Afgangsprojekt - Diplomingeniør i Kemiteknik [999 KB] - sotoft.dk

K-PROJEKT 7 

13081 - Johnny Søtoft Jespersen 

12894 - Susan Renneberg Larsen 

Opformering af 

Saccharomyces cerevisiae 

Propagation of Saccharomyces cerevisiae 

Afleveret d. 11. december 2003 

Vejleder: Lene Pedersen 

Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum 

Sektor for industri og byggeri 

Kemiingeniøruddannelserne 

K-PROJEKT efterår 2003

K-PRO 7 Synopsis - Dansk Gruppe 2 

Synopsis - Dansk 

I dette projekt vil der blive fokuseres på at tilpasse forskellige parametre til opformering af 

gæren Saccharomyces cerevisiae, således at der opnås et cellemasseudbytte tæt på den 

teoretiske værdi. 

Dette gøres ved foretage fermenteringer vha. Saccharomyces cerevisiae. Under disse 

fermenteringer udtages prøver, som anvendes til at bestemme cellemasseudbyttet samt til at 

finde koncentrationen af uomsat sukker og dannet ethanol i fermenteringsvæsken. Herudover 

bestemmes indholdet af nitrogen og kuldioxid i udgangsgassen. 

g cellemasse dannet 

Der blev opnået en udbyttekonstant på 0,45 , som ligger meget tæt på den 

g sukker forbrugt 


teoretiske værdi, der ligger mellem 0,46 og 0,47 . 


Herudover blev der fundet følgende anvendelige fermenteringsparametre; en 

omrørerhastighed på 700 O 

min , et overtryk på 0,2 bar samt en sukkerkoncentration i 

startsubstrat på 7,25 g 

L . 

Opformering af Saccharomyces cerevisiae

K-PRO 7 Synopsis - English Gruppe 2 

Synopsis - English 

The focus in this project will be to adjust different parameters to the propagation of the yeast 

Saccharomyces cerevisiae that makes it possible to achieve a yield of biomass close to the 

theoretical value. This will be done by fermentation of Saccharomyces cerevisiae. 

Samples were taken during the fermentations, and used for determination of the yield of 

biomass and the concentrations of unconsumed sugar and formed ethanol in the fermentation 

broth. In addition to this the content of nitrogen and carbon dioxide in the exhaust gas was 

found. 

A yield coefficient of 0.45 

g biomass formed 

g sugar consumed 

Opformering af Saccharomyces cerevisiae 

was found. This value is very close to the theoretical 

value between 0.46 and 0.47 gbiomassformed 

g sugar consumed . 

The following usable parameters for fermentation were found; a stirring rate of 700 rpm, a 

pressure of 0.2bar above the atmosphere and a sugar concentration of 7.25 g 

L .

K-PRO 7 Forord Gruppe 2 

Forord 

Dette projekt er skrevet som afgangsprojekt for kemiingeniøruddannelserne, Sektor for 

Industri og Byggeri på Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum og betragtes som fortroligt. 

Projektet omhandler opformering af gæren Saccharomyces cerevisiae. Analyser foretaget 

til måling og kontrol af væksten er udført online vha. en PC, samt offline vha. bl.a. 

gaschromatograf og et spektrofotometer. Der er i dette projekt blevet ændret på forskellige 

parameter for at forbedre væksten af Saccharomyces cerevisiae. 

Projektet er en videreførelse af projektet ”Optimering af fed-batchfermentering af 

genmodificeret Saccharomyces cerevisiae” udført i foråret 2003 på Ingeniørhøjskolen Odense 

Teknikum af A. S. Forssling og J. Johansen. Når der diskuteres og viderearbejdes på data eller 

elementer fra dette projekt, henvises med: Forssling et al. Der henvises til kilder med [X], 

disse forefindes i litteraturlisten. Yderligere henvises til måledata fra opformeringsforsøgene 

med Måledata X, disse forefindes som et ekstra kompendium. 

Til sidst skal der rettes en stor tak til Novo Nordisk A/S, specielt Berit Eskerod Madsen og 

Michael Elleskov, som har været behjælpelige med gærceller, vitaminer og substratopskrift 

anvendt under dette projekt, samt information omkring insulin og fermentering. 

Odense, den __________________ 

Johnny S. Jespersen Susan R. Larsen 


K-PRO 7 Indholdsfortegnelse Gruppe 2 

Indholdsfortegnelse 

1 Problemformulering.....................................................................................................1 

1.1 Projektoplæg...............................................................................................................1 

1.2 Projektanalyse.............................................................................................................1 

1.3 Projektformulering .....................................................................................................2 

1.4 Projektafgrænsning.....................................................................................................2 

2 Insulin ............................................................................................................................3 

2.1 Human insulin ............................................................................................................3 

2.2 Industriel produktion af insulin ..................................................................................5 

3 Vækst af Saccharomyces cerevisiae .............................................................................8 

3.1 Saccharomyces cerevisiae..........................................................................................8 

3.2 Metabolisme for S. cerevisiae ....................................................................................9 

3.2.1 Udbyttekonstanter...............................................................................................9 

3.2.2 Metabolismeligninger.......................................................................................11 

3.2.3 Respirationskoefficient.....................................................................................12 

3.3 Pasteur-effekt............................................................................................................13 

3.4 Crabtree-effekt..........................................................................................................13 

3.5 Substratinhibering.....................................................................................................14 

4 Fermenteringsteori.....................................................................................................16 

4.1 Batch fermentering ...................................................................................................16 

4.2 Fed-batch fermentering.............................................................................................16 

4.3 Kontinuert fermentering ...........................................................................................17 

4.4 Vækstfaser for gærceller...........................................................................................17 

5 Betydningen af ilt og omrøring .................................................................................19 

5.1 Ilts opløselighed i væske ..........................................................................................19 

5.2 Iltoverførsel ..............................................................................................................20 

5.2.1 Sammenligning af estimeret KLa og praktisk KLa............................................21 

5.2.2 Sammenligning af forskellige P/V forhold.......................................................22 

6 Forsøgsbeskrivelse......................................................................................................24 

6.1 Forkultur ...................................................................................................................24 

6.2 Podning af fermentor................................................................................................24 

6.3 Fermentering.............................................................................................................24 

6.4 Online dataopsamling...............................................................................................25 

6.5 Prøveudtagning.........................................................................................................27 

6.5.1 Tørstofbestemmelse..........................................................................................27 

6.5.2 Sukker- og ethanolbestemmelse .......................................................................28 

6.5.3 Gasanalyse........................................................................................................29 

6.5.4 Pladeudspredning .............................................................................................29 

6.6 Tilledning til fermentoren.........................................................................................30 

6.6.1 Substratforbrug .................................................................................................31 

6.6.2 Skumdæmpning................................................................................................31 

6.6.3 pH .....................................................................................................................31 

6.7 Temperatur................................................................................................................31 

6.8 Ilt...............................................................................................................................32 

6.9 Autoklavering ...........................................................................................................32 



7 Fermenteringerne .......................................................................................................33 

7.1 Fermentering 1..........................................................................................................34 

7.1.1 Startbetingelser f1.............................................................................................34 

7.1.2 pH og temperatur f1..........................................................................................34 

7.1.3 Ilt f1 ..................................................................................................................35 

7.1.4 Værdier fra Forssling et al................................................................................36 

7.1.5 Sukkerkoncentration f1.....................................................................................37 

7.1.6 Ethanolkoncentration f1 ...................................................................................38 

7.1.7 Deldiskussion 1 ................................................................................................38 

7.2 Fermentering 2..........................................................................................................38 



7.2.3 Substrattilledning f2 .........................................................................................39 

7.2.4 Sukker- og ethanolkoncentration f2 .................................................................39 

7.2.5 Ilt f2 ..................................................................................................................40 


7.3 Fermentering 3..........................................................................................................41 


7.3.2 Temperatur f3 ...................................................................................................41 

7.3.3 Ilt f3 ..................................................................................................................42 


7.4 Fermentering 4..........................................................................................................43 



7.4.3 Ilt f4 ..................................................................................................................44 


7.5 Fermentering 5..........................................................................................................45 



7.5.3 Ilt f5 ..................................................................................................................46 



7.6 Tilledningsprofil .......................................................................................................47 

7.7 Fermentering 6..........................................................................................................48 



7.7.3 Ilt f6 ..................................................................................................................50 



7.8 Kulturrenhed.............................................................................................................51 

7.9 Prøveudtagning.........................................................................................................52 



8 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter...................................................53 

8.1 Respirationskoefficient.............................................................................................53 

8.1.1 Målinger på udgangsgassen..............................................................................54 

8.1.2 Respirationskoefficient fra fermentering f5 .....................................................56 

8.1.3 Beregning af antal mol CO2 dannet..................................................................56 

8.1.4 Beregning af antal mol O2 forbrugt ..................................................................57 

8.1.5 RQ.....................................................................................................................58 

8.2 Specifik væksthastighed ...........................................................................................59 

8.2.1 Beregning af den specifikke væksthastighed for f5..........................................59 

8.3 Udbyttekonstanter.....................................................................................................61 

8.4 Fermenteringsparametre ...........................................................................................64 

9 Diskussion.................................................................................................................... 66 

10 Konklusion ..................................................................................................................69 

11 Bilags- og måledataliste..............................................................................................71 

12 Litteraturliste..............................................................................................................72 


K-PRO 7 Problemformulering Gruppe 2 

1 Problemformulering 

1.1 Projektoplæg 

Projektet skal omhandle løsningen af et kemiingeniørrelevant emne. Emnet skal have 

relationer til praktiske ingeniørmæssige opgaver, normalt i samarbejde med en ekstern 

virksomhed. 

Herunder skal der formuleres en projektopgave. Opgaven analyseres og løses ved brug af 

indlært og selverhvervet viden samt ved inddragelse af anden relevant information. Dette 

afsluttes ved at udforme en teknisk rapport. 

1.2 Projektanalyse 

Formålet med projektet er at tilpasse forskellige parametre, så cellemasseudbyttet af gæren 

Saccharomyces cerevisiae senere kan optimeres. Dette sker som en videreføring af 

projektet ”Optimering af fed-batchfermentering af genmodificeret Saccharomyces cerevisiae” 

fra foråret 2003 af Forssling et al. i samarbejde med Novo Nordisk A/S. 

Inden der kan optimeres på forskellige parameter såsom pH eller temperatur under 

opformeringen, er det vigtigt at foretage nogle indledende forsøg. Hvis der skal optimeres på 

forskellige parameter er det vigtigt, at der ikke er begrænsende faktorer, der overskygger 

variationerne i de parameter, der optimeres på. Ønskes det eksempelvis at optimere på 

parameter X, er det vigtigt at parameter Y ikke er en begrænsende faktor, da parameter Y evt. 

har en større indflydelse på cellemasseudbyttet end parameter X. 

Hvis der opnås et cellemasseudbytte i nærheden af det teoretiske mulige, vil der ikke være 

nogen begrænsende parameter, der for alvor er dominerende. Herefter vil det så være mulig at 

optimere på forskellige parametre. 

Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 1 af 73

K-PRO 7 Problemformulering Gruppe 2 

1.3 Projektformulering 

Der vil i dette projekt blive fokuseres på at tilpasse forskellige parametre til opformering af 

gæren Saccharomyces cerevisiae således, at der opnås et cellemasseudbytte tæt på den 

teoretiske værdi. Dette vil ske ved at foretage en opformering af gæren under bestemte 

forhold. Resultaterne fra denne opformering vil så blive vurderet, hvorefter nogle af 

forholdene ændres. Der vil derefter blive udført en ny opformering, under de nye forhold. 

Således anvendes der altså ikke en på forhånd fastlagt forsøgsplan. 

Resultaterne til vurdering af de forskellige opformeringer, vil komme fra analyser, der vil 

blive foretaget under den enkelte opformering. Der vil blive målt pH og temperatur for at 

kontrollere, at disse ligger stabilt under opformeringen, desuden vil iltkoncentrationen i 

fermenteringsvæsken blive målt, da det bedste cellemasseudbytte opnås ved aerobe forhold. 

Der vil derudover løbende blive udtaget prøver fra fermentoren, og disse prøver vil blive 

anvendt til at måle cellemasseudbyttet, samt finde koncentrationen af uomsat sukker og 

dannet ethanol i fermenteringsvæsken. Herudover måles på sammensætningen af 

udgangsgassen fra fermentoren, denne vil blive analyseret for indholdet af kuldioxid og 

nitrogen, således at indholdet af ilt kan beregnes. 

1.4 Projektafgrænsning 

Målingerne under fermenteringerne af pH, temperatur og iltkoncentrationen vil ske online vha. 

elektroder. Analyserne af sukker- og ethanolkoncentrationerne vil blive foretaget vha. 

enzymkit på et spektrofotometer, mens analyserne af udgangsgassen vil blive udført vha. en 

gaschromatograf. Cellemasseudbyttet vil blive målt ved tørstofanalyse. 

Startbetingelserne for fermenteringerne er fastlagt i samarbejde med Novo Nordisk A/S. 

Dette gælder for det substrat, der anvendes under fermenteringerne (opformering af gæren), 

samt den pH-værdi og temperatur, der anvendes. 


K-PRO 7 Insulin Gruppe 2 

2 Insulin 

Gæren Saccharomyces cerevisiae anvendes i industrien bl.a. til fremstilling af insulin. Denne 

fremstilling finder bl.a. sted på Novo Nordisk A/S, som er førende inden for fremstilling af 

insulin til mennesker (human insulin). 

2.1 Human insulin 

Insulin er det eneste hormon, der kan stimulere nedbrydning af sukkerstoffer, hvilket betyder 

at hvis der udskilles for lidt insulin, vil sukkerstoffer ophobes i kroppen. Dette fører til 

diabetes mellitus også kaldet sukkersyge. Hjerneceller bruger næsten udelukkende 

sukkerstoffer som energikilde, hvilket gør sukkersyge til en farlig sygdom. Dette skyldes, at 

svingende blodsukkerkoncentrationer i værste fald kan medføre hjerneskader, hvorfor 

sukkersyge kræver behandling. 

Insulin er et polypeptid, som består af 51 aminosyrer fordelt på to polypeptidkæder, en Akæde 

på 21 aminosyrer, hvor fire af aminosyrerne er cystein (CYS) og en B-kæde på 30 

aminosyrer, hvor to af aminosyrerne er cystein, se Figur 2.2. Cystein kan danne disulfidbroer 

med andre cysteingrupper. De to kæder er bundet sammen af to sådanne disulfidbroer, hvilket 

giver insulin sin tertiære struktur. 

Insulin produceres af β-cellerne i bugspytkirtlen som en enkeltkædet forbindelse, kaldet 

præ-pro-insulin, som ved udskillelse til cellen bliver foldet vha. disulfidbroer og danner 

proinsulin. Proinsulin består af en polypeptidkæde på 86 aminosyrer. Den primære struktur af 

proinsulinkæden består af A- og B-kæden og er bundet sammen vha. en tredje kæde, C-kæden, 

på 35 aminosyrer. Denne kæde medvirker til at holde A- og B-kæden i den rigtige position i 

forholdet til hinanden, således at de rigtige disulfidbroer kan dannes, se Figur 2.1. Efter 

dannelse af svovlbroer spaltes proinsulinproteinet ved enzymatisk katalyse, således at A-, og 

B-kæden frigøres, og proteinet opnår den ønskede tertiære struktur. [7] 



Figur 2.1: Human proinsulin Figur 2.2: Human insulin 

Insulin til regulering af blodsukker har tidligere været ekstraheret fra svinebugspytkirtler. 

Svineinsulin er dog ikke identisk med human insulin. Forskellen mellem svineinsulin og 

human insulin er aminosyre nr. 30. I human insulin er aminosyre nr. 30 threonin (THR), mens 

den i svineinsulin er alanin (ALA). 

β-cellerne reagerer på sukkerniveauet i blodet, dvs. ved en stigning af 

sukkerkoncentrationen til over det normale niveau 1 øges produktionen og den efterfølgende 

udskillelse af insulin med det resultat, at sukkerkoncentrationen i blodet falder. Som en 

konsekvens heraf falder produktionen og udskillelsen af insulin igen. 

Måden, hvorpå insulin regulerer optagelsen af bl.a. glucose, er ved at op- og nedregulere 

antallet af glucosetransportører på celleoverfladen, se Figur 2.3. Insulin binder sig til 

insulinreceptorer i den plasmamembran, der omslutter cellen. Dette bevirker, at der indsættes 

ekstra glucosetransportører i membranen. Disse glucosetransportører bliver opbevaret i 

membranvesicler 2 inde i cellen, se Figur 2.3. Modsat kan insulinen igen løsrives fra 

insulinreceptorerne, hvorefter membranvesiclerne gendannes og antallet af 

glucosetransportører i cellemembranen sænkes [20]. 

1 Det normale niveau hos mennesker er 0,8 til 1,0 g pr.L [19]. 

2 Membranvesicle: lille kugleformede hulrum inde i cellen til opbevaring af forskellige cellemembranenheder. 



Figur 2.3: Overførsel af glucose gennem glucosetransportører fra blodåre til celle [20]. 

Udover at insulin regulerer glucoseniveauet i blodet, har insulin også indflydelse på lagring 

og mobilisering af energi i primært leveren samt muskel- og fedtvæv. Insulinets virkning på 

disse væv varierer. Først fremmer insulin anvendelsen af glucose som energikilde, på samme 

tid fremmer det oplagringen af kulhydrater i form af polysakkaridet glycogen. For det andet 

reducerer insulin anvendelsen af fedt som energikilde, og fremmer oplagringen af det, hvilket 

stemmer overens med at glucose er en lettere tilgængelig energikilde end fedt. For det tredje 

reducerer insulin anvendelsen af proteiner som energikilde og fremmer dermed 

proteinsyntesen. [19] 

2.2 Industriel produktion af insulin 

På Novo Nordisk A/S fremstilles human insulin ved fermentering af en genmodificeret 

stamme af gæren Saccharomyces cerevisiae. Gærcellerne kan ved hjælp af et indsat plasmid 

producere et forstadie til insulin præ-pro-mini-insulin, også kaldet Mi3. Et plasmid er et 

ringformet DNA-molekyle, som ikke indeholder gener, der har betydning for cellens 

stofskifte, men derimod indeholder resistensgener [7]. C-kæden af Mi3 indeholder kun tre 

aminosyrer og er dermed meget kortere end C-kæden i naturligt pro-insulin, hvorfor det er 

nemmere at fjerne denne kæde kemisk. Selvom C-kæden er kortere, forhindrer dette ikke, at 

insulinmolekylet opnår den rigtige tertiære struktur [23]. 



Ved at indsætte genet der koder for insulin på et plasmid i stedet for på et af gærcellens 

kromosomer opnås en stor insulinproduktion fra hver enkelt celle, da plasmider kan optræde i 

stort antal i hver celle. 

Dog er der en risiko for at cellerne taber plasmiderne, da det er meget energikrævende for 

cellerne at producere stoffer, som de ikke selv har brug for. Derfor er dele af et livsvigtigt 

enzym triose phosphat isomerase (TPI) fjernet fra cellernes kromosomer og i stedet sat ind i 

plasmidet. Dette betyder, at hvis cellen ikke indeholder plasmidet, kan denne ikke producere 

TPI og dermed ikke overleve. TPI er indsat i plasmidet således at hver gang dette produceres, 

vil der også blive produceret insulin. Herudover er genet for protease fjernet fra gærcellerne. 

Protease er et enzym, som nedbryder proteiner, inden de kan nå at blive udskilt til 

fermenteringsvæsken. Protease ville også nedbryde insulin, hvis enzymet var tilstede i S. 

cerevisiae [23]. 

Produktion af insulin startes ved optøning af en ampul indeholdende genmodificerede S. 

cerevisiae celler, som herefter overføres til en fernbachkolbe 3 indeholdende et flydende agar 

med den nødvendige næring. Efter en vis opformering overføres kolbens indhold til en 

podetank, hvor cellerne opformeres i ca. 65 timer [22]. Herefter føres indholdet af podetanken 

over i hovedtanken, hvor fermenteringen fortsættes i 3 uger, forudsat at der ikke sker 

kontaminering undervejs. Hovedtanken er en kontinuert fermentor, dvs. at der under 

fermenteringen løbende fjernes fermenteringsvæske indeholdende Mi3 og tilledes frisk 

substrat, se Figur 2.4. 

Figur 2.4: Produktion af human insulin [23]. 

3 En kolbe til podning af opformeringstank, som sterilt kan tilsluttes tanken. 



Fermenteringen styres meget nøje med hensyn til pH, temperatur, iltindhold og substrat, så 

gæren har optimale vækstbetingelser. På Novo Nordisk A/S foregår fermenteringen ved ca. 30 

til 32 ºC og pH omkring 4 til 5. For nylig har Novo Nordisk A/S skiftet fra at anvende glucose 

som kulstofkilde til at anvende en flydende sukkeropløsning. Specielt sukkerkoncentrationen 

er meget vigtigt for fermenteringen. Hvis denne bliver for høj, vil sukkeret udelukkende blive 

omdannet under anaerobe betingelser, selvom der er ilt tilstede 4 . Herved vil uønskede 

biprodukter som f.eks. ethanol blive dannet, hvilket giver et mindre udbytte af cellemasse og 

dermed også et mindre udbytte af insulin. Når fermenteringen er færdig, oprenses 

fermenteringsvæsken. Først fjernes gærcellerne ved centrifugering og tromlefiltrering, 

hvorefter væsken opkoncentreres på forskellig vis alt efter hvilken type insulin der ønskes og i 

hvilken renhed [23]. 

Opformeringen, som foregår i podetanken, er en batchfermentering, se Afsnit 4.1, hvilket 

vil sige at alt substrat tilsættes fra starten, og gærcellerne dermed har et stort overskud af 

sukker. Dette betyder, at nedbrydningen af sukker foregår under anaerobe forhold. Det burde 

derfor være muligt at få en bedre udnyttelse af sukkeret, hvis fermenteringen foregår som en 

fed-batch fermentering, hvor der startes ud med en vis mængde substrat i fermentoren, og 

herefter tilledes substrat kontinuert, se Afsnit 4.2. Hermed er det muligt at opnå en vis 

nedbrydning af sukker under aerobe forhold og dermed få et større cellemasseudbytte, se 

Afsnit 3.2. 

4 Denne effekt kaldes Crabtree-effekten, se Afsnit 3.4. 


K-PRO 7 Vækst af Saccharomyces ceerevisiae Gruppe 2 

3 Vækst af Saccharomyces cerevisiae 

3.1 Saccharomyces cerevisiae 

Den gær, der anvendes til industriel fremstilling af insulin og som vil blive anvendt i dette 

projekt, er som tidligere nævnt en genmodificeret stamme af Saccharomyces cerevisiae. 

S. cerevisiae bedre kendt som bage- eller ølgær er sammen med mange andre gærtyper 

gennem de sidste årtusinder blevet anvendt til fremstilling af f.eks. vin, øl og brød ved 

fermentering [10], [11]. I nyere tid har genmodificeret gær fundet anvendelse som vært ved 

fremstilling af proteiner [7]. 

S. cerevisiae er en eukaryote nærmere betegnet en encellet gær, som har en diameter på 

omkring 5 til 10 µm [7] [9]. Gærceller er dermed meget større end bakterier og kan nemt 

skelnes fra disse mikroskopisk [7] [9]. S. cerevisiae er en af de mest undersøgte gærtyper og 

den første, hvis genom blev fuldstændig kortlagt [7]. 

S. cerevisiae deler sig ved celleafsnøring, se Figur 3.1, hvor en ny celle, kaldet dattercelle, 

dannes som en lille udvækst på modercellen. Når dattercellen har en vis størrelse sker der en 

adskillelse af cellerne. Umiddelbart herefter kan modercellen igen dele sig ved celleafsnøring. 

Dattercellen derimod skal først modnes, før denne kan påbegynde celledeling [7], [12]. 

Figur 3.1: Celledeling ved celleafsnøring i S. cerevisiae [7]. 

Grundene til at S. cerevisiae anvendes til industriel produktion af insulin er mange, bl.a. er 

gærceller i stand til at danne et korrekt foldet molekyle med de svovlbroer, der er 

karakteristiske for insulin, se Afsnit 2.1. Derudover udskilles insulinet til 

fermenteringsvæsken samtidig med, at der udskilles relativt få andre proteiner, dette gør 

oprensningen lettere. S. cerevisiae celler er robuste, vokser hurtigt og kan gro meget tæt, 

hvilket giver et højt udbytte. Desuden kan S. cerevisiae vokse på et simpelt og billigt substrat 

[23]. 



3.2 Metabolisme for S. cerevisiae 

For at kunne opdyrke en population af S. cerevisiae er det nødvendigt at gæren får opfyldt de 

vækstparametre den kræver, det vil bl.a. sige at få et optimalt tilpasset substrat. 

Hovedingrediensen i dette substrat vil være en kulstofkilde som f.eks. glucose eller sukker. 

Herudover kræver gæren en nitrogenkilde, en fosforkilde samt mange forskellige mineraler og 

sporstoffer. Udover dette kræver gæren ilt for at kunne vokse optimalt under aerobe forhold, 

hvilket giver det største cellemasseudbytte, se Afsnit 3.2.1. 

S. cerevisiae er en fakultativ aerob gær, dvs. den kan omsætte sukker ved både aerob og 

anaerob nedbrydning [15], [10]. S. cerevisiae vil ikke kunne optimeres til at omsætte sukker 

fuldstændig aerobt. Det er kun muligt at omsætte mellem 3 og 20 % af sukkeret under aerobe 

forhold [15], derfor vil metabolismen for S. cerevisiae være både aerob og anaerob. 

3.2.1 Udbyttekonstanter 

For at få en ide om hvor stort et cellemasseudbytte det er muligt at opnå ved fermentering af S. 

cerevisiae undersøges den maksimale udbyttekonstant, når der tages højde for både aerob og 

anaerob nedbrydning af sukker. Dette gøres beregningsmæssigt med glucose. 

