barbazuk y col., 2008).
Existen varios ejemplos de cuproproteínas reguladas por este mecanismo de
“splicing” alternativo en plantas: CUTA de Arabidopsis (Burkhead y col., 2003),
COX19 de Arabidopsis (Attallah y col., 2007b), CuZnSOD de Populus (Srivastava y
col., 2009) y HMA8 de soja (Bernal M., 2006, Tesis Doctoral, Universidad de
Zaragoza).
1.6 OBJETIVOS
1. Regulación de la expresión a nivel de mRNA y proteína de la chaperona CCS y
la enzima CuZnSOD cloroplásticas en suspensiones celulares fotosintéticas y
planta entera de soja. Estudio de la respuesta frente al exceso de cobre.
Identificación y localización subcelular de GmCCS y GmCuZnSOD.
2. Clonación, sobreexpresión y purificación de la GmCCS.
3. Caracterización bioquímica, espectroscópica y físico-química de la GmCCS
recombinante purificada.
4. Búsqueda de una hipotética cpCCS en soja, homóloga a la supuestamente
encontrada en Arabidopsis e implicada en el transporte de cobre entre HMA6 y
HMA8.

MATERIALES Y MÉTODOS

A B
C
53
Materiales y Métodos
Figura 2-1: Métodos de crecimiento de las suspensiones celulares de soja. (A) Cultivo
en medio líquido. (B) Cultivo en medio sólido. (C) Observación al microscopio óptico
de las suspensiones celulares de soja crecidas en medio líquido, donde se observan
claramente los cloroplastos y los septos de la división celular.
El cultivo de este tipo de suspensiones celulares es complicado ya que requiere
medios nutritivos relativamente complejos en comparación con los medios bacterianos,
mucho más restringidos. Por esta razón, la manipulación debe ser muy cuidadosa,
poniendo especial cuidado en utilizar todo el material convenientemente esterilizado en
autoclave y realizar todos los procesos de manipulación del cultivo en el interior de una
campana de flujo laminar (Telstar AH-100).

55
Materiales y Métodos
Figura 2-2: Crecimiento de plantas de soja en cámara climática y medio hidropónico.
2.1.3 Tratamientos de suspensiones celulares de soja
Durante los últimos años, hemos obtenido en nuestro laboratorio suspensiones
celulares fotosintéticas de soja tolerantes a exceso de Cu (5-50 μM). Las células
tolerantes acumularon niveles de Cu promedio 60 veces superiores al control. Estos
resultados sugieren que el transporte de Cu en las células tolerantes debe estar
estimulado, así como sus sistemas de distribución y almacenamiento dentro de la célula
vegetal (Bernal y col., 2006). Por ello, utilizamos este sistema biológico como modelo,
pues, además de corresponder a las células fotosintéticas de la hoja, nos permite llevar a
cabo tratamientos experimentales de una manera más controlada y más fácil
técnicamente.
Los tratamientos se llevaron a cabo suplementando el medio hidropónico (KN 1 )
con disoluciones de los metales Cu, Fe y Zn a una concentración de 10 μM. La
concentración inicial de estos metales en el medio hidropónico (KN 1 ) es: 0´1 μM de Cu,
100 μM de Fe y 30 μM de Zn. De esta forma, los tratamientos a los que fueron
sometidas las suspensiones celulares fueron los siguientes:
• 10 µM CuSO4 · 5 H2O durante 1 dilución*
• 10 µM CuSO4 · 5 H2O durante 76 diluciones

Materiales y Métodos
• 10 µM FeSO4 · 7 H2O durante 1 dilución
• 10 µM ZnSO4 · 7 H2O durante 1 dilución
• 10 µM CuSO4 · 5 H2O + 10 µM ZnSO4 · 7 H2O durante 1 dilución
*1 dilución corresponde a los primeros 21 días de tratamiento.
Las disoluciones de estos metales se esterilizaron previamente por filtración con
un filtro estéril de 0´2 μm (Pall Corporation) antes de ser añadidas al medio de cultivo.
2.1.4 Tratamientos de plantas de soja
Los tratamientos que se llevaron a cabo en las plantas a partir de los primeros 15
días de crecimiento fueron los siguientes:
• Tratamiento foliar de Cu: las hojas fueron pintadas cada cuatro días con una
disolución 10 µM CuSO4 · 5 H2O.
• Tratamiento radicular de Cu: el medio hidropónico de half-Hoagland fue
suplementado con 10 µM CuSO4 · 5 H2O. Los medios hidropónicos fueron
renovados una vez a la semana.
Las plantas se recogieron a los 28 días de crecimiento. Los tejidos cosechados
fueron: hoja joven (primer trifolio), hoja madura (tercer trifolio), tallo, raíz y flor.
2.2 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Todo el material fue autoclavado durante 20 min a 120 ºC antes de su uso. Las
soluciones se prepararon con H2O miliQ y se autoclavaron en las mismas condiciones.
2.2.1 Extracción del RNA de suspensiones celulares de soja
Tras ser recogidas mediante filtración a través de papel Miracloth (Hoechst,
Calbiochem) y lavadas con medio de cultivo KN 1 fresco, las células de soja (0´3 g) se
congelaron con nitrógeno líquido y se rompieron con la ayuda de un mortero hasta la
obtención de un polvo fino. Para la extracción y posterior purificación del RNA, se
utilizó el kit “RNeasy Plant Mini Kit” (Quiagen GMBH, Hiden, Alemania) según las
instrucciones del fabricante. A continuación, se resuspendió en 35 μl de H2O miliQ con
0´1% (v/v) de inhibidor de RNAsas DEPC.
56

57
Materiales y Métodos
La concentración de RNA se determinó espectrofotométricamente midiendo la
absorbancia a 260 nm. Para el cálculo de la concentración, cada unidad de absorbancia a
260 nm se consideró como 40 μg/ml de RNA. Finalmente, el RNA se diluyó en agua
con 0´1% (v/v) de DEPC hasta una concentración de trabajo estándar de 2 μg/μl.
2.2.2 Extracción del RNA de plantas de soja
Para la extracción y purificación del RNA de plantas se siguió el mismo
procedimiento que con las suspensiones celulares, se utilizó el kit “RNeasy Plant Mini
Kit” (Quiagen GMBH, Hiden, Alemania), según las instrucciones del fabricante. Se
partió de 0´1 g de material para todos los tejidos analizados (hoja joven, hoja madura,
tallo, raíz y flor). En el caso de la raíz, se realizó una incubación adicional de 3 min a 56
ºC tal y como indica el manual en el paso 3. A continuación, el RNA se resuspendió en
30 μl de H2O miliQ con 0´1% (v/v) de DEPC y se midió su concentración (apartado
2.2.1). Finalmente, el RNA se diluyó en H2O miliQ con 0´1% (v/v) de DEPC hasta una
concentración de trabajo estándar de 2 μg/μl.
2.2.3 RT-PCR semicuantitativa
La técnica de RT-PCR (Transcripción reversa – Reacción en cadena de la
polimerasa) se utilizó para estudiar de modo semicuantitativo los niveles de mRNA de
los genes GmCCS y GmCSD2. La realización de una RT-PCR conlleva dos etapas: la
síntesis del DNA complementario (cDNA) a partir del mRNA y la amplificación
mediante cebadores específicos del cDNA derivado del mRNA del gen de interés.
2.2.3.1 Síntesis de cDNA
El RNA extraído tal y como se explica en el apartado anterior, ha sido tratado
previamente con 5 unidades de DNAsa I libre de RNAsa a 37 ºC durante 10 min para
eliminar la posible contaminación con DNA genómico antes de ser purificado con las
columnas del kit “RNeasy Plant Mini Kit”, las cuales eliminan posteriormente esta
DNAsa.
Se sintetizó la hebra de cDNA a partir de 5 μg de RNA, utilizando como cebador
un oligonucleótido compuesto por desoxirribonucleótidos de timina denominado oligo
dT. Para ello se añadió el cebador (dT)12-18 (Invitrogen) a una concentración final de 1
μM e incubamos a 70 ºC durante 10 min. Tras enfriar rápidamente en hielo durante al

Materiales y Métodos
menos 5 min, se añadió el tampón de la retrotranscriptasa y la mezcla de
desoxirribonucleótidos, incubándose todo a 42 ºC durante 1 min. Pasado este minuto, se
añadieron 200 unidades de la retrotranscriptasa (M-MLV retrotanscriptase, Promega)
incubándose durante 1 h a 42 ºC. La retrotranscriptasa se inactivó a 70 ºC durante 10
min y la muestra se trató con RNAsa H libre de DNAsa que digiere el RNA de las
dobles cadenas formadas por RNA y DNA. Finalmente, el cDNA sintetizado se diluyó
hasta un volumen final de 120 μl con H2O miliQ estéril, y se conservó a -80 ºC.
2.2.3.2 Condiciones de PCR
Tras encontrar las condiciones de PCR adecuadas para cada pareja de cebadores,
los productos de amplificación fueron clonados y secuenciados para comprobar su
identidad.
Las PCRs se realizaron en un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (PE
Applied Biosystems) en tubos de 0´2 ml en los que se dispuso la siguiente mezcla de
reacción:
cDNA 8 μl
dNTP mix (10 mM) 3´5 μl
Tampón Taq × 10 5 μl
MgCl2 (50 mM) 4 μl
Cebador 5’ (10 µM) 2 μl
Cebador 3’ (10 µM) 2 μl
H2O miliQ 24´5 μl
Taq Platinum (5 u/µl) 1 μl
58

GmCCS
GmCCS´
GmCSD2
Gen Cebador Secuencia (5´- 3´)
NSP-GmCCS1
NSP-GmCCS2
NSP-GmCCS3
NSP-GmCSD2
CpCCS
Actina
FW-CCS
RW-CCS
FW-SAC
RW-KPN
FW-SOD
3´SOD1
2-19 FW
2-5 FW
2-4 RW
3-SOD4
5´-SOJA+X1
3´-SOJA+X1
5´-ACT
3´-ACT
Tabla 2-1: Cebadores utilizados para cada gen.
59
Materiales y Métodos
GGATCCATGGCATTTCTGAGGTCA
TCTAGACTATCAGACCTTGCTAGT
GAGCTCATGGACCACAAACTCT
GGTACCCTATCAGACCTTGCTA
GTGGCTCTGTGAGTGAGTGAG
GCTTCACAGAAGACATAACATCAG
GTTAGTTCCTTGTTGTCTG
GCATGCCATGGATTTCCGTC
GTCAGCCATCATGATGCATC
CATAAGCAGGTCCAGGATCCAG
ATGGC(TCAG)AA(TC)GT(TCAG)GT
(TCAG)GA(AG)(TC)T(TCAG)AA(AG)
(TCAG)CC(TCAG)(AG)(CT)(TCAG)AC
(TCAG)GT(TCAG)AC(TC)TT(TCAG)TT
ATTGTAGGTCGTCCTCGTC
TTGCATAAAGTGA AAGAACAG
Como se muestra en la Fig. 2-3, todas las PCRs realizadas constaron de una etapa
de desnaturalización a 94 ºC durante 3 min, seguida de varios ciclos compuestos por
una etapa de desnaturalización a 94 ºC durante 30 s, otra de hibridación de los
cebadores y otra de extensión. La temperatura de hibridación (Tm) varía para cada
pareja de cebadores (Tabla 2-2). Todos los programas de PCR se finalizaron con una
etapa de extensión a 72 ºC durante 10 min.

Materiales y Métodos
94 ºC 94 ºC
3 min 30 s
35 ciclos
Tm
30 s
72 ºC 72 ºC
t 10 min
Figura 2-3: Programa tipo de PCR utilizado. La temperatura de hibridación (Tm) y
el tiempo de extensión (t) se ajustaron de forma apropiada para cada gen.
Gen
GmCCS
GmCCS´
GmCSD2
NSP-GmCCS1
NSP-GmCCS2
NSP-GmCCS3
NSP-GmCSD2
Actina
Tm (ºC)
54
55
54
50
50
50
55
46
Tiempo de
extensión (s)
Tabla 2-2: Temperatura de hibridación y tiempo de extensión a los que se ha
realizado cada amplificación, así como el tamaño del producto amplificado.
60
90
60
60
60
60
60
60
45
930
762
791
755
678
1160
609
334
4 ºC
∞
Tamaño del
producto (pb)

94 ºC 94 ºC
4 min 1 min
40 ciclos
52 ºC
2 min
61
72 ºC 72 ºC
90 s 10 min
Materiales y Métodos
Figura 2-4: Programa de PCR utilizado para amplificar el gen que codifica a la
hipotética chaperona cpCCS de soja. (*) Significa que las rampas de temperatura
anterior y posterior a la etapa de hibridación a 52 ºC corrieron más lentas que en el
programa tipo.
2.2.4 Electroforesis de DNA en geles de agarosa
*
La electroforesis se realizó sobre un soporte sólido de agarosa en tampón TBE. En
estas condiciones, a pH neutro, el DNA presenta una carga negativa de manera que,
sometido a un campo eléctrico, migra hacia el ánodo. Las moléculas de DNA lineal
migran a través del gel a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo de su
peso molecular. De este modo, pudo determinarse el tamaño de los fragmentos de DNA
de interés en relación con marcadores comerciales de peso molecular conocidos.
La electroforesis horizontal en geles de agarosa se utilizó como método general de
análisis de preparaciones de DNA, y para separar, identificar o purificar fragmentos de
DNA. La concentración de agarosa de los geles dependió del tamaño del fragmento que
se deseó analizar. En nuestro caso, debido a la diversidad de tamaños, se utilizaron geles
desde el 0´7% de agarosa para los fragmentos más grandes hasta el 1´2% para los más
pequeños.
Para preparar el gel, la agarosa (Pronadisa) se fundió mediante calentamiento y
con agitación en tampón TBE. Una vez preparada la disolución de agarosa, se añadió
bromuro de etidio a una concentración final de 5 μg/μl, se vertió en el molde del gel y
4 ºC
∞

Materiales y Métodos
se colocó el peine para formar los pocillos. El bromuro de etidio se intercala en la doble
hélice del DNA y fluoresce bajo luz ultravioleta. Una vez solidificado el gel (20 min),
se retiró el peine y se colocó con el molde en la cubeta de electroforesis. La cubeta se
rellenó con TBE hasta cubrir el gel y se dispusieron en los pocillos las muestras diluidas
y con el tampón de carga añadido 1/5 del volumen total de la muestra. Juntamente con
las muestras, se aplicó 1 μg de marcadores de peso molecular (1 kb Plus DNA Ladder,
Invitrogen). Se conectó la fuente a 60 V y se dejó correr hasta que el colorante azul de
bromofenol llegó a 2/3 del gel. Las preparaciones de DNA se observaron y
fotografiaron bajo luz ultravioleta, en un equipo de análisis de imágenes (Gel Doc,
BioRad).
Tampón de carga x 6: 30% (v/v) Glicerol, 0´25% (p/v) Azul de bromofenol, 0´25%
(p/v) Azul de xilen-cianol.
TBE: 90 mM Tris-borato (pH=8), 2 mM EDTA.
2.2.5 Clonación de los productos de PCR
Los productos de amplificación obtenidos en la RT-PCR semicuantitativa fueron
clonados y secuenciados para identificarlos con total seguridad. Para realizar esta
clonación, se siguieron los procedimientos que se describen en los siguientes apartados.
2.2.5.1 Extracción de los productos de PCR de geles de agarosa mediante lana de
vidrio
Una vez separados los productos de PCR mediante electroforesis en gel de
agarosa, éstos se visualizaron bajo luz ultravioleta y la zona del gel donde se localizó la
banda se recortó con un bisturí estéril. El fragmento de agarosa que contiene el DNA se
troceó y se colocó junto con 20 μl de H2O miliQ estéril en un eppendorf de 0´5 ml al
que se le había practicado un orificio en el fondo y en el que se había dispuesto lana de
vidrio hasta aproximadamente la mitad de su volumen. El tubo con la lana de vidrio y la
agarosa se acopló a un tubo eppendorf de 1´5 ml y se centrifugó a 9170 x g durante 10
min. El eluyente obtenido tras la centrifugación contiene el DNA. El tubo con la lana de
vidrio se acopló a un nuevo eppendorf de 1´5 ml, se añadieron otros 20 μl de H2O
milliQ estéril y se centrifugó de nuevo en las mismas condiciones anteriores. A los dos
eluyentes resultantes se añadió H2O miliQ hasta llegar a los 300 μl de volumen total y
62

63
Materiales y Métodos
se eliminaron posibles contaminaciones de proteínas extrayendo la fase acuosa superior
con un volumen de fenol:cloroformo-isoamilalcohol (1:1, v/v) mediante centrifugación
a 5870 x g durante 10 min. Posteriormente se extrajo de nuevo la fase acuosa superior
con un volumen de cloroformo:isoamilalcohol (24:1, v/v) mediante centrifugación a
5870 x g durante 10 min. Finalmente, el DNA se precipitó con dos volúmenes de etanol
al 96% y 1/5 del volumen de 3 M acetato de sodio a -20 ºC durante como mínimo 1 h. A
continuación, se centrifugó a 13200 x g durante 30 min, se decantó y se añadieron 200
μl de etanol al 70%. Se volvió a centrifugar a 15500 x g durante 5 min, se decantó y se
dejó secar al aire el sedimento. Por último, el DNA se resuspendió con 10-15 μl de H2O
milliQ estéril.
2.2.5.2 Ligación de los productos de PCR
Una de las características de la Taq polimerasa que se utilizó en las reacciones
de PCR (Taq Platinum, Invitrogen), es que introduce una base adenina (A) en los
extremos 3’ del amplicón. El plásmido pGEM-T-easy (Promega) contiene una timina
(T) en los extremos 5’ lo que permite la unión del fragmento amplificado mediante la
acción de la enzima T4 ligasa (Promega). La ligación del gen GmCCS al vector
pMALc2x modificado (modif.), ambos con extremos cohesivos conteniendo los sitios
de restricción de las enzimas BamHI y XbaI, se realizó también con la enzima T4 ligasa.
La mezcla de ligación debe contener, de forma aproximada, cantidades equimolares de
plásmido y fragmento que se desea clonar para que la ligación sea óptima. Las
ligaciones, tanto para el vector pGEM-T-easy como para el vector pMALc2x modif., se
realizaron mediante una primera incubación durante 1 h a temperatura ambiente seguido
de una incubación posterior durante toda la noche a 8 ºC.
2.2.5.3 Preparación de células competentes
La preparación de células competentes (permeabilización de la pared y
membrana de las células) se ha realizado mediante el tratamiento con CaCl2 frío
siguiendo el siguiente protocolo. El día de antes se prepara un cultivo previo de 4 ml de
LB (Pronadisa) con “un glicerol” de bacterias de Escherichia coli JM109 (Promega) o
DH5α comerciales. A continuación, se prepara un cultivo de 25 ml en un erlenmeyer de
100 ml con un inóculo del cultivo previo. Este cultivo se crece a 37 ºC hasta que la
D.O.600nm llegue a 0´4 unidades. Entonces, se pone 1 ml de estas células en tubos
eppendorfs previamente enfriados. Estos tubos eppendorfs se centrifugan a 4400 x g

Materiales y Métodos
durante 10 min a 4 ºC. Una vez centrifugados, se retira el sobrenadante con una pipeta y
el sedimento se resuspende en 100 μl de 0´1 M CaCl2 frío. Las células competentes se
mantienen en hielo si van a ser transformadas inmediatamente o se guardan
fraccionadas (100-200 μl) con un 20% de glicerol a -80 ºC para su conservación a largo
plazo. Una vez descongeladas, se aconseja no volver a congelar las células competentes,
ya que pierden eficiencia al descongelarlas por segunda vez.
2.2.5.4 Transformación de E. coli
Las células competentes de la cepa JM109 (Promega) y DH5α comerciales de E.
coli se transformaron mediante choque térmico con las mezclas de ligación. Para ello,
las bacterias competentes que se conservan a -80 ºC fueron descongeladas en hielo
durante 15-20 min. Una vez descongeladas, se añadieron 100 μl de bacterias a 10 μl de
ligación y se incubó en hielo durante otros 20 min. A continuación, el tubo conteniendo
la mezcla de ligación se transfirió rápidamente a 42 ºC y se mantuvo a esa temperatura
durante 2 min. Seguidamente, se incubó en hielo durante 15 min. A continuación, se
añadieron a la mezcla 850 μl de medio LB y se incubó durante 1 h a 37 ºC con
agitación. Se centrifugó a 13000 x g durante 3 min para recoger las células y se
eliminaron 700 μl de sobrenadante. Los 200 μl restantes de sobrenadante se utilizaron
para resuspender las células. La mezcla se sembró en placas de LB con Ampicilina (50
μg/ml) a razón de 200 μl de mezcla por placa. La Ampicilina fue utilizada como
marcador selectivo, ya que tanto el vector pGEM-T-easy como el vector pMALc2x
modificado, confieren resistencia a este antibiótico. Tras incubar las placas sembradas a
37 ºC durante toda la noche, aparecieron abundantes colonias correspondientes la
mayoría de las veces a clones positivos conteniendo la construcción deseada. Las
colonias, así obtenidas, se numeraron y se inocularon algunas de ellas en tubos con 4 ml
de LB y 100 μg μl -1 de Ampicilina para el posterior análisis de su DNA plasmídico de
forma individual. Los cultivos de uso continuo se mantuvieron a 4 ºC durante algunas
semanas (no más de un mes). Para el mantenimiento indefinido, los cultivos se
guardaron con 20% (v/v) glicerol a -80 ºC.
2.2.5.5 Aislamiento de DNA plasmídico
Tras incubar los cultivos en medio LB líquido con Ampicilina toda la noche a 37
ºC, se procedió a aislar su DNA plasmídico. Para ello, 3 ml del cultivo líquido fueron
64

65
Materiales y Métodos
centrifugados a 15500 x g durante 3 min y se retiró cuidadosamente el sobrenadante con
una pipeta Pasteur. A continuación, se utilizó el kit de aislamiento de DNA plasmídico
“High pure plasmid isolation kit” (Roche) según las instrucciones del fabricante. La
elución se realizó con 10 μl de tampón de elución más 20 μl de H2O milliQ estéril.
Una alícuota del DNA plasmídico obtenido fue digerido con las enzimas de
restricción adecuadas que cortaron el plásmido liberando el producto de PCR clonado.
Los fragmentos originados en las digestiones se separaron mediante electroforesis en
geles de agarosa y se observaron bajo luz ultravioleta (apartado 2.2.4). Los plásmidos
que habían incorporado el inserto del tamaño deseado se enviaron a secuenciar (Servicio
de secuenciación del CNIO, Madrid) para comprobar la identidad del producto clonado
y los cultivos positivos elegidos se conservaron en 20% (v/v) glicerol estéril a -80 ºC.
2.3 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
2.3.1 Aislamiento de cloroplastos, tilacoides y estroma a partir de suspensiones
celulares y plantas de soja
Los cultivos de suspensiones celulares de soja presentan una tendencia natural a
agregarse lo que dificulta su manipulación, a lo que hay que añadir los problemas que
presenta la ruptura de la pared celular de estas células. Las distintas fracciones celulares
se obtuvieron a partir de 50 ml de cultivo después de tres semanas de crecimiento,
tiempo éste en el que los cultivos presentan un color verde intenso.
Las células se filtraron a través de papel Miracloth (Hoechst, Calbiochem) para
eliminar el medio de cultivo y se resuspendieron en tampón B1. Este tampón se añade a
razón de 1´5 ml/g de células filtradas. La rotura de las células se llevó a cabo con un
homogeneizador manual de teflón durante 10 min. Para evitar el calentamiento de la
preparación, se interrumpió 1 min el proceso de rotura cada 2 min, manteniendo la
muestra constantemente en hielo. El extracto celular se agitó durante 10 min a 4 ºC para
favorecer la liberación de los cloroplastos retenidos entre los restos celulares.
Posteriormente, el extracto se centrifugó a 300 x g durante 2 min, reservando el
sobrenadante. El sedimento se resuspendió en tampón B1 y se centrifugó de nuevo en
las mismas condiciones. Los dos sobrenadantes obtenidos anteriormente se mezclaron y
se centrifugaron a 13000 x g durante 10 min. El sedimento obtenido contiene
fundamentalmente cloroplastos. Este sedimento se resuspendió en tampón B2 con ayuda

