Actualizaciones Teóricas - Olimpíada Argentina de Biología
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OLIMPÍADA ARGENTINA DE BIOLOGIA<br />
AUSPICIA Y FINANCIA EL MINISTERIO DE EDUCACIÓN, CIENCIA Y<br />
TECNOLOGÍA<br />
UNIVERSIDAD NACIONAL DE RÍO CUARTO<br />
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS FÍSICO-QUÍMICAS Y NATURALES-<br />
CUADERNILLO TEÓRICO<br />
OAB
CONCEPTOS DE LAS CIENCIAS BIOLÓGICAS<br />
1<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Sobre la base <strong>de</strong> los temarios teóricos y prácticos propuestos para la OAB, y<br />
consi<strong>de</strong>rando la necesidad <strong>de</strong> lograr un abordaje <strong>de</strong>l conocimiento actualizado es que<br />
ponemos a su disposición esta guía orientadora, según la bibliografía disponible en<br />
esta <strong>Olimpíada</strong>, la cual es consultada por los Comités académicos para lograr i<strong>de</strong>as<br />
que permitan la elaboración <strong>de</strong> los exámenes <strong>de</strong> todas las instancias <strong>de</strong> esta<br />
<strong>Olimpíada</strong>.<br />
La ampliación <strong>de</strong> estos contenidos pue<strong>de</strong>n realizarse en cualquier material que<br />
Ud. disponga y que se encuentre acor<strong>de</strong> a lo aquí especificado.<br />
En esta primera propuesta se presentan los tres tópicos <strong>de</strong> los temarios teóricos<br />
(<strong>Biología</strong> Celular, Organismos y Etología, Ecología y Evolución), <strong>de</strong> los cuales se<br />
seleccionaron algunos puntos en función <strong>de</strong> las dificulta<strong>de</strong>s observadas en ediciones<br />
anteriores <strong>de</strong> la OAB, entre ellos Biotecnología, Sistemática <strong>de</strong> animales, Anatomía <strong>de</strong><br />
vegetales, Cladismo y conceptos incluidos en Etología. Asimismo se incorporaron<br />
algunas <strong>de</strong>strezas básicas incluidas en los temarios prácticos <strong>de</strong> ambos niveles.<br />
Compilación: Lic. y Prof. Analía Barbosa<br />
Secretaria <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong>
Tópico: <strong>Biología</strong> Celular<br />
Ingeniería genética<br />
2<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
En 1970 comienza el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> la tecnología <strong>de</strong>l DNA recombinante, llevando<br />
a métodos <strong>de</strong> investigación novedosos.<br />
Las técnicas <strong>de</strong> DNA recombinante se <strong>de</strong>sarrollaron en un principio como<br />
herramientas que permitirían a los científicos obtener una gran cantidad <strong>de</strong> copias <strong>de</strong><br />
cualquier segmento <strong>de</strong> DNA específico, <strong>de</strong> manera que éste pudiera estudiarse <strong>de</strong>s<strong>de</strong><br />
el punto <strong>de</strong> vista bioquímico. Esto se realizó en un inicio introduciendo DNA ajeno en<br />
células <strong>de</strong> microorganismos. En condiciones apropiadas, éste se duplica y transmite a<br />
las células hijas cuando la original se divi<strong>de</strong>. Así una secuencia <strong>de</strong> DNA específica<br />
pue<strong>de</strong> ser amplificada o clonada para producir millones <strong>de</strong> copias idénticas que pue<strong>de</strong>n<br />
aislarse en forma pura. En la actualidad son cada vez más importantes los métodos in<br />
vitro.<br />
La tecnología <strong>de</strong>l DNA recombinante tiene varias aplicaciones, una <strong>de</strong> las que<br />
más avanza es la ingeniería genética, que implica la modificación <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> un<br />
organismo para producir nuevos genes con nuevas características. Su <strong>de</strong>sarrollo se<br />
<strong>de</strong>be al <strong>de</strong>scubrimiento <strong>de</strong> las enzimas <strong>de</strong> restricción y <strong>de</strong> la transformación bacteriana<br />
<strong>de</strong> los plásmidos. Las bacterias producen enzimas conocidas como <strong>de</strong> restricción, las<br />
cuales cortan las moléculas <strong>de</strong> DNA sólo en lugares específicos.<br />
La amplificación <strong>de</strong> un fragmento <strong>de</strong> DNA pue<strong>de</strong> lograrse in vitro, con el uso <strong>de</strong><br />
polimerasas <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> bacterias termorresistentes e in vivo, introduciendo moléculas<br />
<strong>de</strong> DNA recombinante (vector + inserto DNA) en bacterias u otros microorganismos<br />
como las levaduras.<br />
Las enzimas <strong>de</strong> restricción son “tijeras moleculares” cuya especificidad permite<br />
realizar cortes <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> manera controlada. Existen varias enzimas conocidas, un<br />
ejemplo es Bam HI que reconoce y corta una molécula <strong>de</strong> DNA en la secuencia <strong>de</strong><br />
bases 5´G/GATTCC-3´, otro es EcoRI, que corta la secuencia 5´-G/AATTC-3´.<br />
Muchas <strong>de</strong> las enzimas empleadas para estudios <strong>de</strong> DNA recombinante cortan<br />
secuencias polindrómicas, en las cuales una ca<strong>de</strong>na se lee igual que su complemento<br />
pero en sentido opuesto, por ejemplo para 5´-AAGCTT-3´ se lee, 3´-TTCGAA-5´.<br />
Cuando la enzima corta, quedan extremos <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>nas sencillas complementarios a los
3<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
que se <strong>de</strong>nomina “pegajosos” por la posibilidad que poseen <strong>de</strong> unirse entre sí por<br />
enlaces <strong>de</strong> hidrógeno. A<strong>de</strong>más, el fragmento pue<strong>de</strong> tratarse con una ligasa <strong>de</strong> DNA<br />
para lograr una molécula recombinante estable.<br />
En la figura se muestra el mecanismo <strong>de</strong> acción <strong>de</strong> una enzima <strong>de</strong> restricción.<br />
Luego <strong>de</strong>l aislamiento, los fragmento <strong>de</strong>l DNA, <strong>de</strong>ben ser incorporados a un<br />
portador a<strong>de</strong>cuado llamado vector para po<strong>de</strong>r ser amplificado.<br />
Vectores<br />
Después <strong>de</strong> unirse a un vector o vehículo <strong>de</strong> clonación, un segmento <strong>de</strong> DNA<br />
pue<strong>de</strong> llegar a entrar en una célula huésped y replicarse (clonarse). Los vectores son,<br />
esencialmente, moléculas <strong>de</strong> DNA transportadoras. Para servir <strong>de</strong> vector, una molécula<br />
<strong>de</strong> DNA <strong>de</strong>be tener unas <strong>de</strong>terminadas características:<br />
1. Debe po<strong>de</strong>r replicarse in<strong>de</strong>pendientemente junto con el segmento <strong>de</strong> DNA que<br />
transporta.<br />
2. Debe contener varios sitios <strong>de</strong> corte para enzimas <strong>de</strong> restricción, presentes sólo una<br />
vez en el vector. Estos sitios <strong>de</strong> restricción únicos permiten insertar segmentos <strong>de</strong><br />
DNA cortados con la misma enzima sin <strong>de</strong>smembrar el vector, situación que se<br />
produciría si se utilizasen sitios <strong>de</strong> restricción presentes más <strong>de</strong> una vez en el
4<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
vector.<br />
3. Debe tener algún marcador <strong>de</strong> selección, (normalmente genes <strong>de</strong> resistencia a<br />
antibióticos o genes <strong>de</strong> enzimas que la célula huésped no tenga) para po<strong>de</strong>r<br />
distinguir las células huésped que transportan al vector, <strong>de</strong> las que no las contienen.<br />
4. El vector <strong>de</strong>bería po<strong>de</strong>r extraerse fácilmente <strong>de</strong> la célula huésped.<br />
Actualmente se utilizan tres tipos principales <strong>de</strong> vectores: los plásmidos, los<br />
bacteriófagos y los cósmidos.<br />
Los plásmidos<br />
Un plásmido es una molécula circular separada <strong>de</strong>l DNA bacteriano y mucho<br />
más pequeña que éste pero con la capacidad <strong>de</strong> duplicarse <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la célula<br />
bacteriana y <strong>de</strong> brindarles faculta<strong>de</strong>s para <strong>de</strong>sarrollarse en condiciones específicas en<br />
las que no podrían hacerlo si no estuvieran transformadas.<br />
Son moléculas <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> doble ca<strong>de</strong>na extracromosómicas <strong>de</strong> origen natural<br />
que tienen un origen <strong>de</strong> replicación (ori+) y que se replican autónomamente en células<br />
bacterianas. Para po<strong>de</strong>r utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado <strong>de</strong> manera<br />
que contengan un número limitado <strong>de</strong> sitios <strong>de</strong> restricción y genes <strong>de</strong> resistencia a<br />
antibióticos específicos.<br />
El vector pBR322 fue uno <strong>de</strong> los primeros plásmidos diseñados que se utilizó.<br />
ori<br />
Figura. Mapa <strong>de</strong> restricción <strong>de</strong>l plásmido pBR322, que muestra las localizaciones <strong>de</strong> los sitios<br />
<strong>de</strong> las enzimas <strong>de</strong> restricción que cortan el plásmido por un solo sitio. Estos sitios pue<strong>de</strong>n<br />
utilizarse para insertar los fragmentos <strong>de</strong> DNA a clonar. También se muestran las<br />
localizaciones <strong>de</strong> los genes <strong>de</strong> resistencia a antibióticos.
5<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Este plásmido tienen un origen <strong>de</strong> replicación (ori), dos genes <strong>de</strong> selección<br />
(resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios <strong>de</strong> restricción<br />
únicos. Dentro <strong>de</strong>l gen <strong>de</strong> resistencia a tetraciclina hay sitios <strong>de</strong> restricción únicos para<br />
las enzimas BamHI, SpbI, SalI, XmaIII y NruI, y <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l gen <strong>de</strong> resistencia a<br />
ampicilina hay sitios <strong>de</strong> restricción únicos para las enzimas RruI, PvuI, y PstI. Si se<br />
introduce un pBR322 en una célula bacteriana sin plásmidos y sensible a antibióticos,<br />
la célula se convertirá en resistente a la tetraciclina y a la ampicilina. Si se inserta un<br />
fragmento <strong>de</strong> DNA en los sitios <strong>de</strong> restricción RruI, PvuI, o PstI, se inactivará el gen <strong>de</strong><br />
resistencia a ampicilina, pero el gen <strong>de</strong> resistencia a tetraciclina seguirá activo. Si este<br />
plásmido recombinante se transfiere a una célula bacteriana que no contenga<br />
plásmidos, las células que contengan el plásmido recombinante podrán i<strong>de</strong>ntificarse, ya<br />
que serán resistentes a tetraciclina y sensibles a ampicilina.<br />
ori<br />
Figura. El plásmido pUC18 ofrece varias ventajas como vector <strong>de</strong> clonación. Debido a su<br />
pequeño tamaño, pue<strong>de</strong> aceptar fragmentos <strong>de</strong> DNA relativamente gran<strong>de</strong>s; se replica hasta<br />
un alto número <strong>de</strong> copias y tiene un gran número <strong>de</strong> sitios <strong>de</strong> restricción en el sitio <strong>de</strong> clonación<br />
múltiple, localizado <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l gen lacZ. Las bacterias que contienen pUC18 producen colonias<br />
<strong>de</strong> color azul si crecen en un medio que contenga X-gal. El DNA insertado en el sitio <strong>de</strong><br />
clonación múltiple interrumpe el gen lacZ, resultando en colonias blancas, lo que permite la<br />
i<strong>de</strong>ntificación directa <strong>de</strong> las colonias que tienen insertos <strong>de</strong> DNA clonados.
6<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Los bacteriófagos lambda y M13<br />
Lambda es un bacteriófago muy utilizado en experimentos <strong>de</strong> DNA<br />
recombinante. Se han i<strong>de</strong>ntificado y cartografiado todos los genes <strong>de</strong> lambda, y se<br />
conoce toda la secuencia nucleotídica <strong>de</strong> su genoma. El tercio central <strong>de</strong> su<br />
cromosoma es prescindible, y pue<strong>de</strong> reemplazarse por DNA exógeno sin afectar la<br />
capacidad <strong>de</strong>l fago para infectar células y formar calvas. Se han <strong>de</strong>sarrollado más <strong>de</strong><br />
100 vectores basados en el fago lambda, eliminado diversas porciones <strong>de</strong>l grupo<br />
génico central. Para clonar utilizando el vector lambda, se corta el DNA <strong>de</strong>l fago con<br />
una enzima <strong>de</strong> restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un<br />
brazo <strong>de</strong>recho y una región central. Se aislan los brazos y se ligan (utilizando la DNA<br />
ligasa) a un segmento <strong>de</strong> DNA obtenido tras cortar DNA genómico con la misma<br />
enzima <strong>de</strong> restricción (en este ejemplo EcoRI).<br />
Las moléculas recombinantes resultantes pue<strong>de</strong>n introducirse en células<br />
huésped bacterianas <strong>de</strong> dos maneras: Por transformación. Una vez en las células<br />
huésped, se replican generando fagos infectivos, llevando cada uno <strong>de</strong> ellos el inserto<br />
<strong>de</strong> DNA. Por infección , se mezcla el DNA <strong>de</strong> lambda que contiene el inserto con los<br />
componentes proteicos <strong>de</strong>l fago (cabezas y colas); <strong>de</strong> esta mezcla se forman partículas<br />
fágicas infectivas (empaquetamiento “in vitro”). Los fagos pue<strong>de</strong>n amplificarse<br />
haciéndose crecer en placas sembradas con bacterias, don<strong>de</strong> se formarán calvas, o<br />
bien infectando células en un medio líquido y recogiendo las células lisadas.<br />
Figura. Pasos en la<br />
clonación utilizando el fago<br />
lambda como vector. Se<br />
extrae el DNA <strong>de</strong> una<br />
preparación <strong>de</strong> fago lambda<br />
y se elimina el grupo central<br />
<strong>de</strong> genes por tratamiento<br />
con una enzima <strong>de</strong><br />
restricción. El DNA a clonar<br />
se corta con la misma<br />
enzima y se liga entre los<br />
brazos <strong>de</strong>l cromosoma <strong>de</strong><br />
lambda. Luego se<br />
empaqueta el cromosoma<br />
recombinante <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las<br />
proteínas <strong>de</strong>l fago para<br />
formar un virus<br />
recombinante. Este virus<br />
pue<strong>de</strong> infectar células<br />
bacterianas y replicar su<br />
cromosoma, incluido el<br />
inserto <strong>de</strong> DNA.
Los cósmidos y los vectores transbordadores<br />
7<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Los cósmidos son vectores híbridos construidos utilizando partes <strong>de</strong>l cromosoma<br />
<strong>de</strong>l fago lambda y <strong>de</strong> DNA plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia cos <strong>de</strong>l<br />
fago lambda, necesaria para el empaquetamiento <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong>l fago <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> su<br />
cubierta proteica, y secuencias plasmídicas <strong>de</strong> replicación (ori) y <strong>de</strong> genes <strong>de</strong><br />
resistencia a antibióticos, que permiten i<strong>de</strong>ntificar las células huésped que los<br />
contienen. El DNA <strong>de</strong> los cósmidos que contienen insertos <strong>de</strong> DNA se empaqueta en la<br />
cápsi<strong>de</strong> proteica <strong>de</strong> lambda para formar partículas fágicas infectivas.<br />
Una vez que el cósmido entra en la célula huésped se replica como un<br />
plásmido. Puesto que la mayoría <strong>de</strong>l genoma lambda se ha <strong>de</strong>lecionado, los cósmidos<br />
pue<strong>de</strong>n transportar insertos <strong>de</strong> DNA mucho más gran<strong>de</strong>s que los que lambda pue<strong>de</strong><br />
llevar. Los cósmidos pue<strong>de</strong>n transportar casi 50kb <strong>de</strong> DNA insertado; los vectores<br />
fágicos pue<strong>de</strong>n acomodar insertos <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> unas 15 kb, y los plásmidos<br />
generalmente están limitados a insertos <strong>de</strong> 5- 10 kb.<br />
Existen otros vectores híbridos, construidos con orígenes <strong>de</strong> replicación<br />
provenientes <strong>de</strong> distintas fuentes (por ejemplo, plásmidos y virus animales como<br />
SV40), que pue<strong>de</strong>n replicarse en más <strong>de</strong> un tipo <strong>de</strong> célula huésped. Generalmente,<br />
estos vectores transbordadores contienen marcadores genéticos que permiten su<br />
selección en los dos sistemas huésped, y pue<strong>de</strong>n utilizarse para transportar insertos <strong>de</strong><br />
DNA entre E. coli y otras células huésped como levadura y viceversa.<br />
A menudo, estos vectores se emplean para investigar la expresión génica.
Figura. El cósmido pJB8 contiene un origen <strong>de</strong><br />
replicación bacteriano (ori), un solo sitio cos<br />
(cos), un gen <strong>de</strong> resistencia a ampicilina (amp)<br />
para seleccionar las colonias que han<br />
incorporado el cósmido, y una región que<br />
contiene cuatro sitios <strong>de</strong> restricción para la<br />
clonación (BamHI, EcoRI, Clal y Hind III). Las<br />
cubiertas víricas que contienen un cósmido<br />
pue<strong>de</strong>n utilizarse para infectar células huésped<br />
a<strong>de</strong>cuadas, y el vector que transporta el inserto<br />
<strong>de</strong> DNA se transferirá a la célula huésped por<br />
infección. Una vez <strong>de</strong>ntro, la secuencia ori<br />
permite que el cósmido se replique como un<br />
plásmido bacteriano.<br />
8<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Para cartografiar y analizar genomas eucarióticos complejos, se <strong>de</strong>sarrolló un<br />
vector multiuso llamado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F <strong>de</strong><br />
bacterias. Éste es un plásmido que se replica in<strong>de</strong>pendientemente y está implicado en<br />
la transferencia <strong>de</strong> información genética en la conjugación bacteriana. Como los<br />
factores F pue<strong>de</strong>n transportar fragmentos <strong>de</strong>l cromosoma bacteriano <strong>de</strong> hasta 1 Mb, se<br />
diseñaron para que funcionen como vectores <strong>de</strong> DNA eucariótico. Los vectores BAC<br />
tienen los genes <strong>de</strong> replicación y <strong>de</strong> número <strong>de</strong> copia <strong>de</strong>l factor F, e incorporan un<br />
marcador <strong>de</strong> resistencia a un antibiótico y sitios <strong>de</strong> restricción para insertar el DNA<br />
exógeno a clonar. A<strong>de</strong>más, el sitio <strong>de</strong> clonación está flanqueado por regiones<br />
promotoras que pue<strong>de</strong>n utilizarse para generar moléculas <strong>de</strong> RNA y expresar así el gen<br />
clonado, o para utilizarlas como sonda para paseo cromosómico, y para secuenciar el<br />
DNA <strong>de</strong>l inserto clonado.
9<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Figura. Resumen <strong>de</strong> los pasos seguidos en la clonación <strong>de</strong> un vector plasmídico. Los vectores plasmídicos se aíslan y<br />
se cortan con una enzima <strong>de</strong> restricción. El DNA a clonar se corta con la misma enzima <strong>de</strong> restricción, produciendo<br />
una colección <strong>de</strong> fragmentos. Estos fragmentos se reparten entre los vectores y se transfieren a huéspe<strong>de</strong>s<br />
bacterianos para su replicación. Las células bacterianas que contienen plásmidos pue<strong>de</strong>n i<strong>de</strong>ntificarse por crecimiento<br />
en un medio selectivo, y pue<strong>de</strong>n aislarse. El DNA clonado pue<strong>de</strong> recuperarse <strong>de</strong>l huésped bacteriano para nuevos<br />
análisis.