Idet S. cerevisiae maksimalt kan nedbryde 20 % af sukkeret under aerobe forhold, kan den 

maksimalt opnåelige udbyttekonstant ud fra teoretiske udbyttekonstanter opskrives som: 

aerob 

anaerob 

Y X = 0, 

20⋅ 

Y + ( 1− 

0, 

20) 

⋅ Y 

S max 

X 

S 

Ud fra litteraturen er der fundet flere udbyttekonstanter for både aerob og anaerob vækst, 

disse udbyttekonstanter er fundet for cellemasse ud fra et substrat bestående af glucose. For at 

kunne vælge hvilken der sammenlignes med i dette projekt, udregnes den maksimale 

aerob 

udbyttekonstant, X max 

S 

Y , ud fra de fundne værdier [3], [2]: 

aerob anaerob 

(I) : Y X = 0,50 , Y X = 0,15 

g biomasse dannet g biomasse dannet 

S 

g glucose forbrugt 

S 


aerob anaerob 

(II) : Y X = 0,67 , Y X = 0,11 

g biomasse dannet g biomasse dannet 

S 


S 


Hvis der kun tages højde for nedbrydningen af substrat, i dette tilfælde glucose ved aerob 

og anaerob nedbrydning, fås følgende maksimalt opnåelige udbyttekonstanter: 

Opformering af Saccharomyces cerevisiae Side 9 af 73 

X 

S


Y 

Y 

Y 

X 

S max 

X 

S max 

X 

S max 

aerob 

anaerob 

aerob 

= 0, 

20⋅ 

Y + ( 1− 

0, 

20) 

⋅ Y 

Y X = 0, 

20⋅ 

Y + ( 1− 

0, 

20) 

= 0, 

20⋅ 

0, 

50 + 

= 0, 

220 

X 

S 

( 1− 

0, 

20) 

X 

S 

⋅0, 

15 

= 0, 

222 

( 1− 

0, 

20) 


Y 

Y 

S max 

X 

S max 

X 

S max 

X 

S 

= 0, 

20⋅ 

0, 

67 + 

(I) (II) 

⋅ Y 

⋅0, 

11 

anaerob 

X 

S 

Hvis der samtidig med nedbrydningen af glucose tages højde for aerob nedbrydning af den 

ethanol, der dannes ved den anaerobe glucosenedbrydning, er det muligt at estimere ' 

er defineret som: 

Y 

anaerob 

+ ( 1− 

0, 

20) 

⋅ 

Y X + YE 

⋅ X 

S 

S E 

' X aerob 

= 0, 

20⋅ 

Y 

S 

X 

Y 

max 

S 

Dette kræver dog, at udbyttekonstanterne E 

S 

Y og X 

E 

Y kendes, hvor 

Y ,der 

X 

S 

Y E er massen af ethanol 

S 

dannet set i forhold til massen af substrat forbrugt, i dette tilfælde glucose og 

cellemasse dannet set i forhold til massen af ethanol forbrugt. 

YX E 

er massen af 

Y 

Y 

Y 

' X 

S max 

' X 

S max 

' X 

S max 

aerob 

anaerob 

' 

= 0, 

20⋅ 

Y + ( 1− 

0, 

20) 

⋅ Y + YE 

⋅ Y X Y X 

aerob 

= 0, 

20⋅ 

Y + ( 1− 

0, 

20) 

= 0, 

20⋅ 

0, 

50 + 

= 0, 

463 

X 

S 

 

 

 

X 

S 

( 1− 

0, 

20) 

⋅( 

0, 

15 + 0, 

41⋅ 

0, 

74) 

S 

E 

 

 

 

Y 

Y 

S max 

' X 

S max 

' X 

S max 

= 0, 

20⋅ 

0, 

67 + 

= 0, 

465 

(I) (II) 

X 

g biomasse dannet 

= 0, 

74 

[2] 

g ethanol dannet 

hvor Y E = 0, 

41 og Y 


g ethanol forbrugt 

S 

E 

X 

S 

 

⋅ 

Y 

 

anaerob 

X 

S 

+ Y 

E 

S 

( 1− 

0, 

20) 

⋅( 

0, 

11+ 

0, 

41⋅ 

0, 

74) 

Ved at tage højde for den aerobe nedbrydning af ethanol er det muligt at opnå et teoretisk 

udbytte på ca. 0,46 til 0,47 g cellemasse pr. g glucose forbrugt mod kun 0,22 g cellemasse pr. 

g glucose forbrugt uden hensyntagen til nedbrydning af ethanol. Det vil være 

udbyttekonstanten på 0,46 til 0,47 g biomasse pr. g substrat, der vil stræbes efter at nå i dette 

projekt. 

Som det ses af den ovenstående beregning er forskellen mellem (I) og (II) ved beregning 

' af Y X , meget lille ved brug af de forskellige teoretiske udbyttekonstanter. Derfor vælges at 

S 

aerob g biomasse dannet 

anaerob g biomasse dannet 

anvende (I): Y X = 0, 

50 

og Y 


X 0, 

15 


S 

S 

⋅ Y 

= til beskrivelse af den 

teoretiske vækst for S. cerevisiae. Nedbrydningen af glucose foregår som nævnt ved både 

X 

E


aerob og anaerob nedbrydning samt aerob nedbrydning af ethanol. Disse 

nedbrydningsreaktioner er beskrevet i Afsnit 3.2.2: 

3.2.2 Metabolismeligninger 

Aerob nedbrydning af glucose 

Ved aerob nedbrydning omdannes glucose hovedsageligt til cellemasse: 

a C6 

H12O 

6 + b NH3 

+ d O 2 → C6H 

10, 

9O1, 

03N 

3, 

06 + e CO 2 + f H 2O 

(a) 

aerob 

g biomasse produceret 

hvor Y X 0, 

50 

S 


= , hvilket medfører: 

1, 58 C6 

H12O 

6 + 3, 

06 NH 3 + 3, 

57 O 2 → C 6H 

10, 

9O1, 

03N 

3, 

06 + 3, 

49 CO 2 + 8, 

63H 

2O 

(b) 

Anaerob nedbrydning af glucose 

Figur 3.2: (a) Aerob nedbrydning af glucose [3]. 

(b) Aerob støkiometrisk nedbrydning af glucose. 

Ved anaerob nedbrydning omsættes glucose til cellemasse samt kuldioxid og ethanol: 

a C H O 

+ 

6 

12 

6 + b NH3 

→ C6H 

10, 

9O1, 

03N 

3, 

06 + d H 2O 

+ eCH 

3CH 

2OH 

f CO 2 (a) 

anaerob 


hvor Y 

X 0, 

15 

S 



5,27C6H12O6 + 3,06NH3 → C6H10,9O1,03N3,06 + 5,06H2O+ 8,57CH3CH2OH+ 8,48CO2 

(b) 

Aerob nedbrydning af ethanol 

Figur 3.3: (a) Anaerob nedbrydning af glucose [3]. 

(b) Anaerob støkiometrisk nedbrydning af glucose. 

Ved anaerob nedbrydning af glucose dannes en del ethanol, som ved tilstedeværelse af ilt kan 

omdannes til yderligere cellemasse og kuldioxid: 

a CH 3 CH 2OH 

+ b NH 3 + d O 2 → C6 

H10, 

9O1, 

03N 

3, 

06 + e CO 2 + f H 2O 

(a) 


hvor Y X 0, 

74 

g ethanol forbrugt 

E 


4 2 

, 18 CH 3 CH 2OH 

+ 3, 

06 NH 3 + 6, 

61O 

2 → C 6H 

10, 

9O1, 

03N 

3, 

06 + 2, 

35CO 

2 + 11, 

67 H O (b) 

Figur 3.4: (a) Aerob nedbrydning af ethanol [3]. 

(b) Aerob støkiometrisk nedbrydning af ethanol. 

Det er valgt at anvende samme kemiske formel for cellemasse, som der blev anvendt i 

Forssling et al. 



Ud fra de tidligere definerede udbyttekonstanter er det muligt at udregne konstanterne a til 

f i de tre reaktionsligninger, se Figur 3.2, Figur 3.3 og Figur 3.4(b). 

Ud fra ovenstående ligninger ses det tydeligt, at der dannes langt mere kuldioxid ved 

anaerob nedbrydning af glucose og den efterfølgende omsætning af ethanol end ved aerob 

nedbrydning af glucose. Ud fra denne teoretiske betragtning vurderes, at det vil være muligt at 

kunne måle forskellen mellem dannelsen af kuldioxid ved aerob og anaerob vækst 

eksperimentalt vha. respirationskvotienten, og derved bestemme om fermenteringen forløber 

under aerobe eller anaerobe forhold. 

3.2.3 Respirationskoefficient 

De analyser, der vil blive udført på udgangsgassen, kan anvendes til at vurdere 

respirationskoefficienten (RQ) med. Respirationskvotienten er en anvendelig måde til at 

bestemme, hvorvidt en fermentering foregår under aerobe eller anaerobe forhold. 

Respirationskvotienten er defineret som [3]: 

RQ = 

mol CO2 

dannet 

mol O2 

forbrugt 

Værdier større end 1 indikerer dannelse af ethanol og dermed anaerobe forhold, værdier 

under 0,6 indikerer ethanolnedbrydning, mens værdier mellem 0,6 og 1,0 indikerer aerob 

vækst [3], [22]. 

Ud fra Figur 3.2, Figur 3.3 og Figur 3.4 er det muligt at beregne respirationskoefficienten 

for aerob og anaerob nedbrydning af glucose samt aerob nedbrydning af ethanol: 

3, 49 mol 

RQaerob glucose = = 0,98 

3,57 mol 

2,35mol 

RQaerob ethanol = = 0,36 

6,61mol 

8, 48mol 

RQanaerob glucose = = lim RQ→∞ 

molO forbrugt →0 

O2→0 2 

Som det ses af ovenstående beregninger ligger den teoretiske respirationskvotient for aerob 

nedbrydning af glucose på 0,98; hvilket passer med definitionen på en RQ liggende mellem 

0,6 og 1,0. Den teoretiske respirationskvotient for aerob nedbrydning af ethanol er beregnet til 

0,36; og denne skulle være under 0,6; hvilket også passer fint. 



Det er ikke muligt at beregne den teoretiske respirationskoefficient for anaerob 

nedbrydning af glucose, idet der ikke indgår ilt i reaktionsligningen. Dog ses det at 

respirationskoefficienten er over 1,0. I praksis vil det være muligt at beregne RQ, da indholdet 

af ilt og kuldioxid i udgangsgassen til et givet tidspunkt kan beregnes, se Afsnit 8.1. 

3.3 Pasteur-effekt 

Tilstedeværelsen af ilt inhiberer S. cerevisiaes fermenteringsevne under aerobe forhold, det vil 

sige at omsætningen af sukker forløber hurtigere ved anaerobe forhold end ved aerobe forhold, 

uden forbrug af ilt. Denne effekt kaldes Pasteur-effekten [15]. 

g 

Pasteur-effekten ses kun i S. cerevisiae ved sukkerkoncentrationer under ca. 1 [15] eller 

L 

ved mangel på en vigtig vækstfaktor. Drejer det sig dog om mangel på en nitrogenkilde, har 

det ikke nævneværdig indvirkning på den aerobe væksthastighed, men derimod på den 

anaerobe væksthastighed [15]. 

Ved opformering af S. cerevisiae vil cellerne som tidligere nævnt kun kunne nedbryde 

mellem 3 til 20 % af sukker ved aerobe forhold sammenlignet med aerob nedbrydning på 25 

til 100 % for celler i dvale [15]. Da celler i vækst nedbryder sukker hurtigere end celler i 

dvale, fås hurtigere en lav sukkerkoncentration. Dermed vil Pasteur-effekten ses tydeligere for 

celler i vækst [15]. 

3.4 Crabtree-effekt 

Hvis koncentrationen af tilgængeligt sukker er høj, vil Pasteur-effekten ikke længere have 

nogen indvirkning på fermenteringen, idet denne som nævnt kun er aktiv ved 

g 

sukkerkoncentrationer under ca. 1 , herimod vil Crabtree-effekten aktiveres. Crabtree- 

L 

effekten bevirker, at metabolismen ændres fra aerob til anaerob ved sukkerkoncentrationer 

g 

over 0,5 til 1,0 [17], [16], selvom der er ilt tilstede i fermentoren, og dermed vil der blive 

L 

dannet ethanol, se Figur 3.5. 

Crabtree-effekten er særlig udbredt i forbindelse med sukkerfølsomme gærtyper som S. 

cerevisiae [15], [2]. For at undgå Crabtree-effekten er det nødvendigt at kunne regulere 

g 

tilledningen af substrat, så sukkerkoncentrationen ikke overstiger 0,5 til 1,0 . Det vil derfor 

L 

være fordelagtigt at anvende fed-batch fermentering, da det på den måde er muligt ikke at 



lede større mængder substrat til fermentoren end cellerne har brug for. Dette vil være meget 

effektivt, hvis det er muligt at måle sukkerkoncentrationen online. 

C6H12O6 glucose 

anaerob 

C 3 H 3 O 3 - 

CH 3 CH 2 OH 

ethanol 

pyruvat 

+ 

CO 2 

aerob 

aerob 

C 6 H 10 , 9 O 1 , 03 N 3 , 06 

cellemasse 

+ CO 2 

Figur 3.5: Glucose omdannes til pyruvat, som alt efter om der er aerobe eller anaerobe forhold bliver til 

henholdsvis cellemasse og kuldioxid eller ethanol og kuldioxid [17] 

En anden måde at beskrive begrænsningen i S. cerevisiaes anvendelse af sukker under 

aerobe forhold på er overflowsmetabolisme, som er skitseret i Figur 3.6. Ved tilfælde 1 er der 

overskydende kapacitet til nedbrydning af substrat, hvorfor det hele bliver omsat ved aerob 

vækst. I tilfælde 2 bliver det tilstedeværende substrat omsat aerobt, men en forøgelse af 

koncentrationen vil medføre dannelse af ethanol, anaerobe forhold. I tilfælde 3 er 

substratkoncentrationen højere end gærens nedbrydningskapacitet ved aerobe forhold og 

dermed vil der blive dannet ethanol, selvom der er ilt tilstede [17]. For at undgå 

ethanoldannelse under opformering af S. cerevisiae, så der lige akkurat opnås tilfælde 2, se 

Figur 3.6, skal tilledningen af substrat styres [17]. 

3.5 Substratinhibering 

Figur 3.6: Overflowsmetabolisme [17]. 

Udover Crabtree-effekt ved høje sukkerkoncentrationer kan der også forekomme inhibering af 

enzymaktiviteten ved høje substratkoncentrationer. Disse substratkomponenter kan være 

forskellige proteiner, vitaminer og lignende. Inhibering sker ved, at en inhibitor binder sig til 



enzymet, som herved ikke kan binde sig til sukkermolekyler. Denne type inhibering kaldes 

kompetitiv, se Figur 3.7a). Alternativt kan en inhibitor binde sig til enzym-sukkerkomplekset 

og dermed inhiberes omdannelsen af sukkeret, dette kaldes unkompetitiv inhibering, se Figur 

3.7b) [8]. 

a) Kompetitiv inhibering. b) Unkompetitiv inhibering. 

Figur 3.7: Enzyminhibeirng [8], hvor E: Enzym, S: Sukker, I: Inhibitor og P: Produkt. 

Kompetitiv inhibering vil ikke fuldstændigt kunne forhindre omdannelse af sukker, men vil 

bevirke en lav koncentration af frit enzym, hvorimod unkompetitiv inhibering vil forhindre, at 

enzymet katalyserer omdannelsen af sukker, idet inhibitoren som sagt sætter sig på enzymsukkerkomplekset 

[8]. Kompetitiv og unkompetitiv inhibering er reversible, og derfor vil det 

være muligt at ophæve disse, hvis indholdet af inhibitorer reduceres. Ved at tillede substratet 

løbende under fermenteringen, så substratkoncentrationerne ikke når over et vist niveau, er 

det muligt at undgå substratinhibering. Løbende substrattilledning ses ved både fed-batch og 

kontinuert fermentering, se Afsnit 4. 


K-PRO 7 Fermenteringsteori Gruppe 2 

4 Fermenteringsteori 

Der findes forskellige fermenteringstyper, tre af disse er batch, fed-batch og kontinuert 

fermentering, som gennemgås herunder. 

4.1 Batch fermentering 

Ved batch fermentering placeres gærceller i en lukket fermentor indeholdende substratet og 

inkuberes under optimale vækstbetingelser, se Figur 4.1a). Der er ikke noget flow ind i eller 

ud af fermentoren under fermenteringen bortset fra luftflow gennem fermentoren samt 

tilsætning af base og syre til regulering af pH [9]. Dette betyder, at substratet i fermentoren 

indeholder alle de næringssalte, vitaminer og sporstoffer, som gæren har brug for, i høje 

koncentrationer, hvilket kan medføre substratinhibering, se Afsnit 3.5. Derudover indeholder 

substratet også en høj sukkerkoncentration, hvilket betyder, at væksten vil foregå under 

anaerobe betingelser pga. Crabtree-effekten, se Afsnit 3.4. 

Under fermenteringen vil sukkerkoncentrationen falde, mens indholdet af cellemasse vil 

stige, se Figur 4.1b). En batch fermentering vil dog give et lavere udbytte end fed-batch 

fermentering pga. anaerob vækst under hele fermenteringen, se Afsnit 4.2. 

4.2 Fed-batch fermentering 

a) b) 

Figur 4.1: a) Skematisk oversigt over batch fermentering 

b) ----- sukkerkoncentration som funktion af tiden 

⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ cellemasse som funktion af tiden [9]. 

Ved fed-batch fermentering startes fermenteringen som ved batch fermentering, dvs. at der er 

overskud af alle næringsstoffer, hvilket som nævnt kan medføre både substratinhibering og 

Crabtree-effekt. Herudover tilledes yderligere substrat, se Figur 4.2a). Efter en vis periode er 

både substrat- og sukkerkoncentrationen faldet så meget, at der ikke længere er hverken 

substratinhibering eller Crabtree-effekt, og sukkerkoncentrationen er i stedet blevet den 



begrænsende faktor, se Figur 4.2b). På denne måde er det muligt at forlænge vækstfasen og 

dermed øge cellemasseudbyttet i forhold til batch fermentering. 

a) b) 

Figur 4.2: a) Skematisk oversigt over fed-batch fermentering 



4.3 Kontinuert fermentering 

Ved kontinuert fermentering fjernes fermenteringsvæske kontinuert fra fermentoren og 

samtidig tilsættes frisk substrat med samme hastighed, herved er det muligt at opretholde en 

høj cellekoncentration, se Figur 4.3. 

Ved kontinuert fermentering er det vigtigt at styre fortyndingshastigheden, dvs. den 

hastighed hvormed det friske substrat tilsættes og fermenteringsvæsken fjernes, da for høje 

fortyndingshastigheder kan medføre udvaskning af gærcellerne [15], [6]. 

a) b) 

Figur 4.3: a) Skematisk oversigt over kontinuert fermentering 



4.4 Vækstfaser for gærceller 

Vækst af gærceller sker i fire faser. Ved tilsætning af en cellestamme til et substrat vil der 

forekomme en vis nølefase, mens cellerne vender sig til de nye forhold. Herefter begynder 



den eksponentielle fase, hvor cellernes væksthastighed er størst. Ved batch fermentering kan 

den eksponentielle fase ikke fortsætte i længere tid, da der enten er en begrænset mængde af 

næringsstoffer tilstede, og der bliver ikke tilført yderligere næring, eller ved ophobning af et 

inhiberende produkt. Derfor går cellerne over i en ny fase kaldet den stationære fase, hvor der 

hverken sker nogen forøgelse eller nedgang i celleantallet. Efter en længere periode i den 

stationære fase overgår kulturen til dødsfasen, simpelthen fordi der ikke er flere 

næringsstoffer tilbage, og cellerne dør, se Figur 4.4 [7]. 

Ved fed-batch fermentering er det muligt at opretholde den eksponentielle vækstfase 

længere end ved batch fermentering, da der tilledes frisk substrat, men også her vil 

cellekulturen overgå til den stationære fase, idet affaldsprodukter og inhiberende biprodukter 

vil ophobes i fermenteringsvæsken. Derimod vil det ved kontinuert fermentering være muligt 

at opretholde den eksponentielle fase i en lang periode, da der både tilledes frisk substrat og 

samtidig fjernes fermenteringsvæske. Dette betyder, at alle de nødvendige næringsstoffer er til 

stede i fermentoren samtidig med at inhiberende produkter fjernes løbende, så disse ikke 

opnår en koncentration, der er høj nok til at inhibere væksten. 

Figur 4.4: En typisk vækstkurve for mikroorganismer [7]. 


K-PRO 7 Betydningen af ilt og omrøring Gruppe 2 

5 Betydningen af ilt og omrøring 

Da S. cerevisiae som tidligere nævnt maksimalt kan nedbryde 20 % af den tilgængelige 

mængde sukker under aerobe forhold, er det vigtigt at have et højt indhold af ilt i 

fermenteringsvæsken, så det er muligt for gæren at opnå den maksimale aerobe nedbrydning. 

Der vil ved den resterende anaerobe vækst dannes en vis mængde ethanol, som ved en høj ilt 

tilgængelighed kan omdannes til yderligere cellemasse. Kan ethanol ikke nedbrydes pga. lav 

ilt tilgængelighed, vil denne blive ophobet og kan dermed inhibere væksten af S. cerevisiae. 

5.1 Ilts opløselighed i væske 

For at undersøge betydningen af iltoverførslen samt omrørerhastigheden er det nødvendigt at 

vide hvor meget ilt der i teorien kan opløses i væsken. I dette afsnit beregnes ilts opløselighed 

i vand, som så senere kan sammenlignes med opløsningen af ilt i fermenteringsvæske. 

For at beregne opløseligheden skal ligevægten mellem ilt i gasfasen og i væskefasen kendes: 

O2(g) O2(aq) 

Ligevægten kan opskrives på følgende måde, hvor KH er Henrys lov konstant: 

Partialtrykket af ilt findes på følgende måde: 

C 

K C K p 

O2(aq) 

H = O = 

2(aq) H⋅ O2(g) 

pO2(g) 

p O = 

2(g) 

Til beregningerne benyttes følgende formel: 

y O · P 

2(g) total 

[ ] 

mg mol 

g mg 

C O 2(aq) KH y L L bar O 2(g) Ptotalbar M O 1000 

 

= ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ 

⋅ 

2 mol g 

y O = 0,209; se Tabel 8.1 

2(g) 

M O = 31,9988 

2 

g 

mol 

For værdier af H K , se Tabel 6.2. 

For ilts opløselighed ved forskellige overtryk og temperaturer, se Figur 5.1. 



16 

14 

12 

10 

8 

6 

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 

Overtryk [bar] 

8,6 

8,4 

8,2 

8,0 

7,8 

7,6 

7,4 

7,2 

7,0 

24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 

Temperatur [°C] 

Overtryk 

[bar] 

Ilts opløselighed 

mg 

L 

Temperatur 

[°C] 

Ilts opløselighed 

mg 

L 

0,0 7,79 25 8,48 

0,1 8,56 26 8,33 

0,2 9,33 27 8,18 

0,3 10,10 28 8,04 

0,4 10,87 29 7,91 

0,5 11,64 30 7,79 

0,6 12,41 31 7,65 

0,7 13,18 32 7,53 

0,8 13,95 33 7,41 

0,9 14,71 34 7,29 

1,0 15,48 35 7,18 

a) Trykafhængighed ved T = 30 °C b) Temperaturafhængighed P = 1 atm 

Figur 5.1: Opløseligheden af ilt i forhold til tryk og temperatur. 

Det ses af Figur 5.1, at en lille trykændring har en større indflydelse på opløseligheden af 

ilt i vand end en temperaturændring inden for de intervaller, hvor disse er beregnet. 

5.2 Iltoverførsel 

Under fermenteringerne er der anvendt en omrørerhastighed på 400 O 

min ved fermentering 1, 2 

og 3, herefter blev omrørerhastigheden øget til 700 O 

min ved fermentering 4, 5 og 6, se Afsnit 

7.3.4. Da der under fermenteringerne er anvendt to forskellige omrørerhastigheder undersøges, 

om dette har en effekt på iltoverførslen. 

Iltoverførslen fra luften til mikroorganismerne kan opdeles i 3 trin [3]. 

1 - Overførsel af ilt fra en luftboble til væsken. 

2 - Transport af opløst ilt gennem væsken til mikroorganismen. 

3 - Optagelse af opløst ilt fra væsken til mikroorganismen. 



Det har i praksis vist sig, at det begrænsende trin ofte er trin 1, derfor er det overførsel af ilt 

fra en luftboble til væsken, der vil blive set nærmere på her. 

Overførslen af ilt fra luftbobler til væske kan beskrives med følgende udtryk [3], [13]: 

d C 

d t 

O2 

= K 

L 

⋅ a ⋅ 

( C − C ) 

O2 

mættet 

hvor : KL : masseoverførselskoefficient [m/s] 

a : gas-væske kontaktflade pr. væskevolumen [m 2 /m 3 ] 

Det er ofte svært at måle både KL og a hver for sig i praksis, derfor måles de ofte som én 

konstant KLa[s -1 ] også kaldet den volumetriske masseoverførselskoefficient. Jo højere en 

værdi KLa antager, jo bedre er iltoverførslen. 

Det er muligt at bestemme KLa på flere måder, blandt andet ud fra nedenstående ligning 

samt ud fra en række forsøg. Begge dele er gjort for den MBR fermentor, som er anvendt i 

dette projekt, se Bilag 1. KLa kan estimeres ud fra følgende ligning [3], [13]: 

P Ka= k⋅ ⋅ V 

V 

 

 


x 

( ) 

beluftet 

L s 

hvor : Pbeluftet : Effektforbruget til iltoverførslen [W] 

V : Væskens volumen [m 3 ] 

Vs : Den lineære gashastighed [m/s] 

k,x og y : Konstanter 

Ovenstående formel gælder under følgende betingelser: 

y 

O2 

Pbeluftet 

V : 2 – 4400 L og 

V : 500 – 10.000 W 

3 

m 

5.2.1 Sammenligning af estimeret KLa ogpraktiskKLa 

De fundne værdier for KLa ved estimering og forsøg sammenlignes, se Tabel 5.1. 

Nomdrejninger 

O min 

KLaestimeret 

[s -1 ] 

KLapraktisk 

[s -1 ] 

400 0,030 0,0123 

700 0,132 0,0198 

Tabel 5.1: Estimeret og praktisk KLa fra Bilag 1.


De praktisk bestemte værdier for KLa er, som det ses af Tabel 5.1, meget mindre end de 

estimerede værdier, men der sker dog stadig en stigning fra 400 O 

min til 700 O 

min ved begge 

metoder. Den store forskel fra de praktiske til de estimerede værdier kan skyldes de 

konstanter der er indsat for k, x og y i formlen for udregning af KLaestimeret. Konstanterne 

gælder for fermentorer på mellem 2 og 4400 L, hvilket er et meget stort interval. Samtidig 

gælder formlen for omrørte fermentorer uafhængigt af omrørertype og antallet af 

omrørerblade samt udformningen af iltfordeler [3]. Pga. disse forhold vil der være en del 

usikkerhed på de estimerede værdier. 

