Artículo - Revista Fitotecnia Mexicana

Artículo Científico Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3):251 - 259, 2002
GENERACIÓN DE RAÍCES Y PLÁNTULAS TRANSGÉNICAS DE TORONJA Y LIMA DULCE
MEDIANTE EL USO DE Agrobacterium rhizogenes
GENERATION OF GRAPEFRUIT AND SWEET LIME TRANSGENIC ROOTS AND PLANTLETS VIA
Agrobacterium rhizogenes
Recibido: 27 de Julio del 2003.
Aceptado: 9 de Agosto del 2004.
Arturo Serna Pérez y Eugenio Pérez Molphe Balch*
Departamento de Química, Centro de Ciencias Básicas, Universidad Autónoma de Aguascalientes. Av. Universidad 940. C.P. 20100 Aguascalientes, Ags.
México. Tel: 01 (449)910-8420, Fax: 01(449)910-8401. Correo electrónico: eperezmb@correo.uaa.mx
* Autor para correspondencia
RESUMEN
La transformación genética es una técnica atractiva para el mejoramiento
de los cítricos ya que evita los largos periodos juveniles y
permite introducir nuevas características a un cultivar sin alterar los
rasgos existentes. Un paso indispensable para aplicar esta tecnología
de mejoramiento de los cítricos, es el desarrollo de sistemas eficientes
de transformación genética que confieran ventajas agronómicas. En
este reporte se presenta el desarrollo de sistemas de transformación
genética basados en Agrobacterium rhizogenes para la toronja (Citrus
paradisi cvs. Duncan y Rio Red) y la lima dulce (Citrus limmettioides).
Primero se generaron raíces transformadas por medio del cocultivo
de segmentos de tallo obtenidos de plántulas germinadas in vitro con
A. rhizogenes cepa A4, que contenía el plásmido tipo silvestre pRiA4
y el vector binario pESC4 con los genes nos-nptII y cab-gus. La mayor
eficiencia de transformación, medida como el porcentaje de explantes
que formaron raíces, se obtuvo en la toronja Duncan (78 %),
seguida por la toronja Rio Red (68 %) y la lima dulce (60 %). Se detectó
actividad de GUS en 89, 92 y 76 % de las raíces generadas en
toronja Duncan, toronja Rio Red y lima dulce, respectivamente. Luego
se regeneraron brotes adventicios a través de organogénesis en
segmentos de raíz transformada cultivados en medios con citocininas
o con citocininas y auxinas; tales brotes adventicios se generaron en
24 % de los casos en toronja Duncan, en 14 % de los de toronja Rio
Red y en 8 % de los de lima dulce. Los análisis GUS confirmaron que
las plantas regeneradas conservaron la actividad de este gen introducido
a las raíces transformadas. Los resultados mostraron que el sistema
de transformación establecido introdujo exitosamente ADN foráneo
a la toronja y a la lima dulce, y que puede ser útil para la generación
de plantas que expresen genes de interés agronómico.
Palabras clave: Citrus paradisi, Citrus limmettioides, raíces transformadas,
transformación genética.
SUMMARY
Genetic transformation is an attractive technique for citrus improvement
because it avoids long juvenile periods and it offers the
ability to introduce single new characteristics into a cultivar without
altering existing traits. Development of efficient genetic transformation
systems that confer agronomic advantages is an indispensable
step to apply this technology to citrus breeding. In this report we pre-
sent the development of genetic transformation systems for grapefruit
(Citrus paradisi cvs. Duncan and Rio Red) and sweet lime (C. limmettioides)
using Agrobacterium rhizogenes. First, transformed roots were
generated by coculturing stem segments obtained from in vitro germinated
seedlings with A. rhizogenes strain A4 containing the wild-type
plasmid pRiA4 and the binary vector pESC4 with nos-nptII and cabgus
genes. The highest transformation efficiency, measured as the
percentage of root forming explants, was obtained in Duncan grapefruit
(78 %), followed by Rio Red grapefruit (68 %) and sweet lime
(60 %). GUS activity was observed in 89, 92 and 76 % of Duncan and
Rio Red grapefruits, and sweet lime roots, respectively. Second, adventitious
buds were regenerated through organogenesis on transformed
root segments cultivated in media with either cytokinins and
auxins or only cytokinins. Adventitious buds were generated in 24, 14
and 8 % of the segments of Duncan and Rio Red grapefruits, and
sweet lime transformed roots, respectively. Regenerated buds were
transferred to medium without growth regulators to elongate and
produce adventitious roots. GUS analyses confirmed that generated
plants conserved its activity. Our results show that the established
transformation system successfully delivered foreign DNA to grapefruit
and sweet lime, and it might be useful in generation of plants
expressing genes of agronomic interest.
Index words: Citrus paradisi, Citrus limmettioides, genetic transformation,
transformed roots.
