Dr. Raimon Sanmartí Sala Hospital Clínic i Provincial

ANTICOSSOS CONTRA PÈPTIDS CITRULINATS EN L’ARTRITIS
REUMATOIDE DE CURTA EVOLUCIÓ: SIGNIFICACIÓ
DIAGNÒSTICA I PRONÒSTICA
Investigadors principals:
Dr. Raimon Sanmartí Sala
Hospital Clínic i Provincial de Barcelona
Dra. Isabel Haro Villar
Institut d'Investigacions Químiques i Ambientals de Barcelona
Dr. Alejandro Balsa Criado
Sociedad Española de Reumatología. Madrid
Durada : 3 anys
MEMÒRIA FINAL
1. Resum
Aquest és un projecte multicèntric i coordinat que té com a objectiu
principal desenvolupar un mètode enzim-immunoassaig emprant
pèptids sintètics citrulinats derivats de dominis de fibrina humana,
que pugui ser utilitzat com a test diagnòstic per a l’artritis reumatoide
(AR) i estudiar-ne el seu valor pronòstic.
Aquest projecte consta dels tres subprojectes següents:
1

Subprojecte 1 (Dra. Isabel Haro). Projecte bàsic en el qual es
pretén sintetitzar químicament pèptids derivats de dominis de les
cadenes alfa i beta de la fibrina, en el qual l’aminoàcid arginina és
substituït per l’aminoàcid citrulina. Aquests pèptids citrulinats han de
servir de substrat antigènic per detectar mitjançant tècniques
d’enzim-immunoanàlisi (ELISA) anticossos presents en el sèrum de
pacients amb artritis reumatoide. Els ELISA que empren aquests
pèptids citrulinats derivats de fibrina (àmpliament present en la
membrana sinovial de pacients amb AR) poden ser més sensibles que
els utilitzats fins ara (derivats de filagrina i altres proteïnes) i poden
tenir més capacitat pronòstica.
En aquest projecte s’han seleccionat seqüències peptídiques a partir
de l’estructura primària de la fibrina, mitjançant algoritmes clàssics
de predicció d’antigenicitat i/o epitope mapping de les proteïnes i
posteriorment s’han obtingut químicament determinats anàlegs
citrulinats (seguint metodologies de síntesi de pèptids en fase sòlida)
en forma lineal, cíclica i/o ramificada. Posteriorment, s’han
desenvolupat diferents ELISA per a la detecció d’autoanticossos en el
sèrum, fent servir els pèptids citrulinats obtinguts. Ha estat avaluada
la unió covalent i l’adsorció directa, amb derivació hidròfoba prèvia,
de les seqüències peptídiques a les plaques de microtitulació.
Finalment, s’ha estudiat la sensibilitat i especificitat d’aquests ELISA
per al diagnòstic d’AR i s’han comparat els resultats amb els ELISA
comercials de primera i segona generació que empren pèptids
citrulinats cíclics derivats de l’estructura de la filagrina humana
(antiCCP1) i altres seqüències peptídiques (antiCCP2).
Subprojecte 2 (Dr. Raimon Sanmartí). En aquest projecte s’ha
estudiat el valor pronòstic dels nous ELISA desenvolupats en el
primer subprojecte que empren pèptids sintètics citrulinats derivats
de fibrina humana, en pacients amb AR de curta evolució. S’ha
estudiat una cohort de pacients amb AR de menys de dos anys
2

d’evolució, que han estat seguits de forma protocol·litzada al llarg de
dos anys de seguiment. Com a mesura de mal pronòstic ha estat
considerat el grau de destrucció articular (avaluat per radiografia) al
final del seguiment. S’han estudiat els factors (clínics, genètics i de
laboratori) que s’associen a una major destrucció articular, incloent-hi
els valors d’anticossos contra pèptids citrulinats de fibrina humana.
S’han estudiat altres associacions d’aquests autoanticossos i s’ha
comparat el seu valor pronòstic amb els antiCCP2.
Subprojecte 3 (Dr. Alejandro Balsa). És un projecte multicèntric de
la Sociedad Española de Reumatología en el qual participen 34
centres de tota la geografia espanyola i que analitza els factors
associats al desenvolupament d’AR en una cohort prospectiva de
pacients amb artritis de començament recent i que ha estat seguida
durant 5 anys. S’han determinat el paper del anticossos contra
pèptids citrulinats (CCP2 i contra fibrina humana) en el futur
diagnòstic d’artritis reumatoide.
2. Resultats
Subprojecte 1. S’ha comprovat que els pèptids citrulinats sintètics
relacionats amb la fibrina són reconeguts pel sèrum de pacients amb
AR. Han estat sintetitzades satisfactòriament diferents regions
citrulinades de les cadenes alfa i beta de la fibrina. Determinades
regions d’aquestes cadenes –alfa (pèptids p18, p19, p22) i beta
(pèptid p38)–, han demostrat nivells molt alts de sensibilitat per a la
detecció dels autoanticossos presents en el sèrum de pacients amb
AR. Posteriorment, es va comprovar que la capacitat antigènica dels
pèptids lineals es millorava per la ciclació de les seqüències.
Finalment, es demostrà que la combinació en la mateixa molècula de
pèptids derivats de la filagrina (pèptid cíclic cfc1cyc) i de la cadena
3

