R. Callejón

Desarrollo de un método de HPLC para la determinación de 

aminoácidos en vinagre y su validación en muestras reales 

Trabajo de investigación presentado por 

Raquel Callejón 

Para optar al Diploma de Estudios Avanzados del Programa de Doctorado en Enología

ÍNDICE 

1. INTRODUCCIÓN 1 

1.1. EL VINAGRE 1 

1.1.1. Tipos de vinagre 1 

1.1.2. Historia 2 

1.1.3. Las bacterias acéticas 2 

1.1.4. Métodos de elaboración de vinagre 6 

1.1.4.1. Métodos tradicionales de acetificación con cultivo 

superficial 6 

1.1.4.2. Métodos de acetificación con cultivo sumergido 11 

1.2. DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN PRODUCTOS 

DERIVADOS DE LA UVA 13 

1.2.1. Aplicaciones del análisis de aminoácidos en enología 13 

1.2.2. Métodos de análisis de aminoácidos 16 

1.2.3. Derivatización de aminoácidos 19 

1.2.4. Elección del método óptimo 30 

2. MATERIALES Y MÉTODOS 31 

2.1. MATERIAL 31 

2.1.1. Muestras 31 

2.1.2. Reactivos 32 

2.1.3. Instrumentación 34 

2.1.3.1. Cromatógrafo líquido de alta eficacia 34 

2.1.3.2. Instrumentación y material 34 

2.2. MÉTODOS 35 

2.2.1. Preparación de las fases móviles 35 

2.2.2. Condiciones cromatográficas 35 

2.2.3. Preparación de patrones 36 

2.2.4. Preparación de muestras 38 

2.2.5. Reacción de derivatización 38 

2.2.6. Identificación 39 

2.2.7. Cuantificación 40 

2.2.8. Límites de detección y cuantificación 41 

2.2.9. Estudios de precisión 42 

2.2.10. Estudios de recuperación 43 

2.2.11. Estudios de dilución de las muestras 44 

2.3. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 44 

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45 

3.1. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES 

CROMATOGRÁFICAS 45

3.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO 46 

3.2.1. Especificidad o selectividad 46 

3.2.2. Linealidad 47 

3.2.3. Exactitud 48 

3.2.4. Límites de detección y cuantificación 51 

3.2.5. Estudios de precisión 51 

3.3. ELECCIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DE LAS 

MUESTRAS 53 

3.4. APLICACIÓN DEL MÉTODO A MUESTRAS DE VINAGRE 54 

3.4.1. Consumo de nitrógeno total 55 

3.4.2. Evolución en el perfil de aminoácidos libres y amonio 57 

4. CONCLUSIONES 62 

5. BIBLIOGRAFÍA 64 

6. ANEXO 71

1.1. EL VINAGRE 

Introducción 

1. INTRODUCCIÓN 

Según la Reglamentación Técnico Sanitaria correspondiente (Presidencia del 

Gobierno, 1993) con la denominación genérica de vinagre se designa: “el líquido apto 

para el consumo humano resultante de la doble fermentación, alcohólica y acética de 

productos de origen agrario que contengan azúcares o sustancias amiláceas, con una 

riqueza mínima de 50 g/L”. Se entiende por grado de acidez de los vinagres su acidez 

total expresada en gramos de ácido acético por 100 mL, a 20ºC. El contenido permitido 

por la norma para los vinagres, expresado en ácido acético, no será inferior a 50 g/L; 

excepto para el vinagre de vino, que será, al menos, de 60 g/L. 

1.1.1. Tipos de vinagre 

Cualquier sustrato azucarado o amiláceo puede ser utilizado en la elaboración de 

vinagres. Asimismo los métodos de elaboración serán diferentes. Por tanto, los vinagres 

se pueden clasificar en función del tipo de sustrato empleado o del método usado en su 

elaboración. 

Según la materia prima originaria se establecen los siguientes tipos (Presidencia 

del Gobierno, 1993): 

- Vinagre de vino: Es el producto obtenido exclusivamente por 

fermentación acética de vino. 

- Vinagre de frutas: Es el producto obtenido a partir de frutas o bayas. 

- Vinagre de alcohol: Es el producto obtenido por la fermentación acética 

de alcohol destilado de origen agrario. 

- Vinagre de cereales: Es el producto obtenido sin destilación intermedia 

por el procedimiento de doble fermentación alcohólica y acética, de 

cualquier cereal en grano, cuyo almidón se ha desdoblado en azúcares 

mediante un procedimiento distinto de la diastasa de la cebada malteada. 

- Vinagre de malta: Es el producto obtenido sin destilación intermedia por 

el procedimiento de doble fermentación alcohólica y acética a partir de la 

cebada malteada, con o sin adición de grano, cuyo almidón se ha 

desdoblado en azúcares mediante la diastasa de la cebada malteada. 

- Vinagre de miel: Es el producto obtenido a partir de la miel. 

- Vinagre de suero de leche: Es el producto obtenido a partir de suero de 

leche. 

1

1.1.2. Historia 

Introducción 

El vinagre ha formado parte de la alimentación humana desde la antigüedad más 

remota como condimento y conservador de alimentos, así como base de remedios 

sencillos para hombres y animales. La fermentación alcohólica seguida de la acética se 

produce espontáneamente sobre cualquier sustrato azucarado expuesto al polvo y a los 

insectos que transportan levaduras y bacterias. Duddington (1961) afirma que la 

elaboración de vino es un arte que data al menos de hace unos 10.000 años, por lo que 

podemos suponer la existencia del vinagre desde este tiempo. Las referencias más 

antiguas al uso del vinagre se hallan en la cultura babilónica (5000 a.C.) sobre la 

obtención de vinagre de dátiles. 

En 1732, el holandés Boerhaave hace notar que la llamada “madre del vinagre” 

es un organismo vivo, aunque sin precisar su papel en la acetificación. Lavoisier 

demuestra que la acetificación consiste en la oxidación de etanol, pero sin sospechar la 

existencia de bacterias acéticas. Persono, (1822) describe las películas grasas que se 

forman en la superficie del vino, la cerveza o el vinagre como sustancias de naturaleza 

vegetal, y en la “Micología europea” añade nuevas especies de Micoderma: ollare, 

mesentericum, lagenoe y pergameneum. También Chaptal había observado que la 

producción de vinagre va bien cuando en la superficie del vino aparecen las llamadas 

“flores de vino”, cuya aparición anuncia y precede a la acetificación, pero sobre esto 

Berzelius advertía que en todas las materias orgánicas en descomposición, expuestas al 

aire aparece el mismo tipo de vegetación. La acetificación también llega a formar parte 

de la controversia entre químicos como Berzelius y Liebig quienes mantienen que el 

proceso era puramente químico (Berzelius 1829-1833) y aquellos que afirmaban que en 

dicha transformación intervenía un “ser organizado”. En cuanto a la ”madre del 

vinagre”, Kützing observó que la débil película que recubre la superficie del líquido 

acidificado está formada por glóbulos seis veces más pequeños que los de las levaduras; 

se trataba de bacterias acéticas que fueron observadas al microscopio por primera vez 

por Kützing (1837) por lo que, en las primeras clasificaciones taxonómicas de estos 

microorganismos, se denominó Acetobacter kützingianum a una especie de ellos 

(Llaguno, 1991). 

Pasteur publicó en el año 1864 una amplia memoria sobre la fermentación 

acética “Études sur le vinaigre, sa fabrication, ses maladies, mohines de les prévenir” 

que recoge la conferencia que pronunció en Orleáns en 1867. Pasteur afirma que 

siempre que el vino se transforma en vinagre, es debido a la acción de un velo de 

Micoderma aceti desarrollado en su superficie. 

1.1.3. Las bacterias acéticas 

Las bacterias acéticas fueron observadas por primera vez al microscopio por 

Kützing en 1837. Estas bacterias constituyen un grupo ecológico que comprende 

bacterias gram-negativas (gram-positivas en cultivos viejos), aerobias estrictas y muy 

sensibles al SO2. Son catalasa positiva y oxidasa negativa, pueden presentar 

pigmentación en cultivos sólidos y producir diferentes tipos de polisacáridos (De Ley et 

al., 1984). 

2

Introducción 

Al microscopio óptico las bacterias acéticas se presentan como pequeñas células 

cilíndricas, frecuentemente en parejas cocobacilares, cortas y algo gruesas, alineadas o 

en cadenas, y a menudo agrupadas en forma de ocho. Constituyen un grupo de 

morfología variable, que se presentan en forma elipsoidal o de bastoncillos (Suárez e 

Iñigo, 1990). Las bacterias acéticas crecen en medios azucarados y alcoholizados, 

ligeramente ácidos como flores, frutas, cerveza, vino, sidra, vinagre, zumos de fruta 

agrios y miel. En estos sustratos, las bacterias acéticas oxidan los azúcares y los 

alcoholes, produciendo una acumulación de ácidos orgánicos como producto final. 

Cuando el sustrato es etanol, producen ácido acético, lo que ha originado el nombre que 

reciben estas bacterias. La oxidación del etanol tiene lugar en dos pasos. En el primero, 

el etanol es oxidado a acetaldehído y en el segundo el acetaldehído es oxidado a acetato. 

En ambas reacciones, los electrones son transferidos y el último aceptor es el oxígeno 

(Figura 1.1). Esta oxidación de etanol a ácido acético es la característica mejor conocida 

de la bacteria acética, pero estas bacterias también pueden oxidar glucosa a ácido 

glucónico, etc. Algunas de estas transformaciones resultan interesantes desde el punto 

de vista de la biotecnología. La aplicación industrial mejor conocida de las bacterias 

acéticas es la producción de vinagre pero también se usan para producir sorbosa, 

sorbitol y celulosa. 

1/2 O2 

H2 O 

Etanol 

Acetaldehído 

CR 

Acetato 

CAT 

2H NAD + 

2H 

CO2 

Cit Cit 

CAT: ciclo de los ácidos 

tricarboxílicos 

CR: cadena respiratoria 

Figura 1.1. Proceso de oxidación del etanol. 

Las primeras clasificaciones de bacterias acéticas se hicieron atendiendo 

exclusivamente a criterios morfológicos. Visser`t Hooft (1925) toma en consideración 

también su fisiología, y más tarde Asai (1968) clasifica las bacterias acéticas según su 

capacidad para metabolizar la glucosa y el ácido acético. Frateur (1950) propone un 

sistema de clasificación del género Acetobacter en cuatro grupos, basado en los 

caracteres bioquímicos siguientes: producción de catalasa, oxidación de acetato y 

lactato a carbonato, formación de compuestos cetónicos, producción de ácido glucónico 

y capacidad para crecer en un medio con alcohol y sales de amonio como única fuente 

de nitrógeno (medio de Hoyer). Propuso los siguientes grupos: Acetobacter peroxydans, 

Acetobacter mesoxydans, Acetobacter oxydans y Acetobacter suboxydans. El nombre de 

O2 

3

Introducción 

cada grupo alude fundamentalmente a su capacidad para oxidar el etanol a ácido 

acético. 

Durante largo tiempo se aceptó que las bacterias acéticas móviles, pertenecientes 

al género Acetobacter, tenían flagelos polares monotricos, y dicho género estaba 

incluido por lo tanto en la familia Pseudomonodaceae. Sin embargo, Leifson (1954) 

descubrió que 30 cepas de Acetobacter no mostraban este tipo de flagelos, poniendo de 

manifiesto otro tipo de disposición de flagelos: flagelación perítrica. Propuso entonces 

separar Acetobacter en dos géneros: Acetobacter y Acetomonas género nov., incluyendo 

en este último las especies con flagelos polares multitricos y las no flageladas, todas 

incapaces de oxidar el acetato y el lactato a CO2 y H2O. 

Según la clasificación recogida en el manual de Bergey, en su 8ª edición (1974), 

las bacterias acéticas pertenecen al orden Pseudomonodales, familia 

Pseudomonodaceae, incluyendo en esta última dos géneros distintos al género 

Pseudomonas (sobre todo por su capacidad de crecimiento a pH inferior a 4.5): el 

género Gluconobacter y el género Acetobacter, que incluye a su vez tres especies 

importantes: Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus y Acetobacter peroxydans. El 

género Acetobacter puede variar en su forma de elipsoide a barra derecha, o ligeramente 

curva, 0.6-0.8 µm x 1.0-1.4 µm. Se encuentran no agrupadas, en pares o formando 

cadenas. Las células pueden ser móviles o no. Si son móviles, los flagelos son peritricos 

o laterales, oxida acetato y lactato a CO2 y H2O. El pH óptimo para el crecimiento es de 

5.4-6.3 (De Ley et al., 1984). Sin embargo, estas bacterias pueden crecer a pH bajos, 

entre 3-4. El género Gluconobacter es capaz de producir grandes cantidades de ácido 

glucónico a partir de glucosa, tiene incapacidad de formar películas en medios líquidos 

y pobre crecimiento en sustratos que contienen etanol. Además, es incapaz de oxidar el 

acetato. 

En una serie de trabajos publicados por diversos autores, principalmente 

Shinwell y Carr (1960), se pone de manifiesto la clara tendencia de las especies de 

Acetobacter a dar cepas mutantes, originándose especies distintas a las ya existentes. 

Carr (1968) publicó un trabajo en el que pone de manifiesto las observaciones hechas 

por Shimwell, y afirma que en general, las bacterias acéticas no son genéticamente 

estables, aunque unas especies sean más estables que otras. 

La taxonomía tradicional de los microorganismos, basada fundamentalmente en 

criterios morfológicos y fisiológicos, se ha visto sometida a continuas reordenaciones y 

cambios. Esto se ha debido fundamentalmente a la aplicación de técnicas moleculares 

muy potentes al estudio taxonómico como son la hibridación ADN-ADN, la 

secuenciación de diferentes regiones del genoma bacteriano, etc. La familia 

Acetobacteriaceae no ha sido una excepción a este proceso de reordenación de géneros 

y especies. En el año 1997, a los dos géneros mencionados, Acetobacter y 

Gluconobacter, hay que sumarle la definición de dos nuevos géneros de bacterias 

acéticas: Gluconoacetobacter y Acidomonas (Yamada et al.,1997); y en los dos últimos 

años se han definido otros dos nuevos géneros más: Asaia (Yamaguchi y Ninomiya, 

2000) y Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002). 

Por tanto, en estos momentos, la familia Acetobacteriaceae está formada por 6 

géneros y 34 especies de bacterias acéticas (Tabla 1.1). Acetobacter y 

4

Introducción 

Gluconoacetobacter, con 14 y 11 especies respectivamente, son los géneros donde 

existe una mayor diversidad de especies (Guillamón et al., 2003). 

El conocer qué cepas y bacterias acéticas están implicadas en la transformación 

de etanol en ácido acético es de gran importancia por su repercusión y aplicación a la 

producción industrial. En general, la producción de vinagres sólo se ha asociado con las 

especies: A. aceti, A. pasteurianus, Ga. europaeus Gax. No obstante, es probable que la 

especie G. oxydans se encuentre asociada a la producción de “condimentos 

alimentarios” que parten directamente de mosto para la producción de acético, como 

sería el “Aceto Balsamico Tradizionale” (Guillamón et al., 2003). 

Tabla 1.1. Géneros y especies de bacterias acéticas descritos según Yamada, 2003. 

Acetobacter Gluconoacetobacter Gluconobacter 

A. aceti Ga. Liquefaciens G. oxydans 

A. pasteurianus Ga. diazotrophicus G. frateurii 

A. Pomorum Ga. xylinus G. assaii 

A. peroxydans Ga. hansenii 

A. indonesiensis Ga. obodiens 

A. tropicalis Ga. intermedius 

A. syzygii Ga. sacchari 

A. cibinongensis Ga. entanii 

A. orientalis Ga. johannae 

A. orleanensis Ga. azotocaptans 

A. lovaniensis Ga. europaeus 

A. estunensis 

A. malorum 

A.cerevisiae 

Acidomonas Asaia Kozakia 

Ac. methanolica A. bogorensis K. baliensis 

A. siamensis 

A. indonesiensis 

A. krungthepensis 

La microbiología del proceso no se comprende todavía en su totalidad (Giudici, 

2003). En el caso de las bacterias acéticas, se están desarrollando nuevas líneas de 

investigación centradas en la búsqueda de técnicas de identificación rápida que además 

pueden aplicarse a una correcta clasificación de las mismas. Mediante la aplicación de 

las distintas técnicas de biología molecular se pretende alcanzar el objetivo de 

identificar las bacterias viables responsables del proceso sin necesidad de que sean 

previamente cultivadas. Como técnicas específicas para la cuantificación e 

identificación de la bacteria en el proceso de acetificación se aplican en la actualidad las 

siguientes: 

5

Introducción 

• PCR cuantitativa: Esta técnica ya ha sido aplicada para la 

cuantificación del número total de bacterias (mediante el uso de 

cebadores universales) en una muestra biológica (Franke et al., 2000). 

En el caso de bacterias acéticas se podrían utilizar cebadores 

universales de bacterias acéticas diseñados ya para los métodos de 

identificación (Ruiz et al., 2000), así como cebadores particulares de 

especie, lo que permitiría una segunda cuantificación a nivel de 

especie. 

• Sistemas basados en el uso de marcadores fluorescentes, como 

epifluorescencia y FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation). La 

primera de ellas ha sido utilizada para la cuantificación de bacterias 

acéticas totales (Mesa et al., 2003). La técnica de FISH podría 

permitir la identificación de bacterias acéticas a nivel de especie lo 

que sería de gran utilidad y posiblemente complementaria de la PCR 

cuantitativa (Franke et al., 1999). 

1.1.4. Métodos de elaboración de vinagre 

En el mercado existen dos tipos de vinagres. El primero se obtiene como 

producto de la fermentación o acetificación con cultivo superficial, las bacterias acéticas 

se encuentran en contacto directo con oxígeno gaseoso, situadas bien en la interfase 

líquido/gas o bien fijadas a soportes de materiales tales como virutas, elaborándose así 

la mayoría de los vinagres tradicionales. El segundo tipo se elabora por la acetificación 

o fermentación con cultivo sumergido, donde las bacterias acéticas están sumergidas 

libremente en el seno del líquido a fermentar, en el que constantemente se introduce 

aire, (solo o enriquecido con oxígeno), en condiciones que permitan la máxima 

transferencia posible desde la fase gaseosa a la fase líquida. Así se obtienen de forma 

rápida los vinagres comerciales actuales de menor precio. 

El vinagre de vino, se produce en los países mediterráneos de forma mayoritaria 

en biorreactores y con cultivo sumergido, que puede después envejecerse o no en 

madera. Los métodos tradicionales, lentos, con cultivo superficial se llevan a cabo en 

toneles de madera de diferente capacidad y suponen un menor volumen de producción 

(Garcia-Parrilla et al., 1998). 

1.1.4.1. Métodos tradicionales de acetificación con cultivo superficial 

a) Método de Orleáns 

Es uno de los métodos más antiguos para fabricar vinagres. Emplea toneles de 

aproximadamente 250-300 litros de capacidad, que se colocan tumbados en filas 

horizontales y superpuestas, provistos de 2 agujeros de aproximadamente 5 cm en cada 

extremo de los fondos de cada barril a 2/3 de la altura del fondo, que se rellenan con 

6

Introducción 

estopa para evitar la entrada de las moscas del vinagre, pero que dejan pasar aire 

(Figura 1.2). 

Figura 1.2. Pilas de botas para la acetificación en una fábrica de vinagre por el método de Orleáns. 

Además, en el lateral superior se hace otro orificio que se tapa con un tapón de 

corcho por donde penetra un tubo de vidrio, recto, que llega casi hasta el fondo del 

líquido permitiendo renovar el sustrato sin alterar el velo bacteriano situado en la 

superficie (Figura 1.3). Se trata de un procedimiento estático donde el líquido a 

acetificar es una mezcla de vino de bajo grado alcohólico con un 20% de vinagre turbio. 

Los rendimientos de la transformación de etanol en acético son bajos y el proceso dura 

de 8 a 10 días una vez comenzada la acetificación, la velocidad depende de la 

temperatura, ya que la temperatura de 30 ºC es la óptima para el crecimiento de la 

bacteria acética. 