Materiales y Métodos
de un pincel, provocando la ruptura del cloroplasto por choque osmótico. Los
cloroplastos rotos fueron centrifugados a 13000 x g durante 10 min obteniendo como
sedimento las membranas tilacoidales y como sobrenadante el estroma. Las membranas
fueron resuspendidas en tampón B3 sacarosa y las fracciones del estroma se
concentraron en tubos Centripep-10 y Centricon-10 (Amicon).
Se recogieron las hojas de las plantas de soja (60 g) después de 28 días de
crecimiento, se lavaron con agua desionizada y se cortaron en trozos pequeños. A
continuación, los trozos se homogeneizaron con ayuda de una licuadora en tampón B1
con un volumen de tampón en relación 1:2 (p/v). La mezcla se filtró a través de una
capa de papel Miracloth (Calbiochem) y se centrifugó a 300 x g durante 2 min. Los
pasos siguientes fueron los mismos que se han descrito para las suspensiones celulares.
Todos los pasos fueron realizados en cámara fría y bajo luz tenue. Tras su
aislamiento, los cloroplastos, los tilacoides y el estroma se congelaron en N2 líquido y
almacenaron a -80 ºC. Una vez descongelados deben ser mantenidos a 4 ºC durante su
utilización.
Tampón B1 células: 400 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 20 mM Tricina (pH=8), 0´2% (p/v)
Sacarosa.
Tampón B1 plantas: 400 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 40 mM Ascorbato, 20 mM Tricina
(pH=8), 0´2% (p/v) BSA.
Tampón B2: 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 20 mM Tricina (pH=8).
Tampón B3 sacarosa: 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM MES (pH=6), 400 mM
Sacarosa.
Todos los tampones llevaban los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml),
antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
2.3.2 Aislamiento de cloroplastos intactos a partir de suspensiones celulares y
plantas de soja
La obtención de cloroplastos intactos se realizó según el método descrito por van
Wijk y col. (1995) modificado según Andreasson y col. (1988), adaptado tanto a
suspensiones celulares como a plantas de soja.
Las hojas de soja (60 g), troceadas y lavadas con agua desionizada, se
homogenizaron en un homogenizador tipo politrón en presencia de tampón A y, tras
66

67
Materiales y Métodos
filtrar el homogenizado por dos capas de papel Miracloth (Hoechst, Calbiochem), se
agitó suavemente durante 10 min a 4 ºC para favorecer la liberación de los cloroplastos
retenidos entre los restos celulares. Posteriormente, el extracto se centrifugó a 300 x g
durante 2 min, reservando el sobrenadante. En el caso de las suspensiones celulares (6
g), la homogenización se realizó con un homogenizador de teflón en presencia de
tampón A, tal y como se ha descrito anteriormente (apartado 2.3.1). Posteriormente, el
lisado se centrifugó a 300 x g durante 1 min.
El sobrenadante obtenido en ambas muestras (plantas y suspensiones celulares)
se centrifugó a 1000 x g durante 2 min. Se reservó el sedimento y el sobrenadante se
volvió a centrifugar a 2000 x g durante 5 min. De esta forma, se obtienen en el
sedimento fundamentalmente los cloroplastos. Este sedimento se resuspendió en el
menor volumen posible (100 μl) de tampón B con ayuda de un pincel y se cargó
cuidadosamente sobre un colchón de percoll al 35% (p/v) preparado en tampón B. La
muestra se centrifugó a 5000 x g durante 10 min en un rotor basculante. Tras la
centrifugación se observó una banda verde intensa de cloroplastos intactos, situada
aproximadamente a 1 cm de la superficie del líquido (Fig. 2-5), que recogimos
cuidadosamente con una pipeta de boca ancha. Finalmente, los cloroplastos intactos se
lavaron con tampón B centrifugando a 1300 x g durante 5 min para eliminar posibles
restos de percoll, y se resuspendieron suavemente con ayuda de un pincel en tampón C.
Los cloroplastos se conservaron en presencia de los inhibidores de proteasas Pefabloc
(100 µg/ml), antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
Tampón A: 330 mM Sorbitol, 5 mM Ascorbato, 2 mM EDTA, 20 mM NaCl, 1 mM
MgCl2, 1 mM MnCl2, 0´5 mM KH2PO4, 5 mM MES-KOH (pH=6´1).
Tampón B: 330 mM Sorbitol, 5 mM Ascorbato, 2 mM EDTA, 20 mM NaCl, 1 mM
MgCl2, 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES-KOH (pH=7´6).
Tampón C: 330 mM Sorbitol, 5 mM MgCl2, 50 mM HEPES-KOH (pH=7´6).
Todos los tampones llevaban los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml),
antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).

Materiales y Métodos
Figura 2-5: Aislamiento de cloroplastos intactos mediante centrifugación en
percoll. La flecha indica la banda que forman los cloroplastos intactos.
2.3.3 Aislamiento de estroma y tilacoides a partir de cloroplastos intactos de
suspensiones celulares y plantas de soja
Los cloroplastos intactos aislados a partir de suspensiones celulares y hojas de
soja, tal y como se ha descrito en el apartado 2.3.2, fueron utilizados para aislar
tilacoides y estroma. Los cloroplastos intactos fueron recogidos mediante centrifugación
y resuspendidos en 5 ml de tampón D con ayuda de un pincel, provocando la ruptura del
cloroplasto por choque osmótico. Los cloroplastos rotos fueron centrifugados a 13000 x
g durante 10 min, obteniendo como sedimento las membranas tilacoidales y como
sobrenadante el estroma. Las membranas fueron resuspendidas en medio B3 sacarosa
(300 μl) y las fracciones del estroma se concentraron hasta 100 μl en tubos Centripep-10
y Centricon-10 (Amicon), como se describe en el apartado 2.3.1. Tanto los tilacoides
como el estroma aislados se conservaron en presencia de los inhibidores de proteasas
Pefabloc (100 µg/ml), antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
Tampón D: 5 mM MgCl2, 50 mM HEPES-KOH (pH=7´6).
Tampón B3 sacarosa: 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM MES pH=6´0, 400 mM
Sacarosa.
Todos los tampones llevaban los inhibidores de proteasas Pefabloc (100 µg/ml),
antipaína (1 µg/ml) y leupeptina (1 µg/ml).
68

2.4 TÉCNICAS BIOQUÍMICAS
2.4.1 Extracción de clorofila
69
Materiales y Métodos
Se tomaron 200 μl de muestra (tilacoides) y se añadieron 800 μl de acetona pura.
A continuación, la muestra fue sonicada durante 2 min en un baño de ultrasonidos y se
centrifugó a 15500 x g durante 5 min. Se recogió el sobrenadante y se midió la
absorbancia a 645, 663 y 750 nm. Para el cálculo de la concentración (mg/l) de clorofila
total (ChlT), clorofila a (Chla) y clorofila b (Chlb), se utilizaron las siguientes
ecuaciones:
[Chl]T = 20´2 . A645 + 8´02 . A663
[Chl]a = 12´7 . A663 – 2´69 . A645
[Chl]b = 22´9 . A645 – 4´68 . A663
2.4.2 Electroforesis SDS-PAGE de proteínas
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se llevó a cabo según el
protocolo de Laemmli (1970), en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio
(SDS) y urea como agente desnaturalizante. El equipo de electroforesis utilizado fue el
Miniprotean III (BioRad). Gracias a la unión del detergente y al pH ligeramente básico
del tampón de electroforesis, se consigue que todas las proteínas migren hacia el ánodo
al someterlas a un campo eléctrico. El agente reductor, β-mercaptoetanol, presente en el
tampón de carga, rompe los puentes disulfuro de las proteínas favoreciendo su
desnaturalización.
Este tipo de electroforesis se llevó a cabo en un gel compuesto por dos fases: un
gel superior o concentrador y un gel inferior o separador. El primero lleva una
concentración de acrilamida menor y un pH de 6´8. El segundo es de una concentración
de acrilamida superior y un pH de 8´8. Esta diferencia de pH entre los dos geles genera
un gradiente de voltaje que provoca una aceleración de las proteínas y el consiguiente
apilamiento de éstas en el frente electroforético. Ello tiene un efecto concentrador, que
llega a su máximo justo antes de entrar en el gel inferior, obteniéndose así la máxima
resolución.
En este trabajo, se utilizaron dos tipos de geles separadores: geles del 12% (p/v)
y del 15% (p/v) de acrilamida. La conveniencia de estos dos tipos de geles dependió del

Materiales y Métodos
peso molecular de las proteínas a analizar. Los geles separadores se prepararon con la
siguiente composición:
Gel separador (5 ml) 12% (p/v) 15% (p/v)
Urea 1´2 g 1´2 g
Tris-HCl 1´5 M (pH=8´8) 1´25 ml 1´25 ml
SDS 10% (p/v) 50 μl 50 μl
Acrilamida/Bisacrilamida 40% (p/v) 1´5 ml 1´87 ml
H2O miliQ 1´75 ml 1´25 ml
APS 10% (p/v) 25 μl 25 μl
TEMED 2´5 μl 2´5 μl
Debido al carácter higroscópico de la urea, hay que tener la precaución de
disolver la misma sin añadir el H2O y una vez disuelta ajustar el volumen a 5 ml con
H2O. Una vez ajustado el volumen, añadimos el TEMED y el APS preparado en el
momento. El molde se rellenó con gel separador hasta un nivel de aproximadamente 1
cm por debajo del peine. A continuación, se añadió alcohol isopropílico hasta el borde
del molde lo que evita la deshidratación del gel y favorece la formación de un frente
uniforme. El gel se dejó polimerizar durante 45 min.
Una vez polimerizado el gel separador, se retiró el alcohol lavando con H2O
milliQ y se añadió el gel concentrador que se preparó con la siguiente composición:
Gel concentrador 4% (p/v)
Tris-HCl 0´5 M (pH=6´8) 625 μl
SDS 10% (p/v) 25 μl
Acrilamida/Bisacrilamida 40% (p/v) 244 μl
H2O miliQ 1´61 ml
APS 10% (p/v) 25 μl
TEMED 5 μl
Tras añadir el gel concentrador sobre el gel separador se colocó el peine y se
dejó polimerizar durante 30 min.
70

71
Materiales y Métodos
Una vez que los geles estuvieron completamente polimerizados, se retiraron los
peines, se lavaron los pocillos con H2O milliQ para eliminar posibles restos de
acrilamida/bisacrilamida y se colocaron en la cubeta de electroforesis vertical en
presencia del tampón de electroforesis. Antes de ser cargadas en los pocillos con una
micropipeta, las muestras fueron desnaturalizadas. La desnaturalización de las muestras
de origen bacteriano se realizó hirviendo durante 5 min con el tampón de
desnaturalización. Sin embargo, la desnaturalización de las muestras de origen vegetal
se realizó a temperatura ambiente y en oscuridad durante 1 h con el tampón de
desnaturalización. Este método de desnaturalización supone una alternativa válida a la
desnaturalización térmica en el caso de proteínas del cloroplasto, ya que la
desnaturalización térmica suele resultar en agregados proteicos de alto peso molecular,
dificultando la separación y, por lo tanto, la identificación de las proteínas de interés.
Además de las muestras, se cargó en el mismo gel un patrón con proteínas de pesos
moleculares conocidos entre 12 y 110 kDa, aproximadamente (Low-range prestained
SDS-PAGE standars, BioRad). La electroforesis se desarrolló a un voltaje constante de
100-200 V, hasta que el frente de colorante alcanzó el final del gel (alrededor de 2-3 h).
Finalizada la electroforesis, el gel se retiró del molde y se tiñó durante 1-24 h
con la disolución de teñido, tras lo cual se decoloró con la disolución de desteñido hasta
que el fondo quedó claro y las bandas proteicas fueron apreciables. Por último, el gel se
conservó en agua milliQ.
Tampón de electroforesis: 15 g/l Tris-HCl (pH=8´3), 72 g/l Glicina, 5 g/l SDS.
Tampón de desnaturalización × 4: 62 mM Tris-HCl (pH=6´8), 2´3% (p/v) SDS, 10%
Glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 0´02% Azul de bromofenol.
Disolución de teñido: 0´25 g Azul de Coomassie, 450 ml Metanol, 60 ml Ácido acético,
490 ml Agua desionizada.
Disolución de desteñido: 250 ml Metanol, 750 ml Ácido acético, 1500 ml Agua
desionizada.
2.4.3 Ensayo de actividad SOD
La actividad SOD ha sido detectada por tinción selectiva según el método
descrito por Beuchamp y Fridovich (1971), basado en la inhibición de la reducción
fotoquímica del azul de nitrotetrazolio (NBT) debido a los radicales superóxido (O2 - )

Materiales y Métodos
generados por la acción de la luz sobre una disolución de riboflavina y TEMED. La
electroforesis PAGE se llevó a cabo según el protocolo de Laemmli (1970), en ausencia
de agentes desnaturalizantes como el SDS y la urea. El equipo de electroforesis
utilizado fue el Miniprotean III (BioRad).
El gel nativo separador del 15% (p/v) de acrilamida se preparó con la siguiente
composición:
Gel separador (10 ml / 2 geles) 15% (p/v)
Tris-HCl 1´5 M (pH=8´8) 2´5 ml
Acrilamida/Bisacrilamida 40% (p/v) 3´75 ml
H2O miliQ 3´75 ml
APS 10% (p/v) 50 μl
TEMED 9 μl
Una vez ajustado el volumen, añadimos el TEMED y el APS preparado en el
momento. El molde se rellenó con gel separador hasta un nivel de aproximadamente 1
cm por debajo del peine. A continuación, se añadió alcohol isopropílico hasta el borde
del molde lo que evita la deshidratación del gel y favorece la formación de un frente
uniforme. El gel se dejó polimerizar durante 45 min.
Una vez polimerizado el gel separador, se retiró el alcohol lavando con H2O
milliQ y se añadió el gel nativo concentrador que se preparó con la siguiente
composición:
Gel concentrador (5 ml) 4% (p/v)
Tris-HCl 0´5 M (pH=6´8) 2´5 ml
Acrilamida/Bisacrilamida 40% (p/v) 1´3 ml
H2O miliQ 6´1 ml
APS 10% (p/v) 50 μl
TEMED 10 μl
Tras añadir el gel concentrador sobre el gel separador, se colocó el peine y se
dejó polimerizar durante 30 min.
Una vez que los geles estuvieron completamente polimerizados, se retiraron los
peines, se lavaron los pocillos con H2O milliQ para eliminar posibles restos de
acrilamida/bisacrilamida y se colocaron en la cubeta de electroforesis vertical en
presencia del tampón de electroforesis. Las muestras cargadas en este ensayo fueron
72

73
Materiales y Métodos
estromas de suspensiones celulares y plantas de soja (20-30 μg). Antes de ser cargadas
en los pocillos, se igualó la concentración de las muestras en base a proteína. La
electroforesis se desarrolló a un voltaje constante de 200 V durante 2´5 h a 4 ºC.
Tampón de electroforesis x 5: 25 mM Tris-HCl (pH=8´3), 192 mM Glicina.
Tampón de carga × 10: 0´25 mM Tris-HCl (pH=6´8), 50% (p/v) Glicerol, 0´02% (p/v)
Azul de bromofenol.
Finalizada la electroforesis, el gel se retira del molde y se empieza el revelado e
identificación de las isoenzimas de la SOD mediante el uso de inhibidores específicos
(Tabla 2-3). Para ello se necesitan tres geles idénticos, cargados con las mismas
muestras y a las mismas concentraciones. El primero será el gel control (Gel 1), el
segundo se incubará con KCN (Gel 2) y el tercero se incubará con H2O2 (Gel 3).
Isoenzima / Inhibidor H2O2 KCN
CuZnSOD Se inhibe Se inhibe
FeSOD Se inhibe No se inhibe
MnSOD No se inhibe No se inhibe
Tabla 2-3: Inhibición de la actividad SOD por H2O2 y KCN.
Los geles se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en:
Gel 1: Tampón A.
Gel 2: 3 mM KCN en tampón A.
Gel 3: 5 mM H2O2 en tampón A.
A continuación, los tres geles fueron incubados durante 30 min a temperatura
ambiente y en oscuridad con 0´48 mM NBT en tampón A. La siguiente incubación fue
durante 30 min a temperatura ambiente y en oscuridad con 30 μM riboflavina y 0´02%
(p/v) TEMED en tampón A. Después de estas incubaciones, se lavaron los geles durante
5 min a temperatura ambiente y en oscuridad con tampón A. Por último, los geles
fueron revelados exponiéndose a la luz durante 10 min.
Tampón A: 50 mM KPi (pH=7´8).

Materiales y Métodos
2.5 TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS
2.5.1 Western Blot
Una vez separadas las proteínas mediante electroforesis SDS-PAGE (apartado
2.4.2), éstas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Trans-blot transfer
medium, BioRad) para los métodos de revelado colorimétricos con la peroxidasa y la
fosfatasa alcalina o a una membrana de PVDF (Pall Corporation) para el método de
revelado quimioluminiscente. La membrana de nitrocelulosa se activó sumergiéndose
unos segundos en H2O milliQ antes de equilibrarse con el tampón de transferencia, la
membrana de PVDF se activó de la misma manera pero se utilizó metanol en lugar de
H2O milliQ para su activación. Estas proteínas se detectaron mediante anticuerpos
específicos (Tabla 2-4). Para ello, tras desarrollar la electroforesis, el gel sin teñir se
dispuso junto a la membrana en el equipo de transferencia (Mini Trans-blot, BioRad).
Tanto el gel como la membrana, previamente hidratada, se colocaron entre dos papeles
Whatman y dos esponjas, todo ello empapado en tampón TBS. Los papeles Whatman y
la membrana se recortaron con las dimensiones exactas del gel para que la transferencia
transcurriera eficientemente. La transferencia se llevó a cabo a un voltaje constante de
100 V durante 90 min en presencia del tampón de transferencia.
Una vez realizada la transferencia, la membrana se incubó con el anticuerpo
específico para la proteína que se deseaba detectar. Este anticuerpo, denominado
anticuerpo primario es reconocido a su vez por un anticuerpo secundario. El anticuerpo
secundario se encuentra conjugado con una molécula que permite la detección del
complejo formado por la proteína de interés. En nuestro caso se han utilizado dos tipos
de anticuerpos secundarios; conjugados con peroxidasa y conjugados con fosfatasa
alcalina biotinada (Tabla 2-4). El tipo de método de revelado realizado dependió del
tipo de anticuerpo secundario utilizado y de la sensibilidad requerida. Para el anticuerpo
secundario conjugado con peroxidasa se realizaron el método de revelado colorimétrico
y el quimioluminiscente, siendo este segundo más sensible. Para el anticuerpo
secundario conjugado con la fosfatasa alcalina biotinada se realizó el método de
revelado colorimétrico correspondiente. A continuación, se detallan los protocolos
seguidos para cada uno de estos revelados.
Tampón de transferencia: 14´4 g/l Glicina, 3´03 g/l Tris-HCl, 200 ml Metanol.
74

Método de revelado colorimétrico con la peroxidasa
75
Materiales y Métodos
Tras la transferencia, se lavó la membrana con tampón TBS y se dejó incubando
con agitación toda la noche a 4 ºC en tampón TBS conteniendo 5% de leche en polvo.
Esta incubación permite que las proteínas de la leche bloqueen el resto de la membrana
impidiendo que los anticuerpos se unan inespecíficamente a ella. Tras esta incubación,
realizamos dos lavados de 10 min con TBS 0´1% leche en polvo. Tras los lavados, se
añadió el anticuerpo primario en TBS con 0´1% de leche en la dilución apropiada.
Incubamos con el anticuerpo primario durante 1 h a temperatura ambiente y retiramos el
exceso lavando de nuevo dos veces con TBS 0´1% leche. Añadimos el anticuerpo
secundario conjugado con la peroxidasa (Goat Anti-mouse IgG horseradish peroxidase
conjugate, BioRad) diluido en TBS con 0´1% de leche en polvo. La membrana se
incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Retiramos el exceso de anticuerpo
secundario lavando dos veces durante 10 min con TBS con 0´1% de leche en polvo y
preparamos la mezcla de reacción de la peroxidasa (disolución A y disolución B). Las
dos disoluciones se mezclaron rápidamente y se añadieron a la membrana. Las proteínas
que reaccionaron con los anticuerpos se hicieron visibles al cabo de 5-10 min. Para
detener la reacción, se lavó la membrana con H2O milliQ. Tras secar la membrana, ésta
fue escaneada utilizando un escáner modelo EPSON Perfection 2400 PHOTO. El
análisis densitométrico se llevó a cabo utilizando el software Quantity One (BioRad).
Una vez analizada, la membrana se guardó envuelta en papel de aluminio entre dos
capas de papel de filtro para evitar la decoloración por la luz.
TBS: 25 mM Tris-HCl (pH=7´5), 0´9% NaCl.
Disolución A: 25 ml TBS, 50 μl H2O2.
Disolución B: 15 mg Naftol, 5 ml Metanol.
Método de revelado colorimétrico con la fosfatasa alcalina
Para el revelado con la alcalínfosfatasa se utilizó el kit “Amplified Alcaline
Phosphatase Goat Anti-rabbit Inmuno-blot Assay” de BioRad, siguiendo las
instrucciones proporcionadas por el fabricante. La gran especificidad de la unión entre
la biotina y la estreptavidina permite que se produzca una reducción del ruido de fondo
y un aumento de la sensibilidad de la detección, pudiendo detectarse con este método de
revelado hasta 10 pg de proteína en la membrana. Al igual que en el método anterior de
revelado, la membrana una vez transferida se lavó con TBS y se bloqueó durante toda la

Materiales y Métodos
noche a 4 ºC con TBS 5% leche. A continuación, se lavó la membrana con TTBS (180
ml TBS y 90 μl Tween 20) dos veces durante 10 min. Tras incubar con el anticuerpo
primario durante 90 min y realizar dos lavados de 10 min con TTBS, la membrana se
incubó con el anticuerpo secundario (Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG, BioRad)
durante 60 min a temperatura ambiente. Durante esta incubación se preparó el complejo
estreptavidina-fosfatasa alcalina. Tras la incubación con el anticuerpo secundario, la
membrana se lavó dos veces con TTBS y se incubó durante 90 min con el complejo
estreptavidina–fosfatasa alcalina que formamos previamente a temperatura ambiente.
Tras realizar cuatro lavados con TTBS revelamos la membrana con las disoluciones de
NBT (azul de nitrotetrazolio) y BCIP (5-bromo-4-cloro-indolilfosfato) en
dimetilformamida proporcionadas en el kit. Tras secar la membrana, ésta fue escaneada
utilizando un escáner modelo EPSON perfection 2400 PHOTO.
Método de revelado quimioluminiscente con la peroxidasa
El método de revelado quimioluminiscente con la peroxidasa es más sensible
que el método colorimétrico. Se utilizó el anticuerpo secundario conjugado con la
peroxidasa (Anti-chicken IgG whole molecule peroxidase conjugate, Sigma-Aldrich). El
procedimiento es similar al descrito con el método de la fosfatasa alcalina hasta el paso
de la incubación con el anticuerpo secundario. La detección de bandas se realizó
incubando con el reactivo Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce)
durante 5 min a temperatura ambiente, según las instrucciones del fabricante.
Posteriormente, la membrana se expuso en un cuarto oscuro a una película fotográfica
(CL-XPosure Blue X-Ray Film, Pierce). El revelado de las películas se realizó en un
baño de revelador T-Max Professional (Kodak, Rochester, EEUU) durante 4-5 min,
seguido de un baño de paro (agua destilada) y otro baño de fijador Polymax (Kodak)
durante 2-3 min. Todas las películas se digitalizaron usando un escáner modelo EPSON
Perfection 2400 PHOTO.
76

2.5.2 Desarrollo de anticuerpos contra GmCCS y GmCuZnSOD
77
Materiales y Métodos
El anticuerpo policlonal de conejo anti-GmCCS fue producido por Genosphere
Biotechnologies (París) contra un péptido sintético de 15 aminoácidos,
CVPEDFLISAAVSEF, diseñado a partir de la secuencia de la chaperona depositada en
el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el código AF329816. Mediante análisis “western
blot”, se comprobó la baja reactividad del anticuerpo contra nuestra proteína
recombinante purificada. Para mejorar la especificidad de este anticuerpo, se purificó
por cromatografía de afinidad utilizando como antígeno el péptido sintético
(Genosphere Biotechnologies, París). Para la elección de este péptido se tuvo en cuenta
que el anticuerpo no reconociera a la enzima CuZnSOD ni a otras chaperonas de Cu de
plantas. Para ello, se realizó un alineamiento de la secuencia de GmCCS con las
secuencias de estas otras proteínas. Además, se prestó atención a que el péptido
diseñado no formara parte de los dominios conservados de unión a metal, ni del péptido
señal de tránsito al cloroplasto que contiene la proteína GmCCS no madura.
El anticuerpo policlonal de conejo anti-GmCuZnSOD fue producido por Sigma-
Genosys (Reino Unido) contra un péptido sintético de 13 aminoácidos,
EDDLGKGGHELSL, diseñado a partir de la secuencia depositada en el Instituto de
Investigación Genómica (TIGR; http://www.tigr.org/) con el código TC224966. Para la
elección de este péptido, se realizó un alineamiento de la secuencia de GmCuZnSOD
con las secuencias de GmCCS, GmFeSOD y GmMnSOD con el objetivo de que el
anticuerpo producido no reconociese a ninguna de estas proteínas. Además, se tuvo en
cuenta que el péptido diseñado no formara parte de los dominios conservados de unión
a metal, ni del péptido señal de la enzima GmCuZnSOD. Este anticuerpo reconoce tanto
a la isoenzima CuZnSOD cloroplástica (CSD2) como a la citosólica (CSD1) de plantas.

