kit hydragel if k20 - Sebia

HYDRAGEL IF K20
Ref. 3031
Ref. 3220*
Masque standard / Standard mask
2005/03

UTILISATION
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Le kit HYDRAGEL IF K20 permet la détection des protéines monoclonales dans le sérum humain, par électrophorèse sur gel d’agarose. Les protéines
sont séparées en tampon alcalin (pH 9,1) puis immunoprécipitées par les antisérums des différentes spécificités : anti-chaînes lourdes gamma (Ig G),
alpha (Ig A), et mu (Ig M) et anti-chaînes légères kappa et lambda (libres et liées). Après immunofixation, les protéines sont colorées par une solution
de violet acide. L’excès de colorant est éliminé en milieu acide.
Chaque gel d’agarose contenu dans les kits HYDRAGEL IF K20 est prévu pour l’analyse d’un seul échantillon. Les kits sont proposés au choix avec
ou sans antisérums et avec ou sans colorant violet acide.
À usage in vitro exclusivement.
PRINCIPE DU TEST
Les immunoglobulines monoclonales, marqueurs des gammapathies, sont détectées lors de l’électrophorèse des protéines. Elles se présentent sous
forme de bandes anormales situées essentiellement dans les zones bêta ou gamma globulines. L’immunofixation effectuée à l’aide d’antisérums
monospécifiques permet l’identification des bandes monoclonales dépistées par électrophorèse.
Elle se réalise en quatre étapes :
1. Séparation électrophorétique des protéines en gel d’agarose.
2. Fixation et immunoprécipitation des protéines séparées par électrophorèse : application du fixateur et des antisérums sur le gel, au niveau des
pistes de migration. Le fixateur et les antisérums diffusent dans le gel. Le fixateur précipite toutes les protéines et les anticorps précipitent les
antigènes correspondants.
3. Élimination des protéines non précipitées par pompage et lavage. Les protéines précipitées restent piégées dans le gel.
4. Coloration des protéines et comparaison de la position des bandes immunoprécipitées avec celle des bandes anormales observées après
électrophorèse des protéines.
Pour identifier de façon précise la nature de la bande monoclonale, l’échantillon est testé sur six pistes. Après électrophorèse, une piste (ELP) sert de
référence grâce à la précipitation de toutes les protéines présentes ; les cinq autres pistes permettent de caractériser la ou les bandes monoclonales à
l’aide des anticorps spécifiques anti-chaînes lourdes gamma (Ig G), alpha (Ig A) et mu (Ig M) et anti-chaînes légères kappa et lambda (libres et liées).
Cette technique simple et rapide donne une image claire et très facilement interprétable.
RÉACTIFS FOURNIS DANS LES KITS HYDRAGEL IF K20
| COMPOSANTS | RÉF. N° 3031 | RÉF. N° 3220* |
| Gels d’agarose (prêts à l’emploi) | 10 gels | 100 gels |
| Tampon Tris-Barbital (solution concentrée) | 3 fl. de 75 mL | 30 fl. de 75 mL |
| Colorant violet acide (solution concentrée) | 1 fl. de 75 mL | 3 fl. de 75 mL |
| Décolorant (solution concentrée) | 1 fl. de 100 mL | 1 fl. de 100 mL |
| Diluant (prêt à l’emploi) | 1 fl. de 3,2 mL | 1 fl. de 32 mL |
| Fixateur (prêt à l’emploi) | | 1 fl. de 14,4 mL |
| Immunoglobulines totales de mammifère | | |
| anti-chaînes lourdes gamma (prêtes à l’emploi) | | 1 fl. de 2,5 mL |
| Immunoglobulines totales de mammifère | | |
| anti-chaînes lourdes alpha (prêtes à l’emploi) | | 1 fl. de 2,5 mL |
| Immunoglobulines totales de mammifère | | |
| anti-chaînes lourdes mu (prêtes à l’emploi) | | 1 fl. de 2,5 mL |
| Immunoglobulines totales de mammifère anti-chaînes | | |
| légères kappa (libres et liées)(prêtes à l’emploi) | | 1 fl. de 2,5 mL |
| Immunoglobulines totales de mammifère anti-chaînes | | |
| légères lambda (libres et liées) (prêtes à l’emploi) | | 1 fl. de 2,5 mL |
| Applicateurs 6 dents (prêts à l’emploi) | 1 boîte de 10 | 10 boîtes de 10 |
| Papiers-filtres fins | 1 sachet de 10 | 10 sachets de 10 |
| Peignes de papier-filtre | 1 sachet de 10 | 10 sachets de 10
| |
Papiers-filtres épais | 2 sachets de 10 | 20 sachets de 10 |
* HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
La quantité de tampon fournie dans le MAXI-KIT est destinée à deux migrations. Conserver le tampon pour deux gels.
NOTE : Le fixateur et les antisérums sont commercialisés séparément sauf pour le MAXI-KIT (voir RÉACTIFS NÉCESSAIRES NON FOURNIS).
POUR DES RÉSULTATS OPTIMUMS
Les éléments d’un même kit doivent être utilisés ensemble et selon les instructions de la notice.
LIRE ATTENTIVEMENT LA NOTICE D’UTILISATION.
1. GELS D’AGAROSE
Préparation
Les gels d’agarose sont prêts à l’emploi. Chaque gel contient : agarose, 8 g/L ; tampon tris-barbital, pH 9,1 ± 0,1 ; composants sans danger aux
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.
ATTENTION : Les gels contiennent 0,31 % de barbital et 0,34 % de barbital sodé. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter immédiatement
un médecin !