INTRODUCCIÓN
México ocupa el 5º lugar mundial en producción de cítricos,
con poco más de 5.5 millones de toneladas cosechadas
durante 1999-2000 (FAO, 2001). Los cítricos más
importantes son la naranja dulce (Citrus sinensis) y el limón
mexicano (C. aurantifolia), seguidos por la mandarina
(C. reticulata), toronja (C. paradisi) y lima dulce (C.
limmettioides). El cultivo de los cítricos está expuesto a
factores que disminuyen la producción y restringen su extensión,
como las enfermedades, plagas y condiciones de
estrés abiótico, problemas que se pueden resolver mediante
la generación de materiales genéticamente más resistentes,
más productivos y de mejor calidad. Los programas de

RAÍCES Y PLÁNTULAS TRANSGÉNICAS DE TORONJA Y LIMA DULCE Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
fitomejoramiento convencional han logrado avances sustanciales
en la obtención de nuevas variedades en muchas
especies de plantas cultivadas; sin embargo, los largos periodos
de juvenilidad, la existencia de híbridos interespecíficos
o poliploides complejos que se deben propagar de
forma vegetativa, el reducido número de genotipos disponibles
y el desarrollo de embriones nucelares, dificultan y
prolongan la selección de plantas en los cítricos (Gmitter et
al., 1992). La introducción directa de genes a través de la
transformación genética podría acelerar el mejoramiento
de las especies citrícolas y evitar los obstáculos antes descritos.
Recientemente se ha reportado la transformación genética
en varias especies de cítricos a través del uso de diversas
metodologías (Pérez-Molphe-Balch, 2003). Luth y
Moore (1999) fueron los primeros en reportar la transformación
genética de toronja (Citrus paradisi), al introducir
mediante Agrobacterium tumefaciens el gen reportero gus
y el marcador de selección nptII; observaron actividad de
GUS (β-glucuronidasa) en 43.5 % de los brotes regenerados
después de la transformación, pero la mayoría resultaron
ser quimeras y sólo 11.9 % mostró actividad en todos
los tejidos, y obtuvieron algunas plantas transgénicas del
cultivar Duncan al enraizar algunos de los brotes generados.
Yang et al. (2000) también obtuvieron plantas transgénicas
de toronja cv. Rio Red al introducir una construcción
que incluía el gen gus, una versión no traducible del gen
de la cápside del Virus de la Tristeza de los Cítricos
(VTC) y el gen de la aglutinina de Galanthus nivalis (con
propiedades insecticidas); debido a su incapacidad de enraizamiento,
los brotes generados fueron injertados sobre
plántulas no transformadas, y así pudieron obtener plantas
completas. Febres et al. (2003) generaron y caracterizaron
plantas de toronja cv. Duncan transformadas con varias
secuencias del VTC, con un promedio de 14 % de brotes
GUS positivos, aunque 83 % de estos brotes resultaron ser
quimeras. En todos los trabajos citados se utilizaron sistemas
de transformación basados en el cocultivo de explantes
con A. tumefaciens y en la posterior regeneración de
brotes por organogénesis directa a partir de los tejidos cocultivados.
En el caso de la lima dulce (C. limmettioides),
no existen reportes previos de transformación genética.
La transformación con A. rhizogenes para la introducción
directa de genes es un sistema alternativo que ha sido
utilizado con éxito en cítricos como el limón mexicano
(Pérez-Molphe-Balch y Ochoa-Alejo, 1998) y el naranjo
agrio (C. aurantium) (Chávez-Vela et al., 2003). Consiste
en la generación de raíces transformadas al cocultivar explantes
con una cepa silvestre de A. rhizogenes que contenga,
además del plásmido Ri, un vector binario con los
252
genes de interés. Las raíces transformadas son usadas como
explantes para la regeneración de brotes transgénicos
por organogénesis. Este sistema de transformación ha mostrado
algunas ventajas con respecto al basado en A. tumefaciens,
como mayor eficiencia de transformación, ausencia
de quimeras y fácil enraizamiento de los brotes transgénicos
generados (Pérez-Molphe-Balch, 2003). A la fecha
no existen reportes de transformación genética de la toronja
y la lima dulce al usar A. rhizogenes como vector.
El objetivo del presente estudio fue desarrollar sistemas
alternos para la transformación genética de toronja y lima
dulce mediante el uso de A. rhizogenes, ya que esta tecnología
podría permitir la introducción directa de genes de
interés agronómico, como los que confieren mayor resistencia
a plagas, enfermedades y factores ambientales adversos,
o mejoran la calidad del fruto.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal. Los explantes usados para el cocultivo
se tomaron de plántulas de toronja (cvs. Duncan y Rio
Red) y lima dulce germinadas in vitro, éstas provenientes
de semillas de frutos seleccionados por su buen tamaño y
color, y por la ausencia de daños y síntomas de infección
por microorganismos. Las semillas se lavaron tres veces
con el detergente líquido Dermoclean 1 %, luego se trataron
con etanol 70 % durante 45 s y finalmente se desinfectaron
por 25 min con una solución de hipoclorito de sodio
0.75 %. Se enjuagaron cuatro veces con agua destilada esterilizada
y se sembraron en condiciones de asepsia, en el
medio básico MS (Murashige y Skoog, 1962) con 50 % de
la concentración de sales y compuestos orgánicos, pH 5.7
y 8 g L -1 de agar (Sigma) como gelificante. Estos cultivos
se mantuvieron en oscuridad a 25 ± 2 °C por dos meses y
luego se incubaron bajo luz continua por dos semanas con
una intensidad lumínica de 54 µmol m -2 s -1 , provista por
lámparas fluorescentes de 75 W.