Materiales y Métodos
Proteína (soja)
MBP-His6-CCS
MBP-His6
CCS
CuZnSOD
CuZnSOD
PsbA / D1
RbcL
Anticuerpo 1º
Dilución
Anti-His
(GE Healthcare)
1:3000
Anti-GmCCS
Ver apartado 2.5.2.
1:100
Anti-GmCuZnSOD
Ver apartado 2.5.2.
1:1000
*Anti-CuZnSOD
1:250
Anti-PsbA
(Agrisera)
1:4000
Anti-RbcL
(Agrisera)
1:20000
78
Anticuerpo 2º
Dilución
Anti-ratón
1:1000
Anti-conejo
1:3000
Anti-conejo
1:3000
Anti-conejo
1:3000
Anti-pollo
1:20000
Anti-pollo
1:20000
Revelado
Peroxidasa
Colorimétrico
Fosfatasa alcalina
Colorimétrico
Fosfatasa alcalina
Colorimétrico
Fosfatasa alcalina
Colorimétrico
Peroxidasa
Quimioluminiscente
Peroxidasa
Quimioluminiscente
Tabla 2-4: Anticuerpos, diluciones y tipo de revelado utilizados para los análisis
western. El anticuerpo primario *Anti-CuZnSOD fue producido contra la proteína
entera de cebada y fue gentilmente donado por el profesor B. Sabater de la Universidad
de Alcalá de Henares.
2.6 OBTENCIÓN DE LA PROTEÍNA GmCCS RECOMBINANTE
2.6.1 Clonación
La secuencia del gen de la chaperona GmCCS se encuentra depositada en la base
de datos del NCBI con el código AF329816. Su longitud es de 983 pb y codifica para
una proteína de 328 aminoácidos con un peso molecular de 32687 Da y un punto
isoeléctrico de 5´55.
La obtención del gen a clonar se realizó a partir de suspensiones celulares de
soja crecidas en medio KN 1 suplementado con 10 µM Cu, condición donde se obtiene
una mayor expresión de este gen. Para ello, se ha extraído RNA (apartado 2.2.1),
sintetizado cDNA y amplificado el ORF (marco de lectura abierto, “open reading
frame”) completo con el péptido señal del gen mediante RT-PCR (apartado 2.2.3)
usando los cebadores específicos FW-CCS y RW-CCS (Tabla 2-1), los cuales
introdujeron los sitios de restricción de las enzimas BamHI y XbaI en cada uno de los
extremos del gen GmCCS. Se confirmó la identidad del producto de PCR por
secuenciación (Servicio de secuenciación del CNIO, Madrid) como la secuencia del gen

79
Materiales y Métodos
que codifica para la chaperona GmCCS con una mutación puntual conservativa en la
posición I175V de la secuencia proteica, introducida accidentalmente por la Taq
polimerasa en la PCR.
Una vez obtenido el gen, se procedió a realizar su clonación. Para ello, se eligió
una estrategia que requiere dos vectores diferentes: pGEM-T Easy (Promega) y
pMALc2x modificado (Pryor y Leiting, 1997). El plásmido utilizado como vector de
expresión es un derivado del plásmido pMALc2x (New England BioLabs) modificado
con la adición de una cola-His6 y la secuencia de bases que reconoce la proteasa
trombina (Fig. 2-6). Se eligió este plásmido porque la MBP (“maltose binding protein”)
confiere una mayor solubilidad a la CCS y, junto a la cola-His6, facilitaría la posterior
purificación de esta proteína. De esta forma, se realizó primero una subclonación del
gen CCS en el vector pGEM-T Easy. A continuación, se aisló el plásmido pGEM-T
Easy de las bacterias E. coli JM109 (apartado 2.2.5.5) y fue digerido con las enzimas
BamHI y XbaI para extraer el gen de interés. Con estas mismas enzimas, se digirió el
vector pMALc2x modif. y se ligó posteriormente al gen CCS (apartado 2.2.5.2). Se
transformaron las bacterias E. coli competentes de la cepa DH5α (apartados 2.2.5.3 y
2.2.5.4) con la mezcla de ligación y los transformantes se seleccionaron en placas de
LB-agar conteniendo 50 µg/ml de Ampicilina. La presencia del inserto se comprobó
mediante digestión con BamH1 y XbaI y se confirmó posteriormente por secuenciación
(Servicio de secuenciación del CNIO, Madrid). El clon positivo elegido se guardó a 4
ºC para su uso continuado o con un 20% de glicerol estéril a -80 ºC para su
conservación a largo plazo.

Materiales y Métodos
A
B
Factor X a
I E G R G H H H H H H L V P R G S
MalE...ATC GAG GGA AGG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC CTG GTG CCA CGC GGT AGT
A M G E F G S S R V D L Q A S L
GCC ATG GGA GAA TTC GGA TCC TCT AGA GTC GAC CTG CAG GCA AGC TTG…LacZ
NcoI EcoRI BamHI XbaI SalI PstI HindIII
Figura 2-6: Estrategia seguida para la clonación de GmCCS. (A) Sitios de
reconocimiento de las enzimas de restricción y la proteasa trombina en el plásmido
pMALc2Xmodif. (B) La construcción de pMALc2Xmodif-CCS. El plásmido
pMALc2Xmodif. fue digerido con BamHI y XbaI. El fragmento de DNA obtenido en la
PCR fue digerido y ligado con este plásmido, obteniendo, así, el vector recombinante
pMALc2Xmodif.-CCS.
80
Trombina

2.6.2 Inducción de la expresión en E. coli
81
Materiales y Métodos
Se probaron diferentes condiciones de inducción de la expresión con el objetivo
de obtener la mayor cantidad posible de proteína de fusión MBP-His6-GmCCS. Los
parámetros modificados fueron: la temperatura de inducción, el tiempo de inducción, la
concentración del inductor de la expresión Isopropil-β-tio-D-galactopiranósido (IPTG)
y las concentraciones de CuSO4 y ZnSO4. Se creció durante toda la noche una colonia
de E. coli DH5α con el plásmido pMALc2x-GmCCS en su interior a 37 ºC y con
agitación, en 4 ml de medio LB esterilizado previamente en el autoclave y
suplementado con 100 µg/ml de Ampicilina esterilizada previamente por filtración con
filtros de 0´2 μm (Pall Corporation). A la mañana siguiente, se inocularon 5 ml de este
cultivo previo a 500 ml de medio LB fresco (dilución 1:100) y se crecieron en
esterilidad a 37 ºC con una agitación de 225 r.p.m. hasta que la D.O.600nm alcanzó 0´6
unidades, que coincide con la fase exponencial de crecimiento de las células. En este
momento, se añadió el inductor de la expresión 0´3 mM IPTG (Sigma), 0´5 mM CuSO4
y 0´5 mM ZnSO4, los cuales fueron esterilizados previamente por filtración. Los
metales Cu y Zn provocan un aumento notable de la expresión de la proteína de fusión.
Se continuó incubando el cultivo a 37 ºC durante 3 h adicionales hasta que alcanzó una
D.O.600nm de 1´2 unidades, momento en el que las células se encuentran en la fase
estacionaria de crecimiento. Las células se recogieron por centrifugación durante 5 min
a 10000 x g en frío y se guardaron a – 20 ºC.
2.6.3 Purificación
Las bacterias E. coli DH5α con el plásmido pMALc2x-GmCCS en su interior,
fueron descongeladas y resuspendidas en 8 volúmenes (respecto al cultivo) de tampón
A en presencia de los inhibidores de proteasas 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo
(PMSF) (Sigma) y 1 mM Pefabloc (Fluka). A continuación, se lisaron por
ultrasonicación (sonicador Ultrasonic Processor XL 2020 Misonix) en 6 ciclos de 1 min
a una potencia del 12% con intervalos de enfriamiento de 1 min en hielo para evitar la
desnaturalización proteica. Para separar el extracto crudo que contiene la proteína de
fusión de las membranas celulares y células sin romper, se centrifugó durante 30 min a
14500 x g a 4 ºC. Se analizaron tanto el sobrenadante como el sedimento mediante
SDS-PAGE (apartado 2.4.2), para averiguar en qué fracción se encontraba la proteína
de fusión. Al tratarse de una proteína soluble, se esperaba que se encontrara

Materiales y Métodos
mayoritariamente en el sobrenadante, sin embargo, detectamos la proteína de fusión en
ambas partes, en forma soluble y en forma de cuerpos de inclusión. Se decidió trabajar
con el sobrenadante debido a que la manipulación de la proteína soluble era más sencilla
técnicamente.
El sobrenadante (extracto crudo) se filtró con filtros de 0´45 μm de acetato de
celulosa (Cole-Parmer) y se cargó en una columna 1 x 5 ml Hitrap Ni 2+ -IMAC (GE
Healthcare) previamente equilibrada con 7 veces su volumen de tampón A, a un flujo de
1 ml/min a 4 ºC. De esta forma, la proteína de fusión se retuvo en la columna a través de
la afinidad de su cola de His por el Ni 2+ , eliminando, así, la mayor parte del resto de las
proteínas presentes en el extracto celular. A continuación, la columna se lavó con 5
veces su volumen de tampón A y, seguidamente, con otras 5 veces su volumen de
tampón B, para eluir las proteínas contaminantes que no se fijaron a la resina. La
proteína de fusión se eluyó usando un gradiente lineal de 50-450 mM de imidazol en el
mismo tampón. Todas las disoluciones utilizadas con la columna Hitrap Ni 2+ -IMAC
fueron filtradas previamente. Se recogieron fracciones de 0´75 ml a un flujo de 0´5
ml/min con ayuda de un colector automático y se analizaron mediante SDS-PAGE para
identificar todas aquellas fracciones ricas en la proteína de fusión MBP-His6-GmCCS.
Las fracciones ricas en esta proteína se juntaron y dializaron frente al tampón C
donde la proteasa trombina funciona óptimamente. Todas las diálisis se realizaron
mediante dos cambios consecutivos en un volumen de 2 L cada uno a 4 ºC con
membranas de diálisis (MWCO: 10000, Spectrum). La proteína de fusión se digirió con
10 µg/ml de la proteasa trombina (GE Healthcare) a 22 ºC durante 22 h obteniendo
como producto una mezcla de las proteínas GmCCS y MBP-His6.
La muestra digerida se volvió a cargar en otra columna Hitrap Ni 2+ -IMAC. Para
ello, se añadió a la digestión la cantidad de NaCl necesaria para igualar la concentración
de esta sal a la del tampón A y, por otro lado, se equilibró la columna con 7 veces su
volumen de este tampón a un flujo de 1 ml/min a 4 ºC. A continuación, la columna se
lavó con 10 veces su volumen de tampón A para eluir las proteínas no fijadas a la
resina. La proteína GmCCS quedó retenida a la columna debido al contenido de sus
histidinas intrínsecas y se eluyó usando un gradiente lineal de 0-450 mM de imidazol en
el mismo tampón. Se recogieron fracciones de 0´75 ml a un flujo de 0´5 ml/min y se
analizaron mediante SDS-PAGE. En estas condiciones, GmCCS eluyó unas fracciones
antes que la MBP-His6, lográndose, así, separar ambas proteínas de una manera eficaz.
82

83
Materiales y Métodos
Finalmente, para conseguir una pureza aún superior de la proteína recombinante,
las fracciones seleccionadas fueron dializadas frente al tampón D y se cargaron en una
columna de intercambio aniónico débil Toyopearl TSK DEAE-650s (Tosoh)
previamente equilibrada con 5 veces su volumen de tampón D con un flujo de 2 ml/min
a 4 ºC. El volumen de resina utilizado en la columna dependió del volumen de muestra
a cargar. A continuación, la columna se lavó con 5 veces su volumen de tampón D. La
elución de la proteína se realizó mediante un gradiente lineal de pH desde 7´5 a 4´5 en
el mismo tampón a un flujo de 1 ml/min a 4 ºC. El análisis de la pureza de la suspensión
de la proteína obtenida se realizó mediante SDS-PAGE.
La concentración de proteína del extracto crudo y de la solución proteica
parcialmente purificada se midió según el método descrito por Bradford (1976). La
concentración de proteína pura se calculó utilizando el coeficiente de extinción molar
ε280nm(M -1 cm -1 ) = 15470.
Tampón A: 20 mM NaPi (pH=7´4), 500 mM NaCl.
Tampón B: 20 mM NaPi (pH=7.4), 500 mM NaCl, 50 mM imidazol.
Tampón C: 20 mM NaPi (pH=7), 140 mM NaCl.
Tampón D: 20 mM Bis-Tris Propano (pH=7´5), 20 mM NaCl.
Columna Hitrap Ni2+ -IMAC
Gradiente 50-450 mM imidazol
Digestión trombina
22 h 22 ºC
Columna Hitrap Ni2+ -IMAC
Gradiente 0-450 mM imidazol
Columna Toyopearl TSK DEAE-650S
Gradiente pH 7.5-4.5
Figura 2-7: Esquema de las etapas llevadas a cabo para purificar la proteína GmCCS
recombinante.

Materiales y Métodos
2.7 SERVICIOS
2.7.1 Análisis MALDI-TOF
El análisis MALDI-TOF (“matrix-assisted laser desorption-time of flight”) fue
utilizado para identificar la proteína recombinante purificada. La metodología de este
análisis se basa en una digestión tríptica seguida de un análisis de los péptidos
resultantes por espectrometría de masas. La identificación se llevó a cabo a través de la
huella peptídica de la proteína sumada a la información de la secuencia de alguno de los
péptidos. Para ello, mediante SDS-PAGE (apartado 2.4.2) en un gel del 15% (p/v), se
tiñó con Coomassie Brilliant Blue R-205 (Sigma) y se cortó manualmente la banda
correspondiente de la proteína que interesaba analizar con la ayuda de un bisturí.
Debido a la sensibilidad de este tipo de análisis, es importante evitar contaminaciones,
por tanto, se debe trabajar con guantes y limpiar todo el instrumental con metanol. La
banda del gel cortada se guardó en un tubo eppendorf de 1,5 ml con una gota de H2O
milliQ para evitar que se secara, y se envió para ser analizada en un equipo MALDI-
TOF/TOF 4700 Proteomics Analyzer, Applied Biosystems (Servicio de la Plataforma
de Proteómica, Parque Científico de Barcelona).
2.7.2 Determinación de la secuencia N-terminal
El extremo amino terminal de la proteína se secuenció mediante un método
basado en la degradación secuencial de Edman. La muestra de proteína se analizó
usando un gel SDS-PAGE del 15% (p/v) (apartado 2.4.2), el cual fue transferido a una
membrana de PVDF (Pall Corporation). La membrana se tiñó con Coomassie Brilliant
Blue R-205 (Sigma). La proteína transferida en la membrana se cortó con la ayuda de
un bisturí y se guardó a 4 ºC. El análisis se llevó a cabo en un secuenciador Perkin
Elmer, Procise 494 (Servicio del Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid) y en un
secuenciador Applied Biosystems Procise 492 (Servicio de Proteómica y
Bioinformática de la Universidad Autónoma de Barcelona).
84

2.7.3 ICP-MS
85
Materiales y Métodos
La técnica de espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo
(ICP-MS, “inductively coupled plasma mass spectrometry”), es una variante de las
técnicas de análisis por espectrometría de masas. Las ventajas principales de esta
técnica radican en la alta precisión, bajos límites de detección y bajo coste económico,
analizando la mayoría de los elementos e isótopos presentes en la tabla periódica de
manera simultánea en pocos min.
Se analizó el contenido de los metales Cu y Zn en la muestra de la proteína
recombinante GmCCS purificada. Para ello, la solución proteica fue dializada con H2O
milliQ para eliminar los iones de Cu y Zn unidos inespecíficamente y a continuación se
envió para ser analizada al Servicio Científico-Técnico de la Universidad de Barcelona.
También se analizó el contenido de Cu de los siguientes tejidos de la planta: hoja
joven (primer trifolio), hoja madura (tercer trifolio), tallo y raíz. Para ello, las muestras
de estos tejidos vegetales fueron lavadas primero con 2 mM EDTA y seguidamente con
agua desionizada. A continuación, fueron secadas en una estufa durante 6 días a 60 ºC y
una vez secas, fueron molidas con la ayuda de un molinillo de bolas hasta conseguir una
textura de polvo fino. Las muestras molidas se enviaron para ser analizadas al Servicio
de Ionómica del CEBAS-CSIC de Murcia.
2.8 TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS
La espectroscopia molecular puede ser definida como el estudio de la interacción
de ondas electromagnéticas con la materia. Como consecuencia de esta interacción, la
materia puede absorber, emitir o dispersar radiación, modificando parámetros como el
índice de refracción, los estados excitados, los estados redox, etc.
Una de las principales aplicaciones que hemos realizado para las técnicas
espectroscópicas fue la caracterización de la proteína recombinante pura GmCCS. Para
ello, la solución proteica fue dializada y al mismo tiempo concentrada en el tampón de
trabajo correspondiente mediante tres diluciones 1:10 a 4 ºC con tubos Centripep-10 y
Centricon-10 (Amicon). Para obtener Cu + se probó la utilización de Cu 2+ añadido como
CuCl2 junto al reductor ascorbato, sin embargo, el ascorbato interfirió en las medidas de
fluorescencia y dicroísmo circular. Por tanto, se utilizó directamente Cu + comercial
añadido como CuCl (Sigma-Aldrich) diluido en NH4Cl.

Materiales y Métodos
2.8.1 Absorción UV-Vis
La calidad de las membranas tilacoidales aisladas a partir de suspensiones
celulares y plantas de soja (apartado 2.3) se comprobó realizando espectros en la región
del Vis, 350-750 nm, en donde la clorofila presenta varias bandas de absorción. Para
ello, se diluyó 1 μl de muestra de tilacoides en 1 ml de tampón B3 sacarosa (apartado
2.3) y se registró el espectro correspondiente en un espectrofotómetro de fotodiodos
DU640 (Beckman Instruments, Fullerton, CA).
La concentración de la proteína GmCCS recombinante pura se calculó utilizando
el coeficiente de extinción molar ε280nm(M -1 cm -1 ) = 15470. Los aminoácidos aromáticos
de la proteína absorben luz a esta longitud de onda. Esta proteína purificada fue
caracterizada espectroscópicamente. Una de las técnicas utilizadas fue la absorción UV-
Vis, para ello se realizaron titulaciones con concentraciones crecientes de los metales
Cu + , Zn 2+ y Co 2+ . La titulación en el UV de GmCCS (3 μM) con Cu + añadido como
CuCl diluido en NH4Cl, se llevó a cabo en tampón A y el cambio de absorbancia a 240
nm fue registrado. La titulación en el UV-Vis de GmCCS (5 μM) con Zn 2+ (ZnCl2) se
realizó en presencia de 10 μM del indicador mag-fura-2 (Molecular Probes, Eugene,
OR) en tampón B y el cambio de absorbancia a 322 nm fue registrado. Se realizaron
espectros de absorción en el Vis añadiendo Co 2+ (CoCl2) a una suspensión de GmCCS
en tampón B y se registró el cambio de absorbancia a 730 nm. Antes de las titulaciones,
todas las disoluciones fueron incubadas varios minutos bajo una atmósfera de nitrógeno.
Con los metales Zn 2+ y Cu + se utilizó como blanco la proteína junto con el tampón.
Debido a que el Cu + fue el único metal que absorbió a la longitud de onda elegida, se
registraron espectros sólo con Cu + a cada una de las concentraciones analizadas para ser
sustraídos del resto de espectros experimentales. Con el Co 2+ se utilizó como blanco el
tampón. Los espectros se registraron a 25 ºC en un espectrofotómetro de fotodiodos
DU640 (Beckman Instruments, Fullerton, CA). La Kd del complejo metal-proteína se
calculó a partir de las representaciones de dobles recíprocos.
Tampón A: 20 mM NaPi (pH=7.0), 150 mM NaCl.
Tampón B: 20 mM Hepes (pH=7.0), 150 mM NaCl, 10 mM ácido ascórbico.
86

2.8.2 Fluorescencia
87
Materiales y Métodos
Los fluoróforos de la cadena peptídica de las proteínas son el triptófano y, en
menor medida, la tirosina y la fenilalanina. Al irradiar la proteína a la longitud de onda
adecuada estos residuos absorben energía (se excitan), relajándose a continuación por
diversos mecanismos, en particular por emisión de luz de menor frecuencia
(fluorescencia). Esta diferencia entre la frecuencia de absorción y de emisión se
denomina “Stokes shift”. Algunos cofactores de las cromoproteínas también pueden
absorber luz y emitirla en forma de fluorescencia.
La afinidad de la unión de Cu + a la proteína recombinante pura GmCCS (2 μM)
se analizó también mediante fluorescencia. La titulación se llevó a cabo en tampón A
(apartado 2.8.1). Antes de la titulación, las disoluciones de trabajo se incubaron varios
min bajo una atmósfera de argón. Se midió la fluorescencia intrínseca del triptófano
excitando a 290 nm y registrando el espectro de 300 a 400 nm. Como blanco se utilizó
el tampón. Los espectros de fluorescencia se obtuvieron a 25 ºC en un
espectrofluorímetro Aminco-Bowman Series 2. Este trabajo se ha realizado en
colaboración con la profesora Milagros Medina del Departamento de Bioquímica y
Biología Molecular y Celular de la Universidad de Zaragoza.
2.8.3 Dicroísmo circular
La técnica de dicroísmo circular (DC) mide la diferencia entre la absorbancia de
luz polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha. Cualquier región del espectro
donde la proteína o sus cofactores absorban luz puede presentar, en principio, señal de
DC. En el UV-lejano se puede observar la organización espacial de los enlaces
peptídicos (los distintos elementos de estructura secundaria presentan espectros
diferentes en la zona de 200 a 250 nm). En el UV-cercano se mide la asimetría de los
residuos aromáticos inducida por el entorno. Por último, en el Vis se pueden observar
los cambios en el entorno de los cofactores que absorban en esta zona del espectro.
Se midió el DC en el UV-lejano entre 190 y 250 nm, utilizando una cubeta de
0´1 cm a 25 ºC en un espectropolarímetro Chirascan (Applied Photophysics Ltd). Este
trabajo se ha realizado en colaboración con la profesora Milagros Medina del
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular de la Universidad de
Zaragoza. Para ello, se dializó la proteína recombinante pura GmCCS (14 μM) en
tampón C. Las disoluciones utilizadas se incubaron durante varios min bajo una

Materiales y Métodos
atmósfera de nitrógeno. Los espectros obtenidos con todos los componentes de la
solución de medida excepto la proteína (tampón y metal) fueron sustraídos del resto de
espectros experimentales. Los datos fueron analizados a través del Servidor Dichroweb
(http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html) utilizando el algoritmo K2d
(Whitmore y Wallace, 2004; 2008).
Tampón C: 5 mM NaPi (pH=7.5).
2.9 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO
2.9.1 Análisis de secuencias
El alineamiento de las secuencias, tanto de nucleótidos como de aminoácidos, se
realizó utilizando el programa ClustalW (Thompson y col., 1994). El análisis de
homología de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos se llevó a cabo utilizando el
Servidor BLAST. La identificación de los posibles intrones de las secuencias se llevó a
cabo con el Servidor Web GenScan (Burge y Karlin, 1997).
2.9.2 Modelado molecular
La secuencia de aminoácidos de la chaperona GmCCS se comparó mediante el
programa ClustalW con la secuencia CCS de otro organismo, cuya estructura está
resuelta y depositada. La secuencia de la proteína CCS de levadura (1jk9_B.pdb; Lamb
y col., 2001) con los aminoácidos 20-237, fue el molde utilizado para desarrollar el
modelado por homología de la GmCCS. El modelado de la estructura de la proteína
GmCCS se llevó a cabo a través del programa Geno3D (http://geno3d-pbil.ibcp.fr;
Combet y col., 2002). La estructura de la proteína se visualizó con el programa Swiss-
PdbViewer (http://www.expasy.org/spdbv/).
88

