5.9 RMN Bidimensional
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<strong>5.9</strong> <strong>RMN</strong> <strong>Bidimensional</strong><br />
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Un experimento multipulso contiene etapas de preparación, evolución y detección. Los<br />
espectros que se obtiene en estos experimentos dependen de la naturaleza de la<br />
preparación y de la longitud del periodo de evolución. Lo que ocurre durante el período<br />
de evolución no es detectado directamente, pero puede estimarse realizando múltiples<br />
experimentos con periodos de evolución de diferente duración. De esta forma puede<br />
obtenerse información sobre dos conjuntos separados de parámetros espectrales: aquel<br />
que influye sobre la magnetización durante el periodo de evolución y el que actúa durante<br />
la adquisición propiamente dicha. En <strong>RMN</strong>-2D se utiliza una segunda transfomada de<br />
Fourier para convertir la dependencia temporal durante la evolución en una segunda<br />
frecuencia, lo que permite diseñar experimentos de diversa índole, muy ricos en<br />
información. La idea original sobre <strong>RMN</strong>-<strong>Bidimensional</strong> (<strong>RMN</strong>-2D) se debe a Jeener<br />
(1971), aunque fue llevada a la práctica por Ernst y colaboradores en 1976.<br />
La <strong>RMN</strong>-2D corresponde a la generación de espectros de <strong>RMN</strong> con dos frecuencias<br />
como variables independientes. Estos espectros <strong>RMN</strong>-2D se generan registrando FID (tB2B)<br />
al final de una secuencia de pulsos con variación sistemática de otro parámetro, más<br />
comúnmente el tiempo de evolución tB1B entre un par de pulsos. Los FIDs sucesivos se<br />
adquieren por incremento de los tiempos de evolución y se almacenan como filas en una<br />
matriz de datos, tal como se muestra en la Figura 5.121, donde se comparan las técnicas<br />
1D y 2D. El espectro 2D se obtiene por una doble transformación de Fourier (2D-TF).<br />
Esta doble transformación consiste en TF unidimensionales a todas las filas y columnas<br />
de la matriz de datos. Una 2D-TF conduce al espectro 2D que muestran picos mezclas<br />
de componentes de absorción y dispersión que pueden muchas veces corregirse por<br />
ciclado de fases y manipulación de los datos, resultando en espectros con fases absortivas<br />
puras. Dependiendo de la secuencia de pulsos, se obtienen correlaciones muy útiles entre<br />
diferentes picos de los espectros 1D o se simplifican espectros 1D muy superpuestos por<br />
dispersión en las nuevas dimensiones.<br />
Los experimentos de más de dos dimensiones (<strong>RMN</strong>-3D y -4D) se generan introduciendo<br />
tiempos de evolución adicionales y se aplican principalmente en el campo de las<br />
biomoléculas, donde la complejidad estructural y la superposición espectral las hacen<br />
necesarias.<br />
191
Figura 5.121 <strong>RMN</strong>-1D y -2D<br />
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Existen diferentes métodos, basados en la técnica del eco de espines o en la<br />
transferencia de polarización, que permiten editar un espectro 1D del espín heteronuclear<br />
X, y que suministran información sobre el número de hidrógenos unidos al heteroátomo<br />
(APT, INEPT, DEPT). Sin embargo, estos métodos no aportan evidencias directas sobre<br />
qué protones están unidos a cada heteronúcleo (átomo de carbono) en una molécula. Los<br />
experimentos de correlación heteronuclear nos permiten resolver este problema.<br />
Comenzaremos el análisis de las técnicas de <strong>RMN</strong>-2D con el experimento de correlación<br />
de desplazamientos químicos heteronuclear (HETCOR), en el que en una dimensión<br />
13<br />
tenemos la información sobre un tipo de espín, usualmente P<br />
PC, y en la otra sobre los<br />
protones acoplados. Cada señal o pico en el diagrama de contornos nos informa sobre los<br />
desplazamientos químicos de un núcleo de carbono y de los protones con los que está<br />
13<br />
directamente enlazado. Tal espectro permite una asignación de las señales de P<br />
PC si se<br />
conocen los desplazamientos químicos de los protones o viceversa. También podemos<br />
asignar las señales protónicas en caso que la superposición sea muy fuerte en el espectro<br />
13<br />
monodimensional, si en el espectro de P<br />
PC, como es habitual, se tiene una buena<br />
dispersión de señales. Este experimento puede considerarse como un análogo<br />
192
Resonancia Magnética Nuclear<br />
bidimensional del INEPT, presentando el mismo incremento en sensibilidad derivado de<br />
la transferencia de polarización desde los protones a los núcleos de P<br />
menor razón magnetogírica.<br />
13<br />
PC, los cuales poseen<br />
Utilizaremos el modelo vectorial, aplicado anteriormente en los experimentos<br />
multipulsos, que nos permite tener una idea de las bases físicas de algunas de las<br />
secuencias más comunes. Es importante señalar que este modelo no es aplicable a la<br />
descripción de la mayoría de los experimentos de <strong>RMN</strong> bidimensional basados en el<br />
acoplamiento escalar, pero si es aplicable al experimento HETCOR. Un tratamiento más<br />
riguroso y general, aplicable en sistemas con acoplamiento escalar débil, es el formalismo<br />
del operador producto. Su complejidad no nos permite incluirlo en este texto.<br />
<strong>5.9</strong>.1 Experimento de correlación heteronuclear directa HC-COSY (Heteronuclear<br />
correlation, HETCOR)<br />
Este experimento bidimensional (Freeman, Morris, Bax, 1978, 1981) puede ser<br />
interpretado sobre la base de las secuencias antes vistas de eco de espines y tranferencia<br />
de polarización. La secuencia de pulsos se muestra en la Figura 5.122.<br />
Figura 5.122 Secuencia de pulsos del experimento HCCOSY<br />
Como se observa en la Figura 5.122 el experimento consta de 4 etapas bien definidas:<br />
preparación, evolución, mezcla y detección. Solo la etapa de mezcla resulta nueva<br />
respecto a los experimentos multipulsos vistos con anterioridad.<br />
En la preparación el sistema recupera el equilibrio y se crea coherencia protónica por el<br />
pulso inicial. El período de evolución consta en este caso de un eco de espines donde<br />
se desarrolla la coherencia protónica de acuerdo con los desplazamientos químicos<br />
respectivos. En la etapa de mezcla se crea coherencia de protones en antifase (ΔB1B = 1/2J),<br />
0<br />
que el doble pulso simultáneo de 90P P transforma en coherencia en antifase de carbono por<br />
193
Resonancia Magnética Nuclear<br />
transferencia de polarización desde los protones. Durante la segunda mitad del período de<br />
mezcla se crea coherencia de P<br />
desacoplamiento protónico simultáneo.<br />
13<br />
PC en fase, que es la que detectamos en la etapa final con<br />
Analicemos, mediante el modelo vectorial de la magnetización, el desarrollo del<br />
experimento para un grupo CH (P<br />
13<br />
1<br />
PC-P PH); que puede generalizarse a grupos CHB2B y CHB3B.<br />
Preparación: durante el periodo de preparación la magnetización longitudinal de los<br />
protones en equilibrio (1) se convierte en coherencia protónica cuyos dos componentes<br />
correspondientes a las proyecciones de espín α y β del carbono inmediato comienzan el<br />
periodo de evolución (2).<br />
Figura 5.123 Experimento HCCOSY: magnetización transversal o<br />
coherencia durante la evolución (modelo vectorial)<br />
Evolución (Puntos 2-5, Figura 5.123): la evolución es un periodo de eco de espines. La<br />
coherencia protónica evolucionará de acuerdo a sus desplazamientos químicos. La<br />
0 13<br />
aplicación del pulso de 180P P<br />
(P<br />
PC) reenfoca el acoplamiento heteronuclear: la posición<br />
de la magnetización de cada protón al final del periodo de evolución, dada por el ángulo<br />
φ (5), dependerá sólo de su desplazamiento químico (modulado débilmente por el<br />
acoplamiento homonuclear interprotónico) y del tiempo tB1B.<br />
194
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.124 Experimento HCCOSY: coherencia durante el período de<br />
mezcla (modelo vectorial). Hasta 7 se representa la magnetización<br />
13<br />
protónica. A partir de 8 se muestra la magnetización de P<br />
PC.<br />
Mezcla (Puntos 5-9, Figura 5.124): El periodo de mezcla comienza con intervalo fijo ΔB1B<br />
= 1/2J (J constante de acoplamiento heteronuclear directa C-H) para lograr poner en<br />
antifase los componentes del doblete protónico debido al acoplamiento con el P<br />
13<br />
PC (6,<br />
0<br />
13<br />
representación en 2 y 3 dimensiones). El doble pulso de 90P P de protones y de P<br />
PC produce<br />
la transferencia de polarización. Sus efectos se pueden analizar en forma secuencial. El<br />
0<br />
pulso de 90P P protónico convierte la coherencia en antifase en magnetización longitudinal<br />
0<br />
con uno de los componentes invertido (7). El pulso de 90P P de<br />
transferencia de polarización del protón al P<br />
13<br />
P<br />
13<br />
PC genera entonces<br />
PC y coherencia en antifase de este último(8).<br />