Utilisation
Support pour l’électrophorèse et l’immunofixation des protéines.
NOTICE D’UTILISATION SEBIA - Français

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les gels peuvent être conservés à température ambiante (de 15 à 30 °C) ou au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Ils sont stables jusqu’à la date
d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet du gel. Les gels doivent être conservés horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur
le devant du kit doit être pointée vers le haut). Ne pas stocker les gels à proximité d’une fenêtre ou d’une source de chaleur. Éviter toute variation
brutale de température.
NE PAS CONGELER.
Éliminer le gel dans les cas suivants :
(I) apparition de cristaux, de précipité en surface du gel ou texture du gel très molle (indiquant que le gel a gelé) ;
(II) apparition de bactéries ou de moisissures ;
(III) présence anormale de liquide dans la boîte du gel (indiquant une exsudation du gel liée à de mauvaises conditions de conservation).
2. TAMPON TRIS-BARBITAL
Préparation
Chaque flacon de tampon concentré doit être complété à 1 litre avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
Après dilution, la solution contient : tampon tris-barbital, pH 9,2 ± 0,3 ; azoture de sodium.
ATTENTION : Le tampon concentré contient 2,45 % de barbital, 13,73 % de barbital sodé et 0,13 % d’azoture de sodium. Ne pas avaler ! En
cas d’ingestion, consulter immédiatement un médecin ! L’azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas de
contact avec des acides, du plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des solutions, laver abondamment avec une grande quantité
d’eau.
Utilisation
Tampon d’électrophorèse.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le tampon concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable pendant plusieurs années et au minimum jusqu’à
la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de tampon.
Le tampon dilué est stable pendant un an à température ambiante en flacon fermé.
Éliminer le tampon dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.
3. COLORANT VIOLET ACIDE
Préparation
Le flacon de violet acide concentré doit être complété à 300 mL avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
Après dilution, la solution colorante contient : solution acide pH ≈ 2 ; violet acide, 2 g/L ; éthylène-glycol, 3,25 % ; composants sans danger aux
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.
ATTENTION : Nocif en cas d’ingestion.
Utilisation
Pour la coloration des gels après séparation électrophorétique et immunofixation des protéines.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les solutions de colorant concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés pour éviter
l’évaporation. La solution concentrée est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de colorant. La solution diluée
est stable pendant 6 mois.
4. DÉCOLORANT
Préparation
Le flacon de décolorant concentré doit être dilué au 1/1000 avec de l’eau distillée ou déminéralisée, il permet d'obtenir 100 litres de solution
décolorante.
Prélever par quantité de 1 mL et compléter à 1 litre avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
Après dilution, la solution décolorante contient : acide citrique, 0,5 g/L.
Utilisation
Pour la décoloration, c’est-à-dire l’élimination de l’excès de colorant après coloration du gel.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le décolorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou
sur l’étiquette du flacon de décolorant.
Le décolorant dilué est stable pendant 1 semaine à température ambiante, en flacon fermé.
Éliminer le décolorant dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.
Ne pas ajouter d'azoture de sodium.
En cas de conservation prolongée (au delà d’une semaine) de la solution diluée, ajouter 50 µL/L de ProClin 300 pour prévenir toute prolifération
microbienne.
Le décolorant dilué contenant du ProClin est stable en flacon fermé à température ambiante ou au réfrigérateur jusqu’à la date d’expiration indiquée
sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de décolorant.
5. DILUANT
Préparation
Le diluant est prêt à l’emploi. Il contient : tampon pH 7,5 ± 0,3 ; bleu de bromophénol ; composants sans danger aux concentrations utilisées,
nécessaires pour des perfomances optimales.
Utilisation
Pour la dilution des échantillons. Le bleu de bromophénol permet de vérifier la bonne application des échantillons et la qualité de la migration.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le diluant peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette
du flacon de diluant.
Il ne doit pas y avoir de précipité.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
6. ANTISÉRUMS (Réf. N° 3220)
Préparation
Les antisérums sont prêts à l’emploi. Ils contiennent des immunoglobulines totales de mammifère anti-humaines. Chaque réactif a une couleur
spécifique pour éviter toute erreur lors de l’utilisation. La couleur est rappelée sur les étiquettes des flacons (voir chapitre II. 6.).
Lorsque les antisérums présentent un léger trouble, il suffit généralement de mettre les flacons à température ambiante environ 10 minutes avant leur
utilisation. Ceci étant, si le trouble persiste, il ne perturbe en rien la réaction immunologique.
Utilisation
Pour l’immunoprécipitation des protéines séparées par électrophorèse.
NOTE : Les antisérums sont spécifiques à la technique d’immunofixation réalisée avec les masques 1 IF, SEBIA.
Les antisérums peuvent être d’origines animales différentes. Il est donc impératif de ne pas mélanger deux flacons différents d’antisérums, y compris
de la même spécificité, et de TOUJOURS changer l’embout de la pipette lors d’un changement de flacon.
IMPORTANT : Pour éviter toute contamination entre les différents réactifs, il est impératif de remettre chaque bouchon sur le flacon correspondant
après toute utilisation.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les antisérums doivent être conservés au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Ils sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur les
étiquettes des flacons d’antisérum.
Éliminer l’antisérum s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne.
NOTE : Durant le transport, les antisérums peuvent rester à température ambiante (entre 15 et 30 °C) pendant 15 jours sans que cela n’affecte la
qualité du test.
7. FIXATEUR (Réf. N° 3220)
Préparation
Le fixateur est prêt à l’emploi. Il contient : une solution acide et des composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des
performances optimales.
