metodos de diagnóstico en fauna silvestre: citologías y biopsias

METODOS DE DIAGNÓSTICO EN
FAUNA SILVESTRE:
CITOLOGÍAS Y BIOPSIAS
Ursula Höfle
Fundación Aquila
Centro de Estudios de Rapaces Ibéricas
45671 Sevilleja de la Jara
E-mail: Uholfeh@nexo.es/Aquilafoundation@hotmail.com
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Introducción
Quién esta implicado en el trabajo con fauna silvestre es consciente de uno de los
problemas principales de esta labor que es la crónica escasez de recursos. Esto y la
frecuentemente asociada falta de tiempo limitan en muchos casos limita las posibilidades para
efectuar análisis para la detección del agente etiológico de una lesión. Siendo esto último lo
correcto y el ideal ante un problema infeccioso dado que permite al mismo tiempo la
determinación de la susceptibilidad antibiótica del patógeno en cuestión, hay otros métodos, más
económicos que pueden permitir un diagnóstico, como mínimo preliminar, más rápido. Además
en ocasiones puede permitir a descartar la realización de cultivos innecesarios al delatar la
presencia o ausencia de un agente determinado. El método del que se habla es la citología en su
sentido más amplio, siendo una técnica ampliamente empleada en medicina humana y algunas
disciplinas de veterinaria.
La palabra citología se refiere al examen microscópico de extensiones o improntas, que hasta
hace poco se empleó principalmente en el examen post mortem. Las citologías pueden realizarse
de prácticamente cualquier liquido o superficie, son fáciles de hacer y de teñir, por lo que
constituyen un método rápido de diagnóstico para el clínico.
Dado que su examen e interpretación requiere experiencia, persiste una cierta reticencia a su
utilización por parte del clínico. Sin embargo, cualquier clínico puede adquirir la experiencia
necesaria para llevara a cabo esta interpretación, por lo cual es recomendable no descartar este
instrumento rápido y económico de diagnóstico.
En el presente capítulo se resumen las principales técnicas y posibilidades de la citología,
demostrando su utilidad como técnica complementaria de ayuda al diagnóstico de diferentes
enfermedades. Su uso en combinación con biopsias puede resultar de gran interés.
El uso de biopsias es también bastante común, especialmente en la clínica de pequeños
animales - y constituye un método muy útil para la obtención de diagnósticos con una visión
global incluyendo la estructure del tejido examinado. La gran diferencia con las citologías es que
el examen de una biopsia quiere un preparación especial de la muestra y la interpretación por un
experto en histopatología, con lo cual no resulta menos económico. Además de su examen
microscópico el material obtenido mediante biopsia o métodos aplicados para la obtención de
citologías puede ser utilizado para otras pruebas de diagnóstico como cultivos o técnicas
moleculares
Citologías y Medio Ambiente
Al mismo tiempo que propagamos el uso de citologías y con ello de tinciones como
herramienta de uso en los centros de recuperación, parece muy importante que su uso no genere
mas perjuicio que beneficios para el medio ambiente. Todas las tinciones y la gran mayoría de
los fijadores que se usan para la preparación de citologías son residuos tóxicos que han de
tratarse como tales. Esto implica por un lado el cuidado personal durante su uso, y por otro la
debida recogido durante y después de su uso. Una forma de hacer esto es realizar las tinciones en
bandejas con rejillas y recoger los liquidos después en bidones. Existen diferentes empresas que
se encargan de la recogida de residuos químicos, incluidas dichas tinciones
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A- CITOLOGÍAS
Consideraciones previas
El valor de una citología depende de varios factores:
1- El método de toma de muestra
2- El método de fijación
3- La tinción elegida
4- La interpretación por el clínico veterinario
Generalmente una citología se obtiene para determinar la naturaleza del material objeto de
examen y/o para diagnosticar el proceso nosomial y su etiología primaria en el tejido examinado.