La eficiencia de esta transferencia dependerá de la posición de la coherencia protónica<br />
0<br />
en antifase al aplicar los pulsos de 90P<br />
Py por lo tanto de lo ocurrido durante el período de<br />
evolución. El intervalo final permite poner en fase los componentes de la coherencia de<br />
P<br />
13<br />
PC (9).<br />
Detección: la magnetización transversal de P<br />
13<br />
PC es registrada durante este periodo con<br />
desacoplamiento protónico simultáneo. Por lo tanto sólo evolucionará el desplazamiento<br />
químico de P<br />
13<br />
PC.<br />
195
Resonancia Magnética Nuclear<br />
La señal detectada (caída de inducción libre, FID) es función no sólo del tiempo real de<br />
adquisición tB2B, sino también de la duración del periodo de evolución tB1B. Si<br />
secuencialmente realizamos un tándem de experimentos con valores variables de tB1B<br />
tendremos una matriz bidimensional de datos S(tB1B,tB2B) correspondiente a la digitalización<br />
de los FIDs (tB2B) para diferentes valores de tB1B. Una primera transformación de Fourier<br />
sobre tB2B<br />
suministra un conjunto de espectros de P<br />
13<br />
PC con señales cuya intensidad depende<br />
de la duración del intervalo tB1B. Ésto se debe a que la eficiencia de la transferencia de<br />
polarización está modulada por la posición que ocupe el doblete protónico en antifase (6)<br />
lo que es función del desplazamiento químico protónico, y la duración del periodo de<br />
evolución tB1B. Una segunda transformación de Fourier, ahora con respecto a tB1B, nos<br />
revelará las frecuencias de las coherencias activas durante el período de evolución, es<br />
decir los desplazamientos químicos de los protones acoplados directamente a cada núcleo<br />
de carbono:<br />
S(tB1B, tB2B) TF(tB2B) S(tB1B, δBCB) TF(tB1B) S(δBHB, δBCB)<br />
Existe una diferencia significativa entre los períodos ΔB1B y ΔB2B. El primero se introduce<br />
para poner en antifase los componentes del doblete protónico y por lo tanto dependerá<br />
13 1<br />
sólo de la magnitud de la constante de acoplamiento directa P<br />
PC-P PH, que en la mayoría de<br />
los casos toma valores entre 125 y 160 Hz. Es usual adoptar un valor de compromiso de<br />
135 Hz, que corresponde a un valor de 1/2J de 3.7ms. Durante el período ΔB2B deseamos<br />
13<br />
llevar los componentes del multiplete de P<br />
PC, inicialmente en antifase, a encontrarse en<br />
fase. Este proceso depende ahora fuertemente del número de protones unidos a dicho<br />
carbono, como se ha visto anteriormente en la técnica INEPT. En la Figura 5.125 se<br />
muestra la situación para grupos CH, CHB2B y CHB3B en función de la duración del período<br />
ΔB2B. Se adopta usualmente un valor de 1/4J (1.85ms), para el cual el nivel de reenfoque es<br />
aceptablemente alto para todos los carbonos hidrogenados.<br />
196
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.125 Intensidad de las señales en función de la duración del<br />
intervalo ΔB2B (en unidades de 1/J) para grupos CH, CHB2B y CHB3B.<br />
En la Figura 5.126 se muestra un espectro HC-COSY típico<br />
1<br />
Figura 5.126 Espectro HC-COSY de un cetoendoperóxido en CDClB3B a 200 MHz (P PH).<br />
x-señales del solvente<br />
La representación utilizada es la estándar en <strong>RMN</strong>-2D: el diagrama de contorno. Las dos<br />
variables independientes, las frecuencias νB1B<br />
(FB1B,<br />
usualmente en la vertical) y νB2B<br />
horizontal) corresponden respectivamente a los periodos de evolución y detección. La<br />
variable dependiente, que corresponde a las intensidades de las señales se representa en<br />
(FB2B,<br />
197
Resonancia Magnética Nuclear<br />
forma análoga a un mapa de relieve con curvas de nivel. Se muestran los espectros<br />
monodimensionales P<br />
respectivamente.<br />
1<br />
PH y de P<br />
13<br />
PC como referencia a lo largo de FB1B(δBHB) y FB2B<br />
El espectro HC COSY mostrado nos permite correlacionar las señales de los carbonos<br />
con las de los protones directamente enlazados. La escala FB2B, que corresponde a las<br />
frecuencias del período de detección, muestra los desplazamientos químicos de P<br />
(δBCB)<br />
13<br />
PC. La<br />
escala FB1B, que corresponde a las frecuencias del período de evolución muestra los<br />
desplazamientos químicos de los protones.<br />
Así las señales A y B vinculan a los protones olefínicos con los carbonos<br />
correspondientes (5.6ppm/120.0ppm). Las señales C y D vinculan a los protones<br />
alifáticos de los CH puentes unidos al grupo epoxi con los carbonos correspondientes en<br />
las cercanías de 80 ppm. Finalmente las señales E y F corresponden a los protones<br />
disterotópicos del grupo CHB2B que correlacionan con el mismo carbono cerca de 40 ppm.<br />
<strong>5.9</strong>.2 Experimentos de correlación heteronuclear directa a larga distancia: LR-<br />
HETCOR y COLOC.<br />
Aunque el experimento HETCOR resulta muy útil en la elucidación de estructuras, su<br />
limitación fundamental es su carácter local. Sólo logramos correlacionar protones y<br />
carbonos unidos directamente. Una variante de este experimento permite correlacionar<br />
protones y carbonos separados por 2 o 3 enlaces, los que presentan pequeños<br />
acoplamientos geminales y vecinales generalmente inferiores a 10Hz. Se impone<br />
modificar la duración de los periodos de mezcla ΔB1B y ΔB2B, alargándolos para permitir la<br />
creación de componentes protónicos en antifase respecto a los acoplamientos indirectos y<br />
13<br />
posterior reenfoque de los componentes de P<br />
PC asociados dichos acoplamientos<br />
indirectos. Tomando un valor de compromiso para los acoplamientos a dos y tres enlaces<br />
C-H de 7 Hz, el valor del intervalo ΔB1B debe extenderse hasta unos 71ms. El experimento<br />
muestra ahora picos cruzados entre protones y carbonos separados 2 o 3 enlaces además<br />
de la presencia eventual de los picos cruzados originalmente presentes en el experimento<br />
HETCOR, que indican la conectividad a un enlace. Se ha utilizado esta técnica en el<br />
pasado para correlacionar protones de grupos metilos con carbonos cuaternarios vecinos.<br />
198
Resonancia Magnética Nuclear<br />
El incremento de los periodos de mezcla en el experimento LR-HETCOR (Long Range-<br />
HETCOR) alarga considerablemente la secuencia de pulsos reduciendo drásticamente la<br />
sensibilidad por la acción de los procesos de relajación. Se logra compensar parcialmente<br />
esta pérdida de sensibilidad haciendo el tiempo de evolución constante (constant time<br />
experiment) e incluyéndolo dentro del período de polarización INEPT. El efecto neto es<br />
0<br />
que el pulso de 180P P es el que se desplaza en función del tiempo de evolución, de forma<br />
tal que al final de la etapa la coherencia protónica adquiere carácter de antifase<br />
13<br />
respecto al acoplamiento con el P<br />
PC. Puede entonces tener lugar de inmediato la<br />
0<br />
transferencia de polarización INEPT (doble pulso de 90P P aplicado a ambos núcleos). Esta<br />
modificación denominada COLOC (Correlation Spectroscopy via Long Range<br />
Couplings, Kessler, Griesinger 1984, 1987), mostrada en la Figura 5.127, reduce la<br />
duración de la secuencia de pulsos y el experimento es más sensible por reducción de<br />
los efectos de la relajación.<br />
Figura 5.127 Secuencia de pulsos del COLOC. El intervalo de tiempo entre<br />
0<br />
los 2 pulsos protónicos de 90P P es constante. Valores típicos son ΔB1B = 25ms y<br />
ΔB2B=33ms (optimizadas para un acoplamiento indirecto de 10 Hz)<br />
En la Figura 5.128 se muestra el espectro COLOC de la vainillina. Las correlaciones<br />
directas, que aunque atenuadas aparecen en los espectros COLOC, aparecen indicadas<br />
con un círculo. Obsérvese las 2 correlaciones observadas para el protón aldehídico 7 que<br />
corresponden a los carbonos 2 y 3. Asimismo el carbono cuaternario 3 puede asignarse<br />
fácilmente pues es el único que correlaciona con los protones del grupo metoxilo. Ya<br />
2<br />
hemos visto que en sistemas aromáticos los acoplamientos P PJBCH Bson débiles y los picos<br />
cruzados correspondientes pueden estar ausentes de los espectros COLOC (HB5B muestra<br />
picos cruzados intensos con los carbonos vecinales CB1B y CB3B, otro más débil con el<br />
carbono geminal CB4B y no se observa con el otro carbono geminal CB6B)<br />
199
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.128 Espectro COLOC 400 MHz de la vainillina en CDClB3B<br />
<strong>5.9</strong>.3 Experimentos de correlación heteronuclear inversa<br />
Los experimentos originales de correlación heteronuclear, anteriormente descritos, se<br />
basan en la detección de la coherencia del heteronúcleo X de baja razón magnetogírica<br />
con detección indirecta del protón a lo largo de la dimensión FB1B<br />
en<br />
el experimento<br />
bidimensional. Estos experimentos se derivan de los análogos monodimensionales de<br />
transferencia de polarización como el INEPT. Más recientemente se han desarrollado<br />
métodos donde se detecta el núcleo de mayor razón magnetogírica, usualmente el protón,<br />
