Prácticas de Microbiología - IMB: Instituto de Microbiología ...

Prácticas de Microbiología
2º Curso (Lic. Biología)
Departamento de Microbiología y Genética
Universidad de Salamanca

Práctica 1
TÉCNICAS DE MICROBIOLOGÍA BÁSICA: AISLAMIENTO Y
RESIEMBRA DE MICROORGANISMOS, MANEJO DEL
MICROSCOPIO ÓPTICO y TINCIONES.
Introducción
1. Obtención y mantenimiento de cultivos puros
El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones
extensas y homogéneas del microorganismo a estudiar. Por lo tanto, el microbiólogo utiliza
técnicas que permiten obtener un cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho
microorganismo.
Para obtener cultivos puros se han de utilizar instrumentos estériles, es decir, libres
de otros microorganismos no deseados (contaminantes). La esterilidad se consigue por
diferentes métodos:
1. Calor seco. Para material de vidrio y de metal. Estos objetos (envueltos en papel o
aluminio) se someten a una temperatura de 170°C durante al menos 90 minutos.
2. Calor húmedo. Se utiliza para soluciones acuosas y plásticos. Este material se somete a
una temperatura de 120°C durante 20 minutos en una atmósfera de vapor de agua a
elevada presión, lo cual evita la ebullición. Se realiza en el autoclave.
3. Filtración. Para esterilizar soluciones termolábiles, a las que se hace pasar a través de un
filtro con un tamaño de poro que permite el paso de la solución, pero no de los
microorganismos.
4. Esterilización química. Se utiliza para esterilizar material (generalmente algunos tipos
de plástico) termolábil. Se utilizan sustancias como el óxido de etileno, que se eliminan
una vez finalizado el proceso de esterilización.
5. Radiación. La radiación UV o las radiaciones α o γ pueden utilizarse para esterilizar
habitaciones o algunos plásticos.
Para poder estudiar los microorganismos en el laboratorio el microbiólogo también debe
utilizar medios de cultivo que posean los nutrientes necesarios para el crecimiento de los
mismos. Si los nutrientes están en forma de solución acuosa hablamos de medios de cultivo
líquidos, mientras que si añaden solidificantes, como la gelatina o el agar (2-3%), obtenemos
medios de cultivo sólidos. A veces se utilizan medios de cultivo semisólidos, si la
concentración de agar es 0,6-1,5%. Los medios de cultivo se esterilizan mediante calor
húmedo.
Para aislar un microorganismo de una mezcla de varios y obtener un cultivo puro del
mismo, la técnica más utilizada es la de siembra por estría en placa Petri, en medio sólido,
que permite obtener colonias separadas de individuos que proceden por división de una única
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célula. Estas colonias nos sirven para iniciar un cultivo a gran escala. Otra técnica consiste en
obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se
vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.
Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos
de agar inclinado o bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -80°C, en nitrógeno
líquido a -173°C, o mediante liofilización.
2. El microscopio
El microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, ya que permite la
observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de
los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de
iluminación utilizada, se agrupan en:
• Microscopios ópticos: La fuente de iluminación es la luz.
De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastadas
mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante.
De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre
un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales.
De contraste de fases. Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos especiales, que
consiguen aumentar las diferencias en el índice de refracción de las células y el medio que
las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no es necesario realizar ninguna
tinción de las mismas.
De interferencia. Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una imagen en
relieve de las mismas.
De fluorescencia. La luz ultravioleta que excita ciertas moléculas presentes en las células
(bien de forma natural o añadidas a la preparación) que emiten fluorescencia en el espectro
visible.
Confocal. Permite obtener imágenes bi y tridimensionales de alta resolución. Es un
microscopio computerizado que acopla un láser a un microscopio óptico obteniéndose
imágenes fluorescentes. Análisis digital por ordenador. Tiene un diafragma especial
llamado pinhole que elimina la señal de las regiones que se encuentran fuera de foco.
• Microscopios electrónicos: La fuente de iluminación es un chorro de electrones
y las lentes son electroimanes.
De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que son
resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadas
cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que éstos se envían a una
pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el número de electrones que
inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente impedirán el paso
de electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas
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estructuras aparecerán oscuras en un fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y
100.000 aumentos.
De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes finos, de
modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000
y 10.000 aumentos.
Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos componentes
fundamentales (mecánicos, de iluminación y ópticos) se muestran en la Figura.
Oculares
Objetivos
Pletina móvil
Condensador
Diafragma
Filtros
Tornillos de enfoque
Fuente de iluminación
Soporte
Esquema del microscopio óptico
La capacidad de un microscopio para observar diferentes estructuras se refleja en el número
de aumentos y en el límite de resolución (LR).
• El número de aumentos de un microscopio resulta de multiplicar los aumentos que
proporciona cada una de las lentes presentes entre la fuente de iluminación y la lente
ocular.
• El límite de resolución (LR) se define como la distancia mínima a la que se deben
encontrar dos puntos para que puedan observarse separados. El microscopio es mejor
cuanto menor sea el LR del mismo. El LR viene definido por la fórmula:
LR = λ / 2nsenθ
λ: longitud de onda de la fuente de iluminación.
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2nsenθ: apertura numérica. Está definida por el valor de 2senθ (característica de
cada microscopio y no se puede variar) y n, el índice de refracción del medio.
Por lo tanto si queremos mejorar la capacidad de observación de un microscopio se debe
incrementar el número de aumentos y disminuir el límite de resolución (LR). Para
conseguir lo primero, casi todos los microscopios disponen de varias lentes que se pueden
cambiar según el tamaño de la muestra a observar. Para disminuir el LR podemos utilizar una
fuente con menor longitud de onda (el caso extremo es el de los microscopios electrónicos) o
bien aumentar n, para lo que podemos intercalar entre la preparación y el objetivo un medio
más denso que el aire. Normalmente se utiliza aceite de inmersión. Es importante recordar
que no todos los objetivos son impermeables al aceite. En los microscopios que se utilizarán
en las prácticas, ¡¡sólo puede utilizarse el aceite de inmersión con el objetivo de 100 ×!!.
2. Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:
Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos
entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente.
Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota
de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos). Después se
tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y,
habitualmente, con objetivos de inmersión.
3. Tinciones
Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los
mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la
célula y del colorante. Los colorantes pueden ser de distintos tipos:
Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y
las tiñen. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta, safranina.
Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las
células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: eosina,
nigrosina.
Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: negro sudán.
Las tinciones pueden ser:
Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una
composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de
forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno,
safranina) o no (nigrosina).
Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta
composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo
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que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de
tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la
tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones
utilizan más de un colorante.
Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta
composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej;
tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos.
Pueden utilizarse uno o más colorantes.
Objetivos
1. Obtención de cultivos puros de microorganismos mediante estría en medio sólido y
mantenimiento de los mismos en tubos de agar inclinado.
2. Manejo del microscopio óptico de campo claro.
3. Realización de preparaciones húmedas de suspensiones de microorganismos y
tinciones que nos permitirán observar la forma y tamaño de distintos microorganismos,
así como algunas estructuras especiales (esporas en Bacillus y corpúsculos
metacromáticos en Lactobacillus). También realizaremos tinciones diferenciales que nos
permitirán clasificar microorganismos en distintos grupos (tinción de Gram y de ácidoalcohol
resistencia).
Materiales
Asa de siembra, placas de medio sólido y tubos de agar inclinado (Agar Nutritivo). Mechero
de alcohol. Microscopio óptico. Portaobjetos, cubreobjetos y colorantes. Suspensión de una
mezcla de microorganismos. Resiembras de microorganismos: Bacillus megaterium,
Escherichia coli, Micrococcus luteus, Serratia marcescens. Yogurt preincubado a 37°C.
Agar Nutritivo (AN)
Extracto de levadura 2 g/l
Extracto de carne 1 g/l
Peptona 5 g/l
ClNa 5 g/l
Agar 20 g/l
pH 7,4
Procedimiento
1. AISLAMIENTO
A partir de una suspensión de microorganismos se realizarán estrías sucesivas en placas de
medio sólido. Las placas se incuban luego a 28ºC durante 24 horas.
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2. RESIEMBRA
Mediante el asa de siembra se transfieren microorganismos desde unos tubos de agar
inclinados con la muestra a otros estériles. Luego se incuban a 28ºC durante 24 horas.
3. TINCIONES
• Simples
a) Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular. Tiñe
microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo se tiñen si están
muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos metacromáticos, se tiñen más
intensamente con este colorante que el resto de la célula.
Procedimiento
1. Extensión: poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra
(Escherichia y Bacillus ) utilizando el asa de siembra.
2. Fijación: pasar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero de alcohol,
sin permitir que llegue a hervir, hasta que se seque.
3. Añadir Azul de metileno y esperar 2 minutos.
4. Lavar con agua
5. Secar.
6. Observar primero con el objetivo 40×; luego se añade aceite de inmersión y se observa con
el objetivo 100×.
b) Nigrosina (Tinción negativa). Se trata de un colorante aniónico, que no penetra en el
interior celular. Proporciona una visión de la forma y el tamaño celulares al observarse los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Procedimiento
1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos.
2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra.
3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra
toda la superficie del primero.
4. Secar al aire.
5. Observar (primero 40× y luego 100× con aceite de inmersión).
• Selectivas
a) Tinción de corpúsculos metacromáticos en células de Lactobacillus.
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Procedimiento
1. Tomar una muestra de un yogurt con el asa de siembra y colocar en un portaobjetos.
2. Teñir con azul de metileno como se ha descrito anteriormente.
En esta preparación se observan dos microorganismos: Lactobacillus (con los corpúsculos
metacromáticos en su interior) y Streptococcus (forman cadenas).
b) Tinción de endosporas. Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se
caracterizan porque forman endosporas. Las endosporas son formas de resistencia que
garantizan la supervivencia de la especie en situaciones adversas (agotamiento de
nutrientes, cambios de temperatura, acumulación de metabolitos tóxicos...). Estas
estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el interior de
la célula bacteriana y cuando la célula muere y se lisa la endospora queda libre. Las
endosporas germinarán cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables.
Algunas enfermedades muy conocidas son producidas por especies de los géneros
Clostridium [ej. C. tetani (tétanos), C. perfringens (gangrena gaseosa) y C. botulinum
(botulismo)] y Bacillus [ej. B. anthracis (antrax)].
Procedimiento
1. Extensión (B. megaterium).
2. Fijación.
3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con
Verde malaquita y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de
vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama,
volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos.
4. Retirar el papel y lavar con agua.
5. Safranina 1 minuto.
6. Lavar con agua.
7. Secar.
8. Observar (100×).
• Diferenciales
a) Tinción de Gram. De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos
grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las
bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las
bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica
externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con
etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el
colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se
teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
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Procedimiento
1. Extensión de la muestra (Escherichia y Bacillus).
2. Fijación.
3. Cristal violeta 1-2 minutos.
4. Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!).
5. Añadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (¡No lavar con agua!)
6. Decolorar con etanol-acetona (20 segundos)
7. Lavar con agua.
8. Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto.
9. Lavar con agua.
10. Secar.
11. Observar (100×).
Membrana
externa
Gram(-)
Espacio
Periplásmico
Gram(+)
Peptidoglicano
Membrana
Plasmática
Gram (-)
Polisacárido O
Gram(-)
Núcleo Polisacarídico
Proteína
Peptidoglicano
Membrana Plasmática
Espacio periplásmico
Lipopolisacárido
y Proteína
Lípido A
Porina
Exterior
Lipopolisacárido
(LPS)
8 nm
Fosfolípido
Lipoproteína
Peptidoglicano
Membrana Plasmática
Interior
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Proteína asociada
a la pared
Gram (+)
Acidos Teicoicos
Peptidoglicano
Acidos
Lipoteicoicos
Membrana
Plasmática
b) Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen). Se basa en que ciertos
microorganismos no son desteñidos con alcohol ácido si han sido previamente teñidos con
fucsina fenicada. A estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes. Una
vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de
metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con alcohol ácido.
Son microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, debido a la
composición de su pared celular (tiene ácidos micólicos). Esta tinción tiene interés desde el
punto de vista del diagnóstico clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son
