Dr. Rafael Franco Fernández Facultat de Química / UB

PAPER DELS HETERÒMERS CXCR4/CD26 EN LA FUNCIONALITAT
DELS LIMFÒCITS T I EN L’ENTRADA I INFECTIVITAT DEL VIH
Investigador principal: Dr. Rafael Franco Fernández
Centre: Facultat de Química. Universitat de Barcelona
Durada: 3 anys
MEMÒRIA FINAL
1. Resum
Objectiu1. Determinar d’una manera precisa el paper dels heteròmers
CXCR4/CD26 en la funcionalitat dels limfòcits T. S'investigarà amb detall
de quina manera l'activació dels receptors CXR4, en presència d'ADA o en
la d'inhibidors de CD26/DPP IV, afecta l'activació i la migració de limfòcits,
com també la dessensibilització i el tràfic de CXCR4 i de CD26/DPP IV. Es
correlacionaran els resultats obtinguts i el contingut en CD26/DPP IV dels
diversos clons de cèl·lules T.
Objectiu 2. Estudiar el paper coestimulador del complex ADA/CD26 en la
proliferació limfocitària i en la producció de citocines en cocultius de
cèl·lules dendrítiques i limfòcits T en individus sans i en individus infectats
amb VIH amb grau diferent de virèmia i diversitat de contingut de
limfòcits T. S'investigarà com la proteïna gp120 afecta la proliferació
1

limfocitària induïda per ADA. Es correlacionaran els resultats obtinguts
amb la virèmia i el contingut en CD4 i CD26/DPP IV dels diversos clons de
cèl·lules T.
Breu síntesi del disseny, procediment i mètodes
Els receptors de quimiocines són explotats pel VIH-1 per entrar dins les
cèl·lules i per a la transmissió de la malaltia. Recentment hem aportat
evidències convergents i múltiples de la interacció entre el receptor de
quimiocines CXCR4 i CD26. CD26, una peptidasa de membrana, produeix
dipèptids a partir de la part N-terminal de cadenes polipeptídiques. CD26
codistribueix amb CXCR4, i ambdós coimmunoprecipiten a partir de les
membranes de línies de cèl·lules T i codistribueixen i cointernalitzen en
limfòcits de sang perifèrica. Per altra banda, nosaltres hem demostrat que
SDF-1α i gp120 indueixen l'aparició de pseudopòdia en la que CD26 i
CXCR4 colocalitzen i en la qual l'ADA, enzim que interacciona amb CD26 i
participa en l’activació de cèl·lules T, no està present. L'associació física de
CXCR4 i CD26, directa o com a part d'una estructura supramolecular en la
qual també està present l’ADA, suggereix un paper essencial en el
funcionament del sistema immunològic i en la patofisiologia de la infecció
pel VIH. Aquesta hipòtesi es provarà en models cel·lulars humans:
limfòcits T de sang perifèrica i cocultius de cèl·lules dendrítiques i limfòcits
T. Les tècniques que s’empraran són les pròpies de bioquímica molecular i
cel·lular i immunologia, com electroforesi i Western blot,
immunocitoquímica, FACS, tècniques de determinació de segons
missatgers, FRET, FLIM, tècniques de determinació de citocines i
tècniques de caracterització d’apoptosi, entre d’altres.
Breu síntesis del pla de treball
Activitat 1. Determinar de manera precisa el paper dels heteròmers
CXCR4/CD26 en la funcionalitat dels limfòcits T. S'investigarà amb detall
de quina manera l'activació dels receptors CXCR4, en presència d'ADA o
2