mientras que el heteronúcleo se detecta indirectamente. Por razones históricas estos<br />
métodos se denominan de detección inversa y se han generalizado debido al incremento<br />
sustancial en sensibilidad que aportan.<br />
La intensidad de una señal en <strong>RMN</strong> depende, como hemos visto antes, de la razón<br />
magnetogírica de los núcleos. En general la relación señal/ruido (S/R) en un experimento<br />
depende de una serie de factores:<br />
200
Resonancia Magnética Nuclear<br />
-número de moléculas en el volumen activo de la sonda (concentración) N<br />
-abundancia natural de los núcleos observados en el experimento A<br />
-temperatura de la muestra T<br />
-intensidad del campo magnético estático BB0B<br />
-razones magnetogíricas de los núcleos inicialmente excitados y observados γBexcB γBobs<br />
-tiempo de relajación transversal efectivo (define ancho de banda) TB2PB<br />
-número de FIDs acumulados n<br />
S<br />
R<br />
1 3 1<br />
−1<br />
2 2 * 2<br />
∝ NAT B0<br />
γ excγ<br />
obsT2<br />
n [5.103]<br />
Al diseñar un experimento bidimensional buscando la mayor sensibilidad para una<br />
muestra concreta en un equipo determinado en un mínimo de tiempo, los factores que<br />
podemos modificar son γBexcB y γBobsB: debemos tratar de que los núcleos excitados y<br />
observados sean los de mayor razón magnetogírica.<br />
Puede pensarse en cuatro combinaciones para experimentos de correlación<br />
heteronuclear XH de acuerdo a la naturaleza de los núcleos excitados y detectados, las<br />
que se muestran en la Figura 5.129.<br />
Figura 5.129 Esquemas para generar espectros 2D de correlación heteronuclear<br />
P, E, M, D-períodos de preparación, evolución, mezcla y detección<br />
*<br />
P<br />
201
Resonancia Magnética Nuclear<br />
El esquema 1 con excitación y detección de los núcleos de menor γBXB<br />
sensibilidad, se toma como referencia de intensidades.<br />
,<br />
y por lo tanto de menor<br />
En el esquema 2, que corresponde al HETCOR, se excita inicialmente el protón cuya coherencia<br />
se deja evolucionar y durante el periodo de mezcla se transfiere la coherencia al heteronúcleo que<br />
es el detectado directamente. En dependencia del valor de γBXB<br />
se<br />
obtienen incrementos en<br />
sensibilidad respecto a los valores de referencia, que son mostrados a la derecha de la Figura<br />
5.126 (γB1HB ~ 2.5 γB31PB ~4 γB13CB ~ 10 γB15NB).<br />
Al esquema 4 le corresponden la mayores sensibilidades relativas. Aquí se excita inicialmente al<br />
protón, se crea coherencia de X que evoluciona durante tB1B y finalmente durante la mezcla se<br />
vuelve a coherencia protónica que es la detectada directamente. Estos experimentos de detección<br />
inversa, que estudiaremos a continuación, representan ganancias sustanciales de sensibilidad<br />
respecto al HETCOR que para las correlaciones P PH-P<br />
1<br />
13<br />
1<br />
PC y P PH-P<br />
15<br />
PN son de 8 y 30 veces. Aunque<br />
estos valores teóricos de incremento de sensibilidad no sean alcanzados completamente en la<br />
práctica, aun un incremento moderado, digamos sólo un factor de 4 para las correlaciones P<br />
13<br />
1<br />
PC-P PH<br />
representan una reducción del tiempo de adquisición en 16 veces. Así si un experimento<br />
HETCOR requiere por las condiciones de la muestra de un tiempo de adquisición del orden de<br />
las horas, puede obtenerse la información equivalente por los métodos inversos en cuestión de<br />
minutos. Como ventaja adicional de los experimentos de correlación inversa se tiene que en ellos<br />
en FB1B, donde se tiene menor resolución, se despliegan los desplazamientos del heteronúcleo, que<br />
normalmente están mucho menos superpuestos que los protónicos. Los experimentos de<br />
correlación inversa se han impuesto y son los que se utilizan en la actualidad para las<br />
1<br />
correlaciones X-P PH.<br />
Existen 2 técnicas ampliamente utilizadas para la correlación heteronuclear inversa a un enlace,<br />
que se conocen por sus siglas en inglés: la correlación heteronuclear múltiple cuántica HMQC<br />
(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) y la correlación heteronuclear a simple cuanto<br />
HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation). La información que suministran ambas<br />
técnicas es esencialmente la misma, difiriendo sólo en detalles. El experimento HMQC es menos<br />
sensible a desajuste en los parámetros de registro, mientras que el HSQC presenta una mayor<br />
resolución, ventaja que es explotada particularmente en espectros muy cargados de señales como<br />
son los de los biopolímeros. El experimento HSQC es más versátil, existiendo numerosas<br />
variantes del mismo, lo que lo ha popularizado en la comunidad química. Ambas técnicas, como<br />
métodos inversos, requieren una supresión efectiva de las señales que no provienen de los<br />
12<br />
14<br />
protones unidos al heteronúcleo activo (P<br />
PC-H y P<br />
PN-H). Esta supresión puede lograrse por<br />
202
Resonancia Magnética Nuclear<br />
diferentes métodos. El mas utilizado y efectivo es el los gradientes de campo pulsados (PFGs-<br />
Pulsed Field Gradients).<br />
<strong>5.9</strong>.4 HMQC<br />
Este experimento de correlación heteronuclear inverso fue desarrollado por Bax en 1986. El<br />
HMQC permite correlacionar protones y carbonos unidos directamente a través de un enlace con<br />
elevada sensibilidad. La secuencia del HMQC se muestra en la Figura 5.130. La programación de<br />
fases de pulsos y receptor mostrada es para eliminar las señales provenientes de los protones<br />
12<br />
unidos a P<br />
PC.<br />
Figura 5.130 Secuencia de pulsos y CTC del HMQC<br />
La secuencia básica del HMQC es relativamente simple conteniendo sólo 4 pulsos de RF.<br />
Ilustraremos su funcionamiento para un grupo CH, tal como hicimos en el HETCOR.<br />
0 1<br />
Preparación.- la secuencia comienza con un pulso de 90P P(P PH) que genera coherencia protónica<br />
1<br />
seguida de la evolución de la magnetización protónica en un intervalo Δ = 1/2P PJBCHB (~3.3ms) para<br />
poner dicha coherencia en antifase con respecto al acoplamiento con el carbono vecino. Como en<br />
el INEPT está magnetización en antifase puede transferirse a la pareja en acoplamiento mediante<br />
0 13<br />
un pulso. El pulso de 90P P(P<br />
PC) transfiere coherencia al carbono-13 creando lo que se conoce<br />
como coherencia a múltiple cuanto (MQC), donde hay magnetización transversal de ambos<br />
núcleos.<br />
203
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Evolución.- las coherencias a múltiple cuanto no son detectables directamente en <strong>RMN</strong> (una<br />
adquisición inmediata no registraría señal alguna) y evolucionan con los desplazamientos<br />
químicos de ambos núcleos. Para estas coherencias el acoplamiento mutuo no se desarrolla. La<br />
0 1<br />
aplicación de un pulso de 180P P<br />
(P PH) en el centro de esta etapa elimina la evolución del<br />
desplazamiento químico protónico. Luego durante tB1B evoluciona sólo el desplazamiento químico<br />
13<br />
de P<br />
PC y los acoplamientos interprotónicos (JBHHB)<br />
0 13<br />
Mezcla.- El pulso final de 90P P(P<br />
PC) da inicio al periodo de mezcla. Este pulso reconvierte la<br />
1<br />
MQC en coherencia protónica en antifase. Un nuevo intervalo Δ = 1/2P PJBCHB lleva a la coherencia<br />
protónica en fase.<br />
Detección.- La coherencia protónica es detectada durante tB2B evolucionando de acuerdo con los<br />
desplazamientos químicos protónicos y las constantes de acoplamiento homonucleares JBHHB. El<br />
13<br />
acoplamiento con el P<br />
PC es eliminado por desacoplamiento.<br />
Tenemos entonces:<br />
13 n<br />
Evolución durante tB1B: δ (P<br />
PC*) + P PJBHHB<br />
1<br />
13 n<br />
Detección durante tB2B: δ (P PH-unidos a P<br />
PC*) + P PJBHHB<br />
El espectro 2D HMQC mostrará picos o señales de cruce entre núcleos de carbonos y protones<br />
separados por un enlace. En la dimensión FB1B podremos evaluar el desplazamiento químico del<br />
13<br />
P<br />
PC con la estructura fina de los acoplamientos H-H, usualmente no resueltos, mientras que en FB2B<br />
tendremos los desplazamientos químicos de los protones unidos a cada carbono con estructura<br />
fina correspondiente a los acoplamientos interprotónicos.<br />
En la parte inferior de la Figura 5.130 se muestran los llamados caminos de transferencia de<br />
coherencia (CTC). Estos CTC permiten visualizar de forma simplificada la evolución de las<br />
coherencias durante una secuencia. Los órdenes de coherencia p para cada núcleo definen la<br />
magnetización presente en las diferentes etapas del experimento. Sólo los pulsos de RF pueden<br />
modificar los órdenes de coherencia. A las magnetizaciones longitudinales (equilibrio)<br />
corresponde p = 0, a las magnetizaciones transversales o coherencias a simple cuanto generadas<br />
0<br />
0<br />
por la acción de pulsos de 90P<br />
Pcorresponde p = ±1. Los pulsos de 180P P sólo pueden invertir<br />
0<br />
coherencias. Las coherencias a múltiple cuanto se generan por aplicación de pulsos de 90P P a<br />