7

Orificio tapado 

con algodón 

Introducción 

Figura 1.3. Acetificación por el método de Orleáns (Adams, 1980). 

b) Método Luxemburgués 

Embudo cubierto de gasa 

Entrada de aire 

cubierta con gasa 

Orificio de 

observación 

Indicador 

de nivel 

Grifo 

El fundamento de este método y su diferencia fundamental con el método de 

Orleáns estriba en emplear virutas de haya que periódicamente quedan sumergidas en el 

líquido que está acetificándose. Así se consigue aumentar la superficie de acetificación 

de la bacteria y mejorar la transferencia de oxígeno, por lo que aumenta la velocidad de 

acetificación. 

La cuba giratoria más elemental (Figura 1.4) se prepara con un orificio grande 

en el centro de uno de los fondos, para procurar la entrada de aire. En uno de los 

costados de esta cuba, en la parte más alejada de la abertura, se practica un orificio 

estrecho, que puede obturarse con un tapón; es una canilla de madera o vidrio para 

vaciado del envase. El tonel está dividido en dos partes desiguales por un falso fondo, 

agujereado, con numerosos y finos orificios. La parte menor del tonel está llena de 

virutas de haya. En este compartimento penetra un largo termómetro para controlar la 

temperatura, aspecto muy interesante para todo método rápido o semirrápido. Se 

obtienen cantidades de vinagre, que pueden llegar como máximo, cada cuarenta y ocho 

horas, a la cuarta parte del contenido de un tonel. El vinagre elaborado, que se extrae de 

las cubas, se sustituye por porciones iguales de vino, continuando la elaboración 

indefinidamente (Xandri-Tagüeña, 1977). 

8

Introducción 

Figura 1.4. Cuba rotatoria del método Luxemburgués. 

c) Método de Schüzenbach o Método Alemán 

Se emplean toneles o generadores verticales de encina con doble fondo 

(Figura 1.5). Sobre el primero, agujereado, se colocan una serie de capas de virutas de 

madera de haya, impregnadas de vinagre de buena calidad. Sobre el borde superior lleva 

un diafragma perforado, con los orificios obturados con algodón. Al pasar el vino por el 

diafragma, burbujea aire que existe entre las virutas. El vinagre se extrae por la parte 

inferior. Se pueden emplear barriles de roble giratorios, parcialmente llenos de virutas, 

consiguiéndose así una mejor aireación. Las ventajas que se destacan de este proceso 

son la regulación de oxígeno y su uso para la producción continua de vinagre. 

El vinagre obtenido con el método de cultivo superficial tiene el aroma y el 

gusto propio de la lentitud de la acetificación que se ve favorecido por el simultáneo 

envejecimiento (Llaguno y Polo, 1991a). 

9

Y 

X 

Introducción 

Figura 1.5. Esquema de un generador vertical, para la producción de vinagres vínicos. 

Los principales inconvenientes de los métodos de acetificación en cultivo 

superficial que emplean las virutas como soporte son: 

X 

- Acumulación de bacterias muertas sobre las virutas (debido a falta de 

aireación o aumentos de temperaturas). 

- Desarrollo de bacterias productoras de celulosa. 

- La infección por anguílulas (pequeños nematodos) que son imposibles de 

combatir una vez que se desarrollan. 

- Aumentos de temperatura difícilmente controlables, pérdidas de alcohol 

por evaporación en la corriente ascendente de aire caliente, con bajada 

del rendimiento. 

- Necesidad de gran espacio (generadores de relleno). 

Y 

10

Introducción 

Entre los vinagres artesanales producidos por fermentación con cultivo 

superficial con denominación de origen y reconocimiento internacional destacan el 

“Aceto Balsámico Tradicionale“ de la ciudad italiana de Módena y el no menos 

prestigioso “Vinagre de Jerez”. 

1.1.4.2. Métodos de acetificación con cultivo sumergido 

Se entiende por fermentación sumergida aquella en la que no se utiliza material 

poroso o soporte, sino que se hacen circular pequeñas burbujas de aire a través de la 

biomasa, con lo que se favorece el proceso fermentativo. Emplea toneles de madera o 

tanques acero inoxidable quedando siempre una parte del vinagre de la operación 

anterior como inóculo para iniciar el ciclo siguiente. Se llena con el vino, y se introduce 

posteriormente una fuerte corriente de aire. La acetificación es muy rápida. Este proceso 

se utiliza ampliamente en la actualidad. Los rendimientos de la transformación del 

alcohol en ácido acético (hasta el 94%) resultan ser muy elevados. La velocidad a la que 

se desarrolla el proceso es mayor (25-30 horas), así como la uniformidad del producto 

y, sobre todo, se puede lograr la acetificación de iguales volúmenes de alcohol en 

mucho menor volumen de instalación, con el consiguiente ahorro de espacio. Se puede 

trabajar con dispositivos automáticos que no sólo regulen el control de la aireación, sino 

también los ciclos de carga y descarga (Llaguno y Polo, 1991a). 

Modelos Frings 

En 1878, Heinrich Frings fundó en Aquisgrán una sociedad productora de 

vinagre, que más tarde, en 1950, incorpora las patentes de invención resultantes de la 

investigación del proceso de fermentación sumergida, alcanzando un alto grado de 

desarrollo. Nació así el Acetator Frings, base de la biotecnología vinagrera actual. 

A partir de las investigaciones de Hromatka y Ebner (1949), en los años 40 fue 

construido el “Acetator Frings” (Figura 1.6) que se mantiene funcionando, con algunas 

modificaciones, en gran parte de las industrias vinagreras actuales y en el que se elabora 

la mayor parte de la producción. 

11

Introducción 

Figura 1.6. Acetator Frings en acero inoxidable 

A, bomba de carga; B, aireador y motor; C, dispositivo para determinación de alcohol residual; D, 

válvula entrada agua refrigeración; E, termostato reguladora ; F, rotámetro; G, serpentín de 

refrigeración; H, entrada de aire; I, salida de gases; J, dispositivo antiespuma. 

El fundamento es la presencia de cultivo sumergido en el seno del líquido a 

acetificar, que se satura constantemente de pequeñas burbujas de aire. Una mayor 

población bacteriana así como la disponibilidad de oxígeno para los microorganismos 

permiten obtener un mayor rendimiento de la transformación de etanol en ácido acético 

(del 94%) y una mayor velocidad del proceso (25-30 horas). Este procedimiento 

requiere la estricta vigilancia de tres parámetros: la temperatura, la presión parcial de 

oxígeno y los ciclos de carga y descarga. 

La bacteria acética es viable entre 28-33ºC, pero la velocidad de fermentación 

varía en función de la temperatura. La temperatura de la fermentación debe estar 

comprendida dentro del intervalo entre 30-31ºC (Ormaechea, 1991) que es la 

temperatura óptima para obtener un mayor rendimiento. Es obvio que la oxidación de 

etanol a ácido acético es una reacción exotérmica que puede producir alrededor de 8.4 

MJ por cada litro de etanol que se oxida (Adams, 1985) elevando la temperatura del 

depósito. Por otra parte, cuando la temperatura es elevada aumentan las pérdidas de 

alcohol y productos volátiles y, en menor cuantía, de ácido acético, pero quizás lo más 

importante, es que puede ocurrir la parada del proceso por la muerte de bacterias. 

Un elevado suministro de aire puede causar el fenómeno de sobreoxidación y 

arrastre de los componentes volátiles y, por otro lado, su carencia puede paralizar la 

acetificación dado el carácter aerobio de las bacterias acéticas. Además de la cantidad 

de aire, se ha de tener en cuenta su calidad y pureza, ya que las bacterias acéticas son 

sensibles a los contaminantes de este. 

Todos los parámetros están interrelacionados en la acetificación; el etanol no 

debe llegar a agotarse totalmente ya que las bacterias acéticas mueren rápidamente y se 

pierde el cultivo. Por ello en este tipo de sistema de producción de vinagre se suele 

12

Introducción 

llevar a cabo la acetificación de forma discontinua realizándose ciclos de descargacarga. 

Así se impide que las bacterias acéticas metabolicen el ácido acético formado 

convirtiéndolo en CO2 y agua. Se descarga aproximadamente el 40-45% del volumen de 

líquido, que se repone con nueva materia prima suministrándole sustrato a la bacteria. 

Por eso, se puede trabajar de forma automatizada con dispositivos que regulen el control 

de la temperatura y de la aireación, así como los ciclos de carga y descarga. El 

acetificador está constituido por un depósito de acero inoxidable de capacidad entre 100 

y 300 HL. Los conductos están rodeados por un intercambiador de calor de agua para 

disipar el calor producido en el proceso y mantener la temperatura a 30ºC. Para evitar 

las pérdidas de compuestos volátiles se ha desarrollado un sistema cerrado (Cantero et 

al., 1996), mejorando sensiblemente los resultados del proceso fermentativo. El 

fermentador consta de un sistema de recirculación de aire y un sistema de control 

automatizado que inyecta oxígeno en dicha corriente a medida que éste es consumido 

por la biomasa. Se alcanzan así rendimientos cercanos al 100% (Gómez et al., 1993). 

Los aminoácidos libres presentes en el medio son las principales fuentes de 

nitrógeno para las bacterias acéticas. Ya que el sustrato para la fermentación acética 

proviene de una fermentación previa realizada por levaduras (Ciani et al., 1998) resulta 

importante asegurar que dicho sustrato posea suficiente nitrógeno disponible para las 

bacterias. 

1.2. DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN PRODUCTOS DERIVADOS 

DE LA UVA 

1.2.1. Aplicaciones del análisis de aminoácidos en enología 

El análisis de aminoácidos encuentra aplicación en muchos campos de 

investigación siendo uno de los más importantes la estimación del valor nutritivo de 

alimentos para humanos y para animales. La elevada demanda de información 

relacionada con el valor nutritivo ha dado lugar al desarrollo de métodos precisos para 

aminoácidos. Además, es creciente el número de aplicaciones como la detección de 

posibles adulteraciones en alimentos y bebidas o la determinación de aminoácidos, 

péptidos o derivados potencialmente tóxicos producidos por las nuevas técnicas de 

procesado de alimentos (White yHart, 1992b). 

Ya en 1958, Stein y Moore aplican la cromatografía de líquidos para determinar 

aminoácidos utilizando una columna de intercambio iónico y reacción postcolumna con 

ninhidrina. La importancia del análisis de aminoácidos no ha dejado de crecer desde 

entonces, tanto desde el punto de vista clínico como farmacéutico y alimentario. 

Es conocida la importancia de los aminoácidos del mosto como nutrientes para 

el desarrollo de las levaduras que realizan la fermentación alcohólica, así como el papel 

que se les atribuye como precursores de los compuestos del aroma. Por otra parte, la 

composición en aminoácidos del mosto está muy relacionada con la madurez de las 

uvas y con la fertilización del terreno, por lo que son muchos los laboratorios 

interesados en el análisis de estos compuestos (Cáceres et al., 1986). Los aminoácidos 

libres representan la parte más importante del nitrógeno total en los mostos y vinos, 

13

Introducción 

aproximadamente entre el 30 y 40 % (Hérberger et al., 2003). Estos aminoácidos tienen 

varios orígenes. Algunos proceden de la uva y pueden ser metabolizados parcial o 

totalmente por levaduras al final de la fermentación o liberados de las levaduras muertas 

y otros son producidos por la degradación enzimática de las proteínas de la uva. El 

contenido de aminoácidos de las uvas depende de varios factores como fertilización, 

condiciones climáticas y duración de la maceración de la piel en el mosto (Soufleros et 

al., 2003). 

Por tanto, la composición de aminoácidos es de gran importancia en la 

producción de vino (Kosir y Kidric, 2001 ). Muchos aminoácidos experimentan una 

serie de biotransformaciones, dando lugar a alcoholes de alto peso molecular, aldehídos, 

ésteres y ácidos cetónicos, los cuales tienen un gran impacto en las propiedades 

organolépticas del vino. Por este motivo a los aminoácidos se les atribuye el papel de 

precursores del aroma (Soufleros et al., 2003). 

A pesar de los diversos factores que afectan a los aminoácidos presentes en el 

vino, muchos investigadores los han empleado para la diferenciación del producto 

(Csomos y Simon-Sarkadi, 2001). Con dicho fin, así como para establecer la 

autenticidad del vino, se han aplicado diferentes procedimientos quimiométricos: 

análisis de cluster, análisis de componentes principales y análisis discriminante. 

Hérberger et al. (2003) encontraron que la aplicación de técnicas quimiométricas al 

contenido de aminoácidos y aminas biógenas resultó ser una buena herramienta para 

clasificar vinos húngaros en función de la tecnología de elaboración empleada, sin 

embargo, la diferenciación de las mismas según su origen geográfico, variedad y 

cosecha no fue del todo satisfactoria. 

Asimismo, Soufleros et al. (2003) estudiaron el perfil de aminoácidos de vinos 

blancos griegos procedentes de siete variedades de uva, seis regiones geográficas, y tres 

vendimias y aplicando el análisis discriminante los clasificaron en función de dichas 

variables (variedad, origen geográfico y vendimia). 

Brescia et al. (2002) diferenciaron vinos procedentes de pequeñas áreas de 

producción de la misma región aplicando estadística multivariante a las determinaciones 

de aminoácidos por resonancia magnética nuclear (RMN). Con esto se consiguió un 

método útil para la protección de la denominación de origen controlada (DOC) contra la 

adulteración. 

Por otro lado, ya que las levaduras juegan un importante papel en el contenido 

de aminoácidos en el vino, otra de las aplicaciones ha sido el estudio de la influencia de 

diferentes cepas de levadura sobre los cambios que sufren los aminoácidos, péptidos y 

proteínas durante el envejecimiento del cava (Martínez-Rodríguez et al., 2002). En este 

estudio se utilizó el mismo vino base y cinco cepas de levaduras. Con los datos 

obtenidos se dedujo que los cambios que se producen en el proceso de envejecimiento 

del cava ocurren en al menos cuatro fases claramente diferenciadas y además se observó 

que el empleo de una cepa de levadura u otra influye en el contenido de aminoácidos 

libres y péptidos. 

Pérez-Coello et al. (1999) analizaron 15 vinos elaborados en La Mancha con 

varias cepas de Saccharomyces cerevisiae, utilizando la composición volátil y el perfil 

14

Introducción 

de aminoácidos con el objeto de determinar la cepa más adecuada para inocular los 

mostos de esta región. 

En otros trabajos se adicionó amonio y aminoácidos a los mostos para estudiar 

su efecto en la composición aromática y en las propiedades sensoriales de los vinos 

obtenidos (Hernández-Orte et al., 2002; 2005; 2006). A pesar de que el factor 

determinante de la composición volátil de los vinos es la cepa de levadura, la adición 

de nitrógeno a los mostos también influye, reduciendo el contenido de β-feniletanol, 

metionol e isoamilalcohol y aumentando el ácido propiónico. Además, se observó que 

los vinos que habían sido enriquecidos con amonio eran más ricos en lactato de etilo y 

cis-3-hexenol mientras que los vinos enriquecidos con aminoácidos eran más ricos en γbutirolactona 

e isobutanol. Desde el punto de vista sensorial, la adición de amonio dio 

lugar a un descenso en notas sulfhídricas y a un incremento en olor cítrico. Por otro 

lado, se observó que las fermentaciones son mucho más rápidas en los mostos 

enriquecidos (Hernández-Orte et al., 2005). 

En el campo de los vinagres el análisis de aminoácidos se ha dirigido a la 

caracterización de vinagres de vino (Kutlán y Molnár-Perl, 2003) y a las 

transformaciones químicas y bioquímicas que se producen en los vinagres de Jerez 

durante las diferentes fases de envejecimiento (Palacios et al., 2002). 

La formación de vinagre implica esencialmente la conversión del etanol en ácido 

acético. Los microorganismos responsables de dicha transformación son bacterias 

acéticas pertenecientes a los géneros Acetobacter y Gluconobacter y los aminoácidos 

presentes en el medio constituyen la principal fuente de nitrógeno para estas bacterias. 

Debido a que el sustrato inicial procede de una fermentación previa realizada por 

levaduras, es esencial asegurarse de que haya una cantidad adecuada de nitrógeno para 

que se lleve a cabo la fermentación acética (Valero et al., 2005). 

Además, se han desarrollado métodos para la determinación conjunta de 

aminoácidos y otras sustancias de interés como las aminas biógenas y poliaminas en 

vinos y en vinagres (Bauza et al., 1995; Herbert et al., 2000; Kutlán y Molnár-Perl., 

2003; Lozanov et al., 2004). Las aminas biógenas son compuestos que afectan a la salud 

y pueden ser indicadores de unas condiciones de producción antihigiénica, formándose 

a partir de ciertos aminoácidos por descarboxilación. Sin embargo, la cuantificación 

rutinaria de estas sustancias no se emplea en el control cualitativo de los vinos debido 

principalmente a las dificultades del análisis. De ahí la importancia de desarrollar 

métodos sencillos que permitan determinar simultáneamente las aminas biógenas y 

aminoácidos en vinos o en vinagres. Las poliaminas, por el contrario, tienen múltiples 

funciones en los organismos vivos, tales como factores de crecimiento, antioxidantes, 

estabilizadores de ADN y ARN, reguladores metabólicos, nutrientes y segundos 

mensajeros. 

Los estudios de racemización constituyen otra área en el análisis de los 

aminoácidos. Los L-aminoácidos de las proteínas de los alimentos se isomerizan 

parcialmente a D-isómeros por tratamiento alcalino o por calor. Este tratamiento puede 

afectar al valor nutritivo y seguridad de los alimentos, ya que la mayoría de los Daminoácidos 

no pueden ser utilizados por los humanos y algunos son tóxicos. Los 

isómeros tienen idénticas propiedades químicas y por tanto, deben ser convertidos en 

dipéptidos diastereométricos mediante una reacción con un agente quiral antes de la 

15

Introducción 

cromatografía. Alternativamente, se puede emplear una fase estacionaria o fase móvil 

quiral. Para conseguir la separación en un solo cromatograma de todos los aminoácidos 

en sus formas D y L, es necesario utilizar columnas largas y tiempos de análisis de 

incluso horas. 

Se han propuesto diferentes métodos para la determinación aminoácidos 

enantiómeros y aminas quirales tanto en vinos, vinagres, como en alimentos, cada uno 

de ellos con sus ventajas e inconvenientes (Brüeckner et al., 1995; Jin et al., 1999; Voss 

y Galensa, 2000; Toyo´oka et al., 2001; Abe et al., 2002; Erbe y Brüeckner, 1998 ). 

1.2.2. Métodos de análisis de aminoácidos 

Durante los últimos años, la evolución del análisis instrumental ha permitido la 

detección y cuantificación de un gran número de aminoácidos con gran precisión y 

sensibilidad. La determinación de aminoácidos en muestras de mostos, vinos y vinagres 

debe permitir: la detección de aminoácidos primarios y secundarios, como la prolina, 

que es el aminoácido más abundante de los vinos; un análisis exacto de la arginina, 

debido a la implicación toxicológica de este compuesto en reacciones posteriores que 

dan lugar a la formación de etilcarbamato y urea; bajos límites de detección para todos 

los aminoácidos; un tiempo de análisis corto, con objeto de poder tener un análisis 

rutinario para la certificación del vino o del vinagre; y la habilidad de crear una base de 

datos con las características de productos químicos para ayudar a la identificación de 

adulteraciones (Herbert et al., 2000). 

Existen diferentes técnicas empleadas en el análisis de aminoácidos en vinos, 

aunque son tres las que se usan con mayor frecuencia: cromatografía de intercambio 

iónico con derivatización postcolumna empleando ninhidrina como agente derivatizante 

y detección por ultravioleta (UV); separación de derivados volátiles de aminoácidos 

por cromatografía gaseosa (CG) y detección por espectrometría de masas (EM) y 

separación de aminoácidos derivados por cromatografía de líquidos (CL) y su detección 

por fluorescencia. La resonancia magnética nuclear (RMN) y la electroforesis capilar 

(EC) son otras de las técnicas usadas en el análisis de aminoácidos (Herbert et al., 

2000). 

a) Separación por cromatografía líquida de intercambio iónico 

Las resinas de intercambio iónico son polímeros sulfonados con partículas de 5 a 

10 micras de diámetro. El mecanismo de separación está basado en la interacción iónica 

con un soporte fuertemente ácido, aunque no se pueden excluir una interacción 

secundaria con el polímero que constituye la base del intercambiador. En primer lugar 

eluyen los aminoácidos ácidos, seguidos por los hidroxilados, luego los neutros y por 

último los básicos (Cáceres et al., 1986). Actualmente las columnas son muy eficaces, 

con lo que los tiempos de análisis son más cortos, pero son bastante caras. 