en la d'inhibidors de CD26/DPP IV, afecta l'activació i la migració de
limfòcits, com també la dessensibilització i el tràfic de CXCR4 i de
CD26/DPP IV. Es correlacionaran els resultats obtinguts i el contingut en
CD26/DPP IV dels diversos clons de cèl·lules T.
Tasca 1.1. Estudis d'heteromerització, coexpressió i dessensibilització.
Tasca 1.2 Estudis de senyalització cel·lular.
Tasca 1.3 Estudis de migració.
Activitat 2. Estudiar el paper coestimulador del complex ADA/CD26 en la
proliferació limfocitària i en la producció de citocines en cocultius de
cèl·lules dendrítiques i limfòcits T en individus sans i en individus infectats
amb VIH amb diferent grau de virèmia i diferent contingut de limfòcits T.
S'investigarà com la proteïna gp120 afecta la proliferació induïda per ADA.
Es correlacionaran els resultats obtinguts i el contingut en CD4 i
CD26/DPP IV dels diversos clons de cèl·lules T.
Tasca 2.1 Efecte de la interacció ADA/CD26 en la proliferació de limfòcits T.
Tasca 2.2 Efecte de la interacció ADA/CD26 en la proliferació de limfòcits
T en individus infectats per HIV
Tasca 2.3 Estudis de senyalització cel·lular en limfòcits d’individus sans o
en pacients de sida, activats amb anti-CD3 en presència o absència d’ADA
Tasca 2.4 Anàlisi de la producció de citocines en cocultius de cèl·lules
dendrítiques i limfòcits T en individus sans i en individus infectats amb VIH
amb grau diferent de virèmia i diversitat de contingut amb limfòcits T.
2. Resultats
S’ha pogut demostrar, mitjançant la tècnica de FLIM (Fluorescence
lifetime imaging microscopy, una variant de FRET), que el CD26 i el
CXCR4 interaccionen molecularment. La interacció entre el CD26 i el
3

CXCR4 no indueix cap cross-talk d’aquestes dues proteïnes en
senyalització intracel·lular (mobilització de calci i fosforilació d’ERK 1/2) i
que ambdues senyalitzacions intracel·lulars induïdes per activació de
CXCR4 no es modifiquen per la unió d'adenosina desaminasa (ADA) al
CD26. Malgrat això, s’ha pogut demostrar que el CD26, l’ADA i els
receptors d’adenosina exerceixen un nou paper coestimulador en la
sinapsi immunològica. S’han fet experiments de cocultiu de cèl·lules
dendrítiques de donants sans amb limfòcits del mateix donant. Aquests
cocultius serveixen per estudiar la immunosinapsi i s’ha determinat el
paper de l’ADA i del CD26 en la proliferació dels limfòcits i en la producció
de citocines en la immunosinapsi (Pacheco et al. [2005] CD26, adenosine
deaminase and adenosine receptors mediate novel co-stimulatory signals
in the immunological synapse. Proc. Nat. Acad. Sci. 102, 9583-9488).
Els limfòcits T necessiten dos senyals quan interaccionen amb les cèl·lules
presentadores d'antigen per a una activació correcta i la resposta
posterior. Un primer senyal és el mateix reconeixement antigènic, i l'altre
senyal ve donat pel coestímul que exerceix la interacció de certs receptors
de la cèl·lula presentadora amb el limfòcit T. Aquest segon senyal és crític,
atès que, si no es produeix, els limfòcits T resten anèrgics. En aquest
marc, els nostres resultats han estat rellevants per entendre alguns
processos implicats en la interacció entre cèl·lules dendrítiques i limfòcits
T (Pacheco et al. [2005] Role of CD26-adenosine deaminase interaction in
the T cell-mediated immunity. Inmunología 24, 235-245).
S’ha posat de manifest que l’ADA estimula també la proliferació induïda en
activar el CD3 de limfòcits T aïllats de pacients de sida (cohort de 30
pacients), tot correlacionant directament amb el contingut en CD4 i
inversament amb la càrrega vírica dels pacients. L’ADA incrementa la
producció d’INF-g d’IL-6 i de TNF-a en pacients de sida. S’ha comprovat
en donants sans que tant la proliferació com la producció de citocines
induïdes per ADA disminueix en presència de la proteïna viral gp120, ja
que la proteïna gp120 desplaça l’ADA del seu centre d’interacció amb el
CD26. Aquesta disrupció pot constituir un nou mecanisme per explicar en
4