Dog skal det nævnes, at der er fundet KLa værdier i litteraturen på 0,090 s -1 og 0,278 s -1 ved 

henholdsvis 500 og 750 O 

min i en fermentor med en diameter på 0,152 m [2], hvor den i dette 

projekt anvendte fermentor har en diameter på 0,20 m. De fundne værdier på 0,090 s -1 og 

0,278 s -1 passer meget godt med de estimerede værdier. Derfor burde det være muligt at opnå 

en højere værdi for KLa med den anvendte fermentor. De muligheder, der er for at øge KLai 

fermentoren, er bl.a. at øge omrørerhastigheden hvilket også vil have en positiv effekt på 

Pbeluftet 

V forholdet. Desuden kan KLapraksis øges ved at ændre udformningen af iltfordeleren, se 

Bilag 1. 

5.2.2 Sammenligning af forskellige P/V forhold 

På Novo Nordisk A/S anvendes fermentorer på 80 m 3 [22], hvorfor det er ikke muligt at 

udregne KLa, da der ikke haves en ligning, der gælder for fermentorer på 80 m 3 . Derfor 

Pbeluftet 

sammenlignes i stedet forholdet, da dette er nemt at beregne. 

V 

På Novo Nordisk A/S anvendes 80 m 3 fermentorer, som under en fermentering vil være 

fyldt op med mellem 60 og 80 m 3 fermenteringsvæske. Herudover vides, at der anvendes en 

effekt på 190 kW til at drive omrøreren. Denne værdi vil ikke være den effekt, der reelt 

omsættes i fermenteringsvæsken, da der vil være noget friktion, hvorfor det antages at 80 % 

af effekten reelt omsættes i væsken: 

PNovo = 190 kW = 190000 W 

Preel Novo = η⋅PNovo =0,80⋅ 190000 W = 152000 W 

VNovo = 

60 −80 

m 

2 

3 

=70m 3 



Pbeluftet 

Der beregnes et 

V forhold for gennemsnitvoluminet: V = 70 m3 , se Tabel 5.2. 

Ud fra KLapraktisk erdetmuligtatberegne beluftet P 

V 

forholdet for MBR fermentoren ved at 

anvende ligningen for KLaestimeret, se nedenstående. Der er som nævnt en del usikkerhed på 

denne ligning, men det er meget interessant at kunne sammenligne beluftet P 

forholdet for den 

anvendte fermentor med beluftet P 

V 

for fermentorerne på Novo Nordisk A/S. 

Den lineære hastighed, Vs, i MBR fermentoren er 1,33 ⋅ 10 -2 m 

s , se Bilag 1. 

0,7 

P K a = 0,002⋅ ⋅ V 

V 

( ) 

beluftet 

L s 

0,2 

P 

−3 

7,5 ⋅10 

 

 

beluftet 

−2 

= 0,002⋅ ⋅( 1,33⋅10 ) 

Værdier for 

Pbeluftet 

V 

forholdet for den anvendte fermentor i praksis ses i Tabel 5.2. 

Derudover beregnes 

Pbeluftet 

V forholdet ud fra de estimerede værdier af Pbeluftet og det 

gennemsnitlige volumen, Vgnst =7,5⋅10 -3 m 3 , se Tabel 5.2. 

N 

O 

min 

 

P 

[W] 


0,7 

V 

[m 3 ] 

V 

Pbeluftet 

V 

W 3 m 

Novo Nordisk A/S - 152000 70 2171 

400 1,22 7,5 ⋅ 10 -3 

Fermentorestimeret 

700 10,26 7,5 ⋅ 10 

162 

-3 

1368 

Fermentorpraktisk 

N 

O 

min 

 

KLa 

[s -1 ] 

V 

[m 3 ] 

400 0,0123 7,5 ⋅ 10 -3 

700 0,0198 7,5 ⋅ 10 -3 

Pbeluftet 

V 

W 3 m 

46 

91 

Tabel 5.2: P/V forhold for fermentor på Novo Nordisk samt MBR fermentoren. 

Pbeluftet 

DetsesafTabel5.2,atderfåset 

Nordisk A/S, mens det højest opnåelige beluftet 

V forhold på 2171 3 

m 

P 

V 

P 

V 

W 

0,2 

for fermentorerne på Novo 

forhold for fermentoren ud fra estimerede 

Pbeluftet-værdier er 1368 W 

3 . Det højeste m 

beluftet forhold er lige godt halvdelen værdien fra Novo 

Nordisk A/S. Sammenlignes 

Pbeluftet 

V 

forholdet i praksis med forholdet på Novo 

Nordisk A/S ses det, at der ved den anvendte fermentor fås en meget lille værdi i forhold til 

Novo Nordisk A/S og i forhold til de estimerede værdier.

K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelse Gruppe 2 

6 Forsøgsbeskrivelse 

I dette afsnit angives hvordan fermenteringerne blev udført rent praktisk, og hvilke apparater 

og metoder der blev anvendt. Fermenteringerne blev udført på Ingeniørhøjskolen Odense 

Teknikum i efteråret 2003. Der blev udarbejdet forskellige checklister for at sikre at alle 

parametre var indstillet korrekt, inden fermenteringerne blev startet, se Bilag 2. 

6.1 Forkultur 

Inden fermenteringen var det nødvendigt at fremstille en forkultur. Denne blev podet med S. 

cerevisiae fra skråagar udleveret af Novo Nordisk A/S, i en 500 mL Erlenmeyer kolbe 

indeholdende 250 mL substrat fremstillet efter opskrift fra Novo Nordisk A/S [21]. Dette blev 

gjort for at få gæren ud af dvale samt for at kunne pode fermentoren med en større mængde 

end der kunne udtages fra skråagaret. Substratet autoklaveredes og efter nedkøling blev det 

podet. Herefter inkuberedes forkulturen ved 32 ºC i ca. to døgn. 

6.2 Podning af fermentor 

Fermentoren blev podet med et kendt volumen forkultur med en steril fuldpipette vha. en 

pipettesuger (Bibby-jet). Efter podning blev der udtaget 30 mL af forkulturen til 

trippelbestemmelse af celletørstof, så indholdet af celletørstof i den tilsatte podemængde 

kunne udregnes, se Måledata 1 til 6. 

6.3 Fermentering 

Fermenteringerne foregik i en 16-liters fermentor af typen MBR REACTOR AG. 

SWIZERLAND, IMCS 2000, som var udstyret med bl.a. en pH-elektrode, en iltelektrode, et 

termometer, et manometer, en prøveudtagningsventil, en trykreguleringsventil samt en 

overtryksventil, se Figur 6.1. Fermentoren havde en gennemsnitlig indvendig diameter på 

0,20 m og en omrørerdiameter på 0,07 m. Fermentoren blev styret vha. en kontrolenhed samt 

reguleringsprogammet VisSim via en PC. Kontrolenheden gjorde det muligt at regulere 

temperatur, pH samt omrørerhastighed, mens det vha. PC’en var muligt at styre 

substrattilledningen samt opsamle data, se Afsnit 6.4. 

Temperaturen og pH-værdien ved fermenteringerne blev valgt i samarbejde med Novo 

Nordisk A/S til henholdsvis 30 ºC og 5,4. Herudover er der valgt et fermenteringsforløb på 34 

timer. 



Udover online temperatur-, pH- og iltmålinger, måltes indholdet af celletørstof samt 

koncentrationen af sukker og ethanol i fermenteringsvæsken, desuden måltes indholdet af 

nitrogen og kuldioxid i udgangsgassen. Disse målinger blev foretaget offline, se Afsnit 6.5. 

Figur 6.1: MBR REACTOR AG. SWIZERLAND, IMCS 2000 

Fermenteringen blev startet som en batchfermentering for at sikre en vis vækst i starten af 

forløbet, se Afsnit 7. Denne vækst var anaerob, da sukkerkoncentration i fermentoren ville 

være højere end grænsen for Crabtree-effekten, se Afsnit 3.4. Sandsynligvis ville sukkeret 

blive nedbrudt først, hvorefter gæren begyndte at nedbryde den dannede mængde ethanol fra 

den anaerobe nedbrydning. Ved at måle på indholdet af sukker var det muligt at følge denne 

udvikling og derved begynde tilledningen af substrat, når koncentrationen af sukker blev lav. 

6.4 Online dataopsamling 

Forskellige parameter blev målt online, disse data blev som nævnt opsamlet vha. en PC. Dette 

var tilfældet for pH, temperatur og koncentrationen af opløst ilt i fermenteringsvæsken. 



Dataopsamlingen fandt sted vha. reguleringsprogrammet VisSim. Fælles for de forskellige 

data var, at PC’en modtog et signal mellem –10 og +10 Volt. Dette signal blev behandlet på 

følgende måde, se Figur 6.2. 

Figur 6.2: Signal behandling for pH 

Til signalet ind blev der lagt 10, således at signalet lå mellem 0 og 20, hvorefter det blev 

multipliceret med 0,5; så signalet lå mellem 0 og 10. Dette signal blev multipliceret med en 

konstant, der udvidede signalet fra mellem 0 og 10 til det ønskede interval. I tilfældet med pH, 

var denne konstant 1,4; således at signalet antog en værdi mellem 0 og 14. Konstanter for 

temperatur og ilt, se Tabel 6.1. 

Måling af Måle interval Konstant 

pH 0 til 14 1,4 

Temperatur 0 til 150 °C 15 

Ilt 0 til 1000 % 100 

Tabel 6.1: Konstanter og måleområde for online parametre. 

Temperaturen og pH var værdier, der direkte kunne anvendes som en konkret værdi, 

hvorimod værdien for ilt først skulle omregnes, hvilket blev gjort på følgende måde: 

- Iltsignalet, som antog en værdi mellem 0 og 1000, multipliceredes med 0,001 således at det 

antog en værdi mellem 0 og 1, denne værdi blev kaldt K . 

- Derefter blev partialtrykket af O2 ( p ) udregnet som følgende [23]: 

O2 

= − ⋅ 

sat 

p (P p ) K 

O2 total H2O O2 

- Herefter omregnedes partialtrykket af O2 til antallet af mg O2, der var opløst pr. L væske, 

dette blev gjort ved hjælp af Henrys lov konstant ( K H ) på følgende måde: 

mol [ ] [ ] 

mg g mg 

C O 2(aq) L = K H ⋅p L bar O bar ⋅M 

2(g) O ⋅1000 

 

⋅ 

2 mol g 

Denne værdi var koncentrationen af ilt i rent vand, hvilket ikke var den korrekte værdi, da 

der i fermentoren var fermenteringsvæske og ikke rent vand. I dette projekt antages dog, at 

værdien for iltkoncentrationen i fermenteringsvæsken ligger lige under iltkoncentrationen i 


O2


vand, se Afsnit 7.1.3. Anvendte damptryk og Henrys lov konstanter til beregningerne i 

temperaturintervallet 25 til 35 ºC, se Tabel 6.2. 

Temperatur 

T [°C] 

Mættet vandamptryk 

sat 

p [bar] 

Henrys lov konstant 

HO 2 

KH mol Lbar ⋅ 

25 3,17 · 10 -2 

1,25 · 10 -3 

26 3,36 · 10 -2 

1,23 · 10 -3 

27 3,56 · 10 -2 

1,21 · 10 -3 

28 3,78 · 10 -2 

1,19 · 10 -3 

29 4,01 · 10 -2 

1,17 · 10 -3 

30 4,24 · 10 -2 

1,15 · 10 -3 

31 4,49 · 10 -2 

1,13 · 10 -3 

32 4,75 · 10 -2 

1,11 · 10 -3 

33 5,03 · 10 -2 

1,09 · 10 -3 

34 5,32 · 10 -2 

1,08 · 10 -3 

35 5,62 · 10 -2 

1,06 · 10 -3 

Tabel 6.2: Damptryk og Henrys lov konstant i temperaturintervallet 25 – 35 ºC. 

6.5 Prøveudtagning 

Prøveudtagningsventilen, se Figur 6.1, blev steriliseret før prøveudtagning ved hjælp af damp, 

hvorefter der blev udtaget omkring 10 mL for at fjerne den væske, der sad i 

prøveudtagningsventilen. Herefter blev der udtaget ca. 45 mL fermenteringsvæske, som blev 

anvendt til tørstof- samt ethanol- og sukkerbestemmelse. Alle manuelt målte data dvs. 

absorbans for ethanol og sukker samt volumenmålinger blev indskrevet i Skema for 

prøveudtagning, se Bilag 2. 

6.5.1 Tørstofbestemmelse 

Indholdet af celletørstof i fermentoren blev fundet ved at udtage tre gange 10,00 mL af de 45 

mL fra prøveudtagningen, som blev centrifugeret i en centrifuge af typen SIGMA 4 – 10 fra 

Stuers ved 3500 O 

min i 5 min. Den ovenstående væske blev bortskaffet, mens det 

tilbageblivende bundfald tørredes i varmeskab ved 105 ºC i 1 til 2 døgn. Vægten af det tørre 

centrifugeglas var kendt, og derved var det muligt efter tørring at bestemme indholdet af 

tørstof i de 10,00 mL fermenteringsvæske, hvorefter koncentrationen pr. liter kunne 

bestemmes, se Måledata 1 til 6. Der blev foretaget trippelbestemmelse af alle 

tørstofbestemmelser. 



Alternativ 

Som alternativ til tørstofmålingerne kunne der være foretaget optiske densitet (OD) målinger 

til bestemmelse af celletørstof som i Forssling et al. Fordelene ved OD målingerne er at der 

opnås et resultat med det samme, hvorimod der ved almindelig tørstofmåling går 1 til 2 døgn, 

før resultatet haves. Dette kan bl.a. anvendes, hvis det var besluttet at pode fermenteren med 

et fast mængde tørstof og ikke et fast volumen som i dette projekt. 

I den indledende fase i dette projekt blev der forsøgt med at foretage OD målinger, disse 

blev fortaget vha. spektrofotometer ved 610 nm. Af resultatet sås det, at målingerne på den 

samme prøve svingede forholdsvist meget, hvilket de tørstofmålinger der blev fortaget under 

dette projekt ikke gjorde, se Måledata 1 til 6. Derudover var det muligt at se en synlig 

udvikling af celletørstof i centrifugeglassene fra prøveudtagning til prøveudtagning 5 . 

Under dette projekt blev der desuden fortaget målinger af sukker og ethanol, hvilket blev 

fortaget vha. spektrofotometer ved 340 nm. Det blev derfor besluttet ikke at måle OD, da det 

hurtige resultat ikke var nødvendigt, samt for at undgå at skifte bølgelængde på 

spektrofotometeret hver gang der skulle udføres en prøve. Ved skift mellem de to 

bølgelængder anvendes forskellige lamper, hvilket medførte, at lamperne jævnligt skulle 

slukkes og dermed ikke ville nå at blive stabile. 

6.5.2 Sukker- og ethanolbestemmelse 

Både sukker og ethanol-koncentrationerne i fermenteringsvæsken blev bestemt ved hjælp af et 

enzymkit fra Boehringer Mannheim, hvorefter det var muligt at måle indholdet på et 

spektrofotometer af typen UVICON 810 fra KONTRON ANALYTICAL ved 340 nm. 

Der blev udtaget en prøve på 10,00 mL af de 45 mL fra prøveudtagningen, som 

centrifugeredes i en centrifuge af typen SIGMA 4 – 10 fra Stuers ved 3500 O 

min i5min. 

Herefter placeredes prøven i et 80 ºC vandbad for at standse de enzymatiske reaktioner i 

væsken. Herefter blev der udtaget 0,100 mL prøve til hver af de to bestemmelser, som blev 

behandlet efter forskrifterne, se Bilag 3 og Bilag 4. Der blev kun foretaget en gentagelse, da 

enzymkittene var kostbare, samtidig var det vigtigere at få et billede af udviklingen i 

indholdet af ethanol og sukker end at få de specifikke koncentrationer. 

Kendte og beregnede koncentrationer af henholdsvis sukker og ethanol blev sammenlignet for 

at undersøge, hvor anvendelige enzymkittene var, se Bilag 3 og Bilag 4. 

5 Denne udvikling kunne kun ses, men ikke måles. 



6.5.3 Gasanalyse 

Til fermentoren var der tilkoblet en gasmus, som er et glasrør med 

to ventiler, en i hver ende samt et septum til udtag af gasprøver. 

Gasmusen anvendes til at opsamle udgangsgas fra fermentoren, se 

Figur 6.3. For at udtage en prøve blev begge ventiler i musen åbnet 

og udgangsgassen løb igennem, herefter blev den nederste ventil 

lukket og efter nogle sekunder den øverste ventil, således at prøven 

var ved 1 atm., og derfor kunne sammenlignes med 

standardkurverne, se Bilag 5. Herved var der opsamlet gas i musen, 

og der kunne nu udtages en prøve på 50 µL med en gassprøjte, 

hvorefter denne analyseredes ved gaschromatografi, se Bilag 5. 

Udgangsgassen 

Figur 6.3: Gasmus. 

analyseredes for nitrogen og kuldioxid, idet koncentrationerne kunne findes ud fra 

udarbejdede standardkurver for de to gasser. Herefter kan koncentrationen af ilt i 

udgangsgassen beregnes og derefter kan respirationskoefficienten vurderes. Standardkurverne 

for nitrogen og kuldioxid er desuden undersøgt statistisk, se Bilag 5. For nærmere beskrivelse 

af anvendt statistik, se Bilag 6. Der blev foretaget trippelbestemmelse af udgangsgassen. 

6.5.4 Pladeudspredning 

Det var meget vigtigt, at fermenteringerne foregik under sterile forhold, og at kun S. 

cerevisiae var tilstede i fermentoren. Derfor blev der foretaget pladeudspredning af gæren 

efter hver fermentering, således at eventuel kontaminering kunne opdages. Der blev foretaget 

dobbeltbestemmelse i tilfælde af at petriskålen blev kontamineret på anden vis. 

Pladeudspredningen blev foretaget ved overfladeudsåning på Yeast-Peptone-Glucose (YPG) 

agar ud fra nedenstående opskrift [5]: 

Yeast-Peptone-Glucose agar 

- 24 g 

L Cell Count Agar 

- 5 g 

L peptone 

- 20 g 

L gærekstrakt 

- 10 g 

L D-glucose 

- 1,00 g 

L KH2PO4 

- 0,50 g 

L MgSO4 ⋅ 7H2O 



Der blev fremstillet 500 mL YGP- agar i en 500 mL målekolbe. Derefter blev der foretaget 

en opblødning af ingredienserne i koldt vand i omkring 15 min for at minimere risikoen for at 

den ydre cellemembran svulmede op og dermed kunne give et grynet substrat, hvilket ofte 

skete ved brug af varmt vand 14]. Til sidst justeredes pH til 5,4 vha. saltsyre. Herefter blev 

blandingen opvarmet til kogning, indtil alle partikler var opløst, hvorefter substratet blev 

autoklaveret ved 121 ºC i 20 min, se Afsnit 6.9. Agaren blev kølet til omkring 50 ºC, inden 

den blev overført til petriskålene for at undgå kondensdannelse i petriskålene ved nedkøling 

til stuetemperatur. Petriskålene blev fyldt i en LAF-sterilbænk for at sikre sterile betingelser. 

Herefter tørredes petriskålene i sterilbænken, hvorefter de blev sat på køl indtil anvendelse. 

Efter pladeudspredning inkuberedes petriskålene ved 32 ºC i ca. to døgn [5]. 

6.6 Tilledning til fermentoren 

Substrat, ammoniakvand, saltsyre og skumdæmper blev tilledt til fermentoren vha. 

slangepumper, se Figur 6.4b). Flaskerne til substrat, ammoniakvand og saltsyre var bluecap 

flasker forbundet med en slange op til fermentoren. Slangepumpen der blev anvendt til dette 

styres automatisk af PC og kontrolenhed, se Figur 6.4b) nederst. Skumdæmperen blev tilledt 

en slangepumpe, se Figur 6.4b) øverst, denne blev styret manuelt. På bluecap flaskernes låg 

var der monteret et luftindtag for at undgå undertryk i flaskerne, et sterilfilter for at undgå 

kontaminering samt en slange til at lede væsken over til fermentoren, se Figur 6.4a). 

a) Bluecap flaske. b) Slangepumper 

Figur 6.4: Flaske og slangepumper til tilledning. 



6.6.1 Substratforbrug 

Substratet blev fremstillet ud fra en opskrift fra Novo Nordisk A/S [23], herefter blev pH 

justeret til 5,4. Der blev til hver fermentering fremstillet 10 L substrat til tilledning, som blev 

autoklaveret umiddelbart efter fremstilling, se Afsnit 6.9, og 3,5 L startsubstrat, der blev 

autoklaveret i fermentoren umiddelbart inden podning. 

Hastigheden, hvormed substratet blev tilledt, styredes af en PC. Substratet blev tilledt med 

en pumpe, som modtog et signal fra PC’en mellem 0 og 5 V. Under fermenteringerne blev der 

anvendt indstillinger i intervallet 0 til 1 V. Pumpen drejede ikke rundt, før den modtog et 

signal der var større end eller lig 0,1 V. Dvs. at modtog pumpen et signal eksempelvis på 0,05 

V; blev der ikke tilledt noget substrat. 

Substratforbruget blev målt manuelt på flasken ved hver prøveudtagning samt før og efter 

fermenteringen, se Bilag 7. 

6.6.2 Skumdæmpning 

For at mindske skumdannelse under fermenteringerne blev der tilsat skumdæmper. Denne 

tilsætning blev foretaget manuelt, når skumniveauet blev for højt. Tilsætningen blev foretaget 

vha. af en slangepumpe, se Figur 6.4b) øverst. 

6.6.3 pH 

Der blev foretaget online pH-målinger, og ved ændringer i pH var fermentoren tilkoblet en 

kontrolenhed, som justerede pH ved tilledning af enten 10 % ammoniakvand eller 2 M 

saltsyre [22]. 

Forbruget af ammoniakvand og saltsyre blev målt manuelt ved hver prøveudtagning samt 

ved opstart og efter endt fermentering, se Bilag 7. Derudover kalibreredes pH-elektroden før 

hver fermentering for at sikre korrekte målinger. 

6.7 Temperatur 

Temperaturen blev målt online som pH, og kontrolenheden sørgede for opvarmning eller 

køling af fermentoren vha. henholdsvis damp eller koldt vand i kappen. 



6.8 Ilt 

Da nedbrydningen af sukker gerne skulle forløbe under så aerobe forhold, som det var 

praktisk muligt, se Afsnit 3.3, blev iltindholdet i fermenteringsvæsken målt online. Hermed 

var det muligt at følge iltindholdet under fermenteringen. Luftflowet gennem fermentoren 

blev sat til 25 L 

min . Luften til fermentoren blev leveret af en kompressor og passerede først 

gennem et oliefilter og derefter et sterilfilter. Oliefilteret havde til formål at undgå tilstopning 

af sterilfilteret, mens sterilfilteret skulle sikre mod kontaminering af fermentoren. 

Iltelektroden blev kalibreret inden opstart ved at tilsætte natriumsulfid til vand i 

fermentoren for at finde nulpunktet for iltkoncentrationen i vand, idet natriumsulfid forbruger 

ilten i vand. Herefter blev vandet gennemboblet med luft i ca. en time under antagelsen af at 

væsken hermed var mættet med ilt. For teori om ilt, se Afsnit 5. 

6.9 Autoklavering 

Substratet blev autoklaveret ved 121 ºC i 20 min i begyndelsen af projektperioden, men dette 

viste sig at være for høj en varmemængde, da der forekom Maillard reaktion 6 , hvorved 

substratet blev sort. Herefter blev autoklaveringstiden og -temperaturen sat ned til 10 min ved 

110 ºC. Derudover blev det observeret, at hvis substratet blev opbevaret i køleskab inden 

autoklavering var der sket en udkrystallisation ved nedkølingen, hvorfor der forekom Maillard 

reaktion ved autoklavering. Derfor blev substratet autoklaveret umiddelbart efter 

autoklavering. Skumdæmper og saltsyre samt sterilfilter, tildrypningsnåle og pipetter blev 

autoklaveret ved 121 ºC i 20 min. Ammoniakvandet blev ikke autoklaveret, da dette ville give 

store lugtgener i laboratoriet, og blev i stedet sterilfiltereret. Dette foregik ved vakuumsug 

gennem et sterilfilter. 

6 

Ikke enzymatisk brunfarvning hvor sukkerstoffer og aminosyrer eller proteiner reagerer. 


K-PRO 7 Fermenteringerne Gruppe 2 

7 Fermenteringerne 

Fermenteringerne foregik i en MBR fermentor, der bl.a. var 

udstyret med en omrører. Omrøreren bestod af en akse med to 

omrørerblade påsat, se Figur 7.1. For at opnå omrøring i 

fermentoren var det nødvendigt, at væskestanden nåede over den 

nederste omrører. Det volumen, der dækker den nederste omrører, 

var ca. 3,5 L. Derfor var startvolumen af substrat sat til 3,5 L. 

I Forssling et al. var de 3,5 L startsubstrat ikke tilsat sukker, 

hvilket betød, at tilledningen af ekstra substrat skulle startes straks, 

således at gæren havde noget næring at vokse af. En lille mængde 

gær kunne kun omsætte en lille mængde sukker, hvilket bevirkede, 

at tilledningen skulle være meget langsom. I praksis kunne substratpumpen 

ikke pumpe så langsomt. Pumpen modtog et signal fra en 

PC. Signalet for at tillede så langsomt, at en inhibering pga. 

sukkerkoncentrationen blev undgået, var så lille, at det af pumpen 

opfattes som 0, se Afsnit 6.6. Figur 7.1: Omrøreren. 

I Forssling et al. resulterede dette i en af to ting. Enten at pumpen ikke kunne tillede 

substrat, før signalet blev tilstrækkeligt stort. Dette fandt først sted efter ca.12 timer og betød, 

at gæren blev sultet og der ikke har været vækst i denne tid, dvs. en forlænget nølefase. Eller 

også blev substrat tilledningen startet på et højere niveau, således at gæren ikke havde den 

forlængede nølefase. I begge tilfælde blev der forholdsvis hurtigt tilledt en mængde sukker til 

en lille mængde gær, hvilket sandsynligvis gav en høj sukker koncentration, og dermed 

virkede inhiberende, se Afsnit 3.4 og 3.5. 

I dette projekt blev der i stedet foretaget en batchfermentering i de 3,5 L startsubstrat. I de 

3,5 L substrat var der tilsat en mængde sukker, således den mængde gær, der blev podet med, 

kunne opformeres, inden tilledningen af substrat blev startes. Meningen var at opnå så stor en 

mængde gær, så gæren kunne nå at forbruge den mængde sukker der blev tilledt, således at 

sukkeret ikke virkede inhiberende. 



I batchfermenteringen ville der være en inhiberende effekt pga. sukkerkoncentrationen. 

Tilledningen af substrat blev først startet, når sukkerkoncentrationen nåede under et 

inhiberende niveau, se Afsnit 3.4, således at sukkeret kun havde en inhiberende effekt i 

batchfasen i starten af fermenteringen, og at der under den resterende del, fed 

batchfermentering, ikke ville være inhibering i særlig udtalt grad. 

