Práctica 7. Técnicas de aislamiento de microorganismos. - UNAM

Unidad 5. Técnicas de aislamiento de microorganismos
Práctica 7. Técnicas de aislamiento de
microorganismos.
Objetivos
Explicar el fundamento de diferentes medios de cultivo y condiciones de incubación
para el aislamiento de microorganismos con características específicas.
Aplicar diferentes técnicas para el aislamiento de microorganismos.
Obtener y comprobar la pureza de los cultivos aislados
Aplicar una técnica de conservación de corto o mediano plazo a los cultivos puros
obtenidos.
Introducción
En todos los ambientes naturales habitan múltiples microorganismos de diversos tipos y
actividad fisiológica. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario
separarlo de la población mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean técnicas de
aislamiento que conduzcan a la obtención de un cultivo puro.
De manera general los métodos de aislamiento incluyen:
1. Separación física de los microorganismos mediante:
a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa
b) Siembra por agotamiento
2. Utilización de medios de cultivo selectivos y diferenciales.
3. Aprovechamiento de características particulares de los microorganismos, tales como
la formación de esporas, el metabolismo anaerobio y/ o facultativo, la capacidad
para utilizar sustratos poco comunes, etc.
Para facilitar el proceso de aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente se
emplean combinaciones de las técnicas anteriores.
1ª sesión
Materiales
Por equipo
1 tripie
1 charola de metal
1 vaso de precipitados de 250 mL
1 varilla de vidrio en “L”
2 mecheros
1 gradilla
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram
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Material por grupo
2 balanzas granatarias
2 jarras de anaerobiosis
2 paquetes de Gas Pack
Medios de cultivo:
1 caja de Petri con TSA
1 caja de Petri con agar EMB
1 caja de Preti con MSA
1 caja de Petri con agar YPDM
1 con agar Sabouraud Rosa de Bengala más estreptomicina.
2 cajas de Petri con agar anaeróbico de Brewer
Material que deben tener los alumnos:
Muestra: lodo de la columna de Winogradski
3 tubos de 16 x 150 con 9.0mL de SSI
2 pipetas de 1.0mL estériles
Metodología
a) Dilución de la muestra
1. Pesar 1 g de lodo de la columna de Winogradsky y en condiciones asépticas vaciar
en un tubo con 9mL de SSI estéril (Dilución1).
2. Homogeneizar y a partir de esta suspensión preparar una dilución decimal en el otro
tubo con SSI estéril (Dilución 2). A partir de esta dilución realizar una tinción de Gram y
una preparación en fresco.
b) Siembra por agotamiento
1. A partir de la primera dilución y con el asa bacteriológica sembrar por la técnica de
cuadrante radial en cada una de las cajas Petri con los medios TSA, agar EMB y MSA.
2. Asegurar cada una de las cajas con maskin tape.
3. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
c) Siembra por extendido en placa
1. A partir de la segunda dilución, inocular 0.1mL con una pipeta estéril en cada una
de las cajas de agar YMPD y agar Sabouraud Rosa de Bengala más estreptomicina.
2. Extender la muestra en la superficie con una varilla esterilizada con alcohol y flama.
3. Asegurar cada una de las cajas con maskin tape.
4. Incubar a 28ºC durante 5 a 7 días.
d) Aislamiento de bacilos esporulados
1. Colocar el tubo con la segunda dilución en un baño de agua a ebullición y
mantenerlo durante 15 minutos.
2. Inocular 0.1mL con una pipeta estéril en cada una de las cajas de agar anaeróbico
de Brewer y extender la muestra en la superficie con una varilla esterilizada con
alcohol y flama.
3. Asegurar cada una de las cajas con maskin tape.
4. Incubar a 37ºC durante 48 horas, una de las cajas en condiciones aeróbicas y la otra
en condiciones anaeróbicas utilizando una jarra de anaerobiosis.