ácido-alcohol resistentes, tales como Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis) o M.
leprae (lepra).
Procedimiento
1. Extensión (Mycobacterium phlei y Micrococcus luteus).
2. Fijación.
3. Colocar un papel de filtro sobre la muestra y sujetarlo con una pinza. Empapar el papel con
Fucsina fenicada y pasarlo por encima de la llama del mechero para que haya emisión de
vapores. Cuando dejen de salir vapores volver a pasar la muestra por encima de la llama,
volviendo a empapar el papel con colorante si es necesario. Repetir hasta 5 minutos.
4. Quitar el papel de filtro y lavar abundantemente con agua.
5. Añadir ácido-alcohol y esperar 30 segundos.
6. Lavar con agua
7. Añadir azul de metileno (colorante de contraste) y esperar 1-2 minutos.
8. Lavar con agua.
9. Secar.
10. Observar (100×).
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Práctica 2
DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE UN MICROORGANISMO
Introducción
El crecimiento microbiano se define como un incremento en el nº de células, es decir, se
refiere al crecimiento de poblaciones. Este viene dado como consecuencia del crecimiento de
cada célula individual y su división celular. El crecimiento de un microorganismo depende de
varios factores como:
1. El microorganismo en sí. Así por ejemplo, en condiciones óptimas E.coli tiene un ciclo
de vida de 15-20 minutos, mientras que Mycobacterium tuberculosis lo tiene de 18 horas.
2. La composición del medio de cultivo. Las células crecerán más lentamente en un medio
mínimo (MM) que en un medio rico (MR) con todos los nutrientes. Dependiendo de la
fuente de carbono y de la facilidad con que la asimilen crecerán más o menos
rápidamente (por ejemplo, crecen mejor con glucosa (Glc) como fuente de carbono que
con galactosa (Gal).
3. Las condiciones de incubación. La temperatura de incubación, la concentración de CO2
en la atmósfera de cultivo, la agitación, etc... son factores importantes.
4. La procedencia y características del inóculo. La curva de crecimiento variará
dependiendo de que se parta de un cultivo estacionario o de uno en crecimiento
exponencial, que se pase un cultivo crecido en MM+Glc a MM+Gal o de MR a
MM+Glc.
Existen varios métodos para medir el crecimiento microbiano:
Métodos directos: son aquellos en los que se cuenta el nº total de células en un volumen
conocido y así se estima el nº total en la población. Entre ellos:
Recuento directo del nº de células al microscopio. Se utilizan portas especialmente
diseñados para el recuento celular y denominados cámaras de recuento. Existen varios tipos
de cámaras de recuento, una de ellas es la cámara Thoma que es la que nosotros utilizaremos.
Este método tiene el inconveniente de que no diferencia entre células viables y no viables. Es
poco preciso.
Contadores electrónicos. Las células son suspendidas en un fluido conductor que pasa
lentamente a través de una abertura fina por la que pasa una corriente eléctrica. Cada célula
que pasa produce un cambio en la conductividad y estos cambios o pulsos convenientemente
amplificados son registrados electrónicamente dando una medida directa del nº de células en
el medio. No diferencia entre células viables y no viables ni entre células o partículas inertes.
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Recuento de células viables. Haciendo diluciones apropiadas seguidas de siembra sobre
placas Petri podemos obtener crecimiento de colonias aisladas procedentes cada una de una
única célula. Si se multiplica por el factor de dilución tendremos el nº de células en cultivo.
Sólo detecta viables pero es un método lento y caro por el elevado número de placas que hay
que utilizar para que los resultados sean significativos.
Métodos indirectos: son aquellos que utilizan parámetros distintos del nº de células, pero
que pueden relacionarse de forma directa con éste (masa celular, actividad metabólica, etc..).
Ello es posible porque durante el crecimiento de un cultivo hay un aumento ordenado de todos
los constituyentes celulares y así la velocidad de crecimiento de la población puede estimarse
por la velocidad del incremento de cualquiera de estos parámetros. Entre los métodos
indirectos se encuentran:
Determinación del peso seco. Se trata de medir la masa celular presente en un cultivo y
estimar el nº de células proporcional a ésta.
Determinación del nitrógeno celular. Medir el contenido proteíco del cultivo.
Determinación del DNA
Determinación de una actividad metabólica según el tipo de microorganismo: consumo de
oxígeno (en aerobios), liberación de CO2 u otro producto de fermentación, aumento de la
concentración de alguna enzima constitutiva, incorporación en la célula de algún material
radiactivo, etc.
Medida de la turbidez del cultivo. Se basa en la capacidad de las células y partículas en
general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. Un cultivo celular aparece
turbio porque las células dispersan la luz que atraviesa la suspensión. La turbidez es
proporcional al número de células y puede medirse utilizando un espectrofotómetro. El
espectrofotómetro es un aparato que hace pasar la luz a través de una suspensión celular y
detecta la luz no dispersada.
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Este instrumento mide la relación de intensidad entre la luz incidente y la emergente después
de atravesar la muestra. Cuanto mayor sea el nº de células mayor es la turbidez del cultivo o
densidad óptica (DO) y menor la cantidad de luz no dispersada que emerge tras atravesar la
muestra. Por tanto, la DO de un cultivo es proporcional a la densidad celular. Sin embargo,
esto es así dentro de ciertos límites, puesto que a elevadas concentraciones pueden formarse
agregados celulares y producirse un efecto “pantalla” de unas células sobre otras (en el caso
de S. cerevisiae la relación entre la DO y la concentración de células es lineal hasta un valor
de DO de aproximadamente 0,3). Por tanto, en algunos casos será necesario diluir la muestra
antes de realizar la medida (ej. para hacer una dilución 1/10 se mezclaría 1 ml de cultivo con 9
ml de medio de cultivo o agua). Cuando la dilución sea alta (mayor de 1/10) conviene hacer
diluciones seriadas para reducir el error (ej. para una dilución 1/50 primero se hace una
dilución 1/10 y despues se hace una dilución 1/5 de la dilución 1/10).
Cálculo del tiempo de generación
El tiempo requerido para que una célula microbiana se divida dando lugar a dos células se
denomina tiempo de generación (g). Por tanto, g es el tiempo que necesita una población
para duplicar el nº de células. Si consideramos que entre un tiempo inicial (To) y otro final
(Tf) han transcurrido n generaciones, el valor de g se expresará como:
g = (Tf - To)/n (A)
Si inicialmente tenemos en el cultivo N0 células, después de la primera división el número de
células será N0 × 2 1 ; después de la segunda división N0 × 2 2 ; después de la tercera división N0
× 2 3 …….; después de n divisiones, el número final de células (Nf) será N0 × 2 n . Por tanto, se
trata de una progresión geométrica cuya sucesión se puede expresar como:
Nf = No × 2 n (B)
Despejando el valor de n se aplican logaritmos:
Log Nf = log(No × 2 n ) log Nf = log No + n log 2
n = (log Nf – log No)/log 2
Conocido el valor de n, lo sustituimos en la ecuación (A) y obtenemos el valor de g:
g = 0,3 (Tf - To)/ (log Nf – log No)
El crecimiento de una población en el que el número de células se dobla cada un tiempo g se
conoce como crecimiento exponencial y está representado por la ecuación (B).
Nº de Células
(escala aritmética)
Logarítmica
Aritmética
Tiempo (horas)
Nº de Células
(escala logarítmica)
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Sin embargo, cuando seguimos el crecimiento de una población microbiana, midiendo por
ejemplo su DO en función del tiempo, obtenemos su curva de crecimiento, que nos viene
dada por una gráfica del tipo:
El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma
exponencial. Esta gráfica es característica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los
nutrientes son limitados. En la curva se distinguen cuatro fases:
Fase de latencia. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de
incubación al que han sido transferidas. Las células no crecen inmediatamente sino después
de este tiempo de latencia. Las células son metabólicamente activas, se adaptan al medio y
eventualmente lo modifican. Para un mismo inóculo, esta fase de latencia varia dependiendo
del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubación.
Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las células se están dividiendo regularmente
a ritmo constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es
máximo. Es en este periodo donde puede calcularse el tiempo de generación de un
microorganismo.
Fase estacionaria. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio se
van agotando y posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose. No hay incremento neto
del nº de células, el nº de células que se originan es igual al nº de las que mueren.
Fase de muerte celular. Las células mueren a una velocidad mayor a la que se originan
debido al agotamiento total de los nutrientes y/o excesiva acumulación de sustancias tóxicas.
A veces la muerte va acompañada de lisis celular y ésto disminuye la absorbancia del cultivo.
Objetivos
Fases de Crecimiento
Latencia Exponencial Estacionaria
Viables
Tiempo
1. Medir el crecimiento de una población microbiana (S.cerevisiae) utilizando dos métodos
distintos: Medir de la turbidez del cultivo (método indirecto) y recuento del nº de
células al microscopio (método directo)
2. Determinar el tiempo de generación de la población (S.cerevisiae).
Muerte
Turbidez
(D.O.)
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Materiales
Inóculo de Saccharomyces cerevisiae 1 ml (DO: 1,25). Matraz con 25 ml de medio YED
(extracto de levadura y glucosa). Pipetas estériles, cámara de recuento (Cámara Thoma),
microscopio óptico, espectrofotómetro. Mecheros de alcohol, incubadores a 28 ºC.
Procedimiento
1. Para la determinación de la curva de crecimiento:
Inocularemos el matraz que contiene el medio de cultivo con un preinóculo. Mediremos la
D.O. a 600 nm y comprobaremos que esta D.O. inicial (to) es aproximadamente de 0.05.
Seguiremos la evolución de la turbidez del cultivo midiendo la D.O. a diferentes tiempos
durante unas 24 horas. Tomaremos muestras cada dos horas. Y en algunos de estos puntos
tendremos que hacer diluciones para medir la D.O.
Representaremos en una gráfica los valores de D.O. obtenidos a lo largo del tiempo. La
curva obtenida será la curva de crecimiento del cultivo.
2. Al mismo tiempo haremos una recta patrón usando la cámara de recuento y suspensiones
celulares de D.O. conocida. Utilizando esta curva patrón, calcularemos por extrapolación
el nº de células que corresponden a los valores de D.O. obtenidos en nuestras lecturas al
espectrofotómetro y haremos una gráfica del nº de células en función del tiempo.
Recuento directo del número de células al microscopio. La cámara de recuento consiste en
un porta modificado con una hendidura de 0,1 mm de profundidad. Está dividida en 16
cuadrados y éstos a su vez divididos en 16 ó 25 celdillas. Cada celdilla tiene una superficie de
0,0025 mm 2 y una profundidad de 0,1 mm. Por tanto el volumen de cada celdilla (Vc) es de
0,00025 mm 3 . Como hay 16 celdillas por cuadrado, el volumen total de una celda (VT) es de
Vc × 16 = 0,004 mm 3 . Como 1 mm 3 = 10 -3 ml.
V = 4 × 10 -6 ml (volumen de una celda)
Se cuentan 6 celdas al azar, se calcula la media (X) de células por celda y se expresa la
concentración en células por ml:
X cel / 4 × 10 -6 ml = X × 25 × 10 4 células/ml
Los valores de células/ml se representan gráficamente frente a su DO correspondiente para
obtener la curva patrón.
3. Por último, haremos un cálculo de g de nuestro cultivo, S. cerevisiae, utilizando dos
valores consecutivos comprendidos dentro de la fase exponencial de crecimiento.
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Práctica 3
ANTIBIÓTICOS
Introducción
Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por
microorganismos, que a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros
microorganismos. Se caracterizan por:
-Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas).
-Son efectivos a bajas concentraciones.
-Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador.
-Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas.
-Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro.
-Solubles en agua.
-Poseen estabilidad química.
-Son productos del metabolismo secundario.
Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados
antibióticos en algunos microorganismos durante el tratamiento de una infección.
Los microorganismos productores se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas
(Bacillus, Streptomyces, Nocardia) como en el de eucariotas (Penicillium, Aspergillus,
Cephalosporium)
Se pueden clasificar según:
Su origen
•Naturales: sintetizados por microorganismos.
•Sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química.
•Semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada
químicamente.
Su estructura química
•ß-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas.
•Macrólidos: eritromicina.
•Aminoglucósidos: estreptomicina.
•Polipeptídicos: bacitracina.
•Poliénicos: anfotericina B
•Tetraciclinas
•Derivados del benceno: cloranfenicol.
Su mecanismo de acción
•Actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas.
•Actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad.
•Inhiben la síntesis proteica.
•Inhiben la síntesis de ácidos nucleicos: mitomicina.
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Objetivos
1. Detectar la producción de antibiótico por microorganismos
2. Valorar la cantidad de antibiótico presente en una solución
3. Determinar qué antibiótico entre varios es más efectivo frente a un organismo
(“antibiograma”).
Materiales
Tubos con 20 ml de AN y YED fundido, baño a 50ºC, placas Petri, mecheros, pipetas pasteur,
pipetas estériles, regla, papel semilogarítmico de 3 periodos, antibióticos: penicilina G 25, 50,
100 µg/ml y concentración desconocida; bacitracina: 10 mg/ml; cicloheximida: 2 mg/ml;
microorganismos: Streptomyces, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis.
Procedimiento
1. PRUEBA DE PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS
Mediante un bioensayo en medio sólido podemos determinar si un microorganismo produce
algún antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de un organismo de prueba. Para ello se
emplearán dos posibles microorganismos productores del género Streptomyces y un
microorganismo sensible (Saccharomyces cerevisiae).
Procedimiento
1. Tomar un tubo con medio YED fundido mantenido a 45-50ºC en un baño a dicha
temperatura.
2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de S.cerevisiae (organismo sensible).
3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía.
4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20’) colocar encima 2 tacos de agar, cada
uno con uno de los microorganismos a ensayar.
5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico.
6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del
microorganismo sensible.
Resultado: Observar la existencia o no de halos de inhibición del crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae.
2. VALORACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ANTIBIÓTICO
La concentración de un antibiótico en una solución se puede determinar por comparación con
el efecto de cantidades conocidas del mismo antibiótico sobre un microorganismo sensible,
Bacillus subtilis. Esta técnica se emplea en los procesos de mejora de la producción de un
17