sistemas fuera del equilibrio. Sólo es posible la detección de coherencia a simple cuanto. En la<br />
detección por cuadratura sólo se puede detectar una de las coherencias a simple cuanto (por<br />
convenio se utiliza p = -1)<br />
Veamos el experimento HMQC de acuerdo a los CTC. Inicialmente en el equilibrio tenemos p =<br />
0<br />
0 para ambos núcleos. El pulso inicial de 90P P protónico genera coherencia a simple cuanto con p<br />
= ±1, en el diagrama sólo se indica el camino con p = +1 que es el que finalmente conduce a la<br />
204
Resonancia Magnética Nuclear<br />
0 13<br />
detección. La aplicación del pulso de 90P P<br />
P<br />
PC crea coherencias con p = ±1 para este núcleo y<br />
globalmente coherencias a múltiple cuanto para el sistema CH. Estas coherencias son mezclas de<br />
coherencias a cero y doble cuanto (Σp = 0, ±2) de acuerdo con los signos relativos de las<br />
coherencias protónicas y de P<br />
13<br />
PC.Estas coherencias múltiples están presentes durante toda la<br />
evolución, pero la evolución con el desplazamiento químico protónico es eliminada por el pulso<br />
0<br />
de 180P P que<br />
invierte la coherencia protónica en el medio del intervalo. El pulso final de P<br />
elimina la coherencia de este núcleo quedando solo la coherencia protónica que es detectada.<br />
En la Figura 5.131 se muestra el espectro HMQC del mentol.<br />
Figura 5.131 Espectro HMQC del mentol<br />
13<br />
1<br />
En la Figura 5.131 se incluyen como referencias los espectros 1D <strong>RMN</strong>-P<br />
PC (FB1B) y <strong>RMN</strong>-P PH<br />
(FB2B). Si conocemos las asignaciones de los carbonos, este experimento nos permite asignar el<br />
espectro protónico. La señal del carbono más desblindado (CB1B) correlaciona con el protón más<br />
desblindado en δ = 3.3 ppm. Asimismo, los carbonos unidos a protones diaterotópicos (CB3B, CB4PB Py<br />
CB6B) correlacionan con 2 señales protónicas cada uno. La resolución espectral en FB2B es baja, pero<br />
permite observar estructura fina en los picos de cruce correspondientes a acoplamientos del orden<br />
13<br />
PC<br />
205
Resonancia Magnética Nuclear<br />
de 10 Hz (geminales y vecinales diaxiales) y a partir de aquí identificar en cada grupo CHB2B a los<br />
protones ecuatoriales como los más desblindados (dobletes frente a cuartetes).<br />
Se han implementado muchas variantes del HMQC básico. La aplicación de pulsos de gradientes<br />
12<br />
(gs-HMQC) elimina totalmente las señales provenientes de los protones unidos a P<br />
PC, un serio<br />
problema en las técnicas inversas.<br />
<strong>5.9</strong>.5 HSQC<br />
Este experimento (Bodenhausen y Ruben , 1980) tiene una secuencia con elementos<br />
comunes con el HMQC y suministra espectros similares. La diferencia esencial es que en<br />
el HSQC durante la evolución hay coherencia a simple cuanto del heteroátomo. La<br />
secuencia de pulsos y los CTC del HSQC se muestran en la Figura 5.132.<br />
Figura 5.132 Secuencia de pulsos y CTC del HSQC<br />
Preparación.- Este período es una secuencia INEPT con el objetivo de crear coherencias de X en<br />
1<br />
antifase con el protón (Δ = 1/2P PJBXHB) a partir de la excitación inicial protónica. El primer pulso de<br />
0 13<br />
90P P de X (P<br />
PC) que cierra el periodo de preparación crea coherencia a simple cuanto en antifase<br />
para este núcleo.<br />
Evolución.- Este período variable tB1B consta de un eco de espines donde las coherencias en<br />
antifase de X evolucionan de acuerdo a sus desplazamientos químicos. La evolución del<br />
0<br />
acoplamiento heteronuclear es suprimida por el pulso protónico de 180P P.<br />
206
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Mezcla.- Consta de una secuencia retro-INEPT. Aquí las coherencias X en antifase con el protón<br />
se reconvierten por transferencia de polarización en coherencias protónicas en antifase con X y al<br />
final de la etapa quedan como coherencias protónicas en fase.<br />
Detección.- Las coherencias protónicas evolucionan de acuerdo a sus desplazamientos químicos y<br />
n<br />
acoplamientos homonucleares P PJBHHB eliminándose el acoplamiento heteronuclear con X mediante<br />
el desacoplador.<br />
Tenemos entonces:<br />
13<br />
Evolución durante tB1B: δ (P<br />
PC*)<br />
1<br />
13 n<br />
Detección durante tB2B: δ (P PH-unidos a P<br />
PC*) + P PJBHHB<br />
La diferencia fundamental con el HMQC radica en que en la dimensión FB1B están ausentes los<br />
acoplamientos homonucleares, por lo que los anchos de línea en esta dimensión están<br />
apreciablemente reducidos en el HSQC. Cuando se desea una buena resolución en FB1B por la<br />
presencia de un gran número de señales, el experimento a escoger es el HSQC. Así, el espectro<br />
15<br />
1 15<br />
patrón para caracterizar una proteína marcada con P<br />
PN es el P PH-P<br />
PN-HSQC, que debe mostrar un<br />
número de picos equivalentes al de residuos aminoacídicos en la estructura. En la Figura 5.133 se<br />
1 15<br />
muestra el espectro P PH-P<br />
PN-HSQC de una proteína.<br />
1 15<br />
Figura 5.133 Espectro (sección) P PH-P<br />
PN-HSQC 600 MHz de<br />
la fracción soluble de un citocromo c (100 residuos AA)<br />
Cada uno de los picos de cruce en el espectro anterior corresponde al grupo N-H de un residuo<br />
aminoacídico. Obsérvese el gran número de señales que pueden distinguirse en esta parte del<br />
207
Resonancia Magnética Nuclear<br />
espectro aprovechando la dispersión de desplazamientos químicos de P<br />
del HSQC.<br />
15<br />
PN y la elevada resolución<br />
La secuencia de pulsos del experimento HSQC es mucho más compleja que la del HMQC y por<br />
lo tanto más susceptible a desajustes instrumentales. Por otra parte es un experimento más<br />
versátil, existiendo numerosas modificaciones como la variante editada, que permite diferenciar<br />
por los signos de los picos de cruce las correlaciones que corresponde a grupos XH, XHB2B y XHB3B.<br />
También se utilizan secuencias modificadas para la medición de parámetros específicos (JBXHB,<br />
NOE) o como componentes de experimentos híbridos (HSQC-TOCSY /HSQC-Total Correlation<br />
Spectroscopy).<br />
12 14<br />
La eliminación de las señales protónicas unidas a P<br />
PC (o P<br />
PN) que son numéricamente dominantes<br />
es también un problema en el HSQC, como en toda técnica de detección inversa. Su eliminación<br />
0<br />
parcial se logra por la alternancia de las fases del primer pulso de 90P P(x) y del receptor (Figura<br />
5.129). También en el HSQC se ha impuesto el uso de pulsos de gradientes (gs-HSQC gradient<br />
selected-HSQC), que eliminan efectivamente las señales indeseadas, reducen fuertemente el<br />
ruido de fondo y mejoran el rango dinámico al eliminar las señales indeseadas antes de la etapa<br />
de detección.<br />
<strong>5.9</strong>.6 HMBC<br />
El experimento de correlación heteronuclear a varios enlaces (HMBC, Heteronuclear Multiple<br />
Bond Correlation), desarrollado por Bax (1986) establece la correlación entre protones y un<br />
heteroátomo X separados por 2 o 3 enlaces y es el equivalente inverso del COLOC. A semejanza<br />
del HMQC y el HSQC es un experimento muy sensible por resultar de excitación y detección<br />
protónica. El HMBC es esencialmente un experimento HMQC adecuado a la detección de<br />
correlaciones a través de acoplamientos débiles. La secuencia del HMBC se muestra en la Figura<br />
5.134.<br />
Figura 5.134 Secuencia del HMBC con filtro de paso de banda inicial<br />
208
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Preparación.- La secuencia es esencialmente la misma del HMQC, sólo se introduce un pulso de<br />
0<br />
90P P (X)<br />
inicial adicional que actúa como filtro para eliminar la señal proveniente de<br />
1<br />
acoplamiento directo (ΔB1B= 1/2P PJBXH B~ 3.3 ms). Se debe esperar el tiempo suficiente para poner en<br />
antifase la coherencia protónica (Δ = ΔB1B +<br />
n<br />
ΔB2B<br />
=<br />
n<br />
1/P PJBXHB ~ 100 ms) optimizándose la creación de<br />
coherencia a múltiple cuanto para P PJBXHB mediante el segundo pulso de 90P<br />
Evolución.- La MQC evoluciona durante tB1B.<br />
Mezcla.- La MQC es reconvertida en coherencia protónica por el pulso final X. El intervalo de<br />
reenfoque Δ al final del período de mezcla en HMQC es eliminado aquí por razones de<br />
sensibilidad: es demasiado largo y la relajación amortiguaría fuertemente las señales.<br />
Detección.- Comúnmente la detección puede o no acompañarse de desacoplamiento de X. Se<br />
prefiere no desacoplar a X para que las señales residuales indeseadas que corresponden a los<br />
acoplamientos P<br />
1<br />
0<br />
P (X).<br />
PJBXHB aparezcan como dobletes en FB2B lo que facilita su identificación.<br />
En una medida aun mayor que sus homólogos la técnica HMBC se beneficia grandemente con la<br />
introducción de los pulsos de gradiente, que reducen considerablemente el ruido de fondo de los<br />
espectros.<br />
Las técnicas de correlación heteronuclear a 2 o 3 enlaces permiten obtener información<br />
valiosísima en la determinación estructural. La intensidad de los picos de cruce en el espectro<br />
