Frakce bílkovin metodou podle Kjeldahla

Návody pro Laboratoře oboru (N352014)
Analýza bílkovin
1. Frakce bílkovin metodou podle Kjeldahla
Princip metody dle Kjeldahla
Pro stanovení obsahu bílkovin v mléce a mlékárenských výrobcích převažuje stále
základní mineralizace dle Kjeldahla s různým stupněm mechanizace a automatizace. Všechny
tyto metody zachovávají třístupňový analytický postup: mineralizace, destilace, titrace.
Mineralizace vzorků mléka se provádí v digesčních zkumavkách (trubicích), které se vkládají
do elektricky vyhřívaných bloků různé konstrukce. Tyto bloky dovolují zlepšit podmínky
mineralizace. Přidá se 10 ml koncentrované H2SO4, tableta katalyzátoru (K2SO4+CuSO4) a
10 ml H2O2 . Mineralizační bloky umožňují současnou mineralizaci až 20 vzorků mléka,
regulovaný postupný záhřev až na mineralizační teplotu 420 °C a tím i snížení rizika pěnění
vzorku.
Destilace amoniaku probíhá v destilační jednotce klasickým způsobem přeháněním
vodní parou. Dávkování činidel (roztok hydroxidu sodného, jímací roztok), průběh destilace
je řízen automaticky. Vzorek neředěného zmineralizovaného mléka v digesční trubici se vloží
do destilační jednotky a uvede se do chodu. Automaticky se nadávkuje příslušné množství
40% hydroxidu sodného a zapne se generátor páry. K úplnému vydestilování amoniaku
z mineralizátoru dojde zhruba za 2 až 4 minuty. Vodní pára s vydestilovaným amoniakem
kondenzuje v chladiči a destilát stéká do předlohy, která obsahuje 1% kyselinu boritou s
indikátorem (bromkresolová zeleň a metylčerveň). Po ukončení destilace následuje
automatická titrace 0,1mol.l -1 HCl.
Varianta a) Příprava vzorku sýrů - hodnocení zrání
Celkový obsah dusíku
Sýr se nastrouhá na struhadle, aby došlo k jeho homogenizaci. Do homogenizační nádobky
(mixeru) se naváží 15 g sýra (n1), přidá 75 g 0,5 mol.l -1 citrátu trisodného (odvážit diferenčně
pomocí odměrného válce = n2) a homogenizuje se při maximálních otáčkách 10 minut.
Suspenze se přelije do Erlenmayerovy baňky na 100 ml se zábrusem a temperuje se 1 hodinu
při 40 °C na magnetickém míchadle s kontrolou teploty. Do předvážené odměrné baňky na
200 ml (V1) se odváží pomocí pipety 60 g (n3) citrátové disperze a po ochlazení se doplní
1

destilovanou vodou. Z disperze se odpipetuje 2 x 15 ml (V2) do digesčních trubic pro
stanovení celkového obsahu dusíku a asi 2 ml vzorku se odeberou na separaci bílkovin
pomocí HPLC.
Spotřeba 0,1mol.l -1 HCl = aTN (ml) - dodá vedoucí úlohy po analýze vzorku
Přesná koncentrace 0,1mol.l -1 HCl (cHCl)- dodá vedoucí úlohy
Výpočet: sestavte vztah pro výpočet obsahu celkového dusíku (%hm) a předložte vedoucímu
úlohy ke kontrole.
Frakce rozpustná při pH 4,5
Do odměrné baňky na 100 ml se odpipetuje 80 ml citrátové disperze (V3) a 5 minut temperuje
za intenzivního míchání v ledové vodní lázni na 10 – 12 °C. Změří se pH, pomocí 1M HCl se
upraví do rozmezí 4,35 – 4,55 a doplní destilovanou vodou na 100 ml (V4). Vzniklá sraženina
se odfiltruje přes filtr s označením 390 (pokud není filtrát čirý, filtrace se opakuje).
Ke stanovení se odpipetuje 2 x 15 ml filtrátu (V5). Na separaci bílkovin se opět odebere asi 2
ml filtrátu.
Spotřeba 0,1mol.l -1 HCl = aTN (ml) - dodá vedoucí úlohy po analýze vzorku
Přesná koncentrace 0,1mol.l -1 HCl (cHCl)- dodá vedoucí úlohy
Výpočet: sestavte vztah pro výpočet obsahu dusíku rozpustného při pH 4,6 a předložte
vedoucímu úlohy ke kontrole.
Varianta b) Příprava vzorku mléka - hodnocení tepelné denaturace
Tepelné (kaseinové) číslo vyjadřuje poměr obsahu dusíku kaseinu a denaturovaných
syrovátkových bílkovin (bílkovin vysrážených při pH 4,6) k celkovému obsahu dusíku
stanoveném metodou dle Kjeldahla.
14 g plnotučného nebo polotučného sušeného mléka nebo 10 g sušeného odstředěného
mléka se rozpustí ve 100 ml destilované vody (40°C). Pasterované nebo UHT mléko se
analyzuje přímo. Odpipetuje se 5 ml do zkumavky ke stanovení celkového obsahu dusíku
(metodou dle Kjeldahla) a 5 ml do kádinky (150 ml) pro izolaci kaseinu.
Mléko v kádince se zředí 75 ml destilované vody (40°C), přidá se 1 ml 10%ní kyseliny
octové a obsah se promíchá tyčinkou. Po deseti minutách se přidá 1 ml roztoku octanu
sodného (34,02 g trihydrátu octanu sodného doplnit na 250 ml destilovanou vodou) a obsah
se promíchá. Kádinka se umístní na 45 minut do lednice, pak se přidá 13 ml vody, obsah se
2

