El cultivo de protoplastos en cítricos y su

Actualizaci6n
Agronomia Costarricense 20(2): 187-204. 1996
EL CULTIVO DE PROTOPLASTOS EN CITRICOS YSU POTENCIAL
PARA EL MEJORAMIENTO GENETICO1
ABSTRACT
Protoplast culture in citrus and its potential for genetic improvement.
Techniques that involve isolation, culture and regeneration of citrus protoplasts
for genetic improvement are reviewed. The species and cultivars from which
viable protoplasts were obtained are listed. Also, plants regenerated through fusion
experiments, cybrid formation and genetic transformation of protoplasts
are described. Potential uses of these techniques and their applications are discussed,
emphasizing protoplast fusion, which has evolved to a higher degree.
VIctor M. Jimenez *
INTRODUCCI6N La diversidad genetica que existe entre las
especies de Citrus y los generos emparentados es
Los cftricos constituyen el principal produc- muy grande y ha sido poco estudiada. En el Cuato
frutfcola en el comercio mundial. A pesar de su dro 1 se observa que la Subtribu Citrinae (Subtrialta
capacidad para hibridarse en forma interespe- bu 2 de la Tribu Citreae, Subfamilia Aurantiodiae,
cffica e incluso intergenerica, la aplicacion efecti- Familia Rutaceae) a la cual pertenece Citrus, ha
va de programas de mejoramiento genetico tradi- sido dividida en tres grupos subtribales, que concional
se ha visto limitada por una serie de facto- tienen en total 28 generos y 125 especies (Swingle
res biologicos propios del grupo, dentro de los y Reece, 1967).
cuales se incluyen una biologfa reproductiva muy En el presente trabajo se hace una descripcompleja
y perfodos de juvenilidad prolongados cion actualizada sobre el uso del cultivo de proto-
(Grosser y Gmitter, 1990a; Grosser, 1992). Algu- plastos como metodo para el mejoramiento genetinas
de estas limitantes pueden obviarse en gran co de cftricos, con enfasis en la fusion de protomedida
mediante la utilizacion de tecnicas biotec- plastos, que es la metodologfa que ha tenido manologicas,
que involucran entre otras: el cultivo in
vitro, el aislamiento, cultivo, regeneracion, fusion
y transformacion de protoplastos, y la formacion
yor desarrollo.
de cfbridos. Estas tecnicas permiten la incorpora- AISLAMffiNTO DE PROTOPLASTOS
cion de caracterfsticas geneticas que son de gran
utilidad para conferir resistencia 0 tolerancia con-
Y REGENERACI6N DE PLANTAS
tra enfermedades, plagas y condiciones adversas La manipulacion de protoplastos y la rege-
(edaficas, climaticas, etc.), que afectan el rendi- neracion de plantas a partir de ellos es una herramiento,
asf como para mejorar la calidad del fruto. mienta innovadora en programas de mejoramiento
genetico. Estos protoplastos provienen de celulas
II
*
Recibido para publicaci6n ell de diciembre de 1995.
Cen~ro para Investig.aciones en Granos y ~emillas, Universldad
de Costa RIca, San Jose, Costa RIca.
alas cuales se les ha eliminado la pared celular, ya
sea por medios mecanicos 0 mediante digestion
enzimatica. La unica barrera entonces entre el pro

188 AGRONOMIA COST ARRlCENSE
Cuadro I. Generos pertenecientes a la familia Rutaceae y la subfarnilia Aqrantiodeae (Swingle y Reece, 1967). Entre parentesis se
indica el nurnero de especies en el genero; y en negrita, aquellos en los que se ha tenido cierto exito al hibridarlos somaticarnente
con Citrus (modificado de Grosser y Grnitter, 199Oc).
TRIBU I. Clauseneae
Subtribu I. Micromelinae Micromelum (9)
Subtribu 2. Clauseninae Glycosmis (35) Murraya (11) Clausena (23)
Subtribu 3. Merrillinae Merrillia
TRIBU II. Citreae
Subtribu I. Triphasiinae Wenzelia (9) Triphasia (3) Monanthocitrus Pamburus
Oxanthera (4) Luvunga (12) Merope Paramignya (15)
Subtribu 2. Citrinae Severinia (6) Fortunella (4) Pleiospennium (5) Eremocitrus
Burkillanthils Poncirus (2) Limnocitrus Clymenia
Hesperathusa
Atalantia (II)
Microcitrus (6)* Citropsis (11) Citrus (16)
Subtribu 3. Balsarnocitrinae Swinglea Balsamocitrus Aegle Feronia
* Utilizado para la fonnaci6n de hfbridos.
Afraegle (4) Feroniella (3) Aeglopsis
toplasl,na celular y el medio externo es la membra- elevadas de variacion somaclonal en varios cultina
plasmatica (Bengochea y Dodds, 1986). vos, en cftricos los embriones obtenidos conservan
Los protoplastos de cftricos pueden aislarse la identidad genetica con la planta madre y exprede
varios tejidos, incluyendo hojas, callos no em- san poca variabilidad. Los mejores resultados para
briogenicos, tetradas florales (protoplastos haploi- el aislamiento de protoplastos se ban obtenido utilides),
callos embriogenicos y cultivos embriogeni- zando tejido friable con bajo contenido de aImidon.
cos en suspension, (Grosser y Chandler, 1987; Los cultivos embriogenicos en cftricos generaImen-
Grosser y Gmitter, 1990a), siendo los dos ultimos te requieren de subcultivos continuos, a intervalos
las fuentes mas apropiadas para obtener protoplas- de 1-2 meses, por largos perfodos de tiempo (genetos
con capacidad embriogenica. ralmente mayores de un afio), antes de que alcancen
un grado de friabilidad adecuado, asf como ni-
Aislamiento de protoplastos a partir de callo veles apropiados de aImidon (Grosser, 1 994b).
Kochba et al. (1972) obtuvieron callos em-
Se puede aislar protoplastos directamente de briogenicos de C. sinensis cv. 'Shamouti' a partir
callos embriogenicos friables, derivados de nuce- del tejido nucelar de 6vulos de frutos inmaduros
las u 6vulos mantenidos en un medio de cultivo cultivados in vitro. La metodologfa descrita por
desprovisto de reguladores de crecimiento, y de ellos, asf como modificaciones posteriores ban
callos friables no embriogenicos, obtenidos a par- permitido incrementar el numero de lfneas nucelatir
de 6rganos de plantulas en medios con altos ni- res de callo friable capaces de producir suspensioveles
de auxina (Grosser et al., 1988b). A partir de nes celulares y protoplastos capaces de regenerar
los primeros es posible obtener protoplastos em- plantas. El Cuadro 2 presenta una lista de las espebriogenicos
con capacidad de regenerar plantas cies y cultivares de cftricos en los cuales se ha innormales.
Sin embargo, ha sido muy diffcil iniciar formado la obtenci6n de callo friable.
y mantener estas lfneas de callo, 10 que ha consti- El primer aislamiento de protoplastos totituido
la etapa limitante para la aplicacion en gran potentes en cftricos rue realizado por Vardi et al.
escala, de metodologfas que involucren el cultivo (1975), utilizando como explante el caIlo embriode
protoplastos (Grosser y Gmitter, 199Oc). Si bien genico de naranja dulce (C. sinensis) cv. 'Shamoula
utilizaci6n de caIlo se ha relacionado con tasas ii' obtenido por Kochba et al. (1972). El cultivo de

JIMENEZ: EI cultivo de protopla...tos en citricos y su potencial para el mejoramiento genetico 189
Cuadro 2. Generos, especies y cultivares de citricos de los cuales se ha obtenido callo friable embriogenico a partir de 6vulos cultivados
in vitro.
E...pecie Cultivar Referencia...
C. aurantif()/ia -- Mitra y Chatuverdi (1972; citados por Button et al., ]974), Hidaka y Omura (1989),
Swing. Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994), Grosser (comunicaci6n
personal)
C. aurantium L. - Vardi etal. (1982b), Galianaetal. (1993),Jimenez y Guevara (1995)
hfbrido Grosser (comunicaci6n personal)
C. delicio.~a Ten. - Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994)
C.jambhiri Lush. 'Milam' Grosser (comunicaci6n personal)
'Volkameriana' Ben-Hayyim y Neumann (1983)
C. limon (L.) 'Femminello Geraci y Tusa (1988), Gentile et al. (1993)
Burm. Conti nella'
'Villafranca' Kochba (no publicado, citado por Vardi et al., 1982b);
Nadel y Spiegel-Roy (1987)
C.meyeriY.Tan. 'Meyer' Singhetal.(1992)
C. maduren.~i.~ Lour. -- Ling et al. (1989)
C. miti.~ B]anco -'-""'-'- Sim et al. (1988)
C.paradi.~i Macf. 'Duncan' Vardi etal. (1982b)
'Marsh Seedless' Hidaka y Omura (1989)
'Thompson Pink' Grosser (comunicaci6n personal)
C. reticulata 'Cleopatra' Galiana et al. (]993), Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994),
Blanco Gros ser (comunicaci6n personal)
'Dancy' Vardi et al. (]982b)
'Murcott' Vardietal.(1982b)
'Ponkan' Vardietal.(1982b)
C. .~inen.~i.~ Osb. 'Acosta 6' Jimenez y Guevara (1995)
'Bahia'
'Hamlin'
Kobayashi etal. (1984)
Gmitter y Moore (1986), Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994),
Niedz (1994)
'Navelina ISA 315' Starrantino (no publicado, citado por Lucretti et al., 1990)
'Pineapple' Galiana et al. (1993)
'Salustiana'
'Shamouti'
Galianaetal (1993)
Kochbaetal. (1972), Vardi etal. (1982b),
Ollitrault et al. (1992; citados por Engelmann et al., 1994)
'Shamouti Landau' Vardi etal. (1982b)
'Succari' Grosser (comunicaci6n personal)
'Tarocco' Gentileetal.(]993)
'Trovita' Kobayashietal.(1984)
'Ukumori'
'Valencia'
Hidaka y Omura (1989)
Hidaka y Omura (1989), Pasqual y Ando (1990), Grosser (~omunicaci6n personal)
'Washington Navel' Button y Rijkenberg (1977), Kobayashi y Ohgawara (1988),
Jimenez y Guevara (1995)
C. .~udachi Hort. - Kobayashi etal. (1984)
C. tankan -- Hidaka y Omura (1989)
C. un.~hiu Marc. 'Ishizuka-wa...e' Ling et al. (1990)
'Kanazawa-wa...e' Ling et al. (1990)
'Miyagawa-wa...e' Kunitakeetal.(1991)
'Miyamoto-wa...e' Hidaka y Omura (1989)
'Ohura-wase' Hidaka y Omura (1989)
'Okitsu-wase' Kunitakeetal. 1991
continua...