Este diagnóstico se basa en la identificación de las células presentes (inflamatorio – no
inflamatorio, estéril – séptico, etc.). En este sentido es importante tener presente que en una
citología raramente se reconoce la estructura del tejido, razón por la cual es importante saber
identificar células individuales.
La celularidad de una muestra es esencial para poder hacer una interpretación de la citología -
falta material no se puede obtener una imagen representativa, y al contrario en una muestra
demasiado gruesa la interpretación se vuelve imposible.
Reglas básicas
1- Intentar obtener una muestra representativa.
2- Realizar más de una citología (si es posible mínimo tres)
3- Utilizar en primer lugar una tinción general
4- Fijar, teñir y examinar lo mas inmediatamente posible tras la obtención.
Métodos de obtención de muestras
1. Raspado de lesiones superficiales
- Examinar y anotar tipo, forma, color, y en caso de presentarse: olor de la lesión antes de
realizar el raspado
- Realizar un raspado de la superficie sin haberla limpiado, con una hoja de bisturí en un
ángulo de 90º.
- Conviene preparar un porta con una gota de suero salino estéril y un cubre para examen
directo, sin teñir.
- Distribuir el material obtenido en varios portaobjetos limpios, presionando suavemente con
un cubre u otro porta para extenderlo.
- El material keratinizado puede ser transferido primero a hidróxido de potasio o lactofenol
clorado para digerir la keratina y mejorar la visibilidad
- Repetir el raspado después de haber limpiado la lesión
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2. Citologías de conjuntiva, mucosa oral, esófago, cloaca
- Mojar un hisopo con solución salina estéril y frotar con presión suave contra la mucosa en
cuestión (es importante en las citologías de cloaca asegurar que el hisopo ha tenido realmente
contacto con la mucosa).
- Extender sobre varios portas limpios rodando el hisopo con presión suave sobre ellos.
- Secar al aire, fijar y teñir
3. Muestras de lavados
- Para lavados bronquiales y de tracto digestivo superior anestesiar al animal
- En lavados de cloaca en tortugas para diagnóstico de parásitos no necesita anestesia
- Instilar una pequeña cantidad de suero salino estéril y aspirar de forma inmediata.
- Si el líquido es muy celular se puede extender directamente sobre varios portas limpios.
- Si la celularidad del liquido obtenido es baja, ha de centrifugarse durante 10min a 600G y
luego aspirarse el concentrado del fondo del tubo (puede a veces no ser muy claramente
distinguible), para extenderse sobre varios portas limpios.
- Secar al aire, fijar y teñir
4. Aspiración de líquidos
Los líquidos pueden proceder de abscesos u otras formaciones, cavidades corporales,
articulaciones, humores,…etc,
- Limpieza y preparación aséptica de la piel a través de la cual se va a realizar la aspiración
- Realizar la aspiración y según la cantidad obtenida distribuir entre un tubo estéril, un tubo
con hepárina y otro con EDTA.
- Determinar color, consistencia y olor del líquido obtenido
- Determinar gravedad específica (refractómetro), Proteínas/sólidos totales (refractómetro), y
celularidad del aspirado
- Si la celularidad es alta realizar directamente varios frotis sobre portas limpios.
- Si la celularidad es baja, centrifugar la muestra y seguir según lo descrito en el apartado 3.
- Secar al aire, fijar y teñir.
5. Impronta de superficie de tejido (biopsia de lesión de piel, biopsia de órganos, necropsias)
- Proporcionar un corte fresco con una hoja de bisturí, para conseguir una superficie de la que
realizar la citología
- Coger el trozo de tejido con una pinza de dientes
- Tocar la superficie suave y repetidamente con una toalla de papel absorbente hasta que ya no
se detecte la presencia de sangre
- Presionar varias veces la superficie del corte en diferentes portas limpios
- Dejar secar al aire, fijar y teñir
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6. Aspiración con aguja fina
(Muy útil para un diagnóstico rápido de masas sólidas sin necesidad de quirófano)
- Limpiar y desinfectar la superficie externa (piel)
- Inmovilizar la estructura de la cual se va a efectuar la aspiración
- Ajustar una aguja del calibre 20 a una jeringa de 10 ml e insertarla en el tejido
- Realizar vacío, luego redirigir la aguja en el tejido mientras se mantiene el vacío.