RESULTADOS

3 RESULTADOS
3.1 REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GmCCS
91
Resultados
La proteína CCS (“copper chaperone for superoxide dismutase”) es una
chaperona que suministra Cu + a la enzima CuZnSOD aunque no se descartan otras
funciones. El material vegetal utilizado para estudiar la regulación de los genes GmCCS
y GmCSD2 a nivel de mRNA fueron suspensiones celulares de soja crecidas en
condiciones control (0´1 μM Cu) y suplementadas con 10 µM CuSO4 · 5 H2O durante
una dilución o generación (apartado 2.1.3) y plantas de soja crecidas en condiciones
control (0´1 μM Cu) y suplementadas con 10 µM CuSO4 · 5 H2O foliar o radicular en
cultivo hidropónico (apartado 2.1.4). Fisiológicamente, estas suspensiones celulares y
plantas de soja no presentaron síntomas visibles de toxicidad por efecto del exceso de
Cu suministrado. En la Fig. 3-1 se muestran las suspensiones celulares y plantas de soja
tipo utilizadas, las cuales presentan un fenotipo normal tanto en condiciones control
como expuestas a un exceso de Cu. En la figura se muestran también los tejidos
analizados de plantas de soja.
3.1.1 Regulación por “splicing” alternativo
En la RT-PCR que se muestra en la Fig. 3-2 se utilizaron los cebadores FW-SAC
y RW-KPN (Tabla 2-1), los cuales amplifican al gen GmCCS sin el péptido de tránsito
al cloroplasto, denominado GmCCS´ en la tabla. En suspensiones celulares de soja, se
obtuvieron tres bandas de diferente tamaño en condiciones control (0´1 μM Cu) y una
banda en condiciones de exceso de Cu (10 μM Cu) con el tamaño esperado y que se
induce fuertemente en respuesta al exceso de este metal (Fig. 3-2A). En planta entera de
soja, con estos mismos cebadores, se obtuvieron varias bandas de diferente tamaño en
condiciones control (C) y tratamiento de Cu foliar (CuF), mientras que con el
tratamiento de Cu radicular (CuR) se obtuvo una sola banda con el tamaño esperado y
que se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu (Fig. 3-2C). Este patrón de
expresión, se repitió en todos los tejidos analizados de la planta: hoja joven (primer
trifolio), hoja madura (tercer trifolio), tallo y raíz. Estos productos de PCR se clonaron y
secuenciaron. Con las secuencias obtenidas se realizaron alineamientos con la secuencia
depositada del gen que codifica para la chaperona. En base a estos alineamientos y a los
programas Blast y GenScan llegamos al siguiente resultado. En el caso de las

Resultados
suspensiones celulares, identificamos las tres bandas como CCS de soja. La banda
inferior se corresponde con una secuencia de 762 pb, similar a la depositada (GmCCS).
La banda intermedia corresponde a dos grupos de secuencias de 873 (NSP-GmCCS1) y
895 pb (NSP-GmCCS2) con un intrón de 111 y 133 pb, respectivamente. La banda
superior se corresponde con una secuencia de 1836 pb (NSP-GmCCS3) que contiene un
intrón de 1074 pb (Fig. 3-3). La banda de unos 1650 pb observada principalmente en
planta, no se clonó ni fue secuenciada. En la Tabla 3-1 se muestran las secuencias de los
posibles péptidos resultantes de la traducción de cada uno de los transcritos. En todos
los transcritos que contienen un intrón, se obtienen péptidos truncados, ya que la
presencia del intrón genera un codón de terminación que provoca la parada prematura
de la traducción. En el caso de planta entera, se detectaron los transcritos GmCCS, NSP-
GmCCS2 y NSP-GmCCS3, similares a los transcritos identificados en las suspensiones
celulares, en todos los tejidos analizados de la planta: hoja joven, hoja madura, tallo,
raíz y flor. A través de los cebadores diseñados en las secuencias intrónicas (Tabla 2-1)
de NSP-GmCCS1 (2-19 FW), NSP-GmCCS2 (2-5 FW) y NSP-GmCCS3 (2-4 RW), se
confirmaron los resultados obtenidos tanto en suspensiones celulares como en planta
entera (Fig. 3-2). El transcrito más abundante en todos los casos fue GmCCS seguido
del NSP-GmCCS3 tanto en suspensiones celulares como en planta entera. En la Fig. 3-
2C se observa que el perfil de expresión de la hoja joven es bastante parecido al perfil
de la hoja madura, salvo que en condiciones control el transcrito NSP-GmCCS3 es
ligeramente más abundante en hoja madura y en condiciones CuF es más abundante en
hoja joven. En condiciones CuR el perfil es idéntico para ambos tejidos. En la Fig. 3-4
se muestra la secuencia de nucleótidos correspondiente a cada uno de los exones e
intrones obtenidos para el gen que codifica para la chaperona. Este patrón de expresión
sugiere que el gen GmCCS está regulado por “splicing” alternativo de tipo retención de
intrón.
En la Fig. 3-5A se muestra otra RT-PCR donde se utilizaron los cebadores FW-
CCS y RW-CCS (Tabla 2-1). Estos cebadores amplifican el gen GmCCS de la misma
forma que los cebadores anteriores (FW-SAC y RW-KPN) pero incluyendo el péptido
de tránsito al cloroplasto. En este caso, el perfil de expresión se repite respecto al
obtenido en la Fig. 3-2 con los cebadores anteriores, tanto en suspensiones celulares
como en planta entera. Comparando el perfil de expresión es importante resaltar que: en
las suspensiones celulares C hay una menor abundancia del transcrito GmCCS que en
hoja joven C, el transcrito NSP-GmCCS3 es ligeramente más abundante en hoja
92

93
Resultados
respecto a las suspensiones celulares y el transcrito NSP-GmCCS2 es más abundante en
suspensiones celulares que en hoja.
Por otro lado, para comprobar que esta regulación por “splicing” alternativo no
era fruto de una contaminación de DNA genómico en la muestra de RNA, se repitieron
las PCRs utilizando como molde el RNA extraído a partir de suspensiones celulares y
de planta entera (Fig. 3-5B). Los cebadores utilizados fueron FW-SAC y 2-4RW, los
cuales amplifican al gen NSP-GmCCS3. El resultado de esta amplificación fue que no se
obtuvo ninguna banda, lo que confirmó la ausencia de contaminación por DNA
genómico en las muestras de RNA, tal y como se esperaba, puesto que todas las
muestras de RNA fueron purificadas tras su extracción.
A
B
0´1 μM Cu (C) 10 μM Cu foliar (CuF) 10 μM Cu radicular (CuR)
Hoja joven
(1 er trifolio)
0´1 μM Cu 10 μM Cu
Hoja madura
(3 er trifolio)
Raíz Tallo Flor
Figura 3-1: Material biológico vegetal utilizado para estudiar la regulación de los genes
GmCCS y GmCSD2. (A) Suspensiones celulares de soja crecidas en condiciones control
(0´1 μM Cu) y en exceso de Cu (10 μM Cu). (B) Plantas de soja crecidas en condiciones
control (0´1 μM Cu) (C), suplementadas con 10 μM Cu foliar (CuF) y radicular (CuR).
Los tejidos analizados se presentan en la parte inferior.

Resultados
A
pb
2000
1650
1000
850
C
650
M B 1 2
pb
2000
1650
1000
850
650
NSP-GmCCS3
NSP-GmCCS2
NSP-GmCCS1
GmCCS
NSP-GmCCS1
NSP-GmCCS2
NSP-GmCCS3
Actina
Figura 3-2: Análisis mediante RT-PCR de la expresión del gen GmCCS en
suspensiones celulares y plantas de soja. (A) B: blanco; 1: suspensiones celulares
crecidas en condiciones control; 2: suspensiones celulares crecidas en condiciones de
exceso de Cu (10 μM). (B) 1: suspensiones celulares crecidas en condiciones control; 2:
suspensiones celulares crecidas en condiciones de exceso de Cu (10 μM); 3:
suspensiones celulares crecidas en condiciones de exceso de Zn (10 μM); 4:
suspensiones celulares crecidas en condiciones de exceso de Cu y Zn (ambos 10 μM).
(C) 1: hoja joven C; 2: hoja joven CuF; 3: hoja joven CuR; 4: hoja madura C; 5: hoja
madura CuF; 6: hoja madura CuR; 7: raíz C; 8: raíz CuF; 9: raíz CuR; 10: tallo C; 11:
tallo CuF; 12: tallo CuR; 13: flor C. M: Marcador 1.0 kb plus DNA.
94
B
pb
2000
1650
1000
850
650
M 1 2 3 4
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 M
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
3 6 9 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Actina
NSP-GmCCS3
NSP-GmCCS2
NSP-GmCCS1
GmCCS
Actina
NSP-GmCCS3
NSP-GmCCS2
GmCCS
NSP-GmCCS1
NSP-GmCCS2
NSP-GmCCS3

E1
I 1
E2
FW-SAC 2-19 FW
GmCCS
I 2
2-5 FW
TRANSCRITOS (mRNAs)
E1 E2 E 3 E 4
NSP-GmCCS1
E1 I 1 E2 E 3 E 4
NSP-GmCCS2
E1 E2 I 2 E 3 E 4
NSP-GmCCS3
762 pb
873 pb
895 pb
Traducción
I 3
Pre mRNA
E 3 I 3
E 4
2-4 RW
95
POSIBLES PÉPTIDOS
E1 E2 E 3 E 4
27 kDa
2´1 kDa
5´4 kDa
Resultados
1836 pb
19´9 kDa
2080 pb
RW -KPN
Figura 3-3: Esquema de los mRNAs de GmCCS identificados en soja. Las cajas azules
representan los exones, las cajas naranja, rosa y amarilla representan los intrones. Las
líneas verdes representan los posibles péptidos resultantes de la traducción de cada uno
de los mensajeros. Los cebadores utilizados en la RT-PCR se indican con flechas negras
que muestran su polaridad. NSP = no splicing.

Resultados
ATGGACCACAAACTCTCTTCTCAGCCTGACGCTGTCTTGCCCGAGTTACTG
GTCAGTTAGATAGATTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTTTTTGGCTCAGTTAAAT
CTAATTCTTAGTTAGTTCCTTGTTGTCTGAATTTTATTTTATTTTTCCGATTTC
AGACGGAGTTCATGGTGGACATGAAATGCGAAGGTTGTGTTAATGCTGTCA
AAAATAAGTTGAACGAGATAAATGGTAAGTGTTCGCTGCTTTCAATATGAA
TGAGTGGAATTGGATATATACAAATTAAATTAAATCAGTTCACAAATCGTG
TGGTTTTAAGCATGCCATGGATTTCCGTCTTCATATTATGGTGGTTCTTGTTC
AGGAGTTAAGAACGTAGAGGTGGACTTGAGCAATCAGGTTGTGAGGATTCT
CGGTTCAACGCCGGTGAAGACTATGACTGAAGCTTTGGAGCAGACTGGTAG
AAAAGCCCGGTTAATTGGACAAGGAGTGCCGGAAGACTTCTTAATATCTGC
TGCTGTTTCCGAATTCAAAGGTCCAGATATTTTTGGTGTTGTTCGCCTGGCTC
AAGTAAATATGGAACTGGCTAGGATTGAAGCCAACTTTAGCGGGCTGTCGC
CAGGAAAGCATGGTTGGTCTATTAATGAGTTTGGTGATCTGACTAGAGGTG
CAGCAAGCACTGGTAAAATGTTCAATCCGGTAAATGAGGAAAACAGTAAA
GAGGTTTGCTTTTCCACATTCCTATCAAACTTCTGTTTTCCTGACTTGGTGTT
AACATATTTCCTGTAGGTTTAATTACTCATTTGGTTCCTACACTTGCCCATAT
TATGTGTTTTAGTCCGTATACCTTTAAACTCTATGTTTTAGTCCCAATGCAAG
CAATTTTTTGTGTCAATCCCTGTCACCTGTTACCAAGTAACTCCATTAACTCT
AGGTTCTCTAATGCGCAAATGACACAGAATTGGAAGCACCACAAAGGCAAT
GAACTTAAATTTTGCGTGCACAACTGCAGAAATTCTAGCATTTACATGCTGT
TCATGTGCAGTTTAGAAACTAGACTATAGAGTACTGTACTACGAAGGATAA
ATGTCTAGTTTATAGAGACTAAATGCAACTTGAATAAGTGTAGCAACCAAG
TGAACAATTAAACCTTTCCTTTAAGGATCGATGACTGGTATATATATTATTA
CGAAACACTAAAACAGTTTGGATAGTGAATTATTTTTTTGGAATCATAAAGT
GTATGGATGCATCATGATGGCTGACTGTTTTCCTCTCAAATGTTAGTTTGAC
AGCTATTACCGAAATTTTAATTCTGCTACTGGGGGTTGAGTAGGTAGGAAG
ATGCAGACACATGGAATACCTCAATTTCTTCGTCAAGCTACAAAATACCTTT
AAAACCTCGTTTTTTTAATATTGAAAAGGGCCGAAAGGCCTACTTTTTAAAC
CTCTTCTACCAATTGATGAATGCATTCTCTGCCCCCTTTGCCTCTACTGACAA
ATGTTTTAATGCATAACATGCCTTAATAATATCATTAGATGGTCATTCCTCA
TTCATTTACTTGCAGTCTATGTCCCTAGTCTGTTGTGCTCATGCCTTTTTGTTT
TTATTGTTGAGTTCTGTTCTTACCGATATAGTAATGGTAATTTTTAGAAATCC
TAAGTAAGTTTTTAGTCAAATATTTTAGTTATTGATTTGATTTATAAATAAA
ATTAATTTCCAAAACAAATCAAAATTATTTTCAAATTTTAATGATTTCAAAC
CCAATTTAACGAAGCCTGATTGATTGGATCTTCAGCCACTGGGCGACCTGGG
AACACTAGAAGCTAACGAAAAGGGTGAGGCCTTCTATAGTGGGGTCAAAGA
AAAGCTGAGGGTGGCTGATCTTATTGGACGATCTGTGGTGGTATATGCAACT
GAAGATAAATCAGAACATGGTATAACTGCTGCAGTAATTGCCAGAAGTGCT
GGGGTGGGTGAGAACTATAAGAAACTCTGTACGTGTGATGGCACCACCATA
TGGGAGGCCACGGATACAGATTTTGTTACTAGCAAGGTCTGATAG
Figura 3-4: Secuencia de nucleótidos correspondiente al pre-mRNA de GmCCS donde
se indican los exones en color negro y los intrones en color naranja (intrón 1), rosa
(intrón 2) y amarillo (intrón 3). La secuencia de bases que traducida da lugar al péptido
que reconoce el anticuerpo anti-GmCCS se encuentra subrayada.
96

A
pb
2000
1650
1000
850
650
M 1 2
97
Resultados
Figura 3-5: Análisis mediante RT-PCR de la expresión del gen GmCCS en
suspensiones celulares y plantas de soja. (A) 1: suspensiones celulares crecidas en
condiciones control; 2: hoja joven C. Los cebadores utilizados fueron FW-SAC y RW-
KPN. (B) 1: RNA de suspensiones celulares crecidas en condiciones control; 2: RNA de
hoja joven C. Los cebadores utilizados fueron FW-SAC y 2-4RW. M: Marcador 1.0 kb
plus DNA.
3.1.2 Regulación por cobre
En la Fig. 3-2A se observa una fuerte inducción de la expresión del gen GmCCS
en respuesta al exceso de Cu (10 μM), suplementado a las suspensiones celulares de
soja en la 1ª generación de crecimiento. Como consecuencia de esta fuerte inducción,
aparentemente no se observa la presencia del resto de mensajeros (NSP-GmCCS1, NSP-
GmCCS2 y NSP-GmCCS3) encontrados en las suspensiones celulares crecidas en
condiciones control. Sin embargo, utilizando cebadores diseñados a partir de la
secuencia intrónica de cada uno de los transcritos descritos, se confirmó la presencia de
los tres transcritos con intrón (NSP-GmCCS1, NSP-GmCCS2 y NSP-GmCCS3).
En base a un estudio publicado en humano donde se describe que la chaperona
CCS contiene dos átomos de Cu + y un átomo de Zn 2+ por proteína (Stasser y col., 2005),
se propuso estudiar el efecto de estos metales (Cu y Zn) de forma individual y conjunta
en la expresión del gen GmCCS. Para ello, el medio de cultivo KN 1 de las suspensiones
celulares de soja fue suplementado con concentraciones 10 μM de Cu 2+ y Zn 2+ ,
individual y conjuntamente. El resultado se muestra en la Fig. 3-2B, donde se observa
una fuerte inducción de la expresión de GmCCS en respuesta al exceso de Cu. Por el
B
pb
2000
1650
1000
850
650
M 1 2

Resultados
contrario, no se observa ninguna respuesta frente al exceso de Zn, dando lugar a un
perfil de expresión semejante al obtenido en condiciones control.
En el caso de la planta entera de soja (Fig. 3-2C), se observa una inducción de la
expresión del transcrito GmCCS y una represión de la expresión del transcrito NSP-
GmCCS3 en respuesta al exceso de Cu (10 μM) en los tejidos de hoja joven, hoja
madura y tallo, tratados con Cu radicular (CuR). Sin embargo, el perfil de expresión en
estos tejidos tratados con Cu foliar (CuF) es muy similar a los de condiciones control
(C). Es interesante observar que en el tratamiento radicular no se detecta apenas
inducción de la expresión de GmCCS en raíz siendo en este tejido la expresión del gen
alta en las tres condiciones de crecimiento analizadas (C, CuF y CuR). Esto se debe
muy probablemente a que la raíz es un tejido que está en contacto directo con el medio
hidropónico y almacena más cantidad de Cu que el resto de los tejidos. Esto se confirmó
por ICP-MS, cuyos datos muestran un mayor contenido de Cu en los tejidos de las
plantas tratadas CuR respecto a los tejidos C y CuF, excepto las raíces que tienen un
alto contenido de Cu en las tres condiciones de cultivo (Fig. 3-6).
Figura 3-6: Análisis por ICP-MS del contendido de Cu en diferentes tejidos de la
planta de soja. 1: hoja joven C; 2: hoja joven CuF; 3: hoja joven CuR; 4: hoja madura C;
5: hoja madura CuF; 6: hoja madura CuR; 7: tallo C; 8: tallo CuF; 9: tallo CuR; 10: raíz
C; 11: raíz CuF; 12: raíz CuR.
98

3.2 REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GmCSD2
99
Resultados
La enzima CuZnSOD (cuprozinc superóxido dismutasa) constituye una defensa
de la célula frente a las especies reactivas de oxígeno. Para realizar su función necesita
interaccionar previamente con la chaperona CCS que le suministra el Cu que necesita
como cofactor. Se han descrito tres isoformas de CuZnSOD codificadas por los genes
CSD1 (citosólica), CSD2 (cloroplástica) y CSD3 (peroxisomal). Las dos isoenzimas
mayoritarias en el tejido verde son CSD1 y CSD2. Nuestro estudio se ha centrado en la
isoenzima cloroplástica CSD2 de soja (GmCSD2). El material vegetal utilizado ha sido
el mismo que se indica en el apartado 3.1 para el gen GmCCS (Fig. 3-1).
3.2.1 Regulación por “splicing” alternativo
En la RT-PCR que se muestra en la Fig. 3-7 se utilizaron los cebadores FW-
SOD y 3´SOD1 (Tabla 2-1), los cuales están diseñados sobre las regiones UTR del gen
que codifica para la enzima CuZnSOD cloroplástica de soja (GmCSD2). En
suspensiones celulares de soja, se obtuvieron dos bandas de tamaño parecido al
esperado tanto en condiciones control (0´1 μM Cu) como en exceso de Cu (10 μM Cu).
La banda inferior fue más abundante que la banda superior y se induce en respuesta al
Cu (Fig. 3-7A). En planta entera y con estos mismos cebadores, se obtuvo una banda
del tamaño esperado en todas las condiciones de crecimiento (C, CuF y CuR) y tejidos
(hoja joven, hoja madura, tallo, raíz y flor) analizados (Fig. 3-7C). Al contrario de lo
que ocurría para GmCCS, el patrón de expresión de GmCSD2 en hoja joven es muy
diferente al perfil en hoja madura. En la hoja joven C, el mensajero GmCSD2 es más
abundante que en la hoja madura C y el efecto del Cu también varía, como se explicará
en el siguiente apartado. Estos productos de PCR se clonaron y secuenciaron. Con las
secuencias obtenidas se realizaron alineamientos con la secuencia depositada para el
gen GmCSD2. En base a estos alineamientos y a los programas Blast y GenScan,
llegamos a los siguientes resultados. En las suspensiones celulares, identificamos las
dos bandas obtenidas como CuZnSOD cloroplástica de soja. La banda inferior
corresponde con una secuencia de 791 pb (GmCSD2) similar a la depositada. La banda
superior se corresponde con una secuencia de 891 pb (NSP-GmCSD2) y retiene un
intrón de 100 pb. Al igual que antes, la presencia del intrón provoca un cambio en el
marco de lectura del gen generando un codón de terminación prematuro lo que da lugar

Resultados
a la traducción de un péptido truncado (Fig. 3-8). En la Tabla 3-1 se muestra la
secuencia del posible péptido resultante de la traducción del transcrito NSP-GmCSD2.
En el caso de la planta entera, se detectaron los transcritos GmCSD2 y NSP-GmCSD2,
similares a los transcritos identificados en las suspensiones celulares, en todos los
tejidos analizados de la planta: hoja joven, hoja madura, tallo, raíz y flor. A través del
cebador diseñado en la secuencia intrónica de NSP-GmCSD2 (3-SOD4) (Tabla 2-1), se
confirmaron los resultados obtenidos tanto en suspensiones celulares como en planta de
soja (Fig. 3-7C). El transcrito GmCSD2 fue mayoritario respecto el transcrito NSP-
GmCSD2 en todos los casos analizados en suspensiones celulares y en planta entera. En
la Fig. 3-9 se muestra la secuencia de nucleótidos correspondiente a los exones y el
intrón obtenidos para el gen que codifica para la enzima CuZnSOD cloroplástica de
soja. Este patrón de expresión, sugiere que el gen GmCSD2 está regulado por “splicing”
alternativo de tipo retención de intrón.
100

A
B
C
pb
1000
850
650
pb
1000
850
650
pb
1000
850
650
M B 1 2
M 1 2 3 4
101
NSP-GmCSD2
GmCSD2
NSP-GmCSD2
Actina
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
NSP-GmCSD2
GmCSD2
Actina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
NSP-GmCSD2
GmCSD2
Resultados
NSP-GmCSD2
Actina
Figura 3-7: Análisis mediante RT-PCR de la expresión del gen GmCSD2 en
suspensiones celulares y plantas de soja. (A) B: blanco; 1: suspensiones celulares
crecidas en condiciones control; 2: suspensiones celulares crecidas en condiciones de
exceso de Cu (10 μM). (B) 1: suspensiones celulares crecidas en condiciones control; 2:
suspensiones celulares crecidas en condiciones de exceso de Cu (10 μM); 3:
suspensiones celulares crecidas en condiciones de exceso de Zn (10 μM); 4:
suspensiones celulares crecidas en condiciones de exceso de Cu y Zn (ambos 10 μM).
(C) 1: hoja joven C; 2: hoja joven CuF; 3: hoja joven CuR; 4: hoja madura C; 5: hoja
madura CuF; 6: hoja madura CuR; 7: raíz C; 8: raíz CuF; 9: raíz CuR; 10: tallo C; 11:
tallo CuF; 12: tallo CuR; 13: flor C. M: Marcador 1.0 kb plus DNA.