Tradicionalmente el análisis de aminoácidos se ha llevado a cabo mediante 

cromatografía de intercambio catiónico, donde los aminoácidos se separaban y 

posteriormente reaccionaban con ninhidrina en un sistema de derivatización 

16

Introducción 

postcolumna. Finalmente se detectaban por absorbancia en la región del UV-visible a 

una o dos longitudes de onda. Aunque ha demostrado tener buena fiabilidad y excelente 

poder de resolución, los tiempos de análisis son demasiado largos, la sensibilidad es 

limitada, pueden resultar picos demasiado anchos y los sistemas de derivatización 

postcolumna resultan difíciles de manejar y mantener. Por otro lado, aunque este 

método da buenos resultados requiere una larga preparación de las muestras, y su 

aplicación en vinos no permite la cuantificación de la cisteína, la cual es un precursor de 

los tioles característicos de la variedad Sauvignon (Pripis-Nicolau et al., 2001), entre 

otras. Además tiene problemas con las interferencias de la matriz y con los límites de 

detección (Herbert et al., 2000). De todos modos, esta técnica se ha empleado 

extensamente en la caracterización de vinos en función del contenido de aminoácidos 

(Csomos y Simone, 2002). 

b) Separación por cromatografía de líquidos en fase reversa 

La mayor parte de los trabajos realizados sobre análisis de aminoácidos por 

cromatografía de líquidos (CL) se ha llevado a cabo en columnas de fase reversa que 

tienen como fase estacionaria sílice, a la que se unen grupos C-8 o C-18. Estas 

columnas, empaquetadas con partículas de sílice muy pequeñas (3-10 µm) y de pequeño 

diámetro (2-5 mm), están sometidas a una alta presión con una velocidad de flujo de las 

fases móviles muy controlada. 

Las fases móviles más utilizadas en fase reversa son mezclas de agua y un 

disolvente orgánico (metanol, acetonitrilo, o tetrahidrofurano, normalmente). Cuando la 

muestra tiene sustancias que contienen grupos ácidos o básicos débiles, como son los 

aminoácidos, se recurre al control del pH de la fase móvil mediante un tampón (Cáceres 

et al., 1986). 

La cromatografía en fase reversa utiliza las propiedades de solubilidad de la 

muestra para distribuirla entre un solvente hidrofílico y otro lipofílico. La distribución 

de los componentes de la muestra entre las dos fases va a depender de sus respectivas 

características de solubilidad. Los componentes menos hidrofóbicos se asociarán 

primeramente con la fase hidrofílica, y los componentes más hidrofóbicos se 

encontrarán en la fase lipofílica. El proceso entero depende del poder extractivo de la 

fase hidrofílica. En fase reversa, las partículas de sílice cubiertas con cadenas 

hidrocarbonadas representan la fase lipofílica, mientras que la mezcla acuosa de un 

solvente orgánico que rodea las partículas representa la fase hidrofílica. 

Puesto que el conjunto de los aminoácidos muestra una amplia gama de 

polaridades, para resolverlos en un solo cromatograma es preciso ir variando la 

composición de la fase móvil a lo largo de la separación, aumentando su poder de 

elución; de esta forma, mediante el empleo de un gradiente de polaridad, se consigue 

separar todos los compuestos en un tiempo razonable, lo que sería imposible de 

conseguir con una elución isocrática (Cáceres et al., 1986). 

Esta técnica tiene muchas aplicaciones como por ejemplo la caracterización de 

vinos (Soufleros et al., 2003) y diferenciación de vinagres en función de la composición 

en aminoácidos (Valero et al.,2005); el estudio de la evolución de los aminoácidos en el 

proceso de elaboración del vino (Martínez-Rodríguez et al.,2002); relación del 

17

Introducción 

contenido en aminoácidos con los compuesto volátiles en el vino (Pozo-Bayón et al., 

2005) y la determinación simultánea de aminas biógenas y aminoácidos en vinos y en 

vinagres (Krause et al. 1995; Lozanov et al., 2004; Kutlán y Molnár-Perl, 2003). 

Además, la cromatografía de líquidos se ha utilizado para determinar los 

isómeros L y D de los aminoácidos en vinos (Brüeckner et al., 1995; Jin et al., 1999; 

Voss y Galensa, 2000; Toyo´oka et al., 2000). Los isómeros tienen idénticas 

propiedades químicas y por tanto, deben ser convertidos en dipéptidos diastereométricos 

mediante una reacción con un agente quiral antes de la cromatografía. Alternativamente, 

se puede emplear una fase estacionaria o fase móvil quiral. 

c) Cromatografía de gases (CG) 

La cromatografía de gases capilar constituye otra alternativa para el análisis de 

aminoácidos. Esta técnica es rápida, y tiene un alto poder de resolución y sensibilidad, 

pero se necesita gran experiencia. Además, como los aminoácidos libres no son 

suficientemente volátiles necesitan ser convertidos en derivados volátiles para poder 

determinarlos. Los ésteres de aminoácidos acilados son la clase más frecuente de 

derivados para el análisis de aminoácidos por CG. 

La principal desventaja de la cromatografía de gases parece ser el procedimiento 

de la derivatización, debido a la complejidad de las reacciones y los tipos de reactivos 

usados. La velocidad de derivatización difiere de un aminoácido a otro y la 

reproducción estricta de las condiciones de reacción es esencial para todas las muestras. 

Además, la mayoría de los derivados de aminoácidos volátiles se pueden perder también 

durante la concentración de la muestra. Por otro lado esta técnica requiere una 

minuciosa extracción y preconcentración de la muestra, por lo que se deben tener en 

cuenta a la hora de asegurar la fiabilidad de los resultados finales (Herbert et al., 2000). 

Se ha comparado la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de 

gases en cuanto a la precisión. Ninguno de los métodos fue claramente superior. La CG 

resultó tener una menor varianza intralaboratorio excepto para la histidina y la arginina. 

También se ha comparado la CG y CL. Considerando muchos factores como la 

facilidad de la derivatización y la duración del tiempo de análisis el método de elección 

fue la CL. Aunque la CG tiene ventajas (velocidad y sensibilidad) la mayoría de los 

análisis de aminoácidos todavía se llevan a cabo por la clásica cromatografía de 

intercambio iónico o por la cromatografía de líquidos en fase reversa. Muchos autores la 

han aplicado para la determinación de D-aminoácidos y separación de enantiómeros 

tanto en vinos (Abe et al., 2002) como en vinagres ( Erbe y Brüeckner, 1998). 

d) Electroforesis capilar 

La técnica de electroforesis capilar (EC) se ha usado para separar y detectar 

aminoácidos, péptidos y proteínas. 

La EC permite el análisis de muestras extremadamente pequeñas, y por lo tanto 

se requieren detectores de alta sensibilidad. Estos detectores incluyen fluorescencia 

inducida por láser, la cual tiene unos límites de detección del orden de 10 -20 moles para 

18

Introducción 

la separación por electroforesis capilar de zona de aminoácidos derivatizados con 

isotiocianato de fluoresceína. Un inconveniente de esta técnica es el consumo de tiempo 

que conlleva la preparación de las muestras, ya que requieren un proceso de 

derivatización y preconcentración previo a su análisis (Kosir y Kidric, 2002). 

Así mismo, se puede aplicar la EC con un detector de fluorescencia inducida por 

láser para reacciones postcolumna usando como agentes derivatizantes el o-ptaldehido y 

el naptaneno-2,3-dicarboxialdehido (Male y Luong, 2001; Kilgore y Smith, 2003). 

El análisis por electroforesis capilar de zona de aminoácidos seleccionados tiene 

unos límites de detección extremadamente bajos. En la práctica, no se precisan límites 

de detección tan bajos en el análisis rutinario de aminoácidos en alimentos. Sin 

embargo, podrían producirse nuevos compuestos en métodos de procesado de alimentos 

del futuro en unos niveles suficientemente bajos como para poder recomendar la 

aplicación de esta técnica. 

e) Resonancia magnética nuclear 

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se ha aplicado 

ampliamente en el campo del análisis químico de alimentos ya que es una técnica no 

destructiva, sensible y capaz de detectar simultáneamente un gran número de 

compuestos, concretamente aminoácidos, en mezclas complejas como es el caso del 

vino ( Kosir y Kidric, 2001; 2002). 

Aunque la cromatografía de líquidos y la electroforesis capilar son más 

sensibles, requieren una preparación de las muestras antes del análisis. Normalmente, la 

separación, derivatización y preconcentración en el caso de compuestos presentes en 

bajas concentraciones, son pasos imprescindibles en el procedimiento. Por el contrario, 

la preparación de muestra para la resonancia magnética nuclear es más simple y 

consume menos tiempo. Otra gran ventaja de esta técnica es la posibilidad de detectar la 

resonancia magnética de diferentes núcleos presentes en una molécula en diferentes 

ambientes electrónicos y espaciales. 

Esta técnica ha sido empleada, obteniéndose muy buenos resultados, en la 

caracterización de la autenticidad del vino, determinación del origen geográfico y año 

de producción (Brescia et al., 2002). 

1.2.3. Derivatización de aminoácidos 

Los aminoácidos pueden ser detectados directamente en el ultravioleta, ya que 

absorben a una longitud de onda entre 190-210 nm. Sin embargo, en esta región del 

espectro también absorben la mayoría de los disolventes y otros componentes de las 

muestras, por lo que normalmente se recurre a la formación de derivados detectables a 

otras longitudes de onda o fluorescentes (Cáceres et al., 1986). 

19

Introducción 

La derivatización puede llevarse a cabo antes de la separación cromatográfica 

(precolumna), inmediatamente después de la elución (postcolumna) o, menos frecuente, 

en la misma columna. Cada forma de obtener el derivado presenta ventajas e 

inconvenientes (Tabla 1.2). 

En la derivatización postcolumna la separación de aminoácidos no derivatizados 

se lleva a cabo con una resina de intercambio catiónico con un gradiente de tampones 

acídicos. Después de la separación se convierten en derivados de ninhidrina coloreados 

para la detección colorimétrica, o en derivados de ortoftaldehído para la detección por 

fluorescencia. 

Tabla 1.2. Ventajas e inconvenientes de la derivatización precolumna y postcolumna 

(Cáceres et al., 1986) 

Derivatización Ventajas Inconvenientes 

Postcolumna 

Precolumna 

-Es posible utilizar varios sistemas de 

detección y eluir los compuestos de la 

columna detectándolos por métodos no 

destructivos antes de derivatizarlos. 

-La reacción es reproducible sin 

necesidad de formar un único derivado. 

-La única limitación a las condiciones de 

la reacción es que se complete en un 

periodo de tiempo razonable y que sea 

cuantitativa. 

-La reacción se puede desarrollar en un 

disolvente no compatible con la fase 

móvil utilizada en la separación 

cromatográfica. 

-Se pueden separar los productos 

secundarios formados, en la misma 

columna o antes de la separación 

cromatográfica. 

-Presencia de interferencias debidas al exceso de 

reactivo o a productos de degradación. 

-Pérdida de resolución producida por el 

ensanchamiento de la banda cromatográfica en el 

reactor donde se produce la reacción. 

-No se pueden utilizar tiempos de retención muy 

largos. 

-Puede resultar un método caro debido a las 

modificaciones que hay que realizar en el equipo 

instrumental para llevar a cabo la reacción. 

-Presencia de picos interferentes en los 

cromatogramas debidos al mismo reactivo, a 

productos de reacción o de degradación o a 

impurezas de los reactivos. 

-Conviene eliminar el exceso de reactivo, 

disolvente u otros componentes de la mezcla de 

reacción antes de la inyección en el cromatógrafo. 

- Una parte sustancial de todos los derivados será 

idéntica. Pequeñas diferencias de la cadena lateral 

de los aminoácidos tendrán un efecto menor en el 

comportamiento cromatográfico de los derivados, 

dando una separación más dificultosa. 

Aunque la derivatización precolumna ofrece más ventajas, los métodos tradicionales 

postcolumna no se han eliminado totalmente. 

20

Introducción 

Los agentes derivatizantes más utilizados en el análisis de aminoácidos son: 

a) Ninhidrina 

La ninhidrina se utiliza para la determinación de los aminoácidos tras su separación 

en su forma natural por cromatografía de intercambio iónico. Por tanto, la derivatización 

con ninhidrina es exclusivamente postcolumna (White y Hart, 1992a). 

La reacción de la ninhidrina con los aminoácidos es muy sensible, llegándose a 

detectar cantidades inferiores a un picomol pero raramente reproducibles por debajo de 

100 picomoles. Esta limitación la hace inadecuada para muchas de las aplicaciones 

demandadas actualmente. La sensibilidad de la ninhidrina depende de una serie de 

factores: es muy sensible a la luz, al oxígeno atmosférico, a cambios de temperatura y 

de pH. 

Con los aminoácidos primarios forma un complejo morado (Ruhemann´s purple) 

que absorbe a una λ de 570 nm, y con los aminoácidos secundarios, prolina e 

hidroxiprolina, forma un complejo amarillo que absorbe a 440 nm. Cuando empieza a 

oxidarse el reactivo, su color no se desarrolla bien a 570 nm pero la absorción a 440 

permanece constante. Por eso cuando la altura de la prolina a 440 nm es igual a la altura 

del ácido glutámino a 570 nm indica la degradación del reactivo. 

Algunos autores han aplicado esta técnica para la caracterización de vinos en 

función del contenido de aminoácidos (Herberger et al., 2003). 

b) Cloruro de dansilo 

El cloruro de dansilo (DNS-Cl) es un reactivo fluorogénico de derivatización 

precolumna que permite la determinación de aminas primarias y secundarias. 

La dansilación se ha usado como un método para la determinación de 

aminoácidos libres, tanto los procedentes de la hidrólisis de proteínas como los 

aminoácidos terminales de proteínas y péptidos. Los derivados son detectables por 

fluorescencia (λex 360 nm; λem 470) o por ultravioleta (254 nm) y los niveles de 

detección están en el orden de picomoles o fentomoles dependiendo de la sensibilidad 

del detector (White y Hart, 1992a). 

La reacción de los aminoácidos con el cloruro de dansilo transcurre en 

condiciones óptimas entre 35-50 minutos en medio básico, a temperatura ambiente y en 

la oscuridad. Además de los dansilaminoácidos se forma como producto secundario el 

ácido dansilsulfónico. Por otro lado, el exceso de cloruro de dansilo reacciona con los 

dansilaminoácidos formando dansilamida. La formación de la dansilamida era una 

inevitable limitación del método y la cantidad formada depende de la concentración de 

aminoácidos y del exceso de cloruro de dansilo. Conviene, pues, reducir en lo posible la 

aparición de tales productos secundarios (Cáceres et al., 1986). 

21

Introducción 

Los derivados son relativamente estables a la hidrólisis lo que no ocurre con el 

reactivo. Hay que evitar, sin embargo, la exposición a la luz por ser fotosensibles. Los 

dansilaminoácidos son estables al menos 7 días si se mantienen a –4 ºC. 

Esta técnica se utiliza generalmente en derivatización precolumna. Numerosos 

autores lo han empleado para la determinación de aminoácidos en mostos de uva, vinos 

y vinagres (Botella et al., 1990; Valero et al., 2005). 

La mayoría de aminoácidos dan monodansil derivados, excepto lisina, ornitina, 

histidina, tirosina y cisteína que forman didansil derivados. 

Este método ofrece una buena reproducibilidad para la mayoría de los 

aminoácidos excepto para la histidina debido a la baja respuesta relativa de 

fluorescencia del derivado didansilado y por la formación de dos dansil derivados 

(White y Hart, 1992a). 

c) Cloruro de dabsilo 

Los derivados obtenidos con el cloruro de dabsilo tienen una absorción máxima 

a 420 nm (región visible), son altamente estables y son rápidamente separados y 

detectados a niveles de picomoles. Los derivados se mantienen perfectamente estables 

durante cuatro semanas a temperatura ambiente. 

Una limitación del método es que la presencia de una excesiva cantidad de sal, 

urea, fosfato, o bicarbonato amónico alterará el pH del tampón e interferirá en la 

reacción de dabsilación. 

Para un análisis cuantitativo de muestras desconocidas, los estándares de 

aminoácidos dabsilados tienen que obtenerse de una mezcla de estándares de 

aminoácidos hidrolizada y dabsilada en paralelo en las mismas condiciones que las 

muestras (White y Hart, 1992a) 

Krause et al. (1995) propusieron el uso del cloruro de dabsilo como un método 

alternativo al análisis convencional de aminoácidos y aminas biógenas en alimentos y 

muestras biológicas, logrando separar más de cuarenta compuestos simultáneamente. 

d) Dinitrofluorobenceno 

El dinitrofluorobenceno (DNFB) es un agente de derivatización precolumna que 

se utiliza para la caracterización de aminoácidos terminales de cadenas peptídicas 

(Cáceres et al., 1986). 

Este agente reacciona con los aminoácidos primarios y secundarios formando 

compuestos que muestran fluorescencia a 365 nm. La reacción se lleva a cabo a 50 ºC 

durante 30 minutos. Los derivados son estables durante 48 horas si se protegen de la 

luz. 

22

Introducción 

Con este reactivo se pueden detectar pequeñas cantidades de aminoácidos, del 

orden de picomoles, y es muy adecuado para determinar aminoácidos que otros 

reactivos resuelven peor. Uno de los inconvenientes de este método está en que destruye 

los péptidos (White y Hart, 1992a). 

e) Fenilisotiocianato 

El agente derivatizante fenilisotiocianato se ha utilizado durante más de 30 años 

en el método de la degradación de Edman para secuenciar proteínas y péptidos. Este 

agente reacciona con los aminoácidos libres produciendo feniltiocarbamil aminoácidos 

(Cáceres et al., 1986). Se ha empleado, asimismo, para determinar aminoácidos en 

zumos de naranja (Naulet et al., 1997), vinos ( Botella et al., 1990; Lehtonen et al., 

1996; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Hernández-Orte et al., 1999; Fox et al., 2001) y 

vinagres (Palacios et al., 2002). 

Hay que señalar que se consigue la cuantificación de los aminoácidos 

secundarios prolina e hidroxiprolina. A diferencia de la ninhidrina y ortoftaldehído, los 

derivados feniltiocarbamil de la prolina y la hidroxiprolina tienen aproximadamente la 

misma respuesta molar que los otros aminoácidos. 

La selectividad es adecuada y no hay evidencia de formación de derivados 

disustituidos con tirosina o histidina. Sólo lisina y cistina reaccionan con dos moléculas 

del agente. En condiciones suaves, la reacción se completa en menos de diez minutos, y 

como el reactivo es volátil, se puede usar en exceso. Este exceso se elimina a baja 

presión. Las muestras secas pueden ser almacenadas a –20 ºC, y resultan estables 

durante 4 semanas. 

Debido a que los derivados no son fluorescentes, la técnica está limitada a la 

detección por UV, la cual se lleva a cabo a 254nm (λmáx = 269 nm). Esta técnica no es 

tan sensible como las que utilizan reactivos fluorescentes, pero la alta absorción en el 

UV de los derivados hace que puedan ser detectados a niveles de picomoles, los cuales 

representan los niveles prácticos de sensibilidad para muestras reales. El límite de 

sensibilidad es 50 picomoles en una relación señal / ruido de 2.5, la cual es 50 veces 

menos sensible que la detección de los derivados de ortoftaldehído y 9-fluorenilmetil 

cloroformato. 

f) Ortoftaldehido 

El ortoftaldehido (OPA), fue introducido en 1971 y es el agente de 

derivatización más comúnmente usado en cromatografía líquida de alta resolución en 

fase reversa para la determinación de aminoácidos. Se ha aplicado a vinos (Pozo-Bayón 

et al., 2005; Soufleros et al., 2003; Lehtonen et al., 1996) y vinagres (Kutlán y Molnár- 

Perl, 2003). Otra de las aplicaciones de este reactivo ha sido la determinación de 

aminoácidos enantiómeros en alimentos y bebidas (Brüeckner et al., 1995). 