determinado antibiótico por la especie productora. El proceso se lleva a cabo mediante
bioensayo en placa sobre un microorganismo sensible. Se valorará la concentración de
Penicilina G en una solución frente a una recta patrón generada con cantidades conocidas del
mismo antibiótico.
Procedimiento
1. Tomar un tubo con medio AN fundido.
2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible).
3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía.
4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 15 minutos) colocar con ayuda de pinzas
cuatro discos de papel saturados con la correspondiente solución de antibiótico.
5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico.
6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del
microorganismo sensible.
Resultado: Observar el tamaño de los halos de inhibición del crecimiento, medir los
diámetros con una regla, hacer la representación gráfica sobre papel semilogarítmico de 3
periodos y deducir la concentración de antibiótico desconocida.
3. “ANTIBIOGRAMA”
El antibiograma se utiliza para comprobar cuál de una serie de antibióticos es más activo
frente a un determinado microorganismo, Bacillus subtilis en este caso. Se compararán tres
antibióticos, Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml).
Procedimiento
1. Tomar un tubo con medio AN fundido.
2. Añadir 1 ml de la suspensión de células de B. subtilis (organismo sensible).
3. Tapar el tubo con Parafilm, invertir varias veces y verter en una placa Petri vacía.
4. Cuando el medio esté sólido (después de unos 20 minutos) colocar con ayuda de pinzas
tres discos de papel saturados con la correspondiente solución de los diferentes
antibióticos: Penicilina G (0,1 mg/ml), Bacitracina (10 mg/ml) y Cicloheximida (2 mg/ml).
5. Poner la placa a 4ºC durante 2 horas para permitir la difusión del antibiótico.
6. Incubar la placa a 28ºC durante unas 24 horas para permitir el crecimiento del
microorganismo sensible.
Resultado: Observar la aparición o no de halos de inhibición del crecimiento y su tamaño.
Indicar qué antibiótico es el más efectivo frente a B. subtilis.
18