7.1 Fermentering 1 

Formålet med fermentering 1 (f1) var at få noget erfaring med kørsel af fermentoren samt de 

forskellige analyser, der skulle udføres under dette projekt. 

7.1.1 Startbetingelser f1 

Det substrat, der bliver anvendt til fermentering på Novo Nordisk A/S, har en 

sukkerkoncentration på 145 g 

L . Det blev derfor valgt at anvende samme koncentration i de 3,5 

L substrat, batchfermenteringen skulle foregå i. 

Herudover blev der valgt en pH-værdi på 5,4 og en temperatur på 30 °C, se Afsnit 6.3. 

Desuden blev der anvendt en podemængde på 100 mL og en omrørerhastighed på 400 O 

min . 

Måledata og resultater fra fermenteringen ses i Måledata 1, og de vigtigste elementer 

diskuteres i nedenstående. 

7.1.2 pH og temperatur f1 

Det ses af Figur 7.2, at reguleringen kunne opretholde et stabilt pH- og temperaturniveau. pH 

elektroden var svær at kalibrere, pga. en løs forbindelse, så om pH-værdien var 5,3 eller eks. 

5,4; vides ikke med sikkerhed. Da der ikke blev optimeret på pH i dette projekt var det ikke 

vigtigt at opretholde en præcis pH-værdi, men at den blev holdt konstant. Det ses af Figur 7.2 

at pH-værdien var stabil på 5,4 ± 0,1, hvilket var tilfredsstillende 7 ,samtattemperaturenlå 

indenfor 30 °C ± 1,5, hvilket også var tilfredsstillende 8 . 

7 Et tilfredsstillende pH interval var ± 0,5 i perioder under 30 min. og ± 0,3 i længere perioder. 

8 En tilfredsstillende temperatur interval var ± 5 °C i perioder under 30 min. og ± 2 ºC i længere perioder. 



5,6 

5,5 

5,4 

5,3 

5,2 

0 5 10 15 20 25 30 35 

7.1.3 Ilt f1 

Tid [timer] 


34 

33 

32 

31 

30 

29 

28 

27 

26 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid[timer] 

a) pH f1. b) Temperatur f1. 

Figur 7.2: pH og temperaturforløb under f1. 

Opløseligheden af ilt i vand ved 30 °C og 1 atm. var 7,79 mg 

L 

1 er opnået følgende måledata: 

Ilt [mg/L] 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

-1 

, se Afsnit 5.1. Fra fermentering 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.3: Iltforløb under f1. 

Det ses af Figur 7.3, at der i de første ca. 10 timer var der rigeligt ilt tilstede i væsken, og at 

iltindholdet lå omkring 7-7,5 mg 

L 

. Denne værdi er lidt under den teoretiske værdi på 7,79 mg 

L , 

hvilket kan skyldes at den teoretiske værdi er ilts opløselighed i rent vand, og at en 

fermenteringsvæske har fysiske egenskaber forskellige fra vands. Derfor antages, at 

opløseligheden af ilt i fermenteringsvæsken ikke er den samme som opløseligheden af ilt i 

vand, men at opløseligheden af ilt i fermenteringsvæsken ligger lidt under opløseligheden af 

ilt i vand. Det antages derfor, at fermenteringsvæsken var mættet med ilt i de første 10 timer.


Herefter blev ilten rimeligt hurtigt forbrugt og efter 12 til 13 timer var iltindholdet i 

væsken nået 0 mg 

L 

, hvilket betød, at gæren brugte ilten ligeså hurtigt, som den blev opløst i 

væsken, og dermed var ilttilførslen ikke tilstrækkelig. Dette medfører at sukkeret omdannes 

anaerobt. 

I Forssling et al. er dette problem ikke omtalt, tværtimod blev det antaget, at iltindholdet i 

væsken var tilstrækkelig. Det vælges derfor at se nærmere på disse resultater. 

7.1.4 Værdier fra Forssling et al. 

Fra Forssling et al. ses der på online iltmålinger fra fermentering 9, hvor måledataene ses i 

Figur 7.4a) i mmHg, og hvor dataene er omregnet i Figur 7.4b) til mg 

L . 

475 

425 

375 

325 

275 

225 

175 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Omregningen fra mmHg til mg 

L 

8 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

a) Ilt [mmHg]. b) Ilt [mg/L]. 

Figur 7.4: Ilt under fermentering 9, fra Forssling et al.. 


20 

18 

16 

14 

12 

10 

i Figur 7.4 er foretaget ved brug af følgende formler: 

[ ] 

[ ] 

p mmHg 

O2 

pO bar = 1,01325bar⋅ 2 

760 mmHg 

[ ] 

mg mol 

g mg 

C O 2(aq) K L H p L bar O bar M 

2 O 1000 

 

= ⋅ ⋅ ⋅ 

⋅ 

2 mol g 

Det ses, at der i Forssling et al. har været en iltkoncentration på op til 20 mg 

L 

. Fermenteringen 

foregik ved en temperatur på 33 °C, hvilket betyder, at den teoretiske opløselighed er på 7,41 

mg 

L 

. Det ser ud som om, iltmålingerne ikke har været præcise nok under forsøg udført af 

Forssling et al. Desuden vides, at iltelektroden ikke var kalibreret, og at det ikke var det 

præcise iltindhold, der var interessant for Forssling et al., men blot om der var ilt tilstede i 

væsken eller ej.


Hvis iltkurven fra fermentering 9 i Forssling et al. forskydes, således at toppunktet passer 

med opløseligheden ved de 33 °C, fås følgende kurve, se Figur 7.5a). 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

-1 

-2 

-3 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 


8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

-1 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

a) Forskudt ilt kurve fra Forssling et al. b) Ilt kurve fra f1. 

Figur 7.5: Sammenligning af forskudt iltkurve fra Forssling et al. med iltkurve fra f1. 

Det ses af Figur 7.5a), at kurven fra Forssling et al. i forløb minder om kurven fra 

fermentering 1, se Figur 7.5b). Det ses desuden, at der efter 10 til 15 timer på begge kurver 

ikke var mere ilt tilstede i fermenteringsvæsken. 

Dog kan værdierne fra Figur 7.5a) ikke direkte anvendes, da iltelektroden som før nævnt 

ikke var kalibreret, og dermed var hældningen på kalibreringskurven ikke den korrekte. Det 

kunne derfor tænkes, at værdierne fra Figur 7.5a), der ligger under nulpunktet, skulle ligge 

omkring 0 mg 

L . 

7.1.5 Sukkerkoncentration f1 

Til måling af sukkerkoncentrationen blev der anvendt et enzymkit og efterfølgende analyse på 

et spektrofotometer. Her måltes en glucosekoncentration, som så blev omregnet til en 

sukkerkoncentration. 

Da der fra starten af fermenteringer var en sukkerkoncentration på 145 g 

L , se Afsnit 7.1.1 

og der under f1 kun er blevet målt en sukkerkoncentration omkring 7 g 

L , se Måledata 1, 

vurderes det, at målingerne fra f1 er ikke sikre nok. Da den rigtige sukkerkoncentration ikke 

kunne findes, blev det besluttet at stoppe målingerne for at spare på enzymkittene, da disse 

var rimelig kostbare. Det var forventet at sukkerkoncentrationen var høj under f1, da 

startkoncentrationen var 145 g 

L , hvilket har virket inhiberende. Derfor blev det besluttet ikke 

at tillede substrat under fermentering 1.


7.1.6 Ethanolkoncentration f1 

Pga. den høje sukkerkoncentration, der gav en inhiberende virkning, blev der dannet en del 

ethanol. Da den dannede ethanol formentlig var i en rimelig høj koncentration, gav denne de 

samme problemer ved ethanolmålingerne, som sukkeret gav ved sukkermålingerne. Af 

samme årsager blev det ligeledes besluttet at stoppe målingen af ethanol. 

7.1.7 Deldiskussion 1 

Det blev pga. den høje sukkerkoncentrationen valgt at sænke startkoncentrationen en faktor 

10 til 14,5 g 

L . Denne lavere koncentration vil ikke kunne inhibere cellevæksten i nær samme 

grad. 


Formålet med fermentering 2 (f2) var at få nogle bedre målinger for sukker og ethanol 

koncentrationen. 


Substratet til batchfermenteringen til f2 havde en sukkerkoncentration på 14,5 g 

L . Desuden 

blev der anvendt en podemængde på 100 mL og en omrørerhastighed på 400 O 

min .Øvrige 

betingelser, se Afsnit 6.3. Måledata og resultater fra fermenteringen ses i Måledata 2 og de 

vigtigste elementer diskuteres i nedenstående. 


pH og temperaturen lå under hele f2 på et stabilt og tilfredsstillende niveau, se Måledata 2, 

uden de store udsving. Dog var der omkring 15. til 17. time et fald i pH-værdien. Dette 

skyldtes, at der under fermenteringen dannedes forsurende produkter og at pumpen til 

tilledning af ammoniakvand satte ud, hvilket blev udbedret. Som det ses i Måledata 2, faldt 

pH fra 5,4 til 4,8, altså et fald på 0,6, hvilket er tæt på det tilfredsstillende interval på ± 0,5. 



7.2.3 Substrattilledning f2 

Der blev under f2 besluttet at starte for substrattilledningen efter ca. 10 timer, se Figur 7.6, 

hvorefter der blev besluttet at skrue op for tilledningen efter 15 timer og igen efter 20 timer. 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 


8000 

6000 

4000 

2000 

Tid [timer] 

a) Pumpesignal til substratpumpe under f2. b) Volumen substrat tilledt under f2. 

Figur 7.6: Substrattilledning under f2 

Det ses af Figur 7.6, at substrattilledningen foregik i 3 trin. 

7.2.4 Sukker- og ethanolkoncentration f2 

Sukker- og ethanolkoncentrationerne for f2 ses af Figur 7.7. Her ses det, at 

sukkerkoncentrationen havde et vist niveau, hvorefter den hen imod 10 timer begyndte at 

falde, hvorefter den igen steg. Endnu et svagt fald efterfulgt af en stigning blev der observeret 

efter ca. 16 timer. Stigningen i koncentrationen kom efter, at der blev skruet op for substrattilledningen 

og dermed også for tilledningen af sukker. 

Koncentration [g/L] 

40 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.7: Sukker- og ethanolkoncentrationen under f2. 

Ethanol 

Sukker


Ethanol koncentrationen var nær nul i starten af fermenteringen og steg derefter dramatisk 

efter ca. 20 timer til et niveau over 60 g 

L . Udover dette kendes den nøjagtige koncentration af 

ethanol ikke, se Bilag 4. 

Stigningen i ethanolkoncentrationen kunne skyldes, at ilttilgængeligheden ikke var 

tilstrækkelig, og der dermed dannedes ethanol under de anaerobe forhold. Samtidig blev den 

dannede ethanol ikke nedbrudt, da der ikke var nok ilt til denne omdannelse, se Afsnit 3.4. 

7.2.5 Ilt f2 

Ilt [mg/L] 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.8: Ilt koncentrationen under f2 

Det ses af Figur 7.8, at der i starten af fermenteringen var rigeligt ilt tilstede i væsken, og at 

koncentrationen lå omkring mætning. Efter 5 til 7 timer faldt koncentrationen af opløst ilt i 

væsken, hvilket tydede på at nølefasen for gæren var ovre, og at den eksponentielle fase var 

påbegyndt. Ilten faldt til nulpunktet, hvorefter der blev observeret en svag stigning. På Figur 

7.8 ses det, at der indtrådte tre stigninger i iltkoncentrationen, henholdsvis efter 10, 14 og 20 

timer. Disse stigninger i iltkoncentrationen tydede på inhibering, hvor gærens væksthastighed 

blev sænket, hvorefter ilten blev opløst i væsken hurtigere end den blev forbrugt af gæren, se 

Figur 7.8. Dette passede med, at der blev skruet op for substrat tilledningen tre gange, se 

Figur 7.6. Herved blev sukkerkoncentrationen øget og dermed også den inhiberende effekt, se 

Afsnit 3.4. 




Fermentering 2 forløb forholdsvis godt, derfor blev det besluttet at udføre en fermentering 

under de samme betingelser som under f2. 


Formålet med fermentering 3 (f3) var at gentage f2. 


Startbetingelserne for f3 var de samme som f2, se Afsnit 7.2.1. Måledataene og resultaterne 

for fermenteringen ses i Måledata 3 og de vigtigste elementer diskuteres i nedenstående. 

7.3.2 Temperatur f3 

Temperaturforløbet under f3 så ud som følgende, se Figur 7.9. 

Temperatur [°C] 

50 

45 

40 

35 

30 

25 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.9: Temperaturforløb under f3. 

Det ses, at temperaturen lå omkring 30 °C det meste af fermenteringen, hvilket var 

tilfredsstillende, dog var temperaturen oppe omkring 50 °C, i de første ca. 10 min., hvilket 

formentlig chokerede gæren, og dermed betød en forlænget nølefase. 



7.3.3 Ilt f3 

Ilt koncentrationen forløb som følgende under f3, se Figur 7.10 

Ilt [mg/L] 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.10: Iltkoncentration under f3. 

Det ses af Figur 7.10, at der under f3 var rigeligt ilt tilstede i væsken fra starten, og at ilten 

lå omkring mætning indtil efter ca. 20 til 25 timer. Herefter faldt koncentrationen af ilt opløst 

i væsken. Den lange nølefase inden gæren for alvor begyndte at bruge ilten, stemmer overens 

med den forventede lange nølefase pga. den forhøjede temperatur i starten af fermenteringen, 

se Figur 7.9. Dog så det ud til, at alt ilten i væsken blev forbrugt, da væksten af gæren kom i 

gang. 


Der kom ikke det store ud af f3, men der var dog elementer der kunne bruges. Der var ikke 

nok ilt opløst i væsken under f3 efter væksten kom i gang. Dette var også tilfældet ved både 

f1 og f2. Det kunne godt se ud, som om ilten var en begrænsede faktor. Derfor vil det ved den 

kommende fermentering f4 blive forsøgt at øge iltkoncentrationen i væsken. 

Under fermenteringen på Novo Nordisk A/S anvendes et overtryk på ca. 0,5 bar. Dette 

gøres for at undgå kontaminering. Ud over denne effekt øger et overtryk også opløseligheden 

af ilt i væsken, se Afsnit 5.1. Derfor besluttes det at øge trykket under f4 med ca. 0,5 bar. For 

yderligere at forbedre iltoverførslen hæves omrørerhastigheden fra 400 O 

min 

til 700 O 

min . 

Herudover ønskes det at gøre nølefasen kortere, således at væksten hurtigere kommer i 

gang, så der i sidste ende opnås et større udbytte. Det besluttes derfor, at podemængden 

fordobles fra 100 mL til 200 mL, så der fra start er en større mængde gær til at omsætte 

sukkeret. Dermed skulle koncentrationen hurtigere komme under et niveau således at 



Crabtree-effekten undgås. Af samme årsag besluttes det endnu en gang at reducere 

sukkerkoncentrationen i startsubstratet. Det besluttes at halvere koncentrationen fra 14,5 g 

L til 

7,25 g 

L . 


Formålet med fermentering 4 (f4) var at opnå en højere iltkoncentration i væsken. 


Substratet til batchfermenteringen under til f4 havde en sukkerkoncentration på 7,25 g 

L . 

Desuden blev der anvendt en podemængde på 200 mL, en omrørerhastighed på 700 O 

min samt 

sat et overtryk på fermentoren på 0,5 bar. Øvrige betingelser, se Afsnit 6.3. 

Måledataene og resultaterne fra fermenteringen ses i Måledata 4, og de vigtigste elementer 

diskuteres i nedenstående. 


pH og temperaturen under f4 lå på et stabilt niveau på nær et par udsving, se Figur 7.11. 

5,8 

5,4 

5,0 

4,6 

4,2 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

35 

34 

33 

32 

31 

30 

29 

28 

27 

26 

25 

0 5 10 15 2 0 2 5 3 0 3 5 

Tid [timer] 

a) pH-forløb under f4. b) Temperaturforløb under f4. 

Figur 7.11: pH- og temperaturforløb under f4. 

Det ses af Figur 7.11, at pH og temperaturen holdte sig på et stabilt niveau under f4 på nær 

et udsving i pH efter 30 timer og et udsving i temperatur efter 15 timer. Disse udsving skyldes 

tryksvingninger undervejs i fermenteringen, hvilket beskrives i næste afsnit. 



7.4.3 Ilt f4 

Ilt [mg/L] 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.12: Iltkoncentrationen under f4. 

Det ses af Figur 7.12, at iltkoncentrationen lå lige over 11 mg 

L 

de første 15 timer, hvilket 

stemmer overens med opløseligheden for ilt ved 0,5 bars overtryk på 11,64 mg 

L ,seAfsnit5.1. 

Efter ca. 15 timer faldt iltkoncentrationen fra lidt over 11 mg 

L 

til lidt over 7 mg 

L 

, hvilket passer 

med opløseligheden af ilt i vand ved atmosfæretryk. Dette skyldes, at der efter 15 timer skulle 

startes for substrattilledningen. Substratpumpen kunne ikke levere et tryk, der var stort nok til 

at overføre substrat til fermentoren ved et overtryk på 0,5 bar. Derfor blev trykket manuelt 

taget af fermentoren, således at substrattilledningen kunne startes, og fermenteringen forsatte 

herefter ved atmosfære tryk. 

Den overnævnte trykændring fandt sted efter 15 timer, hvorefter der også var et udslag i 

temperaturen, se Figur 7.11b), hvilket skyldes trykændringen. 

Fermenteringen forsatte normalt indtil 30. time, hvor iltkoncentrationen pludselig steg. 

Dette skyldes, at fermenteringen begyndte at skumme og ved ca. 30 timer skummede 

fermentoren over, hvilket medførte at alle ventiler stoppede til. Dette bevirkede en 

øjeblikkelig trykstigning til ca. 1 bars overtryk, hvormed opløseligheden af ilt steg. Der blev 

nu tilført mere ilt til væsken end gæren kunne nå at bruge. 

Den ovennævnte trykstigning, som fandt sted efter 30 timer, bevirkede at pumperne ikke 

var i stand til at tilføre hverken substrat eller saltsyre og ammoniakvand til at regulere pH. Da 

der ved fermentering dannedes forsurende produkter, faldt pH, når der ikke løbende blev 

tilledt base. Det var den pH ændring, der blev observeret efter ca. 30 timer, se Figur 7.11a). 



Efter ca. 30 timer blev der tilledt noget skumdæmper, og trykket blev igen manuelt taget af 

fermentoren. Iltkoncentrationen faldt, og pH-reguleringen forsatte. Herefter kendes ikke det 

eksakte volumen af væske i fermentoren, da noget af væsken var presset ud gennem ventiler 

mm. Desuden kunne pumperne ikke pumpe mod det store overtryk, hvilket medførte at noget 

af væsken i fermentoren blev presset fra fermentoren og over i beholderne til både substrat-, 

ammoniakvand- og saltsyretilledning. Dette var tilfældet for ca. halvdelen af væsken i 

fermentoren. 


Under fermentering 4 lykkedes det ikke at hæve trykket i fermentoren, så der kunne opløses 

mere ilt i væsken. Dog ses det af Figur 7.12 efter 30 timer, at hvis trykket og dermed 

opløseligheden af ilt steg, kunne der tilføres mere ilt til væsken, således at ilt ikke længere var 

den begrænsende faktor. 

Efter f4 blev der forsøgt at tillede substrat til fermentoren ved forskellige overtryk, hvor 

det lykkedes at tillede substrat ved et overtryk på 0,2 bar, således at tilledningen også var 

forholdsvis stabil. Det besluttes derfor at udføre næste fermentering f5 med et overtryk på 0,2 

bar. 


Formålet med fermentering 5 (f5) var at udføre en fermentering under et moderat overtryk. 


Substratet til batchfermenteringen under til f5 havde en sukkerkoncentration på 7,25 g 

L . 

Desuden blev der anvendt en podemængde på 200 mL og en omrørerhastighed på 700 O 

min 

samt sat et overtryk på fermentoren på 0,2 bar. Øvrige betingelser, se Afsnit 6.3. Måledataene 

og resultaterne fra fermenteringen ses i Måledata 5, og de vigtigste elementer diskuteres i 

nedenstående. 


pH og temperaturen blev holdt på et stabilt niveau. pH på 5,4 ± 0,05 og temperaturen på 30 

°C ± 1 °C, hvilket er tilfredsstillende, se Måledata 5. 



7.5.3 Ilt f5 

Det ses af Figur 7.13, at iltkoncentrationen de første 10 timer lå omkring 9 mg 

L 

, hvilket passer 

med opløseligheden på 9,33 mg 

L ved 0,2 bars overtryk. Efter 10 timer begyndte mængden af 

opløst ilt at falde, hvilket indikerede at nølefasen var forbi. Efter ca. 15 timer forekom der et 

hak i kurven, som svarede til at der på dette tidspunkt blev startet for substrattilledningen, og 

dermed steg sukkerkoncentrationen, hvilket havde en inhiberende virkning, se Afsnit 3.4. 

På Figur 7.13 ses, at iltkoncentrationen først nærmede sig nul efter 25 til 27 timer. 

Sammenlignes dette med ilten i f2, ses det af Figur 7.8, at iltkoncentrationen faldt hurtigere 

ved f2. Dette kan både skyldes, at ilttilførslen var bedre under f5 end under f2, da 

omrørerhastigheden var sat op, og at der kunne opløses mere ilt i væsken pga. det svage 

overtryk på 0,2 bar. 

Ilt [mg/L] 

10 

9 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [tim e r] 

Figur 7.13: Iltkoncentrationen under f5. 


På Figur 7.14 ses, at koncentrationerne af både sukker og ethanol var lave de første ca. 15 

timer. Herefter blev substrattilledningen startet, hvilket bevirkede, at koncentrationen af 

sukker steg. Stigning i sukkerkoncentrationen medførte inhibering og dermed dannelse af 

ethanol, se Afsnit 3.4. Efter at sukkerkoncentrationen igen faldt, blev ethanolen nedbrudt. Ved 

slutningen af fermenteringen var koncentrationen af både sukker og ethanol lav. 




40 

35 

30 

25 

20 

15 

10 


5 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 


Ethanol 

Sukker 

Det ses af resultaterne for f5, at hvis koncentrationen af sukker var lav, skete der ikke en 

inhibering, og ethanol kunne omdannes. Dette var ønskværdigt, da ethanol formentlig blev 

omdannet til cellemasse. Det ses, at da substrattilledningen blev startet, steg 

sukkerkoncentrationen mere end ønsket, Dette skete under både f4 og f5, se Figur 7.14 og 

Måledata 4, derfor blev der set nærmere på denne tilledning. 

7.6 Tilledningsprofil 

Tilledningen af substrat under fermentering 2, 3, 4 og 5 ses af Figur 7.15. 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

f3 

f 2 

0,7 

0,6 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

a) Tilledningsprofil for f2 og f3. b) Tilledningsprofil for f4 og f5. 

Figur 7.15: Tilledningsprofil for f2, f3, f4 og f5. 

Da der ikke blev tilledt noget substrat under f1, ses den ikke af Figur 7.15. Der er en 

væsentlig forskel mellem f2, f3 og f4, f5, hvilket er starttidspunktet for tilledningen af substrat. 

Under f2 og f3 blev tilledningen af substrat startet efter ca. 10 timer, hvor der under f4 og f5 

først blev startet efter ca. 15 timer. Desuden ses, at i alle fire tilfælde blev tilledningen af 


f4 

f 5


substrat startet med et signal på 0,3. Dette er et stort trin fra 0 i forhold til de mindre trin på 

0,1. 

Under f5 blev der til sidst skruet op til 0,6 uden, at dette betød en stigning i sukkerkoncentrationen, 

se Figur 7.14. Derfor må der kunne skrues endnu mere op sidst i 

fermenteringsforløbet. Et forslag til dette ses på Figur 7.16. Den afbildede tilledningsprofil er 

et 2. gradspolynomium, der er tilpasset en eksponentiel funktion. Dette er valgt på baggrund 

af, at gæren har et eksponentielt vækstforløb, se Afsnit 4.4. Desuden er det valgt at anvende 

en kontinuert funktion, da der hermed ikke manuelt skulle skrues op for substrattilledningen. 

Pumpe signal [V] 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 


f5 

Profil 

0s ≤ t < 54000s : V = 0 

54000s ≤ t < 122400s : V = 1,1350⋅10 ⋅t−8,7422⋅10 ⋅ t + 2,5597 ⋅10 

Figur 7.16: Tilledningsprofil for f5 og ønsket tilledningsprofil for f6. 

−10 2 −6−1 Det ses af Figur 7.16, at tilledningsprofilen starter blidere end tilledningen ved f5, og at der 

til slut tilledes mere end under f5. På denne måde kan inhibering pga. en stigende sukker 

koncentration i starten undgås, og en for lav koncentrationen ikke bliver begrænsende til slut. 

Det besluttes at følge denne tilledningsprofil under f6. 


Formålet med fermentering 6 (f6) var at udføre en fermentering, hvor substrattilledningen 

fulgte et bestemt forløb samt at undgå en stigning i sukkerkoncentrationen, når tilledningen af 

substrat blev startet. 

.



Substratet til batchfermenteringen under f6 havde en sukkerkoncentration på 7,25 g 

L . Desuden 

blev der anvendt en podemængde på 200 mL, en omrørerhastighed på 700 O 

min 

samt sat et 

overtryk på fermentoren på 0,2 bar. Øvrige betingelser, se Afsnit 6.3. Måledataene og 

resultaterne for fermenteringen ses i Måledata 6, og de vigtigste elementer diskuteres i 

nedenstående. 


Temperaturen for f6 lå på et stabilt og tilfredsstillende niveau, se Måledata 6, hvorimod der 

var et stort udsving i pH, se Figur 7.17. 

pH 

9,0 

8,6 

8,2 

7,8 

7,4 

7,0 

6,6 

6,2 

5,8 

5,4 

5,0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.17: pH-forløb under f6. 

Det ses af Figur 7.17, at pH værdien startede omkring 5,4, hvorefter den steg kraftigt, da 

der blev tilledt ammoniakvand. Derfor blev der slukket for pH reguleringen. Stigningen i pH 

skyldtes formentlig en løs forbindelse til både pH-elektroden og til pumperne, der regulerede 

pH. Fermenteringen fik lov til at forsætte og stod sådan i ca.10 timer (natten over). 

Efter 10 timer blev der rettet op på pH-værdien. Den præcis årsag til fejlen kunne ikke 

findes, men efter at have tjekket ledninger mm. virkede reguleringen igen, og der kom igen et 

fornuftig signal fra elektroden og til pumperne. Så efter ca. 10 timer blev der tændt for pHreguleringen 

igen, og pH indstillede sig på omkring 5,4; se Figur 7.17. 