El OPA es un reactivo que no tiene fluorescencia natural, la desarrolla al 

reaccionar con funciones amino primarias. La reacción tiene lugar en medio acuoso a 

pH fuertemente alcalino en presencia de un agente reductor como el 2-mercapto-etanol, 

23

Introducción 

3-mercapto-1-propanol o etanotiol. El derivado isoindólico formado es inestable y debe 

ser estabilizado por acidificación. La reacción se completa totalmente en 1 ó 2 minutos 

a temperatura ambiente (Cáceres et al., 1986). 

Este reactivo se puede emplear tanto para la derivatización postcolumna como 

para la precolumna. 

No es necesario eliminar el exceso de OPA antes de inyectar la muestra ya que 

el reactivo por sí mismo no interfiere en la separación o detección. Sin embargo, como 

los derivados OPA-aminoácidos son inestables, para conseguir unos resultados 

reproducibles es esencial una completa automatización de la reacción precolumna 

controlando de manera muy precisa el tiempo de reacción. El límite de detección con 

este reactivo está en el rango de los fentomoles, lo que demuestra que esta técnica es 

diez veces más sensible que la reacción con ninhidrina. 

Por otro lado, el OPA no reacciona con grupos amino secundarios, por tanto, si 

queremos determinar prolina e hidroxiprolina simultáneamente con el resto de los 

aminoácidos, hay que recurrir a una oxidación con hipoclorito sódico que rompe el 

anillo y los convierte en aminoácidos primarios. Otra alternativa es utilizar OPA con 

otro agente que permita derivatizar los aminoácidos secundarios. Algunos autores 

usaron una doble derivatización con ortoftaldehído y 9-fluorenilmetil cloroformato para 

determinar los aminoácidos primarios y secundarios en mostos y vinos (Herbert et al., 

2000; Martínez-Rodríguez et al., 2002). Pripis-Nicolau et al. (2001) desarrollaron un 

método para determinar la cisteína y otros aminoácidos en mostos y vinos utilizando 

una derivatización previa con ácido iodoacético (IDA) seguida de otra con OPA. 

Otro inconveniente de este reactivo es la débil respuesta de la lisina, que puede 

ser debida a la presencia de dos estructuras isoindólicas fluorescentes que interaccionan. 

La cisteína es también un aminoácido que presenta una débil respuesta debido 

probablemente a la fácil descomposición del derivado. La solución que proponen 

algunos autores es realizar una oxidación previa con ácido peroxifórmico o una 

carboximetilación y detectar el aminoácido como ácido cistéico o carboximetilcisteína 

(Cáceres et al., 1986). 

Los derivados también se pueden detectar en ultravioleta a 330 nm, pero para 

una mayor sensibilidad, se utiliza con preferencia la detección por fluorescencia, cuya 

emisión se mide a una λ de 430 nm. 

g) 9-Fluorenilmetil cloroformato 

Se ha demostrado que el 9-fluorenilmetil cloroformato (FMOC-CL) es adecuado 

para la detección por fluorescencia de aminoácidos primarios y secundarios. Este 

reactivo da lugar a derivados estables y altamente fluorescentes (Bauza et al., 1995). 

A diferencia de los otros derivatizantes precolumna que producen derivados 

fluorescentes, el FMOC-CL es por sí mismo fluorescente. FMOC y los productos 

obtenidos de su hidrólisis pueden interferir en la cuantificación de los aminoácidos 

derivados, sin embargo, esta propiedad no tiene por qué ser un factor limitante, ya que 

el exceso de reactivo y los productos fluorescentes formados en reacciones laterales se 

24

Introducción 

pueden eliminar sin que se pierdan los aminoácidos derivados mediante una extracción 

líquido-líquido. Otra método alternativo para evitar la interferencia del FMOC-OH es 

que el exceso de FMOC reaccione con una amina muy hidrofóbica para formar un 

derivado que eluya después de los picos de interés (White y Hart, 1992a). 

Este agente derivatizante se ha empleado para determinar aminas biógenas y sus 

aminoácidos precursores en vinos (Bauza et al., 1995; Lehtonen et al., 1996) y en 

alimentos (Kirschbaum et al., 1994). 

h) Etoximetilenmalonato de dietilo 

El etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE), es otro agente de derivatización 

precolumna capaz de reaccionar con aminoácidos primarios y secundarios dando lugar a 

derivados detectables en la región UV-visible. 

Este agente se ha aplicado para determinar el contenido de aminoácidos en 

muestras de vino (Chichón et al., 2001) y posteriormente en diferentes tipos de mieles 

españolas (Hermosín et al.,2003). En este último trabajo de investigación, se examinó la 

información obtenida para establecer si la composición de aminoácidos libres de una 

miel podía explicar sus orígenes botánicos. 

Más recientemente, Hermosín et al. (2006) han desarrollado un método para el 

análisis conjunto de aminas biógenas, aminoácidos e ión amonio en vinos. Este método 

consiste en la separación mediante CL en fase reversa de las aminoenonas formadas por 

reacción de los aminoácidos, las aminas biógenas y el ión amonio con el agente 

prederivatizante etoximetilenmalonato de dietilo (EMMDE). 

La reacción de derivatización se realiza en medio metanólico básico, durante 30 

minutos. Posteriormente, la muestra se calienta 2 horas a 70ºC para la completa 

degradación del exceso de reactivo y de sus productos secundarios de reacción. La 

mayoría de los derivados obtenidos son perfectamente estables, al menos durante la 

primera semana, excepto prolina e hidroxiprolina, por lo que de ser necesaria su 

cuantificación, el análisis debería realizarse en las 24 horas siguientes a la reacción de 

derivatización. Este es uno de los inconvenientes del método. 

Sus ventajas son: derivatización directa sin preparación previa; cuantificación 

simultánea de 24 aminoácidos (incluida prolina), 9 aminas biógenas y el ión amonio; 

empleo del detector UV-Visible, el más habitual en cualquier laboratorio y no 

interferencia en el cromatograma del exceso de agente derivatizante. 

Los límites de detección están por debajo de 0.4 mg/L entre los aminoácidos, y 

de 0.07 mg/L entre las aminas biógenas. Con otros agentes se han conseguido límites de 

detección más bajos por lo que este reactivo se debe usar cuando no se requiera una 

sensibilidad por debajo de picomoles. Otro inconveniente es el tiempo de 

derivatización, ya que con otros agentes se consiguen procesos de derivatización más 

cortos (Alaiz et al., 1992). 

25

Introducción 

i) 6-Aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato 

El 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidil carbamato (AQC) es un agente para la 

derivatización de grupos aminos, específicamente diseñado para el análisis de 

aminoácidos, con la idea de simplificar la reacción de derivatización, aumentar los 

rendimientos de la reacción e incrementar la sensibilidad y selectividad de los derivados 

formados cuando se trabaja con detección por fluorescencia (Cohen y Michaud, 1993; 

Cohen y Antonis, 1994; Wandelen y Cohen, 1997). Hernández–Orte et al. (2003) 

optimizaron las condiciones de separación propuestas por Cohen y Michaud (1993) para 

conseguir una cuantificación simultánea de los aminoácidos libres de los mostos y vinos 

sin problemas de interferencia debidos al contenido de azúcar. 

Este compuesto reacciona rápidamente con los aminoácidos primarios y 

secundarios formando productos altamente estables con una fuerte fluorescencia a 

395 nm (Figura 1.7). Los derivados que resultan son estables a temperatura ambiente 

durante, al menos, una semana y se separan fácilmente por CL en fase reversa utilizando 

una columna de C18. 

N 

N 

H 

N 

O 

O N 

O 

Figura 1.7. Reacción de derivatización del AQC 

El exceso del reactivo se hidroliza durante la reacción para formar 6aminoquinolina 

(AMQ) (Figura 1.8), cuyas características espectrales son netamente 

diferentes a cualesquiera de los aminoácidos derivatizados. Ello permite programar una 

longitud de onda que maximice la respuesta de emisión de los derivados y reduzca al 

mínimo la respuesta del AMQ. En esta hidrólisis del reactivo también se forma N- 

O 

+ 

HN 

AQC Aminoácido 1º y 2º 

H 

N 

O 

N 

R 1 

R 2 

+ 

HO 

Aminoácido derivatizado NHS 

O 

N 

R 1 

R 2 

O 

26

Introducción 

hidroxisuccinimida (NHS) y dióxido de carbono pero éstos no interfieren en el análisis 

cromatográfico. La destrucción de exceso del reactivo es completa en un minuto. 

N 

N 

AMQ 

NH 

AQC 

NH 2 

O 

+ 

O N 

Figura 1.8. Hidrólisis del exceso de AQC 

El protocolo de derivatización, agregado del reactivo y calefacción de la muestra 

previamente tamponada, es simple y directo. Los derivados de los aminoácidos se 

inyectan directamente sin preparación adicional de la muestra, mientras que las sales 

(presentes en la muestra) prácticamente no causan interferencias en la reacción o en la 

reproducibilidad de los resultados (Wandelen y Cohen, 1997). 

Este método ha sido optimizado para su uso con un detector de fluorescencia con 

el fin de lograr límites de detección de 50-300 fentomoles para los aminoácidos 

existentes en péptidos e hidrolizados de proteínas (Hernández-Orte et al., 2003). 

Utilizando un detector de UV, a 250 nm, el AMQ absorbe alrededor de 200 

veces más que cualquiera de los aminoácidos derivatizados y esto puede ocasionar 

dificultades en la cuantificación del ácido aspártico, que es el primero de los 

aminoácidos en eluir. Esto no ocurre cuando la detección se lleva a cabo por 

fluorescencia, ya que la señal del AMQ es mucho menor a la obtenida en el UV. Otra 

característica del AMQ es que su tiempo de retención puede variar dependiendo del pH 

de la fase móvil. 

La presencia de dos grupos fluorescentes en una misma molécula puede 

disminuir considerablemente su fluorescencia debido a un fenómeno conocido como 

"quenching interno". Este efecto se observa muy débilmente en el caso de la molécula 

O 

HO 

O 

O 

N 

NHS 

O 

+ 

O 

H 2 

+ CO 2 

27

Introducción 

de lisina, pero es bien notorio con el triptófano. En este caso la sensibilidad del método 

se ve ampliamente favorecida por el uso de un detector UV. 

Tanto el análisis de muestras con triptofano, como el análisis de aminoácidos libres en 

una solución intravenosa, puede ser eficazmente realizado usando ambos detectores en 

serie, primero el de fluorescencia para la mayoría de los aminoácidos y luego el detector 

UV para el triptofano. 

Este reactivo también se ha utilizado como una alternativa al reactivo de 

derivatización más común, OPA, para determinar aminas biogénicas en vinos (Busto et 

al., 1996) y para estudiar la evolución de los aminoácidos y péptidos durante la 

fermentación alcohólica y autolisis de los vinos (Alexandre et al., 2001). 

En la siguiente tabla se muestra un resumen de los agentes empleados en la 

derivatización de los aminoácidos con sus ventajas e inconvenientes. 

Reactivo 

Ninhid 

rin a 

DNSa 

b 

Cl 

Derivatiz. 

Postcolumna 

Precolumna 

y 

Postcolumna 

Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatización de aminoácidos 

Mec 

separación 

Intercambio 

iónico 

Fase reversa 

Tipo detec. 

UV 

Fluorescencia 

UV 

DABS-CL Precolumna Fase reversa Visible 

DNFB 

Precolumna Fase reversa Fluorescencia 

a Aplicado en muestras de vino 

Ventajas 

-Reaciona con aa 

primarios y secundarios 

-Capaz de detectar 

picomoles 

-Reacciona con aa 



picomoles o fentomoles 

-Derivados estables a la 

hidrólisis 

-Buena reproducibilidad 

para todos aa menos para 

His 

-Muy adecuado para 

determinar Cys 


primarios y secundarios. 

-Derivados muy estables 

(4 semanas a Tª 

ambiente) 


picomoles 



-Capaz de detectar bajos 

niveles de picomoles 

-Determina aa que otros 

agentes resuelven peor 

b Aplicado en muestras de vinagre 

Inconvenientes 

-No reproducible en 

cantidades menores a 100 

picomoles 

-Problemas de 

interferencias con la 

matriz 

-Sensible a la luz, O 2, 

cambios Tª y pH 

-El exceso de reactivo 

interfiere en el cromatog. 

-Los derivados son 

fotosensibles 

-Reacción lenta 

-His forma picos 

múltiples 

-No es específico y 

reacciona con otros 

compuestos 

-El exceso de reactivo 


-Las sales y detergentes 

presentes en las muestras 

interfieren 

-Produce múltiples 

derivados 


fotosensibles 

-Reacción muy lenta. 

-Método destructivo para 

péptidos 

28

Introducción 

Tabla 1.3. Agentes empleados en la derivatización de aminoácidos (Continuación) 

Reactivo Derivatiz. 

a b 

PITC 

a b 

OPA 

FMOC a 

EMMDE 

AQC a 

Mec 

separación 

Precolumna Fase reversa UV 

Precolumna 

y 

Postcolumna 

Fase reversa 

y 

Cromatg. 

Intercambio 

iónico 

Tipo detec. Ventajas Inconvenientes 

Fluorescencia 

UV 

Precolumna Fase reversa Fluorescencia 

Precolumna Fase reversa UV-Visible 

Precolumna Fase reversa 

a Aplicado en muestras de vino 

Fluorescencia 

UV 


primarios y secundarios. 

-Determina Prolina e 

Hidroxiprolina con una 

sensibilidad de picomoles 

-Reacción rápida 

-Forma derivados más 

estables que otros 

reactivos 

-El reactivo se puede usar 

en exceso porque no 

interfiere 

-El reactivo se puede usar 

en exceso porque no 

interfiere 


-Derivados altamente 

fluorescentes 

-10 veces más sensible 

que reacción con 

Ninhidrina 



-Reacción rápida (30 

segundos) 

-Derivados estables y 

altamente fluorescentes 

-Muy sensible 

-Reacciona con 

aminoácidos primarios y 

secundarios 

-Derivatización directa 

sin previa preparación 

-El exceso de reactivo no 

interfiere 

-Sensibilidad de 

picomoles 

-El exceso de reactivo no 

interfiere 



-Derivados estables y 

altamente fluorescentes 

-Muy sensible (50-300 

fentomoles) 


-Derivados se inyectan 

sin previa preparación de 

la muestra 

-Las sales y detergentes 

de muestras no interfieren 

b Aplicado en muestras de vinagre 

-Problemas de 

interferencias con la 

matriz en el análisis de 

mostos 

-No adecuado para su 

automatozación 

-Sensibilidad menor a 

otros métodos (50 veces 

menor que OPA y 

FMOC) 

-El proceso es lento 

porque necesita un paso 

de evaporación a 

sequedad 


inestables 

-No reacciona con aa 

secundarios (prolina) 

-Necesita una completa 

automatización de la 

reacción 

-Respuesta de la 

Lys,Hidroxilisina y Cys 

baja 

-Derivados se 

descomponen 

-Produce múltiples 

derivados 

-El reactivo es por sí 

mismo fluorescente e 


-El Proceso de derivatiz. 

es lento ya que se tiene 

que eliminar el reactivo 

-Proceso de 

derivatización lento 

-Inestablilidad de los 

derivados de prolina e 

hidroxiprolina 

-No sensible a niveles 

inferiores a picomoles 

-Lys y Trp muestran una 

menor fluorescencia por 

el llamado “quenching 

interno” 

-Si el amonio no se 

derivatiza totalmente, el 

exceso de éste puede 

distorsionar el análisis de 

Arg y Thr 

29

Introducción 

Aunque la derivatización precolumna ofrece más ventajas, ninguno de los 

agentes prederivatizantes estudiados se considera el agente universal ya que ninguno 

cumple todos los requisitos: 

• Reaccionar rápidamente bajo condiciones suaves para obtener el 

derivado de forma cuantitativa. 

• Reaccionar con aminoácidos primarios y secundarios. 

• Los derivados deberían ser estables durante varios días, preferiblemente 

a temperatura ambiente para permitir el análisis automatizado de 

múltiples muestras. 

• Respuesta lineal en los niveles de concentración típicos de la mayoría de 

las aplicaciones. 

• El exceso de reactivo o productos secundarios no deberían interferir en el 

análisis de aminoácidos. 

1.2.4. Elección del método óptimo 

Cada uno de los métodos tiene sus propias ventajas e inconvenientes. El criterio 

predominante que influirá en la selección de la derivatización y en los procedimientos 

de CL son la resolución, la sensibilidad y la velocidad. 

Hasta ahora los agentes derivatizantes que se han aplicado para la determinación 

de aminoácidos en vinagres ha sido cloruro de dansilo, fenilisotiocianato y 

ortoftaldehído. El ortoftaldehído es el más utilizado para la determinación de 

aminoácidos tanto en muestras de vino como de vinagre, sin embargo, lo descartamos 

ya que no reacciona con la prolina, que es uno de los aminoácidos más abundantes en 

las muestras de vinagre. Además, los derivados que se obtienen son inestables. Los 

otros dos agentes (cloruro de dansilo y fenilisotiocianato), también se descartaron ya 

que se ha visto que dan problemas de interferencias con la matriz y el proceso de 

derivatización es lento. Otro de los motivos por lo que se descartó el cloruro de dansilo 

fue la fotosensibilidad de los derivados. 

Por otro lado, el etoximetilenmalonato de dietilo, a pesar de sus numerosas 

ventajas también se descartó por tener un proceso de derivatización más largo y por la 

inestabilidad que presentan los derivados de la prolina. Los restantes reactivos 

derivatizantes, también mostraban problemas en cuanto a la estabilidad de los derivados 

y a la interferencia del exceso de reactivo en el cromatograma. 

En este trabajo de investigación, se propone la utilización del método empleado 

por Hernández-Orte et al., (2003) para aplicarlo a la determinación de aminoácidos en 

muestras de vinagre de vino y para el seguimiento del proceso de acetificación. Los 

aminoácidos de separan mediante CL tras una previa derivatización con el agente AQC 

y se determinan por fluorescencia. La validación de este método para vinagres 

comprende la determinación de los parámetros analíticos: selectividad, exactitud, 

precisión, linealidad, sensibilidad y límites de detección y cuantificación. 

30

2.1. MATERIAL 

2.1.1 Muestras 

Materiales y Métodos 

2. MATERIAL Y MÉTODOS 

La determinación se llevó a cabo en un total de 36 muestras de vinagres de vino 

o de vinos en proceso de acetificación (Tabla 2.1), que se obtuvieron a partir de dos 

sustratos vínicos distintos. La acetificación de los mismos se llevó a cabo mediante 

cultivo superficial (método de Orleáns) utilizando barricas de diferentes tipos de 

maderas. 

La codificación empleada para identificar las muestras de vinagre es de la forma 

XYZn. 

X indica el vino del que proviene el vinagre, por tanto, tomará los dos posibles 

valores: 

- F, vino tinto procedente del sur de Francia cuyas características aparecen 

en la Tabla 2.1., con elevado azúcar residual. 

- T, vino tinto de la denominación de origen Priorato cuyas características 

aparecen en la misma Tabla. 