Resultados
GmCSD2
UTR1
NSP-GmCSD2
UTR1
E1 E2
E1
UTR1
TRANSCRITOS (mRNAs)
I
(100 pb)
791 pb
UTR2
E2
Pre mRNA
E1
FW-SOD 3-SOD4
891 pb
UTR2
I
Traducción
Figura 3-8: Esquema de los mRNAs de CSD2 identificados en soja. Las cajas moradas
representan los exones, las cajas azules representan las regiones UTR y la caja naranja
representa el intrón. Las líneas marrones representan los posibles péptidos resultantes de
la traducción de cada uno de los mensajeros. Los cebadores utilizados en la RT-PCR se
indican con flechas negras que muestran su polaridad. NSP = no splicing.
GTGGCTCTGTGAGTGAGTGAGGATTATATAATTTGCTTTCACCACCAACCAA
CCACAAATTCACACACACATATTCTTTGTTGCAATATCACAAACACCTCGTC
CGTCACAATGCAGCTAGCTGTGGCGGCCAACGCTGTCGTTTCACCGTCGCCG
TTCCGACCTCATCCCCTTCTCCGGTCATCCTTCTCCGGCGTCTCCGTTAAGCT
CACTCCCCAATCCATAACGTTTTCACGCTTGAAGCCCCTCACCGTCTTCGCC
GCCACCAAGAAGGCCGTCGCTGTCCTCAAGGGGACCTCCGCCGTCGAAGGC
GTCGCCACTCTCATCCAAGAAGACGATGGCCCGACGACAGTTTCTGTTAGC
ATCACTGGCCTTACTCCGGGGCTTCATGGTTTTCACCTACATGAGTATGGTG
ATACCACAAATGGGTGTATATCAACAGGAGCACATTTTAATCCTAATAACTT
GACACATGGTGCTCCTGAGGATGAAGTCCGTCATGCGGGTGACCTGGGAAA
CATAGTTGCTAATGCAGAGGGTATTACTTCTTTCCTTTCTCATTTGTCTTCCT
CTACTATGTACTTCTTTCTGGATCCTGGACCTGCTTATGTATCATTTTGTCAA
TTGTTTAAACACAGGGGTTGCAGAGGCTACAATTGTGGATAATCAGATACC
ACTCTCTGGCCCTAATTCAGTAGTTGGATGAGCCTTGGTGGTCCATGAGCTT
GANGATGACCTTGGAAAGGGTGGGCATGAACTCAGTTTGACAACTGGAAAT
GCTGGTGGAAGATTAGCGTGTGGTGTGGTTGGTTTGACTCCAGCATAAATA
GTGAAGCAAATGTTTTTGTAGCAGTCGTGTTATTTTATCTGATGTTATGTCTT
CTGTGAAGC
Figura 3-9: Secuencia de nucleótidos correspondiente al pre-mRNA de GmCSD2
donde se indican las regiones 5'-UTR y 3'-UTR en color azul, los exones en color negro
y el intrón en color naranja.
102
E2
891 pb
UTR2
3´SOD1
POSIBLES PÉPTIDOS
20´8 kDa
19´4 kDa

Nombre
NSP-GmCCS1
NSP-GmCCS2
NSP-GmCCS3
NSP-GmCSD2
MDHKLSSQPDAVLPELLVS
103
Resultados
Tabla 3-1: Secuencia y peso molecular de los posibles péptidos truncados resultantes de
la traducción prematura de los transcritos NSP-GmCCS1, NSP-GmCCS2, NSP-
GmCCS3 y NSP-GmCSD2. El péptido elegido para producir el anticuerpo anti-GmCCS
se encuentra subrayado en la secuencia de NSP-GmCCS3. El péptido elegido para
producir el anticuerpo anti-GmCSD2 no está incluido en la secuencia de NSP-
GmCSD2.
3.2.2 Regulación por cobre
Péptido truncado teórico
MDHKLSSQPDAVLPELLTEFMVDMKCEGCVNAVKNKLNEINGKC
SLLSI
MDHKLSSQPDAVLPELLTEFMVDMKCEGCVNAVKNKLNEINGVK
NVEVDLSNQVVRILGSTPVKTMTEALEQTGRKARLIGQGVPEDFLI
SAAVSEFKGPDIFGVVRLAQVNMELARIEANFSGLSPGKHGWSINE
FGDLTRGAASTGKMFNPVNEENSKEVCFSTFLSNFCFPDLVLTYFL
MQLAVAANAVVSPSPFRPHPLLRSSFSGVSVKLTPQSITFSRLKPLT
VFAATKKAVAVLKGTSAVEGVATLIQEDDGPTTVSVSITGLTPGLH
GFHLHEYGDTTNGCISTGAHFNPNNLTHGAPEDEVRHAGDLGNIV
ANAEGITSFLSHLSSSTMYFFLDPGPAYVSFCQLFKHRGCRGYNCG
Pm
(kDa)
19´9
19´4
En la Fig. 3-7A se observa una fuerte inducción de la expresión del transcrito
GmCSD2 en respuesta al exceso de Cu (10 μM), suplementado a las suspensiones
celulares de soja en la 1ª generación de crecimiento. Por el contrario, la expresión del
transcrito NSP-GmCSD2 se mantiene constante en respuesta al exceso de este metal. A
pesar de que en estas condiciones de exceso de Cu, las suspensiones celulares expresan
mayoritariamente GmCSD2, también se visualiza expresión del transcrito NSP-
GmCSD2 en el gel, a diferencia de lo que ocurría con GmCCS.
Dado que la enzima CuZnSOD cloroplástica contiene átomos de Cu 2+ y Zn 2+
como cofactores, se propuso estudiar el efecto de estos metales (Cu y Zn) de forma
individual y conjunta en la expresión del gen GmCSD2, de la misma manera que se hizo
con el gen GmCCS. Para ello, el medio de cultivo KN 1 de las suspensiones celulares de
soja se suplementó con 10 μM de estos metales Cu 2+ y Zn 2+ , individual y
conjuntamente. El resultado se muestra en la Fig. 3-7B, donde se observa una fuerte
inducción de la expresión de GmCSD2 en respuesta al exceso de Cu, como se describió
anteriormente. Por el contrario, no se observa ninguna respuesta frente al exceso de Zn,
dando lugar a un perfil de expresión semejante al obtenido en condiciones control.
2´1
5´4

Resultados
Tampoco se observa un efecto cooperante del Zn 2+ sobre el Cu 2+ en la expresión de
GmCSD2.
En el caso de la planta entera de soja (Fig. 3-7C), se observa una inducción de la
expresión del transcrito GmCSD2 en respuesta al exceso de Cu (10 μM) en el tejido de
hoja joven suplementado con Cu foliar y radicular. La respuesta de inducción de la
expresión de este gen por efecto del Cu es más rápida en la hoja joven que en la hoja
madura. El comportamiento de la hoja madura es diferente respecto a la hoja joven ya
que no se detecta apenas expresión de GmCSD2 en condiciones C y CuF, sin embargo,
en condiciones CuR se induce la expresión de este transcrito. El perfil de expresión en
el tallo es similar al encontrado en hoja joven. En la raíz, la expresión de GmCSD2 es ya
alta en el C y, por tanto, no se observa inducción con ninguno de los tratamientos (CuF
y CuR) como también sucedía con GmCCS. Como se indicaba en el apartado anterior,
este hecho se debe muy probablemente a que la raíz es un tejido que está en contacto
directo con la solución de nutrientes y acumula Cu en exceso. De hecho, los datos de
ICP-MS muestran un mayor contenido de Cu en los tejidos de las plantas tratadas con
Cu radicular respecto a los tejidos en condiciones C y tratados CuF, excepto las raíces
que tienen un alto contenido de Cu en las tres condiciones de cultivo (Fig. 3-6).
3.3 IDENTIFICACIÓN, LOCALIZACIÓN Y REGULACIÓN DE GmCCS Y
GmCSD2
El material biológico vegetal utilizado para el estudio a nivel de proteína se
detalla a continuación. Suspensiones celulares de soja crecidas en condiciones control
(0´1 μM Cu), suplementadas de forma individual con 10 µM CuSO4 · 5 H2O, 10 µM
FeSO4 · 7 H2O y 10 µM ZnSO4 · 7 H2O durante una generación, y células adaptadas a
10 µM CuSO4 · 5 H2O durante varias generaciones (apartado 2.1.3). También se
utilizaron plantas de soja crecidas en condiciones control (0´1 μM Cu) y suplementadas
con 10 µM CuSO4 · 5 H2O foliar (apartado 2.1.4) (Fig. 3-1). No se utilizaron muestras
de planta entera CuR porque la aplicación de CuF es más parecida a la aplicación de Cu
que reciben las suspensiones celulares.
Mediante los programas informáticos de localización subcelular TargetIP y
ChloroP (Emanuelsson y col., 1999), se predijo teóricamente la localización
104

105
Resultados
cloroplástica y la existencia de un péptido señal de tránsito al cloroplasto para cada una
de las proteínas analizadas (GmCCS y GmCSD2).
3.3.1 Calidad del fraccionamiento subcelular
Para estudiar la identificación, localización y regulación a nivel de proteína de la
chaperona CCS y la enzima CuZnSOD cloroplástica (CSD2), se llevó a cabo un
fraccionamiento subcelular a partir de suspensiones celulares y hojas de soja con el
objetivo de obtener preparaciones de cloroplastos, estroma y tilacoides (apartado 2.3).
En primer lugar se comprobó la calidad del fraccionamiento utilizando las técnicas de
espectroscopia de absorción electrónica UV-Vis (apartado 2.8.1) y western blot
(apartado 2.5.1).
La Fig. 3-10 muestra el espectro de absorción de una preparación de membranas
tilacoidales extraídas a partir de cloroplastos de soja donde se observan varias bandas de
absorción en la zona visible del espectro, debidas a los distintos pigmentos unidos a los
diferentes complejos proteicos presentes en la preparación. Se observa una banda con
máximo hacia 680 nm, debida mayoritariamente a Chl a; la posición de esta banda es
indicativa de la estabilidad e integridad de la preparación aislada. Si la muestra estuviera
degradada o en mal estado, este máximo a 680 nm se desplazaría total o parcialmente
hacia 670 nm, longitud de onda donde absorbe la Chl a no asociada a proteína en
tampones acuosos. Se observa también la presencia de un hombro hacia 650 nm debido
a Chl b, presente principalmente en la LHCII o antena externa del PSII. Las bandas de
absorción hacia 430 y 415 nm son producidas por las bandas Soret de las Chl, mientras
que el pico alrededor de 490 nm es debido a la presencia de diferentes carotenoides
asociados con los distintos complejos proteicos. Por otro lado, la relación Chl a/b
(apartado 2.4.1) de la preparación de tilacoides podría servir también como indicador de
la calidad de la muestra, siendo su valor normal descrito en soja entre 2´8-3. Todas las
preparaciones de tilacoides utilizadas en este trabajo mostraron un espectro y una
relación Chl a/b como las descritas anteriormente, confirmando la buena calidad de las
mismas.
La calidad del fraccionamiento se ha comprobado también utilizando los
anticuerpos comerciales anti-RbcL y anti-PsbA (Tabla 2-4) como marcadores del
estroma y tilacoide, respectivamente. La Fig. 3-11 muestra que los cloroplastos
reaccionan con ambos anticuerpos, el estroma reacciona con anti-RbcL y los tilacoides

Resultados
reaccionan con anti-PsbA. Este resultado confirma, de nuevo, la buena calidad de las
muestras utilizadas en este trabajo.
Banda Soret
Chl
Carotenos
Figura 3-10: Espectro de absorción de membranas tilacoidales de soja.
1 2 3 4 5
Figura 3-11: Western blot utilizando los anticuerpos anti-RbcL y anti-PsbA. 1:
cloroplastos intactos (18 μg de proteína); 2: estroma (30 μg de proteína); 3: tilacoides
(13 μg de proteína) de suspensiones celulares de soja suplementadas con 10 μM Cu. 4:
estroma (8´6 μg de proteína); 5: tilacoides (20 μg de proteína) de hojas de plantas de
soja crecidas en condiciones CuF.
106
Chl b
Chl a
RbcL (53 kDa)
PsbA (38 kDa)

3.3.2 Western blot anti-GmCCS
107
Resultados
Hemos producido un anticuerpo policlonal de conejo anti-GmCCS (apartado
2.5.2) contra un péptido sintético de 15 aminoácidos, CVPEDFLISAAVSEF, (Fig. 3-
12A), diseñado a partir de la secuencia de la chaperona depositada en el NCBI
(AF329816). Para la elección de este péptido se tuvo en cuenta que el anticuerpo no
reconociera a la enzima CuZnSOD ni a otras chaperonas de Cu de plantas. Para ello, se
realizó un alineamiento de la secuencia de GmCCS con las secuencias de estas otras
proteínas. Además, se prestó atención a que el péptido diseñado no formara parte de los
dominios conservados de unión a metal, ni del péptido señal de tránsito al cloroplasto
que contiene la proteína GmCCS no madura. Mediante análisis de western blot, se
comprobó la baja reactividad del anticuerpo contra nuestra proteína recombinante
purificada, así como la presencia de un alto ruido de fondo. Para mejorar la
especificidad de este anticuerpo y reducir el ruido de fondo, se purificó por
cromatografía de afinidad utilizando el péptido sintético. En la Fig. 3-12B se muestra la
validación de este anticuerpo anti-GmCCS purificado contra nuestra proteína
recombinante, parcialmente purificada.
A
B
MAFLRSIATTAIATIPAALAFSSSSSSSFPRSSQSPNPQNRLGLVKTLATPP
SALHMDHKLSSQPDAVLPELLTEFMVDMKCEGCVNAVKNKLNEINGVKNV
EVDLSNQVVRILGSTPVKTMTEALEQTGRKARLIGQGVPEDFLISAAVSEF
KGPDIFGVVRLAQVNMELARIEANFSGLSPGKHGWSINEFGDLTRGAAST
GKMFNPVNEENSKEPLGDLGTLEANEKGEAFYSGVKEKLRVADLIGRSVV
VYATEDKSEHGITAAVIARSAGVGENYKKLCTCDGTTIWEATDTDFVTSKV
kDa
52
37
28
M P
GmCCS
Figura 3-12: (A) Secuencia de la proteína CCS de soja donde se señala con una caja el
péptido elegido para producir el anticuerpo anti-GmCCS, las secuencias consenso de
unión a metal se indican en negrita y el péptido de tránsito al cloroplasto se encuentra
subrayado. (B) Análisis western blot para validar el anticuerpo anti-GmCCS contra
nuestra proteína recombinante, parcialmente purificada.

Resultados
En la Fig. 3-13A se muestra un western blot contra la GmCCS donde se
observan tres bandas diferentes en el estroma de suspensiones celulares de soja. Una
banda intermedia cuyo peso molecular aparente es de 37 kDa, que correspondería al
monómero CCS, otra banda de bajo peso molecular de 23 kDa, que podría ser el
producto resultante de la traducción del transcrito NSP-GmCCS3 (Tabla 3-1), y otra
banda superior y significativamente más abundante cuyo peso molecular aparente es de
94 kDa, que sería una forma oligomérica de la GmCCS. Es importante destacar que
todas las proteínas analizadas mediante SDS-PAGE en este trabajo poseen pesos
moleculares aparentes ligeramente superiores a los pesos moleculares teóricos
correspondientes.
Esta forma oligomérica de unos 94 kDa podría estar formada sólo la GmCCS o
contener también la enzima GmCuZnSOD, ya que ambas proteínas tienen que
interaccionar en el cloroplasto para que la chaperona ceda el metal a la superóxido
dismutasa. Para resolver el problema, realizamos el mismo western blot pero con el
anticuerpo contra la proteína entera de la CuZnSOD de cebada (Tabla 2-4). Este
anticuerpo anti-CuZnSOD reacciona con el oligómero de la CCS (94 kDa) así como con
el monómero de la CCS (37 kDa) y la forma truncada NSP-GmCCS3 (23 kDa) (Fig. 3-
14). Esto no es sorprendente ya que el dominio II de la chaperona CCS es homólogo a
la enzima CuZnSOD, el cual facilita el reconocimiento de su Diana. Este anticuerpo
reconoció, además, otros polipéptidos, tres de ellos que se inducen fuertemente por
exceso de Cu y cuyos pesos moleculares aparentes están dentro de los esperados para la
CuZnSOD. Pensamos que estos polipéptidos corresponden a distintas isoformas de esta
enzima y que su origen es cloroplástico ya que partimos de cloroplastos intactos. Sin
embargo, ninguno de los otros polipéptidos se vieron afectados significativamente por
el tratamiento con Cu, incluidos los correspondientes a la GmCCS. Esto indicaría,
primero, que los otros dos polipéptidos detectados con ese anticuerpo no corresponden a
la CuZnSOD y, segundo, que el trímero de unos 94 kDa no contiene CuZnSOD. Para
confirmar este segundo supuesto, se desarrolló otro anticuerpo anti-GmCuZnSOD que
no reconociese a la chaperona CCS. Este anticuerpo policlonal de conejo anti-
CuZnSOD de soja (apartado 2.5.2) fue producido contra un péptido sintético de 13
aminoácidos, EDDLGKGGHELSL, (Fig. 3-15), diseñado a partir de la secuencia de la
enzima CuZnSOD cloroplástica de soja depositada en el TIGR (TC224966). Para la
elección de este péptido, se realizó un alineamiento de la secuencia de GmCuZnSOD
cloroplástica con las secuencias de GmCCS, GmFeSOD y GmMnSOD con el objetivo
108

109
Resultados
de que el anticuerpo producido no reconociese a ninguna de estas proteínas. Además, se
tuvo en cuenta que el péptido diseñado no formara parte de los dominios conservados
de unión a metal, ni del péptido de tránsito al cloroplasto de la enzima GmCuZnSOD.
Este anticuerpo reconoce tanto a la isoenzima cloroplástica (GmCSD2) como a la
citosólica (GmCSD1). En la Fig. 3-16B no se observa señal en torno a 94 kDa con este
nuevo anticuerpo anti-GmCuZnSOD, diseñado especialmente para que no reconociera a
la GmCCS. Este resultado indicaría que la estructura oligomérica detectada con el
anticuerpo anti-GmCCS no contiene GmCuZnSOD y, por su peso molecular aparente de
94 kDa, se trataría probablemente de un trímero de GmCCS. Este trímero resistió la
desnaturalización de las muestras (estromas de suspensiones celulares de soja crecidas
en condiciones control y suplementadas con 10 μM Cu durante una y varias
generaciones) hirviendo durante 5 min con el tampón de desnaturalización (Fig. 3-13B).
El trímero resistió también la desnaturalización de las muestras hirviendo durante 15
min con una concentración alta de DTT (datos no mostrados).

Resultados
kDa
106,9
93,6
52,3
37,2
28,2
18,8
A B
M 1 2 3
M 1 2 3
C
4 5 6 7 8
Trímero GmCCS
Monómero GmCCS
NSP-GmCCS3
Figura 3-13: Western blot utilizando el anticuerpo anti-GmCCS. (A) Estroma de
suspensiones celulares de soja crecidas: 1: en condiciones control; 2: suplementadas con
10 μM Cu durante una generación; 3: adaptadas durante varias generaciones a 10 µM
Cu. Las tres muestras (30 μg de proteína) se desnaturalizaron a temperatura ambiente
durante 1 h. (B) Muestras 1, 2 y 3 (30 μg de proteína) desnaturalizadas hirviendo 5 min.
(C) 4: cloroplastos intactos de suspensiones celulares control (30 μg de proteína); 5:
cloroplastos intactos de suspensiones celulares suplementadas con 10 µM Cu durante
una generación (18 μg de proteína); 6: estroma de hojas control (30 μg de proteína); 7:
tilacoides de suspensiones celulares suplementadas con 10 µM Cu durante una
generación (13 μg de proteína); 8: tilacoides de hojas control (20 μg de proteína).
110
Trímero GmCCS
Monómero GmCCS
NSP-GmCCS3

kDa
121
100
54
39
30
20
A B
M 3 2 1 M
M 1 2 3
111
Resultados
Trímero GmCCS
Monómero GmCCS
CuZnSOD 1
CuZnSOD 2
CuZnSOD 3
NSP-GmCCS3
Figura 3-14: Western blot utilizando el anticuerpo anti-GmCCS (A) y el anticuerpo
anti-CuZnSOD contra la proteína entera de cebada (B). Las muestras analizadas (30 μg
de proteína) fueron estromas de suspensiones celulares de soja crecidas en: 1,
condiciones control; 2, suplementadas con 10 μM Cu durante una generación; 3,
adaptadas durante varias generaciones a 10 µM Cu.
MQLAVAANAVVSPSPFRPHPLLRSSFSGVSVKLTPQSITFSRLKPLTVFAATKKAVAVLKGTSAVEGV
ATLIQEDDGPTTVSVSITGLTPGLHGFHLHEYGDTTNGCISTGAHFNPNNLTHGAPEDEVRHAGDLGNI
VANAEGVAEATIVDNQIPLSGPNSVVGRALVVHELEDDLGKGGHELSLTTGNAGGRLACGVVGLTPA
Figura 3-15: Secuencia de la proteína GmCuZnSOD cloroplástica de soja donde se
señala con una caja el péptido elegido para producir el anticuerpo anti-GmCuZnSOD.
A B
kDa M 1 2 3 kDa M 1 2
106,5
97,6
106,5
97,6
Trímero GmCCS
Figura 3-16: Western blot utilizando dos anticuerpos diferentes anti-CuZnSOD: (A)
contra la proteína CuZnSOD entera de cebada y (B) contra un péptido sintético de la
enzima CuZnSOD de soja. Las muestras analizadas fueron estromas de suspensiones
celulares de soja crecidas en: 1, condiciones control; 2, suplementadas con 10 μM Cu
durante una generación; 3, adaptadas durante varias generaciones a 10 µM Cu.

Resultados
El supuesto trímero de GmCCS, el monómero de GmCCS y NSP-GmCCS3
fueron detectados también en cloroplastos de suspensiones celulares crecidas en
condiciones control y suplementadas con 10 μM Cu durante una generación, así como
en estroma extraído a partir de hojas de plantas de soja crecidas en condiciones control.
Sin embargo, en tilacoides extraídos tanto de suspensiones celulares como de hojas, se
detectó únicamente el trímero de GmCCS de entre las tres especies encontradas en el
estroma (Fig. 3-13C). Por otro lado, se observó que la expresión de cada una de las tres
especies encontradas para la proteína GmCCS (trímero, monómero y NSP-GmCCS3) se
mantiene constante en respuesta al exceso de Cu suplementado al medio de cultivo de
las suspensiones celulares de soja durante una y varias generaciones (Fig. 3-13). Por el
contrario y como se describió anteriormente, a nivel de mRNA se inducía la expresión
del transcrito GmCCS y se reprimía la expresión del transcrito NSP-GmCCS3 en
respuesta al exceso de Cu, tanto en suspensiones celulares como en planta entera de soja
(Fig. 3-2).
3.3.3 Western blot anti-GmCSD2 y ensayo de actividad SOD
Se analizaron cloroplastos intactos, así como estroma y tilacoides procedentes de
dichos cloroplastos intactos de suspensiones celulares de soja crecidas en condiciones
control y suplementadas con 10 μM Cu durante una y varias generaciones, utilizando
tanto el anticuerpo desarrollado contra la proteína entera CuZnSOD de cebada (Fig. 3-
14B) como el desarrollado a partir del péptido sintético de la CuZnSOD de soja (Fig. 3-
17). Como ya se comentó anteriormente, se detectan tres isoformas de la enzima
GmCSD2 con un peso molecular aparente entre 20 y 29 kDa. El origen de estas
isoformas es cloroplástico ya que se parte de cloroplastos intactos para evitar una
posible contaminación del citosol. Las tres isoformas se localizaron tanto en el estroma
como en el tilacoide de las suspensiones celulares de soja. En nuestras condiciones de
crecimiento control, la concentración de GmCSD2 no parece ser muy abundante, pero
se observa una fuerte inducción de la expresión de las tres isoformas de la proteína
GmCSD2 en respuesta al exceso de Cu (Fig. 3-14B y 3-17).
En el ensayo de actividad SOD que se muestra en la Fig. 3-18 tampoco se
detecta actividad CuZnSOD o es muy escasa en los estromas de suspensiones celulares
de soja crecidas en condiciones control (0´1 μM Cu). En este ensayo de actividad SOD
(Fig. 3-18), se analizó el efecto de los metales Cu 2+ , Fe 2+ y Zn 2+ en la regulación de
112

113
Resultados
GmCSD2 suplementando el medio de cultivo de las suspensiones celulares de soja con
un exceso (10 μM) de cada uno de ellos (apartado 2.1.3). El resultado fue que se induce
la expresión de la enzima GmCuZnSOD y se reprime ligeramente la expresión de la
enzima GmFeSOD en respuesta al exceso de Cu. No se observaron cambios en la
expresión de la proteína GmCuZnSOD por efecto del exceso de Fe o Zn. Además, se
observó una inducción de la expresión de la enzima GmFeSOD en respuesta al exceso
de Fe. En este ensayo de actividad SOD se visualizaron sólo dos isoformas de la enzima
GmCuZnSOD, sin embargo, cuando se cargó una mayor cantidad de muestra, se
visualizó una tercera isoforma localizada entre las otras dos más abundantes (Fig. 3-19).
Este resultado está de acuerdo con el obtenido en el análisis de western blot donde se
visualizaron también tres isoformas cloroplásticas de la enzima GmCuZnSOD. Los
resultados obtenidos de la regulación por Cu (10 μM) a nivel de proteína de la enzima
GmCSD2 mediante los análisis de western blot y los ensayos de actividad SOD están en
concordancia con los datos obtenidos a nivel de mRNA, donde la expresión del
transcrito GmCSD2 se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu, tanto en
suspensiones celulares como en planta entera de soja (Fig. 3-7).
kDa 1 2 3 4
28,9
19,9
CuZnSOD 1
CuZnSOD 2
CuZnSOD 3
Figura 3-17: Western blot utilizando el anticuerpo contra el péptido sintético de
GmCuZnSOD. 1: Cloroplastos intactos de suspensiones celulares de soja crecidas en
condiciones control (30 μg de proteína); 2,3,4: cloroplastos intactos (18 μg de proteína),
tilacoides (13 μg de proteína), estroma (30 μg de proteína), respectivamente, de
suspensiones celulares de soja suplementadas con 10 μM Cu durante una generación.