opět promíchá a po 15 minutách se filtruje přes filtrační papír o střední hustotě předem
smočený promývacím roztokem (6 ml 10%ní kyseliny octové a 14 ml roztoku octanu sodného
doplnit na 1000 ml, zkontrolovat pH, případně upravit na hodnotu 4,8 ± 0,05). Filtrát musí
být čirý. Pomocí promývacího roztoku převést kvantitativně obsah kádinky na filtrační papír.
Sraženinu třikrát promýt. Filtrační papír se sraženinou vložit do zkumavky ke stanovení
obsahu dusíku (metodou dle Kjeldahla). Do třetí zkumavky se vkládá samotný filtrační papír.
Vyhodnocení:
Tepelné číslo se vypočte ze spotřeb HCl při stanovení dusíku :
V V
H
V
S P
3
C
100
kde V S spotřeba při stanovení dusíku ve sraženině [ml]
V P spotřeba při stanovení dusíku v samotném filtračním papíru [ml]
V C spotřeba při stanovení celkového obsahu dusíku v mléce [ml]
Opakovatelnost: 1,2 %
Určení třídy tepelného ošetření sušeného mléka:
tepelný ohřev před sušením WPNI tepelné číslo [%]
nízký více než 6 mg / g 80,0 nebo méně
střední 4,5 - 5,9 mg / g 80,1 -83,0
středně vysoký 1,5 -4,4 mg / g 83,1 - 88,0
vysoký méně než 1,5 mg / g 88,1 nebo více
Příprava vzorku syrovátky pro HPLC (modifikace předchozího postupu s menším
ředěním; Vasbinder a Kruif, 2003):
0.4 g mléka ve 2 mL Eppendorf. zkumavce se smíchá s 0,8 g destilované vody v bloku
(40 °C), přidá se 40 μL 10% kyseliny octové, po promíchání a 10 min stání při laboratorní
teplotě se přidá 40 μL (1 mol.l -1 ) octanu sodného a 0,72 g destilované vody. Po promíchání a
1 h stání se odstředí 5 min při 3000 g. Supernatant se přefiltruje přes 0,22 μm PVDF filtr do
vialky.
2. Separace bílkovin pomocí RP – HPLC
Vzorky odebrané z obou frakcí sýrů nebo syrovátky se přefiltrují přes mikrofiltr 0,22 μm
PVDF do vialek. Pro separaci bílkovin pomocí RP – HPLC se využívá polymerní kolona
PLRP-S s nástřikem 20 μl a UV detektor firmy TPS s nastavenou vlnovou délkou 214 nm.
Jako mobilní fáze A je použit roztok 0,1% kyseliny trifluroctové (TFA) v ultračisté vodě, jako