190 AGRONOMIA COSTARRICENSE
Cuadro 2. (Continuaci6n)
R.,pecie Cultivar Referencia..,
'Saruwatari' Hidaka y Omura (1989)
'Sugiyama' Hidakay Omura (1989)
'Tokumori-wase' Kunitake et al. (1991)
Microcitrussp. ~ Vardietal.(1986)
C. reticulata x C 'Nova' Grosser (comunicaci6n personal)
paradi.\'i (Tangelo)
'Page' Grosser (comunicaci6n personal)
C. .\'inen.\'i.\' xC.
reticulata
(Tangor)
'Murcott' Grosser (comunicaci6n personal)
estos protoplastos condujo a la forrnacion de callo Hidaka y Omura, 1989).
y la posterior obtenci6n de embriones somaticos. EI aislamiento y regeneracion de protoplas-
Vardi (1981) y Vardi et al. (1982b) obtuvie- tos obtenidos a partir de callos de origen no nuce-
Ton protoplastos de los cultivaTes de naranja dulce Jar se limita a 10 logrado pOT Hidaka y Kajiura
'Shamouti Nucelar' y 'Shamouti Landau'; de las (1988), quienes obtuvieron callos con capacidad
mandarinas (C. reticutata) 'Murcott', 'Dancy' y embriogenica de la regi6n hipocotilar de embrio-
'Ponkan'; de grapefruit (C. paradisi) 'Duncan'; de nes de C. sinensis cv. 'Washington Navel', C.
naranja agria (C. aurantium); y de limon 'Villa- yuko y C. reticutata cv. 'Ponkan'. Tambien Ling
franca' (C. timan). A partir de los protoplastos ob- et at. (1989) regeneraron plantas de C. madurensis
tenidos lograron regenerar plantulas con caracte- Lour. a partir de protoplastos obtenidos de callo derirfsticas
morfol6gicas norrnales. vado de la regi6n del hipocotilo de plantulas diferen-
Kobayashi et at. (1983) aislaron de manera
similar protoplastos de callos nucelares de naranja
ciadas POT cultivo de anteras.
dulce cv. 'Trovita'. Posteriorrnente, Kobayashi et Aislamiento de protoplastos a partir
at. (1985) cultivaron en medio Ifquido los mismos
callos anteriores, y aislaron pOT primera vez proto-
de suspensiones celulares
plastos a partir de suspensiones celulares. A partir de callos friables embriogenicos se
Vardi et at. (1986) obtuvieron plantas a par- puede iniciar facilmente el cultivo de suspensiotiT
de protoplastos del genero Microcitrus. Esta nes celulares, ya que la composici6n misma del
rue la primera vez que se logr6 todo el proceso de callo perrnite que el tejido se disgregue facilmente
regeneracion a partir de protoplastos hasta la for- en medio Ifquido en agitacion. Esto se ve favorecimaci6n
de plantulas para una variedad monoem- do si se cultivan los callos en medio de cultivo
brionica, y dentro de las Rutaceas, de un genero desprovisto de reguladores de crecimiento pOT
diferente de Citrus. tiempo prolongado, ya que en los mismos se da un
Kobayashi (1987) encontro, al observar 25 proceso de habituacion 0 independencia de la adiplantas
regeneradas a partir de protoplastos de na- ci6n extema de reguladores de crecimiento (Kochranja
dulce, que caracteres como morfologfa foliar ba y Spiegel-Roy, 1973).
y floral, aceites de la hoja, patrones de isoenzimas Se ha obtenido mayor cantidad de protoplasy
numero de cromosomas, no variaban entre los tos intactos a partir de suspensiones celulares que
individuos. Observo ademas, uniforrnidad al com- de callos cultivados en medio solido (Kobayashi
parar estos resultados con los obtenidos de plantu- et at., 1985; Citrus Research and Education Cenlas
de origen nucelar. Este y otros estudios eviden- ter, Universidad de Florida, Grosser, 1994, (comucian
que las plantas de Citrus derivadas de proto- nicaci6n personal,), pOT 10 curil a veces se han preplastos
presentan poca 0 ninguna variacion soma- ferido las primeras como material de origen (Sim
clonal (Kobayashi, 1987; Vardi y Galun, 1988; et at., 1988; Kunitake et at., 1991; Niedz, 1993).
.

JIMENEZ: EI cultivo de protopla.~tos en cftricos y su potencial para el mejoramiento genetico 191
Aislamiento de protoplastos a partir de hojas
La mejor fuente de material foliar para aislar
Aislamiento de protoplastos a partir
de yemas florales
protoplastos ha sido a partir de las plantulas nucela- Se ha logrado aislar protoplastos haploides
res desarrolladas in vitro, ya que se elimina lanecesi- de las tetradas que se encuentran en las yemas flodad
de un proceso de desinfeccion antes del aisla- rales de grapefruit (C. paradisi) y 'pamela' (C.
miento. Tambien se puede utilizar hojas de plantulas grandis), ya que sus yemas son de mayor tamafio y
en camaras de crecimiento, invemadero 0 en el cam- faciles de desinfectar (Grosser y Gmitter, 1990a).
po, pero es necesario efectuar una desinfeccion previa.
Estos protoplastos pueden contener en algunos Regeneracion de plantas a partir de
casas metabolitos secundarios que pueden interferir protoplastos
con el cultivo eficiente de los mismos y de los hl'bridos
somaticos en eventos de fusion. A diferencia de Se ha logrado la regeneracion de plantas par
los protoplastos obtenidos de calla friable y suspen- medio de embriogenesis somatica a partir de prosiones
celulares embriogenicos, los protoplastos de toplastos en varios genotipos de Citrus (Cuadro
hoja no son capaces de regenerar en media de culti- 3). La naranja dulce es la especie en la cual se ha
vo desprovisto de reguladores de crecimiento. observado mejor respuesta.
Cuadro 3. Generos, especies y cultivares de cftricos de los cuales se han regenerado plantula.~ a partir de protopla.~tos embriogenicos.
E.~pecie Cultivar Referencia.~
C. aurantium L. - Vardi etai. (1982b), Hidaka y Omura (1989)
C. jambhiri Lush. -- Vardi et at. (1990), Li (1991, cita

192 AGRONOMIA COSTARRICENSE
Los protoplastos pueden cultivarse inicialmente
en media de cultivo lfquido, 0 en medio so-
Fusion de protoplastos en citricos
lidificado con agarosa de bajo punto de fusion. Es A traves de la hibridacion somatica (fusion
recomendable colocarlos a una densidad de culti- de protoplastos) en cftricos se obvian una serie de
vo de aproximadamente 105 protoplastos/ml de problemas de la hibridacion sexual. Este es un
media (Grosser y Gmitter, 1990a), pero para obte- proceso aditivo, que la mayorfa de las veces resulneT
divisiones celulares a densidades menores ta en la formacion de alotetraploides, en los cuales
(103-102 protoplastos/ml), los protoplastos pue- se combinan los genomas nucleaTes completos de
den seT cultivados sabre una capa de protoplastos ambos padres (Grosser y Gmitter, 1990b). La hecuya
division fue detenida 0 disminuida mediante terocigosidad potencial de los hfbridos somaticos
irradiacion con rayos X 0 gamma (Vardi y Raveh, es grande, dependiendo de las diferencias alelicas
1976). acumulativas entre los padres. Y, en contraste con
El tiempo requerido para que los protoplas- la hibridacion sexual, donde la herencia del genotos
en cultivo formen calla depende de factores ma citoplasmatico (cloroplastos y mitocondrias)
como la fuente de protoplastos y la densidad de es predominantemente materna, el hfbrido somatiplateo
(Vardi y Galun, 1988). Generalmente se co recibe contribuciones citoplasmaticas de ambos
observan las primeras divisiones celulares a los progenitores (Grosser y Gmitter, 199Oc; Ohgawara
10-14 dfas, y la formacion de embriones somati- y Kobayashi, 1991). Cierta variabilidad genetic a
cas en forma espontanea alas 6-16 semanas adicional puede resultar de la recombinacion gene-
(Grosser y Gmitter, 1990a; Vardi y Galun, 1988). tica nuclear y citoplasmatica 0 de variacion somaclonal
(Grosser y Gmitter, 1990 b y c).
FUSI6N DE PROTOPLASTOS El primer ejemplo de hibridacion somatica
en Citrus fue descrito par Ohgawara et at. (1985).
La ausencia de la pared celular permite que Este hfbrido somatico intergenerico entre especies
cuando 2 0 mas protoplastos entran en contacto sexualmente compatibles, fue producto de la fufntimo
bajo ciertas condiciones, se adhierm1 entre sian, utilizando PEG, de protoplastos de hoja de
sf, y bajo un estfmulo apropiado puede provocar Poncirus trifoliata, con protoplastos obtenidos de
que ambas celulas se fusionen en una sola unidad. calla embriogenico de C. sinensis cv. 'Trovita'. El
Si bien eventos de fusi6n pueden ocurrir en forma primer hfbrido interespecffico fue producido entre
espontanea en una suspensi6n de protoplastos, la C. sinensis 'Washington' y C. unshiu 'Hayashi'
tasa a la cual ocurre es extremadamente baja, y en (mandarina Satsuma); esta fue una combinaci6n
consecuencia de poca aplicaci6n practica. Se han importante para el mejoramiento de injertos, en
desarrollado varios metodos para aumentar la efi- los cuales el progreso mediante el mejoramiento
ciencia en este proceso. Los que han tenido mayor tradicional ha sido limitado (Kobayashi et al.,
aceptaci6n son la fusi6n mediada par polietilen 1988b).
glicol (PEG) y par la aplicaci6n de una corriente Grosser et at. (1988b), obtuvieron mas de
electrica (electro-fusi6n). El primero provoca la 150 hfbridos somaticos entre especies de dos geaglutinaci6n
de los protoplastos, favoreciendo el neros sexualmente incompatibles: Severinia disticontacto
entre elIas, mientras que el segundo los cha (Blanco) Swing y C. sinensis cv. 'Hamlin'.
alinea mediante la aplicaci6n de un diferencial de Fusionaron protoplastos derivados de cultivos empotenciales,
y luego los fusiona al aplicar un pulso briogenicos en suspensi6n de 'Hamlin' con protoelectrico
de corriente directa (ac) (Bengochea y plastos derivados de callos del epic6tilo de plantu-
Dodds, 1986). las de Severinia. Estos generos estan emparenta-
La hibridaci6n somatic a efectiva se habfa li- dos en forma muy distante. La producci6n de este
mitado hasta hace poco a solanaceas, crucifera- hfbrido evidenci6 la capacidad de esta tecnica para
ceas y leguminosas. Sin embargo, los hfbridos so- sobrepasar barreras de hibridaci6n sexual y de esta
maticos obtenidos no han tenido importancia forma utilizar germoplasma anteriormente no disagron6mica
directa, principalmente porque son ponible, pero importante, dentro de la familia Ruportadores
de caracterfsticas indeseables de las va- taceae.
riedades silvestres, que reducen sus ventajas hortf- El primer hfbrido intertribal fue producto de
colas, incluyendo la calidad del producto cosecha- la fusi6n de naranja dulce 'Hamlin' con Clausena
ble (Grosser y Gmitter, 1990b). lansium (Lour.) Skeels, un miembro de la Tribu I