Resultados
C Cu Fe Zn
Figura 3-18: Ensayo en gel nativo de la actividad de las enzimas SOD de estroma (15
μg de proteína) aislado a partir de suspensiones celulares de soja crecidas durante una
generación en: 1, condiciones control; 2, suplementadas con 10 μM Cu; 3,
suplementadas con 10 μM Fe; 4, suplementadas con 10 μM Zn.
MnSOD
FeSOD
CuZnSOD1
CuZnSOD2
CuZnSOD3
1 2 3
Figura 3-19: Ensayo en geles nativos de la actividad de las enzimas SOD de estroma
(20 μg de proteína) aislado de: 1, suspensiones celulares de soja crecidas en condiciones
control; 2, suspensiones celulares de soja suplementadas con 0´5 μM Cu durante una
generación; 3, hojas de plantas de soja crecidas en condiciones control. Los geles se
preincubaron con A) no inhibidor, B) KCN (inhibe a CuZnSOD) y C) H2O2 (inhibe a
CuZnSOD y FeSOD).
114
MnSOD
FeSOD
CuZnSOD 1
CuZnSOD 2
CuZnSOD 3
A B C
1 2 3 1 2 3

115
Resultados
La ausencia o muy escasa actividad CuZnSOD en el estroma de suspensiones
celulares de soja crecidas en condiciones control nos llevó a analizar lo que ocurría en
planta entera de soja crecida también en condiciones control. Además, se analizó la
actividad SOD de los estromas extraídos a partir de suspensiones celulares de soja
suplementadas con una concentración de 0´5 μM Cu 2+ (Fig. 3-19). El resultado fue que
en plantas de soja control no se detectó actividad CuZnSOD de la misma manera que
ocurría en las suspensiones celulares control. Esto quiere decir que la actividad SOD
cloroplástica en nuestras condiciones de cultivo se debe fundamentalmente a la enzima
FeSOD. La ausencia de actividad CuZnSOD cloroplástica no es, por lo tanto, un
marcador de deficiencia de Cu en soja, ya que tanto las suspensiones celulares como las
plantas de soja control crecieron bien y no mostraron ningún síntoma de estrés por
deficiencia de Cu en nuestras condiciones de cultivo (Fig. 3-1). En la Fig. 3-19 se
muestra la inducción de la expresión de las tres isoformas de la enzima GmCSD2 en
suspensiones celulares de soja suplementadas con 0´5 μM Cu. Esta concentración de Cu
(0´5 μM) es suficiente para visualizar las isoformas de GmCSD2 con la misma
intensidad y abundancia que se visualizan suplementando con una concentración de 10
μM Cu. La expresión de la enzima GmFeSOD se reprime ligeramente por efecto del
suplemento de 0´5 μM Cu. Además, se observa una mayor expresión de esta enzima
FeSOD en el estroma de suspensiones celulares comparada con la obtenida en hojas de
soja.
3.4 CLONACIÓN, SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE GmCCS
3.4.1 Clonación
La obtención del gen a clonar se realizó mediante RT-PCR a partir de
suspensiones celulares de soja crecidas en medio KN 1 suplementado con 10 µM Cu,
condición donde se obtiene una mayor expresión de este gen. El gen obtenido de la
GmCCS posee una mutación puntual conservativa en la posición I175V de la secuencia
proteica, introducida accidentalmente por la Taq polimerasa en la PCR. Una vez
obtenido el gen, se procedió a realizar su clonación. Para ello, se eligió una estrategia
que requiere dos vectores diferentes: pGEM-T Easy (Promega) y pMALc2x modif.
(Pryor y Leiting, 1997). El plásmido utilizado como vector de expresión es un derivado
del plásmido pMALc2x (New England BioLabs) modificado con la adición de una cola-

Resultados
His6 y la secuencia de bases que reconoce la proteasa trombina (Fig. 2-6). Se eligió este
plásmido porque la MBP confiere una mayor solubilidad a la CCS y, junto a la cola-
His6, facilitaría, en principio, la posterior purificación de esta proteína mediante IMAC.
El procedimiento detallado que fue seguido para realizar la clonación del gen GmCCS
se describe en el apartado 2.6.1 de Materiales y Métodos.
3.4.2 Inducción de la expresión en Escherichia coli
Se expresó con éxito el gen entero de la chaperona GmCCS en la bacteria E. coli
DH5α. Para ello, se probaron diferentes condiciones de inducción de la expresión con el
objetivo de obtener la mayor cantidad posible de proteína de fusión MBP-His6-GmCCS.
Los parámetros modificados fueron: la temperatura, el tiempo, la concentración del
inductor (IPTG) y la concentración de CuSO4 y ZnSO4. Las concentraciones de IPTG
probadas fueron 0´3, 0´6 y 1 mM. Las bacterias E. coli DH5α lisadas por sonicación se
centrifugaron y se analizaron los niveles de proteína de fusión tanto en el sobrenadante
(fracción soluble) como en el sedimento (cuerpos de inclusión, paredes celulares y
material que no se ha roto bien) mediante SDS-PAGE. La concentración óptima de
inductor elegida fue 0´3 mM de IPTG (datos no mostrados). Existe un estudio publicado
en humano donde se describe que la chaperona CCS contiene dos átomos de Cu + y un
átomo de Zn 2+ , e inducen la expresión de esta proteína recombinante en presencia de los
dos metales (Stasser y col., 2005). En la Fig. 3-20A se muestran las fracciones solubles
e insolubles de un cultivo inducido a una temperatura de 23 ºC durante 12 h donde se
analiza el efecto de la presencia de exceso de Cu y Zn en el medio de cultivo a dos
concentraciones diferentes de cada uno: 0´5 mM Cu + 0´5 mM Zn (calles S3 y P3) y 3
mM Cu + 30 μM Zn (calles S4 y P4). El resultado de este experimento es que se
observa un incremento notable de la expresión de la proteína de fusión en presencia de
Cu y Zn en el medio de inducción comparado con el cultivo inducido con IPTG sin
suplemento de estos metales. Ambas concentraciones analizadas para los metales Cu y
Zn dieron un perfil de expresión parecido, por lo que se eligió 0´5 mM Cu + 0´5 mM Zn
como concentraciones óptimas de inducción. En presencia de los metales Cu y Zn, parte
de la proteína de fusión sedimenta en forma de cuerpos de inclusión de manera que la
obtenemos en ambas fracciones (sobrenadante y sedimento). En la Fig. 3-20B se
muestran las fracciones solubles e insolubles de un cultivo inducido a una temperatura
116

117
Resultados
de 37 ºC durante 3 h para comparar la expresión con la obtenida a la temperatura
anterior de 23 ºC. De nuevo se confirma que la presencia de 0´5 mM Cu + 0´5 mM Zn
en el medio de cultivo provoca un incremento notable de la expresión de la proteína de
fusión. Se eligió la fracción soluble para continuar con el proceso de purificación
porque su manipulación es más sencilla técnicamente que la de la fracción insoluble en
forma de cuerpos de inclusión. En cuanto a la temperatura de inducción, la cantidad de
proteína de fusión sobreexpresada no varía significativamente entre la inducción a 23 ºC
durante 12 h (Fig. 3-20A) y a 37 ºC durante 3 h (Fig. 3-20B). Por ello, se eligió 37 ºC
como temperatura óptima de inducción pues el tiempo requerido de inducción es mucho
menor (3 h) ya que coincide con la temperatura óptima de crecimiento de esta bacteria.
Por último, se analizó si había diferencias en la expresión de la proteína de fusión entre
añadir los metales Cu y Zn al principio de la fase inicial de crecimiento o en el
momento de inducción con IPTG que coincide con la fase exponencial de crecimiento
del cultivo (Fig. 3-20C). El resultado fue que la expresión de la proteína de fusión es
independiente del momento en que se añaden los metales Cu y Zn. Por lo tanto, se
eligió el momento de la inducción con IPTG (fase exponencial) para añadir 0´5 mM Cu
y 0´5 mM Zn al cultivo. En el apartado 2.6.2 de Materiales y Métodos, se describe en
detalle el procedimiento seguido para sobreexpresar óptimamente la proteína de fusión
MBP-His6-GmCCS.

Resultados
A
kDa M S1 S2 S3 P1 P3
114
88
50,7
35,5
28,8
22
kDa
104
81
48
36
27
M S1 S2 S3 S4 P2 P3 P4
B C
Figura 3-20: Análisis SDS-PAGE 12% (p/v) y tinción Coomassie de la sobreexpresión
de la proteína de fusión MBP-His6-GmCCS en E. coli. (A) La temperatura de inducción
fue 23 ºC durante 12 h. (B) La temperatura de inducción fue a 37 ºC durante 3 h. M:
marcadores de pesos moleculares; S1: fracción soluble no inducida; S2: fracción soluble
+ 0´3 mM IPTG; S3: fracción soluble + 0´3 mM IPTG + 0´5 mM CuSO4 + 0´5 mM
ZnSO4; S4: fracción soluble + 0´3 mM IPTG + 3 mM CuSO4 + 30 μM ZnSO4; P1:
fracción insoluble no inducida; P2: fracción insoluble + 0´3 mM IPTG; P3: fracción
insoluble + 0´3 mM IPTG + 0´5 mM CuSO4 + 0´5 mM ZnSO4; P4: fracción insoluble +
0´3 mM IPTG + 3 mM CuSO4 + 30 μM ZnSO4. (C) Fracciones solubles de cultivos
inducidos a 37 ºC + 0´3 mM IPTG + 0´5 mM CuSO4 + 0´5 mM ZnSO4. Los metales Cu
y Zn fueron añadidos: 1, al principio de la fase inicial de crecimiento; 2, en el momento
de inducción con IPTG, coincidiendo con la fase exponencial de crecimiento del
cultivo.
118
M 1 2
Proteína de fusión
MBP-His 6-CCS
Proteína de fusión
MBP-His 6 -CCS

3.4.3 Purificación
119
Resultados
En el apartado 2.6.3 de Materiales y Métodos se describe el protocolo puesto a
punto para purificar con éxito la proteína recombinante GmCCS. En la Fig. 2-7 se
muestra un esquema de las etapas llevadas a cabo para purificar la chaperona.
En primer lugar, el extracto crudo aclarado mediante centrifugación se cargó en
una columna 1 x 5 ml Hitrap Ni 2+ -IMAC previamente equilibrada. De esta forma, la
proteína de fusión se retuvo en la columna a través de la afinidad de su cola de His por
el Ni 2+ , eliminando así la mayor parte del resto de las proteínas presentes en el extracto
celular. A continuación, la columna se lavó y la proteína de fusión se eluyó con un
gradiente lineal 50-450 mM imidazol. Se recogieron las fracciones y se analizaron
mediante SDS-PAGE para identificar todas aquellas fracciones ricas en la proteína de
fusión MBP-His6-GmCCS (Fig. 3-21A). Se observan dos bandas mayoritarias que se
corresponden con la proteína de fusión MBP-His6-GmCCS (75´6 kDa) y con la proteína
truncada MBP-His6 (52´6 kDa). Este resultado se confirmó utilizando el anticuerpo
monoclonal comercial anti-His (Tabla 2-4). El análisis western blot de las fracciones
eluidas de la columna muestra que tanto la proteína de fusión como la proteína truncada
reaccionan con el anticuerpo anti-His (Fig. 3-21B). A pesar de que la proteína de fusión
es mucho más abundante que la proteína truncada (Fig. 3-21A), en el western blot la
señal correspondiente a la proteína truncada es mucho más intensa que la de la proteína
de fusión. Esta mayor inmunoreactividad de la proteína truncada podría deberse a que la
cola de His está más accesible al anticuerpo en ésta que en la proteína de fusión.

Resultados
A
B
kDa
101
97
54
37
29
kDa
101
97
54
37
29
kDa
114
88
50,7
35,5
M C 3 6 9 11 13 15 17 19
M 40 37 34 31 29 27 25 23 21
C 11 13 15 17 19 21 23 25
Figura 3-21: Primera etapa de purificación de la proteína recombinante GmCCS
mediante cromatografía IMAC. (A) Análisis SDS-PAGE 12% (p/v) y tinción
Coomassie de las fracciones eluidas de la columna. (B) Western blot utilizando el
anticuerpo monoclonal anti-His de las fracciones eluidas de la columna. M: Marcadores
de peso molecular. C: Extracto celular cargado en la columna.
120
Proteína de fusión
MBP-His 6-CCS
Proteína Truncada
His 6 -MBP
Proteína de fusión
MBP-His 6 -CCS
Proteína Truncada
His 6 -MBP
Proteína de fusión
MBP-His 6 -CCS
Proteína Truncada
His 6 -MBP

121
Resultados
Se seleccionaron las fracciones con un contenido mayor de la proteína de fusión
y se digirieron con la proteasa trombina 10 µg/ml a 22 ºC durante 22 h, obteniendo
como producto una mezcla de las proteínas GmCCS y MBP-His6. En la Fig. 3-22A se
muestra el análisis SDS-PAGE donde se observa que la digestión de la proteína de
fusión ha sido prácticamente completa, obteniéndose eficazmente la proteína GmCCS
en forma de doblete. Las mismas muestras se analizaron mediante western blot con el
anticuerpo anti-His que reaccionó contra la proteína de fusión y la proteína truncada,
como era esperable (Fig. 3-22B).
A
kDa
104
81
48
36
27
19
M C Tr
Proteína de fusión
MBP-His 6 -CCS
Proteína Truncada
His 6 -MBP
CCS
C Tr M
Figura 3-22: Segunda etapa de purificación de la proteína recombinante GmCCS.
Digestión con trombina. (A) Análisis SDS-PAGE 15% (p/v) y tinción Coomassie. (B)
Western blot utilizando el anticuerpo monoclonal anti-His. C: Proteína eluida de la
primera columna Hitrap Ni 2+ -IMAC; Tr: productos de la digestión de la proteína de
fusión con trombina; M: Marcadores de peso molecular.
B

Resultados
La mezcla proteica resultante de la digestión se volvió a cargar en la columna
Hitrap Ni 2+ -IMAC, utilizada en la primera etapa de la purificación. La proteína GmCCS
quedó retenida a la columna debido a sus aminoácidos que interaccionan con el Ni 2+ y
se eluyó usando un gradiente lineal 0-450 mM imidazol. Se recogieron las fracciones y
se analizaron mediante SDS-PAGE. En la Fig. 3-23 se observa que la proteína GmCCS
eluyó algunas fracciones antes que la proteína truncada MBP-His6, lográndose, así,
separar ambas proteínas con éxito.
kDa
101
97
54
37
29
20
101
97
54
37
29
20
M C Tr 5 8 10 12 14 16 18
M 36 34 32 30 28 26 24 22 20
Figura 3-23: Tercera etapa de purificación de la proteína recombinante GmCCS
mediante cromatografía IMAC. Análisis SDS-PAGE 15% (p/v) y tinción Coomassie.
M: Marcadores de peso molecular; C: Proteína eluida de la primera columna Hitrap
Ni 2+ -IMAC; Tr: productos de la digestión de la proteína de fusión con trombina; 5-36:
fracciones eluidas de la columna. Las fracciones elegidas se indican entre corchetes.
122
Proteína de fusión
MBP-His 6 -CCS
Proteína Truncada
His 6-MBP
CCS
Proteína de fusión
MBP-His 6 -CCS
Proteína Truncada
His 6 -MBP

123
Resultados
Finalmente, para conseguir una pureza superior de la proteína recombinante, las
fracciones seleccionadas (marcadas con corchetes en la Fig. 3-23) se cargaron en una
columna de intercambio aniónico débil Toyopearl TSK DEAE-650s previamente
equilibrada. A continuación, la columna se lavó y se realizó la elución de la proteína
mediante un gradiente lineal 7´5-4´5 de pH. El análisis de la pureza de las fracciones
eluidas se realizó mediante SDS-PAGE. En la Fig. 3-24A se muestra el resultado de
esta última etapa donde la preparación de GmCCS ha quedado libre de proteínas
contaminantes. La proteína pura aparece en SDS-PAGE como una doble banda con
pesos moleculares aparentes en torno a 37 kDa. Este peso molecular aparente es mayor
que el peso molecular teórico de la proteína, obtenido a partir de su secuencia derivada
de aminoácidos (32´6 kDa).
A B
kDa M C 1 3 6 9 12 15 18 21 24 26 28 30 32
104
97
50
37
29
34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 53 54 55 56 57
Figura 3-24: Cuarta etapa de purificación de la proteína recombinante GmCCS
mediante cromatografía de intercambio aniónico débil utilizando una columna
Toyopearl TSK DEAE-650s. (A) Análisis SDS-PAGE 15% (p/v) y tinción Coomassie.
C: Proteína eluida de la segunda columna Hitrap Ni 2+ -IMAC; 1-57: fracciones eluidas
de la columna. (B) Análisis western blot utilizando el anticuerpo anti-GmCCS. P:
proteína recombinante purificada; M: Marcadores de peso molecular.
CCS
CCS
kDa
107
94
52
37
28
18
M P
CCS

Resultados
Ambas bandas reaccionaron con el anticuerpo específico contra la chaperona
anti-GmCCS mediante western blot (Fig. 3-24B). Por otro lado, el análisis MALDI-
TOF (apartado 2.7.1) confirmó la identidad de ambas bandas como CCS de soja. El
análisis de la secuencia N-terminal (apartado 2.7.2) de la banda inferior revela que la
diferencia de tamaño entre ambas se debe a la pérdida de los primeros 40-50
aminoácidos de la proteína, que corresponden al péptido señal de tránsito al cloroplasto
(Fig. 3-25). Nuestra hipótesis es que proteasas endógenas de la bacteria E. coli digieren
a la chaperona en tres puntos diferentes localizados alrededor del final de su péptido
señal, simulando de alguna manera lo que ocurre en el cloroplasto durante la
maduración de esta proteína. Podemos concluir, por tanto, que la proteína recombinante
GmCCS fue purificada con un alto grado de pureza siguiendo la metodología aquí
descrita. El rendimiento aproximado de la purificación fue 0´5 ml de proteína pura 60
µM a partir de 0´5 l de cultivo de bacterias. El análisis por ICP-MS (apartado 2.7.3)
demostró que la proteína purificada no contenía metales y, por tanto, era obtenida en
forma apo.
MAFLRSIATTAIATIPAALAFSSSSSSSFPRSSQSPNPQNRLGLVKTLATPPSALHMDHKLSSQPDA
VLPELLTEFMVDMKCEGCVNAVKNKLNEINGVKNVVVDLSNQVVRILGSTPVKTMTEALEQTG
RKARLIGQGVPEDFLISAAVSEFKGPDIFGVVRLAQVNMELARIEANFGGLSPGKHGWSINEFGD
LTRGAASTGKMFNPVNEENSKEPLGDLGTLEANEKGEAFYSGVKEKLRVADLIGRSVVVYATE
DKSEHGITAAVIARSAGVGENYKKLCTCDGTTIWEATDTDFVTSKV
Figura 3-25: Procesamiento heterogéneo de GmCCS por las proteasas de E. coli. El
péptido de tránsito al cloroplasto está subrayado. Las tres secuencias N-terminal (seis
aminoácidos) diferentes obtenidas en el análisis por degradación secuencial Edman se
indican en la parte superior de la figura. Las flechas indican su posición en la secuencia
de aminoácidos.
124
LATPPS…
TPPSAL…
LVKTLA…

3.5 CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE LA GmCCS
RECOMBINANTE PURIFICADA
3.5.1 Absorción UV-Vis
125
Resultados
En la Fig 3-26 se presentan los espectros de absorción UV de GmCCS añadiendo
concentraciones crecientes de Cu + . La adicción de iones Cu + da lugar a un aumento de
la absorbancia a 240 nm como consecuencia de la interacción del ión metálico con la
proteína. Para el cálculo de la constante de disociación Kd del complejo GmCCS-Cu + se
utilizó la representación de los dobles recíprocos. La representación de 1/Abs240
respecto a 1/[Cu] se ajusta a dos rectas, cuyas pendientes son Kd1 = 0´18 μM y Kd2 =
6´08 μM. Se sugiere, por tanto, que GmCCS posee dos sitios diferentes de unión del ión
Cu + , cada uno con distinta afinidad. Según su secuencia, la chaperona contiene dos
sitios de unión a metal en los dominios I (MXCXXC) y III (CXC). Los pares de cisteína
de estos dominios I (Cys7 y Cys10) y III (Cys209 y Cys211) se encuentran indicados en
el modelo estructural de GmCCS con color rojo (Fig. 3-29) (apartado 2.9.2).
Los espectros de absorción UV-Vis de la chaperona añadiendo concentraciones
crecientes de Zn 2+ en presencia del indicador mag-fura-2 se presentan en la Fig. 3-27.
La adición de iones Zn 2+ da lugar a un aumento de la absorbancia a 322 nm debido a la
formación del complejo GmCCS-Zn 2+ . Como en el caso anterior, se analizaron los datos
mediante la representación de 1/Abs322 respecto a 1/[Zn] dando lugar el ajuste a una
única recta cuya pendiente corresponde a una Kd.= 9´15 μM. Se propone, por lo tanto,
que la GmCCS posee un único sitio de unión al ión Zn 2+ , con menor afinidad que los de
Cu + y estaría situado probablemente en el dominio II de GmCCS, homólogo a la enzima
GmCuZnSOD.

Resultados
A
B
C
Abs 240 nm
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00
[Cu] micromolar
Y= 7´93 + 48´23 X
R= 0´9649
Figura 3-26: Unión de Cu + a GmCCS. (A) Espectros de absorción UV; (B)
Representación del cambio de absorción a 240 nm en función de la [Cu + ]; (C)
representación de los dobles recíprocos para calcular las Kd del complejo GmCCS-Cu + .
Los datos mostrados son representativos de al menos dos réplicas independientes del
experimento.
126
Y= 16´69 + 3´04 X
R= 0´9869
K d2 = 6´08 µM
K d1 = 0´18 µM

A
B
C
Abs 322-400 nm
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
1/Abs 0
0 2 4 6 8 10 12
50
40
30
20
10
0
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
-10
[Zn] micromolar
127
Y= 21´58 + 2´36 X
R2 = 0´9936
K d = 9´15 µM
1/[Zn]
Resultados
Figura 3-27: Unión de Zn 2+ a GmCCS. (A) Espectros de absorción UV-Vis; (B)
Representación de los cambios de absorción a 322-400 nm en función de la [Zn 2+ ]; (C)
Representación de los dobles recíprocos para la determinación de la Kd del complejo
GmCCS-Zn 2+ . Los datos mostrados son representativos de al menos dos réplicas
independientes del experimento.