10<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Clonación <strong>de</strong> DNA en E. coli<br />
Para replicar el DNA clonado se pue<strong>de</strong>n utilizar distintos tipos <strong>de</strong> células<br />
huésped. Uno <strong>de</strong> los huéspe<strong>de</strong>s más utilizados es la cepa <strong>de</strong> laboratorio K12 <strong>de</strong> E. coli.<br />
Ésta y otras cepas <strong>de</strong> E. coli se utilizan como huéspe<strong>de</strong>s ya que están bien<br />
caracterizadas genéticamente y pue<strong>de</strong>n aceptar un amplio espectro <strong>de</strong> vectores,<br />
incluyendo los plásmidos, los fagos y los cósmidos.<br />
Para crear moléculas <strong>de</strong> DNA recombinante se precisan varios pasos. Si se utiliza<br />
un plásmido como vector, el procedimiento es el siguiente:<br />
1. El DNA que se va a clonar se aísla y se trata con una enzima <strong>de</strong> restricción para<br />
crear fragmentos que acaben en secuencias específicas.<br />
2. Estos fragmentos se ligan a moléculas <strong>de</strong> plásmido que han sido cortadas con la<br />
misma enzima <strong>de</strong> restricción, obteniéndose un vector recombinante.<br />
3. El vector recombinante se transfiere a células huésped bacterianas,<br />
generalmente por transformación, un proceso en el que las moléculas <strong>de</strong> DNA<br />
atraviesan la membrana <strong>de</strong> la célula huésped transfiriéndose a su interior.<br />
4. La célula huésped se hace crecer en una placa <strong>de</strong> cultivo, don<strong>de</strong> formará<br />
colonias. Puesto que las células <strong>de</strong> cada una <strong>de</strong> las colonias provienen <strong>de</strong> una<br />
sola célula inicial, todas las células <strong>de</strong> la colonia, y los plásmidos que contienen,<br />
son genéticamente idénticas, o clones. Se rastrean las colonias para i<strong>de</strong>ntificar<br />
las que han incorporado el plásmido recombinante.<br />
Se utilizan varios métodos para seleccionar las colonias que contienen<br />
plásmidos con el inserto <strong>de</strong> DNA. Este proceso se <strong>de</strong>nomina rastreo (o cribado). Para<br />
vectores como pBR322, el rastreo es un proceso que consiste en dos etapas. Por<br />
ejemplo, si el DNA que se <strong>de</strong>sea clonar se inserta <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l gen <strong>de</strong> resistencia a<br />
tetraciclina, este gen se inactivará. Después <strong>de</strong> transformar células huéspe<strong>de</strong>s con el<br />
plásmido recombinante, éstas se hacen crecer en placas <strong>de</strong> cultivo que contienen el<br />
antibiótico ampicilina. Todas las células que hayan incorporado un plásmido (con o sin<br />
inserto) crecerán y formarán colonias, mientras que las células que no lo hayan<br />
incorporado morirán ya que son sensibles a la ampicilina.<br />
En el segundo paso, se i<strong>de</strong>ntifican las colonias que contiene plásmidos con el<br />
inserto <strong>de</strong> DNA. En este paso, se transfieren las colonias <strong>de</strong> la placa que
11<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
contiene ampicilina a una placa que contiene tetraciclina, <strong>de</strong>bido a que el inserto ha<br />
inactivado el gen <strong>de</strong> resistencia a tetraciclina. Entonces, el patrón <strong>de</strong> colonias <strong>de</strong> la<br />
placa con tetraciclina se compara con el <strong>de</strong> la placa con ampicilina, y se i<strong>de</strong>ntifica las<br />
colonias <strong>de</strong> la placa con ampicilina que no han crecido en la placa con tetraciclina. Las<br />
células <strong>de</strong> estas colonias contienen vectores con el inserto <strong>de</strong> DNA, y se transfieren a<br />
un medio <strong>de</strong> crecimiento para nuevos análisis.<br />
Figura. Selección <strong>de</strong> colonias que contienen un vector plasmídico que tiene dos genes <strong>de</strong><br />
resistencia a antibióticos, uno para tetraciclina y otro para ampicilina. En este experimento,<br />
la presencia <strong>de</strong>l inserto <strong>de</strong> DNA en el plásmido inactivará el gen <strong>de</strong> resistencia <strong>de</strong><br />
tetraciclina.<br />
Otros vectores, como pUC18, tienen construcciones que producen colonias<br />
azules cuando están en células bacterianas sembradas en un medio que contiene una<br />
sustancia <strong>de</strong>nominada X-gal. Los sitios <strong>de</strong> restricción <strong>de</strong>l sitio <strong>de</strong> clonación múltiple <strong>de</strong><br />
pUC18 están <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l gen lac, el gen responsable <strong>de</strong> la capacidad <strong>de</strong> formar colonias<br />
azules, y la inserción <strong>de</strong> DNA en el sitio <strong>de</strong> clonación múltiple interrumpe esta<br />
capacidad. Como se ha expuesto anteriormente, los plásmidos que contienen los<br />
segmentos <strong>de</strong> DNA insertados producen colonias blancas, mientras que los que no<br />
tienen insertos producen colonias azules.<br />
De igual modo, los fagos que contengan DNA exógeno también pue<strong>de</strong>n<br />
utilizarse para infectar células huésped <strong>de</strong> E. coli, y cuando se siembran en un medio<br />
sólido, cada una <strong>de</strong> las calvas resultantes representa los <strong>de</strong>scendientes clonados <strong>de</strong>
12<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
un solo fago inicial. Los cósmidos infectan a las células bacterianas como los fagos,<br />
pero luego se replican como los plásmidos <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la célula huésped. Las células que<br />
contiene cósmidos con DNA clonado pue<strong>de</strong>n i<strong>de</strong>ntificarse y recuperarse <strong>de</strong> la misma<br />
manera que los plásmidos.<br />
Clonación en huéspe<strong>de</strong>s eucarióticos<br />
Hemos <strong>de</strong>scripto la utilización <strong>de</strong> E. coli como huésped para la clonación.<br />
También pue<strong>de</strong>n utilizarse otras especies <strong>de</strong> bacterias como huéspe<strong>de</strong>s, como B.<br />
subtilis y Streptomyces. Estos sistemas huésped bacterianos y sus vectores son<br />
parecidos a los <strong>de</strong>scriptos para E. coli. Sin embargo, para estudiar la expresión y<br />
regulación <strong>de</strong> los genes eucarióticos, a menudo es conveniente e incluso necesario<br />
utilizar huéspe<strong>de</strong>s eucarióticos. En esta sección <strong>de</strong>scribiremos sistemas <strong>de</strong> clonación<br />
que utilizan células eucarióticas como huéspe<strong>de</strong>s.<br />
Vectores <strong>de</strong> levadura<br />
Aunque la levadura es un organismo eucariótico, pue<strong>de</strong> manipularse y crecer <strong>de</strong><br />
manera parecida a las células bacterianas. A<strong>de</strong>más, la genética <strong>de</strong> las levaduras se ha<br />
investigado exhaustivamente, lo que ha proporcionado un gran catálogo <strong>de</strong> mutaciones<br />
y unos mapas genéticos altamente <strong>de</strong>tallados <strong>de</strong> sus cromosomas. En levadura hay un<br />
plásmido <strong>de</strong> origen natural, <strong>de</strong>nominado plásmido 2 micras (o plásmido 2 µ), que se<br />
ha utilizado para construir varios vectores <strong>de</strong> clonación para levadura. Combinando<br />
secuencias <strong>de</strong> plásmidos bacterianos con plásmidos 2 micras, se pue<strong>de</strong>n producir<br />
vectores con muchas propieda<strong>de</strong>s útiles.<br />
Construcción <strong>de</strong> bibliotecas <strong>de</strong> DNA<br />
Puesto que cada segmento <strong>de</strong> DNA clonado es relativamente pequeño, <strong>de</strong>ben<br />
construirse muchos clones diferentes para incluir todas las pequeñas porciones <strong>de</strong>l<br />
genoma <strong>de</strong> un organismo. El conjunto clonado <strong>de</strong> todas las secuencias genómicas <strong>de</strong><br />
un solo individuo se <strong>de</strong>nomina biblioteca. Las bibliotecas clonadas pue<strong>de</strong>n provenir <strong>de</strong>l<br />
genoma completo <strong>de</strong> un individuo, <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> un solo cromosoma, o <strong>de</strong>l conjunto <strong>de</strong><br />
genes transcripcionalmente activos en un único tipo celular.
13<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Bibliotecas genómicas<br />
Las bibliotecas genómicas (o genotecas) suelen construirse utilizando vectores<br />
fágicos, que pue<strong>de</strong>n contener gran<strong>de</strong>s fragmentos cromosómicos. Para preparar una<br />
biblioteca en el fago lambda, se corta el DNA <strong>de</strong> lambda con una enzima <strong>de</strong> restricción<br />
para eliminar el grupo génico central. El DNA genómico que se <strong>de</strong>sea clonar se corta<br />
con la misma enzima, y se purifican los fragmentos cortados <strong>de</strong> tamaño óptimo para el<br />
empaquetamiento (<strong>de</strong> 15 a 17kb) mediante electroforesis en gel o por centrifugación.<br />
Estos fragmentos <strong>de</strong> DNA se ligan con los brazos <strong>de</strong>l cromosoma <strong>de</strong> lambda para<br />
formar la biblioteca.<br />
En una biblioteca genómica están representados todos los genes <strong>de</strong> un<br />
organismo. La biblioteca es un medio para recuperar cualquier gen <strong>de</strong>l genoma <strong>de</strong>l<br />
organismo, pudiéndose estudiar con <strong>de</strong>talle junto con sus secuencias reguladoras<br />
adyacentes. Teóricamente, una biblioteca genómica contiene al menos una copia <strong>de</strong><br />
todas las secuencias representadas en el genoma. Sin embargo, cada molécula <strong>de</strong><br />
vector pue<strong>de</strong> contener sólo relativamente pocas kilobases <strong>de</strong> DNA insertado, por lo que<br />
una <strong>de</strong> las primeras tareas al preparar una biblioteca genómica es seleccionar el vector<br />
más a<strong>de</strong>cuado para contener el genoma completo en el menor número posible <strong>de</strong><br />
clones. El número <strong>de</strong> clones necesarios para contener todas las secuencias <strong>de</strong> un<br />
genoma <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong>l tamaño medio <strong>de</strong> los insertos clonados y <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong>l genoma<br />
a clonar. Este número pue<strong>de</strong> calcularse con la siguiente fórmula:<br />
N= ln (1-P)<br />
ln (1- ƒ)<br />
Don<strong>de</strong> N es el número <strong>de</strong> clones necesarios, P es la probabilidad <strong>de</strong> recuperar<br />
una secuencia <strong>de</strong>terminada, y ƒ representa la fracción <strong>de</strong>l genoma presente en cada<br />
clon.<br />
Si <strong>de</strong>seamos preparar una biblioteca <strong>de</strong>l genoma humano utilizando como<br />
vector el fago lambda. El genoma humano tiene 3,0 x 10 6 kb; si el tamaño medio <strong>de</strong> los<br />
insertos clonados en el vector es 17 kb, y queremos tener una probabilidad <strong>de</strong>l 99 %<br />
(P=0,99) <strong>de</strong> que cualquier gen humano esté representado al menos en una copia,<br />
precisaremos una biblioteca <strong>de</strong> unos 8,1x 10 5 fagos (don<strong>de</strong> f= 1,7 x10 4 /3,0 x 10 9 ). Si<br />
hubiésemos seleccionado a pBR322 como vector, con una tamaño medio <strong>de</strong> insertos<br />
<strong>de</strong> 5 kb, la biblioteca necesitaría contener varios millones <strong>de</strong> clones.
14<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Bibliotecas <strong>de</strong> cDNA<br />
Se pue<strong>de</strong> construir una biblioteca que represente los genes que se están<br />
transcribiendo en una célula eucariótica en un momento dado, utilizando el mRNA<br />
aislado <strong>de</strong> esa célula. Casi todas las moléculas <strong>de</strong> mRNA eucariótico tiene una cola <strong>de</strong><br />
poli-A en su extremo 3’. Primero, se hibrida la población <strong>de</strong> moléculas <strong>de</strong> mRNA que<br />
tienen colas <strong>de</strong> poli-A 3’ con oligo-dT (DNA corto <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na sencilla formado sólo por<br />
<strong>de</strong>xositimidina). La secuencia <strong>de</strong> oligo-dT híbrida con la cola <strong>de</strong> poli –A, y sirve <strong>de</strong><br />
cebador para la síntesis <strong>de</strong> una ca<strong>de</strong>na complementaria <strong>de</strong> DNA utilizando la enzima<br />
retrotranscriptasa (transcriptasa inversa). Esta enzima es una DNA polimerasa<br />
<strong>de</strong>pendiente <strong>de</strong> RNA que copia un mol<strong>de</strong> <strong>de</strong> RNA <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na sencilla en un DNA <strong>de</strong><br />
ca<strong>de</strong>na sencilla. El resultado es un dúplex RNA-DNA <strong>de</strong> doble ca<strong>de</strong>na. La ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong><br />
RNA se elimina y la ca<strong>de</strong>na sencilla <strong>de</strong> DNA se utiliza como mol<strong>de</strong> para sintetizar la<br />
ca<strong>de</strong>na complementaria <strong>de</strong> DNA, utilizando la DNA polimerasa I. El extremo 3’ <strong>de</strong> la<br />
ca<strong>de</strong>na sencilla <strong>de</strong> DNA se dobla sobre sí mismo formando una horquilla (un lazo), por<br />
lo que pue<strong>de</strong> servir <strong>de</strong> cebador para sintetizar la segunda ca<strong>de</strong>na. El resultado es un<br />
DNA dúplex con las ca<strong>de</strong>nas unidas por un extremo. La horquilla pue<strong>de</strong> abrirse,<br />
obteniéndose una molécula <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> doble ca<strong>de</strong>na (<strong>de</strong>nominada DNA<br />
complementario o cDNA), cuya secuencia nucleotídica <strong>de</strong>riva <strong>de</strong> una molécula <strong>de</strong><br />
RNA.<br />
14
15<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Si se aña<strong>de</strong> un trozo corto <strong>de</strong> DNA con sitios <strong>de</strong> restricción en cada uno <strong>de</strong> sus<br />
extremos, el cDNA pue<strong>de</strong> clonarse. Este sitio <strong>de</strong> clonación pue<strong>de</strong> cortarse con la<br />
enzima <strong>de</strong> restricción a<strong>de</strong>cuada, produciendo extremos pegajosos, lo que permite que<br />
el cDNA se inserte en el sitio <strong>de</strong> restricción <strong>de</strong> un vector plasmídico o fágico.<br />
Una biblioteca <strong>de</strong> cDNA es diferente <strong>de</strong> una biblioteca genómica ya que<br />
representa sólo un subconjunto <strong>de</strong> todos los genes <strong>de</strong>l genoma. Otra diferencia es que<br />
las bibliotecas <strong>de</strong> cDNA no contienen las secuencias promotoras adyacentes al gen, ni<br />
tampoco contienen las secuencias intercaladas o intrones, ya que éstos han sido<br />
eliminados <strong>de</strong>l pre-mRNA durante la reacción <strong>de</strong> corte y empalme y no se encuentran<br />
en el mRNA maduro.<br />
Las bibliotecas <strong>de</strong> cDNA utilizan mRNA como punto <strong>de</strong> partida, <strong>de</strong> manera que<br />
sólo representan a las secuencias que se están expresando en un tipo celular, en un<br />
tejido, o en un estadio concreto <strong>de</strong>l <strong>de</strong>sarrollo embrionario. La <strong>de</strong>cisión <strong>de</strong> construir una<br />
biblioteca genómica o <strong>de</strong> cDNA <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong>l problema planteado. Si se está interesado<br />
en un gen particular, podría ser más fácil preparar una biblioteca <strong>de</strong> cDNA <strong>de</strong>l tejido en<br />
el que se expresa dicho gen. Por ejemplo, los glóbulos rojos producen gran<strong>de</strong>s<br />
cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> hemoglobina, y la mayoría <strong>de</strong>l mRNA <strong>de</strong> estas células es mRNA <strong>de</strong> la<br />
β-globina. Una biblioteca <strong>de</strong> cDNA preparada utilizando mRNA aislado <strong>de</strong> glóbulos<br />
rojos permite aislar con facilidad un gen <strong>de</strong> la globina. Si se interesaran las secuencias<br />
reguladoras adyacentes al gen <strong>de</strong> la globina, se necesitaría construir una biblioteca<br />
genómica, ya que estas secuencias reguladoras no se encuentran en el mRNA <strong>de</strong> la<br />
globina, y por lo tanto no estarían representadas en la biblioteca <strong>de</strong> cDNA.<br />
I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> secuencias clonadas específicas<br />
Una biblioteca genómica pue<strong>de</strong> contener varios cientos <strong>de</strong> miles <strong>de</strong> clones. El<br />
problema ahora es i<strong>de</strong>ntificar y seleccionar sólo el clon o clones que contienen el gen<br />
que nos interesa, y <strong>de</strong>terminar si un clon contiene todo el gen o sólo una parte <strong>de</strong> él.<br />
Hay varias maneras <strong>de</strong> hacerlo, y la elección <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> las circunstancias y <strong>de</strong> la<br />
información disponible. Los métodos que se <strong>de</strong>scriben a continuación utilizan diversos<br />
enfoques para encontrar una secuencia específica <strong>de</strong> DNA en una biblioteca.
16<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Sondas para rastrear clones específicos<br />
Muchos <strong>de</strong> los protocolos utilizan una sonda para rastrear la biblioteca e<br />
i<strong>de</strong>ntificar el clon que contiene el gen <strong>de</strong> interés. A menudo, las sondas son<br />
polinucleótidos radioactivos que contienen una secuencia <strong>de</strong> bases complementaria a<br />
todo o parte <strong>de</strong>l gen <strong>de</strong> interés. Otros métodos utilizan sondas que <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>n <strong>de</strong><br />
reacciones químicas o colorimétricas para indicar la localización <strong>de</strong> un clon específico.<br />
Las sondas pue<strong>de</strong>n provenir <strong>de</strong> distintas fuentes; genes relacionados aislados <strong>de</strong> otras<br />
especies pue<strong>de</strong>n servir <strong>de</strong> sonda si la secuencia se ha conservado suficientemente.<br />
Por ejemplo, se aislaron copias extracromosómicas <strong>de</strong> genes ribosómicos <strong>de</strong> la rana<br />
Xenopus laevis por centrifugación, se cortaron con enzimas <strong>de</strong> restricción, y se<br />
clonaron en vectores plasmídicos. Como las secuencias <strong>de</strong> los genes ribosómicos se<br />
han conservado enormemente durante la evolución <strong>de</strong> los eucariotas, estos genes<br />
clonados <strong>de</strong> Xenopus se marcaron con radioisótopos y se utilizaron como sonda para<br />
aislar los genes ribosómicos humanos <strong>de</strong> una biblioteca genómica.<br />
Si el gen que se quiere seleccionar <strong>de</strong> la biblioteca es transcripcionalmente<br />
activo en <strong>de</strong>terminados tipos celulares, se pue<strong>de</strong> utilizar una sonda <strong>de</strong> cDNA para<br />
encontrarlo. Esta técnica es especialmente útil cuando pue<strong>de</strong> obtenerse el mRNA<br />
purificado o enriquecido. Se sabe que el mRNA <strong>de</strong> la $-globina es el RNA mensajero<br />
predominante en <strong>de</strong>terminados estadios <strong>de</strong>l <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> los glóbulos rojos. Para hacer<br />
una sonda, se aísla el mRNA <strong>de</strong> estas células, se purifica, y se copia con la<br />
retrotranscriptasa en una molécula <strong>de</strong> cDNA. Este cDNA pue<strong>de</strong> utilizarse como sonda<br />
para recuperar el gen <strong>de</strong> la $-globina <strong>de</strong> una biblioteca genómica, incluyendo los<br />
intrones y las regiones <strong>de</strong> control adyacentes.<br />
Métodos <strong>de</strong> análisis <strong>de</strong> las secuencias clonadas<br />
La i<strong>de</strong>ntificación y recuperación <strong>de</strong> secuencias <strong>de</strong> DNA clonadas especificas es<br />
una herramienta po<strong>de</strong>rosa para analizar la estructura y la función <strong>de</strong> los genes. Las<br />
técnicas que se <strong>de</strong>scriben a continuación se utilizan para respon<strong>de</strong>r a preguntas<br />
experimentales <strong>de</strong> la organización y <strong>de</strong> la expresión <strong>de</strong> las secuencias clonadas.
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Cartografía <strong>de</strong> restricción<br />
Un mapa <strong>de</strong> restricción es la recopilación <strong>de</strong>l número, <strong>de</strong>l or<strong>de</strong>n y <strong>de</strong> la<br />
distancia entre los sitios <strong>de</strong> corte <strong>de</strong> enzimas <strong>de</strong> restricción en un segmento clonado <strong>de</strong><br />
DNA. Las unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> mapa se expresan en pares <strong>de</strong> bases (pb) o, para largas<br />
distancias, en pares <strong>de</strong> kilobases (kb). Los mapas <strong>de</strong> restricción proporcionan<br />
información que pue<strong>de</strong> utilizarse para subclonar fragmentos <strong>de</strong> un gen, o bien para<br />
comparar la organización <strong>de</strong> un gen y <strong>de</strong> su cDNA con el fin <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar los exones y<br />
los intrones en la copia genómica <strong>de</strong>l gen.<br />
Los fragmentos generados tras cortar el DNA con enzimas <strong>de</strong> restricción pue<strong>de</strong>n<br />
separarse mediante electroforesis en gel, método que separa los fragmentos por su<br />
tamaño, y en el que los fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente. Los<br />
fragmentos aparecen como una serie <strong>de</strong> bandas que pue<strong>de</strong>n visualizarse tiñendo el<br />
DNA con bromuro <strong>de</strong> etidio e iluminándolo con luz ultravioleta (siguiente figura). El<br />
tamaño <strong>de</strong> los fragmentos individuales pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminarse corriendo un conjunto <strong>de</strong><br />
fragmentos marcadores <strong>de</strong> tamaño conocido en otro carril <strong>de</strong>l mismo gel.<br />
Figura. Gel <strong>de</strong> agarosa que contiene fragmentos separados <strong>de</strong> DNA, teñidos con un colorante<br />
(bromuro <strong>de</strong> etidio) y visualizados mediante iluminación ultravioleta.<br />
La siguiente figura muestra los pasos que <strong>de</strong>ben seguirse para construir el<br />
mapa <strong>de</strong> restricción <strong>de</strong> un segmento <strong>de</strong> DNA clonado que contiene sitios <strong>de</strong> corte para<br />
dos enzimas <strong>de</strong> restricción. Para construir el mapa, empecemos con una segmento <strong>de</strong><br />
DNA clonado <strong>de</strong> 7 kb <strong>de</strong> longitud. Tres muestras <strong>de</strong>l DNA clonado se digieren con<br />
enzimas <strong>de</strong> restricción: una con HindIII; otra con SalI; y la última con las dos<br />
17
18<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
enzimas nombradas. Los fragmentos generados por la digestión con las enzimas <strong>de</strong><br />
restricción se separan por electroforesis. El tamaño <strong>de</strong> estos fragmentos se estima por<br />
comparación con un conjunto <strong>de</strong> patrones <strong>de</strong> tamaño separados electroforéticamente<br />
en carriles adyacentes <strong>de</strong>l mismo gel. Para construir el mapa, se analizan los<br />
fragmentos generados con las enzimas <strong>de</strong> restricción.<br />
1. Cuando el DNA se corta con HindIII, se producen dos fragmentos, uno <strong>de</strong> 0,8 kb<br />
y otro <strong>de</strong> 6,2 kb, indicando que sólo hay un sitio <strong>de</strong> restricción para esta enzima (y que<br />
está localizado a 0,8 kb <strong>de</strong> uno <strong>de</strong> los extremos).<br />
2. Cuando el DNA se corta con SalI, se producen dos fragmentos, uno <strong>de</strong> 1,2 kb y<br />
otro <strong>de</strong> 5,8 kb, lo que significa que hay un único sitio <strong>de</strong> restricción localizado a 1,2 kb<br />
<strong>de</strong> uno <strong>de</strong> los extremos.<br />
En conjunto, estos resultados muestran que hay un sitio <strong>de</strong> restricción para cada<br />
enzima, pero se <strong>de</strong>sconoce la relación existente entre estos dos sitios. Con esta<br />
información, hay dos mapas posibles. En un mo<strong>de</strong>lo, el sitio HindIII está a 0,8 kb <strong>de</strong><br />
uno <strong>de</strong> los extremos (mo<strong>de</strong>lo I), y el sitio SalI está a 1,2 kb <strong>de</strong>l mismo extremo. En el<br />
mo<strong>de</strong>lo alternativo (mo<strong>de</strong>lo 2), el sitio HindIII está localizado a 0,8 kb <strong>de</strong> un extremo, y<br />
el sitio SalI está localizado a 1,2 kb <strong>de</strong>l otro extremo.<br />
El mo<strong>de</strong>lo correcto pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminarse si se consi<strong>de</strong>ran los resultados <strong>de</strong> la<br />
digestión <strong>de</strong> ambas enzimas, HindIII y SalI. El mo<strong>de</strong>lo 1 predice que la digestión con<br />
ambas enzimas generará tres fragmentos <strong>de</strong> 0,4, 0,8 y 6,2 kb; ambas enzimas<br />
generarán tres fragmentos <strong>de</strong> 0,8, 1,2 y 5 kb. El patrón real <strong>de</strong> fragmentos observado<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la digestión con ambas enzimas indica que el mo<strong>de</strong>lo correcto es el mo<strong>de</strong>lo<br />
1 <strong>de</strong> la Figura.<br />
En la mayoría <strong>de</strong> los casos, la cartografía <strong>de</strong> restricción es más compleja e<br />
implica un mayor número <strong>de</strong> enzimas y un mayor número <strong>de</strong> sitios para cada enzima.<br />
Los mapas <strong>de</strong> restricción proporcionan una manera importante <strong>de</strong> caracterizar un<br />
segmento <strong>de</strong> DNA, y pue<strong>de</strong>n construirse sin tener ninguna información <strong>de</strong> la capacidad<br />
codificadora ni <strong>de</strong> la función <strong>de</strong>l DNA cartografiado. Junto con otras técnicas, el<br />
cartografiado <strong>de</strong> restricción pue<strong>de</strong> utilizarse para <strong>de</strong>finir los extremos <strong>de</strong> un gen, y<br />
proporciona una manera <strong>de</strong> diseccionar la organización molecular <strong>de</strong> un gen y <strong>de</strong> sus<br />
regiones flanqueantes. El cartografiado también pue<strong>de</strong> servir <strong>de</strong> punto <strong>de</strong> partida para<br />
analizar un gen intacto <strong>de</strong> segmentos clonados <strong>de</strong> DNA, y proporciona una
19<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
manera <strong>de</strong> localizar sitios <strong>de</strong> mutación en los genes.<br />
Los mapas <strong>de</strong> restricción también pue<strong>de</strong>n utilizarse para refinar los mapas<br />
génicos. En la mayoría <strong>de</strong> los casos, la exactitud <strong>de</strong> los mapas construidos por análisis<br />
genéticos se basa tanto en la frecuencia <strong>de</strong> recombinación entre marcadores genéticos<br />
como en el número <strong>de</strong> marcadores genéticos utilizados en la construcción <strong>de</strong>l mapa. Si<br />
hay una gran distancia entre los marcadores y/o variación en la frecuencia <strong>de</strong><br />
recombinación, el mapa genético pue<strong>de</strong> no correspon<strong>de</strong>r al mapa físico <strong>de</strong> esa región<br />
cromosómica. Por ejemplo, el genoma humano es gran<strong>de</strong> (3,2 x 10 9 pb), y el número<br />
<strong>de</strong> genes cartografiados es pequeño (unos pocos millares), lo que significa que cada<br />
unidad <strong>de</strong>l mapa está compuesta por millones <strong>de</strong> pares <strong>de</strong> bases <strong>de</strong> DNA. El resultado<br />
es una correlación baja entre los mapas genético y físico <strong>de</strong> los cromosomas. Los sitios<br />
<strong>de</strong> corte <strong>de</strong> las enzimas <strong>de</strong> restricción pue<strong>de</strong>n utilizarse como marcadores genéticos,<br />
reduciendo así la distancia entre los distintos sitos <strong>de</strong>l mapa, incrementando la fi<strong>de</strong>lidad<br />
<strong>de</strong> los mapas, y proporcionando puntos <strong>de</strong> referencia para la correlación <strong>de</strong> los mapas<br />
genético y físico.<br />
Los sitos <strong>de</strong> restricción han <strong>de</strong>sempeñado una función importante en la<br />
cartografía <strong>de</strong> genes en cromosomas humanos específicos y en regiones <strong>de</strong>finidas <strong>de</strong><br />
cromosomas concretos. A<strong>de</strong>más, si un sitio <strong>de</strong> restricción está cerca <strong>de</strong> un gen<br />
mutante, pue<strong>de</strong> utilizarse como marcador <strong>de</strong> diagnóstico. Estos sitios son conocidos<br />
como polimorfismos <strong>de</strong> longitud <strong>de</strong> fragmentos <strong>de</strong> restricción o RFLP. Su utilización ha<br />
<strong>de</strong>mostrado ser especialmente útil, ya que los genes mutantes que provocan muchas<br />
enfermeda<strong>de</strong>s genéticas humanas están muy poco caracterizados a nivel molecular, y<br />
los sitios <strong>de</strong> restricción cercanos se han utilizado con éxito en la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> los<br />
individuos afectados y <strong>de</strong> los heterocigotas con riesgo <strong>de</strong> tener hijos afectados.