depende tanto de la magnitud de los acoplamientos como del intervalo Δ seleccionado. Estos<br />
acoplamientos son comúnmente de 2-7 Hz, a lo que corresponde un Δ óptimo de unos 100ms.<br />
El debilitamiento de las señales por relajación durante el tiempo entre la excitación y la detección<br />
hace recomendable reducir significativamente este intervalo y valores de Δ de compromiso del<br />
orden de 60-80 ms (óptimas para acoplamientos de 4-10 Hz) son recomendables para los trabajos<br />
de rutina. Sólo en moléculas pequeñas con relajación poco eficiente pueden elevarse los valores<br />
de Δ en busca de conectividades a través de acoplamientos más pequeños. En la Figura 5.135 se<br />
muestra el espectro HMBC de un compuesto bicíclico.<br />
209
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.135 Espectro HMBC sin desacoplar durante la detección<br />
En la Figura 5.135 se muestran las conectividades del protón HB2B que muestra picos de cruce con<br />
CB9B (geminal)<br />
y CB4B, CB5B y<br />
CB8B<br />
(vecinales). Se observa además el acoplamiento directo con CB2B que<br />
puede distinguirse de los anteriores por el doblete resultante del acoplamiento P<br />
1<br />
PJBCHB en FB2B<br />
flecha). También se indican otros picos de cruce producto de acoplamientos directos.<br />
(doble<br />
La riqueza de la información que suministra el HMBC lo convierte en un experimento muy<br />
utilizado en ensamblar una estructura desconocida a partir de fragmentos conocidos. Mientras que<br />
con los espectros HMQC o HSQC sólo logramos conectividades locales a través de un enlace, el<br />
HMBC permite conectar átomos más distantes, inclusive aquellos que carecen de protones y para<br />
los cuales las técnicas de correlación homonuclear no funcionan. En la Figura 5.136 se muestra<br />
el espectro HMBC del α-pineno.<br />
210
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.136.HMBC del α-pineno en CDClB3B a 500 MHz. Desacoplando durante de la detección<br />
En el espectro HMBC del α-pineno si buscamos las correlaciones de los protones de los grupos<br />
metilos del puente (A y B) encontramos correlación con todos los carbonos a 2 y 3 enlaces.<br />
Obsérvese además la presencia de la correlación a un enlace 0.84/20.9 ppm y 1.27/26.4 ppm. El<br />
grupo metilo en 1.67 ppm es el único con picos de cruce con los átomos de carbonos olefínicos<br />
(116.1/144.5 ppm) y además con el CH en 47.2ppm.<br />
En la Figura 5.137 se muestran las secuencias de pulsos de los experimentos de detección inversa<br />
con fines de comparación. La segunda dimensión temporal se genera por incrementos sucesivos<br />
de tiempo de evolución tB1B.<br />
211
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.137 Experimentos de correlación heteronuclear con detección inversa.<br />
<strong>5.9</strong>.7 Experimento de correlación homonuclear (Correlation Spectroscopy, COSY)<br />
Este experimento mediante el cual se correlacionan núcleos a través del acoplamiento escalar fue<br />
históricamente el primero de los experimentos bidimensionales (Jeener 1971, Ernst 1976). La<br />
técnica COSY permite el mapeo de los núcleos (protones) que tienen acoplamientos escalares en<br />
una molécula. La secuencia de pulsos del COSY, mostrada en la Figura 5.138 es muy simple: se<br />
0<br />
aplican 2 pulsos de 90P P separados<br />
por un intervalo variable de tiempo que es el periodo de<br />
evolución y al final del segundo pulso se adquiere el FID.<br />
Figura 5.138 Secuencia de pulsos del COSY<br />
0<br />
El período de mezcla del COSY se reduce al segundo pulso de 90P P. Este pulso transfiere<br />
magnetización de un núcleo a otro núcleo que esté acoplado con él. Este proceso se conoce como<br />
transferencia de coherencia y ha sido tratado anteriormente en el caso heteronuclear como<br />
transferencia de polarización. Para heteronúcleos esta transferencia puede describirse mediante<br />
212
Resonancia Magnética Nuclear<br />
el modelo vectorial porque los pulsos protónicos y del heteronúcleo actúan independientemente.<br />
En el caso homonuclear el problema es mucho más complejo porque todos los espines<br />
experimentan la acción de los pulsos simultáneamente. No obstante los procesos de transferencia<br />
son análogos al caso heteronuclear y la transferencia de coherencias tiene lugar entre los espines<br />
protónicos acoplados.<br />
Consideremos el experimento COSY en un sistema de 2 protones débilmente acoplados (sistema<br />
AX) con una constante de acoplamiento JBAXB y desplazamientos químicos νBAB y νBBB. La<br />
magnetización asociada con A comenzará a precesar de acuerdo a νBAB durante tB1B. El segundo pulso<br />
transfiere una parte de la magnetización (coherencia) de A hacia X y la otra parte permanece<br />
como magnetización (coherencia) de A. Aquella coherencia de A que permanece después del<br />
segundo pulso evolucionará de acuerdo con νBAB durante tB2B. El pico correspondiente en el espectro<br />
bidimensional aparecerá a (νBAB, νBAB). Este pico que aparece a las mismas frecuencias en ambas<br />
dimensiones se denomina pico diagonal. La coherencia original de A que resulta transferida a X<br />
por el pulso de mezcla, evolucionará durante tB2B como νBXB y el pico correspondiente aparecerá en el<br />
espectro 2D a (νBAB, νBXB). Este pico es denominado pico de cruce, se encuentra fuera de la diagonal<br />
y nos indica que los núcleos A y X están acoplados. En efecto, para que ocurra transferencia de<br />
coherencia, la coherencia de A tiene que haber desarrollado carácter de antifase respecto a X y<br />
esto sólo puede ocurrir si ambos núcleos están acoplados. Este análisis puede repetirse para una<br />
excitación inicial de X que conduce al pico diagonal (νBXB, νBXB) y al pico cruzado (νBXB, νBAB) al otro<br />
lado de la diagonal respecto a (νBAB, νBXB). Una representación esquemática del espectro COSY del<br />
sistema AX se muestra en la Figura 5.139.<br />
Figura 5.139 Esquema del espectro COSY para sistema AX<br />
La información en un espectro COSY está en los picos de cruce fuera de la diagonal. Estos picos<br />
indican el acoplamiento escalar entre dos espines y por lo tanto que un reducido número de<br />
enlaces separan a los núcleos correspondientes. La eficiencia del pulso de mezcla en transferir<br />
coherencia depende, como hemos visto, de la presencia de componentes en antifase en el<br />
213
Resonancia Magnética Nuclear<br />
momento de su aplicación. El periodo de evolución debe ser suficientemente largo para permitir<br />
la formación de estos componentes en antifase (φ = 2πJtB1B). Si la constante de acoplamiento es<br />
muy pequeña, el tiempo requerido para su desarrollo puede ser muy largo respecto a la acción de<br />
los procesos de relajación y los picos de cruce correspondientes no son detectables. No obstante,<br />
en muchas ocasiones, pueden detectarse picos de cruce en el COSY correspondientes a<br />
acoplamientos no resueltos en el espectro monodimensional. En la Figura 5.140 se muestra el<br />
espectro COSY de la quinolina.<br />
Figura 5.140 Espectro COSY 400MHz de la quinolina en acetona-dB6B<br />
En este espectro COSY detectamos 2 sistemas de espines casi independientes. Los protones 2, 3<br />
y 4 muestran picos de cruce intensos entre ellos correspondientes a los acoplamientos orto y meta<br />
presentes en aromáticos (señalados en la parte inferior del COSY). Los protones 5-8 forma por su<br />
parte un sistema más complejo debido a la pequeña diferencia de desplazamientos químicos entre<br />
HB5B y HB6B. El pico de cruce entre estos protones está tan cercano a la diagonal que es difícil de<br />
detectar. Este es un problema común en la interpretación de los espectros COSY. La conexión<br />
214
Resonancia Magnética Nuclear<br />
entre ambos sistemas de espines se evidencia por el débil pico de cruce entre HB4B y<br />
HB8B<br />
(7.90-8.03<br />
5<br />
ppm) correspondiente al acoplamiento en zigzag a larga distancia P PJ no resuelto en el espectro<br />
1D.<br />
En el COSY original no pueden separarse las componentes absortivas de las dispersivas de las<br />
señales por correcciones de fase como es común en <strong>RMN</strong>-1D. El espectro COSY se presenta en<br />
modo magnitud, por lo que las señales aparecen muy ensanchadas (mezclas de absorción con<br />
dispersión). Se han desarrollado variantes del COSY, como el COSY con doble filtro cuántico<br />
(DQF-COSY Double Quantum Filter-COSY) que permiten presentaciones en modo absortivo<br />
con mucha mejor resolución y picos diagonales considerablemente reducidos (que no aportan<br />
información y pueden impedir la observación de picos cruzados cercanos a la diagonal).<br />
La aplicación de pulsos de gradientes permite eliminar o reducir las programaciones de fase de<br />
los experimentos y acortar considerablemente los tiempos de registro (gs-COSY, gs-COSY<br />
sensible a la fase). La obtención de un gs-COSY es cuestión de unos pocos minutos. En todas<br />
estas variantes la interpretación del espectro es idéntica a la del COSY original.<br />
<strong>5.9</strong>.8 Experimento de correlación homonuclear total (Total Correlation Spectroscopy,<br />
