HIBRIDACIÓN Y LECTURA DE CHIPS - scsie

Chips de DNA 2007
HIBRIDACIÓN
Y
LECTURA DE CHIPS
Hibridación y factores que le afectan
• Paso clave donde se produce la reacción de complementariedad
entre las hebras del ácido nucleico de la muestra marcada con las
complementarias inmovilizadas en el chip.
• Se ve afectada por la temperatura, la fuerza iónica y la viscosidad.
• La velocidad de hibridación es máxima cuando la diferencia entre
la Tª de hibridación y la Tm es de 25ºC (No son las condiciones
habituales).
• Las reacciones normalmente se hacen a concentraciones altas de
sal, con la presencia de agentes desnaturalizantes, como la
formamida, y en soluciones viscosas.
Cinética y Termodinámica de la Hibridación
Keq = k2 / k1 A = sonda
k B* = diana marcada
1
A + B* AB* Keq = cte. Equilibrio
k k1 = cte. Cinética
2
de seudoprimer orden
-La detección depende de la cantidad de la marca en AB.
-Es directamente proporcional a las cantidades de A y de B
[AB] = Keq [A][B].
-Para una cantidad fija de sonda (A) es proporcional a la cantidad de
diana (B) siempre que A está en exceso (lo habitual), pero varía con
la cantidad de sonda.
-La velocidad de hibridación depende sólo de la concentación de B.
V = k1 [B] porque la concentración local de A está en exceso
(cinética de seudoprimer orden).
Hibridación y lectura 1

Chips de DNA 2007
Tasa de hibridación
La constante cinética k 1 depende de los siguientes
factores:
k 1= [k’ N(L S) 1/2 ]/N
L S = longitud de la cadena más corta en la formación del dúplex.
N = complejidad (número total de los pares de bases presentes en
secuencias no repetitivas).
k’ N = es la constante de nucleación.
Hibridación: pasos generales
• Pretratamiento: Condiciones previas para reducir
el background.
• Prehibridación: Bloqueo de la superficie dónde
no hay DNA depositado.
• Hibridación: Reacción a la temperatura
adecuada.
• Lavados: Para eliminar la muestra marcada que
no se ha unido y la hibridación inespecífica.
Esquema del procesado de macrochips
• Pretratamiento: (sólo para membranas que se
utilizan por primera vez).
• Prehibridación: con o sin formamida.
• Hibridación: solución de prehibridación +
muestra marcada. En horno de hibridación.
• Lavados: a determinada Tª con SSC y SDS.
• Impresión de la pantalla.
• Lectura en fosforimager.
• Deshibridación: limpieza en caliente de la
membrana para su reutilización (tampón fosfato y
SDS).
Hibridación y lectura 2

Chips de DNA 2007
Hibridación de Macrochips
• Tratamiento similar a las membranas de Southern o
Northern blots: En tubos y hornos de hibridación
que producen un movimiento giratorio.
• La muestra se marca con algún dNTP radiactivo,
usualmente [α 33 P]-dCTP, -dATP o -UTP.
• En estudios de comparación se requieren dos pasos
de hibridación diferentes de la misma membrana.
• Cada hibridación sólo genera un valor por punto.
Horno de hibridación
Hibridación en Microchips
- Microarray + cubreobjetos en cámaras de hibridación
Cámara de
hibridación
Hibridación y lectura 3

Chips de DNA 2007
Hibridación de un microchip
Hibridación en Microchips
-Microarray + cubreobjetos en cámaras de hibridación
-SSP (slide sandwich principle). Dos chips enfrentados
por la cara impresa y que comparten la misma solución de
hibridación (i.e. El total de spots a analizar esta distribuido
en 2 slides diferentes).
Slide sandwich principle
Solución de
hibridación
Array 1 Array 2
Spots
Hibridación y lectura 4

Chips de DNA 2007
Slide sandwich principle
Slide sandwich principle
Slide sandwich principle
Hibridación y lectura 5