Il a une couleur spécifique pour éviter toute erreur lors de l’utilisation. La couleur est rappelée sur l’étiquette du flacon (voir chapitre II. 6.).
Utilisation
Pour la fixation des protéines séparées par électrophorèse sur la piste référence (ELP).
NOTE : Le fixateur est spécifique à la technique d’immunofixation réalisée avec les masques 1 IF, SEBIA.
IMPORTANT : Pour éviter toute contamination entre les différents réactifs, il est impératif de remettre chaque bouchon sur le flacon correspondant
après toute utilisation.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le fixateur peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette
du flacon de fixateur.
Il ne doit pas y avoir de précipité.
8. APPLICATEURS
Utilisation
Applicateurs prédécoupés, à usage unique pour le dépôt des échantillons.
Conservation
Les applicateurs doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.
9. PAPIERS-FILTRES FINS
Utilisation
Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons.
Conservation
Les papiers-filtres fins doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.
10. PEIGNES PAPIER-FILTRE
Utilisation
Feuilles de papier-filtre prédécoupées, à usage unique pour l’absorption de l’excès de réactifs à la surface du gel après l’étape d’immunofixation.
11. PAPIERS-FILTRES ÉPAIS
Utilisation
Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption des protéines non précipitées après l’étape d’immunofixation.
Conservation
Les papiers-filtres épais doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur.
RÉACTIFS NÉCESSAIRES NON FOURNIS
1. COFFRET D’ANTISÉRUMS ET DE FIXATEUR IF (pour les kits 3031)
Le coffret Antisérums et Fixateur pour immunofixation IF, Masque standard (SEBIA, référence N° 4815) contient cinq flacons d’antisérums, anti-Ig G,
anti-Ig A, anti-Ig M, anti-Kappa (chaînes légères libres et liées) et anti-Lambda (chaînes légères libres et liées) de 1 ml chacun et un flacon de fixateur
de 2,5 ml, spécifiques à la technique d’immunofixation réalisée avec les masques 1 IF, SEBIA.
1.1 ANTISÉRUMS
Voir paragraphe 6 précédent.
1.2 FIXATEUR
Voir paragraphe 7 précédent.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
2. EAU PHYSIOLOGIQUE
Préparation
Solution de NaCl 0,15 M (9 g/L) dans l’eau distillée ou déminéralisée.
Utilisation
Pour le lavage du gel après incubation avec le fixateur et les antisérums.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
La solution d’eau physiologique peut être conservée à température ambiante ou au réfrigérateur.
Éliminer la solution après 3 mois ou s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. Pour une
conservation prolongée, ajouter 1 g/L d’azoture de sodium.
3. COLORANT AMIDOSCHWARZ (SEBIA, référence N° 4554) (facultatif)
Préparation
Le colorant amidoschwarz concentré est une solution visqueuse qui peut éventuellement gélifier, ce qui n’affecte absolument pas la qualité de la
solution finale et son pouvoir de coloration.
Dans tous les cas, pour obtenir une parfaite reconstitution du colorant, il faut respecter le protocole suivant :
1. Ajouter environ 15 mL de diluant colorant au flacon d’amidoschwarz concentré.
2. Refermer soigneusement le flacon.
3. Agiter très vigoureusement le flacon pendant au minimum 5 secondes.
4. Verser la solution obtenue dans le récipient de préparation de la solution de coloration.
5. Renouveler cette opération deux fois, trois fois, si nécessaire.
6. Verser le reste du diluant dans le récipient de préparation de la solution de coloration.
7. Compléter à 300 mL avec de l’eau distillée ou déminéralisée.
8. Agiter parfaitement cette solution pendant 5 à 10 minutes.
Le colorant est prêt à l’emploi.
NOTE : Une reprise incomplète du colorant peut entraîner une mauvaise coloration de la fraction albumine (baisse du pourcentage ou trou blanc dans
la fraction).
Après dilution, la solution colorante contient : solution acide pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; éthylène-glycol, 6,7 % ; composants sans danger aux
concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales.
ATTENTION : Nocif en cas d’ingestion.
Utilisation
Pour la coloration des gels après séparation électrophorétique et immunofixation des protéines.
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Les solutions de colorant concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés pour éviter
l’évaporation. La solution concentrée est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de colorant. La solution diluée
est stable pendant 1 mois.
Ne pas stocker la solution de colorant diluée à proximité d’une source de chaleur.
Le diluant colorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le
kit ou sur l’étiquette du flacon de diluant colorant. NE PAS CONGELER.
4. FLUIDIL
Préparation
Le Fluidil (SEBIA, référence N° 4587 : 1 flacon de 5 mL) est prêt à l’emploi.
Utilisation
Pour la dilution des échantillons visqueux ou troubles (turbidité induite par la présence d’une cryoglobuline ou d’un cryogel).
Conservation, stabilité et signes de détérioration
Le Fluidil peut être conservé à température ambiante. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette du flacon de Fluidil.
Il ne doit pas y avoir de précipité.
ÉQUIPEMENT ET ACCESSOIRES NÉCESSAIRES
1. Générateur de courant : GD 61 D SEBIA, référence n° 1300 ; GD 251 D SEBIA, référence n° 1301 ; MG 300 SEBIA, référence n° 1302 ou MG 500
SEBIA, référence n° 1303.
