Elektromigrační metody na nosičích
Elektromigrační metody na nosičích
Elektromigrační metody na nosičích
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>Elektromigrační</strong> <strong>metody</strong><br />
Princip:<br />
molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém<br />
Arne Tiselius rozdělil proteiny krevního séra <strong>na</strong> základě jejich<br />
rozdílných rychlostí pohybu v elektrickém poli (Nobelova ce<strong>na</strong> 1948)
molekuly nesoucí náboj se pohybují ve stejnosměrném elektrickém<br />
rychlost pohybu dá<strong>na</strong>:<br />
• celkovým nábojem <strong>na</strong> molekule<br />
• tvarem<br />
• hmotností<br />
• odporem okolního prostředí<br />
Rychlost částice kulového tvaru nesoucí náboj q je v elektrickém<br />
poli E dá<strong>na</strong> rovnicí:<br />
v = qE/6πrη<br />
V praxi se častěji používá výrazu pohyblivost (rychlost částice<br />
v jednotkovém elektrickém poli)<br />
m = q/6πrη
Typy elektromigračních metod<br />
Elektroforéza Izotachoforéza Izoelektrická fokusace
Prostředí elektromigračních metod<br />
• <strong>Elektromigrační</strong> <strong>metody</strong> ve volném roztoku<br />
• <strong>Elektromigrační</strong> <strong>metody</strong> <strong>na</strong> <strong>nosičích</strong><br />
zabránění zpětnému míchání dělených látek difuzí<br />
menší technická náročnost<br />
současné separace více vzorků<br />
reprodukovatelnost<br />
flexibilita a s<strong>na</strong>dná manipulovatelnost<br />
různé druhy gelů, méně často papír, film acetyl celulosy, tenká<br />
vrstev silikagelu.
vertikální<br />
elektroforéza<br />
horizontální<br />
elektroforéza<br />
Uspořádání gelů
Agarové gely<br />
Agar směsi dvou polysacharidů, agarosy a agaropektinu.<br />
V současné době gely <strong>na</strong> bázi agaru <strong>na</strong>hrazeny gely agarosovými<br />
Agarosové gely<br />
0,2 % agarosy - teplota pod 45 o C - vzniká gel<br />
Velikost pórů<br />
1 % (w/v) agarosy 150 nm<br />
0,16 % agarosy 500 nm<br />
Gely <strong>na</strong> bázi agaru<br />
nejčastěji gely o koncentraci agarosy 0,5 až 1 %.
Dvoušroubovice polysacharidu se spojují mezi<br />
sebou a vytvářejí pevnou síť<br />
Použití<br />
tam, kde je zapotřebí větších pórů<br />
částice <strong>na</strong>d 10 nm<br />
a<strong>na</strong>lýza a čištění DNA a RNA a jejich<br />
fragmentů.
Polyakrylamidové gely<br />
polymerací monomerů akrylamidu a síťovacího činidla<br />
N,N’-methylenbisakrylamidu (BIS)<br />
transparentní<br />
chemicky inertní<br />
mechanicky stálý
Velikost pórů<br />
přesný poměr akrylamidu a BISu<br />
Množství akrylamidu (T) - celková koncentrace akrylamidu<br />
v gelu (w/v)<br />
Množství BISu (C) - hmotnostních procentech vztažených <strong>na</strong><br />
celkovou hmotnost akrylamidu v gelu (w/w) podle rovnic:<br />
%T = 100 . (AA + BIS)/V<br />
%C = 100 . BIS/(AA + BIS)
Velikost pórů úměrně závisí <strong>na</strong> koncentraci akrylamidu ne však BISu<br />
Nejmenší póry - koncentrace BISu 5 %<br />
Závislost velikosti pórů<br />
v polyakrylamidoném gelu <strong>na</strong><br />
koncentraci %T akrylamidu a<br />
%C BISu
Fázový diagram závislosti přechodu polyakrylamidového gelu<br />
ze stavu transparentního do stavu zakaleného <strong>na</strong> koncentraci<br />
%T akrylamidu a %C BISu
ozdělovací limit pro koncentrace akrylamidu a BISu
Polymerizace<br />
Příprava PAGE gelů<br />
• katalyzátor - N,N,N’,N’-tetramethylendiamin (TEMED)<br />
• anionty persíranu - zdroj kyslíkových radikálů<br />
• riboflavin - UV záření - volné radikály<br />
• inertní atmosféra - kyslík lapač radikálů<br />
• mezi dvěma skleněnými deskami opatřenými spacery<br />
• polymerační směs - převrstvená (vodný roztokem<br />
alkoholu)<br />
• teplotně závislá - zpomaluje snižováním teploty<br />
• běžně teplota místnosti tj. asi 20 o C
Nosiče <strong>na</strong> bázi dextranu<br />
Inertní polysacharid dextran<br />
Použití v Izoelektrické fokusaci<br />
Semipreparativní účely
Elektroforéza (ELFO)<br />
částice se dělí v elektrickém poli v závislosti <strong>na</strong> jejich pohyblivosti
Volná elektroforéza<br />
• Dělené látky se pohybují<br />
volně v roztoku<br />
• Minimální „odpor prostředí“<br />
• Pohyblivost dá<strong>na</strong> hlavně<br />
velikostí náboje<br />
• Nebezpečí difůze
Elektroforéza <strong>na</strong> gelových nosiších<br />
• agarosový<br />
• polyakrylamidový<br />
• vertikální<br />
• horizontální<br />
• nerestriktivní<br />
• restriktivní
Desková nerestriktivní elektroforéza<br />
• dostatečně velké póry - odpor prostředí<br />
zanedbatelný<br />
• pohyblivost dá<strong>na</strong> velikostí náboje<br />
• agarosové gely – horizontální<br />
uspořádání
Desková restriktivní elektroforéza<br />
• velikost pórů - odpor prostředí<br />
• pohyblivost - celkový náboji + velikosti molekul<br />
logaritmická závislost relativní pohyblivosti <strong>na</strong> koncentraci gelu -<br />
dekadický logaritmus relativní pohyblivosti<br />
Fergusnův plot. A - Bílkoviny mají stejnou velikost ale rozdílný náboj. B - bílkoviny<br />
mají rozdílný náboj i velikost.