mobilní fáze C 0,1% roztok TFA ve směsi acetonitril:ultračistá voda (80:20) a využívá se
gradientové eluce.
3. Stanovení volných aminoskupin spektrofotometricky
Princip metody
Při reakci primárních aminoskupin s o-ftaldialdehydem (OPA) za přítomnosti N-acetyl-L-
cysteinu (NAC) vzniká 1-alkylthio-2-alkylisoindol, který absorbuje při vlnové délce 335 nm.
Příprava vzorku
OPA činidlo se připraví smísením 0,04 g OPA rozpuštěného v 1 ml methanolu, 40 ml
NA2B4O7 (0,1 mol l -1 , pH = 9,55), 2,5 ml SDS (20 %hm), 0,05 g NAC rozpuštěného v malém
množství destilované vody a doplněním na objem 50 ml destilovanou vodou. Takto
připravené činidlo se nechá stát 1 hodinu.
Pro kalibraci se připraví roztoky kyseliny glutamové o koncentracích 0 – 0,16 mmol l -1 , které
se následně proměří na spektrofotometru při vlnové délce 335 nm.
Citrátový výluh (celkový dusík sýra) se zředí 1:1 destilovanou vodou, frakce rozpustná při pH
4,6 se neředí. Mléko se ředí vodou 1:5, ze sušené syrovátky se připraví 7% roztok a nechá se
minimálně 1 hodinu stát.
Poté se smíchá 0,2 ml vzorku a 1 ml SDS (1 %), po 15 minutách se smíchá 0,3 ml této směsi
s 2 ml demi vody. Tímto je vzorek připraven na stanovení volných aminoskupin. Pro samotné
měření vzorku do plastové kyvety napipetuje 1 ml OPA činidla a 1 ml připraveného vzorku.
Obsah kyvety se promíchá a po 12 minutách se proměří absorbance proti slepému pokusu
(místo vzorku se přidá destilovaná voda). Pokud je absorbance mimo kalibrační rozmezí je
nutné ředění vzorku upravit.
4

4. Titrační kyselost a formolová titrace
Titrační kyselost
50 ml vzorku se titruje 0,25 mol l -1 roztokem NaOH za přídavku 2 ml 2% roztoku
fenolftaleinu do slabě růžového zabarvení, které má srovnávací roztok 50 ml vzorku + 1 ml
5% roztoku CoSO4.H2O. Zabarvení má vydržet 1 min.
Výsledek se vyjádří: buď jako číslo spotřebovaných ml 0,25mol.l l -1 NaOH na 100 ml vzorku,
což je vyjádření dle Soxhlet - Henkela (SH): SH= b . 2 . c / 0,25
1
b * c * 1000
či jako látkový obsah kyselin v: mmol l
a
kde: a = množství vzorku, použité k titraci, ml
b = spotřeba přesně 0,25 mol l -1 NaOH při titraci 50 ml vzorku,
c = koncentrace standardního roztoku, mol.l-1 (zde je 0,25)
Příprava 0,25 mol.l -1 NaOH
Pro přípravu 1 L roztoku se naváží 10,20 g NaOH a rozpustí se v čerstvě převařené
destilované vodě a doplní se na 1 l.
Přesná koncentrace se stanoví pomocí 0,125 mol.l -1 roztoku kyseliny šťavelové
(C2H2O4.2H2O; MW 126,07). S přesností 0,0002 g se naváží 7,87938 g, rozpustí se
v převařené vodě a doplní se do 500 ml. Do titrační baňky se odpipetuje 20 ml roztoku
kyseliny šťavelové, přidají se 2-3 kapky 2% roztoku fenolftaleinu v ethanolu a titruje se
NaOH do růžového zbarvení.
Formolová titrace
Princip metody
Podstatou metody je titrace volných -COOH skupin aminokyselin po reakci neutralizovaného
mléka za přídavku formaldehydu za podmínek metody. Metoda je použitelná pouze pro mléka
s kyselostí do 9 SH (9 ml NaOH, 0,25 mol . l-1). Metody může být využito i ke sledování
proteolytických změn bílkovin u různých mléčných výrobků. Byly vypracovány různé
modifikace metody (dle Schulze, Pyneho či Steinegera). Liší se především použitým
množstvím mléka a koncentrací standardního roztoku NaOH při titraci.
Postup dle Steinegera
K 50 ml nebo 25 ml mléka se přidá 2 ml 2% fenolftaleinu a roztok se titruje 0,25M roztokem
NaOH do růžového zbarvení (tzn. provádí se stejně jako stanovení titrační kyselosti dle SH).
5

Pak se přidá 5 ml 30 % formaldehydu čerstvě zneutralizovaného na fenolftalein, promíchá a
ponechá 2 min stát. Následuje neutralizace uvolněných -COOH louhem stejné koncentrace do
růžového zbarvení. Spotřeba při druhé titraci přepočtená na 100ml vzorku se nazývá
aldehydové číslo.
1 stupeň aldehydový odpovídá 0,0758 g dusíku.
Celkový obsah bílkovin se získá násobením faktorem 6,38.
6