2. APPLICATEUR HYDRAGEL K20 SEBIA, référence 1409, contenant le porte-applicateur HYDRAGEL K20 et le masque 1 IF.
3. Chambre humide, référence n° 1270.
4. Cuve d’électrophorèse : K20 SEBIA, référence n° 1400.
5. Bacs et portoirs pour le traitement des gels : kit accessoires HYDRAGEL K20 SEBIA, référence n° 1420.
6. Pipettes de 10 µL, 20 µL, 100 µL et 200 µL.
7. Incubateur-sécheur : IS 80 SEBIA, référence n° 1430.
ÉCHANTILLONS À ANALYSER
Prélèvement et conservation des échantillons
L’analyse se fait sur échantillons frais. Les sérums doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire d’analyses cliniques.
Les échantillons peuvent être conservés une semaine au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Pour des conservations prolongées, congeler les échantillons ;
les échantillons congelés sont stables au minimum 1 mois.
La conservation des sérums congelés est améliorée par addition à l’échantillon d’azoture de sodium 0,2 g/L.
IMPORTANT : Ne pas utiliser de conservateur contenant de l’acide borique.
Les échantillons décongelés peuvent donner, au point de dépôt, une trace due à la dénaturation de protéines ou de lipoprotéines.

Préparation des échantillons
Afin d’éviter des phénomènes de zone, par excès d’antigène, les échantillons de sérum doivent être déposés dilués.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
| PISTE | SÉRUM (µL) | DILUANT (µL) |
| Piste immunologique G | 20 | 100 |
| Profil électrophorétique ELP et autres pistes immunologiques | 30 | 60 |
Cas particuliers
• Si le taux d’immunoglobulines est supérieur à 20 g/l (cas d’hypergammaglobulinémie), il est recommandé d’augmenter le facteur de dilution des
échantillons (sauf pour la piste ELP) afin d’obtenir une concentration normale en immunoglobulines.
• Si le taux d’immunoglobulines est inférieur à 5 g/l (cas d’hypogammaglobulinémie), il est recommandé de diminuer le facteur de dilution des
échantillons.
• Pour une recherche de chaînes légères libres sériques ou urinaires, il est recommandé d’utiliser la technique " BENCE JONES ".
Pour cela, le test pourra être réalisé avec le kit IF et avec les antisérums ANTI-KAPPA LIBRE (SEBIA, référence N° 4610) et ANTI-LAMBDA LIBRE
(SEBIA, référence N° 4611) ou avec le kit HYDRAGEL BENCE JONES K20 (SEBIA, référence N° 3038).
En cas de recherche de chaînes libres sériques, diluer le sérum dans de l’eau physiologique ou dans le diluant pour immunofixation prédilué au 1/4
(1 volume de diluant + 3 volumes d’eau distillée ou déminéralisée) au 1/10 pour les pistes ELP, GAM, K et L (1 volume de sérum + 9 volumes de
diluant prédilué ou d’eau physiologique) et au 1/3 (1 volume de sérum + 2 volumes de diluant prédilué ou d’eau physiologique) pour les pistes
révélées avec les antisérums anti-kappa libres et anti-lambda libres.
Si le taux d’immunoglobulines est inférieur à 5 g/l, il est recommandé de moins diluer le sérum ; par exemple, au 1/5 pour les pistes ELP, GAM, K
et L et au 1/2 pour les pistes Kl et Ll.
• Après conservation au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C) ou congélation, certains sérums (en particulier ceux qui contiennent une cryoglobuline ou un
cryogel) deviennent visqueux ou troubles. Ces sérums présentent des difficultés de manipulation lors du dépôt avec l’applicateur, car ils ne diffusent
que très difficilement sur les dents de l’applicateur. Prétraiter ces sérums avec le Fluidil : ajouter 25 µL de Fluidil à 75 µL de sérum, agiter
15 secondes au vortex, puis suivre la technique.
• Certaines paraprotéines sont polymérisées, le sérum présente alors une bande d'allure "monoclonale" sur toutes les pistes. Préparer une solution
réductrice en ajoutant 1 % de ß-mercaptoéthanol (BME) dans le Fluidil. Prétraiter ces sérums par cette solution : ajouter 25 µL de solution réductrice
à 75 µL de sérum pur, agiter au vortex et laisser en contact 15 minutes minimum (30 minutes maximum), puis suivre la technique.
• Pour l’analyse des Ig D et/ou des Ig E, appliquer les mêmes dilutions que pour les chaînes légères libres et liées.
Échantillon à éviter
• Ne pas utiliser de plasma. Le fibrinogène donne une bande dans la zone gamma. Cette bande peut fausser l’interprétation du test (confusion avec
une gammapathie).
• Ne pas utiliser d’échantillon hémolysé.
TECHNIQUE
I. MIGRATION
1. Poser le porte-applicateur HYDRAGEL K20 à plat sur la paillasse (Fig. 1) et relever le chariot porte-applicateur.
2. Déposer 120 µL d’eau distillée ou déminéralisée sur le plateau du porte-applicateur dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié.
3. Sortir le gel de son emballage.
4. Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin.
ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation.
5. Placer le gel (face orientée vers le haut) sur le plateau du porte-applicateur contre la barrette, à l’intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 2).
6. Donner une forme concave au gel (Fig. 2) et le dérouler sur le plateau jusqu’au contact de la goutte d’eau qui doit se répartir sur toute la
largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d’air éventuellement piégées, puis dérouler totalement le gel au contact du
plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film.
7. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en position intermédiaire, la manette située sur le côté du porte-applicateur en position haute.
8. Poser un applicateur à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 3).
9. Déposer 10 µL d’échantillon de sérum dilué dans chaque puits. Le chargement de l’applicateur ne doit pas excéder 2 minutes.
| PISTE | PUITS DE DÉPÔT |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5 |
| L | 6 |
- L’applicateur doit être utilisé immédiatement après le chargement.