Figura. Construcción <strong>de</strong> un mapa <strong>de</strong> restricción.<br />
20<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Transferencia <strong>de</strong> Southern y Northern<br />
Los insertos <strong>de</strong> DNA clonados en vectores pue<strong>de</strong>n utilizarse en experimentos<br />
<strong>de</strong> hibridación para caracterizar la i<strong>de</strong>ntidad <strong>de</strong> genes específicos, para localizar<br />
regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias clonadas y<br />
para investigar la organización molecular <strong>de</strong> las secuencias genómicas.<br />
Edward Southern <strong>de</strong>sarrolló la utilización <strong>de</strong> segmentos <strong>de</strong> DNA clonado,<br />
separados por electroforesis, transferidos a filtros, y rastreado con sondas.
21<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Conocido como transferencia <strong>de</strong> Southern (Southern blot), este<br />
procedimiento tiene muchas aplicaciones. En la transferencia <strong>de</strong> Southern, el DNA<br />
clonado se corta en fragmentos con una o más enzimas <strong>de</strong> restricción, y estos<br />
fragmentos se separan por electroforesis en gel (Figura 20). El DNA se <strong>de</strong>snaturaliza<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l gel en fragmentos <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na sencilla, y éstos se transfieren a un filtro <strong>de</strong> un<br />
material, normalmente nitrocelulosa o un <strong>de</strong>rivado <strong>de</strong> nylon, que une el DNA. La<br />
transferencia se hace colocando la hoja <strong>de</strong> la membrana encima <strong>de</strong>l gel, y provocando<br />
que el tampón pase por el gel y por la hoja <strong>de</strong> nitrocelulosa o <strong>de</strong> nailon por capilaridad.<br />
El tampón pasa por el gel y por la membrana, arrastrando al DNA fuera <strong>de</strong>l gel e<br />
inmovilizándolo en la membrana.<br />
En la práctica, esto se hace poniendo el gel con el DNA <strong>de</strong>snaturalizado sobre<br />
una gruesa esponja que actúa <strong>de</strong> mecha. La esponja está parcialmente sumergida en<br />
una cubeta con tampón. Se pone una membrana encima <strong>de</strong>l gel, y se cubre con hojas<br />
<strong>de</strong> papel secante o absorbente y un peso. La acción capilar arrastra el tampón <strong>de</strong> la<br />
cubeta a través <strong>de</strong> la esponja, <strong>de</strong>l gel, <strong>de</strong> la membrana, y <strong>de</strong>l montón <strong>de</strong> papel secante.<br />
Al pasar el tampón por el gel, los fragmentos <strong>de</strong> DNA se transfieren a la membrana, a<br />
la que se unen. Después <strong>de</strong> la transferencia, el DNA <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na sencilla se fija a la<br />
membrana calentándola a 80 ºC o exponiéndola a la luz ultravioleta para que se hagan<br />
uniones entre los fragmentos y la membrana.<br />
Entonces, los fragmentos <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong>l filtro se hibridan con una sonda. Sólo<br />
formarán híbridos los fragmentos <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na sencilla presentes en la<br />
membrana que sean complementarios a la secuencia nucleotídica <strong>de</strong> la sonda. Se lava<br />
la sonda no unida, y se visualizan los fragmentos hibridados. Si se utiliza una sonda<br />
radioactiva, la posición <strong>de</strong> la sonda se <strong>de</strong>termina por autorradiografía, utilizando<br />
película fotográfica.<br />
A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> para caracterizar DNA clonado, la transferencia <strong>de</strong> Southern se<br />
utiliza para muchos otros fines, como la cartografía <strong>de</strong> sitios <strong>de</strong> restricción en un gen o<br />
cerca <strong>de</strong> él, la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> fragmentos <strong>de</strong> DNA que contienen un gen <strong>de</strong>terminado<br />
<strong>de</strong> entre una mezcla <strong>de</strong> muchos fragmentos, y la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> genes relacionados<br />
en diferentes especies. La transferencia <strong>de</strong> Southern también se utiliza para <strong>de</strong>tectar<br />
reorganizaciones y duplicaciones en genes asociados a enfermeda<strong>de</strong>s genéticas<br />
humanas y cánceres.
Figura. Transferencia <strong>de</strong> Southern.<br />
22<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Existe una técnica <strong>de</strong> transferencia relacionada que pue<strong>de</strong> utilizarse para<br />
<strong>de</strong>terminar si un gen clonado es transcripcionalmente activo en un tipo celular o en un<br />
tejido dado. Esta técnica <strong>de</strong>tecta la presencia <strong>de</strong> RNA que sea
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
complementario al segmento <strong>de</strong> DNA clonado. Esto se lleva a cabo extrayendo RNA <strong>de</strong><br />
uno o varios tipos celulares o tejidos. Se fracciona el RNA por electroforesis en gel, y el<br />
patrón <strong>de</strong> bandas se transfiere a una membrana que une el RNA como en la<br />
transferencia <strong>de</strong> Southern. El filtro se hibrida con una sonda <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na<br />
sencilla, proveniente <strong>de</strong> DNA genómico clonado o <strong>de</strong> cDNA. Si hay RNA<br />
complementario a la sonda <strong>de</strong> DNA, éste se <strong>de</strong>tectará por autorradiografía como una<br />
banda en la película fotográfica. Como el protocolo original que utiliza DNA unido a un<br />
filtro se conoce como transferencia <strong>de</strong> Southern, el protocolo que utiliza RNA unido al<br />
filtro se <strong>de</strong>nominó transferencia Northern.<br />
La transferencia Northern proporciona información <strong>de</strong> la presencia <strong>de</strong> un<br />
transcripto <strong>de</strong> RNA complementario <strong>de</strong> un gen clonado en una célula o en un tejido<br />
<strong>de</strong>terminado, y se utiliza para examinar patrones <strong>de</strong> expresión génica en tejidos<br />
embrionarios y adultos. La transferencia Northern también pue<strong>de</strong> utilizarse para<br />
<strong>de</strong>tectar cortes y empalmes alternativos <strong>de</strong>l mRNA, y para <strong>de</strong>tectar múltiples tipos <strong>de</strong><br />
transcriptos provenientes <strong>de</strong> un solo gen. La transferencia Northern también<br />
proporciona otras informaciones <strong>de</strong> los mRNA transcriptos. Si se corre un RNA<br />
marcador en un carril adyacente, se pue<strong>de</strong> calcular el tamaño <strong>de</strong>l mRNA <strong>de</strong> un gen <strong>de</strong><br />
interés. A<strong>de</strong>más, la cantidad <strong>de</strong> RNA transcripto presente en una célula o en un tejido<br />
está relacionado con la <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> la banda <strong>de</strong> RNA <strong>de</strong>l film <strong>de</strong> autorradiografía. Se<br />
pue<strong>de</strong> cuantificar la cantidad <strong>de</strong> RNA midiendo la <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> la banda, lo que<br />
proporciona una medida relativa <strong>de</strong> la actividad transcripcional. De esta manera, la<br />
transferencia Northern pue<strong>de</strong> utilizarse para caracterizar y cuantificar la actividad<br />
transcripcional <strong>de</strong> un gen <strong>de</strong>terminado en distintas células, tejidos, u organismos.<br />
Secuenciación <strong>de</strong> DNA<br />
En cierto sentido, la caracterización <strong>de</strong>finitiva <strong>de</strong> un segmento <strong>de</strong> DNA clonado<br />
es la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> su secuencia <strong>de</strong> nucleótidos. La capacidad <strong>de</strong> secuenciar DNA<br />
clonado ha permitido gran<strong>de</strong>s avances en el conocimiento <strong>de</strong> la estructura génica y <strong>de</strong><br />
los mecanismos <strong>de</strong> regulación. Aunque <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la década <strong>de</strong> los 40 hay técnicas que<br />
permiten <strong>de</strong>terminar la composición <strong>de</strong> bases <strong>de</strong>l DNA, fue en la década <strong>de</strong> los 60<br />
cuando se <strong>de</strong>sarrollaron los métodos para <strong>de</strong>terminar la secuencia <strong>de</strong> los nucleótidos.<br />
En 1965, Robert Holley <strong>de</strong>terminó la secuencia <strong>de</strong> una molécula <strong>de</strong> tRNA que contenía<br />
74 nucleótidos. Se necesitó un año <strong>de</strong> esfuerzo para realizar este trabajo. En la<br />
23
24<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
década <strong>de</strong> los 70 se <strong>de</strong>sarrollaron métodos más eficientes <strong>de</strong> secuenciación y,<br />
actualmente, en un laboratorio <strong>de</strong> biología molecular, es posible secuenciar más <strong>de</strong> mil<br />
bases en una semana. En un futuro cercano, con la automatización <strong>de</strong> este proceso, se<br />
podrán secuenciar miles <strong>de</strong> bases en un solo día.<br />
Un método <strong>de</strong> secuenciación <strong>de</strong> DNA diseñado por Alan Maxam y Walter<br />
Gilbert utiliza productos químicos para cortar el DNA. Este método se utilizó para<br />
<strong>de</strong>terminar la secuencia <strong>de</strong> bases <strong>de</strong> los 4.362 nucleótidos <strong>de</strong>l plásmido pBR322. El<br />
segundo método, que es el que generalmente se utiliza, lo <strong>de</strong>sarrollaron Fre<strong>de</strong>rick<br />
Sanger y sus colaboradores. El método <strong>de</strong> Sanger se basa en la elongación 5’ – 3’ <strong>de</strong><br />
las moléculas <strong>de</strong> DNA por la DNA polimerasa. Ambas estrategias generan un conjunto<br />
<strong>de</strong> moléculas <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na sencilla <strong>de</strong> diferentes longitu<strong>de</strong>s. Para <strong>de</strong>terminar la<br />
secuencia <strong>de</strong> los nucleótidos en un segmento <strong>de</strong> DNA, ambos métodos utilizan una<br />
serie <strong>de</strong> cuatro reacciones, realizadas en tubos separados. Estas secuencias, cuya<br />
diferencia en tamaño es <strong>de</strong> un solo nucleótido, se separan por electroforesis en gel en<br />
cuatro carriles adyacentes. El resultado es una serie <strong>de</strong> bandas que forman un patrón<br />
parecido a una escalera. La secuencia pue<strong>de</strong> leerse directamente <strong>de</strong>l patrón <strong>de</strong> bandas<br />
<strong>de</strong> los cuatro carriles. Los secuenciadores automáticos <strong>de</strong> DNA utilizan colorantes<br />
fluorescentes en vez <strong>de</strong> sondas radioactivas. Se utilizan cuatro colorantes, produciendo<br />
un patrón <strong>de</strong> picos <strong>de</strong> colores que, al leerlos, proporcionan la secuencia <strong>de</strong> DNA.<br />
La secuenciación <strong>de</strong> DNA proporciona información <strong>de</strong> la organización <strong>de</strong> los<br />
genes y <strong>de</strong> los sucesos mutacionales que alteran a los genes y a los productos<br />
génicos, confirmando la conclusión <strong>de</strong> que los genes y las proteínas son moléculas<br />
colineares. La secuenciación también se ha utilizado para examinar la organización <strong>de</strong><br />
las regiones reguladoras que flanquean los genes procarióticos y eucarióticos, y para<br />
<strong>de</strong>ducir la secuencia <strong>de</strong> aminoácidos <strong>de</strong> las proteínas. El gen <strong>de</strong> la fibrosis quística<br />
(CF), una enfermedad genética humana autosómica recesiva, se i<strong>de</strong>ntificó clonando y<br />
secuenciando el DNA <strong>de</strong> una región <strong>de</strong>l brazo largo <strong>de</strong>l cromosoma 7. Como no se<br />
conocía el producto proteico <strong>de</strong> este gen, se utilizó la secuencia <strong>de</strong> DNA para i<strong>de</strong>ntificar<br />
una región codificadora. Se utilizó la secuencia <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> esta región para generar<br />
una probable secuencia <strong>de</strong> 1.480 aminoácidos. Esta secuencia se utilizó para buscar<br />
secuencias aminoacídicas <strong>de</strong> proteínas conocidas en las bases <strong>de</strong> datos, lo que<br />
permitió inferir que la proteína CF tiene características similares a las proteínas <strong>de</strong><br />
membrana que <strong>de</strong>sempeñan una función en el transporte <strong>de</strong> iones. Nuevos
25<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
experimentos confirmaron que el producto <strong>de</strong>l locus <strong>de</strong> la fibrosis quística es una<br />
proteína <strong>de</strong> membrana que regula el transporte <strong>de</strong> iones cloro por la membrana<br />
plasmática. En la mayoría <strong>de</strong> casos <strong>de</strong> CF, el gen mutante tiene una secuencia <strong>de</strong> DNA<br />
alterada que causa la producción <strong>de</strong> una proteína <strong>de</strong>fectuosa.<br />
A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar los <strong>de</strong>fectos <strong>de</strong>l DNA que causan los fenotipos mutantes,<br />
la secuenciación <strong>de</strong> DNA también se utiliza para examinar la organización <strong>de</strong> un gen (el<br />
número <strong>de</strong> intrones y <strong>de</strong> exones, y sus límites), para proporcionar información <strong>de</strong> la<br />
naturaleza y <strong>de</strong> la función <strong>de</strong> las proteínas codificadas por los genes, como el tamaño,<br />
el número y tipo <strong>de</strong> dominios (región transmembrana, <strong>de</strong> unión al DNA) y <strong>de</strong> la relación<br />
con proteínas similares y con proteínas <strong>de</strong> otros organismos.<br />
Figura. La secuenciación <strong>de</strong>l DNA se ha automatizado con la utilización <strong>de</strong> colorantes<br />
fluorescentes, uno para cada base; las bases se leen en or<strong>de</strong>n <strong>de</strong> izquierda a <strong>de</strong>recha.<br />
Reacción en Ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> la Polimerasa ( PCR)<br />
Las técnicas <strong>de</strong> DNA recombinante se <strong>de</strong>sarrollaron a principios <strong>de</strong> la década <strong>de</strong><br />
los 70, y en los años posteriores revolucionaron la manera en que los genetistas y los<br />
biólogos moleculares dirigían sus investigaciones. En 1986, se <strong>de</strong>sarrolló una nueva<br />
técnica <strong>de</strong>nominada reacción en ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> la polimerasa (PCR), que ha ampliado<br />
enormemente el po<strong>de</strong>r <strong>de</strong> la investigación <strong>de</strong>l DNA recombinante. Incluso ha<br />
reemplazado algunos <strong>de</strong> los métodos anteriores. El análisis <strong>de</strong> PCR ha encontrado<br />
aplicaciones en una amplio abanico <strong>de</strong> disciplinas, entre las que se encuentran la<br />
biología molecular, la genética humana, la evolución e incluso la medicina forense.
26<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Uno <strong>de</strong> los prerrequisitos para muchas técnicas <strong>de</strong> DNA recombinante es la<br />
disponibilidad <strong>de</strong> gran<strong>de</strong>s cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> un segmento específico <strong>de</strong> DNA. Estos se<br />
obtenían a menudo <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> un trabajo intensivo y tedioso <strong>de</strong> clonación y<br />
reclonación. La PCR permite la amplificación directa <strong>de</strong> segmentos <strong>de</strong> DNA específicos<br />
sin clonación, y pue<strong>de</strong> utilizarse en fragmentos <strong>de</strong> DNA que estén presentes,<br />
inicialmente, en cantida<strong>de</strong>s infinitesimalmente pequeñas. El método <strong>de</strong> PCR se basa<br />
en la amplificación <strong>de</strong> un segmento <strong>de</strong> DNA utilizando DNA polimerasa y cebadores,<br />
oligonucleótidos que hibridan con la ca<strong>de</strong>na complementaria a la secuencia a<br />
amplificar. Hay tres pasos fundamentales en la reacción <strong>de</strong> PCR, y la cantidad <strong>de</strong> DNA<br />
amplificado producido sólo está limitado, en teoría, por el número <strong>de</strong> veces que se<br />
repiten estos pasos.<br />
1. El DNA que se requiere amplificar se <strong>de</strong>snaturaliza en ca<strong>de</strong>nas sencillas. Este<br />
DNA no necesita estar ni purificado ni clonado, y pue<strong>de</strong> provenir <strong>de</strong> distintas fuentes,<br />
incluyendo DNA genómico, muestras forenses como sangre seca o semen, muestras<br />
almacenadas en registros médicos, pelos, restos momificados, y fósiles. El DNA <strong>de</strong><br />
doble ca<strong>de</strong>na se <strong>de</strong>snaturaliza por calor (a unos 90º C) hasta que se disocia en<br />
ca<strong>de</strong>nas sencillas, normalmente unos 5 minutos.<br />
2. Los cebadores hibridan al DNA <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na sencilla. Estos cebadores son<br />
oligonucleótidos sintéticos que hibridan con las secuencias flanqueantes <strong>de</strong>l segmento<br />
a amplificar. Generalmente se utilizan dos cebadores diferentes. Cada uno <strong>de</strong> ellos<br />
tiene la secuencia complementaria a una <strong>de</strong> las dos ca<strong>de</strong>nas <strong>de</strong>l DNA. Los cebadores<br />
se alinean con sus extremos 3’ encarados ya que hibridan a ca<strong>de</strong>nas opuestas, como<br />
se observa en la figura 22. La utilización <strong>de</strong> cebadores sintéticos significa que se <strong>de</strong>be<br />
tener alguna información <strong>de</strong> la secuencia <strong>de</strong> DNA a amplificar.<br />
3. A la mezcla <strong>de</strong> reacción se le aña<strong>de</strong> una DNA polimerasa resistente al calor, la<br />
polimerasa Taq. La polimerasa extien<strong>de</strong> los cebadores en dirección 5’ – 3’, utilizando<br />
como mol<strong>de</strong> al DNA ca<strong>de</strong>na sencilla unido al cebador. El producto es una molécula <strong>de</strong><br />
DNA <strong>de</strong> doble ca<strong>de</strong>na con los cebadores incorporados en el producto final.<br />
Cada grupo <strong>de</strong> tres pasos se <strong>de</strong>nomina ciclo. Generalmente, cada paso
27<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
<strong>de</strong>l ciclo se realiza a una temperatura diferente. El ciclo pue<strong>de</strong> repetirse llevando a<br />
cabo otra vez todos los pasos. Empezando con una molécula <strong>de</strong> DNA, el primer ciclo<br />
produce dos moléculas <strong>de</strong> DNA, dos ciclos producen cuatro, tres ciclos producen ocho,<br />
etc. Veinticinco ciclos amplifican varios millones <strong>de</strong> veces el DNA en cuestión. El<br />
proceso es automático y se utiliza una máquina <strong>de</strong>nominada termociclador, que pue<strong>de</strong><br />
programarse para realizar un número pre<strong>de</strong>terminado <strong>de</strong> ciclos, produciendo gran<strong>de</strong>s<br />
cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> segmentos <strong>de</strong> DNA amplificado en unas pocas horas.<br />
La PCR es ampliamente utilizada en laboratorios <strong>de</strong> investigación y tiene<br />
muchas aplicaciones en campos entre los que se incluyen las enfermeda<strong>de</strong>s<br />
infecciosas, la arqueología, el control <strong>de</strong> alimentos, la genética humana, la terapia <strong>de</strong>l<br />
cáncer y la evolución molecular, entre otros. En aplicaciones clínicas, la PCR se utiliza<br />
para i<strong>de</strong>ntificar los agentes infecciosos como el bacilo <strong>de</strong> la tuberculosis y otras<br />
bacterias, el HIV y otros virus. La PCR tiene la ventaja <strong>de</strong> ser rápida y menos laboriosa<br />
que las técnicas <strong>de</strong> clonación convencionales, y ha reemplazado a la utilización <strong>de</strong><br />
sondas clonadas en campos como el diagnóstico prenatal. Aunque el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> la<br />
técnica <strong>de</strong> PCR representa un a<strong>de</strong>lanto importante, también tiene sus limitaciones.<br />
Puesto que la PCR amplifica secuencias <strong>de</strong> DNA, incluso la más pequeña<br />
contaminación <strong>de</strong>l material inicial con DNA <strong>de</strong> otras fuentes pue<strong>de</strong> provocar<br />
dificulta<strong>de</strong>s. Células <strong>de</strong>sprendidas <strong>de</strong> la piel <strong>de</strong> uno <strong>de</strong> los empleados <strong>de</strong>l laboratorio<br />
mientras se realizaba la PCR pue<strong>de</strong>n contaminar las muestras recogidas <strong>de</strong>l escenario<br />
<strong>de</strong>l crimen, dificultando la obtención <strong>de</strong> datos fiables. La PCR <strong>de</strong>be realizarse siempre<br />
con controles a<strong>de</strong>cuados.
28<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
ESTRATEGIAS BÁSICAS PARA EL CLONADO MOLECULAR<br />
El clonado <strong>de</strong> ADN basado en células se usa para amplificar ADN con el objeto <strong>de</strong><br />
po<strong>de</strong>r caracterizarlo físicamente y llevar a cabo estudios funcionales <strong>de</strong> los genes, <strong>de</strong><br />
grupos <strong>de</strong> genes o <strong>de</strong> otras secuencias <strong>de</strong> ADN <strong>de</strong> interés.<br />
Fig. Esquema <strong>de</strong> clonado molecular en plásmido.<br />
Ejercicio 1<br />
La figura <strong>de</strong> arriba sintetiza los distintos pasos a seguir en un experimento <strong>de</strong> clonado<br />
básico. Analiza el esquema y <strong>de</strong>scribe cada uno <strong>de</strong> ellos.<br />
HERRAMIENTAS BÁSICAS PARA EL CLONADO<br />
1. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN.<br />
Las endonucleasas <strong>de</strong> restricción reciben el nombre según la bacteria a partir <strong>de</strong><br />
la cual se han aislado. A continuación, a modo <strong>de</strong> ejemplo, se muestra una tabla con<br />
los sitios <strong>de</strong> reconocimiento y corte <strong>de</strong> varias enzimas <strong>de</strong> restricción tipo II.