Resultados
En la Fig. 3-28 se presentan los espectros de absorción Vis de GmCCS
añadiendo Co 2+ . La adición de Co 2+ da lugar a un aumento de la absorbancia a 730 nm
debido a la formación del complejo GmCCS-Co 2+ . Aunque el Co no es un cofactor
fisiológico de la chaperona CCS, se utiliza normalmente como test de funcionalidad in
vitro de la apo-chaperona.
Figura 3-28: Unión de Co 2+ (9 μM) a GmCCS. Espectros de absorción Vis. El espectro
obtenido tras la adición del metal se indica en color gris.
128

129
Resultados
Figura 3-29: Modelado de la chaperona GmCCS utilizando como molde la estructura
de la proteína CCS de levadura (1jk9_B.pdb). Los pares de cisteína de unión a Cu +
(Cys7 y Cys10) y (Cys209 y Cys211) se indican con color rojo, los triptófanos (Trp113
y Trp217) en color azul y las tirosinas (Tyr160, Tyr180 y Tyr205) en rosa.
3.5.2 Fluorescencia
Dominio II Dominio III
Dominio I
La unión a Cu + se analizó también a través de los cambios observados en la
fluorescencia intrínseca de la proteína GmCCS purificada. El triptófano (Trp) y en
menor medida la tirosina (Tyr) y la fenilalanina (Phe), son los principales fluoróforos
intrínsecos de las proteínas. GmCCS contiene tres Tyr y dos Trp, señalados en el
modelo estructural de esta chaperona en color rosa y azul, respectivamente (Fig. 3-29).
La Fig. 3-30A muestra el espectro de emisión de la chaperona GmCCS que contiene dos
picos con máximos a 322 nm (contribución parcial de las Tyr) y a 338 nm (contribución
de los Trp). Se midió la variación de la fluorescencia a λ338nm correspondiente a los Trp.
El Trp217 sería el principal responsable de las variaciones observadas ya que está
próximo a un par de cisteínas localizadas en el dominio de unión a metal

Resultados
(Cys209XCys211) (Fig. 3-29). En la Fig. 3-30B se observa una disminución de la emisión
a 338 nm por las primeras adiciones de Cu + y seguidamente se produce un incremento
de la emisión a esta longitud de onda por las siguientes adiciones del metal. Este
comportamiento podría reflejar un cambio en la hidrofobicidad del ambiente que rodea
al residuo Trp217, debido probablemente a un cambio conformacional de la proteína
por efecto del ión metálico.
A
B
Fluorescencia a 338 nm
1
0
0 5 10 15 20 25
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
Tyr
Trp
[Cu] Micromolar
Figura 3-30: (A) Espectro de fluorescencia de GmCCS. (B) Representación de la
fluorescencia a 338 nm en función de la [Cu + ]. Los datos mostrados son representativos
de al menos dos réplicas independientes.
130

3.5.3 Dicroísmo circular
mdeg
9
7
5
3
1
-1
-3
-5
-7
190 200 210 220 230 240 250
Longitud de onda (nm)
131
Resultados
Los espectros de dicroísmo circular en el UV lejano de la proteína GmCCS
purificada añadiendo concentraciones crecientes de Cu + , se presentan en la Fig. 3-31. El
espectro analizado a través del servidor Dichroweb (apartado 2.8.3) muestra que la
estructura secundaria de la chaperona tiene aproximadamente un 7% de contenido en
hélice α, un 45% en lámina β y un 48% en estructura desordenada. Estos porcentajes
son muy similares a los obtenidos a partir del modelado de la estructura de la chaperona
GmCCS (apartado 2.9.2): 10% de contenido en hélice α, un 40% en lámina β y un 50%
en estructura desordenada. El contenido de estructura desordenada es
sorprendentemente alto, indicando que la estructura de la GmCCS con sus tres dominios
diferentes es poco compacta abierta y probablemente es muy flexible. La presencia de
Cu + no parece que provoque una reorganización general significativa de la estructura
secundaria de la proteína. Los espectros a λ menores de 200 nm no son fiables por
posibles interferencias del medio.
h.α. (%) l.β. (%) e.d. (%)
DC GmCCS 7 45 48
Modelo GmCCS 10 40 50
Figura 3-31: Dicroísmo circular en el UV lejano de GmCCS. Las concentraciones de
Cu + utilizadas fueron 0 μM (rosa), 6 μM (azul oscuro), 57 μM (verde) y 120 μM (azul
claro). Los porcentajes de los componentes de estructura secundaria (hélice α = h.α.,
lámina β = l.β. y estructura desordenada = e.d.) calculados a partir del espectro
experimental y del modelo estructural de GmCCS, se indican en la tabla situada en el
interior.

Resultados
3.6 BÚSQUEDA DE UNA HIPOTÉTICA cpCCS EN SOJA
Tottey y col. (2002) identificaron y caracterizaron una chaperona ATX1 en la
cianobacteria Synechocystis PCC 6803 que contiene el dominio de unión a metal CxxC
y transporta Cu entre las Cu-ATPasas CtaA (membrana citoplasmática) y PacS
(membrana tilacoidal), siendo liberado finalmente a la Pc, proteína clave para la
fotosíntesis. Dada la similitud existente entre el cloroplasto y su antecesor, una
cianobacteria, se identificaron posteriormente los homólogos de CtaA y PacS en
plantas: PAA1/HMA6 localizado en la envuelta del cloroplasto (Shikanai y col., 2003)
y PAA2/HMA8 localizado en la membrana tilacoidal (Abdel-Ghany y col., 2005b;
Bernal y col., 2007) (Fig. 1-7).
En A. thaliana se identificó una chaperona denominada cpCCS cuya secuencia
fue depositada en el año 2003 por Burkhead y col. (datos no publicados) en el NCBI
con el código AY303948. Esta chaperona cpCCS contiene un péptido de tránsito al
cloroplasto, un dominio de unión a metal y podría realizar la función de transportar Cu
desde HMA6 hasta HMA8 en el cloroplasto. Actualmente no se ha identificado todavía
la chaperona que realiza esta función de transportar Cu desde HMA6 hasta HMA8 en
los cloroplastos de las plantas (Abdel-Ghany y col., 2005b). A pesar de su semejanza en
el nombre, esta chaperona cpCCS no es la misma que la AtCCS (Wintz y Vulpe, 2002)
porque su secuencia de aminoácidos es diferente y le falta el dominio de unión a
CuZnSOD.
Hemos intentado en este trabajo identificar en soja el homólogo de esta
hipotética cpCCS cloroplástica descrita en Arabidopsis e implicada en el transporte de
Cu entre HMA6 y HMA8. Para ello, se diseñaron cebadores degenerados a partir de las
secuencias de los genes que codifican para cpCCS (AY303948) y AtATX1
(AK220937). Es importante aclarar que la chaperona de Cu ATX1 de Synechocystis es
totalmente diferente a la ATX1 identificada en levadura, humano y planta. El extremo
N-terminal de AtATX1 muestra un plegamiento con estructura βαββαβ y un dominio de
unión a Cu + MxCxxC, típicos de las proteínas de esta familia (metalochaperonas de tipo
ATX1). Se intentó utilizar también el gen que codifica para la ATX1 de Synechocystis
en el diseño de los cebadores, sin embargo, no fue posible porque la degeneración era
excesiva. En total se diseñaron tres cebadores, dos 5´ y uno 3´, los cuales fueron
probados y los que dieron señal en la RT-PCR fueron seleccionados (5´-SOJA+X1 y 3´-
SOJA+X1) (Tabla 2-1). Se utilizó un programa de RT-PCR especial que se indica en la
132

133
Resultados
Fig. 2-4. Este programa varía, entre otras cosas, el tiempo de hibridación, siendo más
alto, y las rampas de temperatura anterior y posterior a la etapa de hibridación corrieron
más lentas que en el programa tipo; ambos cambios se realizaron para facilitar la
correcta hibridación de los oligos degenerados al DNA. El molde utilizado para la RT-
PCR fue cDNA de suspensiones celulares (crecidas en condiciones control y
suplementadas con 10 μM Cu durante una generación) y hojas jóvenes de plantas de
soja (crecidas en condiciones control y suplementadas con 10 μM Cu radicular). No se
observó ninguna banda en las RT-PCRs realizadas excepto con la muestra de hoja joven
de planta de soja control. En la Fig. 3-32 se muestra el producto de esta RT-PCR que
corresponde con una banda de 800 pb, tamaño adecuado para tratarse de la chaperona
cpCCS de soja. Este producto de PCR se clonó y secuenció. Con la secuencia obtenida
se realizó un alineamiento con la secuencia depositada del gen que codifica para la
hipotética chaperona cpCCS de Arabidopsis. La secuencia clonada no presentaba
homología alguna con la de cpCCS. Por otro lado, las secuencias homólogas a nuestra
secuencia clonada, obtenidas mediante el programa Blast, no codificaban para ninguna
proteína relacionada con la homeostasis del Cu. Estas secuencias que presentaban
homología con nuestra secuencia clonada codificaban para la ribonucleoproteína
nuclear heterogénea y la proteína beta-cetoacil-CoA sintasa. Ninguna de estas proteínas
coincidían con la chaperona que buscábamos, por lo que no se consiguió encontrar la
hipotética cpCCS que transporta Cu desde HMA6 hasta HMA8 de soja.
pb
1000
850
650
M 1
Figura 3-32: Análisis mediante RT-PCR para intentar amplificar el gen cpCCS de soja.
1: hoja joven de planta crecida en condiciones control.

DISCUSIÓN

4 DISCUSIÓN
4.1 REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GmCCS Y GmCSD2
137
Discusión
En este trabajo se ha estudiado la regulación a nivel transcripcional de los genes
CCS y CSD2 de suspensiones celulares y plantas de soja, crecidas en condiciones
control (0´1 μM Cu) y suplementadas con un exceso de Cu (10 μM), mediante la técnica
PCR reversa (RT-PCR). Fisiológicamente, estas suspensiones celulares y plantas de
soja presentaron un fenotipo aparentemente normal, sin síntomas visibles de deficiencia
en los controles ni de toxicidad por el metal suministrado.
Ambos genes, GmCCS y GmCSD2, se expresan en todos los tejidos analizados
(hoja joven, hoja madura, tallo, raíz y flor). En A. thaliana, los mRNAs de la CCS
(Abdel-Ghany y col., 2005a), CSD1, CSD2 y FSD1 (Abdel-Ghany y Pilon, 2008) se
expresan también en raíz y en tejido fotosintético. En la literatura existen otros ejemplos
de proteínas cloroplásticas, HMA6/PAA1 (Abdel-Ghany y col., 2005b) y CUTA
(Burkhead y col., 2003), cuyos mRNAs se expresan tanto en tejido fotosintético como
no fotosintético. Sin embargo, los mRNAs que codifican para las proteínas Pc (Abdel-
Ghany y Pilon, 2008) y HMA8/PAA2 (Abdel-Ghany y col., 2005b), se expresan
únicamente en tejido fotosintético de A. thaliana. En el tejido no fotosintético, se
encuentran los plastidios no activos fotosintéticamente. El hecho de que se exprese el
mRNA de estos genes en la raíz, no significa que exista traducción de la proteína
correspondiente y, en caso de traducirse, podría no ser funcional.
4.1.1 Regulación por “splicing” alternativo
GmCCS y GmCSD2 están regulados por un mecanismo de “splicing” alternativo
de tipo retención de intrón. Se ha demostrado que la retención de intrón es el tipo de
“splicing” alternativo más frecuente en Arabidopsis y arroz, y que los transcritos
resultantes están implicados principalmente en funciones como la fotosíntesis y la
respuesta frente al estrés (Ner-Gaon y col., 2004; Wang y Brendel, 2006; Campbell y
col., 2006). En el caso del gen GmCCS, se han detectado cuatro mensajeros (GmCCS,
NSP-GmCCS1, NSP-GmCCS2 y NSP-GmCCS3) en suspensiones celulares y tres
mensajeros (GmCCS, NSP-GmCCS2 y NSP-GmCCS3) en planta entera de soja. En el
caso del gen GmCSD2, se han detectado dos mensajeros (GmCSD2 y NSP-GmCSD2)

Discusión
tanto en suspensiones celulares como en planta entera. Los intrones de cada uno de los
transcritos analizados poseen secuencias ricas en uridina y adenosina, característica
típica de los intrones de plantas dicotiledóneas y en menor proporción de
monocotiledóneas (Goodall y Filipowicz, 1991). En Arabidopsis y arroz se proponen las
secuencias C(A)AG/GTAA y TGCAG/G como secuencias consenso para los sitios del
donador y del aceptor de “splicing” respectivamente. Sin embargo, estos límites son
menos definidos para los intrones de las plantas que para los de animales. Las
secuencias de los genes estudiados en esta Tesis Doctoral, GmCCS y GmCSD2,
cumplen esta regla consenso. Se ha descrito que un porcentaje (14% en Arabidopsis y
17% en arroz) de los genes que sufren “splicing” alternativo no cumplen esta regla (GT-
AG, GC-AG, AT-AC) (Ner-Gaon y col., 2007). Estas secuencias que no cumplen la
regla se pueden encontrar en TIGR
(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/ath1/Arabidopsis_nonconsensus_splice_sites.shtml).
En todos nuestros transcritos que contienen un intrón, se obtienen péptidos
truncados, ya que la presencia del intrón genera un codón de terminación que provoca la
parada prematura de la traducción. Los péptidos truncados no suelen ser funcionales
pero para comprobarlo habría que realizar ensayos de complementación en plantas
transgénicas o en mutantes de levaduras. Por otro lado, el hecho de que el intrón no sea
eliminado en la maduración del mRNA, puede dar lugar también a péptidos truncados
inactivos sin función alguna, esta estrategia le serviría a la célula como una manera
económica de regular la cantidad de proteína activa producida finalmente. De los cuatro
péptidos truncados que se obtienen fruto de la regulación por “splicing” alternativo de
los genes GmCCS y GmCSD2, sólo NSP-GmCCS3 y NSP-GmCSD2 pueden ser
detectados con los anticuerpos que disponemos actualmente. NSP-GmCCS3 conserva la
secuencia de aminoácidos que reconoce el anticuerpo correspondiente anti-GmCCS y
NSP-GmCSD2 podría ser detectado con el anticuerpo contra la proteína CuZnSOD
entera de cebada.
Se ha demostrado que en el genoma de A. thaliana sólo existe una copia del gen
CCS localizada en el cromosoma 1 (Wintz y Vulpe, 2002), sin embargo, en patata se
han encontrado dos copias de este gen (Trindade y col., 2003). Las secuencias
disponibles en las bases de datos indican que la presencia de dos genes es una
característica común en monocotiledóneas pero no en dicotiledóneas. Este hecho
sugiere que los genes de la patata pueden ser el resultado de una duplicación reciente.
En ambas plantas dicotiledóneas, A. thaliana y patata, se describe que el gen CCS está
138

139
Discusión
compuesto por seis exones y cinco intrones. Recientemente se ha depositado el genoma
de soja completo secuenciado (http://www.phytozome.net/soybean.php) donde se
encuentra un único gen para la CCS, localizado en el cromosoma 5 y constituido por 6
exones y 5 intrones, como en A. thaliana y patata. Tres de estos intrones han sido
identificados en esta Tesis Doctoral (intrones 1, 2 y 3), los cuales corresponden al
segundo, tercero y quinto intrón, respectivamente, en la secuencia de soja depositada.
En el caso de la CuZnSOD, existen tres genes diferentes que codifican para la
CuZnSOD cloroplástica (CSD2) en el genoma de soja secuenciado, localizados uno en
el cromosoma 11 y dos en el cromosoma 12, constituidos cada uno de ellos por 8
exones y 7 intrones. Uno de los genes localizado en el cromosoma 12 coincide con el
gen CSD2 utilizado en esta Tesis Doctoral, y hemos identificado uno de los 7 intrones
que corresponde con el cuarto intrón de la secuencia depositada. Por otro lado, existen
también tres genes diferentes que codifican para la CuZnSOD citosólica (CSD1) en el
genoma de soja secuenciado, localizados en los cromosomas 3, 16 y 19, y constituidos
cada uno por 7 exones y 6 intrones. Dos de estos genes, localizados en los cromosomas
3 y 19, codifican para la misma secuencia proteica de CSD1. El hecho de que existan
varios genes diferentes para CSD1 y CSD2 en soja, siendo ésta una planta
dicotiledónea, sugiere que estos genes pueden ser el resultado de una duplicación
reciente posterior a la antigua separación de las plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas, momento en el que las dicotiledóneas perdieron una copia. Esta
duplicación génica puede generar isoformas diferentes de la misma proteína.
Existen varios ejemplos de cuproproteínas reguladas por este mecanismo de
“splicing” alternativo en plantas: CUTA de Arabidopsis (Burkhead y col., 2003),
COX19 de Arabidopsis (Attallah y col., 2007b), CuZnSOD de Populus (Srivastava y
col., 2009) y HMA8 de soja (Bernal M., 2006, Tesis Doctoral, Universidad de
Zaragoza). Se han publicado estudios recientes de “splicing” alternativo en los genomas
de maíz, musgo (Rensing y col., 2008) y tres especies de leguminosas (Wang y col.,
2008). La mayor parte de los casos de “splicing” alternativo no han sido caracterizados
funcionalmente en plantas, pero se sugiere su participación en importantes funciones
como la respuesta a estreses entre los que se encuentra el estrés abiótico (Mazzucotelli y
col., 2008). El mecanismo de “splicing” alternativo en genes que participan en algún
tipo de estrés podría ser una herramienta muy útil para desarrollar mecanismos de
adaptación y supervivencia.

Discusión
4.1.2 Regulación por cobre
Los genes GmCCS y GmCSD2 están regulados por cobre a nivel transcripcional
o postranscripcional. La presencia de un exceso de este metal (10 μM) provoca una
fuerte inducción de la expresión de ambos genes tanto en suspensiones celulares como
en plantas de soja. Aparentemente, el Cu influye en el patrón de “splicing” de GmCCS
ya que cuando este metal está en exceso, se visualiza sólo un mensajero (GmCCS) en el
gel. Sin embargo, mediante RT-PCR utilizando un cebador diseñado en la zona
intrónica de cada uno de los mensajeros con intrón, se amplificaron el resto de
mensajeros (NSP-GmCCS1, NSP-GmCCS2 y NSP-GmCCS3). En plantas, el perfil de
expresión de los tejidos tratados con Cu foliar (CuF) es el mismo que en condiciones
control (C). Este hecho junto a los datos de ICP-MS, indican que el tratamiento CuF no
fue muy eficaz y que probablemente el Cu no entra fácilmente debido a barreras físicas
y/o químicas de la superficie de la hoja. Otro punto a tener en cuenta es que la expresión
de GmCCS en los tejidos fotosintéticos (hoja joven, hoja madura y tallo) se induce en
respuesta al tratamiento con Cu radicular (CuR), sin embargo, en los tallos la inducción
es menor que en hojas. En las raíces no se observa inducción de la expresión de
GmCCS, debido a que ya es muy alta incluso en condiciones control, debido muy
probablemente al alto contenido de Cu en este tejido en todas las condiciones de
crecimiento. Para el gen GmCSD2, el Cu no influye en el patrón de “splicing”. En
plantas de soja, sólo se visualizaba el mensajero GmCSD2 en el gel, sin embargo,
mediante RT-PCR utilizando un cebador diseñado en la zona intrónica, se amplificó el
mensajero NSP-GmCSD2. Se observaron diferencias en la expresión del gen GmCSD2
entre la hoja joven y la hoja madura, a diferencia del gen GmCCS. En condiciones C, se
expresa más GmCSD2 en la hoja joven que en la hoja madura. Además, GmCSD2
demuestra una mayor sensibilidad al exceso de Cu que GmCCS, ya que su expresión
también se induce en la hoja joven tratada con CuF. En cambio, el perfil de expresión de
GmCSD2 en la hoja madura es parecido al perfil de GmCCS, en condiciones C y CuF la
expresión de GmCSD2 es igual y en condiciones CuR aumenta. En tabaco también se ha
demostrado que el cambio de expresión del gen CSD2 en respuesta al exceso de Cu es
más pronunciado en hojas jóvenes que en hojas maduras (Kurepa y col., 1997).
El Cu regula la expresión de los genes GmCCS y GmCSD2 induciendo
fuertemente su expresión. En Arabidopsis se ha descrito que la regulación de CSD2 por
Cu es postranscripcional a través de miR398 (Yamasaki y col., 2007), sin embargo, se
140

141
Discusión
desconoce el mecanismo por el que actúa este metal en la expresión de CCS. Se han
descrito en levadura dos factores de transcripción Ace1 y Mac1 (Jungmann y col.,
1993). En condiciones tóxicas de Cu, la proteína Ace1 une cuatro iones de Cu + e induce
la expresión de genes implicados en la detoxificación de Cu (MTs y CuZnSOD) tras
unirse a los elementos de respuesta a metales (MREs, “metal response elements”)
localizados en los promotores de estos genes. Tanto los factores de transcripción como
los elementos cis/trans implicados en esta regulación transcripcional son prácticamente
desconocidos en plantas. Se han identificado las secuencias homólogas de los
promotores de tres genes que codifican para la CuZnSOD de maíz reconocidos por los
factores de transcripción Ace1 (S. cerevisae) y Amt1 (Candida glabrata) (Ruzsa y
Scandalios, 2003). Además, se ha identificado el elemento cis negativo de respuesta a
Cu, GTACT, donde el factor de transcripción PpSBP2 (“squamosa promoter-binding
protein”) se une y reprime la expresión del gen que codifica para la FeSOD
cloroplástica en la planta Barbula unguiculata (Nagae y col., 2008). Se ha postulado
que las plantas pueden contener sensores específicos para metales que detectan cambios
en el nivel de metal como la deficiencia o el exceso, y provocan cascadas de
señalización que activan la respuesta apropiada. En plantas no se han identificado
todavía las vías de transducción de la señal. Se ha descrito la activación de diferentes
vías de proteínas quinasas activadas por mitógeno de M. sativa en respuesta a
concentraciones tóxicas de Cu o Cd (Jonak y col., 2004). Queda por esclarecer si la
activación de la cascada de las MAP kinasas es dependiente del metal o de un efecto
causado por el estrés oxidativo y la reactividad de los grupos tioles provocados ambos
por la concentración elevada de Cu y Cd.
En patata, la expresión del gen CCS se induce por el tratamiento con auxinas y
se inhibe ligeramente por el tratamiento foliar mediante spray con concentraciones altas
de Cu (Trindade y col., 2003). Estos autores atribuyen la ausencia de cambios notables
en la expresión de StCCS por efecto del Cu a la ineficaz penetración del metal a través
de la epidermis de las plantas en el tiempo ensayado. En A. thaliana, la expresión de
este gen se induce por exceso de Cu y en la senescencia (Abdel-Ghany y col., 2005a;
Schiavon y col., 2007). La expresión de los genes CSD1 y CSD2 de Arabidopsis
también se induce en respuesta al exceso de Cu (Abdel-Ghany y col., 2005b). Se han
identificado otros genes involucrados en la homeostasis de Cu en plantas que se inducen
a nivel transcripcional en respuesta a concentraciones altas de Cu: HMA5 (Andrés-Colás
y col., 2006), HMA8 (Bernal M., 2006, Tesis Doctoral, Universidad de Zaragoza),

Discusión
HMA9 (Lee y col., 2007), MTs (Guo y col., 2003) y COX17 (Balandin y Castresana,
2002). También existen en la literatura datos sobre otros genes involucrados en la
homeostasis de Cu en plantas que se reprimen en respuesta a concentraciones altas de
Cu: HMA6, HMA8, FeSOD, Pc y CCH (Schiavon y col., 2007; Abdel-Ghany y col.,
2005b; Lee y col., 2005). Actualmente existen datos con microarrays de expresión
génica en hojas de arroz donde identifican 305 genes que se inducen (genes
relacionados con la defensa frente al estrés) o reprimen (genes relacionados con la
fotosíntesis y el transporte) en respuesta al exceso de Cu (Sudo y col., 2008).
4.2 IDENTIFICACIÓN, LOCALIZACIÓN Y REGULACIÓN DE GmCCS Y
GmCSD2
4.2.1 GmCCS
Mediante western blot se confirmó la presencia de tres polipéptidos en el
estroma de suspensiones celulares y plantas de soja, que según su peso molecular
corresponden probablemente a NSP-GmCCS3 (23 kDa), al monómero de GmCCS (37
kDa) y al trímero de GmCCS (94 kDa). Para confirmar la identidad de estas bandas
obtenidas en el western blot, sería necesario analizarlas mediante MS. NSP-GmCCS1 y
NSP-GmCCS2 no se detectan porque aparte de su bajo peso molecular, no contienen el
péptido contra el que reacciona el anticuerpo. Este posible trímero de GmCCS es la
forma mayoritaria y es estable incluso hirviendo la muestra durante 5 min en tampón
desnaturalizante. En tilacoides de suspensiones celulares y plantas de soja, la única
forma que se detecta es el trímero de GmCCS. Siendo la chaperona GmCCS una
proteína soluble, lo esperable era que se detectara únicamente en el estroma y no se
detectara en el tilacoide. Sin embargo, su presencia en el tilacoide es razonable ya que
su función consiste en suministrar Cu a la enzima CuZnSOD que detoxifica los
radicales superóxido generados de la fotosíntesis en la membrana tilacoidal por el PSI y
que se localiza también en el tilacoide, como se menciona posteriormente. El hecho de
que el trímero de GmCCS sea la única forma que se detecta en el tilacoide podría
sugerir que esta forma es funcionalmente más activa que la forma monomérica y NSP-
GmCCS3 y, por lo tanto, se encuentra en donde más se la necesita, es decir en donde se
produce la mayor cantidad de radicales libres de oxígeno. En la literatura se ha descrito
la existencia de dímeros de la chaperona CCS de levadura con Cu (Schmidt y col.,
142

