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Boletín del Servicio Bibliográfico de Wiener Laboratorios S.A.I.C.
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Nº 140
Pág. 1: Reacción en cadena de la polimerasa
en tiempo real
Pág. 4: Agenda de congresos
Año XLII - Junio 2008
Director: Gustavo A. Capriotti - Redactor: Cristina M. Crepaldo - Editor Responsable: Wiener Laboratorios S.A.I.C. - 2000 - Rosario - Argentina
REACCION EN CADENA DE
LA POLIMERASA EN
TIEMPO REAL
La Real Time PCR (del inglés: Reacción en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real) es un método
revolucionario basado en la PCR tradicional desarrollada por Kary Mullis en los años 80. Esta técnica original
permite amplificar secuencias específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN) más de un billón de veces.
Muchas técnicas alternativas se han desarrollado en los últimos años a partir de la PCR, facilitando la
manipulación del ADN y permitiendo avances importantes a nivel científico.
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Capriotti, G. A.; Gariglio, R.C.
Centro de Investigación y Biotecnología, Wiener lab., Rosario, Argentina.
rgariglio@wiener-lab.com.ar
iguchi y colaboradores consiguieron
en el año 1992 la primera
demostración de la Real
Time PCR, la cual representa otro salto
tecnológico importante ya que ha abierto
la posibilidad de nuevas y poderosas
aplicaciones para la investigación a nivel
mundial. Esta reacción es un proceso
de amplificación por PCR y detección
simultánea del ADN amplificado en
“tiempo real”, pudiendo realizarse dicha
detección por medio de diferentes químicas.
En los últimos años, el número de compañías
que ofrecen instrumentos y reactivos
para Real Time PCR, sumado a la
inmensa cantidad de trabajos científicos
publicados, ponen en evidencia la importancia
y competitividad de mercado que
produjo esta tecnología.
La Real Time PCR generalmente envuelve
sondas fluorogénicas que “iluminan
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o fluorescen” mostrando la cantidad de
ADN presente en cada ciclo de amplificación.
Otros términos con que se conoce
la tecnología son: “PCR cinética”
refiriéndose al proceso antes mencionado
o “PCR cuantitativa”, ya que la metodología
permite cuantificar una secuencia
específica de ADN presente en
la muestra biológica en estudio.
Por otra parte, el ADN complementario
(ADNc) generado bajo condiciones
adecuadas a partir de la retrotranscripción
de un templado de ácido ribonucleico
(ARN), puede ser utilizado también
como ADN blanco en la Real Time
PCR, reacción que se conoce como RT-
Real Time PCR, ampliamente utilizada en
el trabajo con retrovirus, en la investigación
de la expresión de genes, etc.
Durante la amplificación, la rapidez con
que la señal fluorescente alcanza el nivel
umbral (Threshold level), se correla-
ciona con la cantidad inicial de ADN
blanco, permitiendo de esta manera poder
cuantificarlo. El número de ciclos
necesarios para que la señal fluorescente
alcance el nivel umbral, se conoce
como Threshold cycle (C T ) y es el parámetro
en el cual se fundamenta la cuantificación
según veremos más adelante.
A mayor C T , menor será la cantidad de
ADN blanco o templado inicial.
La Figura 1 muestra curvas típicas de
amplificación, donde se grafica en el eje
de las ordenadas el aumento de fluorescencia
producido durante el transcurso
de la reacción (1a: graficado en escala
lineal y 1b: en escala logarítmica) y en el
eje de las abscisas, cada ciclo de la PCR.
La línea horizontal de color rojo está indicando
dicho valor umbral de fluorescencia
a partir del cual se definen los C T ,
siendo este umbral fijado en la fase
exponencial de la reacción.
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Figura 1a
Una de las ventajas fundamentales de
la Real Time PCR en relación a la PCR
tradicional de punto final, es que en la
primera las mediciones se realizan en la
etapa exponencial de la reacción donde
en teoría, por cada ciclo de amplificación
se acumula el doble de producto
respecto al ciclo anterior, asumiendo
una eficiencia del 100%. Por el contrario,
en la PCR de punto final la detección
del producto de amplificación se
realiza en la fase plateau de la reacción,
donde la misma ya se detuvo y hay degradación
de producto. Por lo tanto,
medidas realizadas en esta fase, no ofrecen
resultados muy confiables en cuanto
a la cantidad inicial de templado de
la muestra (Figura 2).
Otras ventajas de la Real Time PCR son:
- Sistema homogéneo que evita la manipulación
de amplificado, evitando el
grave problema de contaminaciones
con el mismo.
- Rapidez en la obtención de resultados.
- Amplio rango dinámico de cuantificación.
- Permite monitorear la eficiencia de la
reacción.
- Mínima variabilidad en los resultados,
dando una cuantificación confiable y
precisa.