Práctica 4
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA
Introducción
En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en
mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus características organolépticas.
Además de la flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir
microorganismos contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminación son las
aguas residuales, las cuales suelen contener restos de heces que pueden portar
microorganismos patógenos.
Aparte del problema de transmisión de enfermedades, la contaminación del agua
también acarrea otras consecuencias. Por ejemplo, la degradación biológica por los
microorganismos de grandes cantidades de residuos orgánicos vertidos al agua hace disminuir
rápidamente el oxígeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma de vida que
no sea anaeróbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor
característico debido a las actividades de los microorganismos anaerobios.
Objetivo
1. Determinar si el agua está contaminada por heces humanas o de otros animales.
La calidad del agua se determina principalmente por análisis bacteriológicos. Las pruebas que
se realizan son:
Recuento de aerobios totales
Colimetría
Estreptometría
Clostridiometría
Estos ensayos siguen en líneas generales la normativa publicada en el BOE de 20-IX-1990.
No obstante, a partir de marzo de 2003 los criterios de calidad del agua de consumo humano
se determinan de acuerdo a la normativa publicada en el BOE de 21 de febrero de 2003.
Materiales
Muestra de agua (aprox. 100 ml). Medios de cultivo: Placas de agar nutritivo (AN) (4), tubos
de medio Caldo Lactobiliado (3 EC concentrado y 6 EC simple), tubos de medio Caldo Azida
de Rothe (3 AR concentrado, 6 AR simple), medio Wilson Blair (1 tubo de agar WB fundido),
placa de medio Eosina Azul de Metileno (EMB). Tubos con 1 ml de agua estéril para
19