Generación de raíces transformadas. Se utilizó la cepa
A4 de A. rhizogenes, que es de tipo agropina y contiene
el plásmido silvestre pRiA4 que confiere el fenotipo de
raíces pilosas. Además, le fue introducido el plásmido
ESC4 que actúa como vector binario y que lleva el gen
marcador de selección de la neomicina fosfotransferasa II
(nptII) bajo el control del promotor y terminador nos y
el gen reportero de la β-glucuronidasa (gus) bajo el control
del promotor cab y el terminador ocs (Jofre-Garfias et
al., 1997). La bacteria se cultivó en medio YM líquido
(manitol 10 g L -1 , sulfato de magnesio 0.2 g L -1 , fosfato
dibásico de potasio 0.5 g L -1 , extracto de levadura 0.4 g
L -1 y cloruro de sodio 0.1 g L -1 ) con 50 mg L -1 de rifampicina
y 50 mg L -1 de kanamicina, y se incubó por 72 h a
28 °C con agitación orbital a 120 rpm. Para

SERNA Y PÉREZ Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
asegurar una densidad conocida y homogénea de bacterias
en los experimentos de cocultivo, la cantidad de células
por mL del cultivo bacteriano se determinó con un espectrofotómetro,
mediante la determinación de la absorbancia
a 620 nm e interpolación del valor obtenido en una curva
patrón anteriormente elaborada. Una vez conocida la densidad
del cultivo, éste se diluyó en medio MS líquido hasta
obtener las suspensiones de 1x10 8 y 1x10 9 células/mL usadas
en los experimentos posteriores.
El cocultivo se realizó en dos etapas; en la primera se
colocaron los explantes dentro de la suspensión bacteriana
por 45 min, y luego se eliminó el exceso de líquido con
una gasa esterilizada. En la segunda etapa los explantes se
dejaron en medio MS sólido por 72 ó 96 h, según el experimento.
En un primer experimento se probaron dos tipos
de explantes para elegir el de mayor eficiencia de transformación:
segmentos de tallo y de raíz de 15-20 mm, a
los que se les hicieron de cuatro a seis heridas transversales
con bisturí. La suspensión bacteriana fue de 1x10 8 células/mL
y el cocultivo se hizo por 72 h, para después transferir
los explantes al medio de selección. Se utilizaron 50
explantes de cada tipo por especie y el experimento completo
se repitió dos veces.
En un segundo experimento se probaron ocho tratamientos
resultantes de dos tiempos de cocultivo (72 y 96
h), dos concentraciones de la suspensión bacteriana (1x10 8
y 1x10 9 ) e infiltración con vacío (con y sin infiltración),
para elegir el tratamiento de mayor eficiencia de transformación.
La técnica de infiltración consiste en aplicar tres
ciclos de vacío (60 kPa) de 2 min cada uno, durante los 45
min de incubación con la suspensión bacteriana. Los explantes
usados fueron segmentos de tallo de 15-20 mm
heridos con el bisturí, con 50 explantes por tratamiento y
por especie, y el experimento completo se repitió dos veces.
El medio de selección que se utilizó en todos los casos
fue el MS suplementado con 5 % p/v de sacarosa, 0.8 %
p/v de agar, 500 mg L -1 de cefotaxima (Claforan, Russell),
500 mg L -1 de carbenicilina (Carbecin, Sanfer); estos
dos antibióticos se usaron para eliminar la bacteria, y 50
mg L -1 de kanamicina (Sigma-Aldrich) como agente selectivo.
La concentración óptima de kanamicina se determinó
mediante la elaboración de una curva de tolerancia con tejidos
no transformados (datos no mostrados).
En todos los experimentos los cultivos se incubaron a
25 ± 2 °C en la oscuridad y los resultados que se registraron
a los 40 d de cultivo: porcentaje de explantes que presentaron
raíces y número promedio de raíces por explante.
Las raíces presuntamente transformadas obtenidas de
los experimentos anteriores se subcultivaron cada 30 d,
mediante separación del explante original y su transferencia
a medio de selección fresco.
253
Regeneración de brotes adventicios a partir de las
raíces transformadas. Como explantes se usaron segmentos
de 15 mm de longitud de raíz transformada, obtenidos
de los experimentos antes descritos, los cuales se sembraron
en posición vertical con la parte proximal sobresaliendo
del medio. Para cada especie se estableció un experimento
donde se probaron ocho tratamientos obtenidos de la
aplicación de citocininas solas o combinadas con una auxina
en el medio de cultivo (Cuadros 6, 7 y 8). Estos tratamientos
se seleccionaron con base en experimentos previos
con tejido no transformado (datos no mostrados). Los cultivos
se mantuvieron en oscuridad a una temperatura de 25
± 2 °C durante 8 d y luego se incubaron bajo luz continua
(54 µmol m -2 s -1 ) a una temperatura de 25 ± 2 °C. Los
resultados se registraron a los 40 d, como porcentaje de
explantes que generaron brotes y número promedio de
brotes producidos por explante. En este experimento se
utilizaron 25 explantes de cada especie por tratamiento, y
el experimento completo se repitió dos veces. Los mayores
brotes regenerados (> 15 mm de longitud) fueron separados
del explante original y transferidos a medio sin reguladores
para su crecimiento y enraizamiento.