JIMENEZ: EI cultivo de protoplastos en cftricos y su potencial para el mejoramiento genetico 193
Clauseneae (Cuadro 1). Debido a que las plantulas En cftricos generalmente se efectua la fusi6n
de este hfbrido no desarrollaron falces, los brotes de protoplastos derivados de hojas 0 callos no emfueron
microinjertados en citrange 'Carrizo'. S610 briogenicos, con protoplastos obtenidos de callo
Se obtuvieron dos plantas, las cuales crecieron friable 0 suspensi6n celular embriogenica (Grosbien
hasta que alcanzaron 30 cm de altura; pero ser y Gmitter, 1990a), para poder efectuar una seluego
degeneraron, y finalmente murieron. Esto lecci6n temprana. Los protoplastos derivados de
rue atribuido a incompatibilidad de injerto, 0 a una hoja no pueden resintetizar la pared celular 0 iniincompatibilidad
somatica latente. Posteriormente ciar mitosis en medio de cultivo desprovisto de rese
logr6 la fusi6n de naranja dulce 'Hamlin' con guladores de crecimiento, por 10 que los proto-
Feronia timonia (L.) Swing., un miembro de la plastos no fusionados de esta especie mueren
Subtribu 3, Balsamocitrinae (Cuadro 1).. Sin em- (Grosser y Gmitter, 1990b). En los obtenidos de
bargo, las plantulas enraizadas de esta combina- callo la capacidad para formar plantas normales se
ci6n no sobrevivieron la transferencia de condicio- ve reducida a causa de su cultivo por perfodos
nes asepticas, e intentos repetidos de microinjertar- prolongados, con 10 cual se yen disminuidas las
las han sido infructuosos. Tanto Ctausena como posibilidades de regeneraci6n (Ohgawara et at.,
Feronia tienen una compatibilidad de injerto lirni- 1985; Grosser y Gmitter, 1990a).
tada con Citrus (Swingle y Reece, 1967). En el Por otra parte, en los productos de fusi6n
Cuadro 1 se presentan los generos con los cuales ocurre cierta complementaci6n que permite el crese
ha logrado cierto exito al hibridarlos con Citrus. cimiento de los hfbridos somaticos (Grosser y
Saito et at. (1991) indican que el procedi- Gmitter, 1990b). Aparentemente la capacidad emmiento
de fusi6n qufmica utilizando PEG consume briogenica en cftricos esm bajo el control de genes
mucho tiempo, y es complicado y t6xico para los dominantes, que pueden expresarse en los producprotoplastos;
y que las tecnicas de electrofusi6n de- tos de fusi6n, permitiendo la obtenci6n de plantas
sarrolladas recientemente son muy simples y efi- completas (Grosser y Gmitter, 1990a), y recientecientes.
Los primeros ht'bridos somaticos producidos mente se ha planteado la posibilidad de que haya
por medio de electrofusi6n fueron las siguientes alguna ingerencia del genoma mitocondrial (Saito
combinaciones: sudachi (C. sudachi) y lima 'Mexi- et at., 1993) como se describe mas adelante.
cana' (C. aurantifotia) (Saito et al., 1991); mandarina
'Satsuma' (C, unshiu) y lim6n rugoso (C. jamb- Verificacion de los hibridos somaticos
hiri) 0 yuzu (C, junos) (Hidaka y Omura, 1992). . ,
El Cuadro 4 presenta una recopilaci6n de ,A pe~ar de que el esquema de ~el~cI.on d,eslos
hfbridos somaticos interespecfficos e interge- ~r~t? antenormente permlte un~ dlscnmmacl6n
nericos informados para cftricos hasta la fecha, Im~lal d~ los protopla.st?~ no f~slonados, es,nececon
informaci6n sobre el metodo de fusi6n, el nu- sarlo venficar la condlclon h~nda 0 no hfbnda de
mero de lantulas hfbridas obtenidas y el uso po- carla ?na de las pl~ntas o~te~ldas. Para este procet
. I d P I ' so existen una sene de tecmcas, las cuales se des-
encla e as mlsmas.
T d ' b. I I' .ta .
0 avla no se conocen len as Iml clones
, ' d 1 h ' b .d ., .( t . C 't
genetic as e a I n aclon som(1 Ica en I rus,
A I t.b' l .d d d . . rt fl '
parentemente a compa I I I a e mJe 0 re eJa
.b . .
cn en a contmuaci 6n,
.. , '
Se espera que los hfbndos somatlcos en Cltrl-
,., ,
cos tengan una morfologla vegetatlva mtermedla
. 1 .
clerto potencla para I n aclones som(1 Ica exi 0-,
, '
sa~, .Aunque se han produc!do ~lantas hfbndas so-
,
y mamfiesten una expresl6n compuesta de marca-
dores moleculares. Las tecnicas disponibles para
~atlcas ~ntre ocho combmaclones sexualmen~e verificar que las plantas regeneradas, presumibleincompatibles
~Cu~dro 4~, s610 un~ se ha pr?~ucI- mente de heterocariones, son en realidad hfbridos
do ~ntre c?mbmaclones incompatIbles por mJerto somaticos, incluyen la evaluaci6n visual por una
(Shmozakl et at., 1992), persona familiarizada con la morfologfa de los pa-
. , . . , .
Selecclon de embrlones hibrldos somatlcos
dres, la determinaci6n del numero de cromosomas
durante la mitosis, la caracterizaci6n molecular me-
.
,
1 h ' b . d .
.
( t .
. t e
. "diante electroforesis de ADN 0 isoenzimas yla se-
. , La clav~ para ,un programa, exI~oso de hlbn- paraci6n cromatografica de aceites de hoja. Sin emdaclon
somatica ~e,slde en la .a~llcacI6n de un ~s- bargo, ninguno de estos metodos por sf solo provee
quema de selecclon muy enclente, que permlta conclusiones determinantes, ya que carla uno tiene
identificar y seleccionar los hfbridos. sus limitaciones (Grosser y Gmitter, 1990a),
n
t
r
e
l
o
s
p
r
o
g
e
m
t
o
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,

194 AGRONOMIA COST ARRICENSE
Cuadra 4. Hibridos somaticos obtenidos en la familia Rutaceae mediante fusi6n de protopla.~tos.
Progenitores y fuentede protopla.~tos( I) Tipo de NQ. de Usa Referencia
fusi6n(2) planta.~ potencial(3)
Hibridos interespecfficos:
C. auranf(t()lia lima 'Key' (s.e.) + C. PEG >40 P,I Grosser ef at. (1989)
sinensis 'Valencia' (hoja)
C. auranf(t()lia lima mexicana (c.e. cibrido) +
C. limon 'Eureka' (hoja)
E 5 I Saito et at. (1994)
C. autanfium naranja agria + C. limonia PEG? I Grosser (1993)
'Rangpur'
C. auranfium naranja agria (c.e.) + C. PEG 113 P Louzada et at. (1992)
volkameriana 'lim6n Volkamer' cig6tico (hoja)
C.jambhiri'Milam' (c.e.)+C. limon PEG I P,I Tusaetal.(1992)
'Pemminello' (hoja)
C. jambhiri 'Milam' + C. reficulafa 'Sun Chu
Sha'
PEG? I Grosser (1993)
C. paradi.vi 'Thompson Pink' (s.e.) + tangor
'Murcott' (hoja)
PEG 19 I Grosser ef at. (1992b)
C. reficulafa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C.
auranfium naranja agria (hoja)
PEG 171 P Louzada et at. (1992)
C. reficuiafa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C.
jambhiri 'lim6n rugosa' (hoja)
PEG 5 P Louzada ef at. (1992)
C. reficulafa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C. PEG >1000 P Louzada et at. (1992)
limonia 'Rangpur' (hoja)
C. reticula fa mandarina 'Cleopatra' (c.e) + C. PEG 8 P Louzada et at. (1992)
volkameriana 'lim6n Volkamer' (hoja)
C. .vinen.vi.v 'Bahia' navel (s.e.) + C. paradi.vi
'Marsh' (hoja)
PEG 1000 P Louzadaefal.(1992)
'Rangpur' (hoja)
C. .vinen.vi.v 'Hamlin' (c.e.) + C. reticula fa PEG I I Grosser et al. (1992a)
'Dancy' (hoja)
C. .vinen.vi.v 'Hamlin' (c.e.) + [mandarina PEG? I Grosser (1993)
'Clementina' x tangelo 'Minneola']
C. .vinen.vLv 'Trovita' (s.e.) + C. un.vhiu PEG ? I Kobayashi y Ohgawara (1988)
'Haya.~hi' mandarina Satsuma (hoja)
C. .vinen.vLv 'Valencia' (s.e.) + C. jambhiri PEG 12 P Grosser ef at. (1992b)
lim6n rugosa (hoja)
C..vinen.vLv'Valencia'(s.e.)+C./imon PEG 25 P,I Tusaefal.(1990)
'Pemminello' (hoja)
C. .vinen.vLv 'Valencia' + [tangelo 'Robinson' x PEG? I Grosser (1993)
tangor 'Temple']
C. sinensis 'Washington' navel (s.e.) + C. PEG I I Kobayashi et at. (1988b)
un.vhiu 'Hayashi' mandarina Satsuma (hoja)
C. sinen.vLv 'Washington' navel (s.e.) + tangor PEG? I Kobaya.~hiefal.(1988a)
'Murcott' (hoja)
C. .vudachi (s.e.) + C. auranfi!olia lima E 12 I Saito et at. (1991)
mexicana (hoja)
C. .vudachi (s.e.) + C. limon 'Eureka' (hoja) E 6 ? Saito et at. (1993)
C.un.vhiu'Saruwatari'(s.e.)+C.jambhiri E?? Hidakay Omura (1992)
lim6n rugosa (hoja)
C. unshiu 'Saruwatari' (s.e.) + C. junos yuzu (hoja) E?? Hidaka y Omura (1992)
Tangelo 'Nova' (c.e.) + C. .vinen.vis 'Succari' (hoja) PEG 2 I Grosser et at. (1992a)
Tangelo 'Nova' (c.e.) + C. grandis 'Hirado
Buntan' cig6tico (hoja)
PEG >10 I Grosser (1992)
continua...

