Microarrays de DNA
Microarrays de DNA
Microarrays de DNA
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Transcriptómica
Vida – una receta para hacer proteínas<br />
Transcripción<br />
<strong>DNA</strong> RNA<br />
Traducción<br />
proteína
El Dogma Central <strong>de</strong> la Biología Molecular
El Dogma Central <strong>de</strong> la Biología Molecular
¿Qué es la Información Biológica?<br />
Genoma -> Transcriptoma ->Proteoma
¿Qué es la Información Biológica?<br />
Tres niveles básicos <strong>de</strong> información biológica:<br />
Genoma: la información genética común a todas las<br />
células <strong>de</strong>l organismo.<br />
Transcriptoma: la parte <strong>de</strong>l genoma que se expresa en<br />
una célula en una etapa específica <strong>de</strong> su <strong>de</strong>sarrollo.<br />
Proteoma: las proteínas que interactuan para dar a la<br />
célula su carácter individual.<br />
Del GENOMA estático, único<br />
al PROTEOMA dinámico, múltiple.
La era <strong>de</strong> la genómica
La genómica se ha <strong>de</strong>sarrollado como consecuencia<br />
<strong>de</strong> los avances en Biología Molecular e Informática.<br />
La introducción y popularización <strong>de</strong> las tecnologías<br />
<strong>de</strong> alta procesividad ha cambiado drásticamente la<br />
manera en que se abordan los problemas biológicos<br />
y se prueban las hipótesis.
Genómica funcional<br />
• El objetivo <strong>de</strong> la genómica funcional es<br />
generar un catálogo <strong>de</strong> todos los genes y <strong>de</strong><br />
su función.<br />
• Para compren<strong>de</strong>r el comportamiento <strong>de</strong> los<br />
sistemas biológicos y <strong>de</strong> los algoritmos<br />
genéticos que permiten el funcionamiento<br />
celular y el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> los organismos.
Genómica funcional<br />
• La genómica funcional engloba el estudio <strong>de</strong>l:<br />
• Transcriptoma: conjunto completo <strong>de</strong><br />
transcritos.<br />
• Proteoma: conjunto <strong>de</strong> proteínas codificadas<br />
por un genoma.<br />
• Interactoma: interacción <strong>de</strong> estos productos.
Genómica funcional<br />
• Planteamiento clásico:<br />
• Dirigido por una hipótesis.<br />
• Limitado el número <strong>de</strong> genes estudiados.<br />
• Planteamiento genómico:<br />
• No hay hipótesis <strong>de</strong> partida.<br />
• Información sobre miles <strong>de</strong> genes.
El paradigma pre-genómico<br />
…codifican<br />
proteínas...<br />
>protein kunase<br />
acctgttgatggcgacagggactgtatgctgatct<br />
atgctgatgcatgcatgctgactactgatgtgggg<br />
gctattgacttgatgtctatc....<br />
Genes en el<br />
<strong>DNA</strong>...<br />
…cuya estructura<br />
influye en la función...<br />
Del genotipo al<br />
fenotipo<br />
…producen el<br />
fenotipo final<br />
…a<strong>de</strong>más el<br />
ambiente...
¿Quién?<br />
Secuenciación<br />
genoma<br />
Espectrometría <strong>de</strong> masas<br />
para complejos proteícos<br />
¿Y quién más?<br />
La visión post-genómica<br />
<strong>Microarrays</strong><br />
<strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
¿Don<strong>de</strong>, cómo y cuanto?<br />
SNPs<br />
Literatura,<br />
bases <strong>de</strong> datos<br />
¿Qué<br />
sabemos?<br />
¿En qué manera?
Transcriptoma
Estudio <strong>de</strong> los perfiles <strong>de</strong> expresión <strong>de</strong> todos<br />
los genes presentes en el genoma.<br />
El método más utilizado es el <strong>de</strong> microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>,<br />
que permite el análisis simultaneo <strong>de</strong> la expresión <strong>de</strong><br />
miles <strong>de</strong> genes.
<strong>DNA</strong><br />
mRNA<br />
Transcripción<br />
G T A A T C C T C<br />
| | | | | | | | |<br />
C A T T A G G A G<br />
RNA<br />
polimerasa<br />
G U A A U C C
Regulación <strong>de</strong> la expresión génica<br />
• Varios niveles <strong>de</strong> regulación: transcripción,<br />
maduración, transporte al citoplasma,<br />
<strong>de</strong>gradación, traducción, post-traducción.<br />
• Los genes no actúan <strong>de</strong> forma aislada.<br />
• Existen re<strong>de</strong>s <strong>de</strong> interacción:<br />
• Física (directa o indirecta).<br />
• Funcional.
Sistemas <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> la expresión génica<br />
• Pasado: técnicas tradicionales para medir la<br />
expresión génica, como Northern y RT-PCR.<br />
• Desarrollo tecnológico:<br />
• Expressed Sequenced Tags (ESTs).<br />
• Serial analysis gene expression (SAGE).<br />
• Suppression substractive hybridization (SSH).<br />
• <strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>.
Cambio <strong>de</strong> escala: <strong>de</strong>l gen al genoma
Cambio <strong>de</strong> escala: <strong>de</strong>l gen al genoma
Tecnicas genómicas <strong>de</strong> alta procesividad<br />
• In<strong>de</strong>pendientes <strong>de</strong> conocimiento previo:<br />
• ESTs<br />
• SAGE<br />
• SSH<br />
• Dependientes <strong>de</strong> conocimiento previo:<br />
• <strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>
ESTs<br />
(Expressed Sequenced Tags)<br />
• Generación <strong>de</strong> colecciones <strong>de</strong> ESTs<br />
(etiquetas <strong>de</strong> secuencia expresadas).<br />
• La complejidad <strong>de</strong> los genomas eucariotas<br />
hace aconsejable no abordar inicialmente el<br />
estudio <strong>de</strong>l genoma completo.<br />
• Es preferible estudiar aquellos genes que se<br />
están expresando en un momento<br />
<strong>de</strong>terminado <strong>de</strong> la vida <strong>de</strong>l organismo.