29<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Enzima Organismo fuente Sitio <strong>de</strong> restricción<br />
I<br />
EcoRI<br />
Escherichia coli<br />
5’ -G-A-A-T-T-C-<br />
-C-T-T-A-A-G- 5’<br />
I<br />
I<br />
Sau3AI<br />
Satphylococcus aureus<br />
5’ -N-G-A-T-C-N-<br />
-N-C-T-A-G-N- 5’<br />
I<br />
I<br />
HindII<br />
Haemophilus influenzae<br />
5’ -G-T-Py-Pu-A-C-<br />
-C-A-Pu-Py-T-G- 5’<br />
I<br />
I<br />
HaeIII<br />
H. aegiptus<br />
5’ -G-G-C-C-<br />
-C-C-G-G- 5’<br />
I<br />
I<br />
BamHI<br />
Bacillus amyloliquefaciens 5’ -G-G-A-T-C-C-<br />
-C-C-T-A-G-G- 5’<br />
I<br />
I<br />
MsoI<br />
Moraxela bovis<br />
5’ -N-G-A-T-C-N-<br />
-N-C-T-A-G-N- 5’<br />
I<br />
NotI<br />
Nococardia otitdis-caviarum<br />
I<br />
5’ -G-C-G-G-C-C-G-C-<br />
-C-G-C-C-G-G-C-G- 5’<br />
I<br />
Ejercicio 2<br />
a)¿ Qué son las endonucleasas <strong>de</strong> restricción?<br />
b) ¿Qué características poseen los sitios <strong>de</strong> reconocimiento <strong>de</strong> las enzimas <strong>de</strong><br />
restricción?<br />
c) ¿Qué tipos <strong>de</strong> corte pue<strong>de</strong>n producir y qué nombres reciben las terminaciones<br />
formadas?<br />
d) A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> ser útiles como “ tijeras moleculares” ¿qué otro uso se les da a las<br />
endonucleasas <strong>de</strong> restricción?<br />
2. VECTORES DE CLONADO<br />
Existen vectores naturales tales como plásmidos o bacteriófagos que han sido<br />
modificados artificialmente para po<strong>de</strong>r ser utilizados en el clonado. Otros han sido
que los plásmidos recircularicen sin incorporar un inserto?<br />
30<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
construidos por el hombre como los cósmidos, cromosomas artificiales <strong>de</strong> levadura<br />
(YACs) y los cromosomas artificiales <strong>de</strong> mamíferos (MACs). Los vectores empleados<br />
más frecuentemente comparten las siguientes propieda<strong>de</strong>s:<br />
1. Molécula pequeña, bien caracterizada.<br />
2. Origen <strong>de</strong> replicación en la molécula que permita su propia reproducción así como<br />
también la <strong>de</strong>l fragmento insertado.<br />
3. Fácil recuperación <strong>de</strong> la molécula híbrida.<br />
Ejercicio 3<br />
a) ¿Qué son los plásmidos y qué características naturales poseen?<br />
b) Los plásmidos naturales han sido modificados para hacerlos más a<strong>de</strong>cuados como<br />
vectores <strong>de</strong> clonado. Observa la estructura <strong>de</strong>l pBR322 y <strong>de</strong>duce qué condiciones <strong>de</strong>be<br />
reunir un plásmido para que sirva como vector.<br />
EcoR I Hind III<br />
Origen <strong>de</strong> BamH I<br />
replicación Sph I 562<br />
(ORI) Tet r Sal I 651<br />
Amp r<br />
Pst I<br />
Pvu I<br />
Sca I<br />
Fig.2 Esquema <strong>de</strong>l plásmido vector pBR322<br />
BstZ I 939<br />
c) Volvamos nuevamente a la figura don<strong>de</strong> se muestra el clonado en plásmidos y<br />
supone que el vector usado fue el pBR322. Las moléculas <strong>de</strong> pBR322 circular<br />
purificadas <strong>de</strong>ben ser cortadas con una enzima <strong>de</strong> restricción para insertar un<br />
fragmento <strong>de</strong> ADN extraño ¿Qué enzima usarías y por qué?.<br />
d) ¿Con qué enzima cortarías el ADN fuente? ¿ Por qué?<br />
e) ¿Cómo ligarías los pBR322s con los fragmentos <strong>de</strong>l ADN fuente? ¿Cómo evitarías
31<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
f) ¿Cómo se origina la molécula quimera cuando el ADN <strong>de</strong> interés es cortado con una<br />
enzima diferente a la empleada para cortar el plásmido?<br />
g) ¿Qué tamaño máximo <strong>de</strong> fragmentos pue<strong>de</strong> ser clonado en plásmidos?<br />
h) ¿Cómo se introducen las moléculas recombinantes en las bacterias hospedadoras?<br />
i) ¿Cómo i<strong>de</strong>ntificarías las colonias <strong>de</strong> bacterias que han incorporado los plásmidos con<br />
inserto?<br />
j)¿Qué es una biblioteca genómica o genoteca? ¿Cómo se construye?<br />
Bacteriófagos: usaremos como ejemplo el Fago lambda por ser uno <strong>de</strong> los más<br />
conocidos.<br />
Brazo izquierdo Región no esencial Brazo <strong>de</strong>recho<br />
Cabeza ciclo lisogénico<br />
A B E Z J att xis N cro P S<br />
cos W D F int red cl O Q R cos<br />
Cola inmunidad lisis<br />
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100<br />
Figura. Mapa sintetizado <strong>de</strong>l cromosoma lineal <strong>de</strong>l bacteriófago lambda mostrando la<br />
posición <strong>de</strong> algunos genes.<br />
Ejercicio 4<br />
a) ¿Qué son los sitios cos?<br />
b) ¿Qué regiones <strong>de</strong>l lambda pue<strong>de</strong>n ser reemplazadas por ADN exógeno sin afectar<br />
su capacidad <strong>de</strong> infectar bacterias?<br />
c) ¿Cuál es el tamaño máximo <strong>de</strong> fragmentos que pue<strong>de</strong>n ser insertados en el fago<br />
lambda? ¿por qué?<br />
d) ¿Qué ventajas ofrece clonar usando como vector un bacteriófago en lugar <strong>de</strong> un<br />
plásmido?<br />
Ejercicio 5
32<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
a) ¿Qué son los cósmidos?<br />
b) Analiza las ventajas <strong>de</strong>l clonado en cósmidos en relación con el clonado en los dos<br />
vectores anteriores.<br />
VECTORES DE EXPRESIÓN<br />
El objetivo primario <strong>de</strong>l clonado <strong>de</strong> genes para aplicaciones biotecnológicas es la<br />
expresión <strong>de</strong>l gen clonado en el hospedador seleccionado. Pero, la inserción <strong>de</strong> un gen<br />
en un vector no necesariamente asegura que será expresado con éxito. La producción<br />
<strong>de</strong> una proteína a partir <strong>de</strong> un gen requiere que el mismo sea transcripto<br />
a<strong>de</strong>cuadamente y que su mRNA sea traducido. En respuesta a esta necesidad se han<br />
creado varios vectores <strong>de</strong> expresión especializados como el que se muestra a<br />
continuación.<br />
Amp r<br />
ptac<br />
ori<br />
Nco I<br />
ros Pst I<br />
Hind III<br />
Figura. Esquema <strong>de</strong>l vector <strong>de</strong> expresión pKK233-2. Amp r = gen <strong>de</strong> resistencia a la<br />
amicilina.<br />
ptac = promotor <strong>de</strong>l operon lac. rbs = sitio <strong>de</strong> unión a los ribosomas . Noc I, Pst I y Hind<br />
III = sitios <strong>de</strong> cortes para esas endonucleasas <strong>de</strong> restricción. T1 y T2 = secuencias<br />
terminadoras <strong>de</strong> la transcripción.Ori 0 origen <strong>de</strong> replicación. La flecha indica la<br />
dirección <strong>de</strong> la transcripción.<br />
Ejercicio 6 Compara al pKK233-2 con el pBR322 ¿Qué similitu<strong>de</strong>s y qué diferencias<br />
observas?<br />
T 1<br />
T2
33<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
TÉCNICAS DE RASTREO (SCREENING) POR HIBRIDACIÓN DEL ADN.<br />
Una vez construida la biblioteca genómica, se pue<strong>de</strong> localizar <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> ella un<br />
gen o bien algún segmento <strong>de</strong> ADN <strong>de</strong> interés. Se han diseñado numerosas técnicas<br />
<strong>de</strong> son<strong>de</strong>o: Hibridización Southern, hibridización Northern, hibridización Western entre<br />
otras.<br />
Ejercicio 7<br />
a) ¿Qué es una sonda, qué tipos <strong>de</strong> sondas existen y para qué sirven?<br />
b) Describe brevemente cada una <strong>de</strong> las técnicas <strong>de</strong> son<strong>de</strong>o mencionadas arriba.<br />
ADN COMPLEMENTARIO<br />
Ejercicio 8<br />
a) ¿A qué se <strong>de</strong>nomina cADN o ADN copia y cómo se obtiene?<br />
b) ¿Cómo se construye una biblioteca <strong>de</strong> cADN?<br />
CLONADO POR PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA)<br />
El PCR es un procedimiento efectivo para obtener gran<strong>de</strong>s cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> una<br />
secuencia específica <strong>de</strong> ADN in vitro. Se pue<strong>de</strong> obtener una amplificación <strong>de</strong> hasta<br />
más <strong>de</strong> un millón <strong>de</strong> veces. Para que el PCR ocurra se necesita:<br />
• Dos cebadores o primers (repasar transcripción <strong>de</strong>l ADN) complementarios a<br />
regiones sobre ca<strong>de</strong>nas opuestas <strong>de</strong>l ADN a ambos lados <strong>de</strong> la secuencia a<br />
amplificar.<br />
• Una ADN polimerasa termoestable que soporte temperaturas <strong>de</strong> 95ºC o más (Taq,<br />
ADN polimerasa <strong>de</strong> Thermus aquaticus).<br />
• Los cuatro <strong>de</strong>soxirribonucleótidos trifosfato.
34<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Esta técnica consiste en alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> unos 30 ciclos <strong>de</strong> replicación <strong>de</strong>l ADN. Cada ciclo<br />
contiene 3 etapas:<br />
1. Desnaturalización: 95ºC<br />
2. Renaturalización: ~55ºC<br />
3. Síntesis: ~75ºC<br />
Ventajas <strong>de</strong>l clonado por PCR.<br />
• Rapi<strong>de</strong>z: Una reacción típica <strong>de</strong> 30 ciclos <strong>de</strong> 3 a 5 min cada uno. El tiempo requerido<br />
para el clonado en células es <strong>de</strong> semanas o meses.<br />
• Sensibilidad <strong>de</strong> la reacción: Es posible amplificar secuencias a partir <strong>de</strong> diminutas<br />
cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> ADN, aún <strong>de</strong> una única célula.<br />
• No es necesario que el ADN esté muy purificado: Permite amplificar secuencias<br />
específicas <strong>de</strong> material en el que el ADN está muy <strong>de</strong>gradado o embebido en un<br />
medio que hace problemático su aislamiento.<br />
Ejercicio 9<br />
a) Esquematiza una reacción en ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> la polimerasa (PCR) hasta el cuarto ciclo.<br />
BIBLIOGRAFÍA:<br />
GRIFFITHS, A. Genética. Ed. McGraw Hill Interamericana. 5 ta edición.<br />
KLUG, W y M. CUMINGS. 1999. Conceptos <strong>de</strong> Genética. Ed. Prentice Hall. 5ta. ed.<br />
TAMARÍN, R. 1996. Principios <strong>de</strong> Genética. Edit. Reverté
Tópico: Organismos<br />
35<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
La diversidad biológica actual ha sido dividida en tres dominios basado<br />
principalmente en la evi<strong>de</strong>ncia molecular, dado que los organismos que pertenecen a<br />
un dominio particular han ido evolucionando separadamente <strong>de</strong> los hallados en los<br />
otros dominios durante más <strong>de</strong> 1.000 millones <strong>de</strong> años; por esto constituyen las<br />
divisiones más profundas en la historia <strong>de</strong> la vida evolutiva hasta ahora conocida.<br />
LOS CARACTERES QUE DEFINEN A LOS TRES DOMINIOS SON:<br />
Bacteria<br />
Organismos: Termotogales, flavobacterias, cianobacterias, bacterias púrpuras,<br />
bacterias gram-positivas, bacterias ver<strong>de</strong>s no-sulfurosas.<br />
Características: Células procarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente<br />
por diésteres <strong>de</strong> diacil-glicerol. El RNA ribosomal <strong>de</strong> la subunidad pequeña <strong>de</strong> los<br />
ribosomas (16S-rRNA) es <strong>de</strong>l tipo eubacteriano, es <strong>de</strong>cir, posee un bucle entre las<br />
posiciones 500-545.<br />
Dominio Archaea<br />
Organismos: Pyrodictium, Thermoprocteous, termococales, metanococales,<br />
metanobacterias, metanomicrobiales, halófilos extremos.<br />
Características: Células procarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente<br />
por diéteres <strong>de</strong> glicerol isoprenoi<strong>de</strong>s o tetraéteres <strong>de</strong> diglicerol. El RNA ribosomal <strong>de</strong> la<br />
subunidad pequeña <strong>de</strong> los ribosomas (I6S-rRNA) es <strong>de</strong>l tipo arqueobacteriano, es<br />
<strong>de</strong>cir, tiene una estructura única entre las posiciones 180-197 ó 405-498.<br />
Dominio Eukarya<br />
Organismos: Animales, protozoos ciliados, protozoos flagelados, plantas, hongos,<br />
diplomonas, algas rojas, euglenoi<strong>de</strong>s, microsporidias.<br />
Características: Células eucarióticas. Membranas lipídicas compuestas principalmente<br />
por diésteres <strong>de</strong> acil-glicerol. El RNA ribosomal <strong>de</strong> la subunidad pequeña <strong>de</strong> los<br />
ribosomas (18S-rRNA) es <strong>de</strong>l tipo eucariota, es <strong>de</strong>cir, posee una estructura única entre<br />
las posiciones 585-655.
Cuadro <strong>de</strong> los tres dominios<br />
36<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Dominios<br />
Característica Bacteria Archae Eukarya<br />
Núcleo ro<strong>de</strong>ado por membranas ausente ausente Presente<br />
Organelas rodadas por membrana ausente ausente presente<br />
Peptidoglucanos en la pared celular presente ausente ausente<br />
Lípidos <strong>de</strong> membrana Enlazado por éster Enlazado por Enlazado por éster<br />
no ramificado éter ramificado no ramificado<br />
ribosomas 70S 70S 80S<br />
Iniciador <strong>de</strong>l tRNA Formilmetionina Metionina Metionina<br />
Operones Sí Sí No<br />
Plásmidos Sí Sí Raros<br />
RNA polimerasas uno varios Tres<br />
Sensibles a cloranfenicol y a la Si No No<br />
estreptomicina<br />
Ribosomas<br />
diftérica<br />
sensibles a la toxina<br />
No Sí Sí<br />
Algunos son metanógenos No Sí No<br />
Algunos fijan nitrógeno Sí Sí No<br />
Algunos conducen una fotosíntesis<br />
basada en la clorofila<br />
(Purves, el al. 2003)<br />
Sí No Sí<br />
(P(
37<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Figura. La estructura filogenética más profunda <strong>de</strong> la diversidad biológica obtenida por Carl<br />
Woese a partir <strong>de</strong> la secuenciación <strong>de</strong> rRNA.<br />
Figura. La naturaleza jerárquica <strong>de</strong> la clasificación biológica consiste en la formación <strong>de</strong><br />
grupos <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> grupos. El mayor es el Dominio, en el cual se incluye al Reino (Curtis, 2000)
38<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Los tres dominios Archaebacteria , Bacteria y Eukarya, incluyen a los seis Reinos tal<br />
como se muestra:<br />
Dominio Archebacteria: Reino Archaebacteria.<br />
Dominio Bacteria: Reino Bacteria (Eubacteria)<br />
Dominio Eukarya: Reinos: Protista, Fungi, Plantae, Animalia.<br />
LOS CARACTERES GENERALES QUE DEFINEN A CADA REINO, SON:<br />
Reino Características<br />
Archaeobacteria<br />
Eubacteria o<br />
Bacteria<br />
Se caracterizan por la ausencia <strong>de</strong> peptidoglucano en las pare<strong>de</strong>s<br />
celulares y la presencia <strong>de</strong> lípidos <strong>de</strong> composición distintiva en las<br />
membranas celulares que no se encuentra en ninguna otra bacteria. La<br />
mayoría vive en lugares calurosos y ácidos<br />
Células <strong>de</strong> vida libre; diferenciación celular incipiente en algunos<br />
grupos. Incluye a todas las bacterias.<br />
Protista o Células eucariotas. Flagelo <strong>de</strong> estructura 9+2 en algún momento <strong>de</strong> su<br />
Protoctista ciclo <strong>de</strong> vida. La distinción entre unicelularidad y multicelularidad es<br />
irrelevante. Es un grupo <strong>de</strong>finido por exclusión, es <strong>de</strong>cir, no son<br />
animales, ni plantas, ni hongos ni procariotas. Contiene<br />
aproximadamente 27 phyla incluyendo a protozoos y algas como los<br />
organismos más comunes.
Fungi<br />
(Hongos)<br />
Plantae<br />
(Plantas)<br />
39<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Células eucariotas. Formación <strong>de</strong> esporas y ausencia <strong>de</strong> flagelos<br />
(amastigotas). Las esporas haploi<strong>de</strong>s germinan generando hifas que<br />
por un proceso <strong>de</strong> septación más o menos incompleto da lugar a la<br />
formación <strong>de</strong> células. El citoplasma pue<strong>de</strong> fluir en mayor o menor grado<br />
a través <strong>de</strong> la hifa. Al conjunto <strong>de</strong> hifas se le llama micelio y constituye<br />
la estructura visible <strong>de</strong> la mayor parte <strong>de</strong> los hongos. Las hifas<br />
adyacentes pue<strong>de</strong>n compartir núcleos por conjugación dando lugar a<br />
una célula heterocariótica cuyos núcleos se divi<strong>de</strong>n por mitosis y<br />
originan una hifa dicariótica. En la reproducción sexual, ambos núcleos<br />
se fusionan y forman una célula cigótica diploi<strong>de</strong> que se dividirá por<br />
meiosis y formará las nuevas esporas haploi<strong>de</strong>s.<br />
Organismos multicelulares eucariotas <strong>de</strong>sarrollados a partir <strong>de</strong> un<br />
embrión que no produce una blástula. Las células eucariotas <strong>de</strong> la<br />
mayor parte <strong>de</strong> las plantas poseen plástidos fotosintéticos, sin<br />
embargo, ésta no es una característica exclusiva ni general <strong>de</strong> las<br />
plantas. A diferencia <strong>de</strong> los animales -cuyas células son en su mayoría<br />
diploi<strong>de</strong>s- y fungi -cuyas células son haploi<strong>de</strong>s o dicarióticas- las<br />
plantas alternan <strong>de</strong> manera or<strong>de</strong>nada un estadio haploi<strong>de</strong> o <strong>de</strong><br />
gametofito -don<strong>de</strong> se producen gametas por mitosis- y otro diploi<strong>de</strong> o<br />
<strong>de</strong> esporofito -don<strong>de</strong> se producen gametas por meiosis.<br />
En las plantas con flores, el esporofito domina el ciclo <strong>de</strong> vida y el<br />
gametofito, en lugar <strong>de</strong> producir una nueva planta in<strong>de</strong>pendiente, se<br />
reduce a unas pocas células <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la flor <strong>de</strong>l esporofito. Del mismo<br />
modo, en los helechos, el esporoflto es la forma que domina el ciclo <strong>de</strong><br />
vida y el gametoflto, a pesar <strong>de</strong> tener una fase <strong>de</strong> vida libre, no es<br />
visible a simple vista.
Animalia<br />
(Animales)<br />
Ejercicio 1<br />
40<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Organismos multicelulares eucariotas <strong>de</strong>sarrollados a partir <strong>de</strong> un<br />
embrión que pasa por un estadio <strong>de</strong> blástula. Aunque la<br />
multicelularidad ha surgido in<strong>de</strong>pendientemente en todos los reinos, en<br />
los animales es característica ya que las células están unidas por<br />
complejas estructuras como los <strong>de</strong>smosomas uniones <strong>de</strong>nominadas<br />
“gap" y septadas. A diferencia <strong>de</strong> las plantas, en los animales la<br />
meiosis es gamética, es <strong>de</strong>cir, a la reducción cromosómica le sigue<br />
inmediatamente la formación <strong>de</strong> gametas sin posibilidad <strong>de</strong> originar<br />
individuos haploi<strong>de</strong>s como el gametofito.<br />
Ubicar en las categorías taxonómicas especificadas (Dominio y Reino) a: Trifolium<br />
repens (alfalfa), Tripanosoma cruzi (agente causante <strong>de</strong> Mal <strong>de</strong> Chagas), Dipilidium<br />
caninum (gusano parásito <strong>de</strong> perros), Ascaris lumbricoi<strong>de</strong>s (gusano parásito <strong>de</strong><br />
vertebrados), Amynthas hawayanus (lombriz <strong>de</strong> tierra), Azolla sp (planta flotante), Zea<br />
mays (maíz).<br />
Bibliografía:<br />
CURTIS, H. y N. BARNES. 2000. <strong>Biología</strong>. Ed. Med. Panamericana. 6ta. Ed.<br />
PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia<br />
<strong>de</strong> la <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.
¿Cómo iniciar el estudio <strong>de</strong> un animal?<br />
41<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Existen distintos arquetipos que subyacen a la biodiversidad <strong>de</strong> formas animales con<br />
aspectos estructurales comunes que son compartidos por ellos.<br />
Los principales atributos que <strong>de</strong>finen la arquitectura corporal (plan corporal) son: la<br />
multiceluridad, la simetría, el diseño <strong>de</strong>l tubo digestivo, la cavidad corporal (celoma), el<br />
<strong>de</strong>sarrollo embrionario y la metamería.<br />
A continuación se presenta un esquema <strong>de</strong> conceptos que muestra los mencionados<br />
atributos y la forma en que unos se relacionan con los otros. Para interpretarlo<br />
a<strong>de</strong>cuadamente se aconseja utilizar el glosario que se presenta <strong>de</strong>bajo.