Chips de DNA 2007
Hibridación en Microchips
• -Microarray + cubreobjetos en cámaras de hibridación.
• -SSP (slide sandwich principle). Dos arrays tocándose en la cara
impresa que comparten la misma solución de hibridación. (El
total de spots a analizar esta distribuido en 2 slides diferentes).
• -Robot:
– Útil cuando el número de muestras es elevado
– Minimiza la variación de factores entre distintos chips
En cualquiera de los tres casos, la solución de hibridación no se mueve y el
DNA fijado en el chip sólo tiene acceso a la muestra marcada que está 2 o
3 mm alrededor. Esto puede producir un efecto de agotamiento local de
determinadas dianas. Suelen incluir sistemas de mezclado continuo de la
solución de hibridación.
Sistema robotizado de hibridación y lavados
Pasos en la hibridación de microchips
•
•
Rehidratación.
Método del champú.
opcionales
– Lavado a 63 ºC en solución de SSC/SDS
– Bloqueo con anhídrido succínico
• Prehibridación
• Hibridación
• Lavados
• Secado del chip
Hibridación y lectura 6

Chips de DNA 2007
Hibridación con dos
muestras marcadas
con Cy3 y Cy5
Macroarrays Microarrays cDNA Chips de oligos
Tipo
Comparación entre tipos de Chips
Cantidad de
sonda/punto
Cantidad
de muestra
Densidad
de sondas
Volúmen de
hibridación
Macro
40 ng
2 µg de
mRNA
60/cm 2
5-40 mL
Micro
2.5 ng
2 µg de
mRNA
3000/cm 2
25-100µL
Oligos
10 6 /10 7
oligos
2.5 µg de
mRNA
60000/cm 2
200 µL
Hibridación y lectura 7

Chips de DNA 2007
Lectura de chips
• Macrochips: Lectura de la pantalla
fotoestimulada mediante un láser de barrido
(Fosforimager).
Macrochip de levadura
cDNA Genómico
Funcionamiento de la pantalla fotoestimulante
Exposición: la membrana
con componentes
radiactivos se coloca
sobre la plantalla de
cristales de haluros
alcalinos (BaFBrEu)
Oxidación de Eu 2+ a
Eu 3+ por la emisión
radiactiva
Creación del centro
F con el electrón
resultante
Revelado: un
láser barre toda la
superficie
Fotoestimulación del
Eu 3+ que pasa a Eu 2+
excitado
El Eu 2+ emite un
fotón que es captado
por un detector
El Eu 2+ excitado
vuelve a su estado
inicial
Hibridación y lectura 8

Chips de DNA 2007
Nueva tecnología para lectura de Microchips
• Necesidad de resolución moderadamente alta ya que el
tamaño de los puntos (50-200 μm) está entre los dots de las
membranas y los objetos que se ven al microscopio.
• El sistema tiene que escanear un área bastante extensa
(2x6 cm) en poco tiempo.
• Debe distinguir al menos entre dos espectros de fluoróforos.
• La detección debe permitir medir de forma linear entre el
rango de abundancia de los mRNAs.
• Se debe escanear el área completa de forma uniforme para
asegurar la reproducibilidad.
Sistemas de detección de microchips
• Fotodetección (scanning system)
– Lectura confocal
– Lectura no confocal
• Iluminación (staring system)
– Cámaras CCD (Charge-Coupled
Device).
Sistemas de iluminación
• Normalmente son cámaras CCD (Charge-Coupled
Device) con lámparas de xenón de amplio espectro.
• Se utilizan distintos filtros ópticos para los diferentes
espectros de excitación.
• Iluminan y detectan una superficie grande.
• Normalmente hacen falta varias fotos solapantes para
cubrir toda la superficie del microchip.
• Menor resolución (1600x1200 pixels) y mayor rapidez.
Hibridación y lectura 9

Chips de DNA 2007
Lector CCD
Sistemas de Fotodetección
• Utiliza láseres de excitación con λ específica para
cada fluoróforo que iluminan un área muy pequeña.
• La excitación óptima, es el flujo de fotones que
produce un estado excitado en el 50% de las
moléculas.
• La lectura de los dos fluoróforos se puede hacer
secuencial o simultánea.
• La resolución debe ser más fina (5-20 μm) que el
tamaño del spot (100 μm). El tamaño de la imágenes
es de 2500x7600 píxels si se escanea a 10 μm.
• Mayor resolución que las cámaras CCD.
Lector láser de Microchips
Hibridación y lectura 10