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Columna de
Winogradsky
TSA
Agar EMB
MSA
1 gramo
de lodo
Inocular
con asa
Diagrama de flujo
1 mL
Dilución 1 Dilución 2
0.1mL
Agar Sabouraud
Rosa de
Bengala más
estreptomicina
Agar
YMPD
Agar anaeróbico
de Brewer
Ebullir
durante
15
minutos.
Tinción de
Gram y
preparación
en fresco
0.1mL
Aerobiosis Anaerobiosis
Disposición de desechos
1. Esterilizar los tubos en los que prepararon las diluciones y posteriormente lavarlos.
Preparar nuevamente los tubos con 9mL de SSI y esterilizar. Guardar en gaveta.
2. Regresar las pipetas a su envoltura y esterilizarlas, ya estériles lavarlas, y nuevamente
prepararlas para esterilizar. Guardar en la gaveta.
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2ª sesión
Materiales
Por equipo
2 mecheros
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram
Medios de cultivo
1 caja de Petri con TSA
1 caja de Petri con agar EMB
1 caja de Preti con MSA
1 caja de Petri con agar YPDM
Metodología
a) Desarrollo colonial en los diferentes medios de cultivo enriquecidos, selectivos y
diferenciales para bacterias.
En las placas con TSA, agar EMB y MSA proceda a:
1. Comparar la diversidad de las colonias desarrolladas en las cajas sembradas.
2. Fotografiar o dibujar cada caja y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias
bacterianas en cada uno de los medios de cultivo. Ejemplo:
Medio TSA
Colonia Descripción macroscópica (fecha) Descripción microscópica (fecha)
1
2
3
3. Realizar una tinción de Gram solo a aquellas colonias que indique el profesor ya que
serán las seleccionadas para el aislamiento.
b) Aislamiento de bacterias Gram positivas
1. A partir del medio de TSA seleccionar de dos a cuatro colonias diferentes y realizar
una tinción de Gram (en un mismo portaobjetos). Para realizar la tinción es muy
importante tomar como máximo solo una tercera parte de la colonia, el resto de la
colonia será empleada si la colonia es seleccionada para el aislamiento.
2. Si una o varias de las colonias seleccionadas corresponden microscópicamente a
bacterias Gram positivas, resembrar a partir de la misma colonia en la caja con TSA
nueva. Seguir instrucciones del profesor en cada caso para la resiembra.
3. Etiquetar como 2º aislamiento Bacterias G+ (1G+, 2G+, etc.)
4. En caso de que las colonias seleccionadas no correspondan a las bacterias
requeridas, seleccionar otras colonias y realizar la tinción de Gram.
5. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37ºC durante 24 horas.
6. La caja con TSA del primer aislamiento deberá ser refrigerada a 4ºC.
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c) Aislamiento de bacterias Gram negativas
1. A partir del medio de agar EMB seleccionar una o dos colonias que presenten un color
magenta intenso (lactosa positiva) y una o dos colonias que presenten un color rosa
claro o translúcidas (lactosa negativa), y realizar una tinción de Gram (en un mismo
portaobjetos). Para realizar la tinción es muy importante tomar como máximo solo
una tercera parte de la colonia, el resto de la colonia será empleada si la colonia es
seleccionada para el aislamiento.
2. De aquellas colonias que microscópicamente correspondan a bacterias Gram
negativas, resembrar a partir de la misma colonia de la cual se realizó la tinción, una
bacteria lactosa positiva y una bacteria lactosa negativa en una caja de agar EMB
nueva. Seguir instrucciones del profesor en cada caso para la resiembra.
3. Etiquetar como 2º aislamiento Bacterias G- (G-Lac+ y G-Lac-).
4. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37ºC durante 24 horas.