Análisis de los resultados. Para todos los experimentos
antes descritos se utilizó un diseño completamente al
azar. Los promedios de número de raíces por explante y
de número de brotes por segmento de raíz transformada se
compararon t de Student (cuando se tenían sólo dos tratamientos)
o con un análisis de varianza cuando se tenían
tres o más tratamientos; en este último caso se utilizó la
prueba de Tukey-Kramer para la comparación de las medias.
Los resultados que se muestran en los Cuadros 2 a 8
integran los datos de las dos repeticiones hechas por experimento.
Caracterización de los tejidos transformados. Para la
confirmación de la transformación de las raíces y brotes
obtenidos se realizaron ensayos histoquímicos, amplificación
de los genes introducidos por PCR (“Polymerase
Chain Reaction”) e hibridación tipo "Southern blot". El
ensayo histoquímico para detectar la actividad de GUS se
hizo con el método de Stomp (1992), en todas las líneas de
raíces transformadas y en algunos de los brotes producidos
a partir de las mismas (aquéllos que tenían un tamaño suficiente
para tomar una muestra de su tejido sin dañarlos).
El volumen de la solución de reacción que se utilizó fue el
necesario para cubrir por completo al tejido. Las muestras
se incubaron por 12 h a 37 ºC; después se lavaron varias
veces en etanol 96 % para eliminar la clorofila y se registró
el resultado del ensayo. Para el análisis PCR, el ADN
de las raíces transformadas se extrajo con el método
propuesto por Edwards et al. (1991). Los genes que se
amplificaron del ADN vegetal fueron gus, nptII, rolB y
virD1, mediante el procedimiento descrito por Hamill et

RAÍCES Y PLÁNTULAS TRANSGÉNICAS DE TORONJA Y LIMA DULCE Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
al. (1991), con un termociclador Bio-Rad Gene Cycler
programado para 30 ciclos con las siguientes condiciones:
Desnaturalización por 1 min a 94 °C, alineamiento por 1
min a 55 °C y extensión por 3 min a 72 °C. Los iniciadores
que se utilizaron para las reacciones de PCR se muestran
en el Cuadro 1. El gen virD1 de Agrobacterium no se
transfiere al genoma de la planta, por lo que se utilizó para
descartar la presencia residual de la bacteria en el tejido
vegetal.
Los productos de la amplificación se analizaron en un
gel de agarosa 1.25 % teñido con bromuro de etidio. Para
el "Southern blot" se extrajo ADN de raíces presuntamente
transformadas, de acuerdo con el método de Draper y
Scott (1988). El ADN fue digerido con la enzima HindIII
(New England BioLabs, E.U.A.) y separado en un gel de
agarosa 0.7 %. Se utilizaron 20 µg del ADN digerido por
carril. Después de la electroforesis el gel se desnaturalizó
con NaOH 0.5 M y NaCl 1.5 M, y luego se neutralizó con
Tris-HCl pH 8.0 1 M y NaCl 1.5 M. El ADN se transfirió
por capilaridad a una membrana de nylon (Amersham Hybond-N
+ ) y se fijó a la misma en una estufa a 90 °C por 2
h. La sonda que se usó fue un fragmento de 517 pb del gen
npt II marcado con digoxigenina (DIG). El marcaje de la
sonda, la hibridización y la detección se realizaron con el
"Dig High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit
II" (Boehringer Mannheim, Alemania). Debido a la necesidad
de sacrificar una cantidad considerable de tejido para
extraer el ADN, los análisis PCR y Southern blot se hicieron
sólo en una muestra de las raíces transformadas generadas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En un primer experimento se probaron dos tipos de explantes,
segmentos de epicotilo y de raíz, para determinar
al más susceptible a la transformación con A. rhizogenes.
En las tres especies se obtuvieron raíces transformadas en
ambos tipos de explante. Sin embargo, la eficiencia de
transformación, medida como porcentaje de explantes que
254
forman al menos una raíz transformada, fue mayor con
segmentos de tallo (Cuadro 2) (Figura 1a, b). En toronja
Duncan, el número promedio de raíces que se forman por
explante fue también significativamente mayor al utilizar
segmentos de tallo. En las otras especies no se encontraron
diferencias significativas entre el número promedio de raíces
transformadas generadas en segmentos de tallo y de
raíz. En varios explantes se observó la aparición de tejido
calloso en las heridas, además de raíces transformadas. En
los tres cítricos probados, las eficiencias de transformación
que se obtuvieron fueron menores a las observadas con la
misma cepa de A. rhizogenes en limón mexicano, con una
eficiencia de 94 % (Pérez-Molphe-Balch y Ochoa-Alejo,
1998), y en naranjo agrio con una eficiencia del 91 %
(Chávez-Vela et al., 2003). Estas diferencias pueden atribuirse
a factores genéticos inherentes a las especies de cítricos
analizadas en cada caso, ya que las condiciones utilizadas
para la transformación fueron muy similares.