La habilidad que posee la Real Time PCR
para monitorear el progreso de la amplificación
del ADN blanco en tiempo real,
se logra mediante diferentes químicas e
instrumentación específicas. Generalmente,
las químicas consisten en diferentes
compuestos fluorescentes o fluoróforos
que pueden proporcionar una
§ Reacción en cadena de la polimerasa...
Figura 1: Curva de amplificación
detección de tipo no específica (como
son los colorantes fluorescentes) o específica
(como el caso de los cebadores y
sondas fluorescentes).
Dentro de los colorantes fluorescentes,
el más utilizado es el SYBR Green I ® que
tiene la propiedad de unirse al ADN
doble hebra de manera inespecífica,
emitiendo hasta 1000 veces más fluorescencia
cuando se encuentra unido al
ADN que cuando está libre en solución
(absorbe luz de 480 nm de longitud de
onda y emite a 520 nm) (Figura 3). Por
lo tanto, el incremento de la señal de
fluorescencia es proporcional a la cantidad
de ADN doble hebra presente en el
tubo de reacción y la misma se mide al
final de la fase de extensión de la PCR.
Su principal desventaja es la inespecifi-
Figura 1b
cidad, ya que se une independientemente
de la secuencia del ADN, pudiendo
generar resultados falsos positivos al detectar
ADN espurios como son por ejemplo
los dímeros de cebadores de la reacción.
Una forma de asegurar en estos casos la
especificidad de la detección, es analizando
las curvas de disociación o de
melting (Figura 4). Se puede lograr una
mejor caracterización del producto de
amplificación, sometiendo el mismo a un
aumento de temperaturas para determinar
la temperatura de disociación o
melting point, característica para cada
producto, ya que depende de la longitud
y composición nucleotídica del mismo.
La presencia de dos o más picos, sugiere
que se ha obtenido más de un am-
Figura 2: Etapas de la reacción de amplificación

§ Reacción en cadena de la polimerasa...
Figura 3: Fundamento del colorante fluorescente SYBR Green I®
plificado y que el proceso de amplificación
no fue específico para el ADN blanco.
Por otra parte, están los sistemas de señalización
basados en cebadores fluorescentes.
Estos varían considerablemente
desde el más simple llamado LUX TM
primers (Light Upon Extension) a los más
complejos como Scorpion TM primers. Si
bien no se detallarán aquí sus respectivos
fundamentos, ambos tipos de cebadores
poseen en solución, una secuencia
corta auto-complementaria que hace
que los mismos estén “apagados”
(quenched) y no emitan fluorescencia.
Cuando se produce la hibridización del
cebador al ADN blanco y su estructura
se despliega, se observa un incremento
importante en la fluorescencia, el cual es
medido justamente durante esta etapa.
La tercera categoría de sistemas de señalización
para Real Time PCR, es aquella
que envuelve un tercer oligonucleótido
fluorescente localizado entre los
cebadores, denominado comúnmente
sonda. A diferencia de los sistemas anteriores,
éste agrega especificidad a la
reacción, al intervenir un tercero y a
veces hasta un cuarto oligonucleótido o
sonda. Hay varios sistemas basados en
sondas fluorescentes, los más conocidos
son: TaqMan ® probes, Molecular
Beacons ® , Hybridization probes, Locked
Nucleic Acid (LNA) probes, LightUp
probes, etc. En cada caso, múltiples colorantes
fluorescentes (ej. Fluorescein,
6-FAM, JOE, VIC, Cal Fluor, etc.), pueden
ser utilizados con una variedad de
quenchers (ej. TAMRA, DABCYL, BHQ,
etc) que produzcan eficientemente el
necesario efecto FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer). Dicho efecto
se basa en que la excitación electró-
nica de uno de los colorantes fluorescentes,
es transferida al colorante aceptor
cuando ambos se encuentran en posiciones
cercanas, impidiendo la emisión de
fluorescencia del primero. Cuando ambas
moléculas se alejan, por diferentes
mecanismos según el caso, los colorantes
fluorescentes emiten fluorescencia
libremente.
Es importante cuando se diseña el sistema
de amplificación a utilizar, tener en
cuenta las ventajas y desventajas que
presentan las diferentes opciones descritas.
Utilizando sistemas basados en sondas
fluorescentes, se suma la posibilidad
de llevar a cabo reacciones multiplex, que
tanta relevancia tienen a nivel diagnóstico
por su practicidad.
Hay una amplia variedad de instrumentos
para Real Time PCR, que consisten
en una parte óptica y otra de termociclador
para realizar la reacción. La química
elegida y el instrumento están íntimamente
relacionados. Hay tres formas
básicas en que los instrumentos pueden
aportar la energía de excitación para
los fluoróforos: mediante lámparas, diodos
o láser, combinados con distintos tipos
de fotodetectores para medir la fluorescencia
emitida.
Figura 4: Curva de disociación
Además es imprescindible que el instrumento
esté acoplado a una computadora
que posea un software apropiado para
la recolección y análisis de los datos generados.