42<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
según la relación <strong>de</strong> las células que lo componen<br />
Metazoos (mesozoos y<br />
Parazoos) (Porifera)<br />
Radial-diploblástico<br />
(Cnidaria)<br />
Protostomados<br />
(Platyhelminthes, Nematoda,<br />
Mollusca, Annelida<br />
Arthropoda)<br />
Sin metamería<br />
Mollusca<br />
Según su <strong>de</strong>sarrollo embrionario<br />
Según la metamería<br />
Animal<br />
Esquizocelomados (Annelida,<br />
Mollusca, Arthropoda)<br />
Homómera<br />
(Annelida)<br />
Eumetazoos<br />
Según la simetría y número<br />
<strong>de</strong> capas tisulares<br />
Bilateral –<br />
Triploblástico<br />
Según la disposición <strong>de</strong>l tubo digestivo<br />
En saco ciego De tubo en tubo<br />
Según la presencia o ausencia <strong>de</strong><br />
cavidad corporal<br />
Acelomados<br />
(Platyhelminthes) Pseudocelomados<br />
(Nematoda)<br />
Con metamería<br />
Deuterostomados<br />
(Equino<strong>de</strong>rmata,<br />
Chordata)<br />
Heterónoma<br />
(Arthropoda)<br />
Según el modo <strong>de</strong> formación <strong>de</strong>l celoma<br />
* *1 Equino<strong>de</strong>rmata: es consi<strong>de</strong>rado por su<br />
bilateralidad en estadíos larvales.<br />
Celomados<br />
Enterocelomados<br />
(Equino<strong>de</strong>rmata *1 ,<br />
Chordata)
Glosario<br />
43<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Metazoos (mesozoos y parazoos): Animales multicelulares con capas celulares no<br />
homólogas a las <strong>de</strong> los blasto<strong>de</strong>rmos <strong>de</strong> los eumetazoos. Presentan un mayor nivel<br />
<strong>de</strong> organización que el que se encuentra en las colonias <strong>de</strong> protozoos, no obstante se<br />
consi<strong>de</strong>ra que poseen un grado celular <strong>de</strong> organización, en el cual la organización<br />
celular es una agregación <strong>de</strong> células funcionalmente diferenciadas, con división <strong>de</strong><br />
trabajo, pero con escasa ten<strong>de</strong>ncia a organizarse como tejido.<br />
Eumetazoos: Animales multicelulares con una organización estructural, en la cual<br />
combinan sus células en unida<strong>de</strong>s mayores, aquí una célula es una parte especializada<br />
<strong>de</strong>l conjunto <strong>de</strong>l organismo que es incapaz <strong>de</strong> vivir por sí sola. Existe un grado <strong>de</strong><br />
organización celular-tisular, en el cual las células similares se agregan según<br />
patrones <strong>de</strong>finidos, <strong>de</strong> lo cual surgen los tejidos.<br />
Simetría: Es el equilibrio <strong>de</strong> las proporciones, o correspon<strong>de</strong>ncia en tamaño y forma <strong>de</strong><br />
las partes o estructuras situadas en lados opuestos <strong>de</strong> un plano (plano <strong>de</strong> simetría)<br />
Simetría radial: Cuando el organismo pue<strong>de</strong> quedar dividido en mita<strong>de</strong>s semejantes<br />
por más <strong>de</strong> dos planos que contengan un eje longitudinal (plano <strong>de</strong> simetría).<br />
Simetría bilateral: Cuando el organismo pue<strong>de</strong> ser dividido en dos mita<strong>de</strong>s<br />
especulares (<strong>de</strong>recha e izquierda) en un solo plano sagital.<br />
Diploblástico: disposición básica <strong>de</strong> tejidos embrionarios con dos capas tisulares,<br />
endo<strong>de</strong>rmo y ecto<strong>de</strong>rmo.<br />
Triploblástico: disposición básica <strong>de</strong> tejidos embrionarios con tres capas tisulares,<br />
endo<strong>de</strong>rmo, meso<strong>de</strong>rmo y ecto<strong>de</strong>rmo.<br />
Sistema digestivo en saco ciego: Existe una abertura que funciona como boca y ano<br />
que se abre a un saco ciego.
44<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Sistema digestivo <strong>de</strong> tubo en tubo: Tubo unidireccional, con dos aberturas, boca y<br />
ano.<br />
Celoma: Cavidad llena <strong>de</strong> fluido que ro<strong>de</strong>a al tubo digestivo, proporcionando un diseño<br />
<strong>de</strong>l tipo “tubo <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un tubo”, lo que permite una flexibilidad mucho mayor <strong>de</strong> la<br />
cavidad interna. También supone la disponibilidad <strong>de</strong> espacio para los órganos<br />
viscerales y permite un mayor tamaño y complejidad al <strong>de</strong>jar mayor superficie expuesta<br />
para intercambios celulares. Funciona adicionalmente como un esqueleto hidrostático<br />
en ciertos casos, especialmente en muchos gusanos contribuyendo a activida<strong>de</strong>s como<br />
traslación y excavación.<br />
Acelomado: No existe cavidad corporal alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l tubo digestivo. El espacio entre<br />
la epi<strong>de</strong>rmis (ectodérmica) y el tubo digestivo (Endodérmico) está completamente<br />
ocupado por una masa esponjosa <strong>de</strong> células <strong>de</strong>nominada parénquima (meso<strong>de</strong>rmo).<br />
Pseudocelomado: Existe una cavidad corporal alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l tubo digestivo limitada<br />
por blastocele persistente que <strong>de</strong>riva <strong>de</strong>l blastocele embrionario, por ello se <strong>de</strong>nomina a<br />
esta cavidad pseudoceloma o pseudocele.<br />
Celomado: Hay una verda<strong>de</strong>ra cavidad <strong>de</strong>sarrollada <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l meso<strong>de</strong>rmo tapizada<br />
por peritoneo mesodérmico.<br />
44
45<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Metamería (segmentación): la repetición seriada <strong>de</strong> unida<strong>de</strong>s corporales a lo largo <strong>de</strong>l<br />
eje longitudinal <strong>de</strong> un organismo. Cada una <strong>de</strong> esas unida<strong>de</strong>s se <strong>de</strong>nomina segmento o<br />
metámero. Esta disposición afecta a estructuras externas e internas <strong>de</strong> varios sistemas.<br />
La segmentación <strong>de</strong>l cuerpo (metamería) se llama verda<strong>de</strong>ra o mesodérmica,<br />
cuando existen tabiques internos que separan las secciones sucesivas <strong>de</strong>l animal. Se<br />
opone a la llamada segmentación superficial o aparente, que se observa en algunos<br />
gusanos – Acantocéfalos, aschelmintos – y dón<strong>de</strong> sólo la cutícula o la pared corporal,<br />
incluso la musculatura, presenta las divisiones sucesivas a lo largo <strong>de</strong>l eje longitudinal,<br />
pero faltan los tabiques y no hay repetición <strong>de</strong> órganos internos. También se observa el<br />
pseudomatamerismo – Platelmintos, Nenertinos – cuando en el cuerpo existe una<br />
ten<strong>de</strong>ncia a la repetición <strong>de</strong> las partes y <strong>de</strong> los órganos (por ejemplo, las gónadas), sin<br />
que estos sean separados por tabiques. (Novikoff, M. M. 1976.)<br />
Se conoce como Metámero cada uno <strong>de</strong> los segmentos que se repiten en<br />
ciertos grupos <strong>de</strong> animales, celomados <strong>de</strong> simetría bilateral (Bilateria). La<br />
metamerización es una <strong>de</strong> las principales modificaciones <strong>de</strong>l celoma. Cada<br />
metámero tienen cavida<strong>de</strong>s celómicas separadas <strong>de</strong> las <strong>de</strong> otros metámeros por<br />
tabiques, y las estructuras internas (ganglios nerviosos, nefridios, gónadas, etc.) y<br />
externas (patas, branquias, etc.) están repetidas en cada metámero.<br />
Metamería Homómera: Los segmentos son semejantes entre sí.<br />
Metamería Heterónoma: Los segmentos se fusionan entre sí en grupos funcionales<br />
llamados tagmas para funciones especiales.<br />
Esquizocelomado: El celoma surge <strong>de</strong> la división <strong>de</strong> bandas mesodérmicas originadas<br />
a partir <strong>de</strong> células <strong>de</strong> la región <strong>de</strong>l blastoporo (abertura al exterior <strong>de</strong>l tubo digestivo<br />
primitivo) , las cuales proliferan y se ahuecan para formar la cavidad celómica.<br />
Enterocelomado: El celoma se origina por invaginaciones <strong>de</strong>l tubo digestivo primitivo<br />
que se in<strong>de</strong>pendiza <strong>de</strong> éste y aumentan <strong>de</strong> tamaño para formar la cavidad celómica.
46<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Protostomado: El blastoporo origina la boca, en tanto que el ano se forma<br />
secundariamente.<br />
Deuterostomado: El blastoporo origina el ano, en tanto que la boca se forma<br />
secundariamente.
47<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Tagmosis: metamerización heterónoma en tagmas que presentan los Arthropodos<br />
para funciones especializadas.<br />
La asociación <strong>de</strong> tagmas y la presencia <strong>de</strong> apéndices especializados permite la<br />
distinción exomorfológica entre las Clases <strong>de</strong> Artrópodos, estas características se<br />
muestran en el siguiente cuadro.
Clase Antenas Patas Partes<br />
bucales<br />
Crustacea 2 pares N pares y<br />
birrámeas<br />
Insecta 1 par 3 pares y<br />
unirrámeas<br />
Myriapoda 1 par N pares y<br />
unirrámeas<br />
Chelicerata Ausentes 4 pares y<br />
unirrámeos<br />
Ejercicio 2<br />
Madíbulas<br />
1 maxila<br />
2 maxila<br />
Madíbulas<br />
1 maxila<br />
2 maxila<br />
(labium)<br />
Mandíbulas<br />
1 maxila<br />
Variable<br />
Quelíceros<br />
pedipalpos<br />
48<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Tagmosis Ejemplos<br />
Cefalotórax<br />
Abdomen<br />
Cabeza<br />
Tórax<br />
Abdomen<br />
Cabeza<br />
Tronco<br />
Cefalotórax<br />
(prosoma)<br />
Abdomen<br />
(opistosoma)<br />
* Consi<strong>de</strong>rando los conceptos expuestos, realizar un cuadro comparativo entre los<br />
Phyla más conocidos.<br />
* Elige al menos dos animales mencionados en el ejercicio 1 y <strong>de</strong>scríbelos<br />
consi<strong>de</strong>rando todos los aspectos mencionados en este apartado.<br />
Ejercicio 3<br />
* Busca un dibujo <strong>de</strong> pata birrámea y unirrámea, i<strong>de</strong>ntifica sus partes y explica a qué se<br />
<strong>de</strong>be el nombre e hipotetiza cuál será la importancia adaptativa <strong>de</strong> cada tipo.<br />
* Completa el cuadro dado arriba mencionando dos ejemplos <strong>de</strong> cada una <strong>de</strong> las<br />
Clases.<br />
Bibliografía consultada:
49<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
BARNES, R. D. 1989. Zoología <strong>de</strong> los Invertebrados. Ed. Mc Graw Hill Interamericana 5ta.<br />
ed.<br />
CURTIS, H. y S. BARNES 2000. <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.<br />
HICKMAN, C., L. ROBERTS y A. PARSON. 2002. Principios integrales <strong>de</strong> Zoología.<br />
Ed. Mc Graw Hill Interamericana 11ma. ed.<br />
PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia<br />
<strong>de</strong> la <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.<br />
SOLOMON, E. P; L. R. BERG y D. W. MARTIN, 1999. <strong>Biología</strong>. Ed. Mc Graw Hill<br />
Interamericana 5ta. ed.
50<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
El estudio <strong>de</strong> los vegetales, como cualquier ser vivo, implica abordarlo <strong>de</strong>s<strong>de</strong><br />
diferentes perspectivas, entre ellas su morfología externa.<br />
ADAPTACIONES DEL CORMO<br />
No siempre el cuerpo <strong>de</strong> las plantas superiores sigue, el mo<strong>de</strong>lo estructural básico (raíz,<br />
tallo y hoja). A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> la variabilidad en el aspecto externo, que es causada por diferentes<br />
modos <strong>de</strong> ramificación y simetría, la multitud <strong>de</strong> formas <strong>de</strong> los órganos vegetativos aumenta por<br />
modificaciones morfológicas. Estas modificaciones o adaptaciones están generalmente<br />
relacionadas con el ambiente en el que se <strong>de</strong>sarrolla la planta, algunas son la acumulación <strong>de</strong><br />
reservas y la existencia <strong>de</strong> mecanismos <strong>de</strong> multiplicación vegetativa.<br />
Este texto hace referencia a las adaptaciones <strong>de</strong>l cormo no relacionadas y relacionadas<br />
con la acumulación <strong>de</strong> reservas.<br />
A- Adaptaciones in<strong>de</strong>pendientes <strong>de</strong> la acumulación <strong>de</strong> reservas<br />
1- Hoja<br />
a- Espinas foliares: son modificaciones agudas, muy ricas en tejidos <strong>de</strong> sostén y como<br />
consecuencia, rígidas; pue<strong>de</strong>n ser ramificadas o sencillas. Este tipo <strong>de</strong> adaptación está difundida<br />
en vegetales típicos <strong>de</strong> zonas áridas, pero aparece también, como <strong>de</strong>fensa contra herbívoros, en<br />
algunos vegetales no xeromorfos <strong>de</strong> otras regiones climáticas y en ciertas plantas trepadoras.<br />
Las espinas foliares se producen por transformación <strong>de</strong> hojas o <strong>de</strong> partes <strong>de</strong> éstas (fig. 1).<br />
En Berberis sp, por ejemplo, son parte <strong>de</strong> la lámina foliar, que a<strong>de</strong>más presenta estípulas<br />
modificadas. Éstas se <strong>de</strong>sarrollan también en Acacia, Robinia y Prosopis (algarrobo).<br />
Figura 1: Estípulas transformadas en espinas <strong>de</strong> Robinia pseudoacia.
51<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
b- Zarcillos foliares: son órganos filamentosos, simples o ramificados, haptotrópicos que<br />
la planta utiliza exclusivamente para trepar. Tienen origen por transformación <strong>de</strong>l limbo foliar o<br />
<strong>de</strong> otra parte <strong>de</strong> la hoja. Ejemplos: zapallo (Cucurbita pepo) los zarcillos foliares resultan <strong>de</strong><br />
hojas reducidas a la nervadura media, arveja (Pisum sativum) los últimos folíolos <strong>de</strong> la hoja<br />
pue<strong>de</strong>n transformarse en zarcillos ramificados (fig. 2); en Lathyrus aphaca (Leguminosa) el<br />
limbo se ha transformado en un zarcillo simple y su función originaria, es <strong>de</strong>cir, la asimilación<br />
<strong>de</strong> C2O, es <strong>de</strong>sempeñada por dos gran<strong>de</strong>s estípulas.<br />
Figura 2: Zarcillos foliares en una hoja pinnada <strong>de</strong> Pisum sativum; con <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> una rama lateral florífera.<br />
c- Filodios: se le da este nombre a un pecíolo dilatado y lámina que sustituye a la lámina<br />
<strong>de</strong> la hoja, por lo general totalmente abortada. Se presenta en algunas especies <strong>de</strong> género Acacia<br />
(fig. 3).<br />
Figura 3: Filodios <strong>de</strong> Acacia heterophylla; transiciones <strong>de</strong> las hojas pinnadas (abajo) a los filodios (arriba).
2- Tallo<br />
52<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
a- Espinas caulinares: aparecen como toda rama lateral en la axila <strong>de</strong> las hojas. Pue<strong>de</strong>n<br />
ser simples o ramificadas, generalmente presentan una foliación reducida, aunque en algunos<br />
casos producen hojas normales con yemas en las axilas. Ejemplo: Crataegus (fig. 4) y Prunus<br />
spinosa.<br />
Figura 4: Espina <strong>de</strong> Crataegus sp.<br />
b- Zarcillos caulinares: son semejantes en forma y función a los zarcillos foliares, difieren<br />
en su origen. Se originan <strong>de</strong> una yema axilar, <strong>de</strong>l mismo modo que las ramas laterales normales.<br />
Figura 5: Zarcillo caulinar <strong>de</strong> Passiflora sp.<br />
c- Braquiblastos: en las plantas superiores la intensidad <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> las ramas<br />
laterales pue<strong>de</strong> ser muy variada; en unos casos se <strong>de</strong>sarrollan ramas con entrenudos largos, son<br />
los macroblastos, y otras dan lugar a braquiblastos, ramas cortas y con aspecto <strong>de</strong> roseta (fig. 6).<br />
Los braquiblastos tienen, con frecuencia, una vida limitada, suelen ser simples o<br />
escasamente ramificados. En algunas plantas leñosas las hojas normales, al menos en estado<br />
adulto, se forman únicamente en los braquiblastos por Ejemplo: Prunus cerasus (guindo), Malus<br />
y Ginkgo.
Figura 6: Macro y braquiblastos <strong>de</strong> Pinus sp<br />
53<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
d- Cladodios y Filóclados. Cladodios: son ramas <strong>de</strong> forma comprimida o hasta laminar,<br />
generalmente con hojas rudimentarias, color ver<strong>de</strong>, en la que se realiza, por lo tanto la función<br />
fotosintética.<br />
A pesar <strong>de</strong> su semejanza con los nomófilos, con quienes coinci<strong>de</strong>n funcionalmente,<br />
difieren <strong>de</strong> ellos por el origen y por tener crecimiento ilimitado. Es frecuente su <strong>de</strong>sarrollo en<br />
plantas <strong>de</strong> lugares secos, por ejemplo Cactáceas, en las que a<strong>de</strong>más se acumula agua (figs. 7 a y<br />
b).<br />
Figura 7: Opuntia sp tallos aplanados con ramas laterales (aréolas), las hojas <strong>de</strong> dichas ramas se han transformado<br />
en espinas. Derivación <strong>de</strong> una forma suculenta (a la <strong>de</strong>recha) a partir <strong>de</strong> una forma cactácea con hojas (a la<br />
izquierda)<br />
Si las ramas laminares fotosintetizantes son braquiblastos y presentan por ello aspecto<br />
muy semejante al <strong>de</strong> las hojas, reciben el nombre <strong>de</strong> filóclados. Ejemplo :Ruscus sp (fig. 8).
54<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Figura 8: Rama <strong>de</strong> Ruscus aculeatus mostrando filóclados con aspecto <strong>de</strong> hoja, sobre las que aparecen las flores.<br />
e- Estolones: ramas laterales, más o menos <strong>de</strong>lgadas, a menudo muy largas que nacen <strong>de</strong><br />
las base <strong>de</strong> algunos tallos. Los estolones pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>sarrollarse arrastrándose por la superficie <strong>de</strong><br />
la tierra y constituyen estolones epígeos, por ejemplo el fresal (fig. 9); o bien pue<strong>de</strong>n hacerlo por<br />
<strong>de</strong>bajo <strong>de</strong>l suelo formando estolones subterráneos, por ejemplo la menta.<br />
Figura 9: Formación <strong>de</strong> un estolón <strong>de</strong> fresa (Fragaria sp).<br />
3– Raíz<br />
a- Espinas radicales: entre las Monocotiledóneas, por ej. algunas palmeras<br />
(Acanthorrhiza) producen espinas radicales en la base <strong>de</strong>l tallo, originadas por transformaciones<br />
<strong>de</strong> las raíces adventicias.<br />
b- Raíces contráctiles: son raíces embrionarias o adventicias encargadas <strong>de</strong> enterrar más<br />
profundamente la planta o <strong>de</strong> favorecer su dispersión. Cumplen su función por medio <strong>de</strong><br />
contracciones que se observan como estrías en la superficie.
55<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Se <strong>de</strong>sarrollan preferentemente en las especies con tubérculos, bulbos o rizomas (fig.10).<br />
Figura 10: Raíces contráctiles <strong>de</strong> Arum maculatum. Hundimiento progresivo <strong>de</strong>l tubérculo por contracción <strong>de</strong> la raíz:<br />
I germinación, II principio <strong>de</strong>l segundo año, III finales <strong>de</strong> dicho año, IV planta adulta, tubérculo a 10 cm por <strong>de</strong>bajo<br />
<strong>de</strong>l suelo.<br />
B- Adaptaciones relacionadas con la acumulación <strong>de</strong> reservas<br />
1- Hoja<br />
Bulbos: brote subterráneo con los catáfilos o las bases foliares convertidos en órganos<br />
reservantes.<br />
En un bulbo <strong>de</strong> cebolla (Allium cepa) en corte longitudinal se distingue el tallo en forma<br />
<strong>de</strong> disco con entrenudos breves, en su extremo se ubica la yema terminal <strong>de</strong> don<strong>de</strong> brota el<br />
vástago epígeo con la inflorescencia. Las hojas cercanas al ápice tienen vaina engrosada y lámina<br />
fotosintetizante normal. Las ubicadas en la parte media han perdido la lámina, y se reducen a la<br />
vaina gruesa. Las más externas son muy <strong>de</strong>lgadas, y constituyen las vainas foliares <strong>de</strong> hojas<br />
viejas que han muerto <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la reabsorción <strong>de</strong> sus sustancias <strong>de</strong> reserva.<br />
En otros casos, el bulbo está constituido por catáfilos escamosos y reservantes que se<br />
disponen <strong>de</strong> manera imbricada, a este tipo se lo llama escamoso, por ejemplo la azucena.<br />
En las plantas con bulbo, éste permanece latente en la estación <strong>de</strong>sfavorable; al finalizar
56<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
este período se reactiva la yema, produciendo hojas y flores a expensas <strong>de</strong> las reservas<br />
almacenadas en él.<br />
En las axilas <strong>de</strong> las hojas se producen yemas, cuyas hojas también acumulan reservas en<br />
la base formando nuevos bulbos; éstos al in<strong>de</strong>pendizarse y formar raíces adventicias contribuyen<br />
a la multiplicación vegetativa <strong>de</strong> la planta.<br />
2- Tallo<br />
a- Rizoma: tallo subterráneo reservante, con crecimiento horizontal; como vive fuera <strong>de</strong><br />
la zona <strong>de</strong> la luz, carece <strong>de</strong> nomófilos u hojas propiamente dichas capaces <strong>de</strong> asimilar o<br />
transpirar; en su lugar hay catáfilos, la mayoría <strong>de</strong> las veces en forma <strong>de</strong> escamas membranosas.<br />
Posee yemas y produce vástagos folíferos y floríferos; también raíces adventicias. Podría<br />
confundirse con una raíz, difiere <strong>de</strong> ella por sus catáfilos y yemas, por no tener caliptra y<br />
principalmente por su anatomía.<br />
Durante el período <strong>de</strong>l año <strong>de</strong>sfavorable a la vegetación, en los países con inviernos fríos<br />
o con estaciones excesivamente secas, el rizoma <strong>de</strong>fien<strong>de</strong> a la planta contra los rigores <strong>de</strong>l<br />
ambiente.<br />
Figura 11: Rizoma: a, yema que dará el brote epígeo el año siguiente; b, c, d y e, cicatrices <strong>de</strong> los brotes <strong>de</strong> los años<br />
anteriores.
57<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Figura 12: Esquema <strong>de</strong> una planta rizomatosa; a, b, c las ramas floríferas que se han formado como ramas laterales,<br />
en tres años consecutivos, el eje principal continua el crecimiento monopódico.<br />
b- Tubérculos caulinares: son tallos subterráneos, engrosados en mayor o menor grado y<br />
con función <strong>de</strong> reserva. Al igual que los rizomas, presentan escamas catafílicas membranosas<br />
fugaces, o sus cicatrices. Se distinguen <strong>de</strong> dichos rizomas por su consi<strong>de</strong>rable grosor y por su<br />
crecimiento limitado. El ejemplo mejor conocido es el <strong>de</strong> la papa (Solanum tuberosum). Los<br />
tubérculos <strong>de</strong> la papa se originan en el extremo <strong>de</strong> ramas laterales subterráneas plagiótropas<br />
(estolones), éstas nacen en las axilas <strong>de</strong> las hojas inferiores <strong>de</strong>l tallo. Se produce el<br />
engrosamiento <strong>de</strong> los entrenudos terminales, se almacenan sustancias <strong>de</strong> reserva y estos<br />
tubérculos nuevos viven para multiplicar la planta madre. Las oqueda<strong>de</strong>s que se advierten<br />
distribuidas <strong>de</strong> un modo regular en todos los tubérculos, alojan yemas axilares (ojos). La planta<br />
madre muere luego <strong>de</strong> haber producido el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> los tubérculos.<br />
Los tubérculos caulinares pue<strong>de</strong>n originarse también por fuerte engrosamiento primario o<br />
secundario <strong>de</strong>l hipocótilo. Tubérculos puramente hipocotíleos se <strong>de</strong>sarrollan, por ejemplo en<br />
algunas plantas bienales como el rabanito (Raphanus sativus var. sativus) o la remolacha roja<br />
(Beta vulgaris var. conditiva); en el caso <strong>de</strong> la remolacha forrajera algo <strong>de</strong> las reservas se<br />
acumulan en la raíz (fig. 13). Un típico tubérculo caulinar, formado exclusivamente por<br />
segmentos elevados, foliosos, <strong>de</strong>l tallo, es el <strong>de</strong>l calinabo (Brassica oleracia var. gongyloi<strong>de</strong>s).<br />
Tanto el rabanito como la remolacha emplean las reservas acumuladas para la producción<br />
<strong>de</strong> flores y semillas.