alfa de la fibrina –pèptids quimèrics fibrina/filagrina (fb/f)–
incrementava la sensibilitat dels ELISA i permetia identificar
anticossos en el sèrum de pacients amb AR que no es detectaven
amb els tests d’ELISA comercials (CCP1, CCP2).
En analitzar el balanç sensibilitat/especificitat dels nous tests d’ELISA
emprant els pèptids quimèrics fb/f, en diverses poblacions (AR,
donants de sang i altres patologies reumàtiques) s’ha demostrat l’alta
sensibilitat d’aquests ELISA per a la detecció d’autoanticossos en
pacients d’AR (72-78%). En l’estudi d’especificitat dels diversos
autoanticossos en altres patologies en què s’observen fenòmens
autoimmunitaris (Lupus eritematós sistèmic, hepatitis crònica per
virus C) o que tenen un quadre clínic similar a l’AR (artritis
psoriàsica), s’ha comprovat que els anticossos antiquimèrics fb/f són
molt específics, similarment als antiCCP2 comercials. Aquesta
especificitat és del 97-98%, excepte els LES, on aquesta és una mica
més baixa (91-92%), com a conseqüència de la presència d’alguns
falsos positius.
Subprojecte 2. S’ha analitzat en un grup de 118 pacients amb AR
d’inici recent i seguits durant dos anys, el valor pronòstic dels
anticossos contra pèptids sintètics citrulinats quimèrics
fibrina/filagrina p18, p19 i p22. Un 82% de pacients tenia anticossos
contra algun dels pèptids quimèrics citrulinats (respecte d’un 74%
amb el test comercial CCP2). La presència d’aquests autoanticossos
en el moment de la inclusió (valors basals) s’associava a una major
destrucció articular, especialment els dirigits contra el quimèric fb/f
p18, de forma fins i tot superior al test comercial CCP2. S’ha
demostrat una molt bona correlació entre els resultats dels tres ELISA
que empren pèptids quimèrics i el test comercial CCP2, tot i que hi ha
discrepàncies en un nombre important de pacients (al voltant del
14%). Tanmateix s’ha observat una associació entre la presencia
4

d’aquests autoanticossos, especialment del quimèric fb/f p18 i un
determinat genotip HLA (HLA-DRB04).
Subprojecte 3. S’ha analitzat en una cohort de 171 pacients amb
artritis d’inici seguits durant un mitjana de 3,6 anys, el valor
discriminatiu dels antiCCP2 i els anticossos quimèrics fibrina/filagrina,
per al posterior desenvolupament d’AR. La gran majoria de pacients
(94%) foren diagnosticats d’AR durant el seguiment. Tant l’antiCCP2
com els antiquimèrics fb/f p18 (en fase d’anàlisi definitiu) s’han
associat al posterior desenvolupament d’AR en aquesta població.
3. Rellevància i implicacions clíniques dels resultats finals
obtinguts
Els anticossos contra pèptids citrulinats són els marcadors serològics
més específics de l’AR. Els resultats finals obtinguts durant el decurs
d’aquest projecte de recerca han permès definir pèptids quimèrics
que contenen dominis de dues proteïnes diferents (filagrina i fibrina) i
que són reconeguts per autoanticossos presents en el sèrum de
pacients amb AR amb un molt bon balanç especificitat/sensibilitat.
Podem concloure que els pèptids citrulinats sintètics tenen un clar
interès en el desenvolupament de nous tests millorats per al
diagnòstic d’AR. Es reforça la idea que epítops de les cadenes alfa i
beta de la fibrina humana, presents en la sinovial reumatoide podrien
constituir-se en els principals antígens que desencadenen la resposta
immunològica a l’AR, amb les seves implicacions etiopatogenètiques.
En conseqüència, es preveu una notable implicació clínica dels
pèptids quimèrics fibrina-filagrina, ja que aquests milloren la
sensibilitat de detecció dels autoanticossos presents en pacients d’AR.
En l’anàlisi de sensibilitat/especificitat d’aquest autoanticossos, s’ha
demostrat que tenen una alta sensibilitat i especificitat per al
5