diluciones. 1 tubo de vidrio estéril. Pipetas estériles (de 1 y 10 ml). Parafilm. Baño a 80°C.
Baño a 60°C. Estufa incubadora a 37°C. Tabla estadística de “Número Más Probable” (NMP).
Asa de vidrio, mechero de alcohol y alcohol de quemar.
1. Bacterias aerobias totales
Las bacterias que vamos a identificar en este ensayo son bacterias heterótrofas, aerobias y
anaerobias facultativas, mesófilas, capaces de crecer en un medio rico (AN). El ensayo se
basa en contar el nº de colonias capaces de crecer en una placa de medio rico, en la que se ha
sembrado un volumen de agua conocido, transcurrido un determinado tiempo de incubación a
37 °C. Este ensayo sólo nos indica la cantidad de microorganismos de este tipo que hay en la
muestra de agua, pero NO IDENTIFICA microorganismos concretos. Al incubar a 37°C se
seleccionan bacterias de origen fecal (adaptadas a vivir en el interior del cuerpo de los
animales). Si se hiciera el mismo ensayo a 22 °C nos daría una idea de la flora autóctona.
Procedimiento
1. Preparar diluciones seriadas de la muestra original: 1/2, 1/4 y 1/8.
1. Sembrar 0,2 ml de la muestra original y de cada una de las diluciones (1/2, 1/4 y 1/8) en
cuatro placas de AN.
2. Incubar las placas a 37 °C durante 24 horas.
Resultados: Contar el número de colonias existentes en cada placa, seleccionar la placa que
contenga entre 30 y 300 colonias para la realización de los cálculos. El resultado se expresa
como microorganismos por ml de agua. ¡Hay que tener en cuenta las diluciones!.
2. Bacterias coliformes (Colimetría)
Son bacterias de morfología bacilar, Gram (-), aerobias o anaerobias facultativas, oxidasa
negativas, no esporógenas y capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y
gas a 37°C en un tiempo máximo de 48 horas. Las bacterias coliformes de origen fecal se
incluyen dentro de las bacterias entéricas o "enterobacterias" y se caracterizan por habitar
el tracto gastrointestinal del hombre y otros animales. Este grupo incluye los géneros:
Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter. Las heces pueden ser vehículos de
transmisión de otras bacterias no coliformes que son patógenas como Salmonella, Proteus y
Shigella, algunas de cuyas especies causan infecciones intestinales como la fiebre tifoidea y la
disentería bacilar. Ya que los microorganismos patógenos son muy sensibles y se encuentran
en bajas concentraciones se toma como indicador de contaminación fecal la presencia en las
aguas de los géneros arriba indicados y principalmente de Escherichia coli. Se realizan dos
pruebas, presuntiva y confirmativa; el ensayo se considera positivo si dan positivas ambas
pruebas.
20

Prueba presuntiva:
El agua problema se siembra en el medio denominado caldo lactobiliado (EC), que permite
el enriquecimiento e identificación de bacterias coliformes. La lactosa existente es fermentada
produciendo ácido y gas que se detecta en la campana de Durham. La bilis inhibe el
crecimiento de cocos Gram (+) y bacilos formadores de endosporas y no inhibe a los bacilos
entéricos Gram (-) ni otros ambientales (ej. Pseudomonas). Es un medio de enriquecimiento
y selectivo.
Procedimiento
1. Sembrar 10 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado concentrado
(ECC) con campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien.
2. Sembrar 1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con
campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien.
3. Sembrar 0,1 ml de la muestra en 3 tubos con 10 ml de caldo lactobiliado simple (EC) con
campana de Durham. Agitar suavemente hasta mezclarlo bien.
4. Incubar a 37°C durante 24 horas.
Resultados: se consideran "tubos gas +" aquellos en los que aparece enturbiamiento y
acumulación de gas en la campana. Los "tubos gas -" se incuban otras 24 h. La interpretación
se realiza según la tabla de “número más probable” (NMP) adjunta. Esta tabla indica el
número más probable de microorganismos presentes en 100 ml de agua (NMP), teniendo en
cuenta los tubos en que hay crecimiento así como las diluciones y aplicando métodos
estadísticos.
Prueba confirmativa:
1. Siembra en estría en placas de EMB (medio selectivo y diferencial para coliformes) a
partir de "tubos gas+".
2. Incubar a 37°C durante 24 h.
Resultados: En este medio los microorganismos fermentadores de lactosa forman colonias
características opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta con o sin brillo metálico (por
ejemplo, E. coli forma colonias de color verde-violeta oscuro metálico características sobre
este medio). La prueba es + si aparecen este tipo de colonias fermentadoras de lactosa. Otra
prueba confirmativa de la presencia de E. coli es sembrar los microorganismos que han
crecido en caldo lactobiliado a 37°C en este mismo medio pero incubando a 44°C. E. coli es
capaz de fermentar la lactosa en estas condiciones.
21