ESTs
ESTs<br />
• Genoteca <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong>: colección <strong>de</strong> fragmentos<br />
<strong>de</strong> <strong>DNA</strong> clonados que representan el conjunto<br />
<strong>de</strong> genes que se están expresando en un<br />
órgano o tejido <strong>de</strong>terminado, o bajo una<br />
situación particular o momento <strong>de</strong> <strong>de</strong>sarrollo.<br />
• Las genotecas <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong> se secuencian <strong>de</strong><br />
forma masiva para generar miles <strong>de</strong><br />
secuencias parciales o ESTs <strong>de</strong> 200-500 bp.
ESTs
ESTs<br />
• Las diferencias en la expresión <strong>de</strong> genes<br />
pue<strong>de</strong>n ser i<strong>de</strong>ntificadas consi<strong>de</strong>rando el<br />
número <strong>de</strong> veces en que aparece<br />
representada una EST particular.<br />
• Las ESTs por su propia naturaleza, son<br />
incompletas y, hasta cierto punto, imprecisas.<br />
• Las ESTs también suelen ser suficientes<br />
para la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los genes mediante<br />
comparación con las bases <strong>de</strong> datos.
Tecnología SAGE<br />
(Serial Analysis Gene Expression)<br />
• Versión acelerada <strong>de</strong> la secuenciación <strong>de</strong><br />
ESTs.<br />
• Un segmento corto proce<strong>de</strong>nte <strong>de</strong> un mRNA<br />
(etiqueta SAGE) es suficiente para i<strong>de</strong>ntificar<br />
inequívocamente a un gen completo.<br />
• La etiqueta corta tiene que estar ubicada en<br />
una posición <strong>de</strong>finida <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la secuencia<br />
<strong>de</strong>l mRNA.
Tecnología SAGE<br />
• Generación <strong>de</strong> etiquetas SAGE (Tags) <strong>de</strong><br />
secuencias (10-14 bases).<br />
• Ligación <strong>de</strong> las etiquetas SAGE para obtener<br />
concatémeros que pue<strong>de</strong>n ser clonados y<br />
secuenciados.<br />
• Comparación <strong>de</strong> los datos <strong>de</strong> secuencia para<br />
<strong>de</strong>terminar diferencias en la expresión <strong>de</strong> los<br />
genes.
Tecnología SAGE
Tecnología SAGE
Tecnología SAGE
Tecnología SAGE: Ventajas<br />
• Principalmente los ESTs brindan información<br />
<strong>de</strong> secuencia, mientras que el SAGE provee<br />
datos cuantitativos <strong>de</strong>scribiendo la<br />
abundancia <strong>de</strong> transcritos.<br />
• Determina el nivel <strong>de</strong> expresión para cada<br />
gen, y contribuye al <strong>de</strong>scubrimiento <strong>de</strong><br />
nuevos genes.<br />
• Muy buena correlación con la abundancia <strong>de</strong><br />
RNA mensajero en la célula.
Tecnología SAGE: Problemas<br />
• Muy laborioso, laboratorios especializados y<br />
complejidad análisis <strong>de</strong> datos.<br />
• Problemas técnicos:<br />
• Digestión incompleta con la enzima<br />
que genera extremos cohesivos.<br />
• Problemas con la secuenciación<br />
masiva.
Tecnología SSH
Tecnología SSH
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
• Los microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> surgen <strong>de</strong> la<br />
necesidad <strong>de</strong> analizar la cantidad <strong>de</strong><br />
información proce<strong>de</strong>nte <strong>de</strong> los gran<strong>de</strong>s<br />
proyectos <strong>de</strong> secuenciación <strong>de</strong> genomas.<br />
• Permiten elaborar mapas finos <strong>de</strong><br />
transcripción y proporcionan información<br />
indirecta <strong>de</strong> los niveles <strong>de</strong> proteínas.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
• El análisis <strong>de</strong> microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> es una nueva<br />
tecnología que permite estudiar simultáneamente la<br />
expresión <strong>de</strong> miles <strong>de</strong> genes y analizar su expresión<br />
bajo distintas condiciones experimentales.<br />
• Los microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> constan <strong>de</strong> miles <strong>de</strong><br />
conjuntos or<strong>de</strong>nados <strong>de</strong> moléculas <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> <strong>de</strong><br />
secuencia conocida <strong>de</strong>positados en un soporte sólido<br />
(~ 2 cm 2 ) como cristal, nylon o silicio.<br />
• Cada combinación (gen/muestra) se localiza <strong>de</strong> forma<br />
inequívoca en un punto <strong>de</strong>l microarray.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
• Los microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> permiten la medida<br />
simultánea <strong>de</strong> los niveles <strong>de</strong> expresión <strong>de</strong> miles <strong>de</strong><br />
genes (sondas) en un solo experimento <strong>de</strong><br />
hibridación con una mezcla compleja <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> o RNA<br />
(dianas).<br />
• Sondas: secuencias <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> conocidas<br />
(oligonucleótidos o productos <strong>de</strong> PCR) inmovilizadas<br />
or<strong>de</strong>nadamente sobre una superficie sólida.<br />
• Dianas: muestra problema <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> o RNA marcada<br />
cuya abundancia será <strong>de</strong>terminada por hibridación.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> - El concepto<br />
Medir el nivel <strong>de</strong> transcritos (mRNA) <strong>de</strong> un gran número<br />
<strong>de</strong> genes simultáneamente para <strong>de</strong>terminar que genes<br />
se están expresando en la célula.<br />
CELL<br />
RNA
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> – El objetivo<br />
• El objetivo <strong>de</strong> los experimentos con microarrays <strong>de</strong><br />
<strong>DNA</strong> es comparar la expresión <strong>de</strong> múltiples genes<br />
(transcripción) en distintas condiciones:<br />
• Momentos distintos <strong>de</strong>l tiempo<br />
• Tejidos distintos<br />
• Tejidos sanos o enfermos (p.e. Tumores)<br />
• Se basan en tecnologías conocidas como la<br />