Se han seguido seis acetificaciones por cada sustrato que se indican con los 

dígitos YZ. Las acetificaciones de cada sustrato se llevaron a cabo en seis barricas de 60 

L de capacidad que se llenaron con un total de 40 L. Estas barricas presentan diferencias 

en cuanto a sus características de madera (indicado con la letra Y) y tonelería (indicado 

con la letra Z). Las acetificaciones duraron entre 1.5 - 2.5 meses para las muestras del 

sustrato vínico F y entre 5 - 9 meses para las del sustrato vínico T. 

n indica el momento de la toma de muestra durante el proceso de acetificación, 

tomando 3 posibles valores: 

i si se encuentra al inicio (0.37 – 0.62 grados acéticos) 

m si se encuentra a mitad del proceso de fermentación (3.5 – 4 grados 

acéticos) 

f si se encuentra al final del proceso de fermentación (5.5 – 6 grados 

acéticos) 

31

Sustrato T 


Tabla 2.1. Muestras estudiadas en la presente memoria 

Vino de partida Madera 

Sustrato F 

Grado alcohólico: 9.2 

Grado acético: 0.9 

Grado alcohólico: 11.3 

Grado acético: 0.9 

2.1.2. Reactivos 

Puntos de muestreo durante la acetificación 

Inicio Mitad Final 

AL FALi FALm FALf 

BL FBLi FBLm FBLf 

CK FCKi FCKm FCKf 

CL FCLi FCLm FCLf 

CM FCMi FCMm FCMf 

DL FDLi FDLm FDLf 

AL TALi TALm TALf 

BL TBLi TBLm TBLf 

CL TCLi TCLm TCLf 

DK TDKi TDKm TDKf 

DL TDLi TDLm TDLf 

DM TDMi TDMm TDMf 

a) Reactivo empleado para la reacción de derivatización 

Kit “AccQ-Fluor”, constituido por 6-Aminoquinolil-N-Hidroxisuccinimidil 

Carbamato (AQC), acetonitrilo para disolver el reactivo y disolución tampón de borato 

sódico 0.2 mM a pH 8.8. Waters WAT052880 (Milford, MA, USA). 

b) Sustancias patrón 

Se han empleado un total de 24 patrones comerciales, correspondientes a los 

principales aminoácidos en el vino y en vinagre, amonio y patrón interno (Tabla 2.2) 

32


Tabla 2.2. Patrones de aminoácidos 

Aminoácido Proveedor 

Referencia 

L-Ácido Aspártico Aldrich A9,310-0 

L-Asparagina Fluka 11150 

L-Serina Fluka 84960 

L-Ácido Glutámico Aldrich 12,843-0 

L-Histidina Sigma H-8000 

L-Glutamina Fluka 49419 

L-Glicina Merck 1.04201 

L-Arginina Fluka 11009 

L-Treonina Fluka 89179 

L-Alanina Aldrich A2,680-2 

L-Prolina Fluka 81710 

Ácido γ-Aminobutírico Sigma 2129 

Ácido α-Aminobutírico (PI) * Fluka 07200 

L-Cisteina Fluka 30089 

L-Tirosina Fluka 93830 

L-Valina Fluka 94620 

L-Metionina Fluka 64320 

L-Ornitina monohidroclorada Merck 1.06906 

L-Lisina Sigma L-5501 

L-Isoleucina Fluka 58880 

L-Leucina Fluka 61820 

L-Fenilalanina Fluka 78020 

L-Triptófano Fluka 93659 

Sulfato Amónico Sigma A-2939 

* PI: Patrón Interno 

c) Otros Reactivos 

Para la preparación de los eluyentes se han utilizado distintos productos de calidad 

HPLC (Tabla 2.3). El agua desionizada fue obtenida con un sistema de purificación 

Milli-Q “Millipore”. 

Tabla 2.3. Reactivos para eluyentes 

33

Reactivo 


Proveedor Referencia 

EDTA cálcico disódico Sigma ED2SC 

Acetato sódico trihidratado Fluka 71190 

Trietilamina (TEA) Fluka 90335 

Ácido fosfórico Sigma-Aldrich 466123 

Acetonitrilo Merck 1.14291 

Adicionalmente se emplearon para la preparación de las disoluciones de 

patrones: 

Ácido Clorhídrico 32% Merck 1.00319 

Amoniaco 25% Merck 1.05432 

2.1.3. Instrumentación 

2.1.3.1. Cromatógrafo líquido de alta eficacia 

- Equipo cromatográfico “Waters”, formado por: 

Inyector automático Waters 717 

Bomba cuaternaria Waters 600E System Controller 

Horno Waters Steel Columm Heater Module 

Estación de datos Millennium 32 

Desgasificador en línea AF Waters 

Detector de haz de fotodiodos Waters 996 

Detector de fluorescencia Waters 474 

- Columna de sílice Luna C18 en fase reversa, tamaño de partícula 5µm, 250 x 

4.6 mm “Phenomenex” (Torrance, CA, USA) (Distribuida por Jasco Analítica 

SPAIN, Madrid). 

- Precolumna 4.0 mm x 3.0 mm “Phenomenex” (Torrance, CA, USA). 

(Distribuida por Jasco Analítica SPAIN, Madrid). 

- Software Millennium 32 Chromatography Manager de “Waters”. 

2.1.3.2. Instrumentación y material 

34

2.2. MÉTODOS 


• Balanza Analítica “Mettler” con aproximación de 0.0001g 

• Agitadores magnéticos “Selecta-P” 

• Baño Ultrasonido “Selecta-P” con capacidad de 6 L 

• Bomba de Vacío de Membrana Vacuubrand “Schott Iberia” de 1.7 

m 3 /h 

• pH-metro “Crison” GLP22 

• Baño de agua termostatizado “Selecta-P” Digiterm 3000542 

• Vortex “IKA” 230V, 50/60Hz 

• Sistema de filtración de agua Milli-Q “Millipore” 

• Filtros con un tamaño de poro de 045µm “Millipore” 

• Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 10 a 100µl 

• Micropipeta digital Nichipet EX “Nichiryo” de 100 a 1000µl 

• Desecador de vidrio con gel de sílice 

2.2.1. Preparación de las fases móviles 

La disolución de acetato sódico se preparó disolviendo 19.05 g de acetato sódico 

trihidratado con agua Milli-Q hasta un volumen final de 1 L. Seguidamente se ajustó el 

pH de dicha disolución a 5.5 con una disolución de ácido fosfórico en agua al 10% 

(p/v). Una vez ajustado el pH se añadió 1 mL de una disolución de EDTA cálcico 

disódico en agua (1g/L) y 2.37 mL de trietanolamina (TEA). Finalmente se ajustó de 

nuevo el pH bien a 4.92 (para la preparación la fase móvil D) o a 5.15 (para la 

preparación de las fases B y C) con el ácido fosfórico al 10% y se añadió la 

correspondiente proporción de acetonitrilo (fases D, C y B). Para la fase móvil A se 

utilizó acetonitrilo y agua en la proporción 60:40. 

Todas las disoluciones fueron filtradas a través de un filtro de membrana 

“Millipore” con un tamaño de poro de 0.45 µm antes de ser usadas. 

2.2.2. Condiciones cromatográficas 

35


Los derivados de aminoácidos se separaron empleando un gradiente cuaternario 

compuesto por las siguientes fases móviles: 

• Fase Móvil A: acetonitrilo - agua Milli-Q (60:40) 

• Fase Móvil B: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (80:20) 

• Fase Móvil C: acetato sódico pH 5.15 - acetonitrilo (96:4) 

• Fase Móvil D: acetato sódico pH 4.92 - acetonitrilo (96:4) 

Partiendo del gradiente propuesto por Hernández-Orte et al. (2003) se realizaron 

sucesivas pruebas de gradiente, resultando ser el más adecuado el que figura en la 

siguiente tabla: 

Tabla 2.4 . Gradiente de elución 

Tiempo (min) %A %B %C %D 

0 0 0 0 100 

20 0 0 0 100 

22 0 0 100 0 

25 0 31 69 0 

28 0 34 66 0 

44 0 57 43 0 

64 0 100 0 0 

84 100 0 0 0 

94 0 0 0 100 

Los cambios de gradiente se realizaron de manera lineal y el análisis 

cromatográfico se llevó a cabo a 34º C. El volumen de inyección fue de 20 µL. 

2.2.3. Preparación de patrones 

Se prepararon disoluciones para cada uno de los patrones de aminoácidos 

estudiados, así como para el amonio. Las disoluciones de cada patrón se prepararon 

disolviendo en agua Milli-Q una cantidad correspondiente a 400 mg de patrón hasta un 

36


volumen final de 25 mL. Para algunos aminoácidos fue necesaria la adición de ácido 

clorhídrico o amoniaco para su completa disolución como se indica en la Tabla 2.5. 

Tabla 2.5. Concentraciones de las distintas disoluciones empleadas 

Patrones Riqueza mg Patrón 1 Patrón 3 

% 

(mg/L) (mg/L) 

Aspártico (Asp) 

98 400 1.568 333.2 

Asparagina (Asn) a 

>99 400 1.584 330.66 

Serina (Ser) 

99 400 1.584 265.32 

Ácido Glutámico (Glu) a 

99 400 1.584 368.28 

Histidina (His) 99 400 1.584 388.08 

Glutamina (Gln) a 

>99.5 400 1.592 366.16 

Glicina (Gly) 99.7 400 1.595 189.43 

Arginina (Arg) >99.5 400 1.592 437.8 

SulfatoAmónico (NH4 + ) 

98 1498 1.600 * 

45.2 

Treonina (Thr) >99.5 400 1.592 298.102 

Alanina (Ala) 99 400 1.584 222.948 

Prolina (Pro) 99 400 1.584 289.08 

Ácido γ-Aminobutírico (GABA) 99 400 1.584 259.38 

Cisteina (Cys) a 

>99.5 400 1.592 455.4 

Tirosina (Tyr) a 

>99 400 1.584 293.04 

Valina (Val) a 

>99 400 1.584 374.22 

Metionina (Met) a 

>99 400 1.584 332 

Ornitina monohodroclorada (Orn) 99 515 1.600 ** 

366.52 

Lisina (Lys) 98 400 1.568 328.68 

Isoleucina (Ileu) a 

>99 400 1.584 328.68 

Leucina (Leu) a 

99 400 1.584 413.82 

Fenilalanina (Phe) >99 400 1.584 513.42 

Triptófano (Trp) b 

>99.5 400 1.592 

* 

Concentración de amonio 

** Concentración de ornitina 

a 

Se añadió ácido clorhídrico al 32% hasta disolución 

b 

Se añadió amoniaco al 25% hasta disolución 

La preparación de la disolución del patrón interno α-aminobutírico (disolución 

“patrón 2”) empleada en el estudio se llevó acabo en dos pasos. En primer lugar se 

disolvió 26.04 mg de patrón en 50 mL de agua Milli-Q, resultando una disolución de 

520 mg/L teniendo en cuenta su riqueza. En segundo lugar, se tomó 1.25 mL de la 

disolución anterior y se llevó a un volumen final de 10 mL con agua Milli-Q. Esta 

nueva disolución tiene una concentración de 64.45 mg/L de ácido α-aminobutírico. 

Los aminoácidos y el ión amonio son inestables en disolución a temperatura 

ambiente y con el tiempo se van descomponiendo. Por este motivo se deben conservar a 

37


una temperatura entre 4 y 8ºC y los más inestables (cisteina, metionina, triptófano, 

ornitina, tirosina y amonio) a –20ºC. 

A partir de las disoluciones “patrón 1” de los distintos estándares se prepararon, 

mediante sucesivas diluciones, la disolución “patrón 3” y la disolución “mezcla 

enriquecimiento”. 

La disolución “patrón 3”, es una mezcla de todos los aminoácidos estudiados y 

se empleó para preparar los diferentes niveles de concentración de la recta de calibrado. 

Por otro lado, la disolución “mezcla enriquecimiento” que se utilizó para realizar 

los estudios de recuperación se preparó añadiendo todos los aminoácidos estudiados, 

resultando tener una concentración final de 1 mg/L de cada uno de ellos. Debido a que 

los estándares de aminoácidos contienen como impureza ión amonio, se preparó, de 

forma independiente, una disolución con la misma concentración (1 mg/L), que sólo 

contenía dicho compuesto. 

Antes de la derivatización, se procedió del siguiente modo, tanto para disoluciones de estándares, como 

para muestras: 

- Se tomaron 50 µL de α-ABA (PI) de la disolución “Patrón 2” (64.45 mg/L), 125 µL bien de las 

disoluciones estándares o de las muestras diluidas y se añadió agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 

mL. A esta disolución se le denominó “mezcla prederivatización”. 

La mezcla prederivatización de aminoácidos usada para la selección del 

gradiente más adecuado contenía una concentración de 0.01 mM de PI, 0.1 mM de 

ornitina, 0.15 mM de triptófano y cisteina y 0.05 mM del resto de aminoácidos y 

amonio. 

2.2.4. Preparación de muestras 

Las muestras de vinagre se filtraron con papel de filtro y posteriormente se 

diluyeron al 25% añadiendo 500 µL de la muestra a 1500 µL de agua Milli-Q. A partir 

de las muestras así diluidas se preparó la mezcla prederivatización correspondiente tal y 

como se ha explicado en el apartado anterior. 

2.2.5. Reacción de derivatización 

La reacción de derivatización se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del kit 

(Cohen y Michaud, 1993). Para ello se añadieron 20 µL de la mezcla prederivatización 

de los estándares o de las muestras diluidas a 60 µL de una disolución tampón de borato 

sódico 0.2 mM a pH 8.8 y se agitó vigorosamente con un vortex durante 10 segundos. 

Posteriormente, a esta mezcla se le añadió 20 µL de la solución AQC agitando 

nuevamente otros 10 segundos y se llevó a un baño de agua a 55ºC durante 10 minutos 

(Figura 2.1). 

38

Mezcla 

Prederivatización 

2.2.6. Identificación 

20 µL 


60 µL tampón borato 

20 µL AQC 

55ºC-10 min 

Figura 2. 1. Protocolo de derivatización 

Inyectan 20 µL 

La detección de los distintos aminoácidos y el amonio se realizó con un detector 

de fluorescencia usando una λex de 250 nm y una λem de 395 nm. 

La identificación se llevó a cabo utilizando los tiempos de retención 

correspondientes a los picos cromatográficos de los patrones y los tiempos de retención 

relativos de éstos frente al patrón interno (Tabla 2.6). Para conocer tanto los tiempos de 

retención como el orden de elución de los compuestos estudiados se comenzó 

inyectando de forma individual 0.04 nmoles del PI, 0.4 nmoles de ornitina, 0.6 nmoles 

de triptófano y cisteina y 0.2 nmoles del resto de aminoácidos y el amonio y finalmente 

se inyectó una mezcla de todos los patrones para comprobar la resolución de los picos 

cromatográficos. 

39

AMQ * 


Tabla 2.6. Tiempos de retención 

Tiempo de 

retención 

Tiempo de retención relativo 

23.784 0.442 

Ac Aspártico(Asp) 30.414 0.566 

Asparagina (Asn) 31.566 0.588 

Serina (Ser) 32.938 0.613 

Ac Glutámico(Glu) 34.599 0.643 

Histidina (His) 34.863 0.648 

Glutamina (Gln) 35.578 0.662 

Glicina (Gly) 35.914 0.668 

Arginina (Arg) 38.610 0.718 

Amonio (NH4 + ) 39.881 0.742 

Treonina (Thr) 41.453 0.771 

Alanina (Ala) 43.773 0.814 

Prolina (Pro) 47.865 0.890 

Ac γ-Aminobutírico (GABA) 49.809 0.925 

Ácido α-Aminobutírico (PI) 53.772 1.000 

Cisteina (Cys) 57.716 1.073 

Tirosina (Tyr) 60.323 1.122 

Valina (Val) 64.239 1.195 

Metionina (Met) 65.736 1.222 

Ornitina (Orn) 67.124 1.248 

Lisina (Lys) 69.727 1.297 

Isoleucina (Ileu) 75.565 1.405 

Leucina (Leu) 76.346 1.420 

Fenilalanina (Phe) 77.165 1.435 

Triptófano (Trp) 77.883 1.448 

* AMQ: derivado de la hidrólisis del reactivo AQC que tiene lugar durante la reacción de derivatización 

(Figura 1.8 de “Introducción”) 

2.2.7. Cuantificación 

La cuantificación se llevó a cabo utilizando un patrón interno. Para ello se 

construyeron rectas de calibrado tomando los cocientes entre las áreas de los picos de 

40


cada compuesto y la del patrón interno frente a la concentración de cada compuesto en 

la mezcla prederivatización. 

Como se señaló en el apartado 2.2.3, para realizar las rectas de calibrado de los 

aminoácidos se tomaron diferentes volúmenes de la mezcla “patrón 3”, cuyas 

concentraciones se muestran en la Tabla 3.2 del apartado 3.2.2 de “Resultados y 

Discusión”. Para el caso del ión amonio y debido a que los estándares de aminoácidos 

contienen como impureza ión amonio, se preparó de forma independiente una 

disolución “patrón 3” que contenía sólo dicho compuesto, a partir de la cual, tomando 

diferentes volúmenes, se construyó la recta de calibrado del amonio. 

Las rectas de calibrado se construyeron inyectando por duplicado los distintos 

niveles de concentración, previa derivatización también por duplicado. 

2.2.8. Límites de detección y cuantificación 

Dado un método analítico determinado, se entiende por límite de detección 

(LDD) la mínima concentración o cantidad de analito presente en la muestra que se 

puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo las condiciones 

experimentales descritas; y por límite de cuantificación (LDC) la mínima concentración 

o cantidad de analito en la muestra que se puede cuantificar, bajo dichas condiciones 

experimentales, con una adecuada precisión y exactitud. 

Existen diferentes formas de determinar los límites de detección y cuantificación 

dependiendo si el procedimiento es no-instrumental o instrumental (ICH, 1996): 

• Basados en una evaluación visual 

• Basados en la señal/ruido 

• Basados en la desviación estándar de la respuesta y la pendiente 

• Basados en la extrapolación de la recta de calibrado a concentración cero 

En nuestro caso, los límites de detección y cuantificación fueron determinados 

por el método basado en la relación señal/ruido. Este método, uno de los más conocidos 

y empleados, requiere que el procedimiento de análisis sea instrumental y que 

proporcione una señal blanco, un ruido de fondo o una línea de base, es decir una señal 

residual a concentración cero del analito tal como ocurre en los métodos 

cromatográficos. 

Para estimar los límites de detección y cuantificación en estos casos se han 

propuesto estrategias basadas en la medida de la magnitud del ruido y de la altura de los 

picos de los analitos. Generalmente se define el límite de detección como la 

concentración que origina una señal/ruido (S/R), igual a un determinado valor, que 

generalmente es 3. Análogamente, el límite de cuantificación corresponde a una 

relación S/R de 10. Así pues, en la práctica fue preciso medir la magnitud del ruido, 

multiplicar su valor por el factor elegido y convertirlo en una concentración mediante la 

recta de calibrado. Para estimar la magnitud del ruido se realizaron mediciones sobre la 

línea base de un cromatograma obtenido con un blanco, midiéndose su amplitud, es 

decir la diferencia entre el valor máximo y el mínimo. 

41


Debido a que no es posible encontrar en nuestro caso muestras “blancas”, es 

decir muestras de vino o vinagre sin aminoácidos, para la elaboración del blanco se 

realizó la reacción de derivatización sobre una disolución acuosa que contenía 

exclusivamente el patrón interno. 

2.2.9. Estudios de precisión 

El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad del método de 

ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método de 

ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los análisis efectuados 

sobre muestras idénticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a 

resultados idénticos. Los factores susceptibles de influir sobre los resultados de un 

ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, 

tiempo, etc.) de aquí la importancia del estudio de la precisión. 

La precisión es una medida del grado de separación o dispersión entre las 

medidas realizadas empleando un método analítico y trabajando en condiciones 

normales de operación. Se expresa normalmente como porcentaje de desviación 

estándar relativa (DER) o coeficiente de variación (CV). La precisión debe evaluarse a 

tres niveles: repetitividad, precisión intermedia y reproducibilidad. 

La repetitividad es una medida del grado de dispersión de una serie de medidas 

realizadas en un espacio de tiempo corto (en un mismo día). La precisión intermedia es 

una medida de la dispersión de los resultados obtenidos por un método analítico en un 

espacio de tiempo más amplio que la repetitividad, modificando ciertas condiciones de 

operación: diferentes días, analistas, equipos, etc. Por último, la reproducibilidad 

expresa la precisión entre laboratorios, formando parte de los estudios interlaboratorio. 

Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisión fue 

evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión intermedia. Se determinó tanto para el 

método analítico como para el proceso de derivatización. 

