P.C.R. "Técnica de amplificación enzimática de secuencias ...

P.C.R.
"Técnica de amplificación
enzimática de secuencias específicas
de DNA"
• Paso 1: Desnaturalización del DNA
• Paso 2: Hibridación de los "Primers"
• Paso 3: Extensión

Paso 1: Desnaturalización del DNA (>90ºC)

Paso 2: Hibridación de los "Primers"(40-65ºC)

Paso 3: Extensión (72ºC)

Final del Primer Ciclo de PCR

Alineamiento y extensión extensi extensión
5’
T
A C G
3’
A T G C A T G C A T G C

•
Alineamiento y extensión
extensi extensión
5’ 3’
-T
A C G T
• -A T G C A T G C A T G C * *

•
Alineamiento y extensión
extensi extensión
5’ 3’
-T A C G T A
• -A T G C A T G C A T G C * *

•
Alineamiento y extensión
extensi extensión
5’ 3’
-T A C G T A C
• -A T G C A T G C A T G C * *

•
Alineamiento y extensión
extensi extensión
5’ 3’
-T A C G T A C G
• -A T G C A T G C A T G C * *

El Poder de la P.C.R. P.C.R P.C.R.
"En cada ciclo de PCR se consigue duplicar el
número de copias de DNA"
2
4
8
16 32 64

• ELISA en Microplaca
• Electroforesis en Gel de Agarosa
• Hibridación en membrana
• Secuenciación
Detección

Tipaje por PCR-SSO PCR PCR-SSO SSO de los genes HLA clase II
La PCR amplifica
la parte seleccionada
Se añade los primers
marcados con biotina
Extracción DNA
Se añade el DNA
DNA al soporte.
Reacción de color
amplificado
Lavados
Soporte con las
sondas unidas para
cada especificidad
HLA-II
Identificación
del DNA unido
por la posición
en el soporte

Tipaje por PCR-SSP PCR PCR-SSP SSP de los genes HLA clase II
DNA
amplificado
La PCR amplifica
la parte seleccionada
Se añaden los primers
Extracción DNA
Se añade el DNA
al gel de agarosa.

B
B
B
Añadir
solución
stop
B
B
Productos
de PCR
biotinilados
Elisa microplaca
TMB
TMB oxidado
Av-HRP HRP
B
Av
BSA BSA BSA BSA
Medir a 450 Añadir Substrato
para HRP
Lavar
B
B
B
B
B
B
BSA BSA BSA BSA
Lavar
Av-HRP Av HRP
Av-HRP Av HRP
B
Av-HRP Av HRP
BSA BSA BSA
Av-HRP Av HRP
BSA BSA
Añadir Avidina-HRP

Visualización del ADN
ADN* biotina
SA
Conjugado
HRP
Sustrato

TIPAJE MEDIANTE
SECUENCIACIÓN (SBT)
HLA- A HLA-B HLA-C
Ex 2
Ex 3
Ex 4
Ex 2
Ex 3
Ex 4
Comparación de la secuencia obtenida con la base de datos
Ex 2
Ex 3

P.C.R. de RNA: RT-PCR
• Preparación ARN:
– Eliminar ribonucleasas
– RNA m
– Guantes
– Recipientes de plástico estériles
– Soluciones libres de ARNasas

P.C.R. de RNA: RT-PCR
• Transcripción Reversa del RNA para
convertirlo en cDNA
• P.C.R. del cDNA

Componentes y optimización de la
reacción de amplificación

Muestra de ADN
Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en
trozos más pequeños de lo que queremos amplificar.
Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra
no debe llevar agentes quelantes (EDTA). Tampoco debe
haber determinados factores sanguíneos, fenol,
detergentes... que inhibirían la actividad de la polimerasa.
Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente
cantidad para la amplificación de ADN genómico de copia
única se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de
zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng.

Diseño de los cebadores
El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%.
La relación máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%.
Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.
No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una
importante estructura secundaria.
Recomendable, los extremos las últimas bases sean G o C.
Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de
cebadores (dimeros primers)..
Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb.
La Temperatura de hibridación de los cebadores debe ser
similar en ambos y será variable en función de la secuencia de
los mismos. Generalmente oscila entre los 45 y 60 ° C.

DNA Polimerasa
Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa.
Conseguir las mejores condiciones para disminuir errores:
No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error
es proporcional al número de estos (25-45).
La concentración de dNTPs debe ser igual para los 4,
siendo lo mas baja posible, sin perder rendimiento.
Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.
La concentración de Mg ++ no debe estar en exceso, ya que
disminuye la especificidad de la PCR.

Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)
dATP, dGTP, dCTP y dTTP.
Añadir en la solución de la reacción en concentraciones
iguales que normalmente oscila entre los 20 y los 200 mMol".
Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las
concentraciones de ambos componentes deben guardar
siempre la misma relación. La concentración de Mg ++ debe ser
de 0.5 – 1.0 mM veces superior a la concentración de dNTPs.

Amortiguador de la reacción
Por lo general está formado por:
10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente)
50 mM KCl, 0.1%
1.5 mM MgCl2.
Adyuvantes (aumentan la especificidad y fidelidad de la PCR):
•El dimetilsulfóxido (DMSO al 10%) contribuye a la
disminución de la estructura secundaria del ADN
•Detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón
x10, que ayudan a estabilizar la enzima.
•Polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina
bovina (BSA), etc, aunque no son en ningún caso
imprescindibles.

Sales
Es de gran importancia la concentración de dos cationes
*KCl (Influye en la desnaturalización del ADN)
Elevadas concentraciones del K + favorece la
desnaturalización de secuencias cortas de ADN.
Bajas concentraciones de K + ayudan a la desnaturalización de
secuencias largas de ADN.
*MgCl ++ (Aumenta la temperatura de hibridación del DNA)
Altas concentraciones de Mg ++ disminuyen la especificidad de
la reacción.
Bajas concentraciones de Mg ++ aumentan la especificidad de
la reacción

Temperaturas y tiempos de los ciclos
La Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres
etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número
determinado de veces:
1.- Desnaturalización
2.- Hibridación
3.- Elongación
El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores
determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto
modificándolos podemos optimizar la reacción.

1.- Desnaturalización
Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el
ADN molde se desnaturalice completamente.
Se recomiendan temperaturas de 94º-95ºC durante 30´´ a 1´
Alto contenido de G + C aumentar el tiempo o la Tª.
La actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a
partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas o
superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación.
En la práctica se suele añadir un período de
desnaturalización antes de comenzar los ciclos para
asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de
ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC.

2.- Hibridación
En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3
factores relacionados con los iniciadores: la composición de
bases, el tamaño y la concentración.
En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar
entre 45ºC y 65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30
segundos y 1 minuto.
Un aumento de temperatura favorece la especificidad ya que
disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores.
Un aumento del tiempo favorece la inespecificidad por
amplificación de productos inespecíficos

3.- Elongación
En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se
realiza a 72ºC.
Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC.
El tiempo de extensión depende del tamaño de la
amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para
elongar 1 Kb
En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se
realice una última elongación de 5´a 72ºC.

Número de ciclos
Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la
muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados.
Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que
puede dar lugar a la amplificación de productos inespecificos
La reacción está producida por una enzima que tiene el efecto
meseta.
Después de un número de ciclos la amplificación deja de ser
exponencial y llega a fase estacionaria.
Cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN
sintetizado es suficiente para su posterior utilización.

Contaminación en la PCR
La PCR es una técnica muy sensible, por lo que se deben
evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no
deseado se amplifique.
Una de sus mayores ventajas se convierte en el principal
inconveniente.
Existen una serie de normas que ayudan a evitar las
contaminaciones:
Lugar físico exclusivo para realizar la PCR
Uso de instrumental exclusivo para la PCR
Utilización de reactivos y tubos estériles
Uso de guantes por el manipulador
Realización de controles de blanco

Organización del laboratorio
Preparación
ADN
AREAS DE
TRABAJO
Preparación
PCR
Post-PCR

• Control Positivo
– Interno
– Externo
• Control Negativo
– Wipe test
CONTROLES
– Contaminación ambiental

PARAMETROS DETERMINADOS EN EL
LABORATORIO MEDIANTE PCR
• CARGA VIRAL HEPATITIS C
• CARGA VIRAL HEPATITIS B
• CARGA VIRAL HIV
• GENOTIPO HEPATITIS C
• CRIBADO Y GENOTIPADO DE PAPILOMAVIRUS
• DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN HFE
• FACTOR V LEIDEN
• POLIMORFISMOS DE LA PROTOMBINA
• MUTACIONES MTHFR
• HLA B27
• PCR HSV1
• PCR HSV2
• PCR CMV
• PCR SEMICUANTITATIVA CMV
• PCR EBV
• PCR VZ
• PCR HH6
• PCR ENTEROVIRUS

CONTINUARA
PCR TIEMPO
REAL