En un segundo experimento se probó el efecto del
tiempo de cocultivo, concentración de la suspensión bacteriana
e infiltración con vacío en la eficiencia de transformación.
En este caso se utilizaron únicamente segmentos
de tallo como explantes. En general, la eficiencia de transformación
en los tres cítricos se aumentó considerablemente
debido a que se obtuvieron raíces transformadas en todos
los tratamientos. En lima dulce, la mayor eficiencia de
transformación (60 %) se obtuvo con 96 h de cocultivo y
una suspensión de 1x10 9 células/mL, mientras que el promedio
más alto de raíces transformadas por explante (2.0)
se obtuvo cocultivando por 96 h con 1x10 8 células/mL
(Cuadro 3). En la toronja Rio Red, la mayor eficiencia de
transformación (68 %) y el promedio más alto de raíces
transformadas por explante (2.56) se obtuvieron con 96 h
de cocultivo y una suspensión de 1x10 8 células/mL (Cuadro
4).
Cuadro 1. Iniciadores utilizados para la amplificación por PCR de los genes gus, nptII, rolB y virD1 en ADN genómico aislado de tejidos presuntamente transformados
de cítricos.
Gen Iniciador Secuencia Fragmento amplificado (pb)
gus 5´ GGTGGGAAAGCGCGTTACAAG
1200
3´ GTTTACGCGTTGCTTCCGCCA
nptII 5´ TATTCGGCTATGACTGGGCA
517
3´ GCCAACGCTATGTCCTGAT
rolB 5´ ATGGATCCCAAATTGCTATTCCTTCCACGA
780
3´
virD1 5´
3´
TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC
ATGTCGCAAGGACGTAAGCCCA
GGAGTCTTTCAGCATGGAGCAA
450

SERNA Y PÉREZ Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
Cuadro 2. Generación de raíces transformadas en explantes de tallo y raíz de
lima dulce y toronja Rio Red y Duncan.
Especie Tipo de explante Eficiencia de
transformación
(%)
Número de raíces
por explante
(Promedio)
1.1 a
1.3 a
1.1 a
Lima dulce Tallo
22
Raíz
6
Toronja Rio Red Tallo
46
Raíz
8
1.4 a
Toronja Duncan Tallo
72
3.3 a
Raíz
4
1.3 b
La eficiencia de transformación se determinó como porcentaje de explantes
cocultivados que generaron raíces transformadas.
Para obtener el promedio de raíces por explante, se dividió el número total
de raíces entre el número de explantes que produjeron raíces. Las medias seguidas
de la misma letra en cada especie no son diferentes estadísticamente (t
de Student, 0.05).
Cuadro 3. Efecto de la concentración de bacteria, tiempo de cocultivo y el uso
de la técnica de infiltración al vacío en la producción de raíces transformadas
sobre segmentos internodales de lima dulce.
Tiempo de
cocultivo
(h)
Concentración
de la
bacteria
[células/mL]
Infiltración
con vacío
Eficiencia
de transformación
(%)
Número de
raíces por
explante
(Promedio)
72 [1x10 8 ] + 44 1.2 b
72 [1x10 8 ] - 44 1.6 ab
72 [1x10 9 ] + 40 1.4 ab
72 [1x10 9 ] - 52 1.4 ab
96 [1x10 8 ] + 56 1.9 a
96 [1x10 8 ] - 36 2.0 a
96 [1x10 9 ] + 52 1.3 ab
96 [1x10 9 ] - 60 1.5 ab
La eficiencia de transformación se determinó como el porcentaje de explantes
cocultivados que generaron raíces transformadas.
Para obtener el promedio de raíces por explante, se dividió el número total
de raíces entre el número de explantes que produjeron raíces. Las medias seguidas
de la misma letra no son diferentes estadísticamente (Tukey-Kramer,
0.05).
Cuadro 4. Efecto de la concentración de bacteria, tiempo de cocultivo y el uso
de la técnica de infiltración al vacío en la producción de raíces transformadas
sobre segmentos internodales de toronja Rio Red.
Tiempo de
cocultivo
(h)
Concentración
de la
bacteria
[células/mL]
Infiltración
con vacío
Eficiencia
de transformación
(%)
Número de
raíces por
explante
(Promedio)
72 [1x10 8 ] + 40 1.5 ab
72 [1x10 8 ] - 36 1.3 b
72 [1x10 9 ] + 48 1.4 b
72 [1x10 9 ] - 52 1.5 ab
96 [1x10 8 ] + 68 1.8 ab
96 [1x10 8 ] - 60 1.9 ab
96 [1x10 9 ] + 64 2.6 a
96 [1x10 9 ] - 56 2.3 ab
La eficiencia de transformación se determinó como el porcentaje de explantes
cocultivados que generaron raíces transformadas.