- Pour un dépôt différé (8 heures maximum), placer l’applicateur dans la chambre humide dents vers le haut (en manipulant l’applicateur par
la protection en plastique), placer la chambre humide au réfrigérateur et ne placer le gel sur le porte-applicateur HYDRAGEL K20 qu’au
moment de l’utilisation.
Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation.
10. Éliminer la protection des dents de l’applicateur.
11. Placer l'applicateur en position n° 6 sur le porte-applicateur.
IMPORTANT : Les numérotations de l’applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4).
12. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en butée, à l’aide de la manette du porte-applicateur pour amener l’applicateur au contact du gel.
NE PAS FORCER LA DESCENTE DU CHARIOT.
13. Après 1 minute d’application, tourner la manette du porte-applicateur pour relever l’applicateur puis le jeter.
14. Placer le gel dans la cuve d’électrophorèse, selon la polarité indiquée sur le gel.
Positionner l’HYDRAGEL sur le portoir de la cuve K20. La face gel est orientée vers le bas, et le gel plonge dans le tampon sur une distance
de 1 cm de chaque côté.
Voir la notice de la cuve K20 pour les instructions d’utilisation.

15. Brancher la cuve au générateur.
| CONDITIONS DE MIGRATION | SEBIA K20 |
| Volume de tampon par compartiment | 150 mL |
| Volume total de tampon | 300 mL |
| Temps de migration | 20 minutes |
| Voltage constant | 100 V
| |
Ampérage de départ (par gel) | 16 ± 3 mA |
16. Après migration, débrancher la cuve et sortir le gel.
Le marqueur bleu doit se trouver à 5 mm environ du bord anodique du cadre.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
II. IMMUNOFIXATION
1. Poser le porte-applicateur HYDRAGEL K20 à plat sur la paillasse.
2. Déposer 120 µL d’eau distillée ou déminéralisée sur le plateau du porte-applicateur dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié.
3. Placer le gel (face orientée vers le haut) sur le plateau contre la barrette, à l’intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 2).
4. Donner une forme concave au gel (Fig. 2) et le dérouler sur le plateau jusqu’au contact de la goutte d’eau qui doit se répartir sur toute la
largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d’air éventuellement piégées, puis dérouler totalement le gel au contact du
plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film.
5. Mettre en place le masque 1 IF de dépôt des réactifs sur le porte-applicateur comme suit (Fig. 5) :
- Placer les encoches du masque sur les charnières du porte-applicateur en tenant le masque par la poignée.
- Faire pivoter le masque pour l'appliquer sur le gel.
- S’assurer que les pistes du masque soient parfaitement centrées sur les empreintes laissées par les dents de l’applicateur sur le gel.
6. Déposer les réactifs en procédant comme suit :
| PISTE | VOLUME (µL) | DÉSIGNATION | COULEUR |
| ELP | 40 | solution de fixation | jaune |
| G | 25 | antisérum anti-chaînes lourdes gamma | rose |
| A | 25 | antisérum anti-chaînes lourdes alpha | bleu foncé |
| M | 25 | antisérum anti-chaînes lourdes mu | jaune vert |
| K | 25 | antisérum anti-chaînes légères kappa (libres et liées) | vert clair
| |
L | 25 | antisérum anti-chaînes légères lambda (libres et liées) | bleu clair |
NOTE : Pour éviter les inversions, les réactifs sont colorés et la couleur de la piste à remplir est rappelée sur le masque de dépôt des réactifs.
- Lors du prélèvement des réactifs, ne pas piéger de bulles d'air dans l'embout de la pipette.
- Pour déposer les réactifs (Fig. 6) :
- tenir la pipette verticalement et appliquer légèrement l'embout au fond de l'orifice ;
- injecter très progressivement les réactifs.
7. Laisser incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
III. ÉLIMINATION DES RÉACTIFS
1. Éliminer les réactifs à l'aide d’un peigne de papier-filtre (Fig. 7).
2. Le temps d’élimination des réactifs ne doit pas dépasser 30 secondes.
- Présenter le peigne à 30° (par rapport à l’horizontale) et l’introduire dans la fente pratiquée dans la partie inférieure des pistes d’incubation,
selon le plan incliné de celles-ci ;
- faire glisser très délicatement les dents du peigne de papier-filtre, le long de la paroi verticale opposée de la fente ; les dents viennent en
contact avec les réactifs et les absorbent par capillarité ; si le liquide ne progresse pas, incliner davantage le peigne de papier-filtre en faisant
levier sur son sommet pour amener les dents en contact avec le liquide (Fig. 8).
IMPORTANT : Le peigne de papier-filtre doit rester incliné à environ 45° et ne doit pas pénétrer dans le gel.
IV. ÉLIMINATION DES PROTÉINES RÉSIDUELLES
1. Retirer le peigne de papier-filtre.
2. Contrôler la bonne absorption des différents réactifs :
- absence de réactifs sur le gel ;
- toutes les dents du peigne sont colorées sur toute leur hauteur.
Si l'absorption est insuffisante, introduire à nouveau le même peigne (dans le même sens) et renouveler manuellement l'opération.
3. Retirer le masque de dépôt des réactifs :
- tenir le masque par la poignée ;
- faire pivoter le masque et le décrocher ;
4. Appliquer parfaitement un papier-filtre épais sur toute la surface du gel et laisser absorber pendant 4 minutes.
ATTENTION : Bien appuyer sur toute la surface de la feuille de papier-filtre pour assurer un contact parfait entre le gel et le papier.
