g 0.05 inyectados toxina de ng (ppb) ng/g =
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g 0.05 inyectados toxina de ng (ppb) ng/g =
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DETERMINACION DE OCRATOXINA A<br />
EN CAFE VERDE, TOSTADO Y SOLUBLE<br />
POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE<br />
ALTA EFICIENCIA (HPLC)<br />
EXTRACCION<br />
1. Pesar 5 g <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> muestra molida en un vaso <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
licuadora <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> vidrio <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> 200 mL.<br />
2. Añadir 100 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> bicarbonato <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> sodio al<br />
1% en agua.<br />
3. Homogenizar durante 2 minutos a alta<br />
velocidad.<br />
4. Filtrar a través <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> papel <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> filtro cuantitativo<br />
(Por ej. S&S 589-3) doblado en abanico y<br />
colectar al menos 20 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l filtrado.<br />
5. Pipetear 20 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l filtrado y diluir con 20 mL<br />
<stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> PBS (solución salina buferada).<br />
LIMPIEZA<br />
6. Acondicionar una columna <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
inmunoafinidad para ocra<stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>> A (Micotox<br />
Ltda.) pasándole 10 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> PBS. NOTA:<br />
Colocar la columna en un soporte<br />
convencional para columnas <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> fase sólida y<br />
empatar en la parte superior <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> la misma<br />
una jeri<strong>ng</strong>a plástica <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> 50 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> capacidad.<br />
7. Pasar los 40 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l extracto diluído a<br />
través <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> la columna <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> inmunoafinidad<br />
cuidando <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> no pasar más <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> 2-3 mL por<br />
minuto.<br />
8. Una vez hayan pasado los 40 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l<br />
extracto diluido, lavar con 20 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> agua a<br />
un flujo aproximado <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> 5 mL/min.<br />
9. Secar la columna mediante vacio para<br />
retirar cualquier residuo <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> agua.<br />
10. Eluir la ocra<stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>> A con 4 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> metanol<br />
grado HPLC en un vial <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> fondo cónico <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
5 mL. NOTA: Permitir que el metanol<br />
hidrate completamente el gel durante 2 a 3<br />
minutos antes <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> eluir la ocra<stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>>.<br />
11. Evaporar el eluato a sequedad bajo<br />
nitrógeno o usando un baño termostatado<br />
a 60°C y una bomba <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> vacío.<br />
12. Disolver el residuo seco con 1 mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> fase<br />
móvil, filtrar a través <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> membrana <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> 0.45<br />
µm e inyectar 50 µL en el cromatógrafo <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
líquidos.<br />
CONDICIONES CROMATOGRAFICAS<br />
• Columna: RP-18 <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> 12.5 cm x 4 mm.<br />
• Temperatura: 40˚C.<br />
• Fase móvil: mezcla isocrática <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
acetonitrilo–agua–ácido acético (50+50+1).<br />
• Flujo: 0.6 mL/min.<br />
• Detector <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> fluorescencia <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> lo<strong>ng</strong>itu<stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>s <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
onda variables. Excitación: 330 nm,<br />
emisión: 475 nm.<br />
• Tiempo <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> retención aproximado: 7.7 min.<br />
CALIBRACION<br />
13. Pipetear 20 µL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> solución estándar <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
calibración en un vial <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> automuestreador y<br />
añadir 980 µL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> fase móvil. La solución<br />
estándar contiene 1.0 µg/mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> ocra<stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>><br />
A en metanol (solución concentrada 10X<br />
disponible en Micotox Ltda.). La solución<br />
final <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> calibración contiene 20 <strong>ng</strong>/mL <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>><br />
ocra<stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>> A. Inyectar 50 µL (1.0 <strong>ng</strong>) en el<br />
HPLC.<br />
14. Calibrar el integrador <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l HPLC usando el<br />
método <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> calibración con estándar<br />
externo.<br />
CALCULOS<br />
Se toman 5 g <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> muestra y se aña<stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>n 100 mL<br />
<stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> solvente; <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l extracto se toman 20 mL para<br />
purificación. El eluato seco se redisuelve con<br />
1.0 mL, <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l cual se inyectan 50 µL en el<br />
cromatógrafo.<br />
Equivalente en peso <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> la muestra inyectada:<br />
5 g x 20/100 mL x <stro<strong>ng</strong>>0.05</stro<strong>ng</strong>>/1.0 mL = <stro<strong>ng</strong>>0.05</stro<strong>ng</strong>> g<br />
<strong>ng</strong> <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> <stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>> <stro<strong>ng</strong>>inyectados</stro<strong>ng</strong>><br />
<strong>ng</strong>/g (<strong>ppb</strong>) =<br />
<stro<strong>ng</strong>>0.05</stro<strong>ng</strong>>g<br />
www.micotox.com info@micotox.com micotox@cable.net.co Telefax(+57-1) 2870572 Bogotá, D.C., Colombia
Cantidad <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> estándar <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> ocra<stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>> A<br />
inyectado en el HPLC (<strong>ng</strong>):<br />
Vol. (µL) OCRATOXINA A<br />
50 1.0 <strong>ng</strong><br />
Equivalente en <strong>ppb</strong> <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>l estándar <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> ocra<stro<strong>ng</strong>>toxina</stro<strong>ng</strong>> A<br />
inyectado en el HPLC (<strong>ng</strong>/g):<br />
Vol. (µL) OCRATOXINA A<br />
50 20 <strong>ppb</strong><br />
Límite <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>> <stro<strong>ng</strong>>de</stro<strong>ng</strong>>tección:
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