Sund stivelse og vegetabilsk vingummi - Inspirationsdag ...

More documents

Recommendations

Info

4 planteforskning.dk Sundhed og miljø Faktaboks 2. Identifikation og karakterisering af et planteenzym til modifikation af stivelse En type planteenzymer ved navn glukan vand dikinase (på engelsk glucan, water dikinase, GWD), som kan fosforylere stivelse i planter, er nu blevet identificeret. Vi har sammenlignet et GWD-enzym fra kartoffel og tre forskellige varianter af GWD fra modelplanten Arabidopsis thaliana (gåsemad). GWD-enzymerne består af to underenheder (subunits) og indeholder bl.a. et domæne, som binder til stivelse. Vi har karakteriseret GWD enzymet AtGWD3 fra Arabidopsis i detaljer. CBM20, et stivelsesbindende domæne GWD enzymets binding til stivelse er vigtig for funktionen, fordi de reaktioner, som foretages, sker netop på stivelseskornet. Derfor har enzymet et domæne, som får enzymet til at binde til stivelsen. På baggrund af DNA-sekvensen, som koder for det stivelsesbindende domæne i AtGWD3 fra Arabidopsis, regnes dette domæne for at høre til en særlig type (en familie) af stivelsebindende domæner, som kaldes CBM20 (på engelsk Carbohydrate Binding Module 20). Stivelsesbindende domæner af denne type findes i mange mikrobiologiske enzymer, som nedbryder stivelse, men det er første gang, at et CBM20 domæne er fundet i planter. De mikrobielle CBM20 findes i enzymer, som udskilles fra bakterien for at nedbryde stivelse i miljøet og derved danne sukker, som bakterien bruger som energikilde. Transport til cellens grønkorn GWD enzymet fra kartoffel og to af de tre GWD enzymer fra Arabidopsis har en kort aminosyresekvens, et transitpeptid, som får proteinet til at vandre til cellens kloroplaster, hvor de sukkermolekyler, som dannes ved fotosyntesen omdannes til stivelse. For at verificere at transitpeptidet får enzymet til at vandre ind i kloroplasterne, fremstillede vi en variant af enzymet med en fluorescerence del (YFP), som er en variant af green fluorescent protein (GFP). Dette protein kunne tydeligt lokaliseres i plantecellens kloroplaster, og samtidig kunne det bekræftes at enzymets bindes til overfladen af stivelseskornene. Til venstre ses fluorescens fra klorofyl i grønkornene, i midten fluorescens fra YFP, som via det stivelsesbindende domæne fra AtGWD3 er bundet til stivelseskornene. Til højre ses fluorescens fra både klorofyl og YFP. Bar = 10 μmeter. CBM20 fra Arabidopsis udtrykt i bakterie Vi udtrykte den DNA-sekvens, der koder for CBM20 domænet fra AtGWD3, i bakterien Escherichia coli. Det gjorde det muligt at sammenligne CBM20 domænet fra planten med de kendte CBM20 domæner fra mikroorganismer. De mikrobielle CBM20 domæner er karakteriseret ved, at de bindes meget hårdt til stivelse. Karakterisering af det tilsvarende CBM20 domæne fra AtGWD3 viser, at CBM20 fra planten har en meget svagere binding til stivelse end de tilsvarende mikrobielle CBM20 domæner. Enzymer med lav affinitet for substratet er mere dynamiske end enzymer, som har domæner med høj affinitet for et specifikt bindingssted. De kan nemmere flytte rundt i cellen og binde til forskellige steder, hvor der er behov for reaktioner. Udformningen af CBM20 domænet i plantens enzym har derfor stor biologisk betydning. En computermodel af CBM20 Med molekylemodellering i computeren har vi fundet en strukturel forskel mellem CBM20 domænet fra Arabidopsis og CBM20 domænerne fra mikroorganismer. Domænet har to bindingssites og i det ene site, site 2, mangler dele af et loop. Vi er nu ved at undersøge, om det er denne forskel, som er