Agarosová gelová elektroforéza<br />
• veliké částice<br />
• gely o vyšší koncentrací zakalené<br />
• proteiny pouze vysokomolekulární nebo komplexy<br />
• standardní metoda dělení nukleových kyselin a jejich<br />
fragmentů<br />
• DNA, RNA<br />
• horizontální uspořádání tzv. submarine (ponořených) gelů
Polyakrylamidová elektroforéza (PAGE)<br />
• nejrozšířenějším typem elektroforézy proteinů<br />
• bílkoviny i nukleové kyseliny<br />
• u nukleových kyselin sekvenovámí DNA<br />
• lze rozdělit fragmenty DNA lišící se o 6 bází při celkové délce<br />
500 bází<br />
• 0,5 mm gely vyšší citlivost než agarosa<br />
• Gely s velkými póry (T = 2 % a C = 9 %) řetězce DNA okolo<br />
2300 párů bází (800kDa)<br />
• bílkoviny deskové gely horizontální i vertikální
Diskontinuální elektroforéza<br />
gel - dvě části<br />
zaostřovací (stacking)<br />
dělící (resolving)<br />
složení a pH - zaostřovací gel izotachoforéza<br />
dělící gel elektroforéza
Gradientová elektroforéza<br />
postupná změ<strong>na</strong> koncentrace akrylamidu v polymerační směsi<br />
směsi látek s velkým rozsahem pohyblivosti (velikosti, molekulové hmotnosti)
Dělení proteinů v různých typech gelů
Nativní elektroforéza<br />
Elektroforéza za nede<strong>na</strong>turujících podmínek<br />
Proteinům dodává náboj specifická látka Elfo <strong>na</strong> základě přirozeného náboje molekul
SDS de<strong>na</strong>turující elektroforéza<br />
• SDS - sodium dodecylsulphate (dodecylsulfát sodný,<br />
sodium laurylsulphate)<br />
• dělení proteinů za základě molekulových hmotností<br />
• výsledný náboj - množství záporně <strong>na</strong>bitých molekul<br />
detergentu
SDS de<strong>na</strong>turující elektroforéza<br />
• SDS <strong>na</strong>rušuje jak terciální tak i sekundární strukturu<br />
• disulfidické můstky redukující činidlo 2-merkaptoethanol<br />
nebo dithiotreitol (DTT).<br />
• bílkoviny získávají jednotný tvar elipsoidu<br />
• Během dělení nutná přítomnost 0,1 % SDS v gelu<br />
• logaritmický vztah mezi molekulovou hmotností<br />
pohyblivostí
SDS de<strong>na</strong>turuje proteiny, DTT nebo merkaptoethanol<br />
štěpí S-S můstky
Situace kdy pohyblivost v přítomnosti SDS<br />
neodpovídá molekulové hmotnosti:<br />
• protilátky bez redukce disulfidických<br />
můstků<br />
• glykoproteiny - <strong>na</strong> polysacharidy se<br />
SDS neváže<br />
• membránové bílkoviny – <strong>na</strong> hydrofobní oblasti se<br />
SDS váže v jiném poměru<br />
• silně kyselé proteiny a nukleoproteiny - SDS se váže<br />
v neurčitých poměrech
• polymerace DNA <strong>na</strong> izolované<br />
jednovláknové DNA<br />
DNA sekvenování<br />
• frakce s různě dlouhými fragmenty - syntéza<br />
ukonče<strong>na</strong> z<strong>na</strong>čenými terminálními<br />
dideoxynukleotidy<br />
• elektroforetické dělení fragmentů DNA<br />
• sekvence nukleotidů se odečte z gelu<br />
Dideoxycytosine (ddCTP)
Kapilární elektroforéza<br />
Roku 1981 J. W. Jorgenson a K. D. Lukacsová popsali separaci různých iontů<br />
(aminokyselin, dipeptidů, aminů) zónovou elektroforézou ve velmi tenké skleněné<br />
kapiláře s vnitřním průměrem 75 μm<br />
• vodné prostředí v úzkých kapilárách v délce od 10 cm až do 1 m<br />
• vnitřní průměr nejčastěji 25 až 50 μm<br />
• vnitřní úprava - zabraňuje nespecifické adsorpci dělených látek <strong>na</strong> stěnu<br />