- Dejar de aspirar y luego (¡!) retirar la aguja del tejido (Es importante que el aspirado quede
en la aguja!)
- Quitar la aguja de la jeringa, y aspirar aire
- Volver a colocar la aguja y depositar una gota pequeña en varios portaobjetos
- Extender la muestra:
Método 1: (Idéntico al método aconsejado de realización de frotis sanguíneos)
- Colocar otro porta limpio en ángulo de 45-30º detrás de la gota, sujetando al mismo tiempo el
porta sobre el que se encuentra la gota
- Acercarlo hasta que el borde del porta toque la gota y esta empiece a extenderse a lo largo de
este borde
- Realizar un movimiento rápido de deslizamiento del porta manteniendo el ángulo
- Este método resulta en la extensión de un 75% aproximado de la muestra
Imagen 1: Extensión de muestras líquidas para citología
1. 2.
Método 2: (Para muestras muy gruesas)
- Presionar la muestra con otro porta o cúbre-objetos limpio en un movimiento de rotación
- Deslizar el uno sobre el otro en dirección contraria
Imagen 2: Metodo de extensión de líquidos gruesos
7. Aspiración de medula ósea
- Anestesiar al ave
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- Desplumar, limpiar y desinfectar la cara interna del tibiotarso (otra localización posible es la
cresta del esternón)
- Utilizar jeringa y aguja adecuados al tamaño del ave (idealmente aguja espinal pero agujas
normales también valen)
- Insertar la aguja en la tuberositas tibiae en ángulo de 90º a la cresta tibialis
- Realizar vacío
- Antes de retirar la aguja dejar de hacer vacío
- Quitar la aguja de la jeringa, y aspirar aire
- Volver a colocar la aguja y depositar una gota pequeña en varios portaobjetos
- Extender la muestra según los métodos descritos en 6.
Existe otro método muy útil en animales en los que por razones de tratamiento auxiliar o de
soporte se hace necesario colocar un catéter intraóseo en el cúbito. Este método consiste en
instilar una pequeña cantidad de suero salino estéril y aspirarlo. Según la densidad de la muestra
obtenida se puede hacer necesario su centrifugación antes de su uso para realizar citologías.
Métodos de Tinción
Todos los portas deberían secarse al aire y fijarse con rapidez. Conviene siempre realizar primero
una tinción general tipo Romanovsky, y guardar los demás portas fijados para la realización de
tinciones especiales.
1. Fijadores
• Calor (llama de Bunsen)
• Acetona
• Metanol frío al 100%
• Formol tamponado al 10% (las celulas tendrán un color azul)
• Fijadores comerciales en spray
2. Tinciones
• Generales: - Diff-quick ® (existen equivalentes genéricos)
- Giemsa
- Wright
- Nuevo azul de metileno (núcleos)
• Para microorganismos:
- Tinción de gram
- Tinción ácido-alcohol resistente (Ziehl Nehlsen) para micobacterias
- Tinción de Gimenez modificada o de Machiavello para Mycoplasmas,
Chlamydiophila y Rickettsias (también Giemsa) y cuerpos elemtales de
Poxvirus
Muchas de estas tinciones se pueden obtener de forma comercial de proveedores de material
de laboratorio. Las tinciones de Machiavello y Giménez requieren filtración o preparación
poco tiempo ante su uso desde soluciones base. En las tinciones para bacilos aa-resistentes,
Micoplasma y Clamidiophila es conveniente utilizar controles positivos.
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Tan sólo se mencionan algunos ejemplos de tinciones incluyendo los de uso más común y
con los que nosotros hemos obtenido los mejores resultados.
3. Protocolos
a) Diff-quick o equivalentes
Son tinciones rápidas tipo Romanovsky comerciales, que generalmente contienen un fijador,
una solución I (Eosina tamponada) y una solución II (Azul de métileno y otras tamponado).