3. Estreptococos fecales (Estreptometría)
Son cocos Gram (+), anaerobios aerotolerantes, catalasa negativos y fermentadores de
glucosa con producción de ácido láctico a 37°C en un tiempo máximo de 48 h. Este grupo
comprende especies como Streptococcus faecalis, S. faecium, S. bovis y S. equinus. Los
estreptococos fecales son residentes normales del intestino del hombre y animales y reciben la
denominación general de enterococos. El ensayo incluye prueba presuntiva y confirmativa
y se considera positivo si ambas pruebas son positivas.
Prueba presuntiva
El ensayo se basa en saber si existen microorganismos capaces de crecer a 37 °C en un medio
líquido glucosado con agentes inhibidores selectivos. El medio utilizado, denominado caldo
azida de Rothe (AR) es un medio selectivo que contiene azida que inhibe la cadena de
transporte de electrones del metabolismo respiratorio de los microorganismos. Los
estreptococos y otros microorganismos poseen un metabolismo fermentativo y carecen de
cadena de transporte de electrones por lo que no se ven afectados por la azida.
Procedimiento
1. Sembrar de la misma forma que en bacterias coliformes en medio selectivo para
estreptococos, caldo azida de Rothe (3 tubos ARC, 6 tubos AR). Agitar
2. Incubar a 37°C durante 24 h.
Resultados: Se consideran "tubos +" aquellos en que existe enturbiamiento y/o sedimento.
Interpretación según la tabla NMP (microorganismos/100 ml de agua).
Prueba confirmativa
Se trata de realizar una tinción de Gram del sedimento de los tubos con objeto de reconocer
al microscopio los estreptococos, que se observarán como cadenas de cocos Gram (+).
4. Clostridios sulfito-reductores (Clostridiometría)
Son bacterias de morfología bacilar, Gram(+), anaerobios estrictos, capaces de formar
esporas y con actividad sulfito reductora (desasimilatoria). Algunas especies de
Clostridium habitan en el tracto intestinal de animales, otras en el suelo, etc. El ensayo
consiste en contar el número de bacterias anaerobias formadoras de endosporas con
capacidad sulfito reductora en un medio que contiene sulfito sódico y una sal de hierro,
denominado medio Wilson Blair (WB). Estas colonias aparecen de color negro debido a la
formación de sulfuro ferroso por reducción del sulfito.
Procedimiento
1. Fundir previamente el medio Wilson-Blair 2x (WB) y mantener en baño a 60°C.
22

2. Calentar la muestra de agua (10 ml) durante 10 minutos a 80°C, para matar formas
vegetativas e inducir la germinación. Enfriar en el grifo.
3. Añadir la muestra de agua precalentada al tubo de WB 2x
4. Tapar bien el tubo con algodón y con Parafilm. Mezclar por inversión.
5. Incubar a 37°C durante 24-48 horas.
Resultados: Contar el nº de colonias negras existentes en la totalidad del tubo (sin tener en
cuenta las colonias puntiformes). El resultado se expresa como nº de clostridios existentes en
el volumen de agua sembrada. (Ver normas vigentes).
Interpretación de los resultados
El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites
establecidos por la ley. Las normas legales exigen:
Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son:
Aerobios a 37°C: 10 /ml. Aerobios a 22°C: 100 por ml.
Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml.
Estreptococos fecales: < 1 / 100ml.
Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.
NMP (Número más probable)
Con los intervalos de confianza del 95 por 100, entre los cuales pueden variar para diversas
combinaciones de resultados positivos y negativos.
Número de tubos que dan reacción positiva entre
Índice
NMP/100ml
Límite de confianza del 95 por
100
3 tubos de 10
ml
3 tubos de 1 ml
3 tubos de 0,1
ml
Límite inferior Límite superior
0 0 1 3 < 0,5 9
0 1 0 3 < 0,5 13
1 0 0 4 < 0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 149
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 379
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
23

Composición de los medios de cultivo empleados
Caldo lactobiliado (EC) Agar nutritivo (AN)
Biotona 20,0 g/l Extracto de levadura 2 g/l
Lactosa 5,0 g/l Extracto de carne 1 g/l
Fosfato de potasio 5,5 g/l Peptona 5 g/l
Cloruro de sodio 5,0 g/l ClNa 5 g/l
Sales biliares 1,5 g/l Agar 20 g/l
Caldo azida de Rothe (AR)
Peptocomplex 15,0 g/l
Extracto de carne 4,5 g/l
Glucosa 7,5 g/l
Cloruro de sodio 7,5 g/l
Azida sódica 0,2 g/l
Medio Wilson Blair (WB)
Peptona 10,0 g/l
Sulfito sódico 0,5 g/l
Citrato férrico 0,5 g/l
Agar 15,0 g/l
Medio EMB (Eosina-azul de metileno)
Lactosa 5 g/l
Sacarosa 5 g/l
Peptona 10 g/l
Difosfato potásico 2 g/l
Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH ácido) 0,4 g/l
Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) 0,065 g/l
Agar 13,5 g/l
pH 7,2
24

Práctica 5
DETERMINACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
Introducción
En esta práctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una
muestra (heces, agua o alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente
mediante un conjunto de pruebas. Concretamente, vamos a realizar la determinación de
bacterias pertenecientes al grupo de bacilos Gram (-) anaerobios facultativos, en el que se
incluyen las enterobacterias. Muchas de ellas forman parte de la flora normal del tracto
digestivo del hombre pudiendo producir enfermedades en determinadas circunstancias. Otros
como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la ingestión de alimentos o agua
contaminados. De ahí la necesidad de desarrollar pruebas que permitan aislar e identificar
rápidamente estos microorganismos.
La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras
clínicas o de otros orígenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones,
seguir el curso de las enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. Todos los puntos del
proceso son importantes, desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su
manipulación en el laboratorio.
Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en
juego todos los conocimientos acumulados en Microbiología. La identificación de bacterias
puede basarse en muchos caracteres: morfología celular o de las colonias, tinción,
fisiológicos, bioquímicos, de tipo serológico y de patogenicidad.
Morfología celular: forma (bacilos, cocos) y agrupamiento (diplococos, racimos, rosarios).
Presencia o ausencia de estructuras especiales: flagelos, endosporas
Morfología de las colonias: forma, color, consistencia, borde, sección...
Tinción (Gram, ácido-alcohol resistentes...)
Fisiología: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos; temperatura óptima de crecimiento;
movilidad, etc.
Bioquímica: presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metabólica; tipo de
fermentación de carbohidratos; utilización de citratos como única fuente de carbono, etc
Actualmente existen kits que agrupan muchas pruebas fisiológicas y bioquímicas en un
formato sencillo y que produce resultados rápidos. No obstante, todavía muchas pruebas
requieren el empleo de métodos de cultivo tradicionales, selectivos, diferenciales y de
enriquecimiento.
El grupo de bacterias gram (-) anaerobias facultativas incluye bacilos o
cocobacilos que pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 (anaerobios facultativos).
25

En anaerobiosis obtienen la energía por fermentación. En este grupo se incluyen las familias
Enterobacteriaceae y Vibrionaceae.
Familia Enterobacteriaceae
Forma: bacilos, cocobacilos
Movilidad: inmóviles o móviles por flagelos peritricos
Catalasa (+) y Oxidasa (-)
La mayoría de enterobacteriáceas pueden fermentar glucosa y otros azúcares. La
capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la identificación de las
distintas especies. Por ejemplo, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter fermentan la lactosa
(coliformes), mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa (no
coliformes).
Familia Vibrionaceae
Forma: bacilos ligeramente curvados.
Movilidad: móviles por flagelos polares
Catalasa (+) y Oxidasa (+)
Las vibrionáceas crecen bien en medio alcalino. La mayoría son inofensivas y se
encuentran en ambientes acuáticos. Algunos son patógenos, como Vibrio cholerae que es el
agente causal del cólera.
Objetivo
Aislamiento e identificación de las bacterias presentes en una muestra (suspensión que
contiene una mezcla de microorganismos).
Materiales
Se describen para cada experimento
Procedimiento
1. AISLAMIENTO
Para el aislamiento se utilizan medios que son selectivos para determinadas bacterias, donde
podremos ver la morfología, color y otras características de los distintos tipos de
microorganismos presentes en la muestra. Se llevarán a cabo inoculaciones en placas de
medios sólidos (Agar nutritivo, Verde Brillante, EMB, TCBS) y en medio líquido (Peptona
alcalina), empleando las mezclas A o B.
26