Para obtener el promedio de raíces por explante, se dividió el número total
de raíces entre el número de explantes que produjeron raíces. Las medias seguidas
de la misma letra no son diferentes estadísticamente (Tukey-Kramer,
0.05).
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La mayor eficiencia de transformación en los materiales
estudiados se obtuvo en la toronja Duncan, donde 78 %
de los explantes cocultivados por 96 h con una suspensión
de 1x10 9 bacterias/mL generaron raíces transformadas. En
este tratamiento también se obtuvo el mayor promedio de
raíces transformadas por explante (2.94) (Cuadro 5). La
infiltración con vacío durante la incubación con la suspensión
bacteriana tiene como fin facilitar la penetración de
Agrobacterium en las heridas realizadas al explante, para
elevar así la eficiencia de transformación. Sin embargo, en
ninguna de las especies evaluadas hubo un incremento significativo
de la eficiencia a causa de la infiltración, lo que
sugiere que no es indispensable en este sistema de transformación.
Las raíces transformadas mantuvieron su crecimiento
al subcultivarlas a medio fresco (Figura 1c). Los
ensayos histoquímicos mostraron actividad de GUS, medida
como la aparición de un precipitado azul en los tejidos,
en 89, 92 y 76 % de las raíces generadas de toronja Duncan,
toronja Rio Red y lima dulce, respectivamente. También
el tejido calloso generado en algunos explantes mostró
esta actividad (Figura 1d).
Cuadro 5. Efecto de la concentración de bacteria, tiempo de cocultivo y el uso
de la técnica de infiltración al vacío en la producción de raíces transformadas
sobre segmentos internodales de toronja Duncan.
Tiempo de
cocultivo
(h)
Concentración
de la
bacteria
[células/mL]
Infiltración
con vacío
Eficiencia
de transformación
(%)
Número de
raíces por
explante
(Promedio)
72 [1x10 8 ] + 38 1.2 b
72 [1x10 8 ] - 43 1.1 b
72 [1x10 9 ] + 56 1.8 ab
72 [1x10 9 ] - 66 1.8 ab
96 [1x10 8 ] + 72 1.9 ab
96 [1x10 8 ] - 68 2.1 ab
96 [1x10 9 ] + 78 2.9 a
96 [1x10 9 ] - 64 2.1 ab
La eficiencia de transformación se determinó como el porcentaje de explantes
cocultivados que generaron raíces transformadas.
Para obtener el promedio de raíces por explante, se dividió el número total
de raíces entre el número de explantes que produjeron raíces. Las medias seguidas
de la misma letra no son diferentes estadísticamente (Tukey-Kramer,
0.05).
La generación de brotes a partir de las raíces transformadas
se logró en las tres especies estudiadas (Cuadros 6,
7 y 8). La mayor eficiencia se obtuvo en toronja Duncan
cultivadas en medio con 7.5 mg L -1 de BA y 1 mg L -1 de
AIA, donde 24 % de los segmentos de raíz generaron brotes,
con un promedio de 3.3 brotes por explante (Cuadro
8). El porcentaje de regeneración de brotes de toronja
Duncan resultó menor que el del limón mexicano, donde
se obtuvo 41 % de segmentos de raíz transformada que
produjeron brotes; sin embargo, en el limón mexicano se
produjo un promedio de 2.17 brotes por explante (Pérez-
Molphe-Balch y Ochoa-Alejo, 1998), valor que es menor
al 3.3 obtenido con la toronja Duncan.

RAÍCES Y PLÁNTULAS TRANSGÉNICAS DE TORONJA Y LIMA DULCE Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
Tanto el porcentaje de regeneración de brotes como el
número promedio de brotes generados por segmento de
raíz en la toronja Duncan, superaron los valores de 18 % y
1.25 brotes/explante reportados para el naranjo agrio
(Chávez-Vela et al., 2003). En lima dulce y toronja
Rio Red las eficiencias de regeneración fueron menores
(Cuadros 6 y 7). En todos los casos, los brotes se generaron
en la parte superior de los segmentos de raíz cultivados
verticalmente (Figura 1e). En experimentos previos se observó
que la eficiencia de regeneración en raíces cultivadas
en posición horizontal es nula en toronja y muy baja en
lima dulce (datos no mostrados).
Los ensayos histoquímicos registraron actividad de
GUS en todos los tejidos de los brotes regenerados a partir
de raíces transformadas (Figura 1f). De los brotes generados
en toronja Duncan, toronja Rio Red y lima dulce, 42,
36 y 28 % crecieron satisfactoriamente y pudieron ser aislados
y transferidos a medio sin reguladores para su enraizamiento,
el cual ocurrió sin problemas. El resto de los
brotes nunca alcanzaron un tamaño suficiente para ser aislados
y con el tiempo murieron, aun cuando fueron subcultivados
con frecuencia unidos a los segmentos de raíz que
los generaron. Este problema podría resolverse con un
medio y condiciones de cultivo más adecuados para el crecimiento
de los brotes una vez que han sido generados.