Chips de DNA 2007
espejo
Pasos en la lectura de microchips
filtro emisión
microarray
espejo
objetivo
•Excitación por láser.
•Direccionamiento
espacial del espejo del
láser, de la muestra o
ambos.
•Captación por una
lente de objetivo de la
luz emitida.
•Discriminación
excitación/emisión por
el filtro.
•Detección.
Pasos en la detección de la señal
•Los filtros de emisión óptica separan el espectro de
emisión en arrays con marcaje múltiple y detección
simultánea.
•El tubo fotomultiplicador (PMT) convierte los fotones en
una señal eléctrica, que es transformada en una imagen
digital de bits/pixel por medio de un convertidor.
•La imagen se visualiza en una escala log con un color
falso.
Adquisición secuencial vs simultánea
•La simultánea es:
–Más rápida.
– No requiere el alineamiento de las imágenes
después del escaneado.
– Se puede ver la imagen de cada fluoróforo a la
vez y no esperar al final.
– Hay peligro de cross-talk: contaminación óptica
de la señal de un canal por la señal del otro.
Hibridación y lectura 11

Chips de DNA 2007
Esquema de un escáner confocal
Confocal versus no confocal
• Escaner confocal:
+ Utiliza un orificio pequeño en un plano focal del sistema
óptico.
+ El background es menor.
+ Consigue mayor relación señal/ruido.
– Debe mantener un sistema de alineamiento estable ya que
encontrar el plano correcto es crítico.
– El desgaste de las partes que se mueven puede ser un
inconveniente.
– Menor sensibilidad (?) al no captar todos los fotones
– En chips de baja calidad puede ser difícil encontrar el plano
adecuado
Confocal versus no confocal
Hibridación y lectura 12

Chips de DNA 2007
Hibridación y lectura correcta de macrochips
Problemas de macrochips
1. Señal débil y background bajo.
2. Señal débil y background alto.
3. Señal fuerte con artefactos.
4. Señal fuerte con background alto y
uniforme.
5. Artefactos de la impresión específicos de
placa.
6. Fallo total.
Solución:
1. Señal débil y background bajo
Aumentar el tiempo de exposición o repetir el marcaje y poner más
muestra marcada en la hibridación.
Hibridación y lectura 13

Chips de DNA 2007
2. Señal débil y background alto.
Solución:
Marcar otra muestra de nuevo y utilizar un nuevo macrochip
3. Señal fuerte con artefactos.
Solución:
-Excluir los puntos afectados del análisis.
-Repetir el experimento con cuidado de no dañar la membrana.
4. Señal fuerte con background alto y
uniforme.
Solución:
-Eliminar la señal de la membrana y reutilizar.
-Normalizar la señal respecto al otro marcaje.
Hibridación y lectura 14

Chips de DNA 2007
5. Artefactos de la impresión
específicos de placa.
Solución:
-Hacer nuevas impresiones de membranas.
-Normalizar la señal con algún método que tenga en cuenta
diferencias entre agujas.
Hibridación y lectura correcta de microchips
Bajo background.
Señales uniformes y bien
visibles.
Problemas en la preparación e impresión
• 1. Background elevado antes de hibridar.
• 2. Morfología irregular de los puntos.
• 3. Colas de cometa.
• 4. Puntos dilatados.
•5. Donuts.
• 6. Bloqueo de alguna aguja.
Hibridación y lectura 15