hibridación y la fluorescencia.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> - Hibridación<br />
A<br />
G<br />
C<br />
A<br />
C<br />
T<br />
G<br />
T<br />
A<br />
T<br />
C<br />
G<br />
T<br />
G<br />
A<br />
C<br />
A<br />
T<br />
A<br />
G<br />
C<br />
A<br />
C<br />
T<br />
G<br />
T<br />
A<br />
T<br />
C<br />
G<br />
T<br />
G<br />
A<br />
C<br />
A<br />
T
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> - Hibridación<br />
Mediante hibridación, pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>tectar <strong>DNA</strong> o RNA:<br />
Si el <strong>DNA</strong> o RNA hibridado<br />
está marcado<br />
fluorescentemente pue<strong>de</strong> ser<br />
cuantificado mediante<br />
escaneado <strong>de</strong>l chip <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> – Sondas<br />
• Cada sonda <strong>de</strong>l microarray <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> está diseñada<br />
para unirse a un gen <strong>de</strong> forma específica.<br />
• Diseño <strong>de</strong> sondas específicas:<br />
• Especificidad <strong>de</strong> secuencia.<br />
• Tms homogéneas.<br />
• Sin estructuras secundarias.<br />
• Cada sonda está dispuesta <strong>de</strong> forma or<strong>de</strong>nada sobre<br />
el microarray <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> – El proceso<br />
Sondas <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
específicas <strong>de</strong> gen<br />
gen<br />
mRNA<br />
c<strong>DNA</strong> marcado
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> – El resultado<br />
• Los microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> están formados por 100 - 1<br />
millón <strong>de</strong> sondas <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> sobre una superficie <strong>de</strong><br />
1 cm por 1 cm (chip <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>).<br />
• Los resultados <strong>de</strong> microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> se basan en el<br />
concepto <strong>de</strong> “culpable por asociación”.<br />
• Genes que son co-regulados (patrón similar <strong>de</strong><br />
comportamiento) es probable que estén<br />
funcionalmente relacionados formando parte <strong>de</strong>l<br />
mismo proceso biológico.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> – El reto<br />
• Los microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> son una revolución por su<br />
capacidad <strong>de</strong> realizar experimentos inconcebibles<br />
hasta hace poco tiempo.<br />
• Los nuevos chips <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> podrán contener (y por<br />
tanto estudiar) el genoma humano en 2 cm 2 .<br />
• Esto genera cantida<strong>de</strong>s ingentes <strong>de</strong> datos que <strong>de</strong>ben<br />
ser almacenadas, procesadas y analizadas:<br />
- Al tratarse <strong>de</strong> una nueva técnica la mayor parte<br />
<strong>de</strong> métodos, protocólos o estándares se están<br />
aún <strong>de</strong>finiendo.
El primer Microarray <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
• 45 Genes <strong>de</strong> Arabidopsis y 3 genes control:<br />
total 48 señales.<br />
• Schena et al., (1995). Quantitative monitoring of gene expression<br />
patterns with a complementary <strong>DNA</strong> microarray. Science 270, 467-470.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> – Experimento básico<br />
• Un experimento básico <strong>de</strong> microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
consiste en:<br />
1- Diseño y fabricación <strong>de</strong>l microarray.<br />
2- Preparación <strong>de</strong> la muestra e hibridación.<br />
3- Escaneo <strong>de</strong>l microarray.<br />
4- Análisis <strong>de</strong> imagen.<br />
5- Análisis <strong>de</strong> los resultados.
Diseño Array<br />
Diseño Sonda<br />
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
PREGUNTA<br />
Diseño Experimental<br />
Preparación Muestra<br />
Hibridación<br />
Análisis <strong>de</strong> Imagen<br />
Preprocesamiento <strong>de</strong> datos<br />
Normalización<br />
Análisis Estadístico<br />
Análisis Avanzado <strong>de</strong> Datos<br />
Extracción <strong>de</strong> Genes Relevantes<br />
RESPUESTA<br />
Compra Chip/Array
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> – Experimento básico
Diseño y fabricación
Diseño y fabricación<br />
• La primera fase <strong>de</strong>l diseño <strong>de</strong>l microarray <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
consiste en la selección <strong>de</strong> los genes que se <strong>de</strong>sean<br />
incorporar al experimento.<br />
• Las secuencias necesarias pue<strong>de</strong>n obtenerse, por<br />
ejemplo, <strong>de</strong> una base <strong>de</strong> datos <strong>de</strong> ESTs.<br />
• Pue<strong>de</strong> haber problemas en la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> las<br />
secuencias :<br />
• Errores <strong>de</strong> secuenciación<br />
• Splicing alternativo<br />
• Contaminación
Diseño y fabricación - Sondas<br />
• Una vez seleccionados los genes se realizan<br />
múltiples copias <strong>de</strong> cada uno mediante PCR, y los<br />
productos (sondas) se <strong>de</strong>positan en el sustrato.<br />
• Tipos <strong>de</strong> sondas:<br />
• Genotecas <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong> (Stanford microarrays)<br />
• Oligonucleótidos (Affymetrix)<br />
• El soporte sólido (sustrato) <strong>de</strong>l microarray suele ser<br />
cristal, y también membranas <strong>de</strong> nylon o plástico.
Diseño y fabricación – Adhesión sondas<br />
• La adhesión <strong>de</strong> las sondas sobre el sustrato pue<strong>de</strong><br />
hacerse mediante diversas técnicas:<br />
• Impresión mecánica (capilaridad) o<br />
microinyección (Ink-jet) → Stanford microarrays<br />
• Fotolitografía → Affymetrix<br />
• Existen dos tipos <strong>de</strong> tecnologías <strong>de</strong> microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>:<br />
• Arrays <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong>s: Stanford <strong>Microarrays</strong>.<br />
• Arrays <strong>de</strong> oligonucleótidos: Affymetrix.