7.7.3 Ilt f6 

Iltkoncentrationen lå omkring 9 mg 

L 

, som det ses af Figur 7.18, hvilket er som forventet lige 

under opløseligheden på 9,33 mg 

L . Da iltkoncentrationen ikke var faldet efter 23 timers 

fermentering, må nølefasen stadig have været den dominerende. 

Ilt [mg/L] 

10 

9 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 7.18: Ilt koncentration under f6., 


Det ses af Figur 7.19, at koncentrationerne af både sukker og ethanol fra starten var lav, men 

at de begyndte at stige efter ca. 15 timer. Dette skyldes, at her blev substrattilledningen startet. 

Dette bevirkede den forhøjede sukkerkoncentration samt inhibering af den vækst, der skulle 

finde sted, men som set ud fra iltkoncentrationen på Figur 7.18 endnu ikke var begyndt. 


40 

35 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 


Ethanol 

Sukker 




Da gæren sandsynligvis ikke havde påbegyndt den eksponentielle fase efter 23 timer, blev det 

besluttet at stoppe fermentering 6. Dette blev gjort på baggrund af at pH-værdien ikke var 

tilfredsstillende de første 10 timer. Herudover steg sukkerkoncentrationen, da tilledning af 

substrat blev startet. Desuden blev der ikke observeret en stigning i tørstofindholdet ved 

prøveudtagningen. 

Der burde have været foretaget endnu en fermentering, da f6 mislykkedes, så det kunne 

undersøges om tilledningsprofilen virkede efter hensigten. Dette blev ikke gjort af 

tidsmæssige årsager. 

7.8 Kulturrenhed 

Der blev under den sidste prøveudtagning ved hver fermentering udtaget en steril prøve af 

fermenteringsvæske, som blev overfladeudsået på YPG-plader, se Afsnit 6.5.4, for at 

undersøge om fermenteringerne foregik under sterile forhold. Der blev foretaget to 

pladeudspredninger pr. fermentering i tilfælde af kontaminering. Bestemmelse af kulturrenhed 

blev foretaget ved synsmæssige skøn, se Tabel 7.1. 

Fermentering YPG-plade 1 YPG-plade 2 

f1 - - 

f2 - - 

f3 - - 

f4 - - 

f5 - - 

f6 - - 

Tabel 7.1: Kulturrenhed. 

- : ingen kontaminering 

+ : kontaminering 

Der blev ikke observeret nogen kontaminering ved de seks fermenteringer, hvorved det 

kan konkluderes, at væksten under fermenteringerne udelukkende var forsaget af S. cerevisiae. 



7.9 Prøveudtagning 

Under fermentering 1 blev der udtaget prøver hver time. Det blev hurtigt klart, at dette blev 

meget presset, så det blev valgt at udtage prøver med større mellemrum. Herefter blev der 

udtaget prøver ned til hver 2. time, hvilket gav 7 til 19 prøver pr. fermentering, se Måledata 1 

til 6. Grunden til den hyppige prøveudtagning var, at der ønskes flere prøver under en 

fermentering, således at der blev opnået et bedre billede af vækstens forløb, i forhold til 

projektet af Forssling et al., hvor der kun blev udtaget 4 til 7 prøver pr. fermentering. 

For at kunne vurdere om det kan retfærdiggøres at udtage prøver så ofte som der er gjort i 

dette projekt, undersøges om der er signifikant forskel på de enkelte tørstofprøver, se Bilag 8. 

For nærmere gennemgang af anvendt statistik, se Bilag 6. Det ses i Bilag 8 at det kan 

retfærdiggøres at der udtages prøver ned til hver 2. time. 


K-PRO 7 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter Gruppe 2 

8 Beregning af fermenteringsspecifikke konstanter 

I dette afsnit beregnes respirationskoefficienten for fermentering f5 samt specifikke 

væksthastigheder og udbyttekonstanter for fermenteringerne. 

8.1 Respirationskoefficient 

Respirationskoefficienten (RQ) er defineret som: 

mol CO 2 dannet 

RQ = 

mol O forbrugt 

For at kunne finde antallet af mol CO2 dannet og mol O2 forbrugt, er det nødvendigt at 

finde en sammenhæng mellem koncentrationerne i ind- og udgangsgassen samt antallet af mol 

i disse strømme. 

Der ses på de to situationer, hvor der dannes et antal af mol og hvor der forbruges et antal af 

mol, se Figur 8.1. 

c(t) 

cud(t) 

cind(t) 

t 


2 

c(t) 

cind(t) 

t 

cud(t) 

a) Stigende koncentrationer/mol dannet. b) Faldende koncentrationer/mol forbrugt. 

Figur 8.1: Mol dannet og forbrugt. 

Først er det nødvendig at finde en sammenhæng mellem koncentrationen og antallet af mol. 

For at finde denne sammenhæng skal følgende sammenhænge kendes: 

- mellem koncentrationen (Ci) og molbrøken (yi) i gassen. 

- mellem mol (ni) og molbrøken (yi) i gassen. 

- mellem tiden t og volumen V(t) der er bobles gennem fermentoren. 

Disse sammenhænge ser ud som følgende: 

y(t) 

i 

C(t) 

100 

i = i = ⋅ i 

hvor : ν : Volumenflowet i 

R : Gaskonstanten i 

n 

P⋅V(t) R⋅T y (t) 

min = 4,17·10-4 3 

m 

3 

m 

s ν = 25 L 

3 

m ⋅Pa 

R = 8,31447 mol⋅K 3 

m ⋅Pa 

mol⋅K T : Temperaturen i K T = 303 K 

P : Totaltrykket i Pa 

s 

V(t) =ν⋅t


Kombineres dette, og summeres antallet af mol op over tiden fås følgende: 

ni t 

P⋅ν⋅t C(t) i 

ni⋅ dni = ⋅ ⋅dt 

R ⋅T 

100 

0 0 

P ⋅ν 

n = ⋅ t⋅C (t) ⋅dt 

⋅ ⋅ 

i i 

R T 100 0 

Ved beregning af antallet af mol forbrugt, er det forskellen fra i indtil udgangsgassen, der 

skal findes. Dette er tilfældet med O2, hvilket gøres på følgende måde: 

∆ ni = ni ind −ni 

ud 

t t 

P⋅ν P⋅ν 

∆ n = ⋅ t⋅C (t) ⋅dt− ⋅ t⋅C (t) ⋅dt 

 

i iind i ud 

R ⋅T⋅100 R ⋅T⋅100 0 0 

t t 

 

∆ n = t⋅C (t) ⋅dt− t⋅C (t) ⋅dt 

i iind i ud 

0 0 

t 

 


t 

( ) 

∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt 

i iind i ud 

0 

Ved beregning af antallet af mol dannet, er det omvendt forskellen fra ud- til 

indgangsgassen, der skal findes. Dette er tilfældet med CO2, hvilket gøres på følgende måde: 

t 

 

( ) 

∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt 

i i ud i ind 

0 

8.1.1 Målinger på udgangsgassen 

For at finde koncentrationerne af de forskellige komponenter i ind- og udgangsgassen, er der 

fortaget målinger på GC samt fundet data over atmosfærens indhold. For komponenter i 

indgangsgassen anvendes de data, der ses i Tabel 8.1. 

Komponent Indhold i atmosfæren 

[%] 

Molbrøk 

y 

N2 78,1 0,781 

O2 20,9 0,209 

Ar 0,9 0,009 

CO2 0,0365 0,000365 

Tabel 8.1: Atmosfærens indhold [1], [4] 

iind


Ud over disse data er der foretaget en række antagelser. Det antages, at indgangsluften er 

tør, således at vandindholdet ikke ændrer på y iind. 

Desuden antages, at yAr ind = yArud. 

Derudover antages, at udgangsgassen er mættet med vand, hvilket giver følgende ligninger for 

bestemmelse af vandindholdet i udgangsgassen ved 30 °C: 

* 

p 

p 

2 

RF = 100% = 1 = yHOud 

2 

p 

P 

* 

H2O sat 

H2O = 

HO 

total 

sat 

HO 2 

p (30° C) = 4245,1 Pa 

Kombineres disse formler fås følgende udtryk for vandindholdet i udgangsgassen, ved 30 °C: 

y 

HOud 2 

sat 

RF⋅ pHO 2 4245,1 

= = 

P P 

total total 

Indsættes forskellige tryk fås følgende vandindhold, se Tabel 8.2. 

Overtryk 

Ptotal 

[Pa] 

2 HOud y 

0,0 bar 101325 0,0419 

0,2 bar 121325 0,0350 

0,5 bar 151325 0,0281 

Tabel 8.2: Vandindhold ved forskellige tryk. 

Koncentrationen af N2 og CO2 kendes, da disse blev målt vha. GC, se Afsnit 6.5.3. Herimod 

er det nødvendigt at udregne koncentrationen af O2, og denne kan udregnes ud fra 

koncentrationen af N2,CO2,H2O og Ar på følgende måde: 

C = 100 −C−C−C− C = 100 −C−C−100⋅y−100⋅y O2 N2 CO2 H2O Ar N2 CO2 H2O Ar 

Hvis der eksempelvis ved atmosfæretryk blev målt følgende koncentrationer af CO2 og N2: 

Fås følgende koncentration af O2: 

CCO = 5% og 

2 

CN= 80% 

2 

CO = 100 −80 −5−100⋅0,0419 −100⋅ 0,009 = 

9,91% 

2 



8.1.2 Respirationskoefficient fra fermentering f5 

Udviklingen af CO2 og O2 i afgangsgassen fra f5 ses af Figur 8.2. 

CCO (g) [%] , CO (aq) [%] 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

CO2 O2 (aq) N2 O2 (g) 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 


100 

Figur 8.2: Koncentrationer i udgangsgassen og iltkoncentrationen i væsken under f5. 

Det ses af Figur 8.2, at CO2-koncentrationen er svag stigende, hvilket tyder på, at det sker 

en omdannelse i fermentoren. Desuden ses det, at der stadig er ilt i udgangsgassen, hvilket 

betyder, at luftflowet gennem fermentoren er tilstrækkelig. På Figur 8.2 ses, at der efter 30 

timer næsten ikke var opløst noget ilt i fermenteringsvæsken, hvorimod der stadig er ilt i 

udgangsgassen. Dermed er det ikke luftflowet ν, der er for lille, men derimod iltoverførslen 

KLa, se Afsnit 5.2. 

8.1.3 Beregning af antal mol CO2 dannet. 

Koncentrationen af CO2 i ind- og udgangsgassen er afbildet som funktion af tiden, se Figur 

8.3. Udgangskoncentrationerne er tilnærmet med et 2. gradspolynomium, mens 

indgangskoncentrationen har en konstant værdi: 

2 

C CO2 ud (t) = 0,0011⋅ t + 0,0008⋅ t + 0,0365 

C CO2 ind (t) = 

0,0365 

80 

60 

40 

20 

0 

CN (g) [%] , CO (g) [%]


CCO2(g) [%] 

1,5 

1,0 

0,5 

0,0 

Herefter er det muligt at udregne 

CO2 ud CO2 ind 

y = 0,0011x 2 + 0,0008x + 0,0365 

y = 0,0365 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 8.3: CO2 koncentration i ind- og udgangsgassen under f5. 

t 

 

∆n vha. den tidligere definerede ligning: 

CO2 

( ) 

∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt 

CO2 CO2 ud CO2 ind 

0 

Herudfra opnås følgende resultater: 

t [timer] 9 14 19 24 29 34 

∆ n [mol] 3 14 44 105 215 398 

CO2 

8.1.4 Beregning af antal mol O2 forbrugt 

Koncentrationen af O2 i ind- og udgangsgassen er afbildet som funktion af tiden, se Figur 8.4. 

Udgangskoncentrationerne er tilnærmet 9 med en ret linie, mens indgangskoncentrationen er 

en konstant værdi: 

C O2ud(t) =−0,3927⋅ t + 20,9 

C O2ind(t) = 20,9 

9 Dette er en meget grov tilnærmelse. 



Herefter kan 

C [%] 

O2 

25,0 

20,0 

15,0 

10,0 

5,0 

0,0 

O2 ud O2 ind 

y = -0,3927x + 20,9 

y=20,9 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 8.4: O2 koncentration i ind- og udgangsgassen under f5. 

∆n udregnes ud fra den tidligere definerede ligning: 

t 

 

( ) 

∆ n = t⋅ C (t) −C (t) ⋅dt 

O2 O2 ind O2 ud 

0 

Herudfra opnås følgende resultater: 

t [timer] 9 14 19 24 29 34 

∆ n [mol] 95 359 898 1810 3193 5144 

O2 

8.1.5 RQ 

Ud fra ovenstående beregninger af antallet af mol O2 forbrugt og CO2 dannet, er det muligt at 

beregne RQ ud fra følgende formel: 

∆nCO2 

RQ = 

∆n 

Herved kan respirationskoefficienten afbildes som funktion af tiden, se Figur 8.5. 

t [timer] 9 14 19 24 29 34 

RQ 0,032 0,040 0,049 0,058 0,067 0,077 

RQ 

0,09 

0,08 

0,07 

0,06 

0,05 

0,04 

0,03 

0,02 

0,01 

0 


O2 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Figur 8.5: Respirationskoefficient som funktion af tiden.


De opnåede respirationskoefficienter ligger meget lavt. Ud fra tidligere definerede 

respirationskoefficient-intervaller, så indikerer værdier under 0,6 ethanolnedbrydning, se 

Afsnit 3.2.3. Der er dog stor usikkerhed på GC-målingerne samt den tilpassede ligning for 

C iud(t), 

hvilket betyder, at der ikke er korrekt at foretage en konklusion omkring væksten af 

S, cerevisiae på baggrund af respirationskoefficienterne. 

8.2 Specifik væksthastighed 

Væksthastigheden er et udtryk for, hvor hurtigt cellerne vokser, denne måles ofte som 

ændringen i cellemasse pr. tid dX 

 

dt . 

Den specifikke væksthastighed er et udtryk for væksthastigheden pr. cellemasse. Den 

specifikke væksthastighed () er givet ved [6]: 

1 dX 

µ = ⋅ 

X dt 

Dette kan omskrives på følgende måde: 

Xslut t 

1 1 

⋅ dX = µ ⋅dt dX µ dt ln(X slut ) ln(X start ) µ t 

X ⋅ = ⋅ − = ⋅ 

X 

Xstart 0 

Herudfra fås følgende ligning for en ret linie: 

ln(X ) = µ ⋅ t + ln(X ) 

slut start 

8.2.1 Beregning af den specifikke væksthastighed for f5 

Den specifikke væksthastighed for f5 kan udregnes vha. podemængden, koncentrationen af 

cellemasse ved hver prøveudtagning samt tiden for prøveudtagningerne, disse oplysninger ses 

i Tabel 8.3. 

t [timer] X slut [g] ln(X slut) 

9 4,8 1,56 

11 7,7 2,04 

13 12,5 2,52 

15 15,2 2,72 

17 25,2 3,23 

19 43,5 3,77 

21 69,6 4,24 

23 102,6 4,63 

26 155,3 5,05 

29 257,0 5,55 

32 409,7 6,02 

34 506,8 6,23 

Tabel 8.3: Værdier til beregning af µ under f5. 



ln(Xslut) indtegnes som funktion af tiden, og µ kan herefter findes som liniens hældning, se 

Figur 8.6b). Ved udregning af den specifikke væksthastighed, var det forventet at der var flere 

vækstforløb for hver fermentering, da gæren som tidligere nævnt vil have både en nøle- og 

eksponentiel vækstfase. Ses der nærmere på en af kurverne fra de resterende fermenteringer, 

for eksempel f3, se Figur 8.6a). 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

y = 0,00x + 0,70 

y = 0,18x - 1,29 

R 2 =1,00 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

y = 0,20x - 0,22 

R 2 =0,99 


7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

a) Specifik væksthastighed for f3. b) Specifik væksthastighed for f5. 

Figur 8.6: Den specifikke væksthastighed for f3 og f5. 

På Figur 8.6a) ses, at ind til 10 til 15 timer er væksthastigheden nul, hvorfor gæren stadig 

har befundet sig i nølefasen. Til beregning af den specifikke væksthastighed for de 

fermenteringer, hvor nølefasen er observeret ved prøveudtagningerne, er disse punkter 

sorteret fra. Den specifikke væksthastighed for samtlige fermenteringer ses i Tabel 8.4. 

Fermentering 

µ 

[h -1 ] 

f1 0,10 

f2 0,11 

f3 0,18 

f4 0,25 

f5 0,20 

f6 0,12 

Tabel 8.4: Specifikke væksthastigheder 

De specifikke væksthastigheder, der er fundet ved de seks fermenteringer, antager en værdi 

mellem0,10og0,25h -1 . Det ses af Tabel 8.4, at den specifikke væksthastighed svinger en del 

fra fermentering til fermentering, men det er umiddelbart svært at sammenligne de forskellige 

specifikke væksthastigheder, da der er ændret på flere forskellige parametre mellem hver 

fermentering. Det er altid ønskværdigt at have en høj specifik væksthastighed, men denne er 

ikke det samme som et godt udbytte. Hermed menes at en høj specifik væksthastighed i en 

kort periode godt kan give et mindre udbytte end en lav specifik væksthastighed i en længere 

periode.


I Forssling et al. blev der opnået specifikke væksthastigheder på mellem 0,16 og 0,18 h -1 , 

og sammenlignes disse værdier med de specifikke væksthastigheder i Tabel 8.4, ses at det er 

muligt at opnå en højere specifik væksthastighed. Hvis gæren samtidig kan opretholde denne 

specifikke væksthastighed i en længere periode, er det muligt at opnå et højt udbytte af 

cellemasse. 

8.3 Udbyttekonstanter 

For at bestemme hvor stort et cellemasseudbytte, der er dannet ved fermenteringerne i forhold 

til mængden af substrat der er forbrugt, udregnes udbyttekonstanten, Y X . Denne er defineret 

S 

som følgende: 

Y 

X S 

g cellemassse dannet 

= 

g substrat forbrugt 

Ved beregning af udbyttekonstanten er der flere parametre, der kan tages højde for, alt efter 

hvilke oplysninger der ønskes fra udbyttekonstanten. I dette afsnit vil to forskellige værdier af 

udbyttekonstanten blive udregnet. Før udbyttekonstanten kan beregnes, skal den dannede 

mængde af cellemasse og den forbrugte mængde af sukker bestemmes. Dette er gjort for f5 i 

Tabel 8.5. 

Cellemasse 

Volumen 

[L] 

Koncentration 

[g/L] 

Mængde 

[g] 

Til slut 11,35 44,66 506,9 

Til podning 0,20 4,00 0,8 

Dannet - - 506,1 

Sukkerforbrug 

Volumen 

[L] 

Koncentration 

[g/L] 

Mængde 

[g] 

Tilsvarende 

substratmængde 

[g] 

Batch 3,50 7,25 25,4 25,4 

Tilledt 7,66 145,00 1110,7 1110,7 

Total - - - 1136,1 

Substrat til slut 

Volumen 

[L] 

Koncentration 

[g/L] 

Mængde 

[g] 

Tilsvarende 

substratmængde 

[g] 

Slutvolumen 11,35 - - - 

Restsukker - 0,00 0,0 0,0 

Restethanol - 2,41 27,4 66,8 

Tabel 8.5: Beregning af cellemasse og mængden af substrat for f5, yderligere oplysninger se Måledata 1 – 6. 



Udregningen af ” Tilsvarende substrat mængde” for ”restethanol” i Tabel 8.5, er foretaget 

på følgende måde: 

hvor de 0,41 er: YE 

Mængde 

Tilsvarende substrat mængde = 

0, 41 

S 

g ethanol dannet 

= 


Her er det antaget, at udbyttekonstanten, Y E , der er fundet ud fra et substrat indeholdende 

S 

glucose, kan anvendes, når der anvendes sukker som substrat. 

Til udregning af udbyttekonstanten anvendes den dannede cellemasse, massen af det 

substrat, der er blevet tilført samt det substrat, der er anvendt til produktion af andre stoffer, 

her ethanol. Derved fås følgende: 

m 506,1g 

cellemasse 


YX= = = 0,47 g sukker forbrugt 

S mtilledt substrat −mrestsukker −methanol 1136,1g−0,0g−66,8 Ved opformering af gærceller i industrien er det ikke interessant at se på, hvor meget af 

substratet, der er anvendt til produktion af andre produkter end cellemasse, som f.eks. ethanol. 

Her er det kun interessant at se størrelsen af den mængde cellemasse, der dannes i forhold til 

den mængde substrat, der anvendes i processen. Derfor udregnes udbyttekonstanten på 

følgende måde, se Tabel 8.6: 

m 506,1g 

cellemasse 


YX= = = 0,45 g sukker forbrugt 

S mtilledt substrat 1136,1g 

Det ses ud fra beregninger af udbyttekonstanten for f5, at der ikke fås den store forskel om der 

tages højde for restsukker og ethanol eller om der kun ses på den dannede cellemasse i 

forhold til det tilledte substrat. 

Fermentering 

f1 0,15 

f2 0,21 

f3 0,11 

f4 0,12 * 

f5 0,45 

f6 0,01 ** 

Værdierne for udbyttekonstanten er udregnet efter 34 timers fermentering. 

* ) Udregnet efter 26 timer, da fermentoren skummede over på dette tidspunkt. Udbyttekonstanten til slut er op 

imod 3 gange større end denne, dette skønnes ud fra at tørstofkoncentrationen, som de sidste 8 timer stiger fra 10 

til 28 g 

L , se Måledata 4. Den reelle udbyttekonstant er måske ** 

) Udregnet efter 23 timer. 

28 YX≈ ⋅0,12≈ 0,30. 

10 

S 

Tabel 8.6: Udregnede værdier for YX 

S 


YX 

S


Det er valgt at udregne udbyttekonstanten, hvor der ikke tages højde for restsukker og 

ethanol, da denne værdi er lettere at sammenligne med tidligere opnåede værdier af Forsling 

et al. og andre. Desuden er det sjældent at restsukker og -ethanol kendes, hvorimod 

cellemassen og mængden af sukker ofte kendes. 

Udbyttekonstanterne fra Tabel 8.6 er afbildet i Figur 8.7, så det er lettere at se udviklingen af 

disse gennem fermenteringerne. 

Yx/s 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

f1 f2 f3 f4 f5 f6 

Figur 8.7: Udviklingen af YX gennem fermenteringerne. 

S 

Det ses af Figur 8.7, at udbyttekonstanten generelt stiger fra den ene fermentering til den 

anden. Udbyttekonstanterne for f3 og f6 er dog forholdsvis lave, hvilket skyldes, at 

fermenteringerne aldrig nåede at komme i gang. Ved f4 ses med den mørke farve den 

beregnede udbyttekonstant efter 26 timer og den lyse farve den forventede efter 34 timer. 

f1 var en batchfermentering, hvor der blev opnået en udbyttekonstant på 0,15 


g sukker forbrugt ; 

hvilket stemmer overens med den teoretiske udbyttekonstant for anaerob vækst på mellem 

0,11 og 0,15 


g substrat forbrugt 

; se Afsnit 3.2.1. Ved f2 var sukkerkoncentrationen blev mindsket 

med en faktor 10, hvorved væksten undervejs både har været aerob og anaerob. Dette har 

medvirket til at give en højere udbyttekonstant på 0,21 


g sukker forbrugt . Herefter blev det forsøgt 

at gentage resultatet fra f2 ved f3, men dette mislykkedes, da gæren fik en forlænget nølefase 

pga. en for høj starttemperatur, derfor blev der kun opnået et udbytte på 0,11 

dermed formentlig ingen aerob vækst. 


g sukker forbrugt og 



Ved f4 blev der foruden en halvering af sukkerkoncentrationen ændret på 

omrørerhastigheden og trykket i fermentoren. Herved blev det muligt at opløse mere ilt i 

fermenteringsvæsken, dog var der problemer pga. overtrykket, hvorfor slutvolumen ikke 

kendes og derfor kan den endelige udbyttekonstant ikke beregnes. Udbyttekonstanten blev i 

stedet beregnet efter 26 timer til 0,12 

endt fermentering estimeret til 0,30 

og anaerob vækst. 


g sukker forbrugt . Derudover blev udbyttekonstanten ved 



Udbyttekonstanten for f5 antager en værdi på 0,45 

på den teoretisk maksimale udbyttekonstant på 0,46 til 0,47 

; derfor antages at der har været både aerob 


g sukker forbrugt , hvilket ligger meget tæt 


g sukker forbrugt , se Afsnit 3.2.1. Det 

var denne værdi, der blev forsøgt at opnå i dette projekt. 

Generelt ses det i Figur 8.7, at de ændringer, der er fortaget undervejs i fermenteringerne 

har haft en positiv effekt på udbyttekonstanten, og da der er lykkedes at opnå en 

udbyttekonstant i nærheden af den maksimale, vil det herefter være muligt at foretage en 

yderligere optimering af S. cerevisiaes opformering med de ændringer, der er foretaget i 

forhold til fermentering 1. 

8.4 Fermenteringsparametre 

Der er som nævnt foretaget en del ændringer af forskellige parametre fra fermentering 1 til 

fermentering 6. De parametre der kan arbejdes videre med beskrives herunder. 

Ved alle fermenteringerne blev der anvendt en pH-værdi på 5,4 og en temperatur på 30 °C. 

Derudover er der ud af fundet, at en omrørerhastighed på 700 O 

min 

og et overtryk på 0,2 bar 

giver en bedre iltoverførsel. Det er forsøgt at variere på sukkerkoncentrationen i startsubstratet 

til batchfermenteringen, og en startkoncentration på 7,25 g 

L gav det bedste resultat, se Tabel 

8.7. Der er desuden forsøgt med en tilledningsprofil, se Figur 8.8. Dog uden resultat. 

Parameter Værdi 

pH 5,4 

Temperatur 30 °C 

Overtryk 0,2 bar 

Omrørerhastighed 700 O 

min 

Sukkerkoncentration i batch 7,25 g 

L 

Tabel 8.7: Fundne parametre. 




1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

0s ≤ t < 54000s : V= 0 

54000s ≤ t < 122400s : V = 1,1350⋅10 ⋅t−8,7422⋅10 ⋅ t + 2,5597 ⋅10 

Figur 8.8: Tilledningsprofil. 

−10 2 −6−1 Ingen af de fundne værdier er endegyldige, og der er ikke optimeret på de enkelte værdier. 

Der er dog under f5 opnået et cellemasseudbytte på 0,45 



; med de i Tabel 8.7 

nævnte parametre, hvilket kunne tyde på, at de anvendte parametre ligger i samme område 

som de optimale. 