Chips de DNA 2007
1. Background elevado antes de hibridar
Problema: Sustrato
con fluorescencia por
recubrimiento
inadecuado.
Solución: escanear
algunos portaobjetos
antes de la impresión.
2. Morfología irregular de los puntos
Problema:
-Defectos en las agujas que pueden
estar sucias o estropeadas
-Excesivo tiempo de rehidratación.
Solución:
-Limpiar las agujas o utilizar nuevas.
Tratarlas siempre con mucho cuidado.
-Preimprimir algunos portaobjetos y no
rehidratar los chips en exceso.
3. Colas de cometa
Problema:
-DNA demasiado concentrado.
-Fijación incorrecta.
Solución:
-Comprobar la concentración
del DNA a 150-250 µg/ml.
-Asegurarse de que la fijación
por calor o UV sea la correcta.
-Eliminar el DNA no unido
lavando los chips con 1% SDS
antes de la hibridación.
Hibridación y lectura 16

Chips de DNA 2007
4. Puntos dilatados
Problema: Algunas agujas dejan demasiada
cantidad de líquido en la impresión. Suele
ser peor en los primeros chips y al principio
de la impresión.
Solución:
-Comprobar que no haya exceso de líquido
en los pocillos de algunas o todas las
muestras. Lo ideal son 8 µL en placas de 384
pocillos.
-Limpiar bien los pins
-Imprimir con humedad relativa del 50-60%.
5. Donuts
Problema: Distribución irregular del
DNA en el punto causada por el secado
demasiado rápido de los chips.
Solución:
-Controlar la humedad al 50-60%.
-Probar otros substratos mas
hidrofóbicos para los chips.
-Incluir DMSO o betaína en la solución
de impresión.
-Rehidratar los chips después de la
impresión.
6. Bloqueo de alguna aguja
Problema: alguna aguja se bloquea
total o parcialmente por alguna
partícula y deja de imprimir muestra.
Solución:
-Preparar el material a imprimir con
mucha precaución para evitar la
existencia de partículas.
-Limpiar a fondo las agujas antes de
la impresión.
-Sonicar si es posible las agujas en
cada ciclo de lavado.
Hibridación y lectura 17

Chips de DNA 2007
Problemas en la hibridación
• 1. Manchado fluorescente.
• 2. Background en los bordes del cubreobjetos.
• 3. Background después de la hibridación.
• 4. Señal de baja intensidad.
• 5. Burbujas
• 6. Substrato dañado.
• 7. Señal que decrece gradualmente
• 8. Señal reversa: agujeros negros
• 9. Contaminación de partículas.
1. Manchado fluorescente
Problema: Background muy elevado debido a:
-Fallo en la eliminación de las moléculas
fluorescentes no incorporadas.
-El SDS de la sol. de hibridación ha precipitado.
-En algún paso de lavado la solución se ha secado en
el chip.
Solución:
-Utilizar columnas para purificar el marcaje.
-No dejar enfriar la sol. de hibridación después de
desnaturalizar para evitar que precipite el SDS.
-Hacer bien los lavados y secar por centrifugación.
2. Background en bordes del cubreobjetos
Problema: Background muy elevado
predominantemente en la periferia del
chip debido a la deshidratación de la
solución de hibridación en los bordes.
Solución:
-Asegurar una correcta cámara húmeda
durante la hibridación.
-Considerar utilizar formamida en la
solución de hibridación e hibridar a 42º
en lugar de 65º.
Hibridación y lectura 18

Chips de DNA 2007
3. Background después de la hibridación
Problema: No se han
eliminado eficientemente
las moléculas de fluoróforo
no incorporado.
Solución: Purificación de
la muestra marcada
mediante columnas.
4. Señal de baja intensidad
Problema:
-Concentración inadecuada de las sondas
impresas en el chip.
-Problemas de calidad y/o cantidad del RNA
que ha producido un marcaje poco eficiente.
-Solución hibridación diluida.
-Defecto del escáner.
Solución:
- Asegurarse de que hay suficiente DNA
depositado en cada punto.
-Aumentar la cantidad y calidad del RNA a
marcar.
5. Burbujas
Problema: formación
de una burbuja bajo el
cubreobjetos que
impide la hibridación .
Solución:
-Evitar burbujas
centrifugando la
solución de hibridación.
-Utilizar cubreobjetos
específicos y limpiarlos
muy bien con N 2
comprimido
Hibridación y lectura 19