diagnòstic d’AR. Emprant una població de 322 pacients amb AR i 307
controls (Banc de Sang) i mantenint una especificitat del 98%, la
sensibilitat dels tres anticossos antiquimèrics fibrina/filagrina (fb/f)
(p18, p19, p22) és del 72-78%, no inferior a l’observada amb els
antiCCP2 comercials (74%). De forma interessant, i encara que la
correlació entre els diversos autoanticossos és molt estreta, hi ha un
percentatge notable de discrepàncies entre ells (al voltant del 14%),
la qual cosa mostra que la determinació de més d’un anticòs pot
incrementar la sensibilitat (fins a un 81%) sense pràcticament perdre
especificitat (96-97%).
En l’estudi d’especificitat dels diversos autoanticossos en altres
patologies en què s’observen fenòmens autoimmunitaris (Lupus
eritematós sistèmic, hepatitis crònica per virus C) o que tenen un
quadre clínic similar a l’AR (artritis psoriàsica), s’ha comprovat que
els anticossos antiquimèrics fb/f són molt específics, semblantment
als antiCCP2 comercials. Aquesta especificitat és del 97-98%, llevat
de LES, on aquesta és una mica més baixa (91-92%) com a
conseqüència de la presència d’alguns falsos positius.
Quan s’ha analitzat el valor pronòstic d’aquests autoanticossos, s’ha
pogut demostrar que en una cohort de pacients amb AR de curta
evolució, la seva presència s’ha associat a un major grau de
destrucció articular. Els pacients amb aquests autoanticossos
(especialment amb l’anticòs antiquimèric fb/f p18) presenten un
major grau de progressió radiològica de la malaltia després de dos
anys de seguiment, tot identificant aquells pacients amb una malaltia
més greu.
En conclusió, aquests anticossos antiquimèrics fibrina/filagrina tenen
una alta sensibilitat per al diagnòstic de l’AR i poden estar presents
en pacients en què l’antiCCP2 (test comercial, emprat en la pràctica
clínica) no l’ha aconseguit identificar. Per aquest motiu la identificació
conjunta d’aquests autoanticossos antiquimèrics (especialment fb/f
p18) incrementa la sensibilitat diagnòstica per a l’artritis reumatoide,
6

i també aporta informació addicional sobre el pronòstic. Els nous tests
d’ELISA que empren pèptids citrulinats sintètics on s’inclouen dominis
de fibrina humana poden constituir-se com una de les proves amb un
millor balanç sensibilitat/especificitat per al diagnòstic d’AR i ser molt
útils per determinar-ne el pronòstic.
4. Publicacions
M.L. Pérez, M.J. Gómara, D. Kasi, A. Alonso, O. Viñas, G. Ercilla, R.
Sanmartí and I. Haro Synthesis of overlapping fibrin citrullinated
peptides and its use for diagnosing rheumatoid arthritis Chem. Biol.
Drug Des. 68, 194-200 (2006)
M.L. Pérez, M.J. Gómara, G. Ercilla, R. Sanmartí, I. Haro Antibodies to
citrullinated human fibrinogen synthetic peptides in diagnosing
rheumatoid arthritis J. Med. Chem. 50, 3573-3584 (2007)
Vázquez I, Graell E, Gratacós J, Cañete J.D, Viñas O, Ercilla M.G,
Gómez A, Hernández M.V, Rodríguez-Cros J.R, Larrosa M. and
Sanmartí R. Prognostic markers of clinical remission in early
rheumatoid arthritis after two years of Dmards in a clinical setting.
Clin Exp Rheumatol 2007; 25: 232-8
Sanmartí R, *Gómez-Centeno A, **Ercilla G, *Larrosa M, **Viñas O,
Vazquez I, Gómez-Puerta J-A, *Gratacós J , Salvador G and Cañete
JD. Prognostic factors of radiographic progression in early rheumatoid
arthritis. a two year prospective study after a structured therapeutic
strategy using dmards and very low doses of glucocorticoids.
Clinical Rheumatol 2007; 26: 1111-8.
7

Patents
I. Haro, M.J. Gómara, M.L. Pérez, R. Sanmartí
“Polipéptido quimérico fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar
los anticuerpos generados en la artritis reumatoide”
Nº Sol.licitud: P200701167
Entitat titular: CSIC-Fundació Clínic
Pais: Espanya
Any: presentada sol.licitud 30.04.2007
8