TOCSY).<br />
La característica más notable del COSY es la obtención de correlación directa entre 2 protones<br />
acoplados, que inmediatamente sugiere que los mismos están en una relación geminal o vecinal<br />
en la molécula. Podemos ver al experimento COSY como equivalente al conjunto de todos los<br />
experimentos de desacoplamiento de espines imaginables para una molécula. El experimento de<br />
correlación total TOCSY también suministra correlaciones entre espines directamente acoplados,<br />
pero incluye además correlaciones entre todos los espines de un sistema, aun los que no estén<br />
directamente acoplados. Por ejemplo, en una cadena de protones acoplados A-B-C-D, en el<br />
experimento COSY observaríamos pico cruzado de A con su única pareja de acoplamiento B. En<br />
el experimento TOCSY observaríamos picos cruzados de A con B, C y D si los acoplamientos B-<br />
C y C-D son apreciables. Podemos correlacionar en principio mediante el TOCSY todos los<br />
núcleos de un sistema de espines y de aquí su nombre de espectroscopia de correlación total. La<br />
habilidad del TOCSY para detectar transferencia de coherencia a través de una cadena es muy útil<br />
sobre todo en biomoléculas complejas donde están presentes sistemas de espines aislados, en<br />
unidades discretas. En las proteínas los protones de los residuos aminoacídicos constituyen<br />
sistemas de espines independientes, no hay acoplamientos interprotónicos a través del enlace<br />
peptídico. En los polisacáridos, los protones de las unidades de azúcares forman sistemas de<br />
espines independientes, no hay acoplamientos interprotónicos a través del enlace glicosídico.<br />
215
Resonancia Magnética Nuclear<br />
En el TOCSY los componentes de los multipletes en los picos de cruce están en fase mientras<br />
que en el COSY estos componentes están en antifase. En condiciones de baja resolución, los<br />
componentes en antifase del COSY se superponen y tienden a anularse mutuamente, mientras que<br />
en el TOCSY se refuerzan, por lo que esta resulta una técnica más sensible.<br />
La secuencia del experimento TOCSY se muestra en la Figura 5.141. La secuencia de pulsos del<br />
TOCSY es similar a la del COSY excepto que el pulso de mezcla del COSY es sustituido por una<br />
etapa de mezclado con bloqueo de espines, cuyo objetivo es permitir la transferencia de<br />
coherencias a lo largo del sistema de espines.<br />
Figura 5.141 Secuencia de pulsos del TOCSY y tren de pulsos<br />
para bloqueo de espines<br />
Para entender el funcionamiento del período de bloqueo de espines en el TOCSY veamos lo que<br />
ocurriría para un período de evolución tB1B = 0. El pulso inicial crea magnetización en el eje x.<br />
Inmediatamente se aplica el bloqueo de espines que está compuesto por un tren de pulsos de<br />
0<br />
180P Px separados por cortos intervalos de tiempo 2δ. Podemos considerar a todo el período de<br />
mezcla como una sucesión de ecos de espines (δ-180-δ). Como conocemos, en estos ecos se<br />
reenfocan los desplazamientos químicos pero no los acoplamientos homonucleares. Es decir, en<br />
todo el período de mezcla τBmB queda congelada la evolución por desplazamiento químico, los<br />
espines experimentan el mismo campo magnético efectivo y los vectores correspondientes<br />
permanecen fijos en el eje y del sistema de coordenadas rotatorio, de ahí el nombre de bloqueo<br />
de espines. Por contraste los acoplamientos homonucleares evolucionan a través de la toda la<br />
secuencia de ecos de espines. Durante el período de mezcla los espines de un sistema se<br />
comportan como equivalentes (no hay diferencias de desplazamientos químicos efectivos) y<br />
acoplados por lo que constituyen un sistema de no primer orden donde los espines individuales<br />
pierden su identidad (mezcla isotrópica). Esta situación permite el intercambio de coherencias<br />
entre todos los espines del sistema.<br />
La secuencia del TOCSY puede interpretarse entonces como:<br />
216
Preparación.- creación de coherencias.<br />
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Evolución.- evolución de las señales, quedando marcadas por sus desplazamientos químicos. (δBHB<br />
+ JBHHB)<br />
Mezcla.- durante el bloqueo de espines se produce transferencia de coherencia a otros núcleos de<br />
su sistema de espines, cuya efectividad depende de los valores de las constantes de acoplamiento<br />
y el tiempo de mezcla.<br />
Detección.- se detectarán las señales provenientes de un núcleo que no transfirió coherencia a<br />
otro (pico diagonal) o que recibió coherencia de otros miembros del sistema de espines (picos de<br />
cruce). Evolucionan (δBHB + JBHHB).<br />
La apariencia del espectro TOCSY es similar al COSY, con picos simétricos alrededor de la<br />
diagonal, pero con mucha mayor abundancia de picos de cruce.<br />
El intercambio de coherencia tiene carácter oscilante y su efectividad depende del tiempo de<br />
mezcla y de los valores de las constantes de acoplamiento a lo largo del sistema de espines. Para<br />
tiempos de mezcla cortos (< 20 ms) la transferencia de coherencia sólo alcanza a los núcleos<br />
directamente acoplados y el TOCSY registrado en estas condiciones se asemeja al COSY. A<br />
tiempos de mezcla mayores es posible la transferencia de coherencia entre núcleos no acoplados<br />
directamente a través de intermediarios. En casos favorables pueden encontrarse picos de cruce<br />
entre un espín y todos los demás del sistema de espines. En la Figura 5.142 se muestran las<br />
intensidades de los picos de cruce en espectros TOCSY del protón NHε de la cadena lateral de un<br />
residuo de arginina en una proteína en función del tiempo de mezcla.<br />
Figura 5.142 Intensidad de los picos de cruce y<br />
tiempos de mezcla en TOCSY<br />
217
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Para tiempos de mezcla cortos (τBmB< 0.1/JBAXB) sólo hay transferencia efectiva al protón vecinal (ε -<br />
δ). Sólo a partir de 80 ms resulta apreciable el pico de cruce con el protón más remoto del sistema<br />
de espines (ε – α).<br />
En la Figura 5.143 se muestran los espectros COSY y TOCSY de la lactosa (mezcla de anómeros<br />
β y α). Los tres protones anoméricos aparecen apreciablemente desblindados por encima de 4.4<br />
ppm. El resto de los protones de la unidades de glucosa (Glu) y galactosa (Gal) forman un bloque<br />
compacto en la zona de 3.5-4.0 ppm. Los picos de cruce del espectro COSY nos permiten<br />
identificar claramente donde están los protones en las posiciones 2, pero más allá resultan<br />
difíciles las asignaciones por la gran superposición de señales. En el espectro TOCSY sin<br />
embargo, a partir de los protones anoméricos, podemos identificar las posiciones de los protones<br />
de los diferentes azúcares mediante los picos de cruce de los tres protones anoméricos.<br />
Para asignar los protones dentro de cada sistema de espines pueden realizarse experimentos<br />
TOCSY con diferentes tiempos de mezcla. A tiempos de mezcla crecientes van apareciendo las<br />
señales de los protones cada vez más alejados del protón anomérico. Una alternativa es obtener<br />
espectros TOCSY en su variante monodimensional. Estos espectros se obtienen eliminando el<br />
período de evolución y sustituyendo al pulso inicial de excitación por un pulso selectivo aplicado<br />
a la frecuencia del protón cuyo sistema de espines quiere identificarse. En la Figura 5.144 se<br />
muestra los espectros 1D-TOCSY con diferentes tiempos de mezcla. En este caso se aplica el<br />
pulso selectivo a la frecuencia del protón anomérico de la unidad de β –glucosa. Con tiempos de<br />
mezcla crecientes se puede observar la aparición sucesiva de los protones a lo largo de la cadena<br />
de acoplamiento. Para observar los protones en posición 6 hay que esperar un tiempo muy largo,<br />
donde ya la relajación ha comenzado a debilitar el grueso de las señales.<br />
218
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.143 DQF-COSY y TOCSY de la lactosa en DB2BO<br />
219
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.144 Espectros 1D-TOCSY a diferentes τBmB correspondientes al H-1<br />
Glu (4.43 ppm) en la β-lactosa<br />
<strong>5.9</strong>.9 Experimento de correlación homonuclear de espines diluidos (P<br />
INADEQUATE)<br />
13<br />
PC-P<br />
13<br />
PC -<br />
En la determinación de estructuras orgánicas uno de los objetivos centrales es la identificación del<br />
esqueleto carbonado. Por lo común, las conectividades C-C no se determinan directamente sino<br />
se hace uso de las conectividades homonucleares (COSY) o heteronucleares a mas de un enlace<br />
(COLOC, HMBC). En ocasiones este procedimiento indirecto no es funcional, sobe todo cuando<br />
en la cadena carbonada abundan los carbonos cuaternarios. Esta estrategia indirecta se justifica<br />
por las dificultades asociadas con la detección de conectividad directa C-C: la baja abundancia<br />
13<br />
13<br />
natural del P<br />
PC (1.1%) hace que la presencia de dos P<br />
PC vecinos se de en 1 de cada 10000<br />
13<br />