Chips de DNA 2007
6. Substrato dañado
Problema: El chip ha sufrido daños
(rayas) al posicionar el cubreobjetos o
se ha movido posteriormente.
Solución: No intentar reposicionar el
cubreobjetos y evitar que se seque en
exceso la solución de hibridación para
facilitar su eliminación en los lavados.
Problema: El substrato de poli-Llisina
ha sufrido daños por las agujas
de impresión.
Solución: Si sólo lo produce una aguja
ver si está dañada. Si el problema es
general hay que reducir la velocidad
de contacto en la impresión.
7. Señal que decrece gradualmente
Problema: Distribución
desigual de la solución de
hibridación por estar al límite
de la difusión.
Solución:
-Aumentar el volumen de la
solución de hibridación.
-Utilizar como substrato alguna
matriz porosa y alguna estación
de hibridación que fuerce a la
solución de hibridación a entrar
y salir.
8. Señal reversa: Agujeros negros
Problema: La señal de los puntos
es menor que la señal del
background de la zona que los
rodea. Ha fallado el blocking.
Solución:
-Preparar la solución de blocking
inmediatamente antes de su uso.
-Utilizar substratos que no requieran
o que requieran menos pasos de
blocking.
Hibridación y lectura 20

Chips de DNA 2007
9. Contaminación de partículas
Problema:
-Contaminación del material de trabajo
(poyata, guantes, etc.) con fibras o
partículas de polvo.
-Porta y/o cubreobjetos sucios.
-Partículas en las soluciones de lavados.
Solución:
-Utilizar guantes sin polvo y trabajar en
ambiente libre de polvo.
-Utilizar aerosoles de aire comprimido
para la limpieza de las áreas de trabajo.
-Filtrar todas las soluciones de pre- e
hibridación, lavados, etc.
Problemas en la lectura
• 1. Posición del chip en el escáner
• 2. Lectura fuera de foco.
• 3. Óptica defectuosa.
• 4. Canales no alineados.
• 5. Saturación de la mayoría de los
puntos.
1. Posición del chip en el escáner
Problema: La señal disminuye a lo largo
del eje del chip porque no está plano.
Solución:
-Revisión del escáner por el servicio
técnico.
-Asegurarse de que los portaobjetos son de
buena calidad y específicos para
microchips.
Hibridación y lectura 21

Chips de DNA 2007
2. Lectura fuera de foco
3. Optica defectuosa
4. Canales no alineados
Problema: El chip está
fuera de foco.
Solución: Desactivar la
opción “autofocus” y
enfocar manualmente si
el escáner lo permite
Problema: Intensidad
de señal alta y baja
alternante.
Solución: Revisión
del aparato por el
servicio técnico.
Problema: los canales rojo y
verde no están alineados porque
la lectura de cada láser no ha
empezado en el mismo punto.
Solución:
-Revisión de las partes móviles
por el servicio técnico.
-El software de análisis
normalmente permite ajustar el
alineamiento de ambos canales.
Hibridación y lectura 22

Chips de DNA 2007
5. Saturación de la mayoría de los puntos
Problema: Opciones
erróneas de lectura.
Solución: Escanear de
nuevo bajando el poder del
láser y/o la PMT.
Ejemplo de software de lectura
Protocolo de adquisición de las imágenes
Hibridación y lectura 23

