Baktericidní test
Baktericidní test
Baktericidní test
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Imunologické metody – fagocytóza, stanovení<br />
oxidačního metabolismu, chemiluminiscence,<br />
baktericidní <strong>test</strong>
Fagocytóza<br />
Jeden z evolučně nejstarších obranných mechanismů<br />
Součást přirozené imunity<br />
Schopnost buněk imunitního systému pohlcovat, usmrcovat a<br />
rozkládat mikroorganismy (u živých)<br />
Schopnost rozpoznat cizorodou částici, navázat se a pohltit ji<br />
Fagocytující buňky - neutrofily, eosinofily, monocyty, makrofágy
Fagocytóza jako mnohastupňový<br />
proces<br />
Interakce mezi fagocytujícími buňkami a endotelem<br />
Adhezní molekuly<br />
Chemotaxe s účastí chemoatraktantů<br />
Ingesce – pohlcování částic , > 0,5um<br />
Nitrobuněčné zabíjení<br />
Mechanismy zabíjení nezávislé na kyslíku a závislé na<br />
kyslíku (NADPh oxidázový komplex)
Vrozené poruchy fagocytózy<br />
Imunitní nedostatečnost<br />
Primární poruchy – geneticky podmíněné – nízká<br />
incidence 1:100000-1:1000000<br />
Sekundární poruchy<br />
Poruchy v počtu granulocytů (retikulární dysgeneze)<br />
Poruchy funkce granulocytů – LAD syndrom (Leukocyte<br />
Adhesion Deficency, mutace genu pro podjednotku beta<br />
CD18)
Poruchy fagocytózy<br />
Poruchy chemotaxe<br />
Poruchy ingesce<br />
Poruchy tvorby granulí neutrofilních<br />
granulocytů ( Chediak-Higashiho sy, poruchy<br />
myeloperoxidázy)
Fagocytóza – princip metody (<strong>test</strong>y postihující<br />
pohlcení)<br />
Substráty<br />
MSHP – hydroxyetylmetakrylátové partikule<br />
Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans<br />
MSHP – hydrofilní charakter částic (omezení nespecifické<br />
adherence), standardní velikost 1um (nízká spontánní<br />
agregace)<br />
Inkubace s plnou krví 1 hodinu při 37C, po inkubaci nátěr<br />
na podložní sklo , fixace , obarvení a počítání ve světelném<br />
mikroskopu<br />
Hodnocení určitého počtu buněk, pozitivní obsahují 3 a více<br />
partikulí.
Fagocytóza – technické podmínky a<br />
hodnocení<br />
Čerstvá krev s heparinem (zpracování do 2 hodin po<br />
odběru)<br />
EDTa – vyvázání kalciových iontů<br />
Třepání, nátěry<br />
Omezená výpovědní hodnoty v rutinní klinické praxi<br />
Toxikologie, farmakologie<br />
Termostat, třepačka, světelný mikroskop, event. průtokový<br />
cytometr
<strong>Baktericidní</strong> <strong>test</strong><br />
Screeningová metoda<br />
Rozdílné mikrobicidní systémy s druhovou specificitou mikroba<br />
Substrát – živý mikroorganismus!!!<br />
Candida albicans, Staph.aureus, pseudomonády<br />
Vyšetření z plné krve nebo na izolovaných granulocytech<br />
Vitální barvení kandid trypanovou modří, živé kandidy mají<br />
schopnost trypanovou modř eliminovat<br />
Staphylokok – očkování na plotny a počítání kolonií nebo<br />
průtoková cytometrie s barvením přežívajících mikroorganismů
<strong>Baktericidní</strong> <strong>test</strong> – technická úskalí<br />
Obtížná standardizace<br />
Heparinová krev, teplota zpracování, časový limit pro<br />
zpracování<br />
Substrát – mikrobiologická laboratoř , různá citlivost<br />
kmenů, pasážování kmenů<br />
Uplatnění – v rutinní diagnostice omezené, více ve<br />
výzkumu<br />
Technické vybavení – třepačka, termostat, sterilizátor,<br />
mikroskop, průtokový cytometr
Testy oxidačního metabolismu<br />
Testujeme schopnost granulocytů tvořit kyslíkové radikály<br />
aktivací NADPH oxidázy<br />
NBT - nitroblue-tetrazolium chlorid<br />
INT – iod-nitroblue tetrazolium<br />
Schopnost granulocytů redukovat bezbarvé tetrazoliové soli na<br />
barevné formazány<br />
Kyslíkový metabolismus, zabíjení stafylokoků, enterokoků, kandid<br />
Sklíčkový <strong>test</strong> – optický mikroskop , pozitivní buňky jsou s<br />
modrými skvrnami ( redukovaný formazán)<br />
Mikrotitrační destičky s fotometrickým odečtem<br />
Klinické koreláty – chronická granulomatozní choroba<br />
Zpracování do 2 hodin po odběru
Chemiluminiscence<br />
Měření chemiluminiscenční aktivity fagocytů<br />
Kvantitativní sledování oxidačního vzplanutí<br />
Redukce molekulárního kyslíku na superoxid a následně peroxid<br />
vodíku<br />
Peroxid vodíku je substrátem pro myeloperoxidázovou reakci s<br />
emisí fotonů a chemiluminiscencí fagocytů<br />
Pro chemiluminiscenci je stimulem phorbol-myristát-acetát, který<br />
aktivuje proteinkinázu C a následně NADPH oxidázu<br />
Chemické světlo se zesiluje akceptací fotonů luminolem<br />
Spontánní aktivita a aktivita stimulovaných fagocytů<br />
Chemiluminiscenční analyzátor<br />
Hodnotí se vrchol odpovědi a čas nezbytný k jeho dosažení
Chemiluminiscence – technické podmínky,<br />
uplatnění <strong>test</strong>u<br />
Čas zpracování , teplota při zpracování 37C, koncentrace<br />
granulocytů, diferenciál krevního obrazu<br />
Širší uplatnění ve srovnání s NBT <strong>test</strong>em<br />
Poruchy NADPH v oxidázovém a myeloperoxidázovém<br />
systému<br />
Klinický korelát – chronická granulomatóza<br />
Farmakologie<br />
Chemiluminometr, průtokový cytometr
Change language