part les alteracions immunològiques observades en pacients de sida
(Martínez-Navío et al., comunicació acceptada per presentar al CROI,
200714th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, i
treball en fase d’escriptura). Igual que amb individus sans, s’han fet
experiments de cocultiu de cèl·lules dendrítiques d’individus infectats amb
VIH (cohort de 30 pacients) amb limfòcits del mateix donant per estudiar
la immunosinapsi. S’ha posat de manifest que l’ADA té un paper
coestimulador de la proliferació limfocitària molt més gran en pacients de
sida que en donants sans, sempre que el pacient estigui en tractament i la
seva càrrega vírica sigui baixa. En fer els cocultius amb limfòcits T
CD45RA + purificats, s’observa que l’ADA indueix el pas a memòria
(CD45RO + , CD25 + ) i que aquest procés està mediat principalment per
l’augment en l'alliberament d’IL-6 provocat per l’ADA. Al mateix temps
l’ADA afavoreix la supervivència dels limfòcits T, ja que té un paper
antiapoptòtic. Tots aquests resultats fan de l’ADA una molècula candidata
a ser considerada com a part d'una possible vacuna terapèutica basada en
la presentació d'antígens vírics per part de cèl·lules dendrítiques (treball
de Martínez-Navío et al. en fase de finalització i escriptura).
Durant els estudis d’activació limfocitària vam descobrir que els limfòcits T
expressen receptors metabotròpics de glutamat 1 i 5 i que aquests
receptors tenen un paper molt rellevant en la senyalització i en la
proliferació limfocitària (Pacheco et al. [2004] Group I metabotropic
glutamate receptors mediate a dual role of glutamate in T cell activation.
J. Biol. Chem. 279. 33352–33358).
Durant el procés d’immunosinapsi són les cèl·lules dendrítiques les que
lliuren glutamat capaç d’activar els receptors dels limfòcits T i modular la
producció de citocines i la diferenciació a Th1 (Pacheco et al. (2006)
Glutamate Released by Dendritic Cells as a Novel Modulatorof T Cell
Activation. J. Immunol., 2006, 177: 6695–6704).
Tots aquests resultats han permès formular una nova visió de conjunt
sobre com un petit neurotransmissor com el glutamat pot actuar com a
5

mediador de la immunosinapsi (Pacheco et al. (2007) Role of glutamate
on T-cell mediated immunity J. Neuroimmunol; en premsa). Haver
descobert noves molècules implicades en la immunosinapsi obre noves
vies d’estudi dels processos d’activació limfocitària en malalts de sida i
especialment en el desenvolupament de vacunes.
3. Rellevància i possibles implicacions clíniques dels resultats
finals obtinguts
La rellevància dels resultats deriva d'un avenç significatiu en el
coneixement de l’activació dels limfòcits T, tant en condicions fisiològiques
com en una situació d'immunodeficiència com la que es presenta després
de la infecció produïda pel VIH. El model que hem emprat en el projecte
ha estat el més fisiològic, atès que hem emprat cèl·lules dendrítiques de
donants humans (donants sans i pacients de sida) que presentaven
antígens a cèl·lules T del mateix donant. També cal destacar que les
condicions emprades han estat GLP, pensant en la possibilitat que els
resultats puguin donar lloc a noves estratègies terapèutiques per
combatre el sida. Les noves molècules importants per a l’activació de la
proliferació limfocitària, com l’ADA, el CD26 i els receptors metabotròpics
de glutamat i el seu paper en la producció de citocines, són de gran
importància no només des d'un punt de vista acadèmic, sinó des d'un
punt de vista clínic i de cara al desenvolupament de vacunes antisida.
6

4. Publicacions
Rodrigo Pacheco, Francisco Ciruela, Vicent Casadó, Josefa Mallol, Teresa
Gallart, Carmen Lluís, and Rafael Franco (2004)
Group I metabotropic glutamate receptors mediate a dual role of
glutamate in T cell activation.
J. Biol. Chem. 279. 33352–33358
Pacheco R., Martínez-Navio J. M., Lejeune M., Climent N., Oliva H., Gallart
T., Mallol J., Lluís C. and Franco R. (2005)
CD26, adenosine deaminase and adenosine receptors mediate novel co-
stimulatory signals in the immunological synapse.
Proc. Nat. Acad. Sci. 102, 9583-9488
Rodrigo Pacheco, Carmen Lluís and Rafael Franco (2005)
Role of CD26-adenosine deaminase interaction in the T cell-mediated
immunity. Inmunología 24, 235-245
Rodrigo Pacheco, Harold Oliva, Jose M. Martínez-Navıo, Nuria Climent,
Francisco Ciruela, Jose M. Gatell, Teresa Gallart, Josefa Mallol, Carmen
Lluís, and Rafael Franco (2006)
Glutamate Released by Dendritic Cells as a Novel Modulatorof T Cell
Activation.
J. Immunol., 2006, 177: 6695–6704.
Rodrigo Pacheco; Teresa Gallart; Carmen Lluís; Rafael Franco (2007)
Role of glutamate on T-cell mediated immunity.
J. Neuroimmunol (en premsa).
7