Til et senere forsøg anbefales at udføre en prøvefermentering evt. som f6, for at få noget 

erfaring med fermentoren mm., hvorefter fermentering 6 endnu engang efterprøves for at se 

om tilledningensprofilen fungerer som forventet. Opnås der her et højt cellemasseudbytte, kan 

der herefter evt. optimeres på de enkelte parametre. 

De nævnte parametre gælder kun for MBR fermentoren, der er anvendt til 

fermenteringerne i dette projekt, som er udført på Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum. 


K-PRO 7 Diskussion Gruppe 2 

9 Diskussion 

Der blev i dette projekt udført seks fermenteringer for at tilpasse forskellige parametre til 

opformeringen af S. cerevisiae. Udfra disse seks fermenteringer blev der opnået 

udbyttekonstanter på mellem 0,11 og 0,45 


g sukker forbrugt , og det ses tydeligt i Figur 8.7, at der 

sker en udvikling fra f1 til f6 ved ændring af forskellige parametre. Udbyttekonstanten for f5 

på 0,45 

0,47 


g sukker forbrugt ligger tæt på den teoretisk maksimalt opnåelige værdi mellem 0,46 og 


g sukker forbrugt ; hvorfor de parametre, der er blevet ændret undervejs, kan anvendes til 

yderligere at optimere opformeringen af S. cerevisiae. 

De fermenteringsparametre, der blev fundet til optimering af cellemasseudbyttet ved 

opformeringen, er en omrørerhastighed på 700 O 

min , et overtryk i fermentoren på 0,2 bar, en 

sukkerkoncentration på 7,25 g 

L i startsubstratet samt forslag til en tilledningsprofil, som ses i 

Afsnit 7.6. 

Da f5 som nævnt gav gode resultater, vil det være en god ide ved fortsættelse af dette 

projekt at køre f6 igen, da denne var en forbedring af f5. Tilledningsprofilen i f6 vil 

formentlig give en lavere sukkerkoncentration i begyndelsen samt en hurtigere tilledning ved 

slutningen af fermenteringen, hvorved der formentlig undgås Crabtree-effekt og 

substratinhibering. På denne måde holdes gæren i den eksponentielle vækstfase i længere tid. 

Dermed opnås en meget lav inhiberende virkning under hele fermenteringen, hvilket 

formentlig vil medføre et højere cellemasseudbytte. 

En af de parametre, der bør optimeres yderligere på, er iltoverførslen i den anvendte 

fermentor, da de praktiske KLa-værdier på 0,0123 h -1 ved 400 O 

min og 0,0198 h-1 ved 700 O 

min 

er forholdsvis lave i forhold til de estimerede på 0,030 h -1 ved 400 O 

min og 0,132 h-1 ved 700 

O 

min 

. Dette kunne optimeres ved at ændre omrørerhastigheden samt udformningen af 

iltfordeleren til fermentoren, således at der opnås en større gas-væske overflade og dermed en 

bedre iltoverførelse fra luftboblerne til væsken, hvilket vil give en højere KLa-værdi. 

Under fermenteringerne blev der erfaret forskellige praktiske elementer, som bør udbedres, 

før der foretages forsøg på at optimere opformeringen af S. cerevisiae yderligere, disse 

opsummeres og diskuteres herunder. 



Ved fermentering f3 var temperaturen oppe på 50 ºC i omkring 10 min., hvilket har svækket 

gæren og dermed gjort nølefasen længere. Ved fermentering f6 var der problemer med pHelektroden, 

pga. en løs forbindelse, hvilket gjorde at pH-værdien var for høj, dette svækkede 

også gæren og forlængede ligeledes nølefasen. Af disse to forsøg ses, at hvis der ikke er 

ideelle betingelser fra fermenteringens start, så skal opstarten udsættes, til det er muligt at 

genskabe de optimale betingelser. Sker der fejl tidligt i fermenteringsforløbet, så betingelserne 

for gæren ikke er optimale, bør fermenteringen standses med det samme. 

Sammenlignes fermentering f2 og f5 ses, at ved et moderat overtryk på 0,2 bar, er det 

muligt at opløse mere ilt i fermenteringsvæsken, og at gæren har mere ilt til rådighed ved f5, 

hvorfor iltkoncentrationen ikke er nær så begrænsende som ved f2. Dette ses af faldet i 

iltkoncentrationen fra mætning til nulpunkt på Figur 7.8 og Figur 7.13, da hældningen på 

kurven ved f2 er stejlere end hældningen på kurven ved f5. Derudover ses det ved 

bestemmelse af KLa, at en ændring af omrørerhastigheden fra 400 til 700 O 

min 

har en positiv 

effekt på iltoverførslen, dette er formentlig medvirkende til den ændrede hældning på 

ovennævnte iltkurver. 

Som det fremgik af fermentering f4, så er det muligt at opløse mere ilt i 

fermenteringsvæsken ved et højt overtryk, som f.eks. 0,5 bar. Problemet var dog, at 

slangepumperne til væsketilledning ikke kunne pumpe imod dette tryk. Hvis der skal 

anvendes overtryk under fermenteringen er det nødvendigt at anskaffe nogle pumper, som kan 

pumpe mod et højere tryk, så det er muligt at øge opløseligheden af ilt i væsken. Der blev 

anvendt en kompressor til frembringelse af luftflowet på 25 L 

min . Kompressoren virkede ikke 

optimalt, da det var nødvendigt at køle på denne uafbrudt for at forhindre at den satte ud pga. 

overophedning. Dette skyldes, at kompressorens kapacitet kun lige var stor nok til at 

frembringe det førnævnte luftflow. Eventuelt skal der anskaffes en større kompressor eller ske 

en tilkobling til et permanent trykluftsystem. 

Der var en del problemer med at kalibrere pH-elektroden gennem projektperioden. Der var 

en løs forbindelse i kablet, som forbandt kontrolenheden og pH-elektroden. Det var højst 

sandsynlig denne løse forbindelse, som ødelagde væksten under f6. 

Derfor er det nødvendigt at få pH-elektroden samt kabel og kontrolenhed undersøgt, og 

eventuelt må der anskaffes en ny elektrode eller et nyt kabel. 

Til prøveudtagning af udgangsgassen blev der anvendt en gasmus. Det var meget vigtigt 

under fermenteringerne, at gasmusen var tætnet ordentlig, da gasen ellers kunne sive ud 



gennem musen og derved ændre koncentrationen af de enkelte gasser i prøven. Herudover 

blev der anvendt en gassprøjte som havde en skala, der gjorde det svært at udtage et præcist 

volumen hver gang. Gassprøjten blev herudover tilstoppet, så det var nødvendigt at rense 

denne mellem fermenteringerne. 

Gasmålingerne svingende meget, som det ses i Afsnit 8.1 og Måledata 1 til 6, hvilket 

antyder, at målingerne er ret upræcise. Respirationskoefficienten kan i dette projekt ikke 

direkte anvendes, da målingerne er upræcise. Derfor vil det være nødvendigt at optimere på 

metoden, så det er muligt at opnå nogle målinger, der er mere præcise. Samtidig kunne der 

eventuelt anskaffes en gasprøjte med en mindre skala, så det blev nemmere at udtage prøverne. 

Herudover kunne der anvendes et andet splitforhold, så der udtages en anden prøvemængde, 

men stadig sendes samme prøvevolumen ind i kolonnen. Optimeres metoden således, at 

gasmålingerne bliver mere præcise, forventes at respirationskoefficienten bliver mere 

anvendelig. 

Det er som nævnt lykkedes at opnå et cellemasseudbytte på 0,45 


g sukker forbrugt , hvilket bør 

eftervises ved flere fermenteringer, hvorefter der evt. kan foretages en optimering af 

forskellige parametre. 


K-PRO 7 Konklusion Gruppe 2 

10 Konklusion 

I dette projekt blev der udført 6 fermenteringer for at tilpasse forskellige parametre til 

opformeringen af S. cerevisiae. De parametre, der blev tilpasset for at opnå et højt 

cellemasseudbytte ved opformeringen ses af Tabel 10.1. 

Parameter Værdi 

pH 5,4 

Temperatur 30 °C 

Overtryk 0,2 bar 

Omrørerhastighed 700 O 

min 

Sukkerkoncentration, batch 7,25 g 

L 


1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Tid [timer] 

Tabel 10.1: Fundne parametre. Figur 10.1: Tilledningsprofil 

Ud over de tilpassede parametre, er der udarbejdet et forslag til en tilledningsprofil, hvor 

tilledningen starter efter 15 timeres fermentering, se Figur 10.1. Ved brug af ovenstående 

parametre er det lykkedes at opnå et cellemasseudbytte tæt på den teoretiske værdi. Der blev 

opnået udbyttekonstanter, som ligger mellem 0,11 og 0,45, hvor den teoretiske ligger mellem 

0,46 og 0,47. 

Udviklingen af cellemasseudbyttet gennem de forskellige fermenteringer ses af Figur 10.2. 

Her ses det tydeligt, at der sker en udvikling fra fermentering til fermentering, hvilket betyder 

at de ændringer der er foretaget under fermenteringerne har haft en positiv effekt. 


K-PRO 7 Konklusion Gruppe 2 

Yx/s 

0,5 

0,4 

0,3 

0,2 

0,1 

0,0 

f1 f2 f3 f4 f5 f6 

Figur 10.2: Udviklingen af YX gennem fermenteringerne. 

S 

Herudfra bør der udvikles en metode, så det er muligt at opnå et højt cellemasseudbytte 

ved hver fermentering, så der samtidig opnås et cellemasseudbytte der ligger meget stabilt. 

Dette gøres for senere at kunne optimere på forskellige parametre. 

Undervejs i fermenteringerne er der visse elementer, der har bevirket, at fermenteringerne 

ikke har forløbet optimalt, dette gælder større udsving i pH og temperatur. Dette har resulteret 

i store udsving i cellemasseudbyttet. Ved sådanne udsving bør fermenteringen stoppes, da den 

ikke vil give et optimalt cellemasseudbytte, hvorfor det er vigtigt at finde en stabil metode 

uden større svingninger. Hvis mindre usikkerheder i metoden giver større svingninger i 

cellemasseudbyttet end variationerne i den parameter, der bliver optimeret på, kan en videre 

optimering ikke forsvares. 


K-PRO 7 Bilags- og måledataliste Gruppe 2 

Bilag 

11 Bilags- og måledataliste 

Bilag 1 : Bestemmelse af KLa 

Bilag 2 : Huskelister, forsøgsbeskrivelser og resultatskemaer 

Bilag 3 : Bestemmelse af sukkerindhold 

Bilag 4 : Bestemmelse af ethanolindhold 

Bilag 5 : Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid 

Bilag 6 : Anvendt statistik 

Bilag 7 : Måling af tilledt volumen 

Bilag 8 : Prøveudtagning 

Måledata 

Måledata 1 : Måledata og resultater fra fermentering 1 







K-PRO 7 Litteraturliste Gruppe 2 

Kilder 

12 Litteraturliste 

[1] : Databog fysik kemi, 8. udgave 

Andersen, E. S., Jespergaard, P. og Østergaard, O. G. 

F & K forlaget, 1994 

ISBN 87-87229-55-2 

[2] : Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook 

Atkinson, Bernard and Mavituna, Ferda 

M Stockton Press New York 1987 

ISBN 0-333-33274-1 

[3] : Biochemical Engineering Fundamentals 2. udgave 

Bailey, James E. og Ollis, David F. 

McGraw-Hill Inc. 1986 

ISBN 0-07-003212-2 

[4] : Environmental chemistry, 2. udgave 

Baird, Colin 

W. H. Freeman and Company, 1999 

ISBN 0-7167-3153-3 

[5] : Optimering af fed-batchfermentering af genmodificeret Saccharomyces cerevisiae 

Forssling, Ann Sofie og Johnsen, Jesper, 2003 

Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum 

[6] : K-projekt 3 Fermenteringsteknologi 

Hansson, Torben 

Ingeniørhøjskolen Odense Teknikum, 1999 

[7] : Brock Biology of Microorganisms 9. udgave 

Madigan, Michael T., Martinko, John M. and Parker, Jack 

Prentice-Hall, New Jersey 2000 

ISBN 0-13-081922-0 

[8] : Lehninger Principles of Biochemistry, 3. udgave 

Nelson, David L. and Cox, Michael M. 

Worth Publishers 2000 

[9] : Fermentative Capacity of the Yeast Saccharomyces cerevisiae During Growth and Starvation 

Nilsson, Annika 

Department of Cell and Molecular Biology, Göteborg University 2001 

ISBN 91-628-4599-3 

[10] : The Yeasts vol. 3 Yeast Technology 

Rose, Anthony H. og Harrison J. S. 

Academic Press Inc. London 1970 

SBN 12-596403-X 

[11] : Regulation of carbon metabolism in Saccharomyces cerevisiae 

Sierkstra, Laurens 

Universiteit Utrecht, Faculteit Biologie, 1993 

ISBN 90-393-0396-7 


K-PRO 7 Litteraturliste Gruppe 2 

[12] : Regulation of metabolism and cell cycle progression in the yeast Saccharomyces cerevisiae 

Silljé, Herman 

Universiteit Utrecht, Holland 1997 

ISBN 90-393-1289-3 

[13] : Principles of Fermentation Technology, 2. udgave 

Stanbury, P. F.; Whitaker, A. og Hall, S. J. 

Elsevier Science Ltd. 1995 

ISBN 0-08-036131-5 

[14] Praktisk microbiology 

Thougaard, Herluf; Varlund, Verner og Madsen, Rene Møller 

Teknisk forlag, 1996 

ISBN 87-571-1847-7 

[15] : Yeast physiology and biotechnology 

Walker, Graeme M. 

John Wiley & Sons, England 1998 

ISBN 0-471-96447-8 

Artikler 

[16] : Automated fed-batch culture of recombiant Saccharomyces cerevisiae based on on-line monitored 

maximum substrate uptake rate 

Oh, Gyuseop, Moo-Young, Murray og Chisti, Yusuf 

Biochemical Engineering Journal 1 (1998) pp. 211 – 217 

[17] : A kinetik and mass transfer model to simulate the growth of baker’s yeast in industrial bioreactors 

Serio, M. Di, Tesser, R. og Santacesaria, E 

Chemical Engineering Journal 82 (2001) pp. 347 – 354 

[18] : Optimal operation of fed-batch fermentations via adaptive control of overflow metabolite 

Valentinotti, S., Srinivasan, B. o.a. 

Control Engineering Practice 11 (2003) s. 665 – 674 

Hjemmesider 

[19] : http://www.aarhusakademi.dk/intranet/fagene/biologi/Roholt/hjemmeside/undervisning%20online/ 

Hormoner/pancreas/insulin.html (29-11-03) 

[20] : http//www.kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/quinn/teaching/MSc/ModuleB (03-12-2003) 

Andet 

[21] : Materiale fra MBR fermentor 

[22] : Mundtligt fra Novo Nordisk A/S 

[23] : Skriftligt materiale fra Novo Nordisk A/S 


Bilag 1 

Bestemmelse af KLa

K-PRO 7 Bestemmelse af KLa Gruppe 2 

1 Bestemmelse af KLa 

Det er muligt at bestemme KLa både ud fra estimering og praktiske forsøg, begge dele vil 

blive fortaget her. 

1.1 Bestemmelse af KLaestimeret 

KLa kan estimeres udfra nedenstående ligning [1], [2]: 

x 

Pair 

 

K La 

= k ⋅ 

⋅ 

( ) y 

V 

hvor: Pbeluftet : 

V 

Effektforbruget til iltoverførslen [W] 

V : Væskens volumen [m 3 ] 

Vs : Den lineære gashastighed [m/s] 

k,x og y : Konstanter 

Ovenstående formel gælder under følgende betingelser: 

V : 2 – 4400 L og Pbeluftet / V : 500 – 10.000 W/m³ 

Ved lufttilførsel skelnes mellem to situationer; koaleserende eller ikke koaleserende 

luftbobler, hvor boblerne enten bliver større eller mindre op gennem fermentoren. 

a) Boblediameter i fermenteringsvæske b) Iltfordeler i MBR fermentor. 

Figur 1.1: Boblediameter og iltfordeler. 

Figur 1.1a) er et nærbillede af fermentoren i drift med ca. 10 L fermenteringsvæske. På 

billedet kan det svagt ses, at der er bobler i væsken, disse bobler har en diameter på ca. 1 mm. 

Udfra et synsmæssig skøn under fermenteringerne kunne det ses, at boblerne på billedet var 

nogle af de større bobler i fermenteringsvæsken og at der var en del mindre bobler i væsken. 

Bilag 1 Side 1 af 6 

s


På Figur 1.1b) ses iltfordeleren. Hullerne i denne har en diameter på ca. 2 mm. Da boblerne 

har en diameter, der er mindre end huldiameteren, må boblerne gå i stykker under 

opstigningen. Dette betyder, at forholdene i fermenteringsvæsken er ikke koaleserende. 

For en omrørt fermentor med ikke koaleserende luftbobler fås følgende konstanter til 

beregning af KLa[1]: 

k = 0,002 

hvilket medfører følgende ligning: 

x = 0,7 y = 0,2 

1.1.1 Den lineære hastighed, Vs 


0,7 

P K a = 0,002⋅ ⋅ V 

V 

( ) 

beluftet 

L s 

Vs er defineret som den lineære hastighed op gennem hele tværsnitsarealet i en luftfyldt 

fermentor [1]: 

hvor ν : volumenflow i 

 

V= s = 

2 

A 0,25⋅⋅D 3 

m 

s i dette projekt er ν =25 L 

D : diameteren af MBR fermentoren, her D = 0,2 m 

1.1.2 Pbeluftet/V 

For at finde beluftet P 

V 

[1], [2]: 

−4 

4,17⋅10 V = = 

A 0,25⋅π⋅0,2 s 2 

0,2 

min = 4,17·10-4 3 

m 

= 1,33·10 -2 m 

s 

forholdet er der nødvendig at finde Reynolds tal, dette gøres som følgende 

kg 

ρ : Densitet, 3 

m vand = 1000 kg 

3 

m 

µ : Viskositet, 

kg 

ms ⋅ 

N 

Nomdrejninger : Omrørerhastighed O 

s 

Re 

ρ ⋅N ⋅ D 

= 

µ 

2 

omdrejninger omrører 

kg 

vand ved 30 °C = 0,85·10-3 ms ⋅ 

Domrører : Diameter af omrører = 0,07 m 

s


Reynolds tal anvendes til at finde et Power number (NP), hvilket gøres som følgende: 

Nomdrejninger 

N 

100 

10 

Fladbladet omrører 

1 

1 10 100 1000 10000 100000 1000000 

NRe 

Figur 1.2: Power number som funktion af Reynolds tal [1]. 

Nomdrejninger 

O min 

O s 

100 1,66 ~ 9.600 ~ 7 

200 3,33 ~ 19.200 ~ 7 

400 6,66 ~ 38.400 ~ 7 

700 11,66 ~ 67.300 ~ 7 

Tabel 1.1: Forholdet mellem Reynolds tal og NP 

Det ses af Tabel 1.1 og Figur 1.2, at når omrørerhastigheden, Nomdrejninger, er større end ca. 100 

O 

min fås en værdi for NP på ca. 7. 

Power numberet anvendes til at finde den effekt, der skal tilføres til fermentoren, hvis den 

ikke var beluftet (Puden beluftning). Dette gøres som følgende [1], [2]: 

N 

P 


NRe 

uden beluftning 

P = 3 5 

ρ ⋅Nomdrejninger ⋅Domrører 

For at finde effekten til en beluftet fermentor (Pbeluftet) skal effekten til en ikke beluftet 

fermentor (Puden beluftning) omregnes. Dette gøres vha. beluftningshastigheden Nluft og forholdet 

Pbeluftet 

på følgende måde [1], [2]: 

P 


N 

= 

beluftning 3 

Nomdrejninger ⋅Domrører 

 

NP


Luftflowet gennem fermentoren i dette projekt: ν ≈ 25 L 

min ≈ 4,17·10-4 3 

m 

P 

P 

beluftet 


Nomdrejninger 

O min 

samt Pbeluftet er udregnet i Figur 1.3. 

Pbeluftet/ Puden beluftning 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

Nomdrejninger 

O s 

 

Fladbladet omrører 

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 

Nbeluftning 

Nbeluftning 

Puden beluftning 

[W] 

s .Forholdet 


P 

P 

beluftet 


Pbeluftet 

[W] 

400 6,66 0,182 3,48 0,35 1,22 

700 11,66 0,104 18,65 0,55 10,26 

Figur 1.3: Forholdet mellem Nbeluftning og Pbeluftet /Puden beluftning [1] 

1.1.3 Beregning af KLaestimeret. 

For at beregne KLaestimeret er det nødvendigt at kende væskevolumen i fermentoren, og da der 

under forsøgene køres kontinuert, ændres volumen løbende. Der startes ud med et volumen på 

3,5 L; og der sluttes med et volumen på mellem 11 og 12 L ~ 11,5 L, se Måledata 1 til 6, 

derfor ses der på det gennemsnitlige volumen: 

11,5L − 3,5L 

Vgnst = = 7,5 L = 7,5·10 

2 

-3 m³ 

Herefter er det muligt at beregne KLaestimeret: 

0,7 

0,7 

Pbeluftet 

0,2 P 

0,2 

beluftet 

−2 

Ka L estimeret = 0,002⋅ ⋅( 

Vs 

) = 0,002⋅ 3 ( 1,33 10 

− 

) 

V 

⋅ ⋅ 

 

7,5 ⋅10 

 

 

Nomdrejninger 

O min 

 

Nomdrejninger 

O s 

 

Pbeluftet 

[W] 

KLaestimeret 

[s -1 ] 

400 6,66 1,22 0,030 

700 11,66 10,26 0,132 

Tabel 1.2: KLaestimeret


Det ses af Tabel 1.2, at hvis omrøringen øges, så stiger KLa værdien. 

1.2 Bestemmelse af KLapraksis 

For at finde den volumetriske overførselskonstant, KLa, foretages et forholdsvis enkelt forsøg, 

se Afsnit 1.2.1. 

Til beregning af den estimerede KLa blev det gennemsnitlige volumen (7,5 L) anvendt, 

hvilket derfor også anvendes ved dette forsøg for bedre at kunne sammenligne resultaterne. 

DetermuligtatfindeKLavedmåle koncentrationen af ilt i vand som funktion af tiden, 

hvilket kan beskrives med følgende ligning [2]: 

Vedintegrationfås: 

dC L =KLa⋅C-CL dt 

* ( ) 

* ( ) 

ln C -C = -K a ⋅t 

+ b 

L L 

Heraf ses, at det er muligt at bestemme -KLa som hældningen ved afbildning af 

* ( L ) 

ln C -C som funktion af tiden. 

1.2.1 Forsøgsbeskrivelse 

Fermentoren fyldes med 7,5 L vand, hvorefter omrøringen startes ved henholdsvis 400 og 700 

O 

min 

for at mætte væsken med ilt, inden forsøget startes. 

Herefter fjernes ilten i væsken ved at tilføre gasformig nitrogen til fermentoren, indtil 

iltniveauet når ned på nul. Nulpunktet holdes i nogle minutter. Herefter startes lufttilførslen 

samtidig med at tilførsel af N2 stoppes, og der måles på iltindholdet, indtil mætning med ilt er 

opnået [2]. 

1.2.2 Resultater 

Ved de to forsøg er iltkoncentrationen målt i vandet som funktion af tiden, og herudfra fås 

Figur 1.4. 

Bilag 1 Side 5 af 6


8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

400 O/min 

0 

0 5 10 

Tid [min] 

15 2 0 2 5 

a) Målte iltkoncentrationer ved 400 O 

min 

Figur 1.4: Målte iltkoncentrationer ved 400 og 700 O 

min . 

700 O/min 


Ilt [mg/L] 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 5 10 15 20 25 

Tid [min] 

b) Målte iltkoncentrationer ved 700 O 

min 

Der ses af graferne i Figur 1.4, at opløsningen af ilt i væsken efter total fjernelse sker hurtigst 

ved 700 O 

min , idet hældningen er lidt stejlere. For det lineære liniestykke på de to grafer, dvs. 

* 

områdernemellem12og15minberegnes ( L ) 

Figur 1.5. 

ln (C-CL) 

2,4 

2,2 

2,0 

1,8 

1,6 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

400 O/min 

y = -0,0123x + 1,9482 

R 2 = 0,9983 

0 20 40 60 80 100 120 140 160 

Tid [sek] 

a) 400 O 

min 

ln C -C og afbildes som funktion af tiden, se 

ln (C-CL) 

2,4 

2,2 

2,0 

1,8 

1,6 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

0,0 

700 O/min 

y = -0,0198x + 1,7529 

R 2 = 0,9972 

0 20 40 60 80 100 120 140 160 

Tid [sek] 

b) 700 O 

min 

Figur 1.5: ln(C – CL) som funktion af tiden ved 400 og 700 O 

min . 

Udfra hældningen på graferne kan KLa bestemmes, idet -KLa er lig med hældningen, se Tabel 

1.3. Det ses af tabellen, at den volumetriske overførselskonstant stiger ved en øget 

omrørerhastighed. 

Kildehenvisning: 

Nomdrejninger 

O min 

[1] : Biochemical Engineering Fundamentals, 2. udg. 

Bailey, James E. og Ollis, David F. 

McGraw-Hill Inc. 1986 

ISBN 0-07-003212-2 

 

KLapraksis 

[s -1 ] 

400 0,0123 

700 0,0198 

Tabel 1.3: KLapraksis. 

[2] : Principles of Fermentation Technology, 2. udg. 

Stanbury, P. F.; Whitaker, A. og Hall, S. J. 

Elsevier Science Ltd. 1995 

ISBN 0-08-036131-5

Bilag 2 

Huskelister, 

forsøgsbeskrivelser og 

resultatskemaer

K-PRO 7 Huskelister Gruppe 2 

1. Udførsel af fermenteringerne 

Under fermenteringerne er der blevet anvendt forskellige huskelister, forenklede 

forsøgsbeskrivelser og resultatskemaer. Disse vil blive gennemgået i dette bilag. 