Preparación <strong>de</strong> la muestra
Preparación <strong>de</strong> la muestra<br />
• Paralelamente al diseño y fabricación <strong>de</strong>l microarray<br />
que contiene los genes (sondas) cuya expresión se<br />
<strong>de</strong>sea estudiar...<br />
• ...<strong>de</strong>ben prepararse las muestras problema (dianas)<br />
en las que se <strong>de</strong>sea estudiar la expresión <strong>de</strong> estos<br />
genes.<br />
• Extracción <strong>de</strong> todo el mRNA <strong>de</strong> las células en las<br />
condiciones que se <strong>de</strong>sea estudiar, y posterior<br />
marcaje <strong>de</strong>l mRNA.
Preparación <strong>de</strong> la muestra<br />
1. Diseño experimental<br />
2. Realizar experimento<br />
3. Precipitar RNA<br />
4. Marcaje RNA<br />
¿Pregunta?<br />
¿Réplicas?<br />
mutante<br />
¿Eucariota/procariota?<br />
¿Pared celular?<br />
¿Amplificación?<br />
¿Directo o indirecto?<br />
¿Tipo <strong>de</strong> marcaje?<br />
silvestre
Hibridación
Hibridación<br />
• Una vez preparadas y marcadas las muestras<br />
problema (dianas) se <strong>de</strong>positan sobre las sondas en<br />
el microarray <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>.<br />
• Esto hará que los c<strong>DNA</strong>s o cRNAs <strong>de</strong> las muestras<br />
problema se puedan hibridar con los <strong>de</strong> cada gen<br />
contenido en las sondas <strong>de</strong>l microarray <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>.<br />
• La hibridación tendrá lugar en un grado proporcional<br />
a la expresión <strong>de</strong>l gen <strong>de</strong> cada sonda en cada<br />
muestra problema.
Hibridación<br />
• En arrays <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong> las muestras problema se juntan<br />
y se hibridan en un único microarray.<br />
• En arrays <strong>de</strong> oligonucleótidos las muestras se<br />
hibridan por separado en dos microarrays idénticos.<br />
• Tras la hibridación, el microarray se lava para<br />
eliminar el material que no se ha hibridado.<br />
• La intensidad <strong>de</strong> la señal <strong>de</strong> hibridación resultante es<br />
proporcional a la cantidad <strong>de</strong> mRNA que correspon<strong>de</strong><br />
a esa secuencia en la muestra original.
Hibridación<br />
• La <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> la hibridación es un paso clave para<br />
<strong>de</strong>terminar qué sondas se han unido a sus dianas<br />
complementarias proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> la muestra.<br />
• Las principales técnicas <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> la hibridación<br />
requieren <strong>de</strong>l marcaje previo <strong>de</strong> las dianas:<br />
• c<strong>DNA</strong>: Stanford <strong>Microarrays</strong>.<br />
• cRNA: Affymetrix.
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>:<br />
el paradigma <strong>de</strong> una técnica post-genómica<br />
Cy5 Cy3<br />
Arrays <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong> Arrays <strong>de</strong> oligonucleótidos
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> - La tecnología<br />
Stanford <strong>Microarrays</strong><br />
Affymetrix<br />
(GENECHIP)
Stanford <strong>Microarrays</strong>
Stanford <strong>Microarrays</strong> – Arrays <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong><br />
Portas <strong>de</strong> cristal<br />
Hibridación<br />
Impresión <strong>de</strong> las sondas<br />
Post-procesamiento
Stanford microarrays – Impresión robótica<br />
Arrays <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong>
Stanford microarrays – Impresión robótica<br />
Mecánica (capilaridad)<br />
Ink-jet (microinyección)
Stanford microarrays – Impresión robótica<br />
• Tamaño <strong>de</strong>l lunar: 100-300 µm (Ø)<br />
• Espaciado: 150-300 µm<br />
• Número lunares I. mecánica: 250-1000 lunares/cm 2<br />
• Número lunares Ink-jet: >2500 lunares/cm 2<br />
• Cantidad <strong>DNA</strong>:
Stanford microarrays – Perfiles <strong>de</strong> expresión génica<br />
Preparar Microarray<br />
Clones <strong>DNA</strong> PCR<br />
Aislar RNA y marcar<br />
Muestra A Aislar<br />
RNA<br />
Purificar<br />
productos<br />
Marcaje con Cy5<br />
Muestra B Aislar<br />
RNA Marcaje con Cy3<br />
Mezclar, hibridar sondas y analizar datos<br />
Hibridar al<br />
microarray<br />
Impresión<br />
robótica<br />
Lavar Analizar datos
Stanford microarrays – Marcaje dianas (c<strong>DNA</strong>)<br />
Fluorescencia (Cyanine 3 vs. Cyanine 5)<br />
Radioactividad ( 3 H vs. 35 S o 33 P vs. 14 C)<br />
Los dos marcajes más comunes son los fluorocromos<br />
<strong>de</strong> cianina:<br />
Cy3, absorción 554 nm, emisión 568 nm<br />
Cy5, absorción 650 nm, emisión 672 nm<br />
Pero también se utilizan fluorocromos Alexa:<br />
Alexa Fluor 546<br />
Alexa Fluor 647
Stanford microarrays – Marcaje dianas (c<strong>DNA</strong>)<br />
Excitation Emission Excitation Emission
Stanford microarrays – Marcaje dianas (c<strong>DNA</strong>)
Stanford microarrays: marcaje dianas (c<strong>DNA</strong>)<br />
mRNA<br />
c<strong>DNA</strong><br />
G U A A U C C U C<br />
Transcriptasa<br />
Reversa<br />
T T A G G A G<br />
C A T T A G G A G<br />
C A T T A G G A G<br />
C<br />
C<br />
A T T A G G A G<br />
C<br />
A T<br />
C<br />
T<br />
C<br />
A<br />
A<br />
A<br />
T<br />
G<br />
T T<br />
A<br />
G<br />
A<br />
G<br />
A<br />
G<br />
G<br />
G<br />
A<br />
A<br />
G<br />
C<br />
A<br />
A<br />
T<br />
T T<br />
A<br />
A<br />
G<br />
G<br />
G<br />
G<br />
A<br />
A<br />
G<br />
G G<br />
C A T T A G G A G<br />
Retrotranscripción: Obtener ca<strong>de</strong>nas <strong>de</strong> c<strong>DNA</strong><br />
complementarias al mRNA
Stanford microarrays: marcaje dianas (c<strong>DNA</strong>)<br />
Cy5 Cy3
Stanford microarrays: el proceso<br />
Cy5 Cy3
mRNA<br />
c<strong>DNA</strong><br />
Cy5-c<strong>DNA</strong><br />
Stanford microarrays<br />
Muestra A Muestra B<br />
IMPRESIÓN<br />
SONDAS<br />
mRNA<br />
c<strong>DNA</strong><br />
Cy3-c<strong>DNA</strong>
Stanford microarrays – Detección marcaje<br />
• Las muestras hibridadas sobre el microarray se<br />
iluminan sucesivamente con luz láser <strong>de</strong> dos colores<br />
distintos para estimular la fluorescencia <strong>de</strong> uno u otro<br />
fluorocromo.<br />
• La cantidad <strong>de</strong> mRNA unido a una muestra se pue<strong>de</strong><br />
medir por la intensidad <strong>de</strong> la fluorescencia emitida al<br />
ser iluminada por el láser <strong>de</strong>l color correspondiente.