143
Discusión
1999a) y sin Cu a través de sus dominios II (Lamb y col., 1999), un “cluster” de Cu de
la CCS de humano responsable de la formación de holodímeros a través de sus
dominios III, heterotetrámeros con dos hCuZnSOD a través de sus dominios II (Stasser
y col., 2005, 2007) y un “cluster” de Cu responable de la formación de dímeros y
tetrámeros de la chaperona COX17 de levadura (Heaton y col., 2001).
La expresión de las tres formas de GmCCS detectadas (trímero, monómero y
NSP-GmCCS3) en el estroma de suspensiones celulares de soja se mantiene constante
en respuesta a un exceso de Cu (10 μM), suministrado durante una o varias
generaciones. Este resultado contrasta con el obtenido a nivel de mRNA donde sí que se
observa una fuerte inducción de la expresión de los transcritos GmCCS y NSP-GmCCS3
por efecto del Cu. En maíz, se ha descrito que la expresión de CCS a nivel de mensajero
y de proteína no cambia apenas por el exceso de Cu (Ruzsa y Scandalios, 2003). Por
otro lado, existen datos de proteómica en raíces de Cannabis sativa (Bona y col., 2007),
embriones en germinación de arroz (Zhang y col., 2009) y raíces y hojas de Elsholtzia
splendens (Li y col., 2009), donde identifican las proteínas que se reprimen e inducen en
respuesta al exceso de Cu. La chaperona CCS no se encuentra entre ellas.
4.2.2 GmCSD2
Se han detectado mediante western blot tres isoformas cloroplásticas de
GmCuZnSOD en suspensiones celulares de soja. El peso molecular aparente de estas
isoformas (20-29 kDa) es mayor que el teórico esperado según su secuencia de
aminoácidos, hecho que también ocurre en otros estudios como el publicado por
Srivastava y col. (2009). Mediante ensayo de actividad SOD, técnica menos sensible
que el western blot, se visualizaron sólo dos isoformas de GmCuZnSOD, sin embargo,
cuando se cargó el doble de proteína se visualizó la tercera isoforma. Este resultado
concuerda con la existencia de tres genes diferentes en el genoma de soja secuenciado
recientemente que codifican para la CSD2. Las tres isoformas contienen la secuencia de
aminoácidos del péptido sintético que reconoce nuestro anticuerpo contra la GmCSD2.
Las isoformas de la CuZnSOD identificadas hasta ahora en la literatura son: cinco en
Pinus sylvestris de las cuales cuatro son citosólicas y una es cloroplástica (Streller y
col., 1994), siete en arroz de las cuales dos son cloroplásticas
(http://www.gramene.org), tres en Arabidopsis siendo una citosólica, otra cloroplástica
y otra peroxisomal (Kliebenstein y col., 1998), dos en cebada (Mascher y col., 2005),

Discusión
una en Olea europaea (Butteroni y col., 2005), una en Radix lethospermi (Haddad y
Yuan, 2005), tres en remolacha (Pradedova y col., 2009), tres citosólicas en tabaco
(Sheng y col., 2004) y una cloroplástica en algodón (Hu y col., 2007). Se han
identificado tres isoformas citosólicas y una isoforma cloroplástica de CuZnSOD en
maíz que se inducen por Cu (Ruzsa y Scandalios, 2003), aunque otros autores han
identificado cuatro isoformas cloroplásticas de CuZnSOD en esta misma planta (Mauro
y col., 2005). Esta inconsistencia sobre el número de isoformas de la enzima CuZnSOD
de una misma planta podría ser debida a variaciones fisiológicas por diferencias en las
condiciones de cultivo o desarrollo y/o diferencias genéticas entre variedades. La
existencia de varias isoformas de la CuZnSOD en plantas puede deberse a la presencia
de múltiples genes o a la existencia de modificaciones postraduccionales como la
fosforilación, carboximetilación, eliminación de aminoácidos en el extremo C-terminal
o diferentes estados conformacionales de la proteína. En este sentido, es importante
destacar que han sido identificadas varias isoformas de la MnSOD de patata en
diferentes estados de fosforilación (Bykova y col., 2003).
Las tres isoformas de CuZnSOD detectadas en soja se inducen con Cu, su origen
es cloroplástico y se localizan tanto en el estroma como en el tilacoide. Su presencia en
el tilacoide, además del estroma, como ocurre con la GmCCS, es razonable ya que la
fotosíntesis es la mayor fuente de radicales superóxido, localizada fundamentalmente en
el lado aceptor del PSI (reacción de Mehler). En este sentido, se ha demostrado
mediante la técnica de inmuno-oro que la CuZnSOD cloroplástica de espinaca puede
encontrarse tanto en el estroma de forma soluble como en los tilacoides de forma
asociada a membranas (Ogawa y col., 1995).
La expresión de GmCSD2 se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu de
la misma manera que ocurre a nivel de mRNA. El polipéptido NSP-GmCSD2, en caso
de existir, podría ser detectado con el anticuerpo contra la CuZnSOD de la proteína
entera de cebada, sin embargo, no se detecta en el western blot. Son numerosos los
trabajos publicados donde estudian el efecto del Cu en la expresión de la CuZnSOD. Se
ha descrito en la planta Festuca alta que el Cu induce la expresión de CuZnSOD a nivel
de mRNA y actividad (Lee y col., 2007). Se ha descrito en tabaco que el exceso de Cu
aumenta el nivel de mRNA pero no la actividad de la CuZnSOD cloroplástica (Kurepa
y col., 1997), a diferencia de nuestros resultados en soja, donde se observa inducción
tanto a nivel de mRNA como de proteína. Se ha demostrado que el exceso de Cu induce
la actividad de la CuZnSOD citosólica en raíces de soja (Chongpraditnun y col., 1992).
144

145
Discusión
Se ha descrito un aumento de la actividad CuZnSOD en cultivos celulares de tabaco
tratados con Cu (Bueno y Piqueras, 2002), sin embargo, el Cu no afectó a la actividad
CuZnSOD en hojas de Pisum sativum (Palma y col., 1987). Se ha estudiado el efecto
del exceso de Cu y Cd en hojas de A. thaliana y se ha observado un aumento de la
actividad de los tres tipos de SOD en respuesta a Cu (Drazkiewicz y col., 2004, 2007).
Sorprendentemente, la actividad CuZnSOD es prácticamente indetectable en
nuestras condiciones de crecimiento control (0´1 μM Cu), tanto de suspensiones
celulares como de planta entera de soja en cultivo hidropónico. Abdel-Ghany y col.
(2005b) tampoco detectaron actividad CuZnSOD en plantas de A. thaliana crecidas en
condiciones control (0´1 μM Cu), sin embargo, el exceso de Cu (5 y 50 μM) indujo su
expresión tal y como sucede con nuestros resultados. Cuando analizamos el nivel de
mRNA GmCSD2 en hoja madura control tampoco se detecta el transcrito, sin embargo,
en hoja joven y suspensiones celulares control sí se detecta. En presencia de exceso de
Cu (0´5 μM y 10 μM), la actividad GmCuZnSOD se hace aparente y la GmFeSOD
disminuye. Este resultado concuerda con la inducción por Cu de la expresión del gen y
de la proteína observada mediante RT-PCR y western blot, respectivamente, y
demuestra que existe un balance precisamente regulado entre los distintos tipos de SOD
cloroplásticas, dependiendo de la disponibilidad del ión Cu. Esto quiere decir que la
actividad SOD cloroplástica en nuestras condiciones de cultivo control corresponde casi
exclusivamente a la enzima FeSOD. Por todo ello, se podría sugerir que la ausencia de
actividad CuZnSOD cloroplástica no es un marcador de deficiencia de Cu en soja, ya
que tanto las suspensiones celulares como las plantas de soja control crecieron bien y no
mostraron ningún síntoma de deficiencia en nuestras condiciones de cultivo. Sin
embargo, se ha postulado el uso potencial como marcadores del status de Cu en las
plantas de los transcritos y proteínas Pc, FeSOD, CuZnSOD cloroplástica y CuZnSOD
citosólica, los cuales son sensibles a la disponibilidad de Cu (Cohu y Pilon, 2007).
Recientemente, se ha descrito un papel como marcador del status de Cu para el
transcrito de CCS en humano (Olivares y col., 2008) y la proteína de esta chaperona en
ganado (Hepburn y col., 2009).
La nula o escasa actividad CuZnSOD detectada en soja crecida en condiciones
control podría sugerir, por un lado, que esta enzima es más importante en la
homeostasis del Cu comparado con la respuesta al estrés oxidativo y, por otro lado, que
la chaperona GmCCS podría tener otras funciones aparte de transportar Cu a la
CuZnSOD. Esta segunda hipótesis se apoyaría en el hecho de que ambas proteínas,

Discusión
GmCSD2 y GmCCS, estén reguladas por Cu de manera diferente a pesar de que se
supone que su metabolismo está íntimamente ligado. En A. thaliana se ha descrito que
cuando la concentración de Cu es baja, los niveles de mRNA, proteína y actividad de la
FeSOD aumentan notablemente, mientras que los niveles de las CuZnSOD cloroplástica
y citosólica son prácticamente indetectables, lo que provoca a su vez un descenso en la
expresión de su chaperona CCS (Abdel-Ghany y col., 2005b). Esta regulación
coordinada de genes nucleares se dirige probablemente al uso óptimo de Cu en el
cloroplasto y sugiere que los niveles de Cu en el estroma y citosol regulan la expresión
nuclear a través de vías de señalización desconocidas actualmente (Pilon y col., 2006).
Recientemente, se ha descubierto un miRNA, miR398, que media esta regulación en A.
thaliana, degradando el mRNA de las CuZnSOD citosólica y cloroplástica cuando la
concentración de Cu es limitante (0´2-0´5 μM) (Yamasaki y col., 2007). Este miR398 de
Arabidopsis regula también al mRNA de COX5b.1, un gen nuclear que codifica para la
subunidad 5b de la Cit c oxidasa mitocondrial (Jones-Rhoades y Bartel, 2004). La
expresión de miR398 se reprime transcripcionalmente por estreses oxidativos como el
generado por el Cu, lo que conlleva a una acumulación de los transcritos de las
CuZnSOD cloroplástica y citosólica incrementando, así, la tolerancia de la planta a este
metal (Sunkar y col., 2006). La sacarosa induce la expresión de miR398, lo que provoca
una disminución de los mensajeros de las CuZnSOD cloroplástica y citosólica así como
la concentración de las proteínas correspondientes (Dugas y Bartel, 2008). Estos
mismos autores publican un alineamiento de la secuencia complementaria de miR398
con la secuencia de los transcritos CSD1 y CSD2 de varias plantas entre las que se
encuentra la soja. Además, describen una función adicional para miR398 como represor
de la traducción aparte de la degradación del mRNA (Dugas y Bartel, 2008). Otros tres
miRNAs adicionales han sido descritos en Arabidopsis (miR397, miR408 y miR857)
que reconocen y degradan los transcritos de las cuproproteínas plantacianina y varias
lacasas (Abdel-Ghany y Pilon, 2008). En general, se propone a los miRNAs como
reguladores importantes de la respuesta frente al estrés abiótico en plantas (Lu y Huang,
2008). Recientemente, se ha descrito en Arabidopsis la existencia de la proteína SPL7
(squamosa promoter binding protein-like-7) la cual tiene un dominio SBP con el que se
une al dominio GTAC del promotor de miR398 activando, así, la transcripción de este
miRNA. SPL7 también activa la transcripción de otros miRNAs (miR397, miR408 y
miR857), transportadores de Cu (COPT1, COPT2, ZIP2, FRO3 y YSL2) y la chaperona
CCH, jugando un papel central en la regulación de la homeostasis de Cu en
146

147
Discusión
Arabidopsis, principalmente en respuesta a la deficiencia de Cu (Yamasaki y col.,
2009).
En resumen, la regulación tanto a nivel transcripcional como postranscripcional
de CCS y CSD2 de soja por “splicing” alternativo y Cu sugiere que esta regulación es
esencial en el control de la homeostasis de Cu en el cloroplasto. Según el modelo de
regulación de la homeostasis de Cu en el cloroplasto propuesto por Abdel-Ghany y col.
(2005a; b), debe existir un equilibrio entre el mecanismo de transporte y distribución de
Cu a las cuproproteínas cloroplásticas para que el proceso fotosintético sea óptimo. Es
decir, debe existir un equilibrio entre la actividad de la Pc en el lumen tilacoidal y las
actividades de las superóxido dismutasas (CuZnSOD y FeSOD) en el tilacoide y
estroma cloroplásticos, asegurando así un nivel adecuado de Pc para que el PSI pueda
reducirse y una actividad superóxido dismutasa suficiente como para poder eliminar los
radicales O - 2 generados en la cadena de transporte electrónico fotosintético. El buen
funcionamiento de este equilibrio estaría regulado por la inducción o represión selectiva
de la FeSOD y CuZnSOD, y por la regulación de la cuprochaperona CCS cloroplástica
en respuesta a Cu.
Recientemente, se ha propuesto en Arabidopsis un mecanismo alternativo de
transporte de Cu al cloroplasto a través de otros transportadores de baja afinidad. Así, el
Cu 2+ podría entrar en la célula a través de un transportador de la familia YSL para ser
transportado posteriormente al estroma cloroplástico a través del transportador HMA1
(Seigneurin-Berny y col., 2006), localizado en la membrana interna del cloroplasto que
interaccionaría con la proteína soluble CUTA (Burkhead y col., 2003) del espacio
intermembrana. También mediante un mecanismo similar, HMA1 podría ser el
encargado de suministrar Cu 2+ , e incluso Zn 2+ , a la CuZnSOD (Pilon y col., 2006).
También se ha descrito un segundo mecanismo por el que la CuZnSOD de mamíferos y
Caenorhabditis elegans puede adquirir Cu a través de una vía independiente de CCS
que utiliza glutatión (Carroll y col., 2004; Jensen y Culotta, 2005). Este mecanismo u
otro similar podría explicar la falta de un fenotipo severo en los mutantes sin CCS de
Arabidopsis (Chu y col., 2005). El responsable del transporte de Cu 2+ al transportador
tilacoidal HMA8 también permanece sin identificar. En el tilacoide, este mecanismo de
transporte alternativo podría explicarse en base al estudio realizado por Shingles y col.
(2004). Estos autores propusieron la existencia de al menos dos transportadores de Cu
en la membrana tilacoidal y sugirieron que podrían pertenecer a la familia HMA y/o a la
familia ZIP. A día de hoy, uno de ellos sería el transportador HMA8 (PAA2)

Discusión
identificado en A. thaliana (Abdel-Ghany y col. 2005b) y soja (Bernal y col., 2007), sin
embargo quedaría al menos otro transportador por identificar. Todo esto nos indica que
aún existen muchos aspectos desconocidos de la homeostasis del Cu en el cloroplasto.
4.3 SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE GmCCS
Se ha sobreexpresado en E. coli DH5α la chaperona CCS de suspensiones
celulares de soja. La presencia de un exceso de Cu y Zn en el medio de inducción
favoreció la expresión de una mayor cantidad de proteína de fusión MBP-His6-GmCCS.
Este incremento puede ser debido a un mecanismo de regulación transcripcional, donde
los metales podrían activar a factores de transcripción del gen que codifica para la
proteína de fusión o a un mecanismo de regulación postranscripcional, donde los
metales que funcionan como cofactores de la CCS estabilizarían el plegamiento de la
proteína de fusión. Las concentraciones de Cu y Zn utilizadas fueron las mismas que
utilizaron anteriormente Stasser y col. (2005) para expresar la CCS de humano (hCCS),
es decir 0´5 mM para cada metal. Estos autores explican que si se expresa hCCS
añadiendo sólo Cu al medio de inducción, se obtiene una proteína purificada con un alto
contenido en Cu 2+ que hay que reducir posteriormente con ditionito y dializar a
continuación para eliminar los iones de Cu 2+ unidos inespecíficamente (Eisses y col.,
2000). Afirman que la adición de Zn 2+ al medio de inducción evita la necesidad de
reducir posteriormente la proteína purificada. Existen otros estudios en la literatura
donde añaden los metales Cu y Zn en exceso al medio de inducción para sobreexpresar
la proteína recombinante. Así, Ahl y col. (2004) añaden 3 mM Cu 2+ y 30 μM Zn 2+ para
coexpresar la chaperona CCS de levadura (yCCS) junto a la enzima hCuZnSOD.
Srivastava y col. (2009) añaden 500 μM Cu 2+ y 100 μM Zn 2+ para expresar la enzima
CuZnSOD de Populus.
Se ha purificado la chaperona GmCCS recombinante con gran pureza. En el gel
donde se analizó la muestra purificada, se observaron dos bandas de tamaño ligeramente
diferente, ambas identificadas como GmCCS mediante análisis MALDI-TOF y western
blot. El resultado de la secuenciación del extremo N-terminal de la banda inferior indica
que está formada por una mezcla de péptidos de masas parecidas, los cuales
corresponden a la proteína GmCCS con el péptido señal digerido en puntos muy
próximos pero diferentes. El hecho de que estas formas ya se encuentran presentes en el
148

149
Discusión
extracto bacteriano sugiere que la hipótesis más probable sea que las proteasas
endógenas de E. coli son las responsables de estas digestiones. Estas proteasas
reconocen al péptido señal de la proteína y lo cortan aunque no tan específicamente
como lo hacen las proteasas del cloroplasto, de ahí que se obtenga una mezcla de varios
péptidos muy parecidos. Sólo existe un artículo en la literatura donde se publica la
expresión y purificación de la CCS recombinante de plantas, en concreto de la CCS de
tomate (LeCCS) (Zhu y col., 2000) aunque el estudio es mucho menos detallado.
4.4 CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE LA GmCCS
RECOMBINANTE PURIFICADA
En este trabajo se ha caracterizado espectroscópicamente la proteína
recombinante pura apo-GmCCS. La chaperona se obtuvo en forma plegada y “activa”
(se dice que la apoproteína es activa cuando mantiene su capacidad de unir metales de
transición). Para analizar la unión a metal y su estequiometría se han utilizado las
técnicas de absorción electrónica UV-Vis (Cu + , Zn 2+ y Co 2+ ), fluorescencia (Cu + ) y
dicroísmo circular (Cu + ). Para ello hemos seguido las especificaciones técnicas descritas
en Eren y col. (2007), donde caracterizan el dominio N-terminal del transportador
HMA2 de Arabidopsis. Los datos obtenidos de las titulaciones sugieren que esta
proteína es capaz de unir los tres metales analizados, Cu + , Zn 2+ y Co 2+ . En base a los
valores obtenidos de las Kd, se propone que GmCCS presenta un sitio con alta afinidad
y otro sitio con menor afinidad de unión a Cu + . Por otro lado, los datos sugieren que la
proteína posee un sitio de unión a Zn 2+ de menor afinidad que en el caso del Cu + y
estaría situado probablemente en el dominio II de GmCCS, homólogo a la enzima
CuZnSOD. La estequiometría publicada para la CCS de levadura y de humano es de dos
moles de Cu + y un mol de Zn 2+ por mol de proteína (Schmidt y col., 1999a; Eisses y
col., 2000; Lamb y col., 2000; Rae y col., 2001; Stasser y col., 2005). El dominio II de
la chaperona contendría un átomo de Zn 2+ y otro de Cu + con funciones estructurales, y
el segundo átomo de Cu + con función catalítica estaría unido a los dominios I y III de la
chaperona, siendo el único átomo que se transfiere, dejando el sitio de unión vacío y
disponible para comenzar otro ciclo catalítico (Schmidt y col., 1999a; Eisses y col.,
2000; Lamb y col., 2000; Rae y col., 2001). Sin embargo, estudios recientes en humano
afirman que un átomo de Cu + está unido al dominio I y el segundo átomo de Cu + al

Discusión
dominio III, formando éste último un “cluster” de Cu con el dominio III de otro
monómero de hCCS dando lugar, así, al holodímero. A continuación, se uniría una
hCuZnSOD a cada uno de los dominios II de ambos monómeros de hCCS para formar
el heterotetrámero (Stasser y col., 2005, 2007). A pesar de la existencia de estructuras
cristalinas disponibles para la CCS (Lamb y col., 1999, 2000), la CuZnSOD (Djinovic y
col., 1992; Banci y col., 2003) y el heterodímero CCS-CuZnSOD (Lamb y col., 2001)
de levadura, todavía no se conocen en detalle los mecanismos funcionales del
reconocimiento y la transferencia de Cu entre ambas proteínas.
Los porcentajes de estructura secundaria obtenidos a partir del espectro de
dicroísmo circular son muy similares a los obtenidos a partir del modelado de la
estructura de la chaperona GmCCS. El contenido de estructura desordenada es
sorprendentemente alto, indicando que la GmCCS con sus tres dominios diferentes es
muy poco compacta. En plantas, aún no hay datos estructurales disponibles. En un
futuro, nuestro laboratorio pretende abordar la cristalización de la proteína purificada
GmCCS para posteriores estudios de estructura/función.
4.5 BÚSQUEDA DE UNA HIPOTÉTICA cpCCS EN SOJA
Como un trabajo colateral de esta Tesis Doctoral, hemos buscado en soja el
homólogo de la hipotética cpCCS cloroplástica (AY303948) descrita en Arabidopsis e
implicada en el transporte de Cu entre HMA6/PAA1 (envuelta del cloroplasto) y
HMA8/PAA2 (tilacoide). Tottey y col. (2002) identificaron y caracterizaron una
chaperona ATX1 que realizaba esta función en Synechocystis. Para ello, se diseñaron
cebadores degenerados a partir de las secuencias de los genes que codifican para cpCCS
(AY303948) y AtATX1 (AK220937), los cuales fueron utilizados con un programa de
RT-PCR especial. La secuencia amplificada y clonada no presentó homología con la de
cpCCS ni codificó para ninguna proteína relacionada con la homeostasis del Cu. Por lo
tanto y a pesar de los datos no confirmados en Arabidopsis (Abdel-Ghany y col.,
2005b), seguimos a la búsqueda de una posible chaperona que realiza esta función de
transportar Cu desde HMA6 hasta HMA8 en cloroplastos de plantas. Sin embargo, la
existencia de esta hipotética chaperona no está garantizada, y otros mecanismos podrían
ser los responsables de la adquisición de Cu por el transportador HMA8 del tilacoide.
150

CONCLUSIONES

5 CONCLUSIONES
153
Conclusiones
1. El gen GmCCS está regulado por un mecanismo de “splicing” alternativo con
retención de intrón que genera 4 transcritos (GmCCS, NSP-GmCCS1, NSP-
GmCCS2 y NSP-GmCCS3) en suspensiones celulares y 3 transcritos (GmCCS,
NSP-GmCCS2 y NSP-GmCCS3) en planta entera de soja. Estos transcritos se
expresaron en todos los tejidos analizados: hoja joven, hoja madura, tallo, raíz y
flor. La expresión del gen se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu en
el medio.
2. El gen GmCSD2 está regulado por un mecanismo de “splicing” alternativo con
retención de intrón que genera 2 transcritos (GmCSD2 y NSP-GmCSD2), tanto
en suspensiones celulares como en planta entera de soja. Estos transcritos se
expresaron en todos los tejidos analizados: hoja joven, hoja madura, tallo, raíz y
flor. La expresión del gen se induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu en
el medio.
3. A nivel de proteína, la expresión de GmCCS se mantiene constante en respuesta
al exceso de Cu. La chaperona se encuentra formando mayoritariamente
estructura oligomérica en forma posiblemente de trímeros, aunque la forma
monomérica y NSP-GmCCS3 también se detectan en suspensiones celulares y
planta entera de soja. El trímero se localiza tanto en el estroma como en el
tilacoide y es estable incluso hirviendo en condiciones desnaturalizantes,
mientras que las otras dos formas se encuentran únicamente en el estroma.
4. La expresión de la enzima GmCuZnSOD es indetectable en las suspensiones
celulares y plantas de soja crecidas en condiciones control pero su expresión se
induce fuertemente en respuesta al exceso de Cu. Se han detectado tres
isoformas de la GmCuZnSOD cloroplástica que se localizan tanto en el estroma
como en la membrana tilacoidal.

Conclusiones
5. Se ha purificado la proteína recombinante GmCCS de suspensiones celulares de
soja con un alto grado de pureza. La preparación es una mezcla de la proteína
con y sin el péptido señal, posiblemente digerido por las propias proteasas
endógenas de la bacteria recombinante.
6. La proteína GmCCS recombinante pura se obtiene como apo y es activa ya que
se ha demostrado que une dos moles del ión Cu + y un mol del ión Zn 2+ por mol
de proteína. La chaperona presenta un sitio con alta afinidad y otro con menor
afinidad de unión a Cu + , además posee un sitio de unión a Zn 2+ de menor
afinidad que los del Cu + . No se observaron cambios significativos en su
estructura secundaria por efecto del Cu, lo que indica que se purifica en forma
plegada.
7. Se ha buscado sin éxito la hipotética cpCCS que transporta Cu desde HMA6
(envuelta) hasta HMA8 (tilacoide) en soja.
154

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6 BIBLIOGRAFÍA
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