• možnost automatizace - automatické dávkovače vzorků, detektory <strong>na</strong><br />
principu UV/VIS absorpce světla<br />
• malá spotřeba vzorku - <strong>na</strong>nolitrové množství vzorku<br />
• větši<strong>na</strong> a<strong>na</strong>lýz ve vodném prostředí<br />
• polyakrylamidové gely, rozpustné hydrofilní polymery
Schéma zařízení <strong>na</strong> kapilární elektroforézu
Izoelektrická fokusace (IEF)<br />
Dělení látek podle jejich náboje v gradientu pH<br />
Základní předpoklad - vytvoření stabilního a spojitého gradientu pH<br />
Látky, které doputují do místa kde se jejich pI rovná pH v gelu se<br />
zastaví
amfoterické látky - bílkoviny, peptidy<br />
nízké pH<br />
R-COO- + H+ -> R-COOH<br />
R-NH3 + H+ -> R-NH4+<br />
vysoké pH<br />
R-COOH + OH- -> R-COO- + H2O<br />
R-NH4+ + OH- -> R-NH3 + H2O<br />
pH - molekula se jeví jako elektroneutrální - izoelektrický bod pI<br />
pI je pro každou bílkovinu specifické<br />
glykoproteiny a nukleoproteiny - pI určují i cukry a báze nukleových kyselin<br />
Proteinem s nejnižším známým pI 1,8 - kyselý glykoprotein ze šimpanze<br />
Proteinem s nejvyšším známým pI 11,7 - lysozym z lidské placenty
pH gradienty tvořené amfolyty<br />
Amfolyty - směsi uměle připravených amfoterických organických<br />
sloučenin<br />
oligoamino-oligokarboxylové kyseliny<br />
smíchání vhodných látek - rozmezí od pH 3 až do pH 10<br />
anodový pufr – kyselý<br />
katodový pufr – zásaditý
Imobilizované pH gradienty<br />
• deriváty akrylamidu s pufrujícími funkčními skupi<strong>na</strong>mi<br />
• kopolymerace a akrylamidem a síťovacím činidlem<br />
• pH gradient - postupná změ<strong>na</strong> poměru jednotlivých derivátů<br />
akrylamidu v gelu<br />
• pK od 3 do 9<br />
• použití mísiče gradientu<br />
• není nutné používat kyselých a<br />
zásaditých elektrodových pufrů<br />
• nedochází ke změně pH v čase<br />
během dělení látek
Vliv rozsahu pH <strong>na</strong> dělení proteinů IEF
Podmínky izoelektrické fokusace<br />
• nede<strong>na</strong>turující metoda - důležité optimalizovat podmínky<br />
• agregace, precipitace<br />
• kontrola teploty - pK, pI závislé <strong>na</strong> teplotě<br />
• předfokusace - vytvoření pH gradientu před <strong>na</strong>nesením vzorků<br />
• optimální pozice pro <strong>na</strong>nášení vzorků<br />
• pH gradienty citlivé k vyšším koncentracím solí - dialíza<br />
• doba dělení - kompromis mezi optimálním rozdělením a minimálním<br />
osunem pH gradientu
2D (dvojrozměrná) ELFO<br />
První rozměr:<br />
dělení látek za<br />
nede<strong>na</strong>turujících podmínek -<br />
separace celých komplexů<br />
Druhý rozměr:<br />
dělení látek za<br />
de<strong>na</strong>turujících podmínek -<br />
a<strong>na</strong>lýza separovaných<br />
komplexů
2D ELFO a IEF
2D ELFO multicoulor
ílkoviny získají v<br />
prvním rozměru náboj<br />
<strong>na</strong>vázáním záporně<br />
<strong>na</strong>bité Commassie<br />
Brilliant Blue G-250,<br />
která je přítomná v<br />
katodovém pufru<br />
2 rozměr SDS ELFO<br />
2D ELFO Blue <strong>na</strong>tive
Barvení gelů<br />
• Commassie Brilliant Blue G-250 - 500 ng proteinu / band<br />
• Barvení stříbrem - 20-50 ng proteinu / band<br />
• Specifické barvení <strong>na</strong>př. cytochromy
Change language