Las curvas de amplificación graficadas
por dicho software determinan el número
de ciclo en el cual la fluorescencia
alcanza el valor umbral (C T ). Este valor
de C T es inversamente proporcional a la
cantidad inicial de la secuencia específica
del ácido nucleico a cuantificar, en
la muestra original. A partir del mismo,
el software realiza los cálculos de cuantificación.
Un tipo de cuantificación es la absoluta,
que se utiliza para cuantificar muestras
desconocidas por interpolación a partir
de una curva estándar, generada a partir
de diluciones en serie de una muestra
de concentración conocida del ADN
blanco. Un caso en donde se utiliza este
tipo de cuantificación, es la determinación
del número de copias de un virus.
En la Figura 5 se muestra un ejemplo de
cuantificación absoluta, donde se grafican
los respectivos C T correspondientes
a cada muestra de la curva estándar,
versus el logaritmo de las concentraciones
conocidas de las mismas.
El número de copias de la muestra de
ADN desconocida, puede calcularse a
partir de la regresión lineal de la curva
estándar de la siguiente manera:
Log 10 Nº de copias = C T - y-intercept / slope
Siendo: y-intercept: la ordenada al origen
que da la sensibilidad y slope: la pendiente
de la curva que da una medida de la
eficiencia de la amplificación.
La cuantificación relativa es utilizada
para analizar cambios en la expresión de
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un gen en una dada muestra en relación
a otra muestra de referencia, por ejemplo
en respuesta a un tratamiento. Esas
muestras de referencia contienen genes
invariables, llamados Housekeeping genes,
los cuales normalmente no sufren cambios
bajo las condiciones experimentales,
sirviendo por lo tanto como estándares
internos. Por lo tanto, las aplicaciones
más importantes de esta tecnología,
además de incluir las de la PCR
convencional, son entre otras:
- Cuantificación absoluta y relativa de
la expresión génica (mediante RT- Real
Time PCR).
- Detección y cuantificación de microorganismos
(bacterias, virus, hongos, etc).
- Identificación de mutaciones o polimorfismos
de base simple (SNP) y genotipificación
(mediante el análisis de
curvas de melting).
- Inestabilidad genómica: identificación
de deleciones/inserciones que resultan
en trisomías, monosomías, etc.
- Validación de datos de expresión génica
generados por análisis de microarrays.
- Medición del número de copias de
ADN en general.
- Inmuno-qPCR.
- Análisis cuantitativo de metilación de
ADN.
Áreas como la Microbiología, Genética
y Farmacogenética, Oncología y Trans-
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Figura 5: Cuantificación Absoluta
§ Reacción en cadena de la polimerasa...
§ Agenda de congresos
plante se han visto beneficiadas por la
implementación de la Real Time PCR.
Otros campos de aplicación de esta tecnología
de gran potencial, son: Agricultura,
Veterinaria, Alimentos y Medicina
Forense.
Cualquier necesidad de medición rápida
y precisa de pequeñas cantidades de
ácidos nucleicos, representa un futuro
potencial para innovaciones basadas en
Real Time PCR.
La evolución de los instrumentos, el desarrollo
de nuevas químicas de detección,
la estandarización en la puesta a
punto de sistemas basados en esta tecnología,
dispararán seguramente nuevas
aplicaciones y el surgimiento de procesos
relacionados, útiles en el campo de
las Ciencias Biológicas.
Bibliografía
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PCR. Adv Physiol Educ 2005, 29:151-9.
- Dorak MT. Real-time PCR 2006, Edit.
Taylor & Francis Group.
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- Bustin SA, et al. Real-time reverse
transcription PCR (qRT-PCR) and its
potential use in clinical diagnosis.
Clinical Science 2005, 109:365-79.
Agenda de Congresos
Argentina
XVII Jornadas Bioquímicas
del NOA
Jujuy, 7 al 9 de Agosto de 2008
Organiza / Informes
Colegio de Bioquímicos de Jujuy
infocbj@cobiju.com.ar
V Congreso Argentino de la
Calidad en el Laboratorio Clínico
CALILAB 2008
Buenos Aires, 10 al 12 de
Setiembre de 2008
Organiza / Informes
Fundación Bioquímica Argentina
www.fba.org.ar/calilab
calilabV@fba.org.ar
Chile
XIV Congreso Chileno de
Tecnología Médica
«Calidad sin Fronteras»
27 al 30 de Agosto de 2008
Organiza / Informes
Colegio de Tecnólogos Médicos
Regional Arica
www.congresotmarica.cl
Brasil
42º Congreso Brasileiro de
Patologia Clínica y Medicina
Laboratorial
San Pablo, 2 al 5 de Julio de 2008
Organiza / Informes
Sociedade Brasileira de Patologia
Clinica (SBPC)
www.sbpc.org.br
Estados Unidos
2008 AACC Anual Meeting
and Clinical Lab Expo
29 al 31 de Julio de 2008
Convention Center, Washington
DC, USA