Stanford microarrays – Detección marcaje
Stanford microarrays – Detección marcaje<br />
• Si la muestra 1 se marca con rojo y la muestra 2 con<br />
ver<strong>de</strong> se obtendra en cada punto <strong>de</strong>l microarray que:<br />
• Si el RNA <strong>de</strong> la muestra 1 abunda más que el <strong>de</strong><br />
la otra muestra se <strong>de</strong>tecta como un punto rojo.<br />
• Si el RNA <strong>de</strong> la muestra 2 abunda más que el <strong>de</strong><br />
la otra muestra se <strong>de</strong>tecta como un punto ver<strong>de</strong>.<br />
• Si ambos se expresan por igual se <strong>de</strong>tecta como<br />
un punto amarillo.<br />
• Si en ninguna <strong>de</strong> las dos muestras hay mRNA se<br />
<strong>de</strong>tecta como un punto negro.
Stanford microarrays – Detección marcaje<br />
• Las intensida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> las<br />
fluorescencias emitidas<br />
permiten <strong>de</strong>terminar los<br />
niveles relativos <strong>de</strong> expresión<br />
<strong>de</strong> los genes en ambas<br />
muestras problema.
Stanford microarrays: problemas
Stanford microarrays: problemas
La tecnología Affymetrix
La tecnología Affymetrix - Genechip ®
La tecnología Affymetrix - Sondas<br />
• Arrays <strong>de</strong> oligonucleótidos: síntesis in situ <strong>de</strong><br />
oligonucleótidos <strong>de</strong> 25 bases sobre una superficie<br />
cuadrada <strong>de</strong> cristal (1.3 cm x 1.3 cm) mediante<br />
fotolitografía.<br />
• 11-20 parejas <strong>de</strong> sondas específicas para cada gen.<br />
• Sobrerepresentación extremos 3´<strong>de</strong> los mRNA.<br />
• Seleccionadas para maximizar las temperaturas <strong>de</strong><br />
hibridación y la especificidad.
La tecnología Affymetrix - Sondas<br />
• Tamaño <strong>de</strong>l lunar: ~150 µm (Ø).<br />
• Densidad: 10.000-250.000 oligonucleótidos/cm 2 .<br />
• Millones <strong>de</strong> copias <strong>de</strong> cada oligonucleótido<br />
específico (10 7 -10 8 copias).<br />
• Un array <strong>de</strong> oligonucleótidos pue<strong>de</strong> contener<br />
400.000 sondas (aproximadamente 20.000 genes).<br />
• El array <strong>de</strong> S. cerevisae contiene 6.000 oligos, que<br />
representan todos sus genes conocidos.
La tecnología Affymetrix - Sondas<br />
• Para cada gen existen dos sondas: una <strong>de</strong> homología<br />
perfecta (PM, Perfect Match) <strong>de</strong> 25 bases y otra con<br />
una error <strong>de</strong>liberado/mutación (MM, MisMatch) en la<br />
zona central.<br />
• Buena calidad <strong>de</strong> datos/ baja varianza.<br />
• La presencia <strong>de</strong> numerosos genes <strong>de</strong> control permite<br />
una casi perfecta normalización entre diferentes<br />
experimentos.