Otra opción sería microinjertarlos sobre patrones no transformados
con el fin de acelerar su desarrollo, tal como se
ha hecho con brotes transformados con A. tumefaciens
(Yang et al., 2000).
La confirmación de los transformantes a través de los
análisis PCR resultó positiva al amplificarse los genes
rolB, nptII y gus a partir de ADN extraído de raíces transformadas
(Figura 2 a y b). En los tres casos se amplificaron
bandas con el peso molecular esperado. Asimismo, en
algunas de las amplificaciones se incluyeron iniciadores
diseñados para la amplificación del gen virD1, que no se
encuentra en el ADN-t del plásmido Ri, por lo que no se
transfiere al genoma de la planta. En 75 % de los casos la
amplificación del gen virD1 resultó negativa, en las cuales
se descarta la presencia de Agrobacterium residual en estas
muestras. Sin embargo, en el 25% restante sí hubo amplificación
de este gen a partir de ADN aislado de tejidos
transformados, lo que indica que en estas líneas la exposición
a los antibióticos no fue suficiente para eliminar a la
bacteria y que deberán probarse sistemas más eficientes
para lograrlo.
256
Cuadro 6. Producción de brotes adventicios regenerados de segmentos de raíz
transformada de lima dulce cultivados en medios con reguladores del crecimiento
vegetal.
Reguladores del
crecimiento
(mg L -1 )
BA 2iP AIA
5
5
7.5
7.5
0
0
0
0
0
0
0
0
7.5
7.5
10
10
0
1
0
1
0
1
0
1
Segmentos de raíz con brotes
adventicios
(%)
0
8
4
8
4
6
6
2
Brotes adventicios por
segmento de raíz
(Promedio)
0
1.6 b
1.2 bc
1.4 bc
1.6 b
1.2 c
2.2 a
1.2 c
Para obtener el promedio de brotes por explante, se dividió el número total
de brotes entre el número de explantes que produjeron raíces. Medias con
letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey-Kramer, 0.05).
Cuadro 7. Producción de brotes adventicios regenerados de segmentos de raíz
transformada de toronja Rio Red cultivados en medios con reguladores del
crecimiento vegetal.
Reguladores del
crecimiento
(mg/L -1 )
BA 2iP AIA
5
5
7.5
7.5
0
0
0
0
0
0
0
0
7.5
7.5
10
10
0
1
0
1
0
1
0
1
Segmentos de raíz con
brotes adventicios
(%)
0
4
4
8
12
10
14
14
Brotes adventicios por
segmento de raíz
(Promedio)
0
1.4 c
1.2 c
1.6 c
2.4 c
2.8 c
7.0 a
4.2 b
Para obtener el promedio de brotes por explante, se dividió el número total
de brotes entre el número de explantes que produjeron raíces. Medias con
letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey-Kramer, 0.05).
Cuadro 8. Producción de brotes adventicios regenerados de segmentos de raíz
transformada de toronja Duncan cultivados en medios de cultivo MS con reguladores
del crecimiento vegetal.
Reguladores del
crecimiento
(mg/ L -1 )
BA 2iP AIA
5
5
7.5
7.5
0
0
0
0
0
0
0
0
7.5
7.5
10
10
0
1
0
1
0
1
0
1
Segmentos de raíz con
brotes adventicios
(%)
8
14
8
24
0
10
8
12
Brotes adventicios por
segmento de raíz
(Promedio)
1.2 b
1.3 b
1.6 b
3.3 a
0
1.3 b
1.2 b
1.6 b
Para obtener el promedio de brotes por explante, se dividió el número total
de brotes entre el número de explantes que produjeron raíces. Medias con
letras iguales no son estadísticamente diferentes (Tukey-Kramer, 0.05).

SERNA Y PÉREZ Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
Figura 1. a) Generación de raíces transformadas en segmentos de tallo de toronja Duncan, 40 días después de ser cocultivados con Agrobacterium rhizogenes
A4/pESC4. b) Generación de raíces transformadas en segmentos de tallo de lima dulce 40 días después de ser cocultivados con Agrobacterium rhizogenes A4/pESC4.
c) Raíces transformadas de toronja Duncan creciendo después de dos subcultivos a medio de selección fresco. d) Ensayo histoquímico para la detección de actividad
de GUS en tejido calloso y raíces transformadas de toronja Rio Red. A la izquierda se muestran tres segmentos de raíz no transformada usados como testigo negativo.
e) Generación de un brote adventicio en el extremo superior de un segmento de raíz transformada de toronja Duncan cultivado en medio con 7.5 mg L -1 de BA y 1 mg
L -1 de AIA. f) Ensayo histoquímico para la detección de actividad de GUS en un brote adventicio de toronja Duncan generado a partir de un segmento de raíz transformada.
257

RAÍCES Y PLÁNTULAS TRANSGÉNICAS DE TORONJA Y LIMA DULCE Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
rolB
a
nptII
Figura 2. a) Amplificación por PCR de los genes rolB, nptII y gus en ADN de raíces transformadas de toronja Duncan. b) Amplificación por PCR de los genes rolB,
nptII y gus en ADN de raíces transformadas de lima dulce. c) Análisis por Southern blot del ADN genómico de raíces transformadas de toronja Duncan (carril 1),
toronja Rio Red (carril 2) y lima dulce (carril 3), al utilizar como sonda un fragmento del gen nptII.