5. La caja con agar EMB del primer aislamiento deberá ser refrigerada a 4ºC.
d) Aislamiento de bacterias halotolerantes (Staphylococcus)
1. A partir del medio de MSA seleccionar una o dos colonias que viren el indicador a
color amarillo (manitol positivo) y una o dos colonias que viren el indicador a un color
rosa intenso (manitol negativo), y realizar una tinción de Gram (en un mismo
portaobjetos). Las colonias de Staphylococcus son pequeñas de un diámetro
aproximado de 3mm, convexas de color blanquecino a amarillas. Para realizar la
tinción es muy importante tomar como máximo solo una tercera parte de la colonia,
el resto de la colonia será empleada si la colonia es seleccionada para el aislamiento.
2. De aquellas colonias que microscópicamente correspondan a bacterias cocoides
Gram positivas, resembrar a partir de la misma colonia de la cual se realizó la tinción,
una bacteria manitol positiva y una bacteria manitol negativa en una caja de MSA
nueva. Seguir instrucciones del profesor en cada caso para la resiembra.
3. Etiquetar como 2º aislamiento Halotolerantes (Man+ y Man-).
4. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37ºC durante 24 horas.
5. La caja con MSA del primer aislamiento deberá ser refrigerada a 4ºC.
e) Aislamiento de bacterias esporuladas (aerobias y anaerobias)
En las placas con agar anaeróbico de Brewer proceda a:
1. Comparar la diversidad de las colonias desarrolladas en las cajas sembradas.
2. Fotografiar o dibujar cada caja y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias
bacterianas en cada una de las condiciones.
3. Asegurar las cajas con maskin tape e incubar a 37ºC durante 4 días más para
comprobar la formación de esporas.
Disposición de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95 %.
3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.
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3ª sesión
Materiales
Por equipo
2 asas micológicas
1 tripie
1 charola de metal
1 vaso de precipitados de 250 mL
2 mecheros
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram
Por mesa
2 frascos de verde de malaquita 5%
1 frasco de safranina 0.5%
1 frasco con azul de algodón lactofenol
Metodología
a) Continuación del aislamiento de bacterias
1. Revisar cada una de las cajas con los segundos aislamientos y registrar los resultados
para cada tipo de bacterias.
2. Verificar pureza mediante la observación macroscópica.
3. Con la asesoría del profesor seleccionar una colonia para cada uno de los grupos
buscados.
4. Realizar una tinción de Gram para confirmar la morfología microscópica y la pureza.
5. Resembrar en una caja de TSA (3er aislamiento) las tres colonias bacterianas.
6. Asegurar la caja con maskin tape e incubar a 37ºC durante 24 horas.
7. Las cajas del segundo aislamiento deberán ser refrigeradas a 4ºC.
b) Aislamiento de bacterias esporuladas (aerobias y anaerobias)
1. Seleccionar de cada una de las cajas de agar anaeróbico de Brewer dos colonias de
morfología distinta según las instrucciones del profesor.
2. Preparar un frotis (dos por portaobjetos) y realizar una tinción de esporas. Registrar los
resultados en cada una de las condiciones.
3. Desechar las cajas con agar anaeróbico de Brewer.
c) Aislamiento de actinomicetos
1. Observar las características macroscópicas de las colonias desarrolladas en el agar
YPMD.
2. Fotografiar o dibujar y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias
bacterianas.
3. Seleccionar dos colonias que correspondan claramente a las características
coloniales de los actinomicetos (colonias secas, planas, de aspecto polvoso,
blanquecinas o pigmentadas) y preparar un frotis.
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4. Realizar una tinción de Gram y comprobar las características microscópicas
(bacterias filamentosas Gram positivas).
5. Seleccionar una de las colonias que correspondan a las características
macroscópicas y microscópicas de los actinomicetos y resembrar en otro medio de
agar YMPD. Etiquetar como 2º aislamiento de actinomicetos.
6. Asegurar la caja con masking tape e Incubar a 28ºC durante 48 horas.
7. La caja con agar YMPD del primer aislamiento deberá ser refrigerada a 4ºC.
d) Aislamiento de hongos
1. Observar las características macroscópicas de las colonias desarrolladas en el agar
Sabouraud Rosa de Bengala más estreptomicina.