Procedimiento
1.1. Cultivos en placas
Tomar una muestra de la suspensión microbiana con un asa de siembra estéril y sembrar por
estría los siguientes medios, con el fin de obtener colonias bien aisladas: 1 placa de Agar
nutritivo, 1 placa de Verde Brillante, 1 placa de EMB, 1 placa de TCBS.
Incubar a 24 h a 37 °C. Observar la morfología de las colonias y determinar cuantos
microorganismos distintos hay en cada mezcla.
1.2. Cultivos en medio líquido
Añadir con una pipeta Pasteur estéril varias gotas de la suspensión bacteriana en un tubo de
peptona alcalina.
Incubar a 37 °C y observar la presencia o no de crecimiento bacteriano.
Características de los medios empleados
Agar Nutritivo
Extracto de levadura 2g/l
Extracto de carne 1 g/l
Peptona 5 g/l
ClNa 5 g/l
Agar 20 g/l
No es un medio selectivo, por lo tanto permite el crecimiento de muchos microorganismos.
Medio EMB (Eosina-azul de metileno)
Lactosa 5 g/l
Sacarosa 5 g/l
Peptona 10 g/l
Difosfato potásico 2 g/l
Eosina (indicador de pH, cambia de incoloro a negro a pH ácido) 0,4 g/l
Azul de metileno (inhibe el crecimiento de bacterias Gram +) 0,065 g/l
pH 7,2.
Es un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae. También es un medio diferencial ya
que nos permite saber por la coloración de la colonia si los microorganismos que crecen
fermentan lactosa o sacarosa. Si las bacterias fermentan lactosa o sacarosa, acidifican el
medio y la eosina vira a negro dando lugar a la aparición de colonias oscuras. Las bacterias
que no fermentan ni lactosa ni sacarosa originan colonias claras.
27

Medio Agar Verde Brillante
Lactosa 10 g/l
Sacarosa 10 g/l
Peptona 10 g/l
Extracto de levadura 3 g/l
NaCl 5 g/l
Rojo de fenol (indicador de pH) 0,08 g/l
Verde Brillante (colorante que inhibe el crecimiento de muchas bacterias) 0,0125 g/l
Agar 20 g/l
pH 6,9
Es también un medio selectivo de la familia Enterobacteriaceae y un medio diferencial ya
que nos permite saber por la coloración del medio si los microorganismos que crecen
fermentan lactosa o sacarosa. Si crecen microorganismos fermentadores el pH del medio se
acidifica y se torna amarillento debido al Rojo de Fenol. Si no son fermentadores, el pH se
vuelve más alcalino por la utilización de las peptonas, y medio vira a rosa o rojo debido al
mismo colorante. Está indicado para el aislamiento de Salmonella (no para S. typhi). Las
colonias de Salmonella son blanco-rosáceas, con un halo rojo brillante.
Medio Agar TCBS
Tiosulfato Sódico 10 g/l Extracto de levadura 5 g/l
Citrato férrico 1 g/l Citrato sódico 10 g/l
Bilis de vaca 5 g/l Peptonas 10 g/l
Sacarosa 20 g/l Azul de Timol 0,04 g/l
ClNa 10 g/l Azul de Bromotimol 0,04 g/l
Colato de sodio 3 g/l Agar 14 g/l
pH 8,6
Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo de la familia Vibrionaceae, en
concreto de Vibrio cholerae y otros vibrios enteropatógenos. Las colonias de Vibrio son
grandes, de color amarillo o azul. Este medio inhibe selectivamente el crecimiento de la
Familia Enterobacteriaceae, aunque algunas especies pueden crecer dando pequeñas colonias.
Medio Peptona Alcalina
Peptona 15 g/l
NaCl 30 g/l
pH 9,0
Es un medio utilizado para el cultivo y aislamiento selectivo la familia Vibrionaceae. Por su
pH alcalino sólo permite el crecimiento de Vibrio. Es un medio líquido, lo que se observa es
la existencia de crecimiento por turbidez del medio.
28

2. IDENTIFICACIÓN
Las siguientes pruebas se deben realizar con los distintos microorganismos obtenidos en los
aislamientos en placa. Se llevarán a cabo 4 pruebas individuales: Prueba de la oxidasa,
Test de la Catalasa, Prueba de Kligler y Manita-movilidad. Además se llevará a cabo una
prueba compuesta por varias reacciones bioquímicas, el API20E.
2.1. Prueba de la Oxidasa. Se trata de determinar si un microorganismo posee
citocromo c-oxidasa. Para ello se utiliza un compuesto orgánico que puede ser reducido por
el sistema citocromo-oxidasa/citocromo c en presencia de oxígeno molecular, originando un
producto coloreado fácilmente apreciable.
oxidasa
1-naftol + dimetilparafenilendiamina → azul de indofenol
Procedimiento
1. Tomar con el asa de siembra una colonia de la placa de EMB o TCBS (o bien hacer una
suspensión de una colonia en agua) y depositar en un porta.
2. Poner la colonia sobre el porta y añadir una gota de sustrato cromógeno fresco (10
mg/ml).
3. Esperar 20-60 segundos y observar si existe algún cambio en la coloración. Si se pone
azul es (+).
Resultado: Si la tira se pone de color azul oscuro, el microorganismo es oxidasa positivo.
2.2. Test de la Catalasa. Algunas bacterias poseen catalasa, una enzima capaz de
destruir el agua oxigenada generada en algunos procesos metabólicos. Esta enzima está
presente en la mayoría de las bacterias que contienen citocromos, bien aerobias o anaerobias
facultativas.
catalasa
Procedimiento
2 H2O2 → 2 H2O + O2
1. Coger con cuidado una colonia con el asa de siembra (evitar coger agar) de la placa de
EMB (Enterobacteriaceae) y TCBS (Vibrionaceae)
2. Poner la colonia directamente sobre un portaobjetos sin añadir agua.
3. Echar sobre la colonia una gota de agua oxigenada pura o al 30 %.
4. Observar si se forman burbujas de oxígeno.
Resultado: La aparición de burbujas indica que el microorganismo es catalasa positivo.
29