Cuadro 4. (Continuaci6n)
JIMENEZ: EI cultivo de protoplastos en citricos y su potencial para el mejoramiento genetico 195
Progenitores y fuente de protopla.'\tos( I) ! .,, Tipo de No. de Uso Referencia
fusi6n(2) planta.'\ potencial(3)
Tangelo 'Page' (c.e.) + C. .~inen.~i.~ 'Succari' (hoja) PEG 2 I Grosser (1994a)
Hibrido de C. aurantium ('Smooth Flat PEG >70 P Louzada et al. (1992)
Seville') (c.e.) + C. jambhiri lim6n rugoso (hoja) ,I;,
Hibridos intergenericos; padres sexualmente compatibles:
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (c.e) + PEG 5 P Grosser et al. (1992b)
citrumelo 'Swingle' (hoja)
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (c.e) + P. PEG >200 P Grosser (1992)
tri!o!iata 'Argentine' (hoja)
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (c.e) + P. PEG >150 P Grosser et al. (1992b)
trifoliata 'Flying Dragon' (hoja)
C. .~inen.~i.~ 'Bahia' (s.e.) + citrange 'Troyer' (hoja) PEG 20 P,I Ohgawara et al. (1991)
C. .~inen.~i.~ 'Hamlin' (s.e.) + Ponciru.~ PEG >300 P Grosser et al. (1988a)
triftJliata 'Flying Dragon' (hoja)
C. .~inen.~i.~ 'Succari' + P. trifllliata 'Argentine' PEG? P Grosser (1993)
C. .~inen.~i.~ 'Trovitai (s.e.) + P. trifoliata (hoja) PEG > lOP Ohgawara et al. (1985)
C. .~inen.~i.~ 'Trovitai (s.e.) + citrange 'Troyer' (hoja) PEG 17 P,I Kobaya.'\hi y Ohgawara (1988)
C. .~inen.~i.~ 'Valencia' (c.e.) + citrange 'Carrizo' (hoja) PEG 7 P,I Louzada et al. (1992)
C..~inen.~i.~'Valencia'(c.e.)+Fortunel/a
cra.~sifolia 'Meiwa' kumquat (hoja)
PEG >40 P,I Dengetal.(1992)
Hibridos intergenericos; padre-'\ sexualmente incompatibles:
C. aurantiflJlia lima 'mexicana' (s.e.) + E '7 P Takayanagi et al. (1992)
Ferlmiel/a Lucida (hoja) ,
C. aurantiflJlia lima 'mexicana' (s.e.) + E? P Takayanagi et al. (1992)
Swinglea glutinll.~a (hoja)
C. reticulata mandarina 'Cleopatra' (s.e.) + PEG >35 P Grosse, et al. (1990)
Citrllp.~i.~ gil/etiana (hoja)
C..~inen.~i.~'Hamlin'(c.e.)+Atalantia PEG 5 P,I Louzadaetal.(1993)
ceylanica (hoja)
C. .~inen.~i.~ 'Hamlin' (s.e.) + CitroJl.~i.~ PJ::G >150 P,I Grosser y Gmitter (1990b)
gil/etiana (hoja/callo n.e.')
C. .~inen.~i.~ 'Hamlin' (s.e.)'+ Severinia PEG >50 P,I Grosser et al. (1992b)
buxifolia (callo n.e.)
C..~inen.~i.~'Hamlin'(s.e.)+Severinia PEG >150 P,I Grosseretal.(1988b)
di.~ticha (callo n.e.)
C. .~inen.~i.~ 'Trovita' (s.e.) + Murraya E? P Shinozaki et al. (1992)
paniculata (hoja)
(I )s.e.: suspensi6n embriogenica; n.e.: no embriogenico; c.e.: callo embriogenico; (2)PEG: fusi6n quimica utilizando polietilen glicol;
E: fusi6n mediante la aplicaci6n de una corriente electrica; (3)P: patr6n; I: injerto
Evaluacion morfologica. Las diferencias morfo- 1990b) Y de pigmentos rajas de Severinia (Groslogicas
que existen entre Citrus y los generos rela- ser et at., 1988b).
cion ados facilitan en gran medida la identificaci6n Aunque es mas diffcil utilizar diferencias
de los hfbridos somaticos. Caracteres bajo el con- morfologicas para identificar hfbridos somaticos
trol de genes dominantes 0 codominantes se iden- interespecfficos, se pueden utilizar caracterfsticas
tifican general mente con facilidad en los hfbridos menos prominentes, como el tamafio del 'ala' en
somaticos, particularmente cuando se cruzan pa- el pecfo10, 1a forma y el grosor de la hoja, que gedres
muy poco relacionados fi1ogeneticamente. neralmenteson intermedios a los de los progenito-
Las plantas hfbridas pueden identificarse par 1a res (Grosser y Gmitter, 1990a).
expresion de cualquier caracter unico al progeni- Uti1izar caracteres morfol6gicos como unico
tor no embriogenico. Algunos ejemplos incluyen: metoda no es correcto, ya que se ha encontrado,
la expresion de la hoja trifoliada de Poncirus par ejemplo, morfologfa intermedia en regeneran-
(Grosser et at., 1988a; Ohgawara et at., 1985), la tes originados par fusi6n de protoplastos, vera con
hoja pentafoliada de Citropsis (Grosser y Gmitter, eliminacion de cierta cantidad de material cromo-

196 AGRONOMIA COSTARRICENSE
s6mico (pre 0 posfusi6n). Estas plantas no portan diploide y bastante similitud con el progenitor detoda
la informaci6n genetica que deben incluir los rivado de protoplastos de hoja. Mediante este anaverdaderos
hfbridos somaticos tetraploides. lisis se comprob6 que estas plantas eran en realidad
cfbridos, con genoma nuclear del progenitor
Determinacion del numero de cromosomas. Los embriogenico, y genoma mitocondrial del otro.
experimentos de fusi6n somatica en cftricos gene- Como se mencion6 anteriormente, y se describe
ralmente se orientan hacia la obtenci6n de hetero- con mas detalle adelante, existe, probablemente,
cariones, celulas tetraploides que poseen genom as un efecto del genoma mitocondrial en la capacicompletos
de ambos progenitores. La evaluaci6n dad de regeneraci6n de los protoplastos en medio
de los posibles hfbridos mediante conteo de cro- de cultivo.
mosomas unicamente, es poco confiable, ya que Tambien las tecnicas moleculares, utilizadas
los regenerantes homocariones (2 juegos comple- por sf solas, a pesar de ser muy precisas, pueden
tos de cromosomas del mismo progenitor), tam- dar falsos positivos. Por ejemplo, si las plantas rebien
poseeran un numero tetraploide de cromoso- generadas son quimeras, debido a un origen multimas,
y podrfan ser confundidos con hfbridos hete- celular en lugar de unicelular, entonces las tecnirocariones.
cas moleculares indicarfan la presencia de hfbridos,
debido a la presencia de poblaciones de celu-
Analisis electroforetico de isoenzimas de hoja.
Los sistemas de isoenzimas mas utiles para la ve-
las heterogeneas en la planta.
rificaci6n de hfbridos somaticos, son aquellos con APLICACIONES DE LA FUSI6N DE
el control genetico mas simple y con la mayor dis- PROTOPLASTOS
paridad de alelos entre los progenitores (cada progenitor
debe tener al menos un alelo distinto del La fusi6n de protoplastos puede tener 'apliotro).
De los sistemas enzimaticos que se han es- caciones hortfcolas de gran importancia, tanto patudiado
hay 3 que han probado, a traves del tiem- ra el mejoramiento genetico de patrones como de
po, ser muy utiles: fosfoglucomutasa (PGM), ma- injertos. Con relaci6n a los pnmeros, se conocen
Jato deshidrogenasa (MDH) y fosfohexosa isome- mas de 20 caracterfsticas hortfcolas y patol6gicas
rasa (PHI), en los cuales los alelos isoenzfmicos se importantes que son controladas 0 determinadas
expresan en forma codominante (Grosser y Gmit- en cftricos por los patrones (Grosser y Gmitter,
ter, 1 990a). 1990a). Para el desarrollo de patrones mejorados
Los analisis por isoenzimas pueden ser en- en cftricos existen dos aplicaciones principales: la
gafiosos en casos en los cuales ha ocurrido perdida producci6n de hfbridos alotetraploides de cultivade
material genetico. Tambien, esta tecnica es de res que posean caracterfsticas complementarias y
poco valor cuando se necesita la verificaci6n de la formaci6n de hfbridos entre Citrus y especies
cfbridos (como se vera mas adelante), ya que las silvestres incompatibles. Por su parte, el mejoraisoenzimas
comunmente utilizadas esmn codifica- miento de injertos se ha orientado principalmente
das en el nucleo. En tales casos, 0 para verificar hacia la producci6n de triploides sin semilla, con
hfbridos creados por fusi6n de protoplastos de es- calidad de fruto similar al de las yariedades actuapecies
muy cercanas entre sf, se pueden aplicar les, 10 cual podrfa estimular el crecimiento del
tecnicas de caracterizaci6n de ADN mas sensibles,
tanto a genomas nucleares como citoplasmaticos
mercado defruta fresca.
(Grosser y Gmitter, 1990a). Mejoramiento de patrones
AnaIisis de ADN ribosomal y mitocondrial. Es- Formacion de hibridos alotetraploides entre
tas tecnicas son mas sofisticadas que los analisis cultivares con caracteristicas complementarias.
de isoenzimas. Se utiliza el ADN ribosomal ya Debido a que la hibridaci6n somatica es un proceque
se ha observado que es altamente conservado so aditivo, sin segregaci6n, las caracterfsticas que
a nivel filogenetico, y por 10 tanto permite deter- estan bajo el control de genes dominantes ocodominar
diferencias con mayor propiedad. El ADN minantes en uno de los padres tienen gran posibimitocondrial
se utiliz6 para la verificaci6n de cf- lidad de expresarse en cualquier hfbrido somatico
bridos y para esclarecer la naturaleza de plantas alotetraploide. Algunas caracterfsticas que estan
regeneradas en un evento de fusi6n, con genoma bajo el dominio de genes dominantes en Citrus