2. Fotografiar o dibujar y registrar en una tabla los tipos diferentes de colonias.
Seleccionar dos colonias que correspondan a las características coloniales de los
hongos.
3. Realizar una impronta con azul de algodón lactofenol y comprobar las características
microscópicas. En caso de colonias de levaduras realizar una tinción de Gram.
4. Seleccionar dos de las colonias que correspondan a las características
macroscópicas y microscópicas de los hongos y resembrar en otros medio de agar
Sabouraud. Etiquetar como 2º aislamiento de hongos.
5. Asegurar la caja con masking tape e Incubar a 28ºC durante 48 horas.
6. La caja con agar Sabouraud Rosa de Bengala más estreptomicina del primer
aislamiento deberá ser refrigerada a 4ºC.
Disposición de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95 %.
3. En el caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.
4. Sellar con maskin tape las cajas de Petri que contengan los cultivos de bacterias
esporuladas y colocar en el contenedor.
4ª sesión
Materiales
Por equipo:
2 mecheros
Microscopio
Reactivos para tinción de Gram
1 frasco con azul de algodón lactofenol
2 tubos de 13x100 con TSA inclinado
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Metodología
a) Continuación del aislamiento de bacterias
1. Revisar las cepas en el medio de TSA del 3er aislamiento. Corroborar la morfología
colonial y verificar la pureza.
2. De ser necesario realizar una tinción de Gram para confirmar la morfología
microscópica y la pureza.
b) Conservación del cultivo puro
1. Una vez confirmada la pureza de las colonias, seleccionar dos cepas e inocular cada
una en un tubo con agar TSA inclinado y en los medios sólidos en caja
proporcionados por el profesor. Incubar junto con los tubos a 37ºC durante 24 horas.
2. Al termino de la incubación revisar el crecimiento y sellar los tubos con papel parafilm
y guardar en refrigeración a 4ºC junto con las cajas del 3er aislamiento y los medios
sólidos en placa de los cultivos puros seleccionados.
3. Los cultivos del primer y segundo aislamiento pueden ser entonces desechados.
c) Aislamiento de actinomicetos y de hongos
1. Revisar las morfologías macroscópicas y microscópicas de los aislamientos de
actinomicetos y hongos. Registrar los resultados.
2. De no haber crecimiento incubar nuevamente por tres días más.
3. Desechar los medios del primer y segundo aislamiento.
Disposición de desechos
1. Verter los desechos de colorantes en los contenedores dispuestos en los laboratorios.
2. Después de observar las preparaciones, sumergir los portaobjetos en una solución
sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y colocarlos en un
frasco con alcohol al 95 %.
3. En caso de ruptura de las preparaciones, envolver los fragmentos con papel,
esterilizar el paquete en autoclave y después desecharlos en el contenedor de vidrio
roto.
Bibliografía complementaria
Cappuccino, James G. and Sherman Natalie. 2005. Microbiology: a laboratory manual.
7 th edition. Pearson/Benjamin Cummings. USA. QR63 C36 2005
Leboffe Michael J. and Burton E. Pierce. 2006. Microbiology laboratory theory and
application. 2 nd edition, Morton Publishing Co. USA. QR63 L43 2006.
Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11 th edition.
Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock Biología de los microorganismos.
10ª edición, Prentice Hall Iberia. España. QR41.2 B75318 2004.
Prescott Lansing M., Harley John P. and Klein Donald A. 2005. Microbiology. 6 th edition.
McGraw-Hill. USA. QR41.2 P74 2005
Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía
Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M
del C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª
edición. Facultad de Química, UNAM. México.
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Schaechter Moselio, Ingraham John L. and Neidhardt Frederick C. 2006. Microbe.
American Society for Microbiology. USA. QR41.2 S288
Tortora Gerard J., Funke Berdell R. and Case Christine L. 2007. Microbiology : an
introduction. 9th edition. Benjamin Cummings. USA. QR41.2 T67 2007
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