5. Retirer le papier-filtre et laver le gel verticalement en eau physiologique pendant 5 minutes en le plaçant de telle façon que la piste ELP soit
positionnée vers le bas sur le portoir demi-gel.
6. Poser le gel à plat sur la paillasse.
7. Appliquer parfaitement un papier-filtre épais sur toute la surface du gel.
8. Mettre dans l’incubateur-sécheur IS 80 à 80 °C jusqu'à séchage complet du papier-filtre (soit environ 7 minutes) ou, en l’absence d’IS 80,
laisser le papier en contact avec le gel 5 minutes puis sécher totalement le gel sous air chaud.
9. Laver le masque sous l'eau courante avec une petite brosse souple (type brosse à dent). NE PAS UTILISER D'ALCOOL NI TOUT AUTRE
SOLVANT. Pour l'utilisation suivante, le masque doit être parfaitement sec. Pour éliminer les gouttes d'eau pouvant être piégées dans les puits,
tapoter le masque sur un papier ouaté et l'essuyer.

V. COLORATION - DÉCOLORATION
1. Après séchage, immerger verticalement le gel parfaitement sec en eau physiologique pendant 3 minutes minimum.
2. Immerger ensuite le gel dans la solution colorante pendant 4 minutes.
3. Décolorer par trois bains successifs de décolorant jusqu’à obtention d’un fond parfaitement clair.
4. Sécher le gel sous air chaud à 80 °C. Si nécessaire, nettoyer le dos du gel (support plastique) avec un papier ouaté humide.
RÉSULTATS
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Interprétation
Absence de bande monoclonale
• Un sérum normal montre une zone colorée diffuse d’immunoglobulines polyclonales sur toutes les pistes.
• Une hypergammaglobulinémie est caractérisée par une zone diffuse très fortement colorée, avec absence de bande étroite.
Présence d’une bande monoclonale
• Une gammapathie (présence d’une immunoglobuline monoclonale) est caractérisée par une bande étroite détectée avec l’un des anti-chaînes lourdes
(gamma, alpha ou mu) et avec l’un des anti-chaînes légères (kappa ou lambda). La fraction monoclonale mise en évidence, généralement étroite et bien
visible, doit être située au même niveau de migration que la bande détectée sur la piste de référence (ELP).
• L’absence de réaction avec l’un des anti-chaînes lourdes appliqué, mais avec présence d’une chaîne légère peut signifier :
a) la présence d’une gammapathie à Ig D ou Ig E qu’il conviendra de confirmer avec les anti-chaînes lourdes delta ou epsilon,
b) la présence d’une chaîne légère libre qu’il conviendra de confirmer avec les antisérums spécifiques anti-chaînes légères libres kappa ou lambda.
• L’absence de réaction avec les anti-chaînes légères mais avec présence d’une chaine lourde, est rare. Il conviendra de confirmer la présence d’une
maladie des chaînes gamma, alpha ou mu.
Présence de plusieurs bandes monoclonales
• La même interprétation s’applique en présence de plusieurs bandes monoclonales. Ces cas plus rares correspondent à la prolifération de plusieurs
clones de cellules B. Une gammapathie biclonale sera détectée par la présence de deux chaînes lourdes (identiques ou différentes) et de deux
chaînes légères (identiques ou différentes).
• Des immunoglobulines polymérisées sont caractérisées par la présence de plusieurs bandes sur une même chaîne lourde et une même chaîne
légère. Il conviendra d’effectuer un traitement réducteur au ß-mercaptoéthanol et de renouveler l’immunofixation pour confirmer la présence d’une
seule anomalie monoclonale (voir "ÉCHANTILLONS À ANALYSER").
• Un profil oligoclonal est caractérisé par la présence de bandes multiples sur une ou plusieurs chaînes lourdes et sur l’une ou les deux chaînes légères.
Cas particuliers
• Une bande d’allure monoclonale observée à l’électrophorèse mais non retrouvée sur les pistes immunoprécipitées peut indiquer la présence de
fibrinogène.
• Une précipitation sur toutes les pistes, au même niveau, peut indiquer la présence d’une Ig M polymérisée ou d’une cryoglobuline qu’il conviendra
d’identifier après traitement réducteur (voir "ÉCHANTILLONS À ANALYSER").
Interférences et limites
Voir ÉCHANTILLONS À ANALYSER.
L’utilisation d’antisérums autres que ceux spécifiques à la technique d’immunofixation réalisée avec le masque standard peut affecter la qualité des
résultats.
Compte-tenu des principes analytiques des techniques actuelles (principes de l’électrophorèse de zone, résolution et sensibilité), aucune garantie ne
peut être donnée quant à la détection totale de toutes les composantes monoclonales.
Assistance technique
Contacter le Service Technique SEBIA en cas de test défectueux.
Les fiches de données de sécurité des différents réactifs du kit ainsi que les informations relatives à l’élimination des déchets sont disponibles auprès
du Service Technique SEBIA.
PERFORMANCES
Reproductibilité intra-essai et spécificité
Migration de trois échantillons de sérums pathologiques : un sérum à faible gammapathie monoclonale, un sérum à forte gammapathie monoclonale
et un sérum présentant deux paraprotéines. La migration et l’immunofixation de chaque échantillon sont réalisées sur 2 lots différents de gel
HYDRAGEL suivies d’une coloration au violet acide.
Tous les échantillons testés donnent les mêmes résultats pour les 2 lots de gels utilisés. Les profils obtenus sont typiques des échantillons testés,
c’est-à-dire l’immunofixation ne détecte qu’une bande monoclonale pour les 2 premiers échantillons et met en évidence les 2 bandes monoclonales
attendues pour le troisième échantillon pathologique.
