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Marcadores
moleculares
basados en la
Amplificación
sitio-específica
del ADN
Marcadores moleculares SCAR, STS
y CAPS
Sequence Characterized Amplified Regions (amplificación
de regiones de secuencia caracterizada )
Sequence-Tagged Sites (secuencias indicadoras de un sitio
específico)
Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (secuencia amplificada
y clivada polimórfica)

Obtención
de marcadores
SCAR
Un fragmento polimórfico de interés, puede ser escindido de un
gel, clonado (o no) y secuenciado para diseñar iniciadores
específicos para ese fragmento en particular, permitiendo su
amplificación en condiciones de PCR más rigurosas.

STS
Amplificación específica de alelos (ASA)
Adaptado de Nakayashiki N & Sasaki Y, Int J Legal Med, 1996.

CAPS
• Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
también conocido como PCR-RFLP
- El producto de interés amplificado es digerido
con alguna enzima de restricción y visualizado
directamente mediante electroforesis en gel
de agarosa y tinción con bromuro de etidio.
- Esta metodología es más informativa cuando
los sitios de restricción están mapeados dentro
del locus.

Propiedades
de los
marcadores
basados en la
Amplificación
de fragmentos
de ADN
conocidos
• Son muy utilizados en mapeo físico de genomas.
• Su análisis es sencillo
(muy útiles en selección asistida).
• El ensayo es altamente reproducible.
• Son fácilmente transferibles a otros laboratorios.
• Según las caracterísitcas de su diseño,
pueden ser codominantes.
• Pueden separarse en geles multiplex cuando
se analizan varios loci simultáneamente.

Marcadores moleculares
de última generación

Marcadores
moleculares
de última
generación
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
(polimorfismos de un solo nucleótido)

Marcadores
moleculares
de última
generación
• Sustituciones de una sola base, resultando
en un polimorfimo bialélico de secuencia.
En genoma humano: 1/1000 nt
Variación puntual a nivel de secuencia.
• Disponibles por la gran cantidad de secuencias
de genomas.
• Más frecuentes que SSR ⇒ SNPs marcadores cercanos
o en el locus de interés (en un gen ⇒ estructura
de proteína, niveles de expresión, etc ⇒ enfermedades).
Muy útiles como marcadores para la construcción
de mapas de ligamiento más densos que los actuales.
• Dialélicos: mutacionalmente más estables, comparado
con variantes en el largo de la secuencia.

Secuenciación
comparativa
de segmentos
amplificados
• Base:
• Metodología:
- Diferencias en las secuencias específicas
de segmentos conocidos (locus/loci).
- Extracción y purificación de ADN.
- PCR con iniciadores caracterizados.
- Secuenciación del producto de amplificación.
• Ventajas y desventajas:
• Aplicación:
- Altamente reproducible.
- Muy informativo.
- Caro y engorroso.
- Se requiere conocimiento previo.
de la secuencia a analizar.
- Estudios evolutivos.
- Identificación/ parentezco.

Marcadores
moleculares
basados en la
detección
de diferencias
conformacionales
debidas a cambios
en secuencias
únicas del ADN
SSCP
Single-Strand Conformation
Polymorphism

Detección
de polimorfismos de
un solo nucleótido
(SNP) o pequeñas
mutaciones
(inserciones y
deleciones) mediante
el análisis
de los cambios
de movilidad del ADN
simple cadena
causado por la
sustitución
de una sola base.
Amplificación por PCR de la secuencia de interés
1. El amplicón se desnaturaliza por calor
y luego snap-cool.
2. Separación por tamaño y conformación
mediante electroforesis en geles
de poliacrilamida nativos (native PAGE).

SSCP

Ventajas
y limitaciones
del método
de SSCP
•Ventajas
• Limitaciones
- Detección y análisis del fragmento
en simultáneo.
- Análisis de un elevado numero de muestras
en un corto tiempo, con equipo adecuado.
- La posición y el tipo de polimorfismo no puede
ser detectado sólo con SSCP ⇒ requiere
secuenciación.
- Detección de polimorfismo entre 35%
y 80% ⇒ pérdida del 20%.
- Condiciones rigurosas de ensayo.

Métodos
para análisis
de un gran número
de muestras
(high throughput
analysis):
PCR en tiempo real: sistema TaqMan

PCR en
tiempo real:
sistema
TaqMan®

Detección
de SNP
Empleando
sondas
TaqMan® para
cada alelo
Química de la discriminación alélica

DHPLC “Denaturing High-Performance
Liquid Chromatography” *
Adaptado de: Steinmetz L. M., Mindrinos M. & Oefner P. J. Trends Plant Sc. 2000
* (Cromatografía líquida desnaturalizante de alta performance)
- Revela la presencia de polimorfismo por la migración diferencial de la forma heterodúplex pero no
provee información con respecto a su naturaleza química y localización.
Se requiere secuenciar las variantes alélicas
- Cuando la frecuencia de polimorfismo es baja puede ahorrar tiempo y dinero, ya que los
fragmentos que no presentan polimorfismo por DHPLC no requieren resecuenciación.

Arreglos de
oligonucleótidos
de alta
densidad

Arreglos de oligonucleótidos de alta densidad
Genotipificación y resecuenciación de marcadores SNP en microarreglos
Adaptado de: Steinmetz L. M., Mindrinos M. & Oefner P. J. Trends Plant Sc. 2000

Arreglos de
oligonucleótidos
de alta
densidad
• Más conocidos por su aplicación en estudios de expresión.
• Permiten la detección de variantes alélicas y genotipificación
de un gran número de marcadores.
• Oligonucleótidos-sonda cortos (20-25 bases), unidos
covalentemente a vidrio (fotolitografía o síntesis química
fotosensible). 300.000 sondas en 1,28 x 1,28 cm 2.
• Basado en la especificidad de hibridación del ADN.
• Por cada secuencia de referencia se diseñan conjuntos de 4
oligonucleótidos-sonda distintos (una que cotiene una A,
una T, una G o una C) para cada una de las posiciones
posibles en el oligonucleótido, extendiéndose a lo largo
de la secuencia de referencia de a una base por vez.
• Permiten la secuenciación de las variantes alélicas
encontradas.

Referencias
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dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet. 44:398-401.
1989.
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based on sequence tagged microsatellite sites. Biotechnology 8:930-932. 1990.
-Morgante M. & Olivieri A.M. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. The
Plant J. 3:175-182. 1993.
-Livneh O., Vardi E., Stram Y., Edelbaum O. & Sela I. The convertion of a RFLP assay into
PCR for the determination of purity in a hybrid pepper cultivar. Euphytica 62:97-102. 1992.
-Paran I. & Michelmore R.W. Development of reliable PCR based markers linked to downy
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-Tragoonrung S., Kanazin V., Hayes P.M. & Blake T.K. Sequence-tagged-site facilitated PCR
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-Ghareyazie B., Huang N., Second G., Bennet J. & Kush G.S. Classification of rice
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-Zietkiewicz E., Rfalski A. & Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat
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-Kanety R.V., Zeng X., Bennetzen J.L. & Brent E.Z. Assessment of genetic diversity in dent
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-Morgante M. & Vogel J. Compound microsatellite primers for the detection of genetic
polymorphism. U.S. Patent Application No. 08/326456. 1994.