JIMENEZ: EI cultivo de protoplastos en citricos y su potencial para el mejoramiento genetico 197
son: poliembrionfa, resistencia al frIo, a Phytopht- ma triploide 'Persa'. Los triploides general mente
hora parasitica, al virus de la tristeza y al nemato- se obtienen de la hibridacion de madres tetraploido
Tylenchulus semipenetrans (Hutchison, 1985). des con padres diploides; pueden surgir en forma
Ademas, IDS genes recesivos deletereos que se en- espontanea en poblaciones de plantulas nucelares
cuentran enmascarados en IDS progenitores no se u obtenidas de cultivo in vitro de cultivaTes poexpresan
en IDS hfbridos somaticos. POT ejemplo, liembrionicos diploides, mediante la aplicacion de
el hfbrido somatico entre C. sinensis 'Hamlin' colchicina (Oiyama y Okudai, 1986; Grosser y
(naranja dulce) y P. trifoliata 'Flying Dragon' Gmitter, 1990a). Se obtener plantas triploides mepuede
llegar a exhibiT todas las caracterfsticas diante cruces sexuales entre un hfbrido somatico
complementarias de cada progenitor, como resis- tetraploide y una planta diploide, 0 bien fusionantencia
a Phytophthora, tristeza y nematodos, aportadas
por 'Flying Dragon', y cierta tolerancia a
do directamente celulas diploides con aploides.
'blight' POT naranja dulce. Tambien tiene la venta- Produccion de padres alotetraploides para uso
ja de reducir el tamafio del arbol para lograr plan- en cruces sexuales 4x:2x. La hibridacion somatitaciones
con mayor densidad. Los patrones diploi- ca interespecffica provee un metodo excelente
des 'Carrizo' y 'Troyer' que se originaron de cru- para la produccion de progenitores heterocigotos
ces sexuales entre C. sinensis y P. trifoliata. Sin (entre padres complementarios), los cuales
embargo no exhiben todas las caracterfsticas ante- podrfan seT utilizados en cruces sexuales de tetrariores,
debido a la segregacion meiotic a (Grosser ploides x diploides para generar una progenie
y Gmitter, 1990 a y c). cigotica triploide, potencial mente sin semilla.
Formacion de hibridos alotetraploides entre
Podrfa seT ventajoso utilizar hfbridos somaticos
alotetraploides que exhiban una heterocigQcidad
Citrus y especies silvestres sexualmente incom- maxima en dichos cruces, con el fin de producir
patibles. Muchos generos emparentados con variacion maxima en la progenie. POT ejemplo, si
Citrus expresan ciertas caractensticas de impor- el hfbrido somatico entre lim~ 'Key' y naranja
tancia (tolerancia a factores de estres, caracterfsti- dulce 'Valencia' es fertil, podrfa seT hibridado secas
hortfcolas y productividad). Tambien son una xualmente con ciertos cultivaTes diploides de lima,
fuente potencial importante para resistencia a para intentar transferir tolerancia al frIo, mejorar
'blight', 10 cual no se ha encontrado dentro del ge- el tamafio y calidad del fruto, y toleranciaJresisnero
Citrus. Muchas especies emparentadas con tencia a enfermedades de la naranja dulce en una
Citrus son compatibles pOT injerto, pero incompa- progenie triploide, sin semilla, del tipo de la lima
tibles sexualmente, y no son aceptadas desde el (Grosser et al., 1989). Tambien el hfbrido somatipunto
de vista hortfcola cuando son utilizadas di- co entre naranja 'Washington' y mandarina Satsurectamente
como patrones (Citropsis gilletiana, ma 'Hayashi' (Kobayashi et al., 1988b) puede seT
Severinia, Feronia, Swinglea, etc.) (Grosser y cruzado sexualmente con su complementario di-
Gmitter, 1990b). Sin embargo, pOT medio de la hi- ploide, ya sea mandarina 0 naranja dulce, para
bridacion somatica pueden aportar una serie de ca- generar plantas potencial mente sin semilla, faciles
racterfsticas importantes que no estarfan disponi- de pelar, con maduracion temprana y con buena
bles de otra forma, como resistencia a calidad de fruto. Muchas mas combinaciones
Phytophthora citrophthora, a nematodos y a otra triploides serlin posibles con forme se generen
serie de agentes bioticos muy perjudiciales (Gros- nuevos progenitores alotetraploides interespecffiseT
et al., 1988b; Grosser y Gmitter, 1990b). Algunos
hfbridos somaticos desarrollados en este
coso
sentido han sido propagados e introducidos en Produccion directa de triploides por medio de
campos experimentales, con el objeto de evaluar la fusion de n+2n. La fusion de protoplastos sosu
potencial como patrones (Grosser, 1992). maticos diploides, con protoplastos cigoticos haploides,
tal y como se ha realizado con otras espe-
Mejoramiento de injertos cies, produce hfbridos triploides, probablemente
sin semilla. Dichos hfbridos se podrfan obtener me-
Las plantas triploides de citricos pueden seT diante la fusion de protoplastos diploides con protovigorosas
y producir frutos practicamente carentes plastos gameticos haploides, aislados de tetradas de
de semillas, como 10 evidencio el estudio de la li- genotipos seleccionados pOT sus caracterfsticas

198 AGRONOMIA COSTARRICENSE
complementarias. Par ejemplo, la fusion de proto- ma sabre los protoplastos donadores (los que van a
plastos embriogenicos de mandarina 'Dancy' (un transferir las organelas) para disminuir la division
tipo muy popular, facil de pelar, pero con mucha nuclear, y trataron los receptores (I os que aportan
semilla) con protoplastos gameticos haploides de el genoma nuclear) con el antimetabolito iodoacealgun
cultivar de grapefruit 0 pamela, podrfa lle- tala para inactivar el citoplasma. Despues de la fuvar
al desarrollo de tangelos triploides sin semilla. sion donador-receptor, rue posible recobrar las
Al contrario de las fusiones somaticas entre dos plantas cfbridas debido a la complementacion entre
progenitores especfficos, cada planta regenerada a el citoplasma de las plantas donadoras, y el nucleo
partir de una fusion separada de n+2n es unica, de las receptoras (Grosser y Gmitter, 1 990a).
debido a que cadaprotoplasto haploide es un pro- Vardi y colaboradores utilizaron el procediducto
de segregacion (Grosser y Gmitter, 1990a). miento men cion ado anteriormente para generar
Si tiene exito, este metoda tendrfa muchas plantas cfbridas de Citrus. Realizaron las siguienventajas
sabre el metoda descrito anteriormente tes combinaciones (Gal un et at., 1987; Vardi et
de obtener triploides a partir de cruces sexuales
entre diploides y tetraploides. La primera serfa la
at., 1987, 1989):
- Hfbrido de 'Poorman' X Poncirus trifotiata
reduccion del tiempo necesario para producir los (donador) con limon Villafranca (C. limon)
triploides. La segunda es que el uso de un genoma
diploide intacto, sin sufrir recombinacion ni segre- -
(receptor).
Hfbrido de 'Poorman' X P. trifotiata (donagacion,
podrfa mantener ocultos ciertos caracteres dor) con naranja agria (C. aurantium) (rerecesivos
deletereos, en la progenie resultante. Caracterfsticas
importantes bajo el control de genes
ceptor).
Naranja agria (C. aurantium) (donador) con
dominantes 0 codominantes en el progenitor diploide,
0 recesivos en ambos progenitores, serfan -
limon Villafranca (C. limon) (receptor).
Microcitrus sr. (donador) con limon rugoso '
expresados en una progenie generada par fusion
de n+2n. Como resultado, una mayor cantidad d.e -
(C.jambhiri) (receptor)
Microcitrus sr. (donador) con naranja agria
la progenie debe exhibir las caracterfsticas de inte- (C. aurantium) (receptor").
res, en contraste con 10 que se esperarfa en la pro- En todas las combinaciones anteriores se engenie
de un cruce sexual de un tetraploide con un contraron plantas cfbridas con el genoma nuclear
diploide. EI numero de combinaciones parentales y la morfologfa general del progenitor receptor, y
posibles esta limitado par la disponibilidad de If- el genoma mitocondrial del donador (Vardi et at.,
neas de callos embriogenicos totipotentes y arbo- 1987, 1989). En las primeras 3 combinaciones
les de cultivares que produzcan tetradas de tamafio mencionadas, no se pudo verificar la transferencia
suficiente que resistan el proceso de desinfeccion. de cloroplastos del progenitor donador, ya que los
Otro factor limitante es que las fusiones n+2n solo ADN cloroplasticos tienen patrones de restricci6n
pueden realizarse durante la estacion en que las identicos en ambos progenitores (Vardi et at.,
yemas tlorales estan disponibles, a menos que sea 1987). Sin embargo, en las ultimas dos combinaposible
controlar la fIoraci6n en invernadero ciones, se observo incorporacion de cloroplastosde
(Grosser y Gmitter, 1990a). los progenitores donadores en los receptores. Esto
se pudo verificar, porque el genera Microcitrus sf
TRANSFERENCIA DE ORGANELAS presenta diferencias en los patrones de restriccion
ENTRE PROTOPLASTOS del ADN cloroplastico con respecto a los de Citrus
(Vardi et at., 1989).
Cuando en un evento de fusi6n de proto- Esta linea de investigacion generara inforplastos
se pierde el nucleo de uno de los progeni- macion importante con respecto a la identificatares
y permanecen las organelas del otro progeni- cion, herencia y transferencia de caracteres importor
0 de ambos, se forma un cfbrido (Bengochea y tantes codificados por el ADN de las organelas
Dodds, 1986). Aunque puede ocurrir formaci6n de (Vardi y Galun, 1988). Por ejemplo, en vista de
cfbridos en forma espontanea, esto generalmente que Microcitrus posee esterilidad masculina codisucede
en porcentajes muy bajos. Por ello se ban ficada par la mitocondria, es factible introducir esdesarrollado
metodologfas que estimulen su for- ta caracterfstica de importancia agronomica al gemaci6n.
Galun y Aviv (1986) ap1icaron un esque- nero Citrus, con el fin de obtener frutos sin semima
basado en el empleo de radiaciones X 0 gam- lla (Ohgawara y Kobayashi, 1991).