La medida de precisión, expresada como coeficiente de variación (CV), se 

determinó mediante la expresión: 

% CV = (s/x) × 100 

Donde s y x representan los valores de desviación estándar y valor medio de una 

serie de medidas repetidas. 

Para los estudios de precisión se utilizó una muestra de vinagre diluida al 15% 

enriquecida con una concentración de 250 µg/L de cada patrón . 

a) Repetitividad 

42


• Repetitividad del proceso de derivatización: Para llevar a cabo la 

repetibilidad del proceso de derivatización se realizaron 5 derivatizaciones 

de la muestra diluida inyectando cada una por duplicado en la misma sesión 

de trabajo. 

• Repetitividad del método analítico: En este caso se realizaron 5 replicados de 

la muestra derivatizada en una única sesión de trabajo. 

b) Precisión intermedia 

• Precisión intermedia del proceso de derivatización: Para la precisión 

intermedia del proceso de derivatización se realizaron 5 derivatizaciones de 

la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes, a lo largo de un 

periodo de 25 días, inyectando cada una de ellas por duplicado. 

• Precisión intermedia del método analítico: En el caso de la precisión 

intermedia del método se analizó la muestra derivatizada en 5 sesiones de 

trabajo a lo largo de un periodo de 7 días. 

2.2.10. Estudios de recuperación 

La exactitud se evaluó mediante los estudios de recuperación. Para llevar a cabo 

dichos estudios se realizó la adición de patrones a una muestra de vinagre diluida al 

15% a tres niveles de concentración: Nivel 0 = 250 µg/L, Nivel 1 = 300 µg/L, Nivel 2 = 

350 µg/L. Estas concentraciones se eligieron por estar dentro del intervalo de linealidad 

de los distintos patrones. 

La adición se llevó a cabo en la mezcla prederivatización del siguiente modo: 

• Nivel 0: Se tomaron 125 µL de la muestra de vinagre diluida, 125 µL de la 

mezcla enriquecimiento y 50 µL de la disolución “patrón 2” del PI, y se 

diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen final de 2.5 mL, obteniéndose 

una concentración de 250 µg/L de cada patrón. (En el apartado 2.2.3 se 

explica como se preparó la mezcla enriquecimiento). 


mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen 

final de 2.5 mL, obteniéndose una concentración de 300 µg/L de cada patrón. 


mezcla enriquecimiento y se diluyeron con agua Milli-Q hasta un volumen 

final de 2.5 mL, obteniéndose una concentración de 350 µg/L de cada patrón. 

Posteriormente se llevó a cabo la reacción de derivatización de los diferentes 

niveles por duplicado y se inyectó en el cromatógrafo 20 µl de cada duplicado. 

43


2.2.11. Estudio de dilución de las muestras 

Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras. Con objeto de 

determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron diferentes diluciones en agua 

tanto para vino como vinagre: 5, 15, 25, 35 y 50%. 

2.3. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 

Con objeto de establecer si existen o no diferencias significativas entre las 

muestras se aplicó el análisis de la varianza (ANOVA), usando el programa informático 

STADISTICA ® 99, versión 5.5. 

44

Resultados y Discusión 

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

3.1. ESTABLECIMIENTO DE LAS CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS 

Se partió de las condiciones cromatográficas recomendadas en el método 

original para vinos (Hernández-Orte et al., 2003): 

- Fases móviles: acetato sódico 0.14 M a pH 4.92 y 5.15, acetonitrilo y agua 

Milli-Q. 

- Flujo: 1 mL/min. 

- Temperatura de la columna: 34ºC. 

- Detección: fluorescencia con λex de 250 nm y λem de 395nm. 

La resolución entre los picos correspondientes a la parte inicial y final del 

cromatograma obtenido de la disolución patrón no era satisfactoria por lo que se 

hicieron varias modificaciones en el gradiente hasta conseguir la mejor resolución. Las 

fases móviles y el gradiente definitivo aparecen en la Tabla 2.4 de “Materiales y 

Métodos”. El resto de las condiciones se mantuvieron igual que en el método original. 

En la Figura 3.1. se muestra un cromatograma de una disolución de patrones en 

las condiciones óptimas del método. 

Figura 3.1. Cromatograma de una disolución de patrones en las condiciones óptimas del 

método. R: AMQ (Producto de la hidrólisis del reactivo); 1: Asp; 2: Asn; 3: Ser; 4: Glu; 5: His; 6: Gln; 

7: Gly; 8: Arg; 9: Amonio; 10: Thr; 11: Ala; 12: Pro; 13: GABA; 14: Cys; 15: Tyr; 16: Val; 17: Met; 18: 

Orn; 19: Lys; 20: Ileu; 21: Leu; 22: Phe; 23: Trp. 

45


Una vez establecidas las condiciones cromatográficas se llevó a cabo la 

validación del método. 

3.2. VALIDACIÓN DEL MÉTODO 

La definición ISO (International Standars Organization) de validación aplicada a 

los métodos analíticos podría interpretarse como el proceso mediante el cual queda 

establecido, por estudios experimentales, que la capacidad del método satisface los 

requisitos para la aplicación analítica requerida. 

Existe una gran variedad de documentación acerca de la validación de los 

métodos analíticos (Huber, 1998; AEFI, 2001; ICH, 1996), especialmente para métodos 

concretos (Filipe-Ribeiro y Mendes-Faia, 2006), y numerosas organizaciones 

promueven su difusión e importancia, como la AOAC (Association of Official 

American Chemists), EPA (Environmental Protection Agency), FDA (Food and Drug 

Administration), ICH (International Conference on Harmonization), USP (United States 

Pharmacopeia), EURACHEM (European Analytical Chemistry), etc. 

La validación de la metodología propuesta se realizó siguiendo las 

recomendaciones de la ICH y EURACHEM publicados en guías para la validación de 

métodos y procedimientos analíticos (EURACHEM, 1993; ICH, 1996). 

La validación lleva consigo la evaluación de varios parámetros del método como 

la selectividad, exactitud (estudios de recuperación), precisión, linealidad de la 

respuesta del detector frente a la concentración, sensibilidad, así como límites de 

detección y cuantificación (Huber, 1998). 

3.2.1. Especificidad o selectividad 

Ambos términos se utilizan con frecuencia indistintamente, aún siendo 

conceptos diferentes. Para los métodos cromatográficos, la especificidad es la capacidad 

del método para medir con exactitud la respuesta de un analito en presencia de todos los 

posibles componentes de una muestra, mientras que el término selectividad se refiere a 

un método que proporciona respuestas para un número de entidades químicas que 

pueden o no ser distinguidas de otras. Si la respuesta se distingue de todas las demás, se 

dice que el método es selectivo. Por tanto, el término adecuado en nuestro caso es 

selectividad (Huber, 1998). 

La selectividad se determinó en un sustrato vínico y en muestras de vinagre 

tomándose como criterio que los picos adyacentes correspondientes a los analitos 

tuvieran una resolución de al menos 1.5 respecto a los picos restantes. Cuando se 

calcula la resolución en el sustrato vínico y vinagre todos los aminoácidos presentan 

resoluciones superiores a 1. En el sustrato vínico (Tabla 3.1 “Resolución A”), de todos 

los pares de picos, 16 tienen valores superiores a 2 y sólo tres entre 1 y 1.5 (resolución 

entre Ser-Glu, Glu-His y NH4 + ). Por otro lado, la resolución de los picos en las 

46


muestras de vinagre (Tabla 3.1 “Resolución B”) también fueron para casi todos los 

pares de picos superiorres a 1.5 y sólo para dos de ellos entre 1.1 y 1.5 (resolución entre 

Glu-His y Arg-NH4 + ). 

3.2.2. Linealidad 

Tabla 3.1. Resolución de los picos cromatográficos 

Compuesto 

Asp 

tR (min) 

30.414 

Resolución A Resolución B 

3.2 3.0 

Ser 32.938 

1,2 2,8 

Glu 34.599 

1,1 1.33 

His 34.863 

1,5 1,7 

Gly 35.914 

3,6 4,0 

Arg 38.610 

1,7 1,2 

NH4 + 

39.881 

1,1 2,0 

Thr 41.453 

3,5 2,6 

Ala 43.773 

5,7 4,6 

Pro 47.865 

2,9 1,6 

GABA 49.809 

4,5 5,1 

AABA(PI) 53.772 

8,4 8.0 

Tyr 60.323 

5,0 5,5 

Val 64.239 

2,4 2,0 

Met 65.736 

2.0 3,4 

Orn 67.124 

2,8 3,6 

Lys 69.727 

7,3 8,6 

Ileu 75.565 

2,1 1,8 

Leu 76.346 

2,2 2.0 

Phe 77.165 

Resolución A: Valores de resolución calculados en el sustrato vínico diluido al 

25% 

Resolución B: Valores de resolución calculados en muestras de vinagre diluidas al 

25%. 

La linealidad de un procedimiento analítico se define como su capacidad (dentro 

de un intervalo) para obtener resultados que sean directamente proporcionales (o por 

47


medio de ecuaciones matemáticas) a la concentración (cantidad) de analito en la 

muestra. 

Para determinar la linealidad se tomó el área relativa de los picos de cada uno 

de los aminoácidos estudiados y amonio a diferentes niveles de concentración (entre 5 y 

9), dentro del intervalo esperable en las muestras de vinagre, vino y sustratos de partida 

para los procesos de acetificación una vez que hayan sido diluidas convenientemente 

para su análisis (al 25%). Los ensayos se realizaron por duplicado. 

En la Tabla 3.2 aparece el intervalo de concentración lineal, los niveles de 

concentración, la ecuación de regresión lineal de la concentración frente a la respuesta 

del detector y el coeficiente de regresión lineal de cada compuesto. Se observó una 

adecuada linealidad obteniéndose en todos los casos unos coeficientes de correlación 

superiores a 0.992 en los intervalos de concentración indicados en dicha Tabla. 

Tabla 3.2. Rectas de calibrado de los aminoácidos y amonio determinado en vinagres 

Compuestos Intervalo a n * 

Ecuación r 2 

L.D.D. a L.D.C. a 

Asp 33.28 – 1663.75 7 y = 0.0003x - 0.0029 0.995 25.15 53.99 

Asn 33.03 – 1651.50 7 y = 0.0003x + 0.0395 0.993 16.5 33.00 

Ser 13.14 – 1313.63 7 y = 0.0004x + 0.069 0.992 14.0 28.52 

Glu 18.39 – 1839.13 8 y = 0.0003x + 0.0093 0.999 13.91 35.84 

His 19.40 – 1939.50 8 y = 0.0005x + 0.0325 0.997 35.1 70.05 

Gln 18.27 – 1826.88 8 y = 0.0003x +0.0174 0.996 26.14 52.27 

Gly 9.38 – 938.38 7 y = 0.0009x + 0.0205 0.998 6.42 14.74 

Arg 21.80 – 2177.50 9 y = 0.0005x - 0.0006 0.999 45.73 62.05 

NH4 + 

4.5 – 112.5 5 y = 0.0035x + 0.7566 0.997 5.07 16.90 

Thr 14.89 – 1489 8 y = 0.0006x + 0.0132 0.999 0.92 2.11 

Ala 11.14 – 1113.63 8 y = 0.0008x + 0.0190 0.999 0.20 9.61 

Pro 14.40 – 1439.13 8 y = 0.0003x - 0.0008 0.999 36.61 64.40 

GABA 12.89 – 1289 9 y = 0.0007x + 0.0109 0.996 10.21 21.87 

Cys 30.29 – 1514.50 8 y = 0.0001x + 0.0014 0.998 17.4 34.8 

Tyr 45.30 – 2264.88 8 y = 0.0003x + 0.0060 0.999 33.81 55.96 

Val 14.64 – 1464.38 8 y = 0.0009x + 0.0105 0.998 17.82 25.92 

Met 18.65 – 1865.13 9 y = 0.0006x + 0.0021 0.999 26.11 39.75 

Orn 16.52 – 1652 7 y = 0.0004x + 0.0225 0.998 24.24 60.59 

Lys 36.55 – 1827.38 9 y = 0.0003x + 0.0104 0.999 14.35 43.86 

Ileu 16.40 – 1639.75 9 y = 0.0011x + 0.0199 0.998 7.53 14.35 

Leu 16.40 – 1147.82 8 y = 0.0013x - 0.0078 0.995 16.39 31.55 

Phe 20.65 – 1445.41 7 y = 0.0013x + 0.0158 0.996 32.12 83.51 

Trp 127.6 – 2552.8 5 y = 0.00004x + 0.0019 0.994 110.37 280.78 

a Concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización) 

* Niveles de concentración 

3.2.3. Exactitud 

La exactitud de un método analítico es un parámetro que indica la cercanía de 

los resultados obtenidos por este método a un valor considerado como real. 

48


Existen varios procedimientos para determinar la exactitud de una metodología 

analítica: 

- Aplicación del procedimiento analítico a materiales de referencia certificados 

(MRC), cuya concentración de analito es conocida y comparación del valor 

medido con el valor certificado como real. 

- Comparación de los resultados obtenidos por la metodología propuesta con 

aquellos obtenidos mediante un método normalizado cuya trazabilidad es 

conocida. 

- Recuperación de cantidades conocidas de analito, obtenidas mediante el 

enriquecimiento de las muestras. La media de las réplicas indica el grado de 

exactitud del método. 

Para validar la exactitud de la propuesta metodológica, se optó, ante la ausencia 

de un MRC para este tipo de analitos en muestras de vinagres, por el 

enriquecimiento de las muestras. 

En nuestro caso, la recuperación media se calculó a partir de los valores 

obtenidos al inyectar por duplicado una muestra de vinagre diluida al 15% enriquecida 

con todos los patrones a tres niveles de concentración: nivel 0 (250 µg/L), nivel 1 (300 

µg/L) y nivel 2 (350 µg/L). Las recuperaciones así obtenidas se presentan en la Tabla 

3.3. 

Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y 

amonio a tres niveles de concentración. 

Compuesto 

Añadido 

(µµµµg/L) 

Recuperado 

(%) 

Recuperación 

Media (%) 

Asp 250 77.5 76.0 

300 73.5 

350 77.04 

Asn 250 92.2 90.1 

300 86.7 

350 91.5 

Ser 250 52.9 64.35 

300 68.5 

350 71.6 

Glu 250 89.7 88.5 

300 84.8 

350 90.9 

His 250 84.5 88.5 

300 82.4 

350 82.3 

Gln 250 103.5 102.7 

300 102.1 

350 102.5 

Gly 250 79.0 80.3 

300 80.2 

350 81.6 

49


Tabla 3.3. Ensayo de recuperación en una muestra de vinagre enriquecida con aminoácidos y 

amonio a tres niveles de concentración (continuación) 

Compuesto 

Añadido 

(µµµµg/L) 

Recuperado 

(%) 

Recuperación 

Media (%) 

Arg 250 85.0 81.22 

300 75.3 

350 83.4 

250 82.74 86.6 

300 86.7 

350 90.2 

Thr 250 92.6 90.1 

300 87.8 

350 89.7 

Ala 250 91.1 87.11 

300 78.1 

350 92.1 

Pro 250 86.4 82.7 

300 73.8 

350 87.8 

GABA 250 106.9 106.3 

300 105.3 

350 106.6 

Cys 250 52.8 53.0 

300 46.2 

350 59.9 

Tyr 250 90.9 91.9 

300 91.4 

350 93.5 

Val 250 89.1 86.5 

300 85.8 

350 84.8 

Met 250 91.7 91.3 

300 91.3 

350 90.9 

Orn 250 69.7 79.6 

300 83.1 

350 86.0 

Lys 250 84.5 86.9 

300 85.9 

350 90.2 

Ileu 250 88.1 87.6 

300 86.3 

350 88.2 

Leu 250 78.1 81.8 

300 82.5 

350 84.7 

Phe 250 86.2 91.0 

300 92.2 

350 94.5 

Trp 250 68.8 80.0 

300 88.3 

350 82.8 

NH4 + 

50


Según el manual de la AOAC (Huber, 1998), para concentraciones entre 1 ppm 

y 100 ppb las recuperaciones deben ser entre el 80 y 110%. En nuestro caso, para casi 

todos los aminoácidos las recuperaciones fueron superiores al 80%, y por tanto están de 

acuerdo con los valores propuestos por la AOAC. Únicamente serina y cisteína 

mostraron recuperaciones más bajas, pero, coincidiendo con Valero et al. (2005), en las 

muestras de vinagre este aminoácido se encuentra en pequeña concentración e incluso, 

no se consigue determinar. Además, en muchos trabajos de investigación se ha 

comprobado que la cisteína también se encuentra en muy pequeña concentración, 

incluso no detectable, en muestras de vino (Hernández-Orte et al., 2003; Pripis-Nicolau 

et al., 2001; Puig-Deu y Buxaderas, 1994; Botella et al, 1990). Sin embargo, en los 

vinagres de Jerez tradicionales si se ha podido determinar este aminoácido con una 

concentración media de 10 mg/L (Palacios et al., 2002). 

3.2.4. Límites de detección y cuantificación 

Los límites de detección y cuantificación se determinaron según la relación 

señal/ruido (S/R) tal como se explicó en el apartado 2.2.8 de “Materiales y Métodos”. 

Los resultados obtenidos, mostrados en la Tabla 3.2, fueron una media de diez 

veces superiores a los obtenidos por Hernández-Orte et al. (2003) para casi todos los 

aminoácidos y amonio excepto para la treonina y alanina. Los límites de detección 

oscilaron entre 0.20(Ala)-45.73(Arg) µg/L y los límites de cuantificación entre 2.11 

(Thr) –70.05 (His) µg/L, excepto para el caso del triptófano, el cual tuvo unos límites 

superiores (LDD: 110.37 µg/L y LDC: 280.75 µg/L). Estos valores demostraron que el 

método era suficientemente sensible para determinar los aminoácidos y amonio 

presentes en las muestras de vinagre de vino. 

3.2.5. Estudios de precisión 

Para cumplir los objetivos marcados en el presente trabajo, la precisión fue 

evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión intermedia. Se determinó tanto para el 

método analítico como para el proceso de derivatización. (En el apartado 2.2.9 de 

“Materiales y Métodos” se explica como se determinó la repetitividad y la precisión 

intermedia). 

c) Repetitividad y precisión intermedia del método analítico 

Los valores de repetitividad obtenidos, medidos como CV, variaron entre 0.2 

para la arginina y el amonio y 11.6 para la asparagina (Tabla 3.4). Estos valores están de 

acuerdo con los propuestos por el manual de la AOAC (Huber, 1998), donde para 

concentraciones comprendidas entre 1 ppm y 100 ppb se aceptan unos coeficientes de 

variación entre 11 y 15%. 

51


La precisión intermedia del método analítico se realizó durante 5 sesiones de 

trabajo mediante la medida de la muestra derivatizada, la cual se repitió cinco veces. En 

la Tabla 3.4 se muestran los valores de precisión intermedia expresados como 

coeficiente de variación (CV). Estos valores variaron en un intervalo de entre 0.3 

(leucina) y 13.9 (asparagina). 

Tabla 3.4. Repetitividad y precisión intermedia del método analítico 

Repetitividad Precisión Intermedia 

Compuestos (n = 5) 

(n = 5) 

Media a 

C.V. (%) Media a 

C.V. (%) 

Asp 350.1 3.2 402.1 8.3 

Asn 142.3 11.6 142.3 13.9 

Ser 207.4 1.5 294.1 0.9 

Glu 522.0 1.4 532.3 3.3 

His 297.8 2.6 283.3 1.4 

Gln 270.8 1.8 281.0 0.9 

Gly 324.7 0.5 416.9 3.2 

Arg 545.6 0.2 526.0 2.4 

NH4 + 

222.2 0.2 178.1 0.8 

Thr 311.0 2.8 472.9 0.9 

Ala 395.3 1.2 467.4 2.3 

Pro 639.8 1.3 691.8 2.6 

GABA 333.6 6.9 297.1 1.2 

Cys 132.0 5.6 188.2 4.8 

Tyr 330.0 2.8 375.7 2.4 

Val 306.4 2.1 325.7 0.9 

Met 240.2 2.8 225.2 3.5 

Orn 260.7 0.6 292.2 1.1 

Lys 392.3 1.9 361.7 3.3 

Ileu 262.7 1.5 266.8 0.6 

Leu 315.8 1.7 320.7 0.3 

Phe 349.3 4.4 363.9 1.5 

Trp 172.1 1.7 170.4 1.1 

a Media de la concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización) 

d) Repetitividad y precisión intermedia del proceso de derivatización 

En la Tabla 3.5 se muestran los valores de repetitividad y de precisión intermedia, expresados como 

coeficientes de variación. Los valores encontrados para la repetitividad oscilaron entre 0.1 para el amonio y 12.5 para 

la fenilalanina. 