El protocolo por lo general consiste en realizar entre 5 y 8 (según fabricante) inmersiones del
porta en la primera solución (fijador), lavar con agua y realizar lo mismo en las soluciones I y
II, y dejar el porte secar al aire.
b) Wright
- Cubrir el porta con tinción de Wright durante 1-3 minutos
- Adicionar la misma cantidad de tampón, mezclarlos soplando suavemente, hasta que tiene
brillo metálico
- Dejar 2-6 minutos
- Lavar y dejar secar al aire
c) Giemsa
- Fijar los portas con metanol frío al 100% (7minutos), y dejar secar al aire
- Cubrir con la solución de Giemsa y dejar entre 15 y 40 minutos
- Lavar con agua destilada y secar
Las tres tinciones resultan en una imagen parecida:
d) Tinción de gram
Eritrocitos: Naranja con núcleo violeta (más rojizo con Giemsa)
Heterofilos: Núcleo entre rosa y violeta, citoplasma transparente con
gránulos alargados de color naranja rojizo
Eosinofilos: Parecido a heterofilos con gránulos redondos de naranja
Chillón
Basófilos: Idem con gránulos grandes redondos azules
Linfocitos, macrófagos: Núcleo azul oscuro en citoplasma de azul pálido
Células epiteliales: Núcleo azulado, citoplasma pálido - rojo
Microorganismos: Azules
- Fijar el porta seco al calor pasándolo varias veces a través de la llama del Bunsen
- Cubrir durante un minuto con violeta de genciana fenicada (crystal violet)
- Lavar
- Cubrir durante un minuto con solución de Lugol
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- Lavar
- Decolorar durante 15 segundos con Ethanol al 95%
- Lavar
- Contracolorear cubriendo el porta con rojo de safranina durante 1 minuto
- Lavar y dejar secar al aire
Resultado: Organismos gram-negativos rojos, organismos gram-positivos azules
e) Tinción de Ziehl-Nehlsen (bacilos acido-resistentes)
- Fijar el porta seco al calor
- Cubrir con solución de Carbolfuchsina fenicada
- Calentar hasta que salga vapor (sin que haya burbujas) y luego dejar 10 minutos
- Lavar
- Cubrir con solución decolorante (ácido clorhídrico concentrado y etanol al 95%) durante 15
minutos, añadir más solución decolorante en varias ocasiones
- Lavar si no aparece mas color rojizo visible
- Cubrir con contracolorante azul de metileno durante 4 minutos
- Lavar y dejar secar al aire
Resultado: Organismos acido-resistentes rojos, resto del material azul
Existe una tincion modificada que no requiere calentamiento en la primera fase llamada
"Kinyoun" que sobre todo a la hora de manejar un gran volumen de muestras puede resultar util,
sin embargo la menor fijación de la fucsina puede resultar en falsos negativos. Del mismo modo
existe una tincion de fluorescencia (Auramina/Rhodamina), que requiere obligatoriamente el uso
de un microscopio de fluorescencia y de controles positivo, razones por las que su uso encarece
mucho los procedimientos y no será descrita aquí. Reseñar sin embargo que es la tincion de
elección en laboratorios que procesan grandes volúmenes de muestras ya que su examen se
realiza con mayor rapidez que en los Ziehl Neelsen o Kinyoun.
f) Tinción de Gimenez modificada
(utilizar carbolfuchsina recién preparada de tampón y solución base y filtrada)
- Fijar porta al calor
- Cubrir con solución de carbol-fuchsina durante 1(-2) minuto(s)
- Lavar
- Cubrir con verde de malaquita durante 6-9 segundos
- Lavar
- Cubrir con verde de malachita durante 6-9 segundos
- Lavar, y dejar secar al aire
Resultado: Cuerpos elementales e iniciales de Chlamydia de color rojo, resto del material
verde azulado, también para cuerpos elementales de Poxvirus (inclusiones
intracitoplasmáticas en células epiteliales) y micoplasma, rickettsias
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g) Tinción de Machiavello
- Fijar el porta al calor
- Cubrir con fuchina básica durante 3-5 minutos
- Enjuagar en ácido cítrico al 0,5% durante 1-3 minutos
- Lavar
- Cubrir con azul de metileno durante 20-30 segundos
- Lavar y dejar secar al aire
Resultado: Cuerpos elementales de Clamidiofila rojos, cuerpos iniciales de Clamidiofila azules;
micoplasmas azules. A veces falsos positivos por otro material que se tiñe de rojo.