Figura 13: Beta spp, remolacha, a: azucarera, b: forrajera, c: roja<br />
3– Raíz<br />
a b c<br />
58<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
a- Tubérculos radicales: los producen algunas plantas herbáceas bianuales y perennes.<br />
Con frecuencia se asemejan a los tubérculos caulinares, pero se diferencian <strong>de</strong> ellos por la falta<br />
<strong>de</strong> hojas y yemas axilares y por su estructura anatómica. Se <strong>de</strong>sarrolla por transformación <strong>de</strong><br />
raíces adventicias que <strong>de</strong>tienen su crecimiento en longitud y no <strong>de</strong>sarrollan raíces laterales.<br />
Todos los tubérculos radicales realizan la función <strong>de</strong> almacenamiento en el parénquima cortical,<br />
que está muy engrosado a consecuencia <strong>de</strong> procesos <strong>de</strong> crecimiento primario. Ejemplos: dalia<br />
(Dahlia sp) (fig. 14) y batata (Ipomea batata).
Figura 14: Tubérculos radicales <strong>de</strong> una dalia.<br />
59<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
b- Raíces napiformes: son raíces principales engrosadas total o al menos parcialmente; se<br />
encuentran en las Dicotiledóneas alorrizas. Como la mayoría <strong>de</strong> las veces, intervienen también<br />
partes variables <strong>de</strong>l hipocótilo y epicótilo, estos órganos resultan morfológicamente<br />
heterogéneos, y a pesar <strong>de</strong> su semejanza externa, pue<strong>de</strong>n presentar consi<strong>de</strong>rables diferencias en<br />
la estructura anatómica.<br />
Ejemplo <strong>de</strong> ello es la zanahoria (Daucus carota) y la remolacha azucarera, don<strong>de</strong> a<strong>de</strong>más<br />
<strong>de</strong> la raíz, el hipocótilo participa e la acumulación <strong>de</strong> reservas.<br />
GLOSARIO<br />
Epígeo: Hábito <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong> los órganos <strong>de</strong> un vegetal. Que se produce sobre la<br />
superficie <strong>de</strong> la tierra ya sea <strong>de</strong> porte aéreo o rastrero.<br />
Estípulas: Estructuras membranosas o foliosas que se suelen <strong>de</strong>sarrollar en la base <strong>de</strong> las<br />
hojas ubicándose a ambos lados <strong>de</strong>l peciolo.<br />
Haptotrópico: perteneciente o relativo al haptotropismo.<br />
Haptotropismo: conjunto <strong>de</strong> fenómenos relativos a los movimientos <strong>de</strong> orientación que<br />
realizan <strong>de</strong>terminados órganos vegetales estimulados por el contacto unilateral.<br />
Hipocótilo: Primer entrenudo, ubicado entre el cuello <strong>de</strong> la raíz y el nudo cotiledonar. Su<br />
grado <strong>de</strong> <strong>de</strong>sarrollo varia con las especies.<br />
Imbricada: Superpuesta <strong>de</strong> manera escalonada llegando a cubrirse los bor<strong>de</strong>s laterales<br />
Limbo foliar= Lámina foliar<br />
Monopólico: Sistema <strong>de</strong> ramificación <strong>de</strong> las plantas superiores, cuyas ramas se originan<br />
a partir <strong>de</strong> yemas axilares, y que se caracteriza porque la yema terminal <strong>de</strong> los tallo y ramas es
60<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
<strong>de</strong> larga duración. Las ramas más viejas (más largas) están más alejadas <strong>de</strong> estas yemas<br />
terminales.<br />
Nomófilo: Hoja normal cuya función principal es fotosíntesis y regulación <strong>de</strong> la<br />
transpiración.<br />
Plagiótropa/po: la planta o el órgano que, como consecuencia <strong>de</strong> la acción unilateral <strong>de</strong><br />
un estímulo, se coloca en posición oblicua o transversal con respecto a la dirección <strong>de</strong>l mismo.<br />
En un pino, cedro o abeto, el tronco es ortótropo pero las ramas son plagiótropas.<br />
Ortotrópo: en los fenómenos trópicos, la planta o el órgano que, como consecuencia <strong>de</strong> la<br />
acción <strong>de</strong> un estímulo unilateral, se orientan en la misma dirección <strong>de</strong>l estímulo. En el<br />
geotropismo, por Ejemplo: la raíz y el tallo <strong>de</strong> la mayoría <strong>de</strong> las plantas son órganos ortótropos,<br />
porque la dirección <strong>de</strong> la vertical <strong>de</strong>l punto en que crece.<br />
Simpódico Sistema <strong>de</strong> ramificación <strong>de</strong> las plantas superiores , cuyas ramas se originan a<br />
partir <strong>de</strong> yemas axilares, y que se caracteriza porque la yema terminal <strong>de</strong> los tallo y ramas es <strong>de</strong><br />
vida corta transformandose tempranamente en flor.<br />
Xeromorfo: aplícase a los vegetales que por su morfología externa o por su estructura<br />
están adaptados a la sequedad; como los xerófitos.
61<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Ejercicio 1<br />
Analiza la exomorfología <strong>de</strong> los siguientes vegetales, para cada uno, nombra los órganos<br />
marcados con flechas. Menciona el órgano modificado, nombre <strong>de</strong> la modificación y su función.<br />
Allium cepa L. (cebolla) en corte<br />
longitudinal<br />
Sorghum halepensis L. Pers. (sorgo <strong>de</strong> halepo)
Solanum tuberosum L. (papa)<br />
62<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong>
Flor e inflorescencias en Gramíneas<br />
63<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Las Gramíneas= Poaceas son una <strong>de</strong> las familias <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las Liliopsidas=<br />
Monocotiledóneas más importante <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l Reino Plantae. Cobran esta importancia ya que<br />
incluyen una gran cantidad <strong>de</strong> géneros <strong>de</strong> gran valor e importancia económica, como los pastos<br />
que constituyen la base <strong>de</strong> la alimentación <strong>de</strong>l ganado (Bromus, Poa, Panicum, Eragrostis, etc.)<br />
y los cereales que alimentan a la humanidad (Zea, Oryza Triticum, Avena, etc), a<strong>de</strong>más hay<br />
plantas sacaríferas, como la caña <strong>de</strong> azúcar (Saccharum), industriales (Arundo, Saccharum, etc),<br />
ornamentales (Lolium, Cynodon) oleaginosas, medicinales, aromáticas etc. Si analizamos la<br />
exomorfología y la anatomía <strong>de</strong>l cuerpo <strong>de</strong> las plantas <strong>de</strong> las diferentes especies que están<br />
incluidas en esta familia nos encontraremos que en general todas respon<strong>de</strong>n a un plan básico <strong>de</strong><br />
organización con características comunes, (con excepciones), que nos permiten i<strong>de</strong>ntificarlas,<br />
aunque no po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>sconocer que en ellas existe una prodigiosa diversidad <strong>de</strong> <strong>de</strong>licadas e<br />
interesantes estructuras.<br />
Es así como el análisis <strong>de</strong> raíces, tallos, hojas, flores y frutos, entre otros, nos pue<strong>de</strong>n<br />
indicar la pertenencia <strong>de</strong> un vegetal a esta familia.<br />
Este texto trata sobre el estudio <strong>de</strong> la flor e inflorescencias.<br />
Para po<strong>de</strong>r arribar a su estudio se <strong>de</strong>ben recordar algunos conceptos básicos.<br />
¿Qué se entien<strong>de</strong> por inflorescencia?<br />
Son inflorescencias aquellos sistemas <strong>de</strong> ramas que están <strong>de</strong>stinados a la formación <strong>de</strong><br />
flores y se hallan metamorfoseados (modificados) en relación a su especialización.<br />
¿Qué Elementos constituyen una inflorescencia?<br />
Una inflorescencia consta <strong>de</strong>: un eje principal, el raquis con hipsófilos llamados brácteas.<br />
En la axila <strong>de</strong> cada bráctea nacen flores sostenidas o no por un pedicelo, o bien ramificaciones<br />
con flores que constituyen inflorescencias parciales. Toda la inflorescencia está sostenida por un<br />
pedúndulo.<br />
¿Cómo se clasifican las inflorescencias?<br />
A- Inflorescencias simples y complejas<br />
En las inflorescencias simples cada rama lateral <strong>de</strong>l eje principal forma una sola flor.<br />
En las inflorescencias complejas, el eje principal produce inflorescencias parciales<br />
provistas <strong>de</strong> un mayor o menor número <strong>de</strong> flores.<br />
B- Inflorescencias cerradas y abiertas<br />
En las inflorescencias cerradas tanto el eje principal, como el <strong>de</strong> las inflorescencias
64<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
parciales acaban en flores terminales. Estas flores se reconocen claramente porque se abren antes<br />
que las flores laterales inmediatas.<br />
En las inflorescencias abiertas, en cambio, el eje principal y sus ramas laterales <strong>de</strong><br />
primer or<strong>de</strong>n <strong>de</strong>tienen su crecimiento <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> un cierto tiempo, pero no concluyen en una flor<br />
terminal; en otras palabras quedan teóricamente abiertos.<br />
C- Inflorescencias racemosas y cimosas<br />
Las inflorescencias racemosas son abiertas, y las cimosas son cerradas.<br />
flor e Inflorescencia <strong>de</strong> gramineas<br />
Previo al análisis <strong>de</strong> las inflorescencias, i<strong>de</strong>ntificaremos como está constituida la flor.<br />
En las Gramíneas la flor pue<strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rarse como una forma extremadamente reducida <strong>de</strong>l tipo<br />
básico <strong>de</strong> una Monocotiledónea adaptada a la anemofilia (fig. 1).<br />
Figura 1: Flor <strong>de</strong> Gramínea.<br />
Consta <strong>de</strong> los verticilos fértiles y <strong>de</strong> un perianto rudimentario, las glumélulas. En general<br />
son perfectas, (es <strong>de</strong>cir presentan androceo y gineceo), en el arroz por ejemplo tienen androceo<br />
con seis estambres y un gineceo, pero en diversos géneros son imperfectas, (es <strong>de</strong>cir que<br />
presentan un androceo o un gineceo), en el maíz por ejemplo en la misma planta se encuentran<br />
flores estaminadas y carpeladas.<br />
El perianto está constituido por las lodículas o glumélulas. Son dos pequeñas<br />
formaciones, membranosas dispuestas a los lados <strong>de</strong>l ovario.<br />
Cada flor está protegida por un par <strong>de</strong> glumelas (brácteas estériles) que constituyen la<br />
casilla o Antecio floral.
Inflorescencia<br />
65<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Salvo muy raras excepciones, las inflorescencias <strong>de</strong> las Gramíneas son compuestas. La<br />
inflorescencia parcial o elemental es la espiguilla y las totales son panojas o espigas <strong>de</strong><br />
espiguillas.<br />
Espiguilla o Espícula (= espiguita, fig. 2)<br />
Figura 2: Espiguilla (inflorescencia elemental).<br />
La espiguilla representa la inflorescencia parcial o elemental <strong>de</strong> las Gramíneas (fig. 2);<br />
consta <strong>de</strong> un pequeño eje, la raquilla, <strong>de</strong> longitud variable, que soporta las flores. La totalidad <strong>de</strong><br />
la espiguilla está protegida por dos brácteas estériles <strong>de</strong>nominadas glumas, cada flor <strong>de</strong> la<br />
espiguilla se encuentra protegida por las glumelas.<br />
El número <strong>de</strong> flores <strong>de</strong> cada espiguilla es variable según los diversos grupos; se<br />
distinguen:<br />
• Espiguillas plurifloras: poseen dos o más flores (Avena, Bromus).<br />
• Espiguillas unifloras: constan <strong>de</strong> una sola flor ( arroz, maíz);.<br />
Las inflorescencias compuestas respon<strong>de</strong>n a dos tipos principales:<br />
A- Panoja: cada espiguilla está sostenida por un pedicelo <strong>de</strong> longitud variable, originando varias<br />
formas diferentes (fig 3).
Figura 3: Panoja laxa (A) y <strong>de</strong>nsa (B).<br />
66<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
• Panoja laxa: las ramas y pedicelos son alargados y las espiguillas un tanto separadas<br />
entre sí (ej. Avena byzantina, Poa annua, oriza sativa).<br />
• Panoja <strong>de</strong>nsa: las ramificaciones y pedicelos son cortos y las espiguillas están<br />
apretadas junto al raquis principal (ej. Phleum, Alopecurus).<br />
B- Espiga compuesta: las espiguillas están sostenidas sobre el raquis o sostenidas por un<br />
brevísismo pedicelo (fig 4).<br />
Existen tres tipos:<br />
• Espigas unilaterales: las espiguillas están dispuestas en dos o más rangos hacia un<br />
solo lado <strong>de</strong>l raquis. Es posible distinguir las que tienen raquis articulado y las que<br />
tienen raquis continuo y tenaz (ej. Cloris).<br />
• Espigas dísticas: las espiguillas están or<strong>de</strong>nadas en dos series opuestas y alternas a lo<br />
largo <strong>de</strong>l raquis articulado (ej. Triticum).<br />
• Espigas cilíndricas: las espiguillas se disponen en varios rangos sobre el raquis,<br />
generalmente ensanchado (ej. Zea).
Figura 4: Espiga unilateral (A), dísticas (B y C) y cilíndrica (D).<br />
67<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Ejercicio (pregunta extraída <strong>de</strong>l cua<strong>de</strong>rnillo <strong>de</strong> entrenamientos correspondiente a la XII OAB)<br />
La diversidad <strong>de</strong> disposición <strong>de</strong> las flores sobre las ramas <strong>de</strong> las plantas o la extremidad <strong>de</strong>l tallo<br />
(inflorescencia) es enorme. Los esquemas <strong>de</strong> abajo representan algunas <strong>de</strong> ellas. Señala si las<br />
mismas son inflorescencias simples o complejas y busca un ejemplo para cada una.
Bibliografía consultada:<br />
68<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia<br />
<strong>de</strong> la <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.<br />
STRARBURGER, E.; F. NOLL; H. SCHENCK y A. SCHIMPER. 1994. Tratado <strong>de</strong><br />
Botánica. Ed. Omega. 8va. ed.
Tópico: Etología, Ecología y Evolución<br />
Teorías taxonómicas<br />
69<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Una teoría taxonómica establece los principios que rigen el recocimiento y la<br />
jerarquización <strong>de</strong> grupos taxonómicos. Actualmente hay dos corrientes más populares,<br />
la taxonomía evolutiva tradicional y la sistemática filogenética (cladismo), ambas<br />
difieren en el modo <strong>de</strong> utilización <strong>de</strong> los principios evolutivos.<br />
La relación entre los grupos taxonómicos pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong> tres formas:<br />
monofiletismo, parafiletismo y polifiletismo. En el primer caso un grupo monofilético<br />
(A) contiene al antecesor común más reciente <strong>de</strong> todos los miembros <strong>de</strong>l grupo y a sus<br />
<strong>de</strong>scendientes.<br />
Un grupo parafilético (B) contiene al antecesor común más reciente pero no a los<br />
<strong>de</strong>scendientes. Y un grupo polifilético (C) no contiene al antecesor común más<br />
reciente, lo que implica más <strong>de</strong> un origen filogenético <strong>de</strong>l grupo.<br />
Sistemática filogenética cladística<br />
Los sistemáticos usan el llamado método cladístico para encontrar relaciones<br />
evolutivas. Los organismos son <strong>de</strong>scriptos primero en términos <strong>de</strong> caracteres<br />
específicos, un carácter ancestral, es aquel que se encuentra presente en el<br />
antecesor común, en tanto que las formas <strong>de</strong>l carácter que evolucionaron más tar<strong>de</strong><br />
son los estados <strong>de</strong>rivados. La presencia <strong>de</strong> los mismos en las especies indica que
70<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
pue<strong>de</strong>n existir relaciones entre ellas; sin embargo las similitu<strong>de</strong>s compartidas podrían<br />
ser el resultado <strong>de</strong> una evolución convergente y llevar a conclusiones erróneas al<br />
intentar reconstruir las relaciones evolutivas <strong>de</strong>l grupo estudiado.<br />
Sólo las similitu<strong>de</strong>s que son <strong>de</strong>bidas a una <strong>de</strong>scen<strong>de</strong>ncia común pue<strong>de</strong>n ser<br />
verda<strong>de</strong>ros indicadores <strong>de</strong> relaciones, porque podrían ser el resultado <strong>de</strong> <strong>de</strong>scen<strong>de</strong>r <strong>de</strong><br />
un ancestro, pero por sí solas no dicen nada sobre los patrones <strong>de</strong> ramificación<br />
evolutiva a partir <strong>de</strong> este ancestro.<br />
Para distinguir los caracteres primitivos <strong>de</strong> los que han evolucionado<br />
recientemente, el análisis cladista usa el concepto <strong>de</strong> comparación <strong>de</strong> grupos externos.<br />
Un grupo externo es aquel conjunto <strong>de</strong> organismos que se encuentra relacionado al<br />
estudiado, pero no incluido en el mismo. Con esto se pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>ducir que cualquier<br />
estado <strong>de</strong> un carácter que se encuentre tanto en el grupo en estudio como en el<br />
externo, es un carácter ancestral en tanto que los estados <strong>de</strong>l carácter que no<br />
aparezcan en el grupo externo serán <strong>de</strong>rivados.<br />
Los organismos que comparten estados <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> un carácter constituyen<br />
subconjuntos internos <strong>de</strong>l grupo <strong>de</strong>nominados clados (klados= rama). Así un carácter<br />
<strong>de</strong>rivado, compartido por los miembros <strong>de</strong>l clado es una sinapomorfía, en tanto que si<br />
es sólo <strong>de</strong> uno <strong>de</strong> estos miembros se <strong>de</strong>nomina autopomorfía.<br />
De la asociación jerárquica <strong>de</strong> clados, en la cual algunos quedarán incluidos en<br />
otros surgen esquemas ramificados <strong>de</strong>nominados cladogramas. El mejor cladograma<br />
es aquel en el cual el patrón <strong>de</strong> ramas refleja más claramente la distribución <strong>de</strong><br />
caracteres entre los organismos y el menor número <strong>de</strong> cambios in<strong>de</strong>pendientes.
anfioxo carpa lagarto caballo mono<br />
71<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
- pelo, glándulas mamarias<br />
- cuatro patas, huevo amniota<br />
- vértebras, mandíbulas<br />
Figura: Se presenta un cladograma en el cual, el anfioxo es el grupo externo, y el<br />
grupo en estudio compren<strong>de</strong> cuatro vertebrados (carpa, lagarto, caballo y mono). Para<br />
generar este cladograma se han utilizado cuatro caracteres que varían entre los<br />
vertebrados: la presencia o ausencia <strong>de</strong> cuatro extremida<strong>de</strong>s, huevos amnióticos, pelo<br />
y glándulas mamarias. Para todos estos caracteres, la ausencia es el estado ancestral<br />
porque es la condición que aparece en el grupo externo (anfioxo); por lo tanto la<br />
presencia es el estado <strong>de</strong>rivado.<br />
La posesión <strong>de</strong> cuatro extremida<strong>de</strong>s y <strong>de</strong> huevos amniotas permiten que el<br />
lagarto, el caballo y el mono (recuadro) formen un clado “pariente” <strong>de</strong> la carpa. Este<br />
clado se subdivi<strong>de</strong> posteriormente por la presencia <strong>de</strong> pelo y <strong>de</strong> glándulas mamarias,<br />
que reúnen al caballo y mono (óvalo) frente al lagarto.<br />
Por comparación con animales más alejados se conoce que la presencia <strong>de</strong><br />
vértebras y mandíbulas constituyen sinapomorfías <strong>de</strong> los vertebrados; así el anfioxo<br />
que carece <strong>de</strong> tales caracteres queda fuera <strong>de</strong>l clado <strong>de</strong> los vertebrados (recuadro<br />
punteado) y pue<strong>de</strong> ser usado como grupo externo. (Hickman et al, 2002)
Ejercicio 3<br />
72<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
* Analizando el cladograma <strong>de</strong>scripto anteriormente, i<strong>de</strong>ntificar las sinapomorfías<br />
correspondientes a cada clado.<br />
* ¿Cuántos clados hay en el ejemplo?<br />
* Mencionar alguna autopomorfía para el grupo <strong>de</strong> mono y <strong>de</strong> caballo.<br />
* ¿La carpa, lagarto, mono y caballo formarán un grupo mono, para ó polifilético?<br />
Justificar la respuesta.<br />
Ecología <strong>de</strong>l comportamiento<br />
La ecología <strong>de</strong>l comportamiento se ocupa <strong>de</strong> analizar cómo los animales toman<br />
“<strong>de</strong>cisiones “ que influyen sobre su supervivencia y su éxito reproductivo.<br />
Los animales <strong>de</strong>ci<strong>de</strong>n dón<strong>de</strong> llevar a<strong>de</strong>lante sus activida<strong>de</strong>s y cómo seleccionar<br />
los recursos que necesitan (alimento, agua, protección, sitios <strong>de</strong> nidificación). Los<br />
animales también respon<strong>de</strong>n a los predadores y competidores y <strong>de</strong>ci<strong>de</strong>n cómo<br />
interactuar con otros miembros <strong>de</strong> su propia especie. Las elecciones individuales son<br />
fundacionales <strong>de</strong> gran parte <strong>de</strong> la ecología porque los cambios en <strong>de</strong>nsida<strong>de</strong>s y<br />
distribuciones <strong>de</strong> las poblaciones son el resultado acumulativo <strong>de</strong> las <strong>de</strong>cisiones <strong>de</strong><br />
innumerable individuos. Es <strong>de</strong>cir que a lo largo <strong>de</strong> muchas generaciones la selección<br />
natural ha mol<strong>de</strong>ado el comportamiento <strong>de</strong> manera acor<strong>de</strong> con los costos y beneficios.<br />
El costo <strong>de</strong>l comportamiento posee tres componentes. El energético, que resulta<br />
<strong>de</strong> la diferencia entre la energía que el animal hubiera invertido en <strong>de</strong>scanso y la<br />
invertida en realizar este comportamiento. El costo <strong>de</strong>l riesgo, que correspon<strong>de</strong> al<br />
incremento en la probabilidad <strong>de</strong> ser dañado o muerto por haber ese comportamiento,<br />
comparado con el <strong>de</strong>scanso. Y el costo <strong>de</strong> oportunidad <strong>de</strong> un comportamiento es la<br />
suma <strong>de</strong> los beneficios que el animal pier<strong>de</strong> por no haber realizado otros<br />
comportamiento durante el mismo intervalo <strong>de</strong> tiempo. Estos costos mi<strong>de</strong>n la eficacia<br />
involucrada en realizar comportamientos diferentes durante cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> tiempo<br />
diferentes.<br />
Un ejemplo <strong>de</strong>l estudio <strong>de</strong> estos costos es el que sigue: Se observó que durante<br />
la estación reproductiva (abril- marzo), los machos <strong>de</strong> una lagartija mantienen territorios<br />
<strong>de</strong> los cuales excluyen a los machos <strong>de</strong> la misma especie. Se evaluó el costo <strong>de</strong> este
73<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
comportamiento estimulando el comportamiento territorial tres meses antes <strong>de</strong> la<br />
estación reproductiva (enero-febrero), cuando este comportamiento es poco visible.<br />
Para lograrlo insertaron pequeñas cápsulas que contenían testosterona <strong>de</strong>bajo <strong>de</strong> la<br />
piel. Los machos control también fueron capturados y liberados sin recibir el implante.<br />
Al observarlos se <strong>de</strong>tectó que los machos implantados patrullaban más sus<br />
territorios, realizando más <strong>de</strong>spliegues <strong>de</strong> amenazas que los control, quienes ocupaban<br />
más tiempo en alimentarse. Por lo tanto los primeros que capturaban menos insectos,<br />
acumulaban menos energía y murieron en mayor número en los meses siguientes.<br />
Esto <strong>de</strong>mostró que quienes presentan un comportamiento territorial en el verano<br />
mueren en mayor porcentaje que quienes no lo presentan y que este comportamiento<br />
aparece cuando la hembra es receptiva para lograr el mayor éxito reproductivo, siendo<br />
este beneficio mayor que los costos que <strong>de</strong>manda este comportamiento. (Purves et al,<br />
2003)<br />
Ejercicio 4<br />
* Analizando el ejemplo antes expuesto, indicar, en qué parte <strong>de</strong>l párrafo se refleja el<br />
costo energético, el costo <strong>de</strong> oportunidad y el costo <strong>de</strong> riesgo consi<strong>de</strong>rados en el<br />
comportamiento territorial.<br />
Correlación temporal <strong>de</strong>l comportamiento: Ritmos biológicos<br />
Entre las causas próximas <strong>de</strong>l comportamiento están aquellos que <strong>de</strong>terminan<br />
su organización a través <strong>de</strong>l tiempo. Los estudios sobre esta correlación temporal<br />
permitieron <strong>de</strong>scubrir los mecanismos encefálicos y hasta el nivel molecular que<br />
permiten a los animales organizar su comportamiento en el tiempo.<br />
Dentro <strong>de</strong> los ritmos biológicos se conocen a los diarios, mensuales y anuales.<br />
En muchos animales, incluyendo al hombre los períodos <strong>de</strong> actividad y sueño,<br />
alimentación e ingestión <strong>de</strong> agua, fluctuación <strong>de</strong> la temperatura corporal y secreción <strong>de</strong><br />
algunas hormonas tienen ciclos que parecen seguir un ritmo interno. Estas activida<strong>de</strong>s<br />
rítmicas diarias son ritmos circadianos que significa “aproximadamente un día”. Esto<br />
sugiere que los animales poseen relojes biológicos ajustados o reprogramados con<br />
precisión por indicios ambientales.