Para la precisión intermedia del proceso de derivatización se realizaron 5 

derivatizaciones de la muestra diluida en 5 sesiones de trabajo diferentes inyectando 

cada una de ellas por duplicado. Los valores obtenidos variaron entre 0.1 para el amonio 

y 12.8 para la glicina. Estos valores junto con los de la repetitividad están de acuerdo 

con los propuestos por Huber (1998). 

52


Tabla 3.5. Repetitividad y precisión intermedia del proceso de derivatización 

Repetitividad Precisión Intermedia 

Compuestos (n = 5) 

(n = 5) 

Media a 

C.V. (%) Media a 

C.V. (%) 

Asp 343.5 0.3 316.0 1.8 

Asn 154.1 8.9 145.2 5.3 

Ser 217.4 0.6 193.1 2.2 

Glu 504.8 0.5 478.1 9.8 

His 255.7 3.4 249.3 7.0 

Gln 225.0 0.4 212.5 2.1 

Gly 307.9 4.9 328.2 12.8 

Arg 515.3 0.2 507.0 5.2 

NH4 + 

225.6 0.1 225.6 0.1 

Thr 313.7 1.7 307.4 5.8 

Ala 380.5 1.7 410.8 7.4 

Pro 629.8 4.8 653.9 1.4 

GABA 368.8 0.6 338.0 0.4 

Cys 193.8 8.1 160.5 5.6 

Tyr 377.0 2.7 390.7 8.1 

Val 378.9 6.8 320.8 0.8 

Met 282.7 2.7 278.4 3.3 

Orn 267.0 0.7 293.4 8.1 

Lys 349.6 1.4 362.7 4.6 

Ileu 275.3 2.0 280.8 4.7 

Leu 320.2 0.4 322.7 2.4 

Phe 324.6 12.5 360.7 1.7 

Trp 151.1 6.9 155.2 6.9 

a Media de la concentración en µg/L (referido a la mezcla prederivatización) 

3.3. ELECCIÓN DE LA DILUCIÓN ÓPTIMA DE LAS MUESTRAS 

Dada la elevada sensibilidad del método fue necesario diluir las muestras de 

vinagre. Con objeto de determinar la dilución óptima de las mismas se realizaron 

diferentes diluciones (5, 15, 25, 35 y 50%) tanto para sustrato vínico como vinagre 

(apartado 2.2.10 de “Materiales y Métodos”). 

Para este estudio se empleó un sustrato vínico con elevada acidez volátil (0.9º 

acético/100 mL), el cual se utilizó posteriormente como sustrato en la acetificación de 

las muestras de vinagre analizadas, y un vinagre de Jerez. 

El sustrato vínico contenía todos los aminoácidos menos la asparagina y 

glutamina; y el vinagre de Jerez además de éstos carecía de cisteína y metionina. 

Después de valorar las concentraciones de aminoácidos y amonio esperables en 

las muestras de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos compuestos en vino y en 

vinagre, se optó por una dilución del 25%, la cual permitirá cuantificar los aminoácidos 

y el amonio tanto en sustratos vínicos como en vinagres. Además comprobamos que las 

diluciones ensayadas mostraron una adecuada linealidad (Tabla 3.6) obteniéndose unos 

coeficientes de correlación aceptables. 

53


Tabla 3.6. Linealidad de las muestras diluidas 

Compuestos Intervalo 

de dilución 

Vino picado Vinagre de Jerez 

3.4. APLICACIÓN DEL MÉTODO A MUESTRAS DE VINAGRE 

Por último, tras la validación del método sólo queda aplicarlo a muestras reales y de características 

diferentes descritas en el apartado 2.1.1 de “Materiales y Métodos”. 

Al objeto de comprobar la validez del método y llevar a cabo un seguimiento de los aminoácidos durante 

los procesos de acetificación, se analizaron un total de 36 muestras de diferentes características. 

En el “Anexo” (Tablas de la 1 a la 12) aparecen los valores medios obtenidos en las muestras para cada 

aminoácido y amonio acompañados de sus desviaciones estándares. 

3.4.1. Consumo de nitrógeno total 

El consumo de nitrógeno total en los procesos de acetificación estudiados fue 

evaluado considerando conjuntamente el nitrógeno aportado por los aminoácidos libres 

y el procedente del amonio. 

r 2 

Intervalo 

de dilución 

Asp 25-50 % 0.991 5-50% 0.999 

Asn n.d. n.d. n.d. n.d. 

Ser 15-50% 0.990 5-50% 0.981 

Glu 15-50% 0.943 5-50% 0.999 

His 15-50% 0.874 5-50% 0.994 

Gln n.d. n.d. n.d. n.d. 

Gly 15-50% 0.987 5-50% 0.985 

Arg 15-5% 0.934 5-50% 0.999 

NH4 + 

25-50% 0.877 5-50% 0.809 

Thr 15-50% 0.920 5-50% 0.987 

Ala 15-50% 0.962 5-50% 0.998 

Pro 15-50% 0.933 5-50% 0.999 

GABA 15-50% 0.932 5-50% 0.999 

Cys 15-50% 0.993 n.d. n.d. 

Tyr 15-50% 0.934 5-50% 0.993 

Val 15-50% 0.950 5-50% 0.990 

Met 15-50% 0.983 n.d. n.d. 

Orn 15-50% 0.950 5-50% 0.998 

Lys 15-35% 1.000 5-50% 0.994 

Ileu 15-50% 0.994 5-50% 0.993 

Leu 15-50% 0.992 5-50% 0.999 

Phe 15-50% 0.996 15-50% 0.996 

Trp n.d. n.d. 15-50% 0.998 

r 2 

54


Al inicio de la fermentación las muestras del sustrato F tenían una cantidad de 

nitrógeno entre 84.7 y 120.2 mg/L, y las del sustrato T entre 174.1 y 196.5 mg/L. El 

descenso total del contenido de nitrógeno en todas las acetificaciones estudiadas oscila 

entre 7.3-52%. Las acetificaciones duraron 5-9 meses para las muestras del sustrato T y 

1.5-2.5 meses para las del F, comenzando, ambas, en el mes de Agosto. Las primeras se 

llevaron a cabo en bodega y las del sustrato F al aire libre. En el caso del sustrato T, 

coincide el menor consumo con el periodo de tiempo de acetificación más corto (5 

meses) y parece existir una relación entre consumo de nitrógeno y tiempo invertido en 

la acetificación. 

Comparando 4 acetificaciones en las muestras del sustrato F (Figura 3.2), los 

descensos oscilaban entre 17.3-33.2%. 

N (mg/L) 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

0 

A B C D 

Figura 3.2. Descenso del contenido de nitrógeno en las muestras del sustrato F 

En las muestras del sustrato T (Figura 3.3) los descensos oscilaron entre 20- 

52.0%. Todas las acetificaciones de este sustrato mostraron descensos mayores a los 

obtenidos en el sustrato F, probablemente debido a la mayor duración del proceso de 

acetificación en el sustrato T que conlleva un mayor requerimiento de nitrógeno por 

parte de las bacterias acéticas. 

N (mg/L) 

250 

200 

150 

100 

50 

0 

A B C D 

Figura 3.3. Descenso del contenido de nitrógeno en las muestras de Tarragona 

I 

F 

I 

F 

55


Comparando los dos sustratos, F y T, se observa que los descensos menores se 

producen en el mismo sistema de acetificación (CL). 

Por otro lado, en el sustrato F también se compararon las acetificaciones “CK”, 

“CL” y “CM” (Figura 3.4) siendo la acetificación “CK” la que presentó un mayor 

descenso seguido por la “CM”. Se obtuvo un descenso mucho menor en la “CL”. 

Podríamos decir que “CK” y “CM” se asemejan más en cuanto al consumo de 

nitrógeno. 

N (mg/L) 

200 

150 

100 

50 

0 

CK CL CM 

Figura 3.4. Comparación de las acetificaciones “CK”, “CL” y “CM” en cuanto al descenso de 

nitrógeno en las muestras del sustrato F 

Para el sustrato T se estudiaron las acetificaciones “DK”, “DL” y “DM” 

(Figura 3.5) . En este caso “DK” y “DL” mostraron descensos elevados del orden del 

50% y por el contrario, el descenso de “DM” fue mucho menor, siendo, además, el 

menor de todos los obtenidos en todas las muestras analizadas, tanto las T como las F. 

Por tanto, como se puede observar, las acetificaciones se completan con 

consumos muy diferentes de nitrógeno total en las mismas condiciones ambientales. 

I 

E 

56

mg/L 

250 

200 

150 

100 

50 

0 


DK DL DM 

Figura 3.5. Comparación de las acetificaciones “DK”, “DL” y “DM” en cuanto al descenso de 

nitrógeno en las muestras del sustrato T 

Aplicando el tratamiento estadístico del análisis de la varianza (ANOVA) al 

cambio en el contenido total de nitrógeno se demostró que todos los descensos 

observados resultaron ser estadísticamente significativos. 

3.4.2. Evolución en el perfil de aminoácidos libres y amonio 

En todas las muestras iniciales (F y T) el aminoácido mayoritario fue la prolina, seguido de la arginina, 

coincidiendo con lo observado por otros autores (Herbert et al., 2000; Soufleros et al., 2003; Hernández-Orte et al., 

2003). Estos altos contenidos de prolina al inicio de la fermentación acética se deben a la dificultad con la que las 

levaduras metabolizan este aminoácido durante la fermentación alcohólica, por lo que las cantidades de prolina en los 

vinos son similares a la de los correspondientes mostos (Hernández-Orte et al., 2003). 

La prolina aportó en las muestras del sustrato F un 34.7% del contenido de nitrógeno inicial y en las del 

sustrato T un 49.9% y la arginina aportó un 20% en las muestras F y un 14% en las T (Figura 3.8). Por otro lado, en 

ninguna de las muestras se detectó la asparagina, glutamina, cisteína y triptófano, coincidiendo este último con lo 

descrito en la bibliografía (Llaguno y Polo, 1991b; Valero et al. 2005). Según lo observado por Hernández-Orte et 

al., (2003), durante la fermentación alcohólica de los vinos el nivel de aminoácidos decrece, llegando en algunos 

casos, como la cisteína, a consumirse totalmente. 

Durante la fermentación se produjeron modificaciones en el contenido de 

aminoácidos y amonio, dándose descensos importantes y en otros ligeros aumentos. De 

forma general, se observaron descensos estadísticamente significativos en la mayoría de 

los casos para: prolina, metionina, aspártico, amonio, glicina, arginina, isoleucina, 

tirosina y leucina. Los dos primeros, prolina y metionina, descendieron en todos las 

acetificaciones, siendo estos descensos estadísticamente significativos. En el caso del 

aspártico los descensos fueron estadísticamente significativos en 9 de las 12 

acetificaciones estudiadas. Por otro lado se constataron ligeros aumentos no 

significativos para la serina, histidina y glutámico. 

En todas las acetificaciones del sustrato F (Figura 3.6) se observaron descensos 

estadísticamente significativos en los siguientes compuestos: prolina (descenso medio: 

75%) y metionina (66%). También disminuyeron en la mayoría de los casos (siempre en 

las acetificaciones “AL” y “BL”): aspártico, gamma-aminobutírico, amonio, alanina, 

I 

F 

57


isoleucina y arginina. Por tanto, en las muestras del sustrato F el aminoácido que 

presenta el descenso más marcado es la prolina. 

Por otro lado, el ácido glutámico aumentó en todos las acetificaciones. También 

presentan tendencias al aumento en la mayoría de los casos la ornitina, valina, y 

fenilalanina. Estos aumentos no fueron estadísticamente significativos en ninguno de los 

casos. Para el resto de los aminoácidos no se puede indicar una tendencia clara en los 

procesos estudiados. 

mg/L 

300 

250 

200 

150 

100 

50 

0 

ASP 

SER 

GLU 

HIS 

GLY 

ARG 

THR 

ALA 

PRO 

GABA 

TYR 

VAL 

MET 

ORN 

LYS 

ILEU 

LEU 

PHE 

NH4 

Figura 3.6. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato F 

En todas las acetificaciones del sustrato T (Figura 3.7) se observaron descensos 

estadísticamente significativos en los mismos aminoácidos que en el sustrato anterior, 

prolina y metionina, y además en valina. También disminuyeron en la mayoría de los 

casos (siempre en las acetificaciones “AL”, “BL”, “DL” y “DK”) los aminoácidos 

leucina, tirosina, fenilalanina, alanina, aspártico, glicina, arginina, gammaaminobutírico 

e isoleucina, así como el amonio. Estos descensos producidos en los 4 

procesos de acetificación fueron estadísticamente significativos salvo para la glicina. 

Además, en este caso, la ornitina y lisina también disminuyeron en la mayoría de los 

casos y al presentar contenidos iniciales bajos se llegaron a valores no detectables. 

En cuanto al ácido glutámico aumentó en la mayoría de las acetificaciones 

(12.3%), aunque también de forma no significativa como en las muestras F, y 

únicamente la serina, histidina y treonina no demostraron una tendencia clara en los 

procesos estudiados. 

I 

F 

58

mg/L 

750 

700 

650 

600 

550 

500 

450 

400 

350 

300 

250 

200 

150 

100 

50 

0 

ASP 

SER 


GLU 

HIS 

GLY 

ARG 

THR 

ALA 

PRO 

GABA 

TYR 

VAL 

MET 

ORN 

LYS 

ILEU 

LEU 

PHE 

NH4 

Figura 3.7. Evolución de los aminoácidos y amonio en una muestra del sustrato T 

Comparando la evolución de los aminoácidos y amonio en los dos tipos de 

muestras (F y T) podemos observar que muchos de ellos presentan la misma tendencia 

como el aspártico, prolina, gamma-aminobutírico, metionina, isoleucina, arginina, 

alanina, amonio (descienden) y glutámico (aumenta). 

Por otro lado, encontramos algunos aminoácidos con evoluciones diferentes 

como la leucina, fenilalanina, valina y glicina (en las muestras F no presentan una 

tendencia clara y en las T descienden mayoritariamente). 

En resumen, de todos los compuestos estudiados el que presenta el mayor 

descenso en todas las acetificaciones es la prolina. Si nos fijamos en el aporte de 

nitrógeno de cada aminoácido el de mayor consumo, en ambos casos, sigue siendo la 

prolina, observándose descensos del orden de 24.76 mg N/L en las muestras F y 43.4 

mg N/L en las muestras T. Esta tendencia es contraria a la observada por otros autores 

(Valero et al., 2005) en cultivos sumergidos, donde la leucina es el aminoácido más 

consumido por las bacterias acéticas. En nuestro caso la leucina ocupó el séptimo y el 

noveno lugar en el orden de preferencia de las bacterias acéticas en las muestras F y T 

respectivamente (Figura 3.8 y 3.9). 

I 

F 

59

Consumo del resto de aminoácidos y amonio (mg N/L) 

Consumo del resto de aminoácidos (mg N/L) 

1,8 

1,6 

1,4 

1,2 

1,0 

0,8 

0,6 

0,4 

0,2 

ASP 

GLY 

ARG 

THR 

ALA 


NH4 

GABA 

MET 

ILEU 

LEU 

PRO 

28 

24 

20 

16 

12 

8 

4 

0 

Consumo de Prolina (mg N/L) 

Escala Izquierda 

Escala Derecha 

Figura 3.8. Consumo de aminoácidos y amonio en función de la concentración de nitrógeno 

aportado en las muestras F . 

5,0 

4,5 

4,0 

3,5 

3,0 

2,5 

2,0 

1,5 

1,0 

0,5 

ASP 

GLY 

ARG 

THR 

ALA 

GABA 

TYR 

VAL 

MET 

ORN 

LYS 

ILEU 

LEU 

PHE 

NH4 

PRO 

50 

40 

30 

20 

10 

0 

Consumo de Prolina y amonio (mg N/L) 

Escala Izquierda 

Escala Derecha 

Figura 3.9. Consumo de aminoácidos y amonio en función de la concentración de nitrógeno 

aportado en las muestras T. 

60


En los vinagres finales obtenidos el aminoácido mayoritario sigue siendo la 

prolina, pero ahora supone un 17% del total de aminoácidos frente al 45% que 

representaba en el sustrato de partida en las muestras F y un 57% frente al 62% inicial 

en las muestras T. Según lo descrito en la bibliografía (Valero et al., 2005; Palacios et 

al., 2002; Erbe y Brüeckner, 1998; Llaguno y Polo, 1991b) en todos los vinagres de 

vino la prolina es el aminoácido mayoritario, pudiéndose considerar la presencia de éste 

en el vinagre como un indicador de su procedencia vínica. 

A pesar de los cambios experimentados durante la acetificación el orden de 

abundancia del resto de aminoácidos se mantiene prácticamente igual al sustrato de 

partida tanto en las muestras F como en las T. 

61

Conclusiones 

4. CONCLUSIONES 

1. Se ha adaptado y validado un método para la determinación de aminoácidos en 

vinagres de vino y vino en proceso de acetificación mediante Cromatografía de 

Líquidos empleando el agente 6-aminoquinolil-N-hidrosicuccinimidil carbamato 

(AQC), obteniéndose los siguientes resultados: 

- En cuanto a la selectividad, la resolución de los picos cromatográficos 

fue superior a 1.5 para la mayoría de aminoácidos. 

- Se obtuvo una adecuada linealidad con unos coeficientes de correlación 

superiores a 0.992. 

- El método demostró tener una alta sensibilidad, con unos límites de 

detección entre 0.20 (Ala) - 45.73 (Arg) µg/L y unos límites de 

cuantificación entre 2.11 (Thr) - 70.05 (His) µg/L, excepto para el caso 

del triptófano, el cual tuvo unos límites superiores (LDD: 110.37 µg/L y 

LDC: 280.75 µg/L). 

- Las recuperaciones fueron superiores al 80% para todos los aminoácidos 

excepto para serina y cisteína. 

- La precisión fue evaluada a dos niveles: repetitividad y precisión 

intermedia. Estos niveles se determinaron tanto para el método analítico 

como para el proceso de derivatización, obteniéndose en ambos casos 

unos coeficientes de variación acordes con los propuestos por el manual 

AOAC. 

2. Dada la alta sensibilidad del método es necesario diluir las muestras. Después de 

valorar las concentraciones de aminoácidos y amonio esperables en las muestras 

tanto de vino como de vinagre y los intervalos de linealidad de dichos 

compuestos, se optó por una dilución del 25%. 

3. Se han estudiado una serie de acetificaciones con cultivo superficial en madera, 

y en ellos se observaron descensos estadísticamente significativos del nitrógeno 

total. 

4. En todas las muestras estudiadas, vinos y vinagres, el aminoácido más 

abundante es la prolina seguido de la arginina; no detectándose, por el contrario 

la asparagina, glutamina, cisteína y triptófano. De todos los compuestos 

estudiados el que las bacterias acéticas utilizan en mayor extensión es la prolina. 

62

Conclusiones 

5. Durante la acetificación con cultivo superficial se observaron en la mayoría de 

los casos descensos estadísticamente significativos para: prolina, metionina, 

aspártico, amonio, glicina, arginina, isoleucina, tirosina, y leucina. Los dos 

primeros, prolina y metionina, mostraron descensos estadísticamente 

significativos en todos las acetificaciones. 

6. Ciertos aminoácidos como la leucina, fenilalanina, valina y glicina presentan 

evoluciones diferentes, ya que en las muestras F no presentan una tendencia 

clara y en las T descienden mayoritariamente. 

7. Los cambios en la concentración de aminoácidos y amonio a lo largo de la 

acetificación no suponen una alteración en el orden de abundancia de los 

mismos en los dos tipos de sustratos. 