JIMENEZ: EI cultivo de protoplastos en citricos y su potencial para el mejoramiento genetico 199
En eventos de electrofusion entre C. sudachi das por Ohgawara et at. (1989), las cuales ten fan
y C. aurantifotia (lima) 0 C. timon (limon), Saito caractensticas similares al progenitor no embrioet
at. (1993) observaron cierto numero de regene- genico. Con estos y otros resultados, Saito et at.
rantes con genoma diploide y caractensticas simi- (1993) especulan que el genoma mitocondrial de
lares a limon y lima (progenitores derivados de celulas de callos nucelares juegan un papel imporprotoplastos
de hoja). Mediante analisis del ADN tante en el proceso de embriogenesis en cftricos,
mitocondrial se comprobo que estas plantas eran ya que los protoplastos de los progenitores no emen
realidad cfbridos, con el genoma nuclear del briogenicos no regeneran normalmente. En el
progenitor no embriogenico, y genoma mitocon- Cuadro 5 se encuentra una lista de las plantulas
drial del otro. Resultados semejantes obtuvieron obtenidas a partir de protoplastos no embriogeniestos
mismos autores analizando plantas regenera- cos en eventos de fusion.
Cuadro 5. Plantulas diploides con caracterfsticas del progenitor no embriogenico, obtenidas en eventos de fusi6n.
E.~pecie Cultivar Metodo de fusi6n( I) Referencia
C.aurantifolia - E Saitoetal.(1991)
C. aurantium - PEG Louzadaetal. (1992)
C.jambhiri lim6nrugoso PEG Grosseretal.(1992b)
C. limon Eurekai E Saito et al. (1993)
C. limon Femminelloi I!EG Tusa et al. (1990)
C.limonia Rangpurf PEG Louzadaetal.(1992)
C. paradi.vi Marshi PEG Ohgawara et al. (1989)
C.paradi.vi Duncani PEG Grosseretal.(1992b)
C. .vinen.vi.v Succarii PEG Grosser et al. (1992a)
C. .vinen.vi.v xC. reticulata (Tangor) Murcotti PEG Grosser et al. (1992b)
C. .vinen.~i.v x Ponciru.v trij()liata (Citrange)
C. v()lkameriana
Troyerf
-
PEG
PEG
Ohgawara et al. (1991)
Louzada et al. (1992)
(I )PEG: fusi6n quimica utilizando polietilen glicol: E: fusi6n mediante la aplicaci6n de una corriente electrica
Recientemente se utilizo una linea embrio- dulce 'Trovita', un gen quimerico que contenfa el
genica cfbrida, resultante de una fusi6n de C. au- promotor de la nopalina sintetasa, el gen estructurantifotia
con C. sudachi (Saito et at., 1993), para ral que codifica para la aminoglicosido fosfotransefectuar
una fusion con C. timon 'Eureka'. Se 10- ferasa II y la regi6n terminadora del virus del mogro
la obtenci6n de hfbridos alotetraploides que saico de la coliflor (CaMV). Utilizaron PEG para
inclufa el genoma mitocondrial de C. sudachi, efectuar la introduccion directa de plasmidos de
transferido a craves del cfbrido (Saito et at., 1994)
.
ADN a los protoplastos derivados de callos embriogenicos.
Mediante esquemas de selecci6n a
TRANSFORMACI6N GENEllCA nivel celular utilizando kanamicina, lograron aislar
microcallos transformados, aunque no logra-
La transformacion genetic a es un metodo rOll la regeneracion de plantulas.
atracti vo para agregar caractensticas especfficas Posteriormente, Vardi et at. (1990) obtuvieimportantes,
codificadas por uno 0 pocos genes, rOll dos plantas transgenicas de limon rugoso, a
con la finalidad de obtener injertos 0 patrones me- las cuales les introdujeron los genes que codifican
jorados sin alterar la integridad del cultivar. La para la neomicin fosfotransferasa II (nptIl) y la
transformaci6n en Citrus ha demostrado ser mu- cloranfenicol acetiltransferasa (cat), utilizando un
cho mas diffcil que en las especies herbaceas metodo similar al anterior. Este constituyo el prianuales
de solanaceas, que se utilizan como siste- mer ejemplo de transformacion directa de protomas
modelo. Sin embargo, los progresos que se plastos de una especie leiiosa que tuvo como rehall
obtenido recientemente son alentadores sultado finalla regeneracion de plantulas.
(Grosser, 1992). En el Cuadro 6 se encuentra una lista de los
Kobayashi y Uchimiya (1989) realizaron la informes de transformacion genetic a en cftricos
primera transformacion genetica en cftricos y en que involucraron la utilizaci6n de protoplastos. En
una especie leiiosa; en protoplastos de naranja la actualidad, no hay ejemplos de plantas transge-
.

200 AGRONOMIA COSTARRICENSE
Cuadro 6. Genotipos de citricos sobre los cuales se han efectuado eventos de transformaci6n genetica que involucren la utilizaci6n
de protopla...tos.
E...pecie Cultivar Metodo de transformaci6n( I ) No. de plantas Referencia
C.jambhiri -- PEG 2 Vardi etal. (1990)
C.reticulata 'Ohta' electroporaci6n 0 HidakayOmura(1993)
C. .finen.fi.f 'Hamlin' PEG 12 Schell (1991)
C. .finen.fi.f 'Trovita' PEG 0 Kobayashi y Uchimiya (1989)
nicas de Citrus que contengan genes de importan- Gmitter. 1 990b). Tambien mediante transferencia
cia agrfcola. Sin embargo, conforme avance la in- de organelas se puede conocer mas sabre la comvestigaci6n
al respecto, se lograra una mejora sus- posici6n de los genomas citoplasmaticos, como
tancial en las tecnicas. y en consecuencia, aumen- eventuales fuentes de caracterfsticas de interes patara
el numero de genotipos importantes capaces ra incorporar a cultivares comerciales.
de ser transform ados (Grosser, 1992). Es probable que a muy carta plaza se esten
Dentro de las caracterfsticas posibles de ser viendo los beneficios de la aplicaci6n de muchas
introducidas mediante esta tecnica se encuentra el de las metodologfas discutidas. Actualmente se
gen que codifica para la protefna de capside del encuentran en evaluaci6n en condiciones de camvirus
de la tristeza de los cftricos, para tratar de po, una serie de plantas producto de la fusi6n soconferir
resistencia a esta enfermedad. Tambien, matica de protoplastos. Estos ban sido injertados
la tecnologfa 'antisense' (que se basa en la intro- sabre patrones que estimulan la floraci6n precoz,
ducci6n de una secuencia complementaria a la se- con el fin de acelerar las determinaciones de ferticuencia
que codifica para el producto cuya expre- lidad. Hfbridos somatic os con potencial para ser
si6n que se quiere inhibir, con 10 cuallos ARNm utilizados como patrones, estan siendo propagarespectivos
se aparean e inhiben mutuamente su dos, evaluados para resistencia a enfermedades,
traducci6n, reduciendo la presencia de un produc- injertados con varios cultivares e introducidos en
to genico determinado) tiene un gran potencial pa- pruebas de campo con patrones comerciales, para
ra reducir los niveles de enzimas 0 protefnas regu- comparar su rendimiento. Estos arboles estan creladores
indeseabl~s (ej. la pectIn esterasa en na- ciendo a un ritmo similar al de patrones comerciaranja
dulce). Habra mas ejemplos conforme se les (Grosser y Gmitter. 1990c). Sin embargo. estas
identifiquen, afslen y clonen mas genes (Grosser, plantas deben pasar par perfodos prolongados de
1992). evaluaci6n antes de estar disponibles para los productores
para su cultivo a nivel comercial.
CONCLUSIONES Es importante recalcar que ninguna de estas
tecnicas reemplazara los programa~ de hibridaci6n
Las tecnicas mencionadas a 10 largo de este tradicional.. Su pape.\ principal recaera en facilitar
trabajo permitiran oportunidades unicas para estu- en forma cualitativa y cuantitativa la creaci6n de
diar el control genetico de caracterfsticas de importancia
econ6mica en cftricos. de las cuales se
variaci6n genetic a util. Genotipos potencialmente
importantes, obtenidos en estos programas concon
ace muy poco. Serfa posible, par ejemplo, de- juntos, requeriran evaluaciones intensivas y extenterminar
su aditividad 0 dominancia/recesividad sivas en el campo (Grosser, 1992).
mediante la creaci6ri de combinaciones especfficas
de tipos parentales tolerantes y susceptibles y RESUMEN
estudiar asf el comportamiento de hfbridos somaticas.
Tambien, estudios de la meiosis y la fertilidad Se hace una revisi6n de las diferentes tecnirelativa
de los hfbridos somatic os que lleguen a cas que involucran el aislamiento. cultivo y regefloraci6n.
pueden producir informaci6n valiosa en neraci6n de protoplastos de cftricos para el mejocuanto
a la homologfa de cromosomas entre Citrus ramiento genetico del cultivo. Se enumeran y desy
los generos emparentados, que pueden resultar criben los especies y cultivares a partir de los cuautiles
en intentos para describir la relaci6n taxon6- les se ban podido obtener protoplastos viables y
mica entre miembros de esta familia (Grosser y regenerar plantas completas, asf como los resulta-