Diagnóstico Citológico
Un diagnóstico citológico completo debe constar de una descripción detallada de la citología
examinada y de una interpretación de la misma.
Las citologías se examinan utilizando un microscopio con objetivos secos de 10x y 40x y
objetivo 100x con aceite de inmersión.
1. Descripción citológica
Debe contener los siguientes datos:
• Lugar y método de obtención de la muestra
• Tipo de lesión, tamaño y aspecto
• Tipo y celularidad de la muestra obtenida
• Carácteristicas de componentes acelulares
• Tinciones utilizadas
• Disposición de las células
• Tipos de células
• Variabilidad del tipo de células
• Detalles y anomalías celulares: Forma, relación núcleo-citoplasma, carácteristicas del
núcleo, disposición y estructura del citoplasma, inclusiones, etc.
• Presencia y descripción de microorganismos
2. Interpretación
La interpretación de lo observado requiere algo de experiencia en:
1. Reconocimiento de células inflamatorias
2. Interpretación de proporción y morfología de las células inflamatorias
3. Tipos y proporciones de células inflamatorias presentes de forma habitual en un tejido
4. Identificación de microorganismos.
5. Tipos y proporciones de células presentes en el tejido normal, así como su morfología
normal.
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6. En caso de neoplasias criterios citológicos de malignidad (anisocitosis, anisocariosis, mitosis
anormal, aumento relación núcleo-citoplasma, etc.)
7. Reconocimiento de artefactos.
Bibliografía recomendada
Campbell, T.W., Avian Hematology and Cytology. Iowa State University Press, Ames LA, 1988.
2 nd ed. 1996. (También el capitulo de Campbell en el Harrison).
Crowell, R.L., Tyler, R.D. (Eds.), Diagnostic Cytology of the dog and cat. American Veterinary
Publications, INC,, Goleta, CA, 1989.
Doerrestein, G. M., Avian Cytology, In: Altman; Clubb, Doerrestein & Quesenberry (eds).
Avian Medicine and Surgery. W.B. Saunders Company, 1997.
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B- BIOPSIAS
Biopsias en aves son un medio de diagnóstico en la mayoridad de los casos relativamente rápido
de obtener, que pueden dar valiosa información sobre órganos a los cuales el acceso por otros
métodos es muy limitado.
Con un endoscopio rígido con pinzas de biopsia se puede acceder a la mayoría de los órganos
internos. En su ausencia también se pueden realizar laparatomías o aspiraciónes con aguja fina.
Al tomar una Biopsia es importante tener en cuenta que le resultado de su análisis depende
mucho de la calidad de la biopsia obtenida, es decir la buena conservación del tejido y de la
localización de la que procede (lesión + tejido sano, etc.).
1. Biopsias de piel
Indicaciones: Presencia de alteraciones (eritema, ulceras, keratosis, abscesos, masas,
dermatitis por estafilococos, etc.)
Técnica: Anestesia general. En la espalda o en la localización de lesiones, hacer dos
incisiones de media luna, levantar la piel y cerrar con puntos simples o pegamento
para tejidos.
Análisis: Citología, histopatología, cultivo (Poxvirus, Polyoma, Micobacterias),
Microscopía electrónica, técnicas moleculares (PBFD).
2. Biopsias de plumas (folículo)
Indicaciones: Deformaciones de plumas y folículos, diagnóstico de PBFD, Polyoma,
estafilococosis en casos difíciles.