63

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69

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70

. 

Anexo 

Tabla 1. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación AL del sustrato F 

Asp 31.705 a 

Muestras de Vinagre 

FALi FALm FALf 

mg/L DE mg/L DE mg/L DE 

0.005 25.505 0.07 18.453 b 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 14.414 a 

0.005 

0.022 32.083 0.024 7.123 a 0.006 

Glu 39.410 a 0.003 41.288 0.001 40.341 a 0.001 

His 14.331 a 0.011 18.358 0.013 14.034 a 0.002 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 18.506 a 0.019 23.196 0.019 13.833 a 0.009 

Arg 61.062 a 0.002 55.821 0.012 53.458 b 0.006 

NH4 + 

11.186 a 0.085 6.499 0.065 10.612 a 0.110 

Thr 12.758 a 0.005 14.267 0.005 10.533 a 0.004 

Ala 32.923 a 0.010 31.355 0.000 26.912 a 0.018 

Pro 291.142 a 0.006 106.074 0.009 93.971 b 0.000 

GABA 11.457 a 0.001 9.249 0.003 8.796 a 0.001 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 14.580 a 0.002 20.756 0.005 12.361 b 0.001 

Val 17.570 a 0.008 20.821 0.007 9.149 b 0.006 

Met 2.138 a 0.000 0.936 0.001 0.548 b 0.000 

Orn 5.864 a 0.007 13.187 0.026 6.675 a 0.000 

Lys 25.676 a 0.002 28.113 0.000 24.770 a 0.002 

Ileu 6.164 a 0.004 7.132 0.005 5.009 b 0.003 

Leu 19.019 a 0.005 16.802 0.002 14.472 b 0.010 

Phe 17.952 a 0.007 16.826 0.008 14.826 b 0.013 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 

a, b Superíndices diferentes en la misma fila indican diferencias 

significativas de acuerdo con el análisis de la varianza (ANOVA). 

DE: Desviación estándar. n.d.: no detectado. 

71

Anexo 

Tabla 2. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación BL del sustrato F 

Compuestos 


FBLi FBLm FBLf 


Asp 20.420 a 0.006 18.040 0.001 17.511 a 0.005 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 0.185 a 0.000 10.619 0.012 18.011 a 0.031 

Glu 28.116 a 0.008 45.892 0.004 50.790 b 0.002 

His 16.039 a 0.008 12.512 0.004 17.823 a 0.010 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 14.480 a 0.000 14.879 0.006 16.323 a 0.026 

Arg 60.948 a 0.031 52.284 0.002 53.439 a 0.005 

NH4 + 

13.793 a 0.092 3.041 0.084 8.973 a 0.045 

Thr 9.966 a 0.001 10.678 0.002 11.182 a 0.005 

Ala 33.442 a 0.006 26.546 0.007 27.458 a 0.020 

Pro 255.196 a 0.043 95.429 0.004 68.596 b 0.000 

GABA 14.201 a 0.000 9.353 0.001 11.334 a 0.024 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 10.873 a 0.000 13.845 0.001 13.470 a 0.010 

Val 9.035 a 0.000 8.895 0.002 11.876 a 

0.021 

Met 1.726 a 0.000 0.619 0.000 0.544 b 0.001 

Orn 3.346 a 0.003 3.971 0.001 6.915 a 0.016 

Lys 26.602 a 0.006 24.768 0.001 25.337 a 0.000 

Ileu 6.197 a 0.009 5.479 0.001 5.071 a 0.011 

Leu 14.914 a 0.005 14.720 0.006 15.088 a 0.008 

Phe 14.211 a 0.002 14.303 0.004 15.856 a 0.017 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




72

Anexo 

Tabla 3. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CK del sustrato F 

Compuestos 


FCKi FCKm FCKf 


Asp 31.131 a 0.004 21.251 0.005 11.515 b 0.001 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 7.462 a 0.012 3.067 0.005 7.018 a 0.006 

Glu 57.938 a 0.001 43.779 0.003 32.631 b 0.005 

His 14.526 a 0.004 16.590 0.006 15.248 a 0.007 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 18.322 a 0.016 20.684 0.013 13.984 a 0.001 

Arg 66.751 a 0.001 58.193 0.002 51.327 b 0.002 

NH4 + 

26.605 a 0.001 10.105 0.005 3.933 b 0.023 

Thr 13.030 a 0.003 11.235 0.000 12.627 a 0.001 

Ala 30.533 a 0.004 32.431 0.012 21.793 b 0.006 

Pro 308.428 a 0.000 129.703 0.003 76.723 b 0.007 

GABA 15.884 a 0.003 9.130 0.009 7.872 b 0.001 

Cys n.d. .- n.d. -. n.d - 

Tyr 19.493 a 0.003 16.435 0.005 15.420 a 0.004 

Val 16.963 a 0.000 8.722 0.005 16.754 a 0.015 

Met 2.115 a 0.001 0.688 0.001 0.400 b 0.000 

Orn 4.824 a 0.004 4.103 0.004 4.667 a 0.004 

Lys 28.904 a 0.008 27.071 0.002 27.387 a 0.001 

Ileu 7.168 a 0.002 6.167 0.000 5.44 b 0.002 

Leu 20.219 a 0.001 16.507 0.003 14.387 b 0.003 

Phe 19.754 a 0.002 16.00 0.004 15.359 b 0.002 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




73

Anexo 

Tabla 4. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CL del sustrato F 

Compuestos 


FCLi FCLm FCLf 


Asp 23.048 a 0.006 30.061 0.001 17.526 a 0.007 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 7.793 a 0.048 13.200 0.022 23.295 a 0.026 

Glu 28.131 a 0.011 46.165 0.008 42.135 b 0.006 

His 10.679 a 0.031 13.937 0.002 17.289 a 0.007 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 18.128 a 0.045 17.253 0.012 19.007 a 0.014 

Arg 54.858 a 0.002 58.911 0.000 55.428 a 0.004 

NH4 + 

4.457 a 0.107 10.354 0.0222 10.245 a 0.034 

Thr 11.722 a 0.012 14.290 0.007 12.706 a 0.005 

Ala 24.496 a 0.029 25.195 0.030 29.126 a 0.008 

Pro 267.840 a 0.012 135.289 0.002 43.500 b 0.010 

GABA 12.807 a 0.003 4.858 0.002 9.207 b 0.003 

Cys n.d - n.d. - n.d. - 

Tyr 11.966 a 0.003 20.093 0.002 16.372 b 0.003 

Val 13.260 a 0.010 16.613 0.010 18.932 b 0.003 

Met 1.864 a 0.001 0.413 0.001 0.700 b 0.000 

Orn 5.624 a 0.016 6.945 0.003 10.170 a 0.012 

Lys 22.475 a 0.002 29.124 0.003 24.974 b 0.002 

Ileu 4.656 a 0.004 6.263 0.007 6.084 b 0.005 

Leu 15.953 a 0.011 16.016 0.006 16.550 a 

0.010 

Phe 14.751 a 0.000 16.289 0.015 17.483 b 0.014 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




74

Anexo 

Tabla 5. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CM del sustrato F 

Compuestos 


FCMi FCMm FCMf 


Asp 34.247 a 0.010 19.278 0.006 14.550 b 0.001 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 20.107 a 0.084 13.711 0.012 13.325 a 0.008 

Glu 55.358 a 0.010 48.535 0.001 37.503 b 0.004 

His 19.543 a 0.039 13.996 0.005 14.478 a 0.002 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 21.538 a 0.020 15.920 0.006 16.024 b 0.001 

Arg 68.109 a 0.022 51.877 0.003 54.681 b 0.002 

NH4 + 

27.453 a 0.232 1.616 0.013 12.754 a 0.010 

Thr 14.308 a 0.021 10.496 0.001 11.957 a 0.004 

Ala 29.555 a 0.001 27.866 0.002 27.222 b 0.003 

Pro 295.392 a 0.151 109.143 0.004 75.687 b 0.017 

GABA 15.275 a 0.034 9.684 0.004 7.560 a 0.015 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 18.329 a 0.004 16.771 0.002 15.234 a 0.011 

Val 16.920 a 0.000 8.093 0.005 8.294 b 0.005 

Met 1.359 a 0.001 0.630 0.000 0.538 b 0.000 

Orn 6.565 a 0.008 5.626 0.002 4.648 a 0.004 

Lys 28.522 a 0.003 24.860 0.001 26.388 a 0.002 

Ileu 7.144 a 0.005 5.212 0.008 5.092 b 0.001 

Leu 19.307 a 0.187 14.672 0.004 14.596 a 0.019 

Phe 18.376 a 0.018 14.492 0.009 14.857 a 0.014 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




75

Anexo 

Tabla 6. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DL del sustrato F 

Compuestos 


FDLi FDLm FDLf 


Asp 35.109 a 0.003 15.363 0.006 21.423 b 0.007 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 24.576 a 0.008 8.935 0.010 17.948 a 0.026 

Glu 44.096 a 0.004 46.734 0.010 48.882 a 0.011 

His 18.373 a 0.004 14.342 0.003 16.089 a 0.010 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 21.926 a 0.013 14.936 0.008 16.581 a 0.021 

Arg 60.534 a 0.039 53.728 0.006 55.312 a 0.013 

NH4 + 

12.993 a 0.126 0.467 0.015 10.381 a 0.158 

Thr 14.098 a 0.005 12.091 0.004 12.345 a 0.005 

Ala 34.005 a 0.002 27.077 0.006 28.665 a 0.035 

Pro 277.259 a 0.089 116.911 0.011 70.918 b 0.009 

GABA 4.276 a 0.047 10.152 0.002 9.058 a 0.025 

Cys n.d. - n.d. n.d. - 

Tyr 18.484 a 0.001 13.197 0.003 17.544 a 0.017 

Val 9.205 a 0.002 18.435 0.008 15.132 a 0.087 

Met 1.494 a 0.001 0.742 0.000 0.624 b 0.001 

Orn 7.794 a 0.011 3.736 0.003 6.292 a 0.009 

Lys 25.744 a 0.005 25.189 0.004 28.442 a 0.003 

Ileu 6.544 a 0.004 5.696 0.001 6.009 a 0.006 

Leu 17.600 a 0.017 15.849 0.010 15.611 a 0.017 

Phe 16.041 a 0.023 15.666 0.004 16.239 a 0.028 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




76

Anexo 

Tabla 7. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación AL del sustrato T 

Compuestos 


TALi TALm TALf 


Asp 31.030 a 0.004 27.470 0.007 25.415 b 0.001 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 9.631 a 0.000 14.840 0.005 16.498 a 0.020 

Glu 49.670 a 0.009 69.961 0.003 54.763 a 0.000 

His n.d. a - 0.730 0.001 2.698 b 0.003 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 25.869 a 0.005 27.818 0.007 21.231 a 0.022 

Arg 79.238 a 0.002 90.209 0.002 70.799 b 0.001 

NH4 + 

24.501 a 0.025 12.218 0.009 10.838 b 0.111 

Thr 12.087 a 0.003 17.073 0.004 13.558 a 0.006 

Ala 54.073 a 0.008 56.284 0.001 41.633 b 0.015 

Pro 728.950 a 0.053 637.734 0.006 394.449 b 0.003 

GABA 24.790 a 0.001 31.422 0.002 23.826 a 0.009 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 11.417 a 0.001 13.219 0.003 0.931 b 0.000 

Val 20.441 a 0.007 30.847 0.003 2.983 b 0.003 

Met 1.355 a 0.000 0.594 0.000 0.109 b 0.000 

Orn 11.218 a 0.002 12.323 0.003 n.d. b - 

Lys 22.446 a 0.001 30.876 0.003 6.898 b 0.004 

Ileu 8.081 a 0.001 8.356 0.003 5.029 b 0.006 

Leu 16.418 a 0.006 18.080 0.003 2.914 b 0.009 

Phe 18.584 a 0.007 17.521 0.015 8.628 b 0.002 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




77

Anexo 

Tabla 8. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación BL del sustrato T 

Compuestos 


TBLi TBLm TBLf 


Asp 33.015 a 0.009 30.394± 0.003 22.775 b 0.000 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 19.481 a 0.003 26.047 0.001 13.364 b 0.008 

Glu 45.175 a 0.004 63.250 0.001 45.655 a 0.001 

His 7.051 a 0.001 2.030 0.002 0.897 b 0.001 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 28.568 a 0.005 24.056 0.011 20.705 b 0.015 

Arg 82.489 a 0.012 85.936 0.009 60.430 b 0.004 

NH4 + 

24.443 a 0.074 14.494 0.018 7.537 b 0.036 

Thr 16.496 a 0.004 14.301 0.004 11.663 b 0.006 

Ala 55.540 a 0.018 53.924 0.028 31.300 b 0.015 

Pro 742.528 a 0.005 607.089 0.014 388.140 b 0.004 

GABA 25.932 a 0.001 27.679 0.000 22.770 b 0.000 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 12.432 a 0.000 11.214 0.002 1.554 b 0.000 

Val 22.184 a 0.006 29.129 0.018 2.570 b 0.001 

Met 1.527 a 0.000 0.432 0.000 0.801 b 0.000 

Orn 13.107 a 0.005 9.254 0.003 n.d. b - 

Lys 24.822 a 0.002 27.764 0.007 n.d. b - 

Ileu 6.454 a 0.000 7.089 0.004 3.381 b 0.002 

Leu 15.731 a 0.004 17.377 0.016 2.141 b 0.000 

Phe 14.668 a 0.006 15.649 0.012 7.610 b 0.002 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




78

Anexo 

Tabla 9. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación CL del sustrato T 

Compuestos 


TCLi TCLm TCLf 


Asp 33.036 a 0.005 28.329 0.002 25.747 b 0.002 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 4.8780 a 0.016 14.844 0.001 16.339 a 0.009 

Glu 49.660 a 0.009 66.814 0.008 62.289 a 0.000 

His n.d. a - 6.539 0.001 4.429 b 0.009 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 29.385 a 0.048 25.358 0.001 24.734 a 0.006 

Arg 88.670 a 0.014 87.641 0.011 83.155 a 0.001 

NH4 + 

30.982 a 0.207 27.347 0.015 33.286 a 0.131 

Thr 14.638 a 0.019 16.673 0.005 16.130 a 0.004 

Ala 59.597 a 0.023 53.351 0.005 49.970 b 0.003 

Pro 819.126 a 0.021 571.705 0.021 479.010 b 0.012 

GABA 29.373 a 0.010 32.894 0.004 31.798 a 0.009 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 14.070 a 0.011 14.446 0.001 12.945 a 0.001 

Val 23.190 a 0.005 19.809 0.003 18.819 b 0.007 

Met 1.834 a 0.001 0.348 0.000 0.191 b 0.000 

Orn 10.813 a 0.003 13.057 0.001 12.107 a 0.001 

Lys 26.074 a 0.003 34.846 0.007 30.860 b 0.001 

Ileu 7.457 a 0.025 9.473 0.003 8.107 a 0.001 

Leu 17.694 a 0.032 18.176 0.001 16.258 a 0.001 

Phe 17.632 a 0.050 17.433 0.009 15.977 a 0.006 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




79

Anexo 

Tabla 10. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DK del sustrato T 

Compuestos 


TDKi TDKm TDKf 


Asp 34.046 a 0.002 27.056 0.001 17.381 b 0.002 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 15.141 a 0.003 15.209 0.004 27.169 b 0.008 

Glu 48.415 a 0.003 65.308 0.001 50.691 a 0.010 

His 0.347 a 0.001 1.760 0.001 3.330 b 0.001 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 30.413 a 0.018 26.557 0.008 18.860 b 0.007 

Arg 81.165 a 0.002 85.273 0.001 60.694 b 0.008 

NH4 + 

40.053 a 0.009 18.948 0.078 15.076 b 0.081 

Thr 15.013 a 0.006 16.410 0.004 11.479 b 0.004 

Ala 55.681 a 0.027 53.389 0.002 29.853 b 0.003 

Pro 752.184 a 0.015 598.532 0.008 338.283 b 0.010 

GABA 26.218 a 0.003 33.611 0.002 24.119 b 0.005 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 12.042 a 0.006 12.394 0.000 1.762 b 0.000 

Val 22.473 a 0.009 19.967 0.008 2.228 b 0.001 

Met 1.641 a 0.001 0.297 0.000 0.889 b 0.000 

Orn 15.462 a 0.002 12.411 0.003 n.d. b - 

Lys 24.722 a 0.004 31.618 0.001 n.d. b - 

Ileu 15.283 a 0.005 7.941 0.003 3.407 b 0.002 

Leu 16.446 a 0.004 16.086 0.000 1.974 b 0.000 

Phe 15.491 a 0.003 16.128 0.002 8.018 b 0.006 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




80

Anexo 

Tabla 11. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DL del sustrato T 

Compuestos 


TDLi TDLm TDLf 


Asp 32.034 a 0.005 26.178 0.000 23.099 b 0.004 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 20.367 a 0.007 16.137 0.001 19.125 a 0.004 

Glu 54.366 a 0.007 66.096 0.002 50.498 a 0.004 

His 1.062 a 0.002 n.d. - 0.773 a 0.002 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 31.229 a 0.004 25.666 0.013 19.559 b 0.012 

Arg 82.325 a 0.007 84.161 0.000 60.229 b 0.004 

NH4 + 

29.494 a 0.016 12.537 0.021 5.400 b 0.026 

Thr 14.941 a 0.003 16.033 0.003 12.777 b 0.001 

Ala 59.555 a 0.010 53.548 0.008 29.828 b 0.003 

Pro 756.355 a 0.023 603.600 0.016 357.264 b 0.020 

GABA 26.839 a 0.005 34.518 0.003 25.457 a 0.001 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 11.472 a 0.000 12.451 0.007 1.799 b 0.000 

Val 22.444 a 0.014 19.325 0.005 2.519 b 0.000 

Met 1.522 a 0.000 0.308 0.000 0.681 b 0.000 

Orn 17.227 a 0.003 10.043 0.000 n.d. b - 

Lys 25.292 a 0.005 29.249 0.007 n.d. b - 

Ileu 6.893 a 0.005 7.690 0.002 3.584 b 0.001 

Leu 16.111 a 0.002 15.866 0.003 2.203 b 0.001 

Phe 14.710 a 0.010 15.712 0.001 7.518 b 0.007 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




81

Anexo 

Tabla 12. Determinación de aminoácidos y amonio en la acetificación DM del sustrato T 

Compuestos 


TDMi TDMm TDMf 


Asp 26.645 a 0.000 23.700 0.001 31.105 a 0.006 

Asn n.d. - n.d. - n.d. - 

Ser 13.365 a 0.001 10.999 0.001 25.451 b 0.004 

Glu 38.728 a 0.001 59.270 0.005 70.921 b 0.001 

His n.d. - n.d. - 3.035 b 0.003 

Gln n.d. - n.d. - n.d. - 

Gly 20.938 a 0.009 23.186 0.001 29.430 b 0.022 

Arg 59.825 a 0.002 77.415 0.003 83.153 b 0.007 

NH4 + 

75.913 a 0.037 38.912 0.060 33.363 b 0.055 

Thr 13.244 a 0.003 14.414 0.000 17.827 b 0.004 

Ala 41.816 a 0.001 48.959 0.003 54.240 b 0.004 

Pro 552.473 a 0.006 550.465 0.005 489.257 b 0.000 

GABA 22.115 a 0.005 31.632 0.001 34.389 b 0.002 

Cys n.d. - n.d. - n.d. - 

Tyr 8.002 a 0.000 11.289 0.001 12.912 b 0.004 

Val 9.623 a 0.001 16.983 0.001 29.740 b 0.000 

Met 14.522 a 0.003 0.950 0.000 0.145 b 0.000 

Orn 6.925 a 0.000 10.224 0.000 17.252 b 0.007 

Lys 13.837 a 0.004 26.563 0.001 31.713 b 0.002 

Ileu 3.461 a 0.003 6.968 0.000 8.619 b 0.003 

Leu 11.803 a 0.002 14.438 0.000 16.377 b 0.013 

Phe 11.113 a 0.001 14.635 0.001 16.063 b 0.020 

Trp n.d. - n.d. - n.d. - 




82

R. Callejón

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