årsagen til, at CBM20 domænet fra planter har en lavere affinitet for stivelse. Vi vil også undersøge om CBM20 domænerne i planternes enzymer kan bruges til at forbedre de mikrobielle enzymer, som bruges i industrien. For eksempel til fremstilling af bioethanol er der behov for enzymer med forskellig affinitet til forskellige stivelser, så stivelsen kan nedbrydes hurtigt og effektivet. Molekylemodeller af CBM20 domænet fra enzymet glukoamylase i svampen Aspergillus niger (blå) og CBM20 domænet fra GWD3 i fra Arabidopsis thaliana (grøn). Modellerne er lavet med NMR (nuclear magnetic resonance). Strukturerne er meget ens, men i det øvre venstre hjørn (Y556 og W 115) mangler en del af et loop. Denne forskel er muligvis årsag til at CBM20 fra planten har lavere affinitet for stivelse end CBM20 fra mikroorganismer. Illustrationer i denne faktabboks er fra Christiansen C, Abou Hachem M, Glaring MA, Viksø-Nielsen A, Sigurskjold BW, Svensson B, Blennow A (2009). A CBM20 low-affinity starch-binding domain from glucan, water dikinase. FEBS Letters 583:1159-1163. december 2009
ændre på disse enzymers aktivitet i planterne, kan man få planterne til at producere stivelse med nye egenskaber. Enzymerne SS1-SS4 er stivelsessyntaser som forlænger stivelseskæderne i amylopektin. Når disse gener nedreguleres ændres forholdet mellem amylose og amylopektin, så der dannes relativt mere amylopektin. F.eks. er det vist. at en knockout mutant i byg resulterer i amylopektin med kortere kæder og mere amylose. GBSS (Granule Bound Starch Synthase) er også en stivelsessyntase, men dette enzym danner udelukkende amylose (som ikke er forgrenet). GBSS bindes til stivelseskorn. Hvis genet, der koder for GBSS inaktiveres, dannes der amylopektin, men ingen amylose. Der findes naturligt opståede eller inducerede mutationer i GBSSgenerne hos mange afgrødearter, f.eks. ris, majs, hvede og byg. Når stivelsen kun består af amylopektin, bliver den mere klæbrig ved kogning, end når stivelsen er en blanding af amylose og amylopektin. Korntyper med denne mutation betegnes”Waxy” fordi kernens frøhvide ligner voks. For polyploide arter som hvede (hexaploid) og kartoffel (tetraploid) skal alle kopier af genet inaktiveres for at få fuld effekt. Det er vanskeligt at opnå ved mutation, så i stedet kan man nedregulere alle de homologe gener på samme tid ved at indsætte en kopi af et GBSS-gen i omvendt orientering (antisense). På LIFE har vi lavet en GBSSantisense kartoffel, som næsten kun danner amylopektin. Denne egenskab er meget attraktiv for industrien, og en amylopektin-kartoffel, som er udviklet af BASF, er nu på vej mod markedsføring. SBE1 og SBE2 (Starch Branching Enzyme) er forgreningsenzymer, som laver forgreningspunkter i amylopektin. Hvis disse gener nedreguleres, dannes amylopektin med lange kæder. Danisco Biotechnology lavede en kombineret SBE1/SBE2-antisense-kartoffel for år tilbage, men pga. den generelle modvilje mod brug af genetisk modificerede planter i Europa, opgav de projektet. Vi bruger nu denne kartoffel i forskningen. BASF har siden lavet en tilsvarende kartoffel. Isa1 og Isa3 er isoamylaser, som kløver fejlagtigt placerede forgreningspunkter i stivelseskornet. Mutationer i disse gener i majs medfører, at der ophobes mere sukrose i kernerne end normalt. Supersøde hybridmajs, som er homozygotiske med hensyn til de muterede Isa-gener, har været på markedet i en del år. Mutationerne er formentligt induceret med enten kemikalier eller bestråling, men da disse metoder regnes som konventionelle forædlingsmetoder, er forædlingsfirmaerne