74<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Parece ser que el comportamiento <strong>de</strong> muchos animales o las activida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> una<br />
planta está organizado en torno a ritmos circadianos, así existen animales diurnos<br />
como las abejas, crepusculares como los mosquitos, y nocturnos como los<br />
murciélagos; éstos presentan su máxima actividad en esos momentos <strong>de</strong>l día<br />
Algunos ciclos biológicos reflejan el ciclo lunar, esto es notable en los<br />
organismos marinos que se sincronizan con los cambios en las mareas y las fases <strong>de</strong><br />
la luna. Por ejemplo una combinación <strong>de</strong> ciclos <strong>de</strong> marea, lunares y anuales rige el<br />
comportamiento reproductivo <strong>de</strong>l “gronio”, un pequeño pez <strong>de</strong>l Pacífico. Éste forma<br />
gran<strong>de</strong>s cardúmenes <strong>de</strong> abril a junio, durante tres o cuatro noches en que se presentan<br />
las mareas más altas <strong>de</strong>l año. En el punto más alto <strong>de</strong> la marea los peces salen <strong>de</strong>l<br />
mar, <strong>de</strong>positan óvulos y espermatozoi<strong>de</strong>s en la arena <strong>de</strong> la playa y regresan al mar con<br />
la siguiente ola. Cuando la siguiente marea alta llega a esa porción <strong>de</strong> la playa, unos 15<br />
días <strong>de</strong>spués, los pececillos han hecho eclosión en la arena y están listos para ir al<br />
mar. Este ejemplo reafirma la i<strong>de</strong>a que en condiciones normales, los procesos<br />
metabólicos <strong>de</strong> un organismo y su comportamiento están sincronizados con los<br />
cambios cíclicos <strong>de</strong>l ambiente externo, <strong>de</strong> modo que su comportamiento pue<strong>de</strong><br />
anticipar esos cambios regulares.<br />
Al parecer muchos ritmos biológicos son regulados por mecanismos <strong>de</strong><br />
cronometraje internos que actúan como relojes biológicos. Los datos disponibles hacen<br />
pensar que casi ningún organismo tiene un solo reloj biológico, sino que la interacción<br />
<strong>de</strong> varios procesos bioquímicos podrían encargarse <strong>de</strong> regir los ritmos fisiológicos y<br />
conductuales.<br />
Migraciones: Proceso en el que interactúan los ritmos biológicos, la fisiología y<br />
el ambiente.<br />
La migración es el <strong>de</strong>splazamiento periódico a larga distancia y es una<br />
adaptación al cambio ambiental.<br />
La pregunta que surge en primera instancia es ¿Por qué migran los animales? Al<br />
parecer las causas últimas <strong>de</strong> la migración tiene que ver con las ventajas <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>splazarse <strong>de</strong> una zona cuya estación se torna menos hospitalaria a una región más<br />
propicia para la reproducción o supervivencia.<br />
Algunos animales migran al madurar, en otros, <strong>de</strong>terminados indicios
75<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
ambientales activan reacciones fisiológicas que inducen la migración. En las aves<br />
migratorias, pro ejemplo, la glándula pineal percibe cambios en la duración <strong>de</strong>l día<br />
entonces libera hormonas que provocan un comportamiento inquieto característico, el<br />
ave muestra una creciente disposición a volar, haciéndolo por períodos cada vez más<br />
largos.<br />
Al analizar este comportamiento <strong>de</strong>ben consi<strong>de</strong>rarse los siguientes aspectos:<br />
*orientación direccional: se refiere al viaje en una dirección específica.<br />
*sentido <strong>de</strong> orientación: se refiere a dirigirse a un <strong>de</strong>stino en línea recta.<br />
*Navegación: Proceso que implica integrar información <strong>de</strong> distancia y tiempo y<br />
dirección para arribar al <strong>de</strong>stino específico. Es <strong>de</strong>cir que <strong>de</strong>ben tener el sentido <strong>de</strong> la<br />
orientación como el cartográfico (“conciencia” <strong>de</strong> la ubicación).<br />
Los sentidos <strong>de</strong> orientación que usan los animales son variados, en muchos casos es<br />
el sol, también pue<strong>de</strong>n ser los olores, el campo magnético terrestre o las<br />
constelaciones.<br />
El comportamiento <strong>de</strong> pastoreo eficiente contribuye a la supervivencia<br />
El comportamiento <strong>de</strong> alimentación o pastoreo consiste en localizar y seleccionar<br />
el alimento, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> colectarlo y capturarlo. Algunos ecólogos conductuales<br />
estudian los costos y beneficios <strong>de</strong> la búsqueda y selección <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminados tipos <strong>de</strong><br />
alimentos, así como mecanismos empleados para localizar a las presas. Por ejemplo<br />
han surgido, por evolución muchas estrategias <strong>de</strong> camuflaje que hacen a las presas<br />
difíciles <strong>de</strong> <strong>de</strong>tectar. Se piensa que conforme los predadores experimentan éxito<br />
repetido en al localización <strong>de</strong> una presa específica, <strong>de</strong>sarrollan una imagen <strong>de</strong><br />
búsqueda, es <strong>de</strong>cir un conjunto <strong>de</strong> indicios que ayudan a i<strong>de</strong>ntificar presas ocultas.<br />
Cuando un organismo obtiene la mayor eficiencia en buscar y lograr un alimento se<br />
habla <strong>de</strong> pastoreo óptimo dado que cuando se maximiza la energía obtenida por unidad<br />
<strong>de</strong> tiempo <strong>de</strong> pastoreo, se maximiza el éxito reproductivo.<br />
El pastoreo es afectado por factores como la abundancia o escasez <strong>de</strong>l alimento<br />
y la presencia <strong>de</strong> predadores. Esto se evi<strong>de</strong>ncia porque en ambientes con abundancia<br />
<strong>de</strong> alimento el organismo pue<strong>de</strong> ser selectivo y la estrategia óptima sería invertir tiempo<br />
en encontrar la mejor presa, en tanto que en ambientes pobres, don<strong>de</strong> este tiempo
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Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
sería mayor, la estrategia óptima sería seleccionar una mayor variedad <strong>de</strong> alimentos.<br />
Los animales pue<strong>de</strong>n apren<strong>de</strong>n a pastorear <strong>de</strong> manera eficiente a través <strong>de</strong><br />
condicionamiento operante, esto es ensayando al azar diversas estrategias y<br />
seleccionando la que conlleva las mayores recompensas.<br />
El riesgo <strong>de</strong> los predadores influye sobre la estrategia <strong>de</strong> pastoreo, <strong>de</strong> tal<br />
manera que en oportunida<strong>de</strong>s extremas la presión selectiva parece ser más fuerte<br />
sobre el cuidado <strong>de</strong> la prole cachorros y la <strong>de</strong>fensa <strong>de</strong> un territorio contra organismos<br />
extraños que hacia el pastoreo óptimo<br />
Ejemplo <strong>de</strong> la influencia <strong>de</strong> los factores mencionado son los leones, los cuales<br />
pastorean en manadas (unida<strong>de</strong>s sociales en las que suele haber algunas hembras,<br />
cachorros y machos no emparentados) y utilizan diferentes estrategias según la<br />
situación: En caso <strong>de</strong> abundancia <strong>de</strong> alimento cazan en grupos pequeños, gran<strong>de</strong>s o<br />
solos; pero cuando es escaso lo hacen en grupos lo más gran<strong>de</strong>s posibles,<br />
disminuyendo la ganancia <strong>de</strong> energía por el alimento obtenido, pero protegiendo a sus<br />
cachorros <strong>de</strong> predadores y competidores. (Solomon et al, 1999)<br />
Ejercicio 5<br />
Analiza la situación problemática presentada en el cua<strong>de</strong>rnillo <strong>de</strong> entrenamiento XIII<br />
OAB, edición 2005, ejercicio Nº 145.<br />
Bibliografía consultada:<br />
CURTIS, H. y S. BARNES 2000. <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.<br />
HICKMAN, C., L. ROBERTS y A. PARSON. 2002. Principios integrales <strong>de</strong> Zoología.<br />
Ed. Mc Graw Hill Interamericana 11ma. ed.<br />
NOVIKOFF, M. M. 1976. Fundamentos <strong>de</strong> la morfología comparada <strong>de</strong> los<br />
invertebrados. Editorial Universitaria <strong>de</strong> Buenos Aires)<br />
PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La ciencia<br />
<strong>de</strong> la <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.<br />
RICKLEFF, R.E. 1998. Invitación a la Ecología. Ed. Médica Panamericana. 4ta. ed.<br />
SOLOMON, E. P; L. R. BERG y D. W. MARTIN, 1999. <strong>Biología</strong>. Ed. Mc Graw Hill<br />
Interamericana 5ta. ed.
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Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
ALGUNAS DESTREZAS PRÁCTICAS
MÉTODOS BIOLÓGICOS<br />
*PREPARACIÓN PARA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO<br />
ACTIVIDAD: OBSERVACIÓN DE COLONIAS DE BACTERIAS.<br />
Introducción<br />
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Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Las bacterias son organismos unicelulares <strong>de</strong> los Reinos Eubacteria y Archaeobacteria, en<br />
general las que se observarán en un práctico <strong>de</strong> este tipo serán <strong>de</strong>l primer Reino mencionado.<br />
Crecen en medios sencillos con nutrientes básicos por lo cual es posible observar su <strong>de</strong>sarrollo<br />
en todos los ambientes conocidos.<br />
Materiales: cápsulas <strong>de</strong> Petri- agar-agar o gelatina sin sabor- hansa- una papa- una cuchara <strong>de</strong> téazúcar-<br />
½ litro <strong>de</strong> agua- tapón <strong>de</strong> goma- elermeyer gran<strong>de</strong> o frasco <strong>de</strong> vidrio con tapa- embudopapel<br />
<strong>de</strong> filtro- trípo<strong>de</strong>- mechero- varilla <strong>de</strong> vidrio- jarra metálica- trapo o manopla- diferentes<br />
fuentes <strong>de</strong> bacterias (cultivo líquido- saliva, roce <strong>de</strong> manos, granos <strong>de</strong> tierra, agua estancada por<br />
más <strong>de</strong> 5 días, etc.)- hansa- porta y cubreobjeto-microscopio.<br />
Preparación <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong> cultivo sólido<br />
1) Esterilización <strong>de</strong>l material <strong>de</strong> vidrio<br />
Todo el material <strong>de</strong> vidrio <strong>de</strong>be ser lavado con <strong>de</strong>tergente, enjuagado muy bien y puesto a secar<br />
en un horno a gas o microondas, envuelto en papel metalizado o plástico adherente<br />
respectivamente y una vez frío se guarda en la hela<strong>de</strong>ra hasta el momento <strong>de</strong> ser utilizado.
2) Medio <strong>de</strong> cultivo nutritivo<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Preparar en una jarra metálica un caldo, hirviendo <strong>de</strong> 20 a 30 minutos una papa en ½ litro <strong>de</strong><br />
agua, luego agregar una cucharada <strong>de</strong> azúcar y filtrar esta preparación en un elermeyer.<br />
Nota: Si no se usa inmediatamente, se guarda en la hela<strong>de</strong>ra sellado con un tapón <strong>de</strong> goma. (con<br />
esta cantidad se pue<strong>de</strong>n preparar unas 7 cápsulas <strong>de</strong> Petri).<br />
*Colocar nuevamente la preparación sobre el fuego, agregar una cucharada <strong>de</strong> agar-agar o<br />
gelatina sin sabor y revolver suavemente con la varilla <strong>de</strong> vidrio para que se disuelva<br />
completamente.<br />
3) Preparación <strong>de</strong> las placas<br />
*Antes <strong>de</strong> comenzar a trabajar se <strong>de</strong>ben limpiar las mesadas con alcohol, se encien<strong>de</strong> el mechero<br />
y se lo <strong>de</strong>ja en el lugar <strong>de</strong> trabajo.<br />
*Desenvolver las cápsulas y verter el caldo <strong>de</strong> cultivo hasta la mitad, tratando <strong>de</strong> levantar los<br />
menos posible la tapa, tapar rápidamente y esperar a que solidifique.<br />
Importante: Al preparar las placas se <strong>de</strong>be trabajar próximo al mechero para mantener las<br />
condiciones <strong>de</strong> esterilidad. Si las placas no se usan <strong>de</strong> inmediato pue<strong>de</strong>n guardarse en la<br />
hela<strong>de</strong>ra.<br />
4) Sembrado<br />
*Antes <strong>de</strong> comenzar la siembra, también se <strong>de</strong>ben limpiar las mesadas con alcohol, se <strong>de</strong>be<br />
encen<strong>de</strong>r el mechero y <strong>de</strong>jarlo en el lugar <strong>de</strong> trabajo.<br />
* En general se siembra con hansa, palillo o espátula <strong>de</strong> Drigalsky.<br />
1- Esterilizar el hansa en el fuego (Fig. 1. 1), enfriarla sobre las pare<strong>de</strong>s <strong>de</strong> la cápsula antes <strong>de</strong><br />
sembrar.<br />
2- Tomar la muestra con el hansa y pasarla sobre el agar en zigzag con movimientos suaves (Fig.<br />
1. 2 y Fig. 2).<br />
Recomendación: Levantar la tapa <strong>de</strong> la cápsula lo menos posible para evitar contaminaciones y<br />
trabajar siempre al lado <strong>de</strong>l mechero.<br />
79
80<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Importante: El hansa pue<strong>de</strong> prepararse con el tubo <strong>de</strong> un bolígrafo vacío y un alambre fino<br />
doblado formando un rulo.<br />
Fig. 1: esterilización (1) y sembrado (2)<br />
Fig. 2: Sembrado<br />
3- Dejar las cápsulas bien tapadas a temperatura ambiente. Si se contara con una estufa a 36º C<br />
se las coloca <strong>de</strong>ntro para acelerar el crecimiento bacteriano. En cualquier caso, las cápsulas no<br />
<strong>de</strong>ben abrirse para evitar la contaminación por hongos.<br />
5) Observación<br />
palillo<br />
1- Extraer con el hansa, una pequeña porción <strong>de</strong> una colonia bacteriana y colocarla en un<br />
portaobjetos, luego agregarle una gota <strong>de</strong> agua taparlo con un cubreobjetos (ver fig. 3: montaje).<br />
2- Para mejorar la visualización, pue<strong>de</strong> teñirse con azul <strong>de</strong> metileno.<br />
a) Se coloca sobre el portaobjetos una gota <strong>de</strong> agua.<br />
b) Con un hansa estéril (pasando 2 ó 3 veces por el mechero) se toma una colonia <strong>de</strong><br />
hansa<br />
Espátula <strong>de</strong> Drigalsky
81<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
bacterias <strong>de</strong> la placa y se pasa sobre una gota <strong>de</strong> agua tratando que la misma se extienda bien<br />
sobre el portaobjetos.<br />
c) Se coloca sobre el extendido unas gotas <strong>de</strong> azul <strong>de</strong> metileno, se <strong>de</strong>ja <strong>de</strong>scansar un minuto y<br />
luego se enjuaga. Se repite esta operación y luego se coloca el cubreobjetos.<br />
d) Se lleva al microscopio para su observación.<br />
ACTIVIDAD: OBSERVACIÓN DE DIVERSIDAD DE PROTOZOOS AL<br />
MICROSCOPIO.<br />
Materiales: Cultivo <strong>de</strong> protozoos- portaobjetos- cubreobjetos- pipeta Pasteur- pinza- papel tisú.<br />
Cultivo <strong>de</strong> Protozoos<br />
Los protozoos son organismos unicelulares que pertenecen al Reino Protista, por lo tanto<br />
son eucariotas. Según su rol ecológico algunos son heterótrofos y otros autótrofos.<br />
Estos organismos se <strong>de</strong>sarrollan en diferentes medios, uno <strong>de</strong> ellos, el acuático. Por esto<br />
es posible observarlos en lugares con agua estancada <strong>de</strong> pocos días, por. ej. en floreros.<br />
Si no se contara con esos medios, pue<strong>de</strong> prepararse uno, colocando agua en un recipiente<br />
al que se le agregan alguno <strong>de</strong> los siguientes materiales: pequeñas hojas secas, porciones <strong>de</strong><br />
tierra, granos <strong>de</strong> arroz o <strong>de</strong> trigo. Se los <strong>de</strong>ja unos días (4 ó 5) y luego se observan al<br />
microscopio.<br />
Importante: No <strong>de</strong>jar más días porque estos organismos consumen el oxígeno <strong>de</strong>l agua y mueren,<br />
si se los <strong>de</strong>jara más días se <strong>de</strong>be mantener el cultivo, agregando un poco <strong>de</strong> agua potable o <strong>de</strong><br />
lluvia.<br />
Montaje<br />
1- Con una pipeta Pasteur se extrae agua <strong>de</strong>l recipiente, buscando el fondo o rozando los palitos<br />
u hojas que hubiera en el medio.<br />
2- Se prepara un portaobjetos y se le coloca una gota <strong>de</strong>l líquido extraído (a), luego se coloca el<br />
cubreobjetos con la pinza o mano tratando que no que<strong>de</strong> burbujas <strong>de</strong> aire (b y c), ver fig. 3.
82<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Fig. 3<br />
3- Llevar al microscopio y observar, algunos <strong>de</strong> los ejemplares que pue<strong>de</strong>n aparecer se muestran<br />
en la fig. 4.<br />
Fig. 4<br />
4- Si bien no se observarán como en las figuras, los movimientos permitirán <strong>de</strong>terminar qué tipo<br />
<strong>de</strong> estructura <strong>de</strong> movilidad presentan (pseudópodos, cilios, flagelos).
83<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
*PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS PARA OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO<br />
ACTIVIDAD: EXTRACCIÓN Y OBSERVACIÓN DE EPIDERMIS.<br />
Materiales: hoja- hoja <strong>de</strong> bisturí o afeitar- pinza- portaobjetos- cubreobjetos- microscopio-papel<br />
tisú.<br />
Procedimiento<br />
1- Se toma la hoja y se practica un pequeño corte que pue<strong>de</strong> ser en forma <strong>de</strong> V en el órgano en<br />
estudio, luego se toma uno <strong>de</strong> los bor<strong>de</strong>s y se levante <strong>de</strong>slizándolo cuidadosamente y tratando <strong>de</strong><br />
separar la epi<strong>de</strong>rmis <strong>de</strong> los tejidos subepidérmicos (fig. 5). También pue<strong>de</strong> cortarse como se<br />
muestra en la fig. 6<br />
2- El trozo obtenido se monta sobre un portaobjetos con unas gotas <strong>de</strong> agua, orientando la<br />
cutícula hacia arriba para esto pue<strong>de</strong> ayudarse con una pinza (Fig. 6.3).<br />
3- Se coloca el cubreobjetos quedando el preparado listo para su observación (Fig. 6.4). Pue<strong>de</strong><br />
secarse los bor<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l cubre objetos con un papel tisú. (Fig. 6.5)<br />
Fig. 5<br />
Vaina <strong>de</strong> cebolla
Fig. 6<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
4- Observar al microscopio y realizar un dibujo <strong>de</strong>tallado <strong>de</strong> un estoma y las diversas células <strong>de</strong><br />
la epi<strong>de</strong>rmis.<br />
Importante: Generalmente se extrae epi<strong>de</strong>rmis <strong>de</strong> la cara abaxial <strong>de</strong> las hojas, en don<strong>de</strong> los<br />
estomas son más abundantes.<br />
Actividad: Observación <strong>de</strong> epi<strong>de</strong>rmis mediante la técnica <strong>de</strong> improntas<br />
Materiales: hoja- esmalte transparente- portaobjetos- cubreobjetos- pinza- microscopio.<br />
Procedimiento<br />
Gota <strong>de</strong> agua<br />
1- Seleccionar una hoja pequeña y con buena coloración y estructura.<br />
2- Colocar una capa <strong>de</strong> esmalte sobre uno <strong>de</strong> los lados <strong>de</strong> la hoja, extendiéndola rápidamente y<br />
<strong>de</strong>jar secar por 2 minutos.<br />
3-Con la pinza, comenzar a separar la capa <strong>de</strong> esmalte por uno <strong>de</strong> los extremos, <strong>de</strong>be hacerse con<br />
cuidado para que no se rompa.<br />
4-Colocar la capa extraídas sobre un portaobjetos y con su cubreobjetos marcar el campo <strong>de</strong><br />
visión.<br />
5- Observar al microscopio y realizar un dibujo <strong>de</strong>tallado <strong>de</strong> un estoma y las diversas células <strong>de</strong><br />
la epi<strong>de</strong>rmis.<br />
84
*TEÑIDOS<br />
Colorantes usados para la observación <strong>de</strong> estructuras vegetales<br />
85<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
La coloración <strong>de</strong> estructuras celulares está basada en la afinidad específica entre el colorante.<br />
Los más usados son:<br />
Yodo, ioduro <strong>de</strong> potasio (IIK): tiñe almidón <strong>de</strong> color azul violeta.<br />
Hematoxilina: tiñe contenido celular y pare<strong>de</strong>s primarias <strong>de</strong> amarillo.<br />
Fast-Green: Tiñe pare<strong>de</strong>s celulósicas <strong>de</strong> celeste.<br />
Safranina: tiñe pare<strong>de</strong>s secundarias lignificadas, cutinizadas o suberificadas en algunos casos<br />
tiñe nucleolos (color rojo).<br />
Sudán IV: tiñe grasas, cutina y suberina <strong>de</strong> color rojo.<br />
* CORTE A MANO ALZADA<br />
ACTIVIDAD: OBSERVACIÓN DE TEJIDOS AL FRESCO.<br />
Materiales: hoja- raíz o tallo- hoja <strong>de</strong> bisturí o <strong>de</strong> afeitar- portaobjetos- cubreobjetosmicroscopio-<br />
pinza- pipeta Pasteur o gotero.<br />
Introducción<br />
Esta técnica implica realizar finos cortes al órgano a observar, <strong>de</strong> tal manera que sea<br />
posible distinguir los tejidos constitutivos. Es una actividad que permite la observación en el<br />
momento <strong>de</strong> trabajo, ya que no presentan ninguna técnica <strong>de</strong> fijación, por lo tanto es fácil <strong>de</strong><br />
realizar por los alumnos.<br />
Pasos <strong>de</strong>l corte<br />
1- Seleccionar el órgano a cortar, tratando que se encuentre bien fresco y en buenas condiciones<br />
<strong>de</strong> color y textura y que sea <strong>de</strong> un tamaño pequeño, fácil <strong>de</strong> manejar.<br />
2- Con la hoja <strong>de</strong> bisturí o afeitar realizar los cortes en el sentido <strong>de</strong>seado, lo más <strong>de</strong>lgados<br />
posibles (cortes a mano alzada). Fig. 7)
86<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Corte longitudinal: Es aquel que se realiza paralelo al eje longitudinal <strong>de</strong>l órgano.<br />
Fig. 7<br />
3- Limpiar el porta y cubreobjeto con alcohol lavándolos con alcohol 70º y secarlos con una<br />
gasa, evitando <strong>de</strong>jar pelusas en su superficie.<br />
4- Colocar unas gotas <strong>de</strong> agua sobre el portaobjetos y montar el corte con la pinza.<br />
5- Colocar el cubreobjetos en un ángulo <strong>de</strong> 45° para que no se formen burbujas <strong>de</strong> aire, apretar<br />
suavemente con la pinza. (repasar Fig. 6)<br />
6- Observar al microscopio.<br />
Recomendación: Si se va a realizar una observación prolongada (más <strong>de</strong> 10 minutos), en lugar<br />
<strong>de</strong> unas gotas <strong>de</strong> agua, es conveniente colocar unas gotas <strong>de</strong> glicerina diluida (1:1) en agua sobre<br />
el portaobjeto, para evitar la <strong>de</strong>secación <strong>de</strong> la muestra.