La tecnología Affymetrix - Sondas<br />
Cada gen está representado por dos sondas:<br />
- Perfect Match (PM)<br />
- MisMatch (MM) – control hibridación<br />
PM: CGATCAATTGCACTATGTCATTTCT<br />
MM: CGATCAATTGCAGTATGTCATTTCT<br />
PM<br />
MM
La tecnología Affymetrix - Sondas<br />
Cada sonda tiene 25 bases<br />
22-40 sondas por gen<br />
Parejas <strong>de</strong> sondas:<br />
• Perfect Match (PM)<br />
• MisMatch (MM)
La tecnología Affymetrix: síntesis sondas<br />
Cy5 Cy3<br />
Síntesis in situ mediante fotolitografía
La tecnología Affymetrix – Síntesis sondas<br />
Mask #2<br />
Mask #1<br />
T<br />
T<br />
A<br />
T<br />
T<br />
T<br />
A<br />
T<br />
A<br />
T<br />
T<br />
A<br />
Espaciadores unidos a la superficie <strong>de</strong><br />
cristal con grupos protectores fotolábiles<br />
T<br />
T<br />
A<br />
A<br />
A<br />
A<br />
A<br />
A
La tecnología Affymetrix – Síntesis sondas<br />
Luz<br />
(<strong>de</strong>sprotección)<br />
OOOOO<br />
Luz<br />
(<strong>de</strong>sprotección)<br />
TTOOO<br />
Máscara scara<br />
Sustrato<br />
Máscara scara<br />
Sustrato<br />
C –<br />
HO HO O O O TTOOO<br />
T –<br />
TTCCO<br />
REPETIR<br />
CATAT<br />
AGCTG<br />
TTCCG
La tecnología Affymetrix: marcaje dianas (cRNA)<br />
Cy5 Cy3<br />
cRNA fragmentados y biotinilados aislados<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> amplificación lineal
La tecnología Affymetrix - Equipamiento<br />
Fluidic Station Scanner
La tecnología Affymetrix – El proceso
La tecnología Affymetrix: el proceso<br />
Cy5 Cy3
La tecnología Affymetrix: <strong>de</strong>tección marcaje<br />
Cy5 Cy3
La tecnología Affymetrix – El experimento
La tecnología Affymetrix<br />
GeneChip<br />
1.28cm<br />
Célula <strong>de</strong> hibridación<br />
Diana cRNA <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na<br />
sencilla marcado<br />
Sonda Oligonucleotido<br />
Imágen <strong>de</strong> un Genechip hibridado<br />
* *<br />
* *<br />
*<br />
>200,000 differentes<br />
sondas complementarias<br />
24µm 24<br />
Millones <strong>de</strong> copias <strong>de</strong> cada<br />
oligonucleótido específico<br />
(10 7 -10 8 copias)
La tecnología Affymetrix
La tecnología Affymetrix – Arrays comerciales<br />
Humano<br />
Ratón<br />
Rata<br />
Arabidopsis<br />
C. elegans<br />
Perro<br />
Drosophila<br />
E. coli<br />
P. aeruginosa<br />
Plasmodium/Anopheles<br />
Vitis vinifera (uva)<br />
Xenopus laevis<br />
S. cerevisiae<br />
Pez cebra
Resumen<br />
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> - Comparativa<br />
Stanford microarrays:<br />
Flexible, también especies sin secuenciar<br />
Requiere menor presupuesto<br />
Calidad <strong>de</strong> datos: media-alta<br />
Affymetrix:<br />
No flexible, sólo especies secuenciadas<br />
Equipamiento caro<br />
Calidad <strong>de</strong> datos: alta
Análisis <strong>de</strong> imágen
Diseño Array<br />
Diseño Sonda<br />
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
PREGUNTA<br />
Diseño Experimental<br />
Preparación Muestra<br />
Hibridación<br />
Análisis <strong>de</strong> Imagen<br />
Pre-procesamiento <strong>de</strong> datos<br />
Normalización<br />
Análisis Estadístico<br />
Análisis Avanzado <strong>de</strong> Datos<br />
Extracción <strong>de</strong> Genes Relevantes<br />
RESPUESTA<br />
Compra Chip/Array
Análisis <strong>de</strong> imágen<br />
• Esta nueva forma <strong>de</strong> experimentar requiere <strong>de</strong><br />
nuevas herramientas <strong>de</strong> análisis y visualización <strong>de</strong><br />
resultados.<br />
• Cada experimento <strong>de</strong> microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong> genera<br />
una gran cantidad <strong>de</strong> datos y es preciso realizar un<br />
procesamiento apropiado <strong>de</strong> los mismos.<br />
• Transformación <strong>de</strong> las imágenes en números.
Análisis <strong>de</strong> imágen<br />
Escaneado<br />
-Escáner Confocal<br />
-Escáner CCD<br />
Formatos archivos imágen<br />
Análisis <strong>de</strong> imágen<br />
-Localización <strong>de</strong> los puntos<br />
-Segmentación <strong>de</strong> los puntos<br />
-Evaluación calidad <strong>de</strong> los datos
Análisis <strong>de</strong> imágen – Escaneado<br />
Escaneado <strong>de</strong>l porta
Análisis <strong>de</strong> imágen – Escáner confocal<br />
Microscopía confocal
Análisis <strong>de</strong> imágen – Escáner CCD<br />
Luz blanca<br />
Cámara CCD<br />
Filtro excitación<br />
Filtro emisión<br />
Beamsplitter
Análisis <strong>de</strong> imágen – Formato archivos imágen<br />
Los escáners generan un archivo gráfico y el formato <strong>de</strong> archivo<br />
<strong>de</strong> imágen más común es TIFF <strong>de</strong> 16 bits.<br />
Un archivo TIFF <strong>de</strong> 16 bits <strong>de</strong>scribe cada pixel en una imagen<br />
con una intensidad entre 0 y 65535.<br />
Normalmente dos escáners en diferentes longitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong> onda<br />
originan dos archivos monócromos que se superponen.<br />
COMPOSICIÓN<br />
Canal Cy3<br />
Canal Cy5
Análisis <strong>de</strong> imágen – Formato archivos imágen<br />
PM/MM<br />
DOS COLORES<br />
Muestra 1 marcada en rojo (Cy5)<br />
Muestra 2 marcada en ver<strong>de</strong> (Cy3)<br />
Rojo: gen inducido en Muestra 1<br />
Ver<strong>de</strong>: gen inducido en Muestra 2<br />
Amarillo:-niveles similares <strong>de</strong><br />
expresión<br />
Rojo/Ver<strong>de</strong>: ratio <strong>de</strong> expresión<br />
UN COLOR<br />
La intensidad <strong>de</strong> la expresión <strong>de</strong> un<br />
gen utilizando las sondas (PM)<br />
(en algunos casos MM- control)<br />
Los archivos gráficos generados por<br />
el escáner se analizan mediante<br />
diferentes programas informáticos.
Análisis <strong>de</strong> imágen – Stanford microarrays<br />
Hígado (Cy5) / Cerebro (Cy3)<br />
Pérfiles <strong>de</strong> expresión génica en Hígado y Cerebro
Análisis <strong>de</strong> imágen – La tecnologia Affymetrix<br />
Affymetrix Human Genome U95A Genechip<br />
hibridado con cerebro fetal
Análisis <strong>de</strong> imágen – Localización <strong>de</strong> los puntos<br />
La i<strong>de</strong>ntificación y cuantificación <strong>de</strong> las señales <strong>de</strong> hibridación (puntos)<br />
pue<strong>de</strong> realizarse <strong>de</strong> forma manual, automática y semiautomática.<br />
Se dibuja una parrilla sobre la imagen para ayudar al programa en la<br />
i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> puntos individuales.