moléculas. Se trata en este caso de buscar débiles satélites de P<br />
PC en el ya poco sensible espectro<br />
13<br />
de <strong>RMN</strong>-P<br />
PC. La estrategia directa, por su bajísima sensibilidad, requiere muestras muy<br />
concentradas y períodos de adquisición muy prolongados.<br />
A pesar de los problemas de sensibilidad, la información tan valiosa que puede obtenerse de las<br />
conectividades C-C (conocimiento inmediato del esqueleto carbonado) ha estimulado el<br />
desarrollo de las técnicas de correlación C-C. La secuencia INADEQUATE (Incredible Natural<br />
Abundance Double Quantum Transfer Experiment) es la básica en las correlaciones directas C-C<br />
29<br />
y se ha aplicado también para la correlación de otros núcleos de baja abundancia natural (P<br />
PSi y<br />
otros espines diluidos).<br />
220
Resonancia Magnética Nuclear<br />
El problema más grave de esta técnica viene dado por la interferencia causada por las señales<br />
dominantes que carecen de conectividades homonucleares y por lo tanto no pueden suministrar la<br />
información buscada. En el INADEQUATE la acción de un doble filtro cuántico elimina las<br />
13<br />
señales que corresponden a especies con un solo P<br />
PC. La secuencia del experimento y los CTC del<br />
INDEQUATE se muestran en la Figura 5.145. El espectro de correlación bidimensional se genera<br />
13<br />
permitiendo a las coherencias a doble cuanto (sólo presentes en especies con 2 P<br />
PC acoplados)<br />
13<br />
evolucionar durante tB1B seguida de una reconversión a coherencia a simple cuanto de P<br />
PC que se<br />
detecta durante tB2B.<br />
Figura 5.145 Secuencia de pulsos y CTC del experimento INADEQUATE<br />
Preparación.- Se crea coherencia a simple cuanto por el pulso inicial. La generación de<br />
coherencia a doble cuanto requiere de una disposición antifase de los vectores de acoplamiento<br />
1<br />
que se desarrollan durante el período Δ = 1/2P PJBCCB. Ésto se logra mediante un eco de espines que<br />
hace este proceso independiente de los desplazamientos químicos. Finalmente el segundo pulso<br />
0<br />
de 90P P crea las coherencias a doble cuanto.<br />
Evolución.- El período variable tB1B corresponde a las coherencias a doble cuanto evolucionando a<br />
la suma de los desplazamientos químicos de los núcleos de carbonos acoplados. Así, para dos<br />
carbonos A y X acoplados, la frecuencia del pico de cruce en FB1B viene dada por (νBAB + νBBB).<br />
Mezcla.- La reconversión a coherencias a simple cuanto de A o X (νBAB , νBXB) se logra mediante el<br />
pulso final de mezcla que da inicio al período de detección.<br />
Detección.- Durante este período evolucionan las coherencias de núcleos de carbono a simple<br />
1<br />
cuanto y los acoplamientos P PJBCCB.<br />
221
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Durante toda la secuencia se irradian los protones en forma no selectiva para eliminar la<br />
evolución de los acoplamientos heteronucleares y generar efectos NOE para aumentar la<br />
sensibilidad.<br />
La interpretación de los espectros 2D-INADEQUATE es algo más complicada que la de otros<br />
espectros 2D. En la dimensión FB1B, que corresponde a la evolución de las coherencias a doble<br />
cuanto, los picos cruzados aparecen a la suma de las frecuencias relativas de ambos espines en el<br />
sistema de coordenadas rotatorio, sin que exista un espectro 1D de referencia. Como a cada<br />
coherencia DQ corresponden 2 coherencias a simple cuanto, moviéndonos en la horizontal<br />
podemos leer en FB2B las frecuencias de los espines acoplados y que dan lugar a dicha coherencia<br />
a DQ. En la Figura 5.146 se muestra el espectro 2D-INADEQUATE del n-butanol.<br />
Figura 5.146 Espectro 2D-Inadequate del n-butanol<br />
En el espectro tenemos la dimensión FB1B que corresponde al DQ (νBAB + νBXB), en esta escala no<br />
tenemos representación espectral. Los picos de cruce aparecen en FB2B a las frecuencias de<br />
resonancia de los carbonos asociados al DQ. Para interpretar el espectro buscamos en FB2B un pico<br />
de cruce de un núcleo de carbono que se pueda asignar inequívocamente. En este caso la señal<br />
del CB1B debe corresponder a la más desblindada (62 ppm). El DQ vincula a este pico de cruce con<br />
otro del núcleo de carbono en δ = 35 ppm, que puede asignarse entonces al CB2B. Como CB2B está<br />
unido directamente a dos núcleos de carbono, debe tener otro pico de cruce que se identifica<br />
222
Resonancia Magnética Nuclear<br />
fácilmente y lo vincula con el CB3B (18 ppm). Finalmente a partir de CB3B se identifica el CB4B (13<br />
1<br />
ppm). En FB2B los picos de cruce muestran una estructura fina de dobletes (acoplamiento P PJBCCB). La<br />
interpretación se facilita por la existencia de una seudodiagonal que une los centros de las líneas<br />
horizontales que ligan cada par de picos de cruce.<br />
<strong>5.9</strong>.10 Experimentos de correlación dipolar<br />
Todos los experimentos bidimensionales anteriormente descritos detectan conectividades<br />
entre espines que están acoplados escalarmente o que forman parte de un mismo sistema<br />
de espines. Comenzaremos a tratar ahora los experimentos bidimensionales que nos<br />
permiten encontrar las conectividades entre núcleos que tienen acoplamiento dipolar, es<br />
decir aquellos que están vecinos espacialmente y tienen contactos NOE. El experimento<br />
básico de este tipo es el 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy).<br />
Para moléculas en régimen de movilidad intermedio ( ωτ ≈ 1),<br />
donde la magnitud del<br />
NOE es muy pequeña, se puede utilizar con éxito el experimento ROESY (Rotating<br />
frame Overhauser Enhancement Spectroscopy) para la detección de vecindad espacial<br />
entre espines.<br />
<strong>5.9</strong>.10.1 Experimento NOESY<br />
El experimento NOESY permite la detección de NOEs transitorios. La secuencia de<br />
pulsos y los caminos de transferencia de coherencia del NOESY se muestran en la Figura<br />
5.147.<br />
Figura 5.147 Secuencia de pulsos y CTC del NOESY<br />
La secuencia del NOESY está relacionada estrechamente con la del COSY. La diferencia<br />
mas significativa está en el tiempo de mezcla durante el cual se desarrolla el efecto NOE.<br />
Afortunadamente el experimento NOESY puede interpretarse haciendo uso del modelo<br />
c<br />
223
Resonancia Magnética Nuclear<br />
vectorial (Figura 5.148), toda vez que aquí los acoplamientos escalares no juegan ningún<br />
papel. Después de la excitación inicial (Figura 5.148-2) y durante la evolución (tB1B) los<br />
vectores de magnetización están en el plano xy (coherencias) y evolucionarán en dicho<br />
plano de acuerdo con sus desplazamientos químicos (Figura 5.148-3, υ - offset respecto a<br />
0<br />
la RF). El segundo pulso de 90P P lleva componentes de la magnetización al eje –z (Figura<br />
5.148-4), creando la inversión de poblaciones requerida para observar NOE transitorios<br />
que se desarrollan durante el tiempo de mezcla. La fracción de magnetización remanente<br />
en el plano xy daría lugar al COSY si se adquiriera inmediatamente. Al final del tiempo<br />
de mezcla las magnetizaciones resultantes en el eje z son convertidas en coherencias por<br />
0<br />
el pulso final de 90P P y detectadas durante tB2B. El período de evolución sirve para marcar<br />
los desplazamientos químicos. Si partimos de la excitación de un núcleo S, este<br />
evolucionará a su frecuencia durante tB1B y su magnetización, invertida por el segundo<br />
0<br />
pulso de 90P P, se puede transferir a un núcleo vecino I si hay relajación cruzada (σBISB) entre<br />
los mismos. Esta magnetización transferida se detecta a la frecuencia de I durante tB2B por<br />
lo que observamos un pico de cruce (FB1 B- υBSB, FB2B - υBIB) que indica el contacto NOE entre<br />
los mismos. La magnetización no transferida durante el período de mezcla da lugar a los<br />
picos diagonales.<br />
La secuencia es repetida para los diferentes valores de los tiempos de evolución.<br />
Generalmente el período de preparación incluye un intervalo de recuperación de las<br />
magnetizaciones previo al pulso inicial de 1-3 s.<br />
Figura 5.148 Modelo vectorial del experimento NOESY<br />
La secuencia NOESY requiere una programación de fases de pulsos y receptor (no<br />
mostrada en la Figura 5.147) para eliminar coherencias indeseadas. Como en el NOESY<br />
durante el período de mezcla sólo interesa la magnetización longitudinal (p = 0),<br />
cualquier coherencia a simple o doble cuanto indeseada puede eliminarse de forma<br />
relativamente sencilla. Una alternativa a la programación de fases es el uso de un pulso<br />
224
Resonancia Magnética Nuclear<br />
de gradientes durante el período de mezcla. La inhomogeneidad asociada al pulso de<br />
gradientes en z (inhomogeneidad a lo largo de z, campos BB0B<br />
efectivos<br />
que varían<br />
linealmente) desfasa y anula toda coherencia SQ o DQ durante este tiempo pero no<br />
afecta la magnetización longitudinal, que es la de interés en el NOESY. Las<br />
interferencias más difíciles de eliminar son las coherencias a cero cuanto existentes<br />