JIMENEZ: EI cultivo de protoplastos en citricos y su potencial para el mejoramiento genetico 201
dos exitosos en experimentos d~ fusion, formacion Iracheiphila toxin, shows enhanced release of chitina.~e
de cfbridos y transformacion genetica. Se discuten
I . I d I ,. I.
os usos potencta es e as tecnlcas y su ap lca-
and gluca.na.~e into the culture medium. Theor. Appl.
Genet. 86.527-532.
cion, profundizando en la fusion de protoplastos, GERACI, G.; TUSA, N. 1988. Calli and plants from Cilru.v lique
es la metodologfa que ha evolucionado en rha- mlm Bum. cv. 'Femminello' ovules in vitro. Acta Hort.
yor grado. no.227:381-383.
GMITTER, F.G.; MOORE, G.A. 1986. Plant regeneration
AGRADECIMIENTO from undeveloped ovules and embryogenic calli of Ci-
trus: Embryo production, germination, and plant survi-
EI autor agradece a Eric Guevara par la lec- val. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 6: 139-147.
tufa crftica y exhaustiva del presente
trabajo. GROSSER , J.. W 1992 . Th e ro Ie 0 fb lotec . hno Iogy m t he deve
lopment of improved Cilru.~ scion and rootstock culti-
LITERATURA CITADA vars. In Transactions of the 1992 Citrus Engineering
Conference. Florida Section of the American Society of
BEN-HA YYIM, G.; NEUMANN, H. 1983. Stimulatory effect Mechanical Engineers. 38:24-37.
of glycerol on growth and somatic embryogenesis in ci-
trus callus cultures. Z. PtlanzenphysioIII0:331-337. GROSSER, J.W. 1993. Citrus scion and rootstock improve-
ment via somatic hybridization. Acta Hort. 336:297-
BENGOCHEA, T.; DODDS, J.H. 1986. Plant protoplasts: a 305.
biotechnological tool for plant improvement. Cambridge,
U.K., Chapman & Ha1l90p. GROSSER, J.W. I 994a. In vilr{) culture of tropical fruits. In
Cell culture and somatic cell genetics of plants. Plant
BUlTON, J.; RIJKENBERG, F.H.J. 1977. The effect of sub- tissue culture-methods and applications. Ed. by I.K.
culture interval on organogenesis in callus cultures of Vasil, T.A. Thorpe. San Diego. Cal, Academic Press. v.
Cilru.~ .~inen..~i.~. Acta Hort. no.78:225-236. 9, p. 475-496.
BUTTON. J.; KOCHBA, J.; BORNMAN. C.H. 1974. Fine GROSSER, J.W. 1994b. Observations and suggestions for im-
structure of and embryoid development from embryo- proving somatic hybridization by fllant protopla.~t isolagenic
ovular callus of 'Shamouti' orange (Cilru.~ .~inen- tion, fusion and culture. HortScience 29( II): 1241-
.~i.~ Osb.). J. Exp. Bot. 25:446-457. 1243.
DENG. X.X: GROSSER, J.W.; GMllTER, F.G. 1992. Inter- GROSSER, J.W.; CHANDLER, J.L. 1987. Aseptic isolation
generic somatic hybrid plants from protopla.~t fusion of of leaf protoplasts from Cilru.~ X PMciru.~ hybrids and
FMlunella cra.~.~it{Jlia cultivar 'Meiwa' with Cilru.~ .vi- Severinia for use in somatic hybridization experiments.
nen.~i.\. cultivar 'Valencia'. Sci. Holt. 49:55-62. Sci.Hort. 31 :253-257.
ENGELMANN, F.; DAMBIER, D.; OLLITRAULT, P. 1994. GROSSER, J.W.; GMIlTER, F.G. I 990a. Protoplast fusion
Cryopreservation of cell suspensions and embryogenic and citrus improvement. Plant Breeding Rev. 8:339-
calluses of Cilru..~ using a simplifi,ed freezing process. 374.
Cryo-Letters 15:53-58.
GROSSER, J.W.; GMllTER, F.G. 1990b. Somatic hybridiza-
GALl ANA. A.: PEREZ, R.M..; NAVARRO, L.; DURAN- VI- tion of Cilru.v with wild relatives for germpla.~m enhan-
LA. N 1993. Obtenci6n de linea.~ celulares embrioge- cement and cultivar development. HortScience
nica.~ de citricos. Actas del V Congreso, S.E.C.H. 7 p. 25(2): 147-151.
Material mimeografiado.
GROSSER, J.W.; GMITTER, F.G. 1990c. Wide-hybridization
GALUN. E.: AVIV, D. 1986. Organelle transfer. In Plant mo- of Cilru.v via protopla.~t fusion: progress, strategies, and
lecular biology. Methods in enzymology. Ed. by A. limitations. In Horticultural Biotechnology, plant bio-
Weissbach, H. Weissbach. Orlando, Fla., Academic logy. Ed. by A.B. Bennett, S.D. O'Neill. N.Y., Wiley-
Press.v.118,p.595-611 Liss.v.25,p.31-4l.
GALUN, E.; AVIV, ,0.; BREIMAN, A.; FROMM, H.; PERL, GROSSER, J.W.; GMIlTER, F.G,; CHANDLER, J.L. 1988a.
A.; VARDI, A. 1987. Cybrids in Nic{)liana, S{)lanum Intergeneric somatic hybrid plants of Citru.~ .~inen,vi.~
and Cilru.v: isolation and characterization of pla.~tome cv. Hamlin and P{)nciru.~ Irifmiata cv. Flying Dragon.
mutants, pre-fusion treatments, selection and analysis Plant Cell Rep. 7;5-8.
of cybrids. In Plant Molecular Biology. Ed. by D.
Wettsteim, N.H. Chua, N.Y., Plenum Press. p. 199-207,
GROSSER, J.W.; GMITTER, F.G.; CHANDLER, J.L. 1988b.
GENTILE, A.; TRIBULATO, E.; DENG. Z.N.; GAI,.UN, E.; Intergeneric somatic hybrid plants from sexually in-
FLUHR, R.; V ARDI, A, 1993. Nucellar callus of compatible woody species: Cilru.~ .~inen,~i.v and Severi-
'Femminello' lemon, selected for tolerance to Ph{)ma nia di.~licha. Theor. Appl. Genet. 75:397-401.

202 AGRONOMIA COSTARRICENSE
GROSSER. J.W.; MOORE, G.A.; GMITTER, F.G. 1989. In- KOBAYASHI. S.; IKEDA, I.; NAKATANI, M. 1984. Inducterspecific
somatic hybrid plants from the fusion of tion of nucellar callus from orange (Citrus .l'inensi.1'
'Key' lime (Citru.1' aurantifolia) with 'Valencia' sweet Osb.) ovules, and uniformity of regenerated plants.
orange (Citru.1' .l'inen.l'i.l') protoplasts. Sci. Hort. 39:23-
29.
Bull. Fruit Tree Res. Stn. (Jap6n) E 5:43-54.
KOBAYASHI, S.: IKEDA, I.; UCHIMIYA, H. 1985. Condi-
GROSSER, J.W.; GMITTER, F.G.; LOUZADA, E.S.; tions for high frequency embryogenesis from orange
CHANDLER, J .L. 1992a. Production of somatic hybrid (Citru.1' .l'inen.l'i.1' Osb.) protopla.~ts. Plant Cell Tiss. argo
and autotetraploid breeding parents for seedless citrus
development. HortScience 27(10):1 125-1127.
Cult. 4:249-259.
KOBA Y ASHI, S.; UCHIMIY A, H.; IKEDA, I. 1983. Plant re-
GROSSER, J.W.; GMITTER. F.G.; TUSA, N.:CHANDLER, generation from 'Trovita' orange protoplasts. Japan J.
J.L. 1990. Somatic hybrid plants from sexually incom- Breed. 33(2):1 19-122.
patible woody species: Citru.1' reticulata and Citrop.l'i.1'
8illetiana. Plant Cell Rep. 8:656-659. KOBA Y ASHI, S.; FUJIWARA, K.; OIY AM A, I.; OHGA-
WARA, T.; ISHII, S. 1988a. Somatic hybridization
GROSSER, J.W.; GMITTER. F.G.; SESTO, F.; DENG, X.X.; between Navel Orange and 'Murcott' Tangor. In Proc.
CHANDLER, J.L. I 992b. Six new somatic citrus hy- 6th Int. Citrus Congr. Ed. by R. Goren, K. Mendel. Tel
brids and their potential for cultivar improvement. J.
Amer. Soc. Hort. Sci. 117(1):169-173.
Aviv. p. 135-140.
KOBAYASHI, S.; OHGAWARA, T.; OHGAWARA, E.; 01-
HIDAKA. T.; KAJIURA, I. 1988. Plantlet differentiation from Y AMA, I.; ISHII, S. 1988b. A somatic hybrid plant obcallus
protoplasts induced from Citru.1' embryo. Sci. tained by protopla.~t fusion between navel orange (Ci-
Hort.34:85-92.
HIDAKA, T.; OMURA, M. 1989. Control of embryogenesis in
tru.1' .l'inen.l'i.l') and satsuma mandarin (C. un.l'hiu). Plant
Cell Tiss. argo Cult. 14:63-69.
Citru.1' cell culture: Regeneration from protopla.~ts and KOCHBA, J.; SPIEGEL-ROY, P. 1973. Effect of culture meattempts
to callus bank. Bull. Fruit Tree Res. Stn. B dia on embryoid formation from ovular callus of 'Sha-
16:1-17. mouti' orange (Citru.1' .l'inen.l'i.I'). Z. Pflanzenziicht.
69:156-162.
HIDAKA, T.; OMURA, M. 1992. Regeneration of somatic hybrid
plants obtained by electrical fusion between Satsu- KOCHBA, J.; SPIEGEL-ROY, P.; SAFRAN, H. 1972. Advenma
Mandarin (Citru.1' un.l'hiu) and Rough Lemon (C. tive plants from ovules and nucelli in Citrus. Planta
jambhiri) or Yuzu (C. juno.I'). Japan J. Breed. 42(1):79-
89.
106:237-245.
KUNITAKE, H.; KAGAMI, H.; MIl, M. 1991. Somatic embr-
HIDAKA, T.; OMURA, M. 1993. Transformation of Citrus ~ogenesi~ and plant regeneration. from protop~asts of
protopla.~ts by electroporation. J. Japan Soc. Hort. Sci. Satsuma mandann (Cltru.1' un.l'hlu Marc.). SCI. Hort.
62(2):371-376. 47:27-33.
HUTCHISON, D.J. 1985. Rootstock development screening LING, J: T.; NITO, N.; IWAMASA, M. 1?89. Plant regeneraand
selection for disease tolerance and horticultural tl~n from p~toplast~ of Calamondln (Cltru.1' madurencharacteristics.
Fruit Vat. J. 39:21-25. .1'1.1' Lour.). SCI. Hort. 40:235-333.
JIMENEZ, '!. M.; GU~V AR~, E. 199.5. Regene~ci6n in vitr~
LING, J.T.; NITO, N.; IWAMASA, M.; KUNITAKE, H.
1990. Plant regeneration from protoplasts isolated from
medIante embnogenesls somatlca de vanedades de CI- embryogenic callus of 'Satsuma'. HortScience
tricos. I. Obtenci6n de callo friable y suspensiones celulares
de naranja dulce (Citrus .l'inensi.l') y naranja
25(8):970-972.
agria (C. aurantium) cultivadas en Costa Rica. Agrono- LOUZADA, E.S.; GROSSER, J.W.; GMITTER, F.G. 1993.
mfa Costarricense 19(2):7-18, Intergeneric somatic hybridization of sexually incompatible
parents: Citru.1' .l'infn.l'is and Atalantia ceylanica.
KOBAYASHI, S. 1987. Uniformity of plants regenerated from Plant Cell Rep. 12:687-690.
orange (Citrus sinen.l'is Osb.) protoplasts. Theor. Appl.
Genet. 74:10-14. LOUZADA,E.S.;GROSSER, J.W.; GMITTER, F.G.; NIEL-
SEN, B.; CHANDLER, J.L.; DENG, X.X.; TUSA, N.
KOBA Y ASHI, S.; OHGA W ARA, T. 1988. Production of so- 1992. Eight new somatic hybrid citrus rootstocks with
matic hybrid plants through protoplast fusion in Citrus. potential for improved disease resistance. HortScience
J. Agr. Rev. Quarterly 22:181-188. 27(9):1033-1036.
KOBAYASHI,S.;UCHIMIYA,H.1989.Expressionandinte- LUCRETTI, S.; LISTER, A.; CHAPMAN, J.V.; MORETTI,
gration of a foreign gene in orange (Citrus sinensis F.; DE GIAC