Finalmente, el análisis por Southern blot confirmó
también la transformación genética en las líneas analizadas,
al detectarse señales de hibridación entre la sonda
marcada para nptII y el ADN vegetal (Figura 2c). Se detectaron
de una a tres señales de hibridación con tamaños
de entre 7 y 11 kb, según la línea de raíces transformadas.
Esto podría indicar que en algunos casos se tuvieron integraciones
múltiples del gen nptII al genoma de la planta,
pero tendría que confirmarse mediante análisis con otras
enzimas de restricción para digerir al ADN.
CONCLUSIONES
gus
Se cumplió el objetivo de esta investigación ya que se
desarrollaron sistemas basados en Agrobacterium rhizogenes
para la transformación genética de dos cultivares de
toronja y uno de lima dulce. Se demostró la posibilidad de
generar raíces transformadas de estos cítricos mediante el
cocultivo de segmentos de tallo con A. rhizogenes, y se
demostró la posibilidad de regenerar plantas transgénicas
completas a partir de las raíces transformadas. Estas plan-
kb
10
8
c
virD1
258
pb
1500
1000
500
1 2
gus
nptII
3
rolB
b
tas mantienen y continúan expresando los genes foráneos
introducidos. Hasta donde se sabe, éste es el primer reporte
de transformación genética de estas especies mediante
A. rhizogenes.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo financiero brindado al
proyecto por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
(Proyecto 31426-B) y la Universidad Autónoma de Aguascalientes
(Proyectos PIB-98-3 y PIBT-00-1). Al CONA-
CYT se le agradece también la beca de posgrado otorgada
a A. Serna Pérez. Asimismo, agradecen a la Dra. June
Simpson del CINVESTAV por proporcionar el plásmido
ESC4 usado en este trabajo.
BIBLIOGRAFÍA
Chávez-Vela N A, L I Chávez-Ortiz, E Pérez-Molphe-Balch (2003)
Transformación genética del naranjo agrio usando Agrobacterium
rhizogenes. Agrociencia 37:629-639.

SERNA Y PÉREZ Rev. Fitotec. Mex. Vol. 27 (3), 2004
Draper J, R Scott (1988) The isolation of plant nucleic acids: In: Plant
Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory
Manual, J Draper, R Scott, P Armitage, R Walden (eds) Blackwell
Scientific Publications. Oxford. pp:199-236.
Edwards K, C Johnstone, C Thompson (1991) A simple and rapid
method for the preparation of plant genomic DNA for PCR
analysis. Nucleic Acids Res. 19:1349.
FAO (2001) Frutos Cítricos Frescos y Elaborados. Estadísticas Anuales.
Febres V J, C L Niblett, R F Lee, G A Moore (2003) Characterization
of grapefruit plants (Citrus paradisi Macf.) transformed with citrus
tristeza closterovirus genes. Plant Cell Rep. 21:421-428.
Gmitter Jr. F G, J W Grosser, G A Moore (1992) Citrus: In: Biotechnology
of Perennial Fruit Crops, F A Hammerschlag, R E Litz
(eds). CAB International. Cambridge. pp:335-369.
Hamill J D, S Rounsley, A Spencer, G Todd, M J C Rhodes (1991)
The use of the polymerase chain reaction in plant transformation
studies. Plant Cell Rep. 10:221-224.
Jofre-Garfias A E, N Villegas-Sepúlveda, J L Cabrera-Ponce, R M
Adame-Alvarez, L Herrera-Estrella, J Simpson (1997) Agrobacterium-mediated
transformation of Amaranthus hypochondriacus:
light- and tissue-specific expression of pea chlorophyll a/bbinding
protein promoter. Plant Cell Rep. 16:847-852.
259
Luth D, G Moore (1999) Transgenic grapefruit plants obtained by Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Tiss.
Org. Cult. 57:219-222.
Murashige T, F Skoog (1962) A revised medium for rapid growth and
bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15:473-479.
Pérez-Molphe-Balch E, N Ochoa-Alejo (1998) Regeneration of transgenic
plants of Mexican lime from Agrobacterium rhizogenes
transformed tissues. Plant Cell Rep. 17:591-596.
Pérez-Molphe-Balch E (2003) Genetic transformation and regeneration
of citrus species: In: Plant Genetic Engineering Vol. 6. Improvement
of Fruit Crops. P K Jaiwal, R P Singh (eds). Sci-
Tech Publishing LLC. Houston, USA. pp:1-21.
Stomp A M (1992) Histochemical detection of GUS: In. GUS Protocols:
Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression. Gallagher
S A (ed). Academic Press Inc. San Diego. pp:103-113.
Yang Z N, L L Ingelbrecht, E Louzada, M Skaria, T E Mirkov
(2000) Agrobacterium-mediated transformation of the commercially
important grapefruit cultivar Rio Red (Citrus paradisi
Macf.). Plant Cell Rep. 19:1203-1211.