2. Huskelister 

Der er udarbejdet forskellige huskelister over hvilke ting der skulle gøres før, under og efter 

en fermentering. Disse er som følgende: 

2.1. Før fermentering 

2.1.1. To dage før fermentering 

• Fremstilling af substrat til forkultur 

• Podning af forkultur 

2.1.2. Dagen før opstart 

• Fremstilling af substrat, både tilledningssubstrat og startsubstrat 

• Autoklavering af tilledningssubstrat samt flaske til ammoniakvand 

• Autoklavering af tildrypningsnåle, gasmus, pipetter samt sterilfilter til 

lufttilførsel 

• Fremstilling af 2 M saltsyre og 10 % ammoniakvand 

• Autoklavering af saltsyre og skumdæmper 

• Sterilfiltrering af ammoniakvand 

2.1.3. Lige før opstart 

• Kalibrering af pH-elektrode 

• Fyldning af fermentor med startsubstrat 

• Autoklavering af fermentor, se Afsnit 2.1.4 

• Påsætning af tildrypningsnåle, gasmus og lufttilførsel 

• Fermenteren indstilles, se Afsnit 2.1.5 

• Indstilling af kontrolenhed, se Afsnit 2.1.6 

• Podning af fermentor, se Afsnit 2.1.7 

• Start af dataopsamling, se Afsnit 2.1.8 

Bilag 2 Side 1 af 9


2.1.4. Autoklavering af fermentor 

• Anbringelse af substrat i fermentor 

• Panelet og fermentorens kølevand tændes 

• Omrøreren sættes på 700 RPM 

• Ventilerne i toppen af fermentoren stilles på: Blå lukket og rød åben. 

Rød lukkes ved 100 ºC. 

• Temperaturen indstilles på 121 ºC og kontakten ”STER” vælges. 

• Temperaturkontakten sættes på ”ACT”. 

• Når temperaturen nås, autoklaveres i 20 min. 

• Efter endt autoklavering ændres temperaturen til den ønskede temperatur 

(30 ºC) 

• Konstanten ”STER” sættes på ”CULT”. 

• Når temperaturen er nede på 100 ºC, åbnes den blå ventil. 

2.1.5. Indstilling af fermentor 

• Den blå ventil til luft skal være åben 

• Den orange ventil til luft skal være lukket 

• Alle åbninger skal være lukkede 

• De to sorte aftapningshaner skal være lukkede 

• De to røde ventiler skal være lukkede 

• STEAM-knappen skal stilles på ”OFF” 

• DerskalværeovertrykipH-elektroden(ca.2bar) 

• Der skal være kølevand på systemet 

Bilag 2 Side 2 af 9


2.1.6. Indstilling af kontrolenhed 

• Indstilling kontrolenhed 

o POWERskalværepå”ON” 

o STER/CULT kontakten skal stå på ”CULT” 

o H-OFF/RESET kontakten skal stå på ”H-OFF” 

o Kontakten skal stå på ”ON” (grønknap) 

• Indstilling af pH-kontrol 

o pH indstilles til 5,4 

o Displayetskalståpå”ACT” 

o AUTO/MAN kontakten skal stå på ”AUTO” 

o pH pumperne tændes og stilles på ”STEP” 

o ”SPEED” skal stå på 1 streg 

• Indstilling af temperaturkontrol 

o Temperatur indstilles til 30,0 °C 


o AUTO/MAN kontakten skal stå på ”AUTO” 

• Indstilling af substratpumpe 

o Substratpumpen skal være slukket 

o Signalet til substratpumpen fra PC’en stilles til 0 

o Substratpumpen tændes 

o Kontakten skal stå på ”REM” 

• Indstilling af omrører 

o Kontakten skal stå på ”AUTO” 

o Setpoint skal stå på 400/700 RPM 


• Indstilling af iltmåler 

o Range skal stå på ”HI” 

o AUTO/MAN kontakten skal stå på ”MAN” 


L 

o Luftflowet skal være 25 min 

Bilag 2 Side 3 af 9


2.1.7. Podning af fermentor 

• Udpakning af steril pipette 

• Flambering af kolbe 

• Afpipettering 

• Flambering af kolbe 

• Flambering af pipettespids og fermentoråbning 

• Kulturen hældes i fermentoren 

• Fermentoråbningen flamberes og låget sættes i. 

2.1.8. Start af dataopsamling 

• Start programmet VisSim og åben reguleringsfilen. 

• Ændre navnet på den datafil resultaterne gemmes i 

• Tryk på ”Run” i menuen ”simulering” eller på ”F5” 

• Signalet til substratpumpen indstilles til 0 

2.2. Under en fermentering 

2.2.1. Prøve udtagning 

• Dampgeneratoren tændes ca. 15 min før udtag 

• Den røde ventil åbnes, og dampen steriliserer rørene ved udtaget 

• Det yderste rør tages af og prøven udtages 

• Røret sættes på igen 

2.3. Efter en fermentering 

2.3.1. Dataopsamling 

• For videre bearbejdning af prøven, se afsnit 3 

• Programmet VisSim stoppes og gemmes 

• Datafilen, hvor de opsamlede data er gemt, omdøbes, således at denne 

ikke overskrives 

2.3.2. Prøve til kulturrenhed 

• Der udtages en prøve på ca. 50 mL i en steril flaske 

Bilag 2 Side 4 af 9

K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelser Gruppe 2 

3. Forsøgsbeskrivelser 

3.1. Aflæsning af volumener 

• Væskehøjden på alle flasker aflæses 

• Resultatet indskrives på resultatskemaerne 

3.2. Tørstofbestemmelse 

• Tre gange 10,00 mL overføres til centrifugeglas (15 mL) og centrifugeres i 5 min 

ved 3500 RPM 

• Væsken fjernes, og der efterlades kun cellemasse i bunden af glasset 

• Centrifugeglas sættes i varmeskab ved 105 ºC i 1 til 2 døgn 

3.3. Bestemmelser med enzymkit 

• 10,00 mL overføres til centrifugeglas og centrifugeres ved 3500 RPM i 5 min 

• Overdækkes med låg 

• Overføres til 80 ºC vandbad i 15 min for at stoppe enzymatiske reaktioner 

3.3.1. Sukker 

• Prøve klar til glucosetest – kuvette dækkes med låg 

• Fremstilling af opløsning 1 og 3 

Blank Prøve 

Opløsning 3 (37ºC) 0,200 mL 

0,200 mL 

Prøve 

- 

0,100 mL 

Blandes og placeres i 37 ºC vandbad i 5 min, nedkøles til 20 – 25 ºC 

Opløsning 1 

1,000 mL 

1,000 mL 

Dem. vand 

1,800 mL 

1,700 mL 

Blandes og A1 aflæses efter ca. 3 min 

Opløsning 2 0,020 mL 0,020 mL 

Blandes og A2 aflæses efter 10 – 15 min 

Glucose måles efter forsøgsplanen. Blankprøver måles en gang pr. fermentering. 

• Glucosemængden omregnes til en sukkermængde 


Bilag 2 Side 5 af 9

K-PRO 7 Forsøgsbeskrivelser Gruppe 2 

3.3.2. Ethanol 

• Prøve klar til ethanoltest – kuvette dækkes med låg 

• Fremstilling af opløsning 2 

Opløsning 2 

Dem. vand 

Prøve 

Blank Prøvel 

3,000 mL 

0,100 mL 

- 

3,000 mL 

- 

0,100 mL 

Blandes og A1 aflæses efter 3 min 

Opløsning 3 0,050 mL 0,050 mL 

Blandes og A2 måles efter 5 – 10 min 

Ethanol måles efter forsøgsplanen. Blankprøve måles en gang pr. fermentering. 


3.4. Gas analyse 

• Gennemluftning af mus – lukning af mus 

• Udtagning af prøve 

• Kørsel på GC – trippelbestemmelse 

Bilag 2 Side 6 af 9

K-PRO 7 Resultatskemaer Gruppe 2 

4. Resultatskemaer 

4.1. Fermentering 

Dato: 

Forsøgsnr.: 

Fermenteringstype: 

4.2. Podemængde 

Podemængde [g]: 

Podemængde [mL]: 

Koncentration podekolbe [g/L]: 

Pladeudspredning: 

Plade: 

Forbrug af tilledte væsker: 

Ammoniakvandforbrug [mL]: 

Saltsyreforbrug [mL]: 

Substratforbrug [L] 

Skema til prøveudtagning: 

Se vedlagte sider 

Bilag 2 Side 7 af 9


4.3. Skema til prøveudtagning 1 

Fermentering nr.: 

Dato: 

Tørstof 

Ethanol Sukker 

1 2 3 

Prøve nr. Før Efter Før Efter Før Efter FF Abs FF Abs 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

12 

13 

14 

15 

Forkultur - - - - 

Bilag 2 Side 8 af 9


4.4. Skema til prøveudtagning 2 

Fermentering nr.: 

Dato: 

4.5. Væskeforbrug GC 

Prøve nr. Substrat Ammoniakvand Saltsyre 1 2 3 

Start - - - 

1 

2 

3 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

12 

13 

14 

15 

Bilag 2 Side 9 af 9

Bilag 3 

Bestemmelse af 

sukkerindhold

K-PRO 7 Bestemmelse af sukkerindhold Gruppe 2 

1 Bestemmelse af sukkerindhold 

Glucoseinholdet i fermenteringsvæske er bestemt vha. Enzymatisk bioanalyse nr. 139041 fra 

Boehringer Mannheim vha. spektrofotometer, hvorefter denne koncentration omregnes til en 

sukkerkoncentration. Dette beskrives i nedenstående afsnit. Herudover er kendte og 

beregnede koncentrationer af sukker sammenlignet for at undersøge, hvor effektiv 

enzymkittet er til at genfinde en kendt sukkerkoncentration, når der efter bestemmelse af 

glucoseindholdet foretages en omregning. Derudover undersøges om den anvendte 

bølgelængde ved analyserne er den optimale. 

1.1 Bestemmelse af glucoseindhold i fermenteringsvæske 

Det enzymatiske kit gør det muligt at finde indholdet af glucose i fermenteringsvæske ved 

først at spalte sukker til glucose ved enzymatisk inversion og derefter omdanne glucose til Dgluconat-6-phopshat. 

1.1.1 Enzymatisk inversion 

Ved pH 4,6 hydrolyseres sukker, her som sucrose, til fructose og glucose vha. enzymet β- 

fructosidase 

12 

22 

11 

2 

β−fructosida 

se 

C H O + H O ⎯⎯⎯⎯⎯→ 

D − C H O + D − C 

6 Glucose 

6 Fructose 

Ved nedbrydningen af sucrose er der kun glucose og fructose tilstede i prøven, derved er det 

muligt at bestemme den totale mængde glucose tilstede i prøven. 

1.1.2 Glucosebestemmelse 

Ved pH 7,6 katalyserer tilstedeværelsen af enzymet hexokinase (HK) phosphoryleringen af 

D-glucose med ATP. 

O 

H OH 

HOH H OH 

H OH 

OH 

D-Glucose 

+ ATP 

HK 


6 

O 

H 

12 

HO 

H 

H 

OH 

O 

H 

O 

OH 

P 

OH 

O - 

O - 

6 

H 

12 

O 

+ ADP 

Glucose-6-phosphat


Det dannede glucose-6-phosphat oxideres herefter vha. NADP + ved tilstedeværelse af 

enzymet 

NADPH. 

glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6P-DH) til D-gluconat-6-phopshat og 

O 

H 

HO 

H 

H 

OH 

O 

H 

O 

OH 

P 

OH 

O - 

O - 

+ 

Glucose-6-phosphat 

NADP + 

G 6 P-DH 

NADPH H + 


O 

H 

HO 

OH 

H 

H 

OH 

O 

H 

O 

OH 

P 

OH 

O - 

O - 

D-gluconat-6-phosphat 

+ + 

Den mængde NADPH, som dannes ved denne reaktion, vil støkiometrisk være lig med 

mængden af D-glucose omdannet, og derfor kan NADPH anvendes som et mål for 

tilstedeværelsen af glucose og måles ved spektrofotometri, da denne absorberer lys. 

1.1.3 Prøveforberedelse 

En prøve udtaget fra fermentoren centrifugeres og placeres overdækket i et 80 ºC varmt 

vandbad i 15 min for at stoppe enzymatiske reaktioner, og herefter kan væsken anvendes til 

måling af glucoseindholdet. Prøven fortyndes, hvis dette er nødvendigt. 

1.1.4 Reagensfremstilling 

7,2 g pulverblanding (triethanolamin buffer, 110 mg NADP, 260 mg ATP og MgSO4) (pH ca. 

7,6) opløses i 45 mL dem. vand, hvilket danner opløsning 1. Opløsning 2 indeholder 1,1 mL 

enzymopløsning (320 U hexokinase og 160 U G6P-DH). 0,5 g lyophilizat (citrat buffer, pH 

4,6 og 720 U β-fructosidase) opløses i 10 mL dem. vand, hvilket danner opløsning 3. 

1.1.5 Måling af glucose-indholdet 

Der udtages 0,200 mL af opløsning 3 opvarmet til 37ºC og 0,100 mL af prøven, disse blandes 

og inkuberes ved 37ºC i 5 min, herved den enzymatiske inversion sker. Derefter tilsættes 

1,000 mL af opløsning 1 og henholdsvis 1,700 mL dem. vand i prøveopløsningen og 1,800 

mL dem. vand i blankprøven. Dette blandes, og efter 3 min kan absorbansen A1 aflæses.


Inversionsreaktionen startes ved at tilsætte 0,020 mL af opløsning 2 og en opblanding. Efter 

10 – 15 min er reaktionen endt, og absorbansen A2 kan aflæses. 

Herefter er det muligt at bestemme den totale mængde glucose tilstede i prøven: 

∆A 

Glucose 

= ( A 2 − A1 

) Prøve − ( A 2 − A1 

) Blank 

1.1.6 Beregning af koncentrationen af glucose i fermenteringsvæsken 

Prøverne måles på et spektrofotometer ved 340 nm og 20 – 25 ºC, hvorudfra det er muligt at 

beregne koncentrationen af glucose i prøven udfra nedenstående ligning. Det er ifølge 

g 

forskriften muligt at måle koncentrationer indenfor intervallet 8 

L prøve 

være overdækket for at undgå afdampning. 

V ⋅M 

c = ⋅∆A 

Slut Glucose 

Glucose mmol 

ε340nm ⋅ dKuvette ⋅vPrøve⋅1000 mol 

Glucose 

hvor VSlut : Slutvolumen af prøve [mL] 

vPrøve : Volumen prøve tilsat [mL] 

dKuvette : Lysvej gennem kuvette [cm] 

glucose g glucose 

0, - L prøve 

80 . Prøven bør 

6, 3 ] ⋅ 

ε340 nm : Molær absorptionskoefficient for NADPH ved 340 nm [ L 

mmol cm 

1.1.7 Beregning af sukkerindhold 

Ved fermenteringerne anvendes sukker, som hovedsageligt består af sucrose, der så nedbrydes 

til glucose og fructose. Indholdet af sukker i fermenteringsvæsken måles som mængden af 

glucose, hvorfor det er nødvendigt at omregne de fundne glucosekoncentrationer til 

sukkerkoncentrationer. 

For at kunne omregne glucosekoncentrationer til sukkerkoncentrationer er forholdet mellem 

glucose og sukker fundet udfra nedenstående ligning: 

12 

22 

11 

2 

β−fructosida 

se 

C H O + H O ⎯⎯⎯⎯⎯→ 

D − C H O + D − C 

6 Glucose 

6 Fructose 

Her ses, at molforholdet mellem glucose og sukker er 1:1, hvorfor det er muligt at beregne 

masseforholdet, se Tabel 1.1, og derved beregne sukkerkoncentrationerne. 


6 

12 

6 

H 

12 

O


Glucose Sukker 

CH 6 12O6 C12H22O11 M 

g 

 

 

mol 180,2 342,3 

n [mol] 1 1 

m [g] 180,2 342,3 

forhold 

g sukker 

gglucose 

gglucose 

g sukker 

1 

0,526 

1,901 

1 

Tabel 1.1: Forhold mellem glucose og sukker. 

Når dette forhold kendes, er det muligt at beregne koncentrationen af sukker udfra 

koncentrationen af glucose. 

1.2 Sammenligning af kendte og beregnede sukkerkoncentrationer 

For at evaluere resultaterne ved anvendelse af enzymkit til bestemmelse af koncentrationen af 

sukker i fermenteringsvæsken fremstilles en række standardopløsninger indeholdende en 

kendt mængde sukker. Herefter måles disse på spektrofotometer ved 340 nm og udfra 

absorbanserne er det muligt at beregne koncentrationen af glucose i prøven, som herefter kan 

omregnes til sukker. Den beregnede koncentration kan herefter sammenlignes med den kendte 

koncentration, og herudfra kan det vurderes om enzymkittet er anvendeligt til bestemmelse af 

sukkerkoncentrationen i fermenteringsvæske. 

1.2.1 Standardopløsninger 

Der blev fremstillet otte standardopløsninger i intervallet 0,1 til 30 g sukker pr. liter. De 

aktuelle koncentrationer og de beregnede koncentrationer ses i Tabel 1.2. 

Opløsning 

nr. 

Caktuel 

[ g 

L ] 

Cberegnet 

[ g 

L ] 

1 0,1017 0,098 

2 0,5019 0,459 

3 1,0121 1,148 

4 2,5062 2,461 

5 5,0330 5,250 

6 10,0100 9,843 

7 20,2470 19,686 

8 30,8510 47,574 

Tabel 1.2: Aktuelle og beregnede koncentrationer af standardopløsninger. 

Den beregnede koncentration er herefter afbildet som funktion af den aktuelle koncentration, 

se Figur 1.1, derudover er der indsat en kurve til sammenligning af den aktuelle og den 

beregnede koncentration. Det er tydeligt at se de steder, hvor de beregnede koncentrationer 

ikke stemmer overens med de aktuelle. 

Bilag 3 Side 4 af 5


Beregnet koncentration [g/L] 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

0 10 20 30 40 50 

Aktuel koncentration [g/L] 

Sukker 

Figur 1.1: Den beregnede koncentration som funktion af den aktuelle koncentration. 

Som det ses af Figur 1.1, så afviger den beregnede koncentration meget fra den aktuelle ved 

koncentrationer højere end 20 g 

L , dette kan skyldes en fejl ved målingerne, da der kun er 

foretaget en gentagelse. Det ses dog, at de beregnede koncentrationer under 10 g 

L 

passer godt 

med de aktuelle koncentrationer, hvorfor ligningen til beregning af koncentrationen kan 

anvendes, se Afsnit 1.1.6. 

1.3 Bestemmelse af optimal bølgelængde 

Bølgelængden 340 nm anvendes til bestemmelse af glucosekoncentrationen. Denne 

bølgelængde er valgt på baggrund af en bølgelængdescanning for at finde den optimale 

bølgelængde til analyse af glucosekoncentrationen i prøverne, se Figur 1.2. Værdien er valgt, 

da der ved 340 nm er en høj absorbans, men dog ikke så høj en absorbans, at prøven 

absorberer alt lyset, se Figur 1.2. 

Abs 

7,0 

6,0 

5,0 

4,0 

3,0 

2,0 

1,0 

0,0 

Glucose 

240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 

Bølgelængde [nm] 

Figur 1.2: Absorbans som funktion af bølgelængde for glucose. 

Bilag 3 Side 5 af 5

Bilag 4 

Bestemmelse af 

ethanolindhold

K-PRO 7 Bestemmelse af ethanolindhold Gruppe 2 

1 Bestemmelse af ethanolindhold 

Ethanolinholdet i fermenteringsvæske er bestemt vha. Enzymatisk bioanalyse nr. 176290 fra 

Boehringer Mannheim vha. spektrofotometer, hvilket beskrives i nedenstående afsnit. 

Herudover er kendte og beregnede koncentrationer af ethanol sammenlignet for at undersøge, 

hvor effektiv enzymkittet er til at genfinde en kendt ethanolkoncentration. Derudover 

undersøges om den anvendte bølgelængde ved analyserne er den optimale. 

1.1 Bestemmelse af ethanolindhold i fermenteringsvæske 

Det enzymatiske kit fra Boehringer Mannheim virker ved, at ethanol oxideres til acetaldehyd 

af nicotinamid-adenin dinuleotid (NAD) ved tilstedeværelse af enzymet alkohol 

dehydrogenase (ADH): 

+ ADH 

CH 3CH 

2OH 

NAD ⎯⎯ 

⎯ → CH 3 

+ CHO + NADH + H 

Ligevægten vil under alkaline forhold forskydes mod højre, og derved omdannes alt ethanol i 

prøven til acetaldehyd. Acetaldehyd oxideres herefter til eddikesyre ved tilstedeværelse af 

aldehyd dehydrogenase (Al-DH): 

+ 

Al−DH 

CH3CHO NAD + H 2O 

⎯⎯⎯→ 

CH 3CH 

2 

+ OH + NADH + H 

Udfra de to ovenstående reaktionsligninger ses, at der dannes 2 mol NADH for hver gang der 

dannes 1 mol ethanol. Da det er NADH, der måles ved denne bestemmelse på 

spektrofotometeret, skal der tages højde for dette forhold mellem ethanol og NADH i 

beregningen af ethanolkoncentrationen, se nedenstående formel. 

1.1.1 Prøveforberedelse 

En prøve udtaget fra fermentoren centrifugeres og placeres overdækket i et 80 ºC varmt 

vandbad i 15 min for at stoppe enzymatiske reaktioner, og herefter kan væsken anvendes til 

måling af ethanolindholdet. Prøven fortyndes, hvis dette er nødvendigt. 


+ 

+


1.1.2 Reagensfremstilling 

3,000 mL kalium diphosphatbuffer (pH ca. 9) blandes med 1 tablet (ca. 4 mg NAD og 0,8 U 

Al-DH) og danner opløsning 2. Denne blanding tilsættes 0,100 mL udtaget prøve eller dem. 

vand. Efter grundig omrystning måles absorbansen A1. Oxidationsreaktion sættes i gang ved 

at tilsætte 0,050 mL ADH (opløsning 3). Efter 5 – 10 min måles absorbansen A2. 

1.1.3 Beregning af koncentrationen af ethanol i fermenteringsvæsken 

Prøven måles på et spektrofotometer ved 340 nm og 20 ºC, hvorudfra det er muligt at beregne 

koncentrationen af ethanol i prøven. Det er ifølge forskriften muligt at måle koncentrationer 

g ethanol g ethanol 

indenfor intervallet 0, 06 − 60 . Prøven skal være overdækket for at undgå 

L prøve L prøve 

afdampning af ethanol. 

hvor 

V ⋅ M 

c Ethanol = 

⋅ 

Prøve − 

ε ⋅ d 

⋅1000 

VSlut 

340 nm 

Slut Ethanol 

NADH 

Kuvette ⋅ v Prøve ⋅ 2 

Ethanol 

: Slutvolumen af prøve [mL] 

vPrøve : Volumen prøve tilsat [mL] 

dKuvette : Lysvej gennem kuvette [cm] 

( A 2 − A1 

) − ( A 2 A1 

) Blank 


mmol 

mol 

6, 3 ] ⋅ 

ε340 nm : Molær absorptionskoefficient for NADH ved 340 nm [ L 

mmol cm 

1.2 Sammenligning af kendte og beregnede ethanolkoncentrationer 

For at evaluere resultaterne ved anvendelse af enzymkit til bestemmelse af koncentrationen af 

ethanol i fermenteringsvæsken fremstilles en række standardopløsninger indeholdende en 

kendt mængde ethanol. Herefter måles disse på spektrofotometer ved 340 nm og udfra 

absorbanserne er det muligt at beregne koncentrationen af ethanol i prøven. Den beregnede 

koncentration kan herefter sammenlignes med den kendte koncentration, og herudfra kan der 

vurderes, hvor godt enzymkittet kan genfinde en kendt mængde ethanol.


1.2.1 Standardopløsninger 

Der blev fremstillet otte standardopløsninger i intervallet 0,1 g 

L 

g 

til 30 L . De aktuelle 

koncentrationer og de senere beregnede koncentrationer samt afvigelsen ses i Tabel 1.1. 

Opløsning 

nr. 

Caktuel 

[ g 

L ] 

Cberegnet 

[ g 

L ] 

1 0,1055 0,092 

2 0,4860 0,411 

3 0,9980 1,014 

4 2,7460 2,500 

5 5,2620 5,288 

6 11,1520 10,253 

7 20,4500 20,736 

8 31,9800 37,094 

Tabel 1.1: Aktuelle og beregnede koncentrationer af standardopløsninger. 

Den beregnede koncentration er herefter afbildet som funktion af den aktuelle koncentration, 

se Figur 1.1, derudover er der indsat en kurve til sammenligning af kendte og beregnede 

koncentrationer, så det er tydeligt at se de steder, hvor de beregnede koncentrationer ikke 

stemmer overens med de aktuelle. 

Beregnet koncentration [g/L] 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

0 10 20 30 40 50 

Aktuel koncentration [g/L] 

Ethanol 

Figur 1.1: Den beregnede koncentration som funktion af den aktuelle koncentration. 

Bilag 4 Side 3 af 4


Som det ses af Figur 1.1, så afviger den beregnede koncentration meget fra den aktuelle ved 

koncentrationer højere end 20 g 

L , dette kan skyldes en fejl ved målingerne, da der kun er 

foretaget en gentagelse. Det ses dog, at de beregnede koncentrationer under 10 g 

L 

passer godt 

med de aktuelle koncentrationer, hvorfor ligningen til beregning af koncentrationen kan 

anvendes, se Afsnit 1.1.3. 

1.3 Bestemmelse af optimal bølgelængde 

Som nævnt måles absorbansen ved anvendelse af enzymkit ved 340 nm. Denne bølgelængde 

er valgt efter at have foretaget en bølgelængdescanning, se Figur 1.2, for at finde den 

optimale bølgelængde, hvor der opnås en høj absorbans samtidig med at det undgås at prøven 

absorperer alt lyset. 

Bølgelængden 340 nm er valgt, da der her er en høj absorbans, men denne ligger alligevel et 

stykke fra, hvor alt lyset bliver absorberet, se Figur 1.2. 

Abs 

Ethanol 

7,0 

6,0 

5,0 

4,0 

3,0 

2,0 

1,0 

0,0 

240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 

Bølgelængde [nm] 

Figur 1.2: Absorbans som funktion af bølgelængden for ethanol. 

Bilag 4 Side 4 af 4

Bilag 5 

Bestemmelse af nitrogen og 

kuldioxid

K-PRO 7 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid Gruppe 2 

1 Bestemmelse af nitrogen og kuldioxid 

Koncentrationen af nitrogen og kuldioxid i udgangsgassen er bestemt ved anvendelse af 

gaschromatografi. Denne analysemetode er beskrevet i nedenstående. Herudover er der 

fremstillet standardkurver for både nitrogen og kuldioxid, og disse er undersøgt vha. 

regressionsanalyse. 

1.1 Gaschromatografi 

Gaschromatografi (GC) er en chromatografisk metode, hvor en blanding separeres ved først at 

bringe stofferne i blandingen på gasform og dernæst lade dem passere igennem en kolonne. 