Análisis <strong>de</strong> imágen – Segmentación <strong>de</strong> los puntos<br />
Clasificación <strong>de</strong> cada pixel en cada imagen como señal<br />
o ruido <strong>de</strong> fondo.<br />
Para cada punto individual obtener las medidas <strong>de</strong>:<br />
Señal, Fondo y Calidad.<br />
Fixed circle<br />
Adaptive circle<br />
Adaptive shape<br />
Método Programa<br />
Histogram method<br />
ScanAlyze, GenePix, QuantArray<br />
GenePix, Dapple<br />
Spot<br />
ImaGene, QuantArray
Análisis <strong>de</strong> imágen – Segmentación <strong>de</strong> los puntos<br />
Intensidad <strong>de</strong> los puntos: calculo <strong>de</strong> la media<br />
<strong>de</strong> los pixel en cada punto.<br />
Corrección <strong>de</strong>l ruido <strong>de</strong> fondo: local o global.
Análisis <strong>de</strong> imágen – Evaluación calidad <strong>de</strong> los datos<br />
La mayor parte <strong>de</strong> las irregularida<strong>de</strong>s se pue<strong>de</strong>n<br />
<strong>de</strong>tectar por las siguientes medidas:<br />
Variabilidad <strong>de</strong> la intensidad<br />
Desviación <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong> punto<br />
Desviación <strong>de</strong> la circularidad<br />
Intensidad <strong>de</strong> señal relativa al fondo<br />
Desviación <strong>de</strong> la posición en la parrilla<br />
En base a estas medidas, se pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>scartar puntos<br />
irregulares.
Análisis <strong>de</strong> imágen – Evaluación calidad <strong>de</strong> los datos
Análisis <strong>de</strong> imágen – Evaluación calidad <strong>de</strong> los datos<br />
Field Meta Row Meta Column Row Column Gene_ID Flag Signal Mean Background Mean<br />
A 1 1 1 2 ZY030076 0 4655 463<br />
A 1 1 1 3 ZY030066 0 15938 405<br />
A 1 1 1 4 ZY029209 0 7441 390<br />
A 1 1 1 5 ZY030089 0 1842 399<br />
A 1 1 1 6 ZY030084 0 6864 401<br />
A 1 1 1 7 ZY007003 2 471 481<br />
A 1 1 1 8 ZY006869 0 8576 447<br />
A 1 1 1 9 ZY007954 0 4965 405<br />
A 1 1 1 10 ZY006866 0 2236 374<br />
A 1 1 1 11 ZY006782 0 2088 355<br />
A 1 1 1 12 ZY006907 0 4726 342<br />
A 1 1 1 13 ZY006593 0 4437 338<br />
A 1 1 1 14 ZY006850 0 917 321<br />
Matriz <strong>de</strong> datos <strong>de</strong> expresión génica
Normalización
Diseño Array<br />
Diseño Sonda<br />
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
PREGUNTA<br />
Diseño Experimental<br />
Preparación Muestra<br />
Hibridación<br />
Análisis <strong>de</strong> Imagen<br />
Pre-procesamiento <strong>de</strong> datos<br />
Normalización<br />
Análisis Estadístico<br />
Análisis Avanzado <strong>de</strong> Datos<br />
Extracción <strong>de</strong> Genes Relevantes<br />
RESPUESTA<br />
Compra Chip/Array
Normalización<br />
• En general, los niveles <strong>de</strong> expresión <strong>de</strong> genes<br />
individuales se mi<strong>de</strong>n por:<br />
• log (R/G)<br />
• log (PM/MM)<br />
• En cualquier experimento biológico es esencial conocer<br />
el grado <strong>de</strong> reproducibilidad <strong>de</strong> las medidas.<br />
• La repetición <strong>de</strong> experimentos <strong>de</strong> microarrays es costosa.<br />
• El factor limitante pue<strong>de</strong> ser la cantidad <strong>de</strong> muestra<br />
biológica.
Normalización<br />
• Pre-procesamiento <strong>de</strong> datos iniciales previo al análisis<br />
estadístico y análisis avanzado <strong>de</strong> los datos.<br />
• Cada valor <strong>de</strong> intensidad proviene <strong>de</strong> una imagen<br />
in<strong>de</strong>pendiente y es necesario hacer que estos valores<br />
sean comparables. Ajuste básico: igualar la intensidad<br />
media <strong>de</strong> las imágenes.<br />
• Las intensida<strong>de</strong>s no son únicamente concentraciones <strong>de</strong><br />
mRNA, hay múltiples fuentes <strong>de</strong> variación que pue<strong>de</strong>n<br />
afectar y <strong>de</strong>sviar seriamente la interpretación <strong>de</strong> los<br />
resultados.
Normalización – Fuentes <strong>de</strong> variación<br />
Contaminación <strong>de</strong> tejidos<br />
Degradación<br />
Purificación RNA<br />
Transcripción reversa<br />
Eficiencia <strong>de</strong> amplificación<br />
Eficiencia <strong>de</strong> marcaje<br />
(Cy3/Cy5)<br />
Soporte unión <strong>DNA</strong><br />
Spotting<br />
Otros temas relacionados<br />
con la preparación <strong>de</strong>l array<br />
Corrección <strong>de</strong>l fondo<br />
Segmentación <strong>de</strong> la imagen<br />
Eficiencia y especificidad <strong>de</strong><br />
hibridación<br />
Efectos espaciales
A<br />
B<br />
C<br />
Normalización<br />
(a) Después <strong>de</strong> normalización por intensidad media<br />
(b) Después <strong>de</strong> normalización por Lowess<br />
(c) Después <strong>de</strong> normalización teniendo en cuenta<br />
efectos espaciales<br />
Antes (izda.) y <strong>de</strong>spués normalización (dcha.).<br />
(A) BoxPlots<br />
(B) BoxPlots <strong>de</strong> subarrays<br />
(C) MA plots (ratio versus intensidad)
Análisis Estadístico
Diseño Array<br />
Diseño Sonda<br />
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
PREGUNTA<br />
Diseño Experimental<br />
Preparación Muestra<br />
Hibridación<br />
Análisis <strong>de</strong> Imagen<br />
Pre-procesamiento <strong>de</strong> datos<br />
Normalización<br />
Análisis Estadístico<br />
Análisis Avanzado <strong>de</strong> Datos<br />
Extracción <strong>de</strong> Genes Relevantes<br />
RESPUESTA<br />
Compra Chip/Array
Análisis estadístico<br />
• Prácticamente cualquier técnica estadística tiene<br />
cabida en los estudios <strong>de</strong> microarrays <strong>de</strong> <strong>DNA</strong>.<br />
• La técnica <strong>de</strong> agrupamiento <strong>de</strong> datos más popular es<br />
el análisis <strong>de</strong> conglomerados:<br />
• A partir <strong>de</strong> la matriz <strong>de</strong> datos <strong>de</strong> expresión<br />
génica.<br />
• Busca formar “grupos naturales”<br />
(conglomerados o clusters) <strong>de</strong> genes o <strong>de</strong><br />
condiciones experimentales que permitan<br />
respon<strong>de</strong>r las preguntas <strong>de</strong>l estudio.