*INDENTIFICACIÓN DE PHYLA Y CLASES DE ORGANISMOS<br />
Actividad: Análisis <strong>de</strong> la biodiversidad <strong>de</strong> especies.<br />
Introducción<br />
87<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Para esta actividad el docente <strong>de</strong>berá contar con ejemplares <strong>de</strong> invertebrados conservados<br />
en alcohol etílico al 70%. Éste se prepara colocando 300 ml <strong>de</strong> agua por cada 1000 ml <strong>de</strong><br />
alcohol.<br />
Entre los organismos se pue<strong>de</strong>n recolectar bichos bolita, ciempiés, milpiés, arañas, lombrices,<br />
pequeños caracoles, varios insectos como: langostas, escarabajos, cigarras, grillos, alguna larva<br />
<strong>de</strong> mariposa u otro insecto, entre otros.<br />
Luego <strong>de</strong>berá tomar una porción <strong>de</strong> tierra húmeda con hojarasca <strong>de</strong> peso conocido,<br />
colocarla en un recipiente al que le irá agregando los ejemplares conociendo el tipo y número<br />
que colocó.<br />
Esto será presentado a los alumnos como muestra con un protocolo <strong>de</strong> trabajo en el que<br />
se consignen los siguientes aspectos, una fundamentación sobre el concepto <strong>de</strong> biodiversidad y la<br />
importancia <strong>de</strong> su conservación, un objetivo <strong>de</strong> trabajo claro, y los materiales y procedimientos.<br />
El grupo <strong>de</strong> alumnos o cada uno <strong>de</strong>berá tomar el volumen <strong>de</strong> la muestra recibida, luego<br />
con la ayuda <strong>de</strong> un cernidor o pinza buscará la presencia <strong>de</strong> organismos.<br />
Al verificar que todos fueron extraídos es posible:<br />
*<strong>de</strong>terminar la diversidad consi<strong>de</strong>rando la variedad específica y la abundancia relativa.<br />
*<strong>de</strong>terminar la <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> cada población explicando este concepto.<br />
* I<strong>de</strong>ntificar a la especie dominante en ese volumen.<br />
* i<strong>de</strong>ntificar los phyla y clases representados según los organismos encontrados completando una<br />
tabla como la que sigue.<br />
Ejemplar Phyllum- Clase-Or<strong>de</strong>n<br />
Araña<br />
Langosta<br />
bicho bolita
*Construcción <strong>de</strong> una clave dicotómica sencilla<br />
88<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
* Construir una clave dicotómica que permita la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los ejemplares, consi<strong>de</strong>rando<br />
diferentes características exomorfológicas como: apéndices, la tagmosis, presencia <strong>de</strong> alas, tipos<br />
<strong>de</strong> alas, número <strong>de</strong> patas, tipo <strong>de</strong> aparato bucal, etc. Recordar que una clave dicotómica es una<br />
herramienta <strong>de</strong> trabajo que siempre va consi<strong>de</strong>rando <strong>de</strong> a dos alternativas para una <strong>de</strong>terminada<br />
característica.<br />
Una buena clave dicotómica <strong>de</strong>be tener las siguientes características:<br />
-presenta características claramente i<strong>de</strong>ntificables agrupadas <strong>de</strong> a pares que <strong>de</strong>ben ser<br />
mutuamente excluyentes.<br />
- tiene estilo telegráfico en su redacción.<br />
- las características son absolutas y no <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>n <strong>de</strong> juicios (ej. oscuro/claro).<br />
- las características usadas <strong>de</strong>ben ser fácilmente observables.<br />
- las características consi<strong>de</strong>radas <strong>de</strong>ben ser aplicadas a ambos sexos o edad <strong>de</strong>l grupo.<br />
-pue<strong>de</strong> presentar ilustraciones <strong>de</strong> referencia sobre todo <strong>de</strong> características que presentan<br />
confusión, también pue<strong>de</strong> contar con un glosario que <strong>de</strong>fina algunos conceptos o estructuras que<br />
puedan resultar <strong>de</strong>sconocidas.<br />
Ejemplo 1:<br />
1a-cuerpo dividido en cabeza, tórax y abdomen...........................2<br />
1b-cuerpo no dividido en cabeza tórax y abdomen, sino cefalotórax y abdomen....................... 2<br />
2a- un par <strong>de</strong> antenas presentes...........................................................Clase Insecta<br />
2b- más <strong>de</strong> un par <strong>de</strong> antenas presentes………………….....................................................3<br />
3a- dos pares <strong>de</strong> antenas………………………………………. Clase Crustacea<br />
3b- sin antenas………………………………………………….Clase Arácnida
Ejemplo 2:<br />
89<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
A. Fruto seco.<br />
B. Fruto <strong>de</strong>hiscente.<br />
C. La <strong>de</strong>hiscencia se produce por dos líneas <strong>de</strong> sutura (dorsal y<br />
ventral).......................... Legumbre.<br />
CC. La <strong>de</strong>hiscencia se produce por una sustura ventral........Folículo.<br />
BB: Fruto in<strong>de</strong>hiscente.<br />
D. Fruto proveniente <strong>de</strong> un gineceo súpero.<br />
DD. Fruto proveniente <strong>de</strong> un ovario ínfero.<br />
*MONTAJE DE PEQUEÑOS ARTRÓPODOS Y DISECCIÓN<br />
ACTIVIDAD: ESTUDIO EXOMORFOLÓGICO DE INSECTOS<br />
Materiales: insectos con aparatos bucales diferentes conservados en alcohol 70°- pinza- aguja <strong>de</strong><br />
disección- cápsula <strong>de</strong> Petri o vidrio <strong>de</strong> reloj, gotero con agua o recipiente y pipeta Pasteurplancha<br />
<strong>de</strong> telgopor- plasticola transparente o cinta adhesiva.<br />
Introducción<br />
Los insectos conforman el grupo más numeroso y diverso entre los artrópodos, presentan<br />
una gran diversidad tanto en forma como en tamaño. A nivel exomorfológico es posible<br />
reconocer variaciones en el aparato bucal, tipo <strong>de</strong> alas, antenas y modificaciones en las patas.<br />
1- Observación y análisis <strong>de</strong> un insecto<br />
Con la ayuda <strong>de</strong> una figura (Fig. 8) como la siguiente se pue<strong>de</strong> observar con una lupa la<br />
exomorfología <strong>de</strong>l insecto.
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Fig. 8<br />
*Con la ayuda <strong>de</strong> las siguientes figuras pue<strong>de</strong>s <strong>de</strong>terminar las características que te permitirán<br />
completar el cuadro dado <strong>de</strong>bajo.<br />
Fig. 9 Tipos <strong>de</strong> antenas<br />
Ref: 1: filiforme, 2: filiforme modificada, 3: clavada, 4: moniliforme, 5: aserrada, 6: lamelada, 7:<br />
pectinada.<br />
90<br />
7
Fig. 10 tipos <strong>de</strong> alas.<br />
91<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong>
92<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Fig. 11 tipos <strong>de</strong> patas.<br />
Ref: A: caminadora, el resto son modificaciones según el ambiente o por dimorfismo sexual.
Fig. 12 tipos <strong>de</strong> aparatos bucales<br />
93<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Recomendación: El cuadro pue<strong>de</strong> ser completado colocando los códigos que i<strong>de</strong>ntifican a cada<br />
tipo <strong>de</strong> estructura (número o letra).<br />
Cuadro <strong>de</strong> características.<br />
Característica Muestra<br />
Tipo <strong>de</strong> alas<br />
Tipo <strong>de</strong> antenas<br />
Tipo <strong>de</strong> aparato bucal<br />
Tipo <strong>de</strong> patas
94<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
* Se extrae una pata y se la pega sobre el telgopor, se i<strong>de</strong>ntifican sus partes con la ayuda <strong>de</strong> un<br />
esquema como el siguiente. (Fig. 13)<br />
2- Observación <strong>de</strong> aparato bucal masticador<br />
Introducción<br />
Si cuenta con lupa es posible tomar dos ejemplares <strong>de</strong> insectos para analizar los aparatos<br />
bucales, separando e i<strong>de</strong>ntificando cada una <strong>de</strong> las piezas que lo componen. El más fácilmente<br />
visible es el aparato masticador que poseen las langostas, escarabajos o grillos.<br />
En la cabeza <strong>de</strong> los insectos, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> las antenas encontramos tres pares <strong>de</strong> apéndices.<br />
Éstos son los bucales, que conforman el aparato bucal, muy importante para la sistemática <strong>de</strong><br />
insectos y la comprensión <strong>de</strong> sus hábitos.<br />
Los elementos más notables <strong>de</strong> la boca <strong>de</strong> un insecto son las mandíbulas, maxilas, y el labio. La<br />
disposición y forma primaria <strong>de</strong> los mismos son las <strong>de</strong>l aparato bucal masticador típico.<br />
Estas piezas se observan modificadas según los hábitos alimentarios, así aparecen aparatos<br />
bucales: cortador-chupador- chupador- picador-chupador, masticador- lamedor, etc.<br />
Procedimiento<br />
Fig. 13<br />
Se corta la cabeza y con la ayuda <strong>de</strong> una figura como la Fig. 9 se van separando los apéndices y<br />
se van pegando uno a uno sobre el telgopor, con sus nombres.
95<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
ACTIVIDAD: COMPARACIÓN ENTRE DIFERENTES CLASES DE ARTHROPODA<br />
Luego <strong>de</strong>l trabajo <strong>de</strong> observación <strong>de</strong>l o los insectos (I), si se cuenta con otros<br />
invertebrados artrópodos como: araña (A), escorpión (E), cangrejo (C), milpiés (M) u otro<br />
representante <strong>de</strong> cada una <strong>de</strong> las Clases <strong>de</strong> Arthropoda, pue<strong>de</strong> elaborarse un cuadro comparativo<br />
con las siguientes características.<br />
Característica I A E C M<br />
Tagmosis<br />
Segmentos que componen la tagmosis<br />
Nº <strong>de</strong> patas<br />
Nº <strong>de</strong> antenas<br />
Nº <strong>de</strong> alas<br />
Ubicación <strong>de</strong> las patas<br />
Ubicación <strong>de</strong> las alas.<br />
Fig. 9
MÉTODOS FÍSICOS Y QUÍMICOS<br />
*Pruebas estándares <strong>de</strong> monosacáridos, polisacáridos<br />
Actividad: I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> componentes en una sustancia.<br />
96<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
Situación problemática: Un técnico preparó seis soluciones pero al finalizar olvidó rotularlas. Lo<br />
que sabemos es que utilizó glucosa, almidón, y albúmina y que tres <strong>de</strong> las muestras son una<br />
mezcla entre 2 ó 3 <strong>de</strong> los compuestos mencionados anteriormente. Utilizando los test<br />
mencionados a continuación ¿te animas a ayudarnos a <strong>de</strong>terminar que contiene cada muestra?<br />
Muestra (M)<br />
M1: Lugol(+) Fehling (-) Bradford (-) M4: Lugol(+) Fehling (+) Bradford (-)<br />
M2: Lugol(-) Fehling (+) Bradford (-) M5: Lugol(+) Fehling (-) Bradford (+)<br />
M3: Lugol(-) Fehling (-) Bradford (+) M6: Lugol(+) Fehling (-) Bradford (+)<br />
Lo que se conoce <strong>de</strong> cada uno <strong>de</strong> los test es lo siguiente:<br />
Reacción <strong>de</strong> Bradford:<br />
Bajo condiciones apropiadas los grupos ácidos y básicos <strong>de</strong> las proteínas interactúan con grupos<br />
disociados <strong>de</strong> colorantes orgánicos para formar precipitados coloreados. Este procedimiento es<br />
muy útil para la <strong>de</strong>terminación cuantitativa <strong>de</strong> proteínas y fue <strong>de</strong>sarrollado por Marion Bradford.<br />
El método emplea el colorante Azul brillante <strong>de</strong> Comassie G-250. La unión <strong>de</strong>l colorante a la<br />
proteína produce un cambio en la absorción máxima <strong>de</strong>l colorante <strong>de</strong> 465 nm (forma roja) a 595<br />
nm (forma azul). Por lo tanto el cambio <strong>de</strong> color <strong>de</strong> la solución <strong>de</strong> marrón-rojizo a azul indica<br />
presencia <strong>de</strong> proteínas.<br />
Reacción <strong>de</strong> Fehling: En medio alcalino y en presencia <strong>de</strong> azúcares reductores el calentamiento<br />
produce <strong>de</strong>coloración <strong>de</strong> la solución azul <strong>de</strong>l reactivo (que contiene Cu ++ ) y la aparición <strong>de</strong> óxido<br />
cuproso (Cu2O) <strong>de</strong> color rojo.
Test <strong>de</strong> Lugol para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> Almidón:<br />
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Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
El reactivo <strong>de</strong> Lugol cambia <strong>de</strong> un color marrón-amarillo a azul-negro en presencia <strong>de</strong> almidón,<br />
pero no cambia <strong>de</strong> color en presencia <strong>de</strong> un disacárido o monosacárido.<br />
Respuesta<br />
M1: almidón. M4: almidón + glucosa.<br />
M2: glucosa. M5: almidón + albúmina.<br />
M3: albúmina. M6: almidón + glucosa+ albúmina.
MÉTODOS ESTADÍSTICOS<br />
TEST ESTADÍSTICO X 2<br />
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Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
En <strong>Biología</strong> es muy importante po<strong>de</strong>r evaluar si los datos observados (Oi) se ajustan o no<br />
a las frecuencias teóricas esperadas (Ei). Cuando asumimos que los datos se a<strong>de</strong>cuarán a una<br />
proporción dada, establecemos lo que se llama HIPOTESIS NULA (Ho). Se llama así <strong>de</strong>bido a<br />
que se asume que no hay diferencias reales entre Oi y E1, y en el caso <strong>de</strong> existir alguna pequeña<br />
diferencia sería atribuida al azar. Una <strong>de</strong> las pruebas estadísticas más simples para valorar la Ho,<br />
es el análisis <strong>de</strong> X 2 . Esta prueba tiene en cuenta las <strong>de</strong>sviaciones observadas <strong>de</strong> cada componente<br />
<strong>de</strong> una proporción esperada, así como el tamaño <strong>de</strong> la muestra y las reduce a un único valor<br />
llamado estadístico o X 2 calculado<br />
X 2 = ∑<br />
(O1 - E1) 2<br />
Ei<br />
Este valor <strong>de</strong> X 2 se utiliza luego para estimar si la <strong>de</strong>sviación observada se <strong>de</strong>be o no al azar. La<br />
distribución <strong>de</strong> X 2 es una función <strong>de</strong> la <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> probabilida<strong>de</strong>s. El estadístico pue<strong>de</strong> tomar<br />
valores entre 0 → ∝<br />
La tabla <strong>de</strong> doble entrada que se te presenta a continuación representa los valores <strong>de</strong> X 2<br />
tabulados en función <strong>de</strong> los Grados <strong>de</strong> Libertad (GL) y <strong>de</strong> un valor <strong>de</strong> probabilidad α<br />
G.L\ α 0,9 0,7 0,5 0,3 0,1 0,05 0,01<br />
1 0.02 0.15 0.46 1.17 2.71 3.84 9.21<br />
2<br />
3<br />
4<br />
0.21 0.71 1.39 2.41 4.60 5.99 9.21<br />
0.58 1.42 2.37 3.66 6.25 7.82 11.34<br />
01.06 2.20 3.36 4.88 7.88 9.49 13.28<br />
Grados <strong>de</strong> libertad: se calculan como GL = n - 1, don<strong>de</strong> n es en este caso el número <strong>de</strong> clases<br />
fenotípicas.<br />
Valor <strong>de</strong> probabilidad : α es la probabilidad <strong>de</strong> rechazar una hipótesis nula siendo esta
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Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
verda<strong>de</strong>ra.<br />
Uno <strong>de</strong> los aspectos más importantes <strong>de</strong>l análisis <strong>de</strong> X 2 es compren<strong>de</strong>r lo que significa<br />
realmente el valor α. Analicemos un ejemplo: ¿qué indica un α= 0, 26? Si se repitiera el<br />
experimento muchas veces, en el 26% <strong>de</strong> las repeticiones esperaríamos una <strong>de</strong>sviación por azar<br />
igual o mayor que la observada en la prueba inicial. Por el contrario en el 74% <strong>de</strong> las<br />
repeticiones mostrarían menor <strong>de</strong>sviación por azar que la inicialmente observada. Esto<br />
<strong>de</strong>muestra que una Ho nunca pue<strong>de</strong> ser aceptada o rechazada <strong>de</strong> manera absoluta. Por ello se<br />
<strong>de</strong>be fijar un límite que sirva <strong>de</strong> base para rechazar o no la Ho. Este límite es a menudo un valor<br />
<strong>de</strong> α = 0.05. Esto significa que si el valor <strong>de</strong> X 2 calculado no exce<strong>de</strong> al valor <strong>de</strong> X 2 tabulado,<br />
hay 95% <strong>de</strong> probabilidad <strong>de</strong> aceptar la Ho sin equivocarse.<br />
Ejemplo: X 2 calculado = 4,45<br />
GL =2 X 2 tabulado = 5.99<br />
α = 0.05<br />
Conclusión: como el valor <strong>de</strong> X 2 calculado es menor que el valor crítico tabulado, la Ho no<br />
pue<strong>de</strong> ser rechazada.
LA DISTRIBUCIÓN T Y EL TEST T<br />
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Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
La distribución t fue <strong>de</strong>scrita por primera vez por Gosset usando una lapicera llamada “Stu<strong>de</strong>nt”<br />
y por ello se llamo distribución <strong>de</strong> stu<strong>de</strong>nt. Esta distribución dice que la diferencia entre la media<br />
(m) aritmética <strong>de</strong> la muestra (m) y la verda<strong>de</strong>ra (µ) dividida por el error estándar <strong>de</strong> la media <strong>de</strong><br />
la muestra sigue la distribución t<br />
m − u<br />
t =<br />
S m<br />
El error estándar <strong>de</strong> la media <strong>de</strong> la muestra es referida como:<br />
S m<br />
=<br />
S<br />
n<br />
2<br />
Don<strong>de</strong> S es la <strong>de</strong>sviación estándar y n el número <strong>de</strong> observaciones.<br />
La forma <strong>de</strong> la distribución t <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> los grados <strong>de</strong> libertad (v)<br />
V<br />
= n −1<br />
La tabla t está dispuesta con los grados <strong>de</strong> libertad (v) abajo y las probabilida<strong>de</strong>s a lo largo <strong>de</strong> la<br />
tabla. Estas probabilida<strong>de</strong>s correspon<strong>de</strong>n a las áreas bajo la curva <strong>de</strong> la distribución t (figura en<br />
parte <strong>de</strong>recha <strong>de</strong> la tabla). Observa que la tabla muestra sólo los valores absolutos <strong>de</strong> t; dado que<br />
la curva es simétrica alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> 0. Nota que hay dos colas pintadas <strong>de</strong> negro que cada una<br />
contribuye a la mitad <strong>de</strong>l valor <strong>de</strong> α El valor <strong>de</strong> α es elegido <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l nivel <strong>de</strong><br />
significancia que <strong>de</strong>seas; el valor t correspondiente es llamado valor crítico <strong>de</strong> t para α =0,05 y<br />
V=5, encontramos t =2,571. La hipótesis nula (H0) es que la media <strong>de</strong> la muestra no es<br />
significativamente diferente <strong>de</strong> la media verda<strong>de</strong>ra. Si el valor absoluto <strong>de</strong>l estadístico t<br />
observado es menor que el crítico t la hipótesis nula no es rechazada.
Bibliografía consultada:<br />
101<br />
Editado por <strong>Olimpíada</strong> <strong>Argentina</strong> <strong>de</strong> <strong>Biología</strong><br />
CURTIS, H. y S. BARNES. 2000. <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.<br />
DAVIES, R. G. 1991. Introducción a la Entomología. Ediciones Mundi-Prensa.<br />
HICKMAN, C., L. ROBERTS y A. PARSON. 2002. Principios integrales <strong>de</strong> Zoología.<br />
Ed. Mc Graw Hill Interamericana 11ma. ed.<br />
MADIGAN, M. T.; J. M. MARTINKO and J. PARKER. 1998. Brock. <strong>Biología</strong> <strong>de</strong> los<br />
microorganismos. Ed. Prentice Hall. 8va. ed.<br />
MARSHALL, A. y W. WILLIAMS. 1980. Zoología Invertebrados. Ed. Reverté SA.<br />
PURVES, W; D. SADAVA; G. H. ORIANS Y H. CRAIG HELLER. 2003. Vida. La<br />
ciencia<br />
<strong>de</strong> la <strong>Biología</strong>. Ed. Médica Panamericana. 6ta. ed.<br />
SOLOMON, E. P; L. R. BERG y D. W. MARTIN, 1999. <strong>Biología</strong>. Ed. Mc Graw Hill<br />
Interamericana 5ta. ed.<br />
Apuntes elaborados por docentes <strong>de</strong> las Cátedras <strong>de</strong>:<br />
MORFOLOGÍA VEGETAL<br />
GENÉTICA<br />
ZOOLOGÍA DE INVERTEBRADOS<br />
BIOLOGÍA GENERAL<br />
Departamento <strong>de</strong> Ciencias Naturales- Facultad <strong>de</strong> Ciencias Exactas, Físico-Químicas y<br />
Naturales- Universidad Nacional <strong>de</strong> Río Cuarto.