JIMENEZ: EI cultivo de protoplastos en cftricos y su potencial para el mejoramiento genetico 203
NADEL, B,; SPIEGEL. ROY, P. 1987. Selection of Citru.v Li- tion of transgenic plants. MS thesis. University of Flomon
cell culture variant.. resistant to the Mal Secco to- rida, Gainesville, FL.
xin. Plant Sci. 53: 177-182.
SHINOZAKI, S.; FUJITA, K.; HIDAKA, T.; OMURA, M.
NIEDZ, R. P. 1993. Culturing embryogenic protoplasts of 1992. Plantlet formation of somatic hybrids of sweet
'Hamlin' sweet orange in calcium alginate beads. Plant orange (Citru.v .vinen.vi.vf and its wild relative, orange
Cell Ti.ss. argo Cult. 34( I): 19-25.
NIEDZ, R.I;>. 1994. Growth of embryogenic sweet orange ca-
Jessamine (Murraya panicuLata), by electrically-induced
protopla...t fusion. Japan J. Breed. 42(2):287-295.
llus on media varying in the ratio of nitrate to ammo- SIM, G.E.; LOH, C.S.; GOH, C.J. 1988. Direct somatic embrnium
nitrogen. Plant Cell Tiss. argo Cult. 39: 1-5. yogenesis from protop]asts of Citru.v miti.v Blanco.
Plant Cell Rep. 7:418-420.
OHGAWARA, T.; KOBAYASHI, S. 1991. Application of
protoplast fusion to Citru.v breeding. Food Biotechno- SINGH, A.K.; NITO, N.; IWAMASA, M. 1992. Influence of
logy 5(2):] 69-184. lactose and glycerol on growth and somatic embryogenesis
of citrus callus. Acta Hort. 321 :606-609.
OHGAWARA, T.; KOBAYASHI, S.; ISHII, S.; YOSHINA-
GA, K.; OIYAMA, I. 1989. Somatic hybridization in SWINGLE, W.T.; REECE, P.C. 1967. The botany of citrus
Citrus: nave] orange (Citru.v .vinen.vi.v Osb.) and grape- and its wild relatives. In The Citrus Industry. Ed. by W.
fruit (Citru.v paradi.vi Macf). Theor. Appl. Genet. Reuther, L.D. Batchelor, H.J. Weber. Berke]ey, Cal.,
78(5):609-612. Univ.ofCalifomiaPress.v.l,p.190-430.
OHGAWARA, T.; KOBAYASHI, S.; ISHII, S.; YOSHINA- TAKAYANAGI, R.; HIDAKA, T.; OMURA, M. 1992. Rege-
GA, K.; OIYAMA, I. 199]. Fertile fruit trees obtained neration of intergeneric somatic hybrids by electrical
by somatic hybridization: navel orange (Citru.v .vinen- fusion between Citru.v and its wild relatives: Mexican
.vi.v) and Troyer citrange (C. .vinensi.v x Ponciru.v trifoLia- lime (Citru.v aurantifolia) and Java Feroniella (Ferlmiefa).
Theor. Appl. Genet. 81:14]-143. I/a Lucida) or Tabog (SwingLea gLutinll.va). J. Japan Soc.
Hort. Sci. 60(4):799-804.
OHGAWARA, T.; KOBAYASHI, S.; OHGAWARA, E.;
UCHIMIYA, H.; ISHII, S. 1985. Somatic hybrid plant.. TUSA, N.; GROSSER, J.W.; GMITTER, F.G. 1990. Plant reobtained
by protoplast fusion between Citrus .vinensi.v generation of 'Valencia' sweet orange, 'Femminello'
and Ponciru.v trifoliata. Theor. Appl. Genet. 71: 1-4. lemon, and the interspecific somatic hybrid following
protopla...t fusion. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 115(6):1043-
OIY AMA, I.; OKUDAI, N. 1986. Production of colchicine-in- 1046.
duced autotetra~loi~ plants through micrografting in TUSA, N.; GROSSER, J.W.; GMITTER, F.G.; LOUZADA,
monoembryoDlc cItrus cultlvars. Japan J. Breed. E.S. 1992. Production of tetraploid somatic hybrid
36(3):371-376. breeding parents for use in lemon cultivar improvement.
HortScience 27(5):445-447.
PASQUAL, M.; ANDO, A. 1990. Influencia da irradia~ilo gama
na produ~ilo de calos nucelares de Citru.v .vinensi.v V ARDI, A. 1981. Protoplast derived plants from different Ci-
Osb. cV. Valencia in vitro. Pesq. Agrop. Bras. tru.v species and cultivars. Proc. Int. Soc. Citriculture
25(10):1471-1475. 1:149-152.
ROEST, S.; GILISSEN, L.J.W. 1993. Regeneration of proto- V ARDI, A.; GALUN, E. 1988. Recent advances in protoplast
plasts--supp]ementary literatllre review. Acta Bot. culture of horticultural crops: Citru.v. Sci. Hort. 37:217-
Neerlandica42(1):1-23. 230.
SAITO, W.; OHGAWARA, T.; SHIMIZU, J.; ISHII, S. 1991. VARD!, A.; RAVEH, D. 1976. Cross-feeder experiments bet-
Acid citrus somatic hybrids between sudachi (Citrus .vu- ,,:,een tobacco and orange protopl~lstS. Z Pflanzenphydachi
Hort. ex Shirai) and lime (C. aurantifolia Swing.) sI01.78:350-359.
produced by e]ectrofusion. Plant Sci. 77:125-130. V ARD!, A.; BLEICHMAN, S.; AVIV, D. 1990. Genetic trans-
SAITO, W.; OHGAWARA, T.; SHIMIZU, J.; KOBAYASHI, formati~n of Citru.f prot?pla~ts and regeneration of
S 1994 S . h b ' d ' . . C . . b transgemcplants.PlantScl.69.199-206.
. . omatlc y n lzatlon m Itrus usmg em ryogenic
cybrid callus. Plant Sci. 99:89-95. V ARD!, A.; BREIMAN, A.; GALUN, E. 1987. Citru.v cybrids:
production by donor-recipient protoplast-fusion and ve-
SAITO, W.; OHGAWARA, T.; SHIMIZU, J.; ISHII, S.; KO- rification by mitochondrial-DNA restriction profiles.
BA Y ASHI, S. 1993. Citrus cybrid regeneration follo- Theor. Appl. Genet. 75:5 I -58.
wing cell fusion between nucellar cells and mesophyll
cells. Plant Sci. 88:195-201. VARD!, A.; HUTCHISON, D.J.; GALUN, E. 1986. A protoplast-to-tree
system in Microcitru.v ba...ed on protoplasts
SCHELL, J. 1991. Genetic transformation of citrus protoplasts derived from a sustained embryogenic callus. Plant
by PEG-mediated direct DNA uptake and the regenera- Cell Rep. 5:412-414.

~
204 AGRONOMIA COSTARRICENSE
YARDI, A.: SPIEGEL-ROY, P.; GALUN, E. 1975. Citru.v cell YARDI, A.; SPIEGEL-ROY, P.; BEN-HA YYIM, G.; GAcultul-e:
isolation of protoplasts, plating densities, effect LUN, E. 1982a. Protoplast derived plants and fusion
of mutagens and regeneration of embryos. Plant Sci. experiments in different Citrus species. Proc. 5th IntI.
Lett. 4:231-236. Congo Plant Tissue & Cell Culture. p. 619-620.
YARDI, A.; SPIEGEL-ROY, P.; GALUN, E. 1982b. Plant re- YARDI, A.; ARZEE-GONEN, P.; FRYDMAN-SHANI, A.;
generation from Citru.v protoplasts: variability in met- BLEICHMAN, S.; GALUN, E. 1989. Protoplast-fuhodological
requirements among cultivars and species. sion-mediated transfer of organelles from Microcitrus
Theor. Appl. Genet. 62: 171-176. into Citru.vand regeneration of novelallopla.'imic trees.
Theor. A I. Genet. 78:741-747.
..
,