Análisis estadístico<br />
• El análisis <strong>de</strong> conglomerados<br />
permite visualizar aquellos<br />
genes cuyos perfiles <strong>de</strong><br />
expresión son más similares.<br />
• Para facilitar la visualización los<br />
números vuelven a convertirse<br />
en colores.
Análisis estadístico<br />
• Otra forma usual <strong>de</strong><br />
representar los datos es a<br />
través <strong>de</strong> un gráfico que<br />
muestre como varia la<br />
expresión <strong>de</strong>l gen entre los<br />
distintos experimentos.
Análisis <strong>de</strong> resultados
Diseño Array<br />
Diseño Sonda<br />
<strong>Microarrays</strong> <strong>de</strong> <strong>DNA</strong><br />
PREGUNTA<br />
Diseño Experimental<br />
Preparación Muestra<br />
Hibridación<br />
Análisis <strong>de</strong> Imagen<br />
Pre-procesamiento <strong>de</strong> datos<br />
Normalización<br />
Análisis Estadístico<br />
Análisis Avanzado <strong>de</strong> Datos<br />
Extracción <strong>de</strong> Genes Relevantes<br />
RESPUESTA<br />
Compra Chip/Array
Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
• Una vez extraída la información <strong>de</strong> las imágenes hay que<br />
analizar e interpretar los resultados.<br />
• ¿Cómo es posible organizar, visualizar y explorar el<br />
significado <strong>de</strong> millones <strong>de</strong> datos <strong>de</strong> expresión <strong>de</strong> miles <strong>de</strong><br />
genes bajo cientos <strong>de</strong> condiciones distintas?.<br />
• La forma <strong>de</strong> analizar los datos <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>rá <strong>de</strong> lo que se<br />
<strong>de</strong>see averiguar.
Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
• Los patrones o perfiles <strong>de</strong> expresión génica se pue<strong>de</strong>n<br />
estudiar <strong>de</strong>s<strong>de</strong> dos puntos <strong>de</strong> vista:<br />
• A) Comparaciones enfocadas en los genes: análisis <strong>de</strong> la<br />
expresión específica <strong>de</strong> los genes en experimentos<br />
comparativos (p.e . Tejidos diferentes).<br />
• B) Comparaciones enfocadas en las muestras: estudio<br />
<strong>de</strong> las alteraciones <strong>de</strong>l nivel <strong>de</strong> expresión en una<br />
<strong>de</strong>terminada situación fisiológica o patológica con el<br />
objetivo <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar los genes implicados.
Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
• A) Comparaciones enfocadas en los genes: Análisis <strong>de</strong><br />
los valores <strong>de</strong> inducción/represión en una serie <strong>de</strong><br />
experimentos comparativos.<br />
• Esto permite la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> grupos <strong>de</strong> expresión,<br />
genes con patrones <strong>de</strong> expresión correlacionados.<br />
• Si un número <strong>de</strong> genes se inducen/reprimen <strong>de</strong> la misma<br />
manera en varias situaciones, es probable que:<br />
• Los genes estén regulados conjuntamente o,<br />
• Los genes estén relacionados funcionalmente<br />
(participan en el mismo proceso biológico).
Análisis <strong>de</strong> resultados<br />
• B) Comparaciones enfocadas en las muestras:<br />
Diferencias a nivel fenotípico son la causa <strong>de</strong> diferencias<br />
a nivel molecular que, en muchos casos, pue<strong>de</strong>n<br />
<strong>de</strong>tectarse midiendo los niveles <strong>de</strong> expresión génica.<br />
• I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> genes implicados en procesos<br />
biológicos o condiciones experimentales <strong>de</strong> interés<br />
(p.e. Tratamiento hormonal, tumores, etc.).<br />
• También se pue<strong>de</strong>n i<strong>de</strong>ntificar perfiles <strong>de</strong> expresión <strong>de</strong><br />
genes con capacidad <strong>de</strong> diagnóstico.
Análisis <strong>de</strong> resultados
Análisis <strong>de</strong> resultados - Aplicaciones<br />
• Estudios <strong>de</strong> expresión diferencial <strong>de</strong> genes<br />
• Análisis <strong>de</strong> patógenos<br />
• I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> enfermeda<strong>de</strong>s genéticas complejas<br />
• Detección <strong>de</strong> mutaciones y <strong>de</strong> Polimorfismos simples<br />
<strong>de</strong> nucleótido (SNPs)<br />
• Farmacogenómica<br />
• Diseño y <strong>de</strong>scubrimiento <strong>de</strong> fármacos<br />
• Estudios toxicológicos
Análisis <strong>de</strong> resultados - Aplicaciones<br />
Estudio <strong>de</strong> expresión diferencial <strong>de</strong> genes<br />
I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> genes implicados en procesos biológicos <strong>de</strong> interés
Análisis <strong>de</strong> resultados - Aplicaciones<br />
Estudio <strong>de</strong> distintos genotipos / Farmacogenómica<br />
Respuesta a fármacos, toxicidad, predisposición <strong>de</strong>sarrollo enfermeda<strong>de</strong>s, etc.