2.3. Test de Kligler. En este test se utiliza el medio de cultivo KIA ("Agar Hierro de
Kligler") y proporciona varios datos fisiológicos importantes para determinar si un
microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, produce gas o ácido sulfhídrico. Es un
medio que requiere un procedimiento de inoculación especial.
Procedimiento
1. Inocular los microorganismos aislados en la placa de EMB en un tubo de medio KIA con
el asa de siembra. La siembra se hará de la siguiente manera: sembrar la superficie por
estría y sembrar la parte interna del medio por picadura.
2. Incubar 18-24 h a 37°C. Observar e interpretar los cambios producidos en el medio.
En este medio se puede obtener la siguiente información fisiológica:
a) Fermentación de glucosa y/o lactosa. El medio contiene una pequeña cantidad de
glucosa y una gran cantidad de lactosa. Los microorganismo capaces de fermentar
cualquiera de estos compuestos darán lugar a la formación de ácidos que bajan el pH del
medio. Como consecuencia el rojo fenol vira a amarillo. La sucesión de eventos
metabólicos es la siguiente (ver dibujo):
1º) El microorganismo utiliza la fuente de carbono más asequible en el medio, la
glucosa, pero como se encuentra en el medio en muy baja concentración se agota
rápidamente. Los productos de su degradación acidifican el medio que cambia de
rojo a amarillo.
2º) Al agotarse la glucosa empieza a utilizar las peptonas, pero sólamente en aerobiosis
(se corresponde a la zona de la lengüeta del tubo). Este consumo da lugar a residuos
amoniacales, produciendo una basificación del medio. El indicador vira a rojo en esta
parte del tubo.
3º) Posteriormente se produce el consumo de lactosa, en el caso de los microorganismos
que sean capaces de utilizar este disacárido. Esto da lugar a un descenso de pH por
lo que cambiará el medio de rojo a amarillo.
La razón de que la lactosa se utilice después es debido al tipo de regulación de la ßgalactosidasa,
que es la enzima que hidroliza este disacárido para dar los correspondientes
monosacáridos. Se trata de una enzima inducible, lo que significa que existe un periodo de
latencia entre el agotamiento de la glucosa y la producción de las primeras moléculas de ßgalactosidasa,
de tal forma que después de un tiempo de consumo de peptonas se comienza a
utilizar lactosa.
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6 h 10 h
Rojo Amarillo
Medio KIA
Extracto de carne 3 g/l
Extracto de levadura 3 g/l
Peptonas 15 g/l
Lactosa 10 g/l
Glucosa 1 g/l
Tiosulfato sódico 0,3 g/l
Sulfato ferroso (Fe 2+ ) 0,2 g/l
Rojo de fenol 0,024 g/l
ClNa 5 g/l
Agar 12 g/l
pH 7,4
b) Producción de gas. La producción de gas se detecta por la formación en el medio de
burbujas de gas perfectamente visibles ya que cuartean el medio. El gas se origina
mediante la reacción catalizada por la formiato liasa a partir de ácido fórmico.
formiato liasa
24 h
H-COOH → CO2 + H2
Por tanto, son “gas (+)” aquellos microorganismos que produzcan esta enzima.
Rojo
Amarillo
Lac +
Glc +
Amarillo
Lac -
Glc +
Rojo
Amarillo
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c) Producción de SH2. Algunas bacterias son capaces de llevar a cabo la siguiente reacción
a partir del tiosulfato añadido al medio:
tiosulfato reductasa
2 S2O3 2+ + 4 e - + 4 H + → 2 SO3 2+ + 2 SH2
El ácido sulfhídrico se detecta porque reacciona con las sales de metales pesados (Fe 2+ )
presentes en el medio. Esto da lugar a la formación de sulfuro de hierro que se deposita en
gran parte del tubo, sobre todo en el fondo, oscureciendo el medio.
2.4. Manita-Movilidad. Se utiliza un medio semisólido para detectar la movilidad de las
bacterias. Este medio contiene manitol como fuente de carbono. Si el microorganismo es
capaz de usar el manitol se produce una acidificación del medio, lo que da lugar a un viraje
del indicador de pH de rojo a amarillo.
Peptona de caseina 10 g/l
Nitrato potásico 1 g/l
Manitol 7,5 g/l
Rojo fenol 0,04 g/l
Agar 3,5 g/l
pH 7,6
Procedimiento
Medio MM
1. Inocular por picadura un tubo de medio semisólido con cada uno de los distintos
microorganismos aislados.
2. Incubar 24 horas a 37°C.
3. Observar la zona de crecimiento del microorganismo y si ha habido cambio en la
coloración del medio.
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Resultado: El test de la movilidad se hace mirando el desplazamiento del microorganismo. Si
el crecimiento se limita a la zona de la picadura, el microorganismo no es móvil. Si el
crecimiento se produce por todo el medio, el microorganismo es móvil.
Géneros Gas SH2 Lactosa Manita-Movilidad
Escherichia + - + +
Shigella - - - -
Salmonella + + - +
Citrobacter + + + +
Klebsiella + - + +
Enterobacter + - + +
Serratia + - + +
Proteus + + - +
Yersinia - - - +
2.5. Batería de pruebas API20E
La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para enterobacterias y
otras bacterias Gram(-). Básicamente consta de 20 tests bioquímicos estandarizados y
miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido, eficaz y
de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos
o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta
(ver tabla "sumario de los resultados con API 20E ").
Los microtubos se inoculan con una suspensión de microorganismos, en agua o
solución salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37°C y por efecto del
metabolismo bacteriano se van a producir cambios de color espontáneos o bien al añadir
reactivos.
La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura
donde se indica si los microorganismos deben considerarse positivos o negativos para cada
reacción según el color aparecido.
Procedimiento
1. Preparación de inóculo. Tomar una colonia bien aislada de cada microorganismo y
resuspenderla homogéneamente en 5 ml de solución salina (1% de ClNa) o 5 ml de agua
estéril.
2. Inoculación de los pocillos. Cada pocillo tiene un tubo y una cúpula (ver dibujo).
3. Llenar el tubo y la cúpula de los pocillos | CIT | , | VP |, | GEL | con la suspensión de
bacterias.
4. Llenar los tubos, no la cúpula, de los demás pocillos.
5. Llenar con parafina las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para
obtener anaerobiosis.
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6. Poner la tira en la cámara de incubación. Previamente poner agua en los alveolos de la
cámara para proporcionar una atmósfera húmeda durante la incubación.
7. Incubar a 37°C durante 24 h.
Interpretación de los resultados
La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo con
los de la tabla de lectura. Para la lectura se tienen en cuenta los siguientes criterios:
Si la glucosa es positiva y/o 3 o más tests son positivos se revelan los test que requieren
reactivos:
VP: Añadir una gota de KOH 40 % y una gota de α-naftol 6% y esperar 10 minutos.
Positivo= color rojo o rosa fuerte.
TDA: Añadir una gota de Cl3Fe 10 %. Positivo=color marrón oscuro.
IND: Añadir una gota de reativo de Kovacs. Positivo= aparece un anillo rojo en los
dos primeros minutos de la reacción.
Si la glucosa da negativo y los tests positivos son 2 o menos de 2, no hay que añadir
reactivos. Cuando esto ocurre se hacen otros tipos de API como el API OF, el API M o el API
10S para ver determinados metabolismos especiales.
Identificación: del conjunto de reacciones se obtiene un perfil numérico. Los pocillos
están separados en grupos de tres. En total hay 7 tripletes (el test número 21 corresponde al
test de la oxidasa). A cada pocillo se le da el valor 0, 1, 2 o 4 según corresponda:
1. Si la reacción es negativa………… 0
2. Si la reacción es positiva…….…… 1 (primer pocillo de un triplete)
2 (segundo pocillo de un triplete)
4 (tercer pocillo de un triplete)
3. Se suman los valores de cada triplete y se obtiene un código de 7 cifras.
4. Con este código se busca en la tabla de identificación la especie de que se trata.
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