Técnica: Anestesia general. Preparación aséptica de la zona. Mejores zonas en axila
o ingle, preferiblemente plumas en crecimiento. Incidir a lo largo del
folículo a ambos lados. Levantar de los tejidos subyacentes. Cerrar con
puntos simples
Análisis: Citología, Histopatología, cultivo, técnicas moleculares.
3. Biopsias de pulmón
Indicación: Enfermedad respiratoria de vías profundas, mayormente para cultivo.
Técnica: Endoscopía, y pinza de biopsias de 2,7 f., tercer espacio intercostal, a través de
saco aéreo craneal. Vigilar posibles hemorragias.
Análisis: Cultivo de bacterias y hongos, citología para protozoos, histología para protozoos
y otros procesos.
4. Biopsias de Hígado
Indicación: Ave anorectica, letárgia, biliverdinuria, disnea no de origen respiratorio,
hepatomegalia, etc., también para diagnóstico de enfermedades viricas,
clamidiofila, bacterianas (micobacterias), metabólicas etc.
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Técnica: Anestesia general. Aspiración percutánea con aguja fina (Aguja de calibre 22 y
jeringa de 2 a 5 ml, con extensión, si se utiliza ultrasonido), idealmente guiada por
ultrasonido. También se realiza de forma ciega.
Análisis: Citología y cultivos.
5. Biopsias de páncreas
Indicación: Ave anorectica o polifágica, apático, con síntomas de dolor abdominal,
heces pálidas en gran cantidad, poliuria, perdida de peso etc. sin diagnóstico
claro.
Técnica: Anestesia general, laparatomía (bisturí, tijeras de iris, y pinzas pequeñas sin
dientes): Incisión de 1-2cm a lo largo del axis craneo-caudal, Cuidado de no dañar
el asa supraduodenal que se encuentra justo dorsal del duodeno! Exteriorizar el
asa del duodeno que contiene el lóbulo dorsal y ventral del páncreas. Si no hay
lesiones macroscópicas, se toma biopsia de la punta final de páncreas se obtiene
como biopsia, con cuidado de no dañar la última arteria pancreática (Eso significa,
levantar un momento el páncreas y mirar el otro lado antes de cortar la punta). Si
hay lesiones macroscópicas la biopsia debería tomarse de ellas. Tras reponer el
asa de duodeno se cierran el abdomen y la piel con métodos habituales.
Análisis: Histopatología y citología.
6. Biopsias de riñón
Indicación: PUPD crónica, elevación crónica de ácido úrico, imagen
radiológica/endoscópica sospechosos de los riñones, problema renal
desconocido.
Técnica: Endoscopio, pinzas de biopsia. Ave anestesiado en posición lateral; más
común es la aproximación al polo craneal a través del ultimo espacio
intercostal, y el saco aéreo torácico caudal. Se pueden tomar varias
muestras a la vez.
Para acceder al polo caudal, acceder detrás del pubis directamente a través
del saco aéreo abdominal. Existe otra aproximación transcutánea, desde la
espalda, y a través del sacro, pero no permite la visualización del riñón
antes de tomar la muestra.
Análisis: Sobre todo histopatología, si hay más que una muestra también cultivos de
bacterias y hongos y citología.
Bibliografía recomendada
Altman, R.B.; Clubb, S.L.; Doerrestein, G.M.; & Quesenberry, K. (eds). Avian Medicine and
Surgery. W.B. Saunders Company, 1997.
Richie, B.W.; Harrison, G.J. & Harrison, L.R. Avian Medicine: Principles and Application,
Wingers Publishing, Ltd., 1994.
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Speer, B. A look at the avian pancreas in health and disease. Proceedings 6. European AAV-
DVG Conference, Munich, Germany March 7-10, 2001.
Nordberg C, O'Brien RT, Paul-Murphy J & Hawley, B. (2000) Ultrasound examination and
guided fine-needle aspiration of the liver in Amazon parrots (Amazona species), J. Avian
Medicine and Surgery 14 (3), 180-184.
Fundación Aquila, Noviembre de 2002 13