Reproductibilité inter-essais et spécificité
Migration de deux échantillons de sérums pathologiques : un sérum à faible gammapathie monoclonale et un sérum à forte gammapathie
monoclonale. La migration et l’immunofixation de chaque échantillon sont réalisées sur 20 gels de 2 lots différents suivies d’une coloration au violet
acide.
Tous les échantillons testés donnent les mêmes résultats pour les 2 lots de gels utilisés. Les profils obtenus sont typiques des échantillons testés,
c’est-à-dire l’immunofixation ne détecte qu’une bande monoclonale pour les 2 échantillons pathologiques testés.
Exactitude
Trente deux échantillons différents de sérums pathologiques et huit échantillons normaux ont été testés en parallèle sur gel HYDRAGEL avec
coloration au violet acide et sur un autre système en gel d’agarose disponible dans le commerce. Les résultats obtenus montrent une parfaite
corrélation entre les deux systèmes d’analyse et les mêmes bandes sont mises en évidence pour tous les sérums pathologiques analysés, avec une
sensibilité de 100 % et une spécificité de 100 % par rapport à cette dernière technique, calculées selon la méthode recommandée (Wendling, 1986).

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Sensibilité
Trois sérums à gammapathie ont été dilués en série et analysés dans la technique HYDRAGEL IF K20 avec coloration au violet acide et à
l’amidoschwarz. Les résultats sont présentés ci-dessous.
| BANDE MONOCLONALE | LIMITE DE DÉTECTION (g/L) |
ÉCHANTILLON N° | | TYPE CONC. (g/L) | | VIOLET ACIDE AMIDOSCHWARZ | |
| 1 | alpha | 5,33 | 0,25 | 0,25 |
| 1 | kappa | | 0,25 | 0,25 |
| 2 | mu | 10,9 | 0,12 | 0,12 |
| 2 | lambda | | 0,25 | 0,25 |
| 3 | gamma | 17,2 | 0,25 | 0,50
| |
3 | lambda | | 0,12 | 0,12 |
BIBLIOGRAPHIE
Pour des informations complémentaires sur l'interprétation des profils obtenus par immunofixation, voir (1) et (2):
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd
ed., 1994, 397 pp.
(3) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité.
Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97.

INTENDED USE
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
The HYDRAGEL IF K20 kit is designed for the detection of monoclonal proteins in human serum by immunofixation electrophoresis on alkaline
buffered (pH 9.1) agarose gels. Serum proteins are electrophoresed and immunofixed by antisera with different specificities: anti-gamma (Ig G), alpha
(Ig A) and mu (Ig M) heavy chains, and anti-kappa and lambda (free and bound) light chains. After immunofixation, the precipitated proteins are stained
with acid violet. The excess of stain is removed with an acidic solution.
Each agarose gel in the HYDRAGEL IF K20 kit is intended to run one sample.
To accomodate diverse users preferences, the HYDRAGEL IF K20 kits are available either with or without the antisera, and either with or without acid violet.
For In Vitro Diagnostic Use.
PRINCIPLE OF THE TEST
Abnormal bands in the electrophoretic pattern of serum proteins, primarily those in the beta-globulins and gamma-globulins zones, are always suspect
of being monoclonal proteins and therefore an indication of gammopathies. To identify these abnormal bands, the technique of immunofixation is
applied.
Immunofixation electrophoresis is a simple technique that allows a protein to be anchored in situ after electrophoresis, by forming an insoluble complex
with its antibody. It is performed in four stages:
1. Separation of proteins by electrophoresis on agarose gel.
2. Fixation and immunoprecipitation of the electrophoresed proteins: fixative solution and antisera are overlaid directly onto the gel surface over the
appropriate electrophoretic migration tracks. Fixative solution and antisera diffuse into the gel precipitating all the proteins and the corresponding
antigens, respectively.
3. The unprecipitated, soluble proteins are removed from the gel by blotting and washing. Precipitin of the antigen-antibody complex is trapped within
the gel matrix.
4. The precipitated proteins are visualized by staining. The immunoprecipitated bands are then compared with the corresponding abnormal bands
seen in the electrophoretic pattern of serum sample.
To detect and identify the suspect monoclonal components, the samples are simultaneously electrophoresed in six tracks. After the electrophoresis,
one track (ELP) serves as a reference showing electrophoretic pattern of the sample’s proteins. The remaining five tracks allow identification of the
monoclonal component(s) from its (their) reaction(s), or lack of, with antisera against gamma (Ig G), alpha (Ig A) and mu (Ig M) heavy chains, and
against free and bound light chains kappa and lambda.
This simple and fast technique gives a clear and easily interpretable picture.
REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED IN THE HYDRAGEL IF K20 KITS
| ITEMS | PN 3031 | PN 3220* |
| Agarose Gels (ready to use) | 10 gels | 100 gels |
| Tris-Barbital Buffer (stock solution) | 3 vials, 75 mL each | 30 vials, 75 mL each |
| Acid Violet Stain (stock solution) | 1 vial, 75 mL | 3 vials, 75 mL each |
| Destaining Solution (stock solution) | 1 vial, 100 mL | 1 vial, 100 mL each |
| Diluent (ready to use) | 1 vial, 3.2 mL | 1 vial, 32 mL |
| Fixative Solution (ready to use) | | 1 vial, 14.4 mL |
| Mammalian immunoglobulins anti-human | | |
| gamma heavy chains (ready to use) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Mammalian immunoglobulins anti-human | | |
| alpha heavy chains (ready to use) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Mammalian immunoglobulins anti-human | | |
| mu heavy chains (ready to use) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Mammalian immunoglobulins anti-human | | |
| kappa (free and bound) light chains (ready to use) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Mammalian immunoglobulins anti-human | | |
| lambda (free and bound) light chains (ready to use) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Applicators 6 teeth (ready to use) | 1 pack of 10 | 10 packs of 10 each |
| Filter Papers -Thin | 1 pack of 10 | 10 packs of 10 each |
| Filter Paper Combs | 1 pack of 10 | 10 packs of 10 each
| |
Filter Papers -Thick | 2 packs of 10 | 20 packs of 10 each |
* HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
The volume of buffer supplied in the MAXI-KIT is designed for two migrations. Store the buffer to run two gels.