Gaschromatografi kan inddeles i to chromatograferingstyper, GLC og GSC, hvor GLC står 

for Gas Liquid Chromatografi og GSC for Gas Solid Chromatografi. Forskellen mellem de to 

metoder er, ved GLC foregår separationen af blandingens komponenter pga. 

ligevægtsfordelingen mellem en flydende stationærfase og bæregassen. Hvor blandingens 

komponenter ved GSC adskilles pga. deres affinitet 1 til en fast stationær fase. [1], [2] 

1.1.1 Apparatet 

Et GC-apparat er grundlæggende opbygget af fem enheder. Tilførsel af bæregas, en injektor, 

en ovn, en kolonne og en detektor, se Figur 1.1. Bæregassen har til formål at bære prøven 

igennem systemet, hvorfor det er vigtigt at bæregassen er inert, således at den ikke påvirker 

prøven. Af denne grund anvendes ofte N2,H2 eller He som bæregas. Injektoren har til formål 

at føre prøven over i bæregassen. Der findes forskellige typer af injektionssystemer, de 

vigtigste er split, hvor prøven splittes op i to strømme, hvoraf kun den ene føres ind gennem 

kolonnen, eller splitless, hvor hele prøven sendes ind gennem kolonnen. Ovnen holder 

temperaturen gennem kolonnen. De fleste ovne kan programmeres således, at temperaturen 

kan varieres under analysen, så kolonnen får optimale temperaturforhold. I kolonnen foregår 

selve adskillelsen af de forskellige komponenter i prøven. Kolonnen kan enten være en pakket 

eller en kapillar kolonne. Detektoren er den del af apparatet der skal registrere, hvornår de 

separerede komponenter i prøven passerer ud af kolonnen. Detektoren sender et signal videre 

til et databehandlingssystem, som ender ud med et chromatogram. [1], [2] 

1 Stoffers evne til at bindes til den stationære fase. 

Bilag 5 Side 1 af 9


Figur 1.1: Opbygning af GC[2]. 

1.2 Måling af nitrogen og kuldioxid 

Til måling af nitrogen og kuldioxid anvendes en gaschromatograf af mærket Hewlett Packard 

HP 6390 serie GC system Plus+. 

1.2.1 Bæregas 

Som bæregas anvendes helium med et flow på 4 mL 

cm 

, eller en gas hastighed på 52 . 

min s 

En af fordelene ved at anvende He som bæregas er, at den er velegnet til TCD, da den har en 

varmekonduktivitet, der er højere en de fleste almindelige gasser, der analyseres for. Dette gør 

detektoren mere følsom over for komponenter i prøven, se Afsnit 1.2.5. 

1.2.2 Injektion 

Injektionen foregår manuelt i en split injektionsblok. Prøven, der injiceres, har et volumen på 

50 µL og da der anvendes et splitforhold på 1:50, vil 1 µL prøve føres til kolonnen. Prøven 

opvarmes til 200 °C, inden den sendes ind gennem kolonnen. 

1.2.3 Kolonne 

Den anvendte kolonne er en GS-GASPRO kolonne, som hører under kategorien PLOT 

kolonner (Porous Layer Open Tubular). Kolonnen er en kapillar kolonne med en fast 

stationær fase, der består af Fused Silica 2 , hvilket gør det til en GSC adskillelse. 

Selve kolonnen er 30 m lang og har en indvendig diameter på 0,32 mm. 

2 

Fused Silica er SiO2 uden krystallinsk struktur, ligner ikke glas og er et ikke krystallinsk fast stof, og er i høj 

grad amorf (stor atomuorden), har samme karakteristika som en væske [3]. 

Bilag 5 Side 2 af 9


1.2.4 Ovn 

Ovnen skal ifølge metoden, se Figur 1.4, programmeres til at holde en temperatur på 25 °C i 3 

min. og herefter øges temperaturen med 10 °C 

min. til200°C.MendaN2 og CO2 har korte 

retentionstider, se Figur 1.4 og dermed hurtig kommer ud af kolonnen, afkortes programmet 

til en stigning på 10 °C til 100 °C. Herudover blev starttemperaturen hævet fra 25 °C til 30 

min. 

°C. Dette skyldes, at ovnen blev kølet med luft fra laboratoriet og da rumtemperaturen ofte 

var over 25 °C, var det ikke muligt at køle til denne temperatur. 

1.2.5 Detektor 

Den detektor, der anvendes, er en termisk ledningsevne detektor (TCD), som er en detektor 

der består af to kamre, hvor der i hvert af kamrene sidder en wolframglødetråd, se Figur 1.2. I 

det ene kammer løber prøven og bæregassen igennem, hvor der i det andet kammer løber ren 

bæregas. Alle stoffer har forskellige varmeledningsevne, hvilket betyder at når et stof fra 

prøven passerer det ene kammer sammen med bæregassen, ændres temperaturen af 

glødetråden, som følge af ændringen i varmeledningsevnen. Denne ændring i temperatur 

forsager en ændring af modstanden over glødetråden, som så omsættes til et signal. [1], [2] 

Figur 1.2: Opbygning af en TCD detektor [1]. 

Helium er den mest anvendte bæregas, når der anvendes en TCD detektor. Helium har en 

varmekonduktivitet, der er højere de fleste andre gasser, kun hydrogen har en højere værdi, se 

Figur 1.3. Dette betyder, at He kan anvendes som bæregas gennem detektoren til analyse af 

alle andre gasser end He og H2. I forhold til gasserne i prøven har He en stor 

varmeledningsevne, hvilket gør det lettere at detektere et fremmed stof, og dermed bliver 

detektoren mere følsom [1], [2]. 

Bilag 5 Side 3 af 9


Stof λ W mK ⋅ 

Stof λ W mK ⋅ 

H2 0,183 Ar 0,017 

He 0,148 Ne 0,048 

N2 0,026 NO 0,025 

CO2 0,016 Cl2 0,009 

H2O 0,017 SO2 0,008 

O2 0,026 H2S 0,012 

CH4 0,033 NH3 0,024 

C2H6 0,021 CO 0,025 

Figur 1.3: Varmeledningsevne for forskellige gasser [4]. 

Figur 1.4: Metode [5] 

Ved at følge den metode, der er angivet på Figur 1.4, fås et chromatograf pr. prøve, for 

talværdier, se Måledata 1 til 6. Eksempler på chromatogrammer er vedlagt bagest i dette bilag. 

Bilag 5 Side 4 af 9


1.3 Måling af kuldioxid 

Til måling af kuldioxid er der fremstillet en standardkurve ud fra to kendte gasblandinger, ren 

CO2 og atmosfærisk luft. Fra GC målinger fås følgende arealer, se Tabel 1.1. 

Konc. Arealer 

% 1 2 3 snit 

Ren CO2 99,95 483 477 526 495 

Atmosfærisk luft 0,0365 0,311 0,341 0,195 0,282 

Tabel 1.1: Målinger til standardkurve for kuldioxid. 

Indtegnes dette fås følgende standardkurve, se Figur 1.5. 

Konc % 

100 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

CO2 

Konc % = 0,202·Areal - 0,021 

R 2 =0,996 

0 100 200 300 400 500 

Areal 

Figur 1.5: Standardkurve for kuldioxid. 

Denne standardkurve vil blive brugt til bestemmelse af kuldioxidkoncentrationen i 

udgangsgassen under fermenteringerne. 

Bilag 5 Side 5 af 9


1.3.1 Regressionsanalyse for kuldioxid 

Der ses, om der er statistisk grundlag for at anvende den lineære model. 

Konc Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse 

----------------------------------------------- 

0,0365 3 0,3 -21,139 21,704 

99,95 3 495,3 473,912 516,755 

----------------------------------------------- 

Konc Antal Snit Homogene grupper 

----------------------------------------------- 

0,0365 3 0,3 X 

99,95 3 495,3 X 

----------------------------------------------- 

Figur 1.6: Variansanalyse for standardkurver til kuldioxid analyse. 

Det ses af Figur 1.6, at der er signifikant forskel mellem målinger på de forskellige 

koncentrationer, hvilket der skal være for at analysemetoden kan detektere forskelle 

mellem de forskellige koncentrationer. 

Konc % 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

0 100 200 300 400 500 600 

Areal 

[%] = 0,202 · Areal – 0,021 

P-værdi = 0,000 

Figur 1.7: Regressionsanalyse for kuldioxid standardkurven. 

Det ses af Figur 1.7, at det er rimelig at anvende den lineære model til målingerne indenfor 

et 95 % konfidensinterval, da P-værdien er mindre end 0,05. 

Bilag 5 Side 6 af 9


1.4 Måling af nitrogen 

Til måling af nitrogen er der fremstillet en standardkurve ud fra tre kendte gasblandinger, ren 

N2, atmosfærisk luft og ren CO2. Fra GC målinger fås følgende arealer, se Tabel 1.2. 

Konc. Arealer 

% 1 2 3 snit 

Ren N2 99,996 473 489 462 475 

99,996 498 461 473 477 

Atmosfærisk luft 78,084 408 419 409 412 

78,084 400 434 400 411 

Ren CO2 0,0005 3,568 3,547 2,023 3,046 

Tabel 1.2: Målinger til standardkurve for nitrogen. 

Indtegnes dette fås følgende standardkurve, se Figur 1.8. 

Konc % 

100 

90 

80 

70 

60 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

N2 

Konc % = 0,205·Areal - 1,890 

R 2 = 0,985 

0 100 200 300 400 500 

Areal 

Figur 1.8: Standardkurve for nitrogen. 

Denne standardkurve vil blive brugt til bestemmelse af nitrogenkoncentrationen i 

udgangsgassen under fermenteringerne. 

Bilag 5 Side 7 af 9


1.4.1 Regressionsanalyse for nitrogen 

Der ses om der er statistisk grundlag for at anvende den lineære model. 

Konc Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse 

----------------------------------------------- 

0,0005 3 3,4 -7,863 14,741 

78,084 6 411,7 403,675 419,659 

99,996 6 476,0 468,008 483,992 

----------------------------------------------- 

Konc Antal Snit Homogene grupper 

----------------------------------------------- 

0,0005 3 3,4 X 

78,084 6 411,7 X 

99,996 6 476,0 X 

----------------------------------------------- 

Figur 1.9: Variansanalyse for standardkurver til nitrogenanalyse. 

Det ses af Figur 1.9, at der er signifikant forskel mellem målinger på de forskellige 

koncentrationer, hvilket der skal være for at analysemetoden kan detektere forskelle 

mellem de forskellige koncentrationer. 

Konc % 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

0 100 200 300 400 500 

Areal 

[%] = 0,205 · Areal – 1,890 

P-værdi = 0,000 

Figur 1.10: Regressionsanalyse for nitrogen standardkurven. 

Det ses af Figur 1.10, at det er rimelig at anvende en lineære model til målingerne inden 

for et 95 % konfidensinterval, da P-værdien er mindre end 0,05. 

Bilag 5 Side 8 af 9


1.5 Litteraturhenvisning 

[1] : Gas Chromatografi, 2. udgave 

Fowlis, Ian A. 

John Wiley & Sons Ltd. UK 1995 

ISBN 0-471-95468-3 

[2] : Apparatteknik – 3. udgave 

Simonsen, Flemming 

Akademisk Forlag, DK 1997 

ISBN 87-500-3503-7 

[3] : Materials Science and Engineering – An Introduction, 5. udgave 

Callister, William D. Jr. 

John Wiley & Sons Inc. 2000 

ISBN 0-471-32013-7 

[4] : Databog fysik kemi – 8. udgave 

Andersen, E. S., Jespergaard, P. og Østergaard, O. G. 

F & K forlaget, DK 1994 

ISBN 87-87229-55-2 

[5] : http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/pdf/c531.pdf (28/11-03) 

Bilag 5 Side 9 af 9

Bilag 6 

Anvendt statistik

K-PRO 7 Anvendt statistik Gruppe 2 

Anvendt statistik 

I det følgende beskrives de statistiske metoder, der er anvendt til vurdering af standardkurver 

til gaschromatografiske målinger samt tørstofmålinger. Vurderingen af standardkurver er 

foretaget ud fra en regressionsanalyse. Til tørstofmålingerne er anvendt en variansanalyse, 

hvor det undersøges, om der er signifikant forskel mellem de forskellige prøveudtagninger. 

Begge analysetyper er foretaget vha. statistikprogrammet STATGRAPHICS Plus, og ser ud 

som følgende. 

Regressionsanalyse 

For at undersøge hvor godt en tilnærmet linie beskriver en dataserie kan der foretages en 

regressionsanalyse. En sådan ser ud som følgende: 

Y 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

Forklaring til regressionsanalyse 

0 2 4 6 8 10 


X 

Y = 1,004·X + 0,067 

P-værdi: 0,000 

Figur 1: Regressionsanalyse for en tilfældig dataserie. 

Den blå linie på Figur 1, angiver den bedste linie gennem værdierne i dataserien. De orange 

linier angiver konfidensgrænserne, som beskriver sandsynligheden for at gennemsnittet for en 

fremtidig dataserie ligger inden for disse grænser. Normalt vælges konfidensniveauet til 0,95. 

Dvs. at en fremtidig måleserie med 95 % sandsynlighed ligger indenfor disse grænser. De 

violette linier angiver prædiktionsgrænserne. Normalt vælges prædiktionsniveauet til 0,95. 

Dvs. at én fremtidig værdi med 95 % sandsynlighed ligger indenfor disse grænser.


Når konfidens- og prædiktionsniveauerne er sat til 0,95; medfører dette, at der er 5 % 

sandsynlighed for at forkaste en værdi, selvom den er sand med den fundne model. 

Sandsynligheden for at forkaste en værdi, selvom den er sand, kan beskrives med en Pværdi. 

Hvis konfidens- og prædiktionsniveauer er valg til 0,95, ønskes en P-værdi < 0,05. 

Hvis dette er opfyldt, kan modellen anvendes til at beskrive værdierne i dataserien. Hvis Pværdien 

> 0,05 kan modellen ikke anvendes, da dette ikke stemmer overens med de 5 % 

sandsynlighed for at forkaste en værdi, selvom den er sand ud fra den fundne model. 

En regressionsmodel kan også beskrives med determinationskoefficienten (R 2 ), denne 

redegør for, hvor stor en del af variationen i dataene regressionsmodellen redegør for. 

Determinationskoefficienten ligger mellem 0 og 1. Er R 2 = 1 redegør regressionsmodellen for 

100 % af dataene. R 2 kan dog ikke anvendes til at sammenligne to regressionsmodeller med 

forskellige antal frihedsgrader. 

Bilag 6 Side 2 af 3


Variansanalyse 

For at undersøge om der signifikant forskel mellem to grupper af værdier, foretages en 

variansanalyse,seFigur2ogFigur3. 

Gruppe Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse 

------------------------------------------------ 

1 3 Y1 Y1 N Y1 Ø 

2 3 Y2 Y2 N Y2 Ø 

3 3 Y3 Y2 N Y2 Ø 

------------------------------------------------- 

Figur 2: Grupper, deres middelværdi samt nedre og øvre grænse. 

Gruppe Antal Snit Homogene grupper 

------------------------------------------------ 

1 3 Y1 X 

2 3 Y2 X 

3 3 Y3 X 

------------------------------------------------- 

Figur 3: Signifikant forskel. 

På Figur 2 angives først en gruppe af værdier, derefter antallet af værdier i denne gruppe 

(Antal), efterfulgt af en middelværdi (Snit). Til sidst angives en nedre og en øvre grænse for 

gruppen. Disse grænser er konfidensgrænser. 

På Figur 3 angives, om der er signifikant forskel mellem grupper af værdier. Hvis der 

eksempelvis ses på gruppe 1 og 2 i Figur 2, ses at den øvre grænse for gruppe 1 er ”Y1 Ø”og 

at den nedre grænse for gruppe 2 er ”Y2 N”. Om der er signifikant forskel mellem gruppe 1 

og 2 ses således: 

”Y1 N” < ”Y2 Ø” der er signifikantforskel mellem gruppe 1 og 2 

”Y1 N” > ”Y2 Ø” der er ikke signifikantforskel mellem gruppe 1 og 2 

I Figur 3 angives signifikant forskel ved, at X’erne under ”Homogene grupper” står forskudt 

for hinanden, som det er tilfældet mellem gruppe 1 og 2, og 1 og 3. Hvis X’erne står under 

hinanden, som det tilfældet mellem gruppe 2 og 3, er der ikke signifikant forskel. 

Bilag 6 Side 3 af 3

Bilag 7 

Måling af tilledt volumen

K-PRO 7 Måling af tilledt volumen Gruppe 2 

Måling af tilledt volumen 

Under fermenteringerne er der blevet tilledt substrat, saltsyre og ammoniakvand. Disse 

væsker er blevet tilledt fra bluecap flasker af forskellig størrelse. For at bestemme hvilket 

volumen der er blevet tilledt fra disse, er der på siden af flasken sat en lineal med millimeter 

mål, således at der på siden af flasken kunne aflæses, hvor mange mm væsken var faldet ved 

hver prøveudtagning. Dette antal mm skulle så omregnes til et volumen, hvilket er gjort på 

følgende måde: 

Eksempelvis er en 1 L flaske blevet fyldt med 5 · 200 mL vand, hvorefter der så er blevet 

aflæst, hvilken højde dette svarer til. Dette omregnes derefter til et volumen pr. millimeter. 

Måledata og beregning 

Flaskevolumen 

0,5 L 

Gennemsnit * 

1L 

Gennemsnit * 

2L 

Gennemsnit * 

Volumen 

[mL] 

Højde 

[mm] 

∆V 

[mL] 

∆H 

[mm] 

100 21 100 21 

200 41 100 20 

300 62 100 21 

400 82 100 20 

500 102 100 20 

100 20,3 

200 30 200 30 

400 59 200 29 

600 98 200 39 

800 114 200 16 

1000 144 200 30 

200 28,5 

250 22 250 22 

500 43 250 21 

750 63 250 20 

1000 83 250 20 

1250 102 250 19 

1500 122 250 20 

1750 141 250 19 

2000 164 250 23 

250 20,3 

Bilag 7 Side 1 af 2

K-PRO 7 Måling af tilledt volumen Gruppe 2 

10 L 

2000 50 2000 50 

3000 76 1000 26 

4000 103 1000 27 

5000 130 1000 27 

6000 156 1000 26 

7000 181 1000 25 

8000 207 1000 26 

9000 233 1000 26 

10000 259 1000 26 

Gennemsnit * 

1000 26,1 

* 

) Til beregningen af gennemsnittet er den første måling på hver flaske ikke medtaget. 

Herved er der taget højde for den volumenforskel, der kommer pga. at flasken har en krum 

bund. 

Nu udregnes volumen pr. millimeter 

Flaskevolumen ∆V 

∆H 

mL mm 

0,5 L 4,9 

1 L 7,0 

2 L 12,3 

10 L 38,3 

Bilag 7 Side 2 af 2

Bilag 8 

Prøveudtagning

K-PRO 7 Prøveudtagning Gruppe 2 

Prøveudtagning 

Det er blevet set på, om det kan retfærdiggøres at udtage prøver ned til hver 2. time. Dette er 

gjort ud fra udviklingen af cellemassekoncentration, for de anvendte værdier se Måledata 1 til 

6. Statistikken, der er anvendt til dette, er en variansanalyse, der er foretaget vha. programmet 

STATGRAPHICS Plus. Figurerne 1 til 6 er udarbejdet ved et konfidensinterval på 95 %. 

Fermentering 1 

Tid Antal Snit Nedre grænse Øvre grænse 

----------------------------------------------- 

1 3 1,33 1,0340 1,6260 

2 3 1,41 1,1107 1,7026 

3 3 1,55 1,2507 1,8426 

4 3 1,92 1,6240 2,2160 

5 3 1,75 1,4574 2,0493 

6 3 1,69 1,3907 1,9826 

7 3 1,55 1,2540 1,8460 

8 3 1,83 1,5307 2,1226 

9 3 2,26 1,9674 2,5593 

10 3 2,56 2,2674 2,8593 

11 3 2,98 2,6874 3,2793 

12 3 3,13 2,8374 3,4293 

13 3 3,93 3,6340 4,2260 

15 3 7,16 6,8674 7,4593 

18 3 10,67 10,3707 10,9626 

21,5 3 17,59 17,2907 17,8826 

24,5 3 22,75 22,4574 23,0493 

26,5 3 24,62 24,3207 24,9126 

41,5 3 28,32 28,0240 28,6160 

----------------------------------------------- 


Figur 1: Variansanalyse for prøveudtagningen under f1. 


----------------------------------------------- 

6 3 1,24 1,1160 1,3700 

8 3 3,00 2,8727 3,1273 

10 3 5,46 5,3293 5,5840 

12 3 7,00 6,8693 7,1240 

14 3 7,44 7,3127 7,5673 

16 3 7,85 7,7227 7,9773 

18 3 8,58 8,4560 8,7106 

20 3 9,95 9,8227 10,0773 

22 3 11,76 11,6360 11,8907 

24 3 13,98 13,8493 14,1040 

26 3 16,24 16,1093 16,3640 

28 3 18,33 18,2027 18,4573 

30 3 20,21 20,0793 20,3340 

32 3 21,71 21,5827 21,8373 

34 3 22,92 22,7960 23,0507 

----------------------------------------------- 


Tid Antal Snit Homogene grupper 

----------------------------------------------- 

1 3 1,33 X 

2 3 1,41 X 

3 3 1,55 X 

7 3 1,92 X 

6 3 1,75 XX 

5 3 1,69 XX 

8 3 1,55 XX 

4 3 1,83 XX 

9 3 2,26 XX 

10 3 2,56 XX 

11 3 2,98 X 

12 3 3,13 X 

13 3 3,93 X 

15 3 7,16 X 

18 3 10,67 X 

21,5 3 17,59 X 

24,5 3 22,75 X 

26,5 3 24,62 X 

41,5 3 28,32 X 

----------------------------------------------- 

Tid Antal Snit Homogene Grupper 

----------------------------------------------- 

6 3 1,24 X 

8 3 3,00 X 

10 3 5,46 X 

12 3 7,00 X 

14 3 7,44 X 

16 3 7,85 X 

18 3 8,58 X 

20 3 9,95 X 

22 3 11,76 X 

24 3 13,98 X 

26 3 16,26 X 

28 3 18,33 X 

30 3 20,21 X 

32 3 21,71 X 

34 3 22,92 X 

----------------------------------------------- 

Bilag 8 Side 1 af 3




----------------------------------------------- 

6 3 0,84 0,7564 0,9236 

10 3 0,80 0,7131 0,8803 

14 3 1,18 1,0964 1,2636 

18 3 1,48 1,3931 1,5603 

22 3 2,45 2,3697 2,5370 

26 3 4,12 4,0331 4,2003 

30 3 7,27 7,1831 7,3503 

34 3 12,53 12,4464 12,6136 

----------------------------------------------- 




----------------------------------------------- 

7,5 3 0,42 0,3388 0,5079 

9,5 3 0,37 0,2855 0,4545 

12,5 3 0,70 0,6155 0,7845 

14,5 3 1,04 0,9555 1,1245 

18 3 2,09 2,0088 2,1779 

20 3 3,34 3,2555 3,4245 

24 3 7,16 7,0788 7,2479 

26 3 10,14 10,0555 10,2245 

32,25 3 25,68 25,5955 25,7645 

34 3 28,04 27,9588 28,1279 

----------------------------------------------- 




----------------------------------------------- 

9 3 1,38 1,1836 1,5697 

11 3 2,20 2,0069 2,3931 

13 3 3,59 3,3969 3,7831 

15 3 4,44 4,2436 4,6297 

17 3 6,04 5,8503 6,2364 

19 3 8,82 8,6269 9,0131 

21 3 12,65 12,4536 12,8397 

23 3 17,11 16,9169 17,3031 

26 3 22,15 21,9536 22,3397 

29 3 31,82 31,6303 32,0164 

32 3 40,49 40,2969 40,6831 

34 3 44,66 44,4669 44,8531 

----------------------------------------------- 



----------------------------------------------- 

6 3 0,84 X 

10 3 0,80 X 

14 3 1,18 X 

18 3 1,48 X 

22 3 2,45 X 

26 3 4,12 X 

30 3 7,27 X 

34 3 12,53 X 

----------------------------------------------- 


----------------------------------------------- 

7,5 3 0,42 X 

9,5 3 0,37 X 

12,5 3 0,70 X 

14,5 3 1,04 X 

18 3 2,09 X 

20 3 3,34 X 

24 3 7,16 X 

26 3 10,14 X 

32,25 3 25,68 X 

34 3 28,04 X 

----------------------------------------------- 


----------------------------------------------- 

9 3 1,38 X 

11 3 2,20 X 

13 3 3,59 X 

15 3 4,44 X 

17 3 6,04 X 

19 3 8,82 X 

21 3 12,65 X 

23 3 17,11 X 

26 3 22,15 X 

29 3 31,82 X 

32 3 40,49 X 

34 3 44,66 X 

----------------------------------------------- 

Bilag 8 Side 2 af 3




----------------------------------------------- 

10 3 0,62 0,5396 0,7071 

13 3 0,65 0,5696 0,7371 

15 3 0,62 0,5362 0,7038 

17 3 0,60 0,5129 0,6804 

19 3 0,66 0,5762 0,7438 

21 3 0,88 0,7996 0,9671 

23 3 0,92 0,8329 1,0004 

----------------------------------------------- 



----------------------------------------------- 

10 3 0,62 X 

13 3 0,65 X 

15 3 0,62 X 

17 3 0,60 X 

19 3 0,66 X 

21 3 0,88 X 

23 3 0,92 X 

----------------------------------------------- 

Det ses af Figur 1, at der fra fermenteringens start udtages prøver med en times interval. Der 

er ikke fundet signifikant forskel mellem disse prøver, hvorfor det besluttes fremover at 

udtage den første efter ca. 10 timers fermentering. Herefter udtages der kun prøver i 

intervaller ned til hver 2. time. 

Af Figur 2 ses tydeligt en forskel på tørstofindholdet i prøver udtaget ved forskellige tider. 

Derfor kan det retfærdiggøres, at der udtages prøver ned til hver 2. time. 

Det ses af Figur 3 og 4, at de to første prøveudtagninger ikke er signifikant forskellige, 

herefter ses den samme tydelige forskel som ved f2. Grunden til at der ikke er signifikant 

forskel mellem de to første prøveudtagninger ved f3 og f4 er, at gæren ikke er påbegyndt den 

eksponentielle vækst. 

Ved f5 er den første prøve udtaget efter 9 timer, se Figur 5, grundet at der ikke var 

signifikant forskel på tidligere prøveudtagninger ved f3 og f4. Derudover ses det af Figur 5, at 

der herefter tydeligvis er en forskel på tørstofindholdet i prøver udtaget ved forskellige tider. 

Det ses tydeligt af Figur 6, at der ikke er signifikant udvikling i tørstofindholdet før efter 

21 timer, hvilket indikerer en forlænget nølefase. 

Bilag 8 Side 3 af 3

Afgangsprojekt - Diplomingeniør i Kemiteknik [999 KB] - sotoft.dk

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?