ikke forpligtet til at oplyse, hvordan de supersøde majssorter er lavet. GWD1-GWD3 er tre glukan, vand dikinaser, som fosforylerer stivelsen. Vi har påvist, at dette enzym er tæt bundet til stivelsen ved hjælp af et særligt domæne (Faktaboks 2). Ved antisense-nedregulering af GWD1, er der meget lidt fosfat i stivelsen. Ved at indsætte en ekstra kopi af det gen, som koder for GWD1 i kartoffel, har vi påvist, at det er muligt at ved at få kartoffelplanter til at 5 planteforskning.dk Sundhed og miljø lave en hyperfosforyleret stivelse, der egner sig til at lave bioplastik. Fremtidig forskning Mange af de enzymer, der er involveret i biosyntesen af amylose og amylopektin i planer er nu identificeret og karakteriseret, men vi ved stadigvæk ikke, hvordan selve stivelseskornet dannes i planten. Vi kan se at et stivelseskorn har et specifikt udgangspunkt, hvorfra der dannes koncentriske ringe, men ingen har hidtil kunnet lave stivelseskorn i et reagensglas. Et af vores mål er at finde ud af, hvordan stivelsesmolekylerne organiserer sig selv under dannelsen af et stivelseskorn. For at komme videre med forskningen, er det vigtigt, at der laves indsatser på tværs af videnskabelige discipliner, og at forskere med ekspertiser indenfor bioteknologi, fysik og kemi samarbejder. Stivelse laves i planten for at forsyne denne med langtidsenergi. Vi bruger også primært stivelse som energi i form af fødevarer, men sundhedsfremmende fødevareingredienser vinder også indpas. I fremtiden ventes stivelse at blive en endnu vigtigere råvare i industrien end i dag. Stivelse kan produceres i meget store mængder, og det bør i langt højere grad end nu anvendes til intelligent og bæredygtig produktion af materialer, der i dag fremstilles af fossil olie. Med peak oil i sigte og et mål om at reducere udslippet af drivhusgasser vil der være et enormt behov for velstrukturerede materialer i store mængder. Til det formål vil stivelse være en meget værdifuld råvare. Vores forskning i stivelse kan også anvendes til formål, som ikke har ret meget med selve stivelsen at gøre. De stivelsesbindende domæner, som findes i nogle planteenzymer (Faktaboks 2) kan bruges, når man ønsker at bruge planter som produktionsorganisme for bestemte proteiner, f.eks. til medicinske formål. Ved hjælp af et et transitpeptid kan proteinet transporteres ind til amyloplasten, og ved hjælp af et stivelsesbindende domæne kan proteinet lokaliseres til stivelseskornene. Oprensning af proteinet vil dermed være nemmere, end hvis det findes sammen med plantens egne proteiner, da det er meget nemt at oprense stivelseskorn. Om forfatterne Inga C. Bach er hortonom fra Det Biovidenskabelige Fakultet, Københavns Universitet (KU-LIFE, Tidl. Den Kgl. Veterinær og Landbohøjskole) og ph.d. i planteforædling og bioteknologi. Hun er skrivende redaktør på Planteforskning. dk og er desuden ansat som kommunikationsmedarbejder ved Institut for Plantebiologi og Bioteknologi, KU-LIFE. Andreas Blennow er master i bioteknologi fra Lunds Universitet og har en ph.d.-grad i biokemi fra samme sted. Han er lektor ved Institut for Plantebiologi og Bioteknologi, KU-LIFE. Andreas Blennow har forsket i stivelse siden sit ph.d.-studium, og er specialist indenfor stivelsemetabolisme og stivelsens struktur og funktion i fødevarer og materialer. december 2009
Page 1 and 2: Sund stivelse, vegetabilsk vingummi
Page 3: har således en effekt svarende til
Page 7: 7 planteforskning.dk Sundhed og mil

Sund stivelse og vegetabilsk vingummi - Inspirationsdag ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?