NOTE : The fixative solution and the antisera are supplied separately from the kits except for MAXI-KIT (See REAGENTS REQUIRED BUT NOT
SUPPLIED).
FOR OPTIMAL RESULTS
All reagents from the same kit must be always used together and according to the package insert instructions.
PLEASE READ THE PACKAGE INSERT CAREFULLY.
1. AGAROSE GELS
Preparation
Agarose gels are ready to use. Each gel contains: agarose, 0.8 g/dL ; tris-barbital buffer pH 9.1 ± 0.1 ; additives, nonhazardous at concentrations
used, necessary for optimum performance.
WARNING: Agarose gels contain 0.31 % barbital and 0.34 % sodium barbital. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately !
SEBIA INSTRUCTIONS - English

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Use
Support medium for protein electrophoresis and immunofixation.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the gels horizontally in the original protective packaging at room temperature (15 to 30 °C) or refrigerated (2 to 8 °C). They are stable until the
expiration date indicated on the kit package and the gel package labels. (The arrow on the front of the kit box must be pointing upwards).
Avoid storage close to a window or to a heat source. Avoid important variation of temperature during storage.
DO NOT FREEZE.
Discard when :
(I) crystals or precipitate form on the gel surface or the gel texture becomes very soft (all these result from freezing the gel),
(II) bacterial or mold growth is indicated,
(III) abnormal liquid quantity is present in the gel box (as a result of buffer exudation from the gel due to improper storage conditions).
2. TRIS-BARBITAL BUFFER
Preparation
Each vial of the stock buffer solution to be diluted up to 1 liter with distilled or deionized water.
After dilution, the working solution contains : tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; sodium azide.
WARNING: Each vial of the stock buffer contains 2.45 % barbital, 13.73 % sodium barbital and 0.13 % sodium azide. Do not ingest ! If
ingested, consult physician immediately ! Prevent contact with acids, lead or copper, as these are known to form explosive or toxic
compounds with sodium azide. Always flush with a large quantity of water when disposing.
Use
Electrophoresis buffer.
Storage, stability and signs of deterioration
Store stock buffer solution at room temperature or refrigerated. Stock solution is stable for several years, at least until the expiration date indicated on
the kit package or buffer vial labels. Diluted buffer solution is stable for one year at room temperature in a closed bottle.
Discard diluted buffer if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.
3. ACID VIOLET STAIN
Preparation
Vial of the stock acid violet stain to be diluted up to 300 mL with distilled or deionized water.
After dilution, the working stain solution contains: acid solution pH ≈ 2 ; acid violet, 0.2 g/dL ; ethylene-glycol, 3.25 % ; additives, nonhazardous at
concentrations used, necessary for optimum performance.
WARNING: Harmful if swallowed.
Use
For staining gels after protein electrophoresis and immunofixation.
Storage, stability and signs of deterioration
Store both stock and working stain solutions at room temperature or refrigerated in closed containers to prevent evaporation. Stock stain solution is
stable until the expiration date indicated on the kit package or stain vial labels. Working stain solution is stable for 6 months.
4. DESTAINING SOLUTION
Preparation
Each vial of stock destaining solution to be diluted up to 100 liters with distilled or deionized water. It is convenient to dilute only 1 mL of the stock
solution to 1 liter. After dilution, the working destaining solution contains: citric acid, 0.05 g/dL.
Use
For destaining, that is removal of excess and background stain from the gels.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the stock destaining solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or destaining
solution vial labels. Working destaining solution is stable for one week at room temperature in a closed bottle. Do not add any sodium azide.
Discard working destaining solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.
To prevent microbial proliferation in the diluted destaining solution to be stored more than one week, add 5 µL/dL of ProClin 300.
Working destaining solution added with ProClin is stable in a closed bottle at room temperature or refrigerated until the expiration date indicated on
the kit package or destaining solution vial labels.
5. DILUENT
Preparation
Diluent is ready to use. It contains: buffer pH 7.5 ± 0.3 ; bromophenol blue ; additives, nonhazardous at concentrations used, necessary for optimum
performance.
Use
For sample dilution. The bromophenol blue serves as a convenient application and migration marker.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the diluent at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or diluent vial labels.
Diluent must be free of precipitate.
6. ANTISERA (with PN 3220)
Preparation
Ready to use. All antisera are mammalian, anti-human total immunoglobulins. For easy identification of antisera and as an aid in monitoring their
application, the antisera are colored with distinct nonhazardous dyes as noted in Procedure, Section II. 6. The vial labels are matching colors.
When antiserum exhibits a slight turbidity, leave the antiserum vial at room temperature for a minimum of 10 minutes. This should be sufficient to clear
the solution ; however, if turbidity remains, this should not affect in any way the immunological reaction.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Use
For immunofixation of the electrophoresed proteins.
NOTE : The antisera are specific for the immunofixation procedure with the 1 IF masks, SEBIA.