Chips de DNA 2007
Opciones de ajuste de la lectura
Obtención de datos crudos
Spot labels Ctrl Dens Ctrl Bkgd Ctrl Dens Corrected Ctrl Dens/Bkgd Data Dens Data Bkgd Data Dens Corrected Data Dens/Bkgd
R1 - C1 : 1 221,06 27,785 193,275 7,96 68,71 9,036 59,671 7,60
R1 - C1 : 2 30,77 34,3 0 0,90 10,01 11,328 0 0,88
R1 - C1 : 3 457,18 34,646 422,539 13,20 206,31 12,98 193,325 15,89
R1 - C1 : 4 64,44 21,133 43,303 3,05 21,71 9,553 12,156 2,27
R1 - C2 : 1 105,39 22,18 83,211 4,75 31,43 5,882 25,545 5,34
R1 - C2 : 2 24,85 25,744 0 0,97 7,06 6,776 0,282 1,04
R1 - C2 : 3 27,66 26,634 1,024 1,04 8,57 7,834 0,734 1,09
R1 - C2 : 4 45,6 26,951 18,65 1,69 11,41 7,872 3,541 1,45
R1 - C3 : 1 98,24 30,451 67,792 3,23 30,21 9,352 20,856 3,23
R1 - C3 : 2 119,21 36,156 83,054 3,30 31,25 12,672 18,582 2,47
R1 - C3 : 3 322,65 41,263 281,391 7,82 97,41 15,021 82,385 6,48
R1 - C3 : 4 58,31 45,444 12,87 1,28 21,27 15,809 5,463 1,35
R1 - C4 : 1 303,57 72,444 231,125 4,19 84,93 25,866 59,062 3,28
R1 - C4 : 2 367,71 136,471 231,243 2,69 157,06 59,557 97,503 2,64
R1 - C4 : 3 14634,24 361,822 14272,42 40,45 6567,03 130,818 6436,217 50,20
R1 - C4 : 4 290,65 130,835 159,812 2,22 110,43 51,089 59,339 2,16
R1 - C5 : 1 90,22 49,325 40,892 1,83 34,33 17,999 16,326 1,91
R1 - C5 : 2 137,2 42,02 95,179 3,27 47,72 12,756 34,967 3,74
R1 - C5 : 3 56,06 40,091 15,969 1,40 16,33 11,422 4,91 1,43
R1 - C5 : 4 108,21 37,703 70,508 2,87 28,35 9,675 18,674 2,93
R1 - C6 : 1 191,7 40,228 151,468 4,77 49,82 13,184 36,635 3,78
R1 - C6 : 2 289,56 50,514 239,043 5,73 220,54 20,051 200,486 11,00
R1 - C6 : 3 172,34 45,309 127,029 3,80 71,22 16,344 54,873 4,36
R1 - C6 : 4 40,86 33,107 7,757 1,23 11,74 9,704 2,034 1,21
R1 - C7 : 1 184,54 31,799 152,741 5,80 34,07 7,491 26,58 4,55
R1 - C7 : 2 112,68 28,809 83,875 3,91 46,06 7,598 38,459 6,06
R1 - C7 : 3 58,46 25,905 32,555 2,26 23,26 7,435 15,821 3,13
R1 - C7 : 4 32,54 25,619 6,921 1,27 11,58 6,876 4,701 1,68
R1 - C8 : 1 142,52 28,543 113,973 4,99 26,44 7,492 18,946 3,53
R1 - C8 : 2 58,44 31,66 26,779 1,85 18,11 8,812 9,293 2,06
R1 - C8 : 3 74,3 36,969 37,33 2,01 22,54 9,281 13,259 2,43
R1 - C8 : 4 121,8 41,335 80,469 2,95 34,3 10,641 23,66 3,22
R1 - C9 : 1 63,18 34,285 28,9 1,84 20,72 9,224 11,499 2,25
R1 - C9 : 2 59,53 33,467 26,059 1,78 28,16 8,788 19,367 3,20
R1 - C9 : 3 30,32 29,916 0,402 1,01 8,49 7,72 0,772 1,10
R1 - C9 : 4 167,28 29,028 138,251 5,76 49,69 7,248 42,444 6,86
R1 - C10 : 1 209,11 30,36 178,75 6,89 24,37 7,211 17,157 3,38
R1 - C10 : 2 73,92 30,302 43,623 2,44 16,21 8,579 7,631 1,89
R1 - C10 : 3 253,67 29,779 223,895 8,52 136,67 9,31 127,364 14,68
R1 - C10 : 4 70,29 29,122 41,165 2,41 22,59 7,79 14,795 2,90
R1 - C11 : 1 62,19 25,253 36,938 2,46 18,71 6,531 12,176 2,86
R1 - C11 : 2 72,82 26,041 46,777 2,80 17 6,474 10,53 2,63
Hibridación y lectura 24