durante el período de mezcla que sean convertidas por el pulso final en coherencias a<br />
simple cuanto detectables. El procedimiento más común para eliminar estas interferencias<br />
es variar ligeramente en forma aleatoria el tiempo de mezcla de un incremento de tB1B a<br />
otro. La magnetización de interés para el NOESY (magnetización longitudinal) es poco<br />
sensible a pequeños cambios en τBmB, mientras que las coherencias a cero cuanto (oscilarán<br />
de acuerdo al offset y serán muy sensible aún a cambios moderados de τBmB, anulándose<br />
efectivamente por este procedimiento.<br />
Los espectros NOESY presentan una apariencia similar al COSY, con simetría respecto<br />
a la diagonal. Se prefiere su presentación en formato sensible a la fase, donde pueden<br />
ajustarse todas las señales como absortivas positivas o negativas. Lo importante es el<br />
signo relativo de las señales. Si ajustamos las señales en la diagonal como positivas, el<br />
signo de los picos de cruce depende del origen del pico y de la movilidad de la red, como<br />
se muestra en la Tabla 5.29.<br />
Tabla 5.29 Signo de los picos de cruce en NOESY<br />
Signo diagonal Origen pico cruce Signo pico de cruce<br />
Positivo<br />
NOE positivo (alta movilidad) Negativo<br />
(convenio) NOE negativo (baja movilidad) Positivo<br />
Intercambio químico Positivo<br />
Dos espines en intercambio químico lento (señales independientes) pueden intercambiar<br />
magnetización y dar lugar a picos de cruce en el NOESY. En moléculas pequeñas con NOEs<br />
positivos los picos de cruce por contacto NOE y por intercambio químico pueden ser distinguidos<br />
por su signo. Sin embargo en macromoléculas ambos picos de cruce tienen el mismo signo y no<br />
pueden ser diferenciados.<br />
Un parámetro importante a definir al diseñar un experimento NOESY es el tiempo de mezcla (ver<br />
Tabla 5.30). Este debe por una parte ser lo suficientemente largo para permitir la creación del<br />
NOE, pero por otra su duración esta limitada por la relajación longitudinal que tiende a debilitar<br />
todas las señales. Si se quieren determinar distancias intenucleares se debe trabajar en la zona<br />
lineal inicial de desarrollo del NOE, evitándose además la aparición de picos de cruce falsos por<br />
225
Resonancia Magnética Nuclear<br />
difusión de espines. En la Tabla 5.30 se indican los valores de tiempo de mezcla recomendables<br />
para los experimentos NOESY.<br />
Tabla 5.30 Tiempos de mezcla para NOESY<br />
Régimen de movilidad NOE Características Tiempos de mezcla<br />
Moléculas pequeñas + TB1 B↑B BσBISB↓ ~ TB1B 500-2000<br />
ms<br />
Macromoléculas - TB1 B↓ σBISB↑ ~0.5 TB1 B100-300 ms<br />
Moléculas intermedias 0 NOESY no viable, usar ROESY<br />
En la Figura 5.149 se muestra el espectro NOESY de un compuesto heterocíclico. Los picos<br />
cruzados tienen signo opuesto a la diagonal pues el sistema se encuentra en la zona de alta<br />
movilidad. Los protones del grupo metilo 11 tienen contactos NOE con el protón olefínico 8, con<br />
el protón 7 y con el grupo metilo 14 del acetal. Los protones del grupo metoxilo 14 muestran<br />
contacto NOE con el otro grupo metilo del acetal 13. El experimento NOESY brinda tanto<br />
información estructural como conformacional.<br />
Figura 5.149 Espectro NOESY<br />
El experimento NOESY a través de los contactos NOE suministra información esencial para la<br />
determinación de estructuras tridimensionales de proteínas. En la Figura 5.150 se muestra una<br />
sección del espectro NOESY de una proteína de 78 residuos.<br />
226
Resonancia Magnética Nuclear<br />
Figura 5.150 Sección de espectro NOESY de una proteína<br />
Puede observarse la gran cantidad de picos de cruce, que en este caso tienen el mismo signo que<br />
la diagonal (no mostrada). La sección corresponde en fB2B a las resonancias de los protones NH.<br />
(10 – 6.5 ppm). En la línea vertical mostrada a fB2B = 9.70 ppm se observan 8 picos de cruce del<br />
protón NH de un residuo aminoacídico a ese desplazamiento químico con protones en la zona de<br />
0 – 6 ppm (protones HBαB y en cadenas laterales). Los numerosos contactos NOE implican la<br />
cercanía (< 5 Ǻ) entre los protones y por lo tanto constituyen conjuntos muy extensos de<br />
restricciones experimentales que se utilizan ampliamente en la determinación de las estructuras<br />
tridimensionales de las proteínas.<br />
<strong>5.9</strong>.10.2 Experimento ROESY (Rotating Frame Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)<br />
El mayor problema asociado con el experimento NOESY está en la imposibilidad de aplicarlo a<br />
sistemas con movilidad en la zona de cruce del cero, donde el NOE cambia de signo ( ω τ ≈ 0 ),<br />
En este régimen los NOEs se hacen muy pequeños o se anulan totalmente. Esto ocurre en<br />
moléculas con masas moleculares de 1000 a 2000 Da, dependiendo de las condiciones de la<br />
disolución (viscosidad, temperatura) y la frecuencia de trabajo del espectrómetro. La<br />
determinación de los contactos NOE en estas condiciones puede realizarse midiéndolos en el<br />
sistema de coordenadas rotatorio (rotating frame NOE, ROE). La relajación cruzada medida en el<br />
sistema de coordenadas rotatorio es análoga a la de los NOE transientes, pero aquí viene dada<br />
por:<br />
0<br />
c<br />
227
Resonancia Magnética Nuclear<br />
⎡ 3 ⎤ τ<br />
∝ + 2 [5.104]<br />
4<br />
c<br />
οIS γ ⎢ ⎥ 6<br />
⎣1+<br />
ω0τ<br />
c ⎦ rIS<br />
A diferencia de la expresión correspondiente para el NOE [<strong>5.9</strong>6], los NOEs en el sistema<br />
rotatorio o ROEs no se hacen nunca negativos, independientemente del valor de τ c y de aquí su<br />
gran utilidad: permiten determinar vecindad espacial en moléculas de movilidad intermedia.<br />
En la Figura 5.151 se muestra la dependencia de NOE y ROE con la movilidad molecular para<br />
el caso homonuclear.<br />
Figura 5.151 Evolución de NOE y ROE con τBcB<br />
En condiciones de alta movilidad los incrementos NOE y ROE máximos son iguales, mientras<br />
que al reducirse la movilidad el NOE cambia de signo mientras que el ROE permanece positivo y<br />
se incrementa ligeramente (50% a 68%).<br />
En condiciones de alta movilidad:<br />
4<br />
NOE ROE 5γ<br />
τ c<br />
σ IS = σ IS ∝ [5.105]<br />
r<br />
En condiciones de baja movilidad:<br />
σ<br />
− γ τ<br />
6<br />
IS<br />
2γ<br />
τ c<br />
σ ∝ [5.106]<br />
4<br />
4<br />
NOE<br />
IS ∝ 6<br />
rIS<br />
c<br />
ROE<br />
IS<br />
6<br />
rIS<br />
Así para grandes moléculas el ROE crece dos veces mas rápido que el NOE.<br />
Mientras el desarrollo del NOE implica la transferencia de magnetización longitudinal, a lo<br />
largo de z, el ROE se desarrolla cuando la magnetización se mantiene estática en el plano xy<br />
(transversal) por bloqueo de espines.<br />
228
Resonancia Magnética Nuclear<br />
La secuencia de pulsos del experimento ROESY (Figura 5.152) es muy similar a la del<br />
experimento TOCSY. En el ROESY la potencia del campo estático BB1B<br />
espines es considerablemente más débil que el tren de pulsos del TOCSY.<br />
Figura 5.152 Secuencia de pulsos del ROESY<br />
para<br />
el bloqueo de<br />
La selección de los tiempos de mezcla es análoga a la del NOESY. Valores del orden de 600 ms o<br />
menores son adecuados para moléculas de masas moleculares moderadas. En macromoléculas<br />
deben utilizarse los valores recomendados para el NOESY (100-300 ms) o menores teniendo en<br />
cuenta que el ROE crece dos veces mas rápido que el NOE.<br />
La acción del bloqueo de espines es mantener congelada la disposición que los vectores de<br />
magnetización adoptan durante el período de evolución. Esta disposición se perdería por la<br />
acción de la dispersión de desplazamientos químicos en ausencia del bloqueo de espines. El<br />
bloqueo permite el desarrollo de los ROEs por relajación cruzada en el plano transversal. Aquí la<br />
relajación está caracterizada por una constante de tiempo TB1ρB (TB1ρB~ TB2B). Al utilizar el bloqueo de<br />
espines estamos sustituyendo el campo estático BB0B del NOE por el campo BB1B de la RF, mucho<br />
más débil. Mientras que γBB0B corresponde a frecuencias del orden de los cientos de MHz, el valor<br />
de γBB1B corresponde a los kHz (frecuencias en el sistema rotatorio). De aquí que la relación<br />
ω τ
Resonancia Magnética Nuclear<br />
más frecuentes son de tipo TOCSY, es decir pueden observarse picos de cruce espúreos entre<br />
espines del mismo sistema, pero que carecen de un real contacto ROE. Como se mencionó<br />
anteriormente, el campo de bloqueo de espines en ROESY es apreciablemente más débil que el<br />
TOCSY. Esto reduce la intensidad de los picos espúreos tipo TOCSY, que por otra parte tienen el<br />
mismo signo que los picos diagonales y pueden identificarse como tales en condiciones<br />
favorables. La precaución de desplazar la frecuencia de BB1B del centro del rango espectral<br />
contribuye a minimizar los artefactos TOCSY en el espectro ROESY. Los riesgos mayores de<br />
artefactos se presentan entre espines de desplazamiento químico muy semejante y picos de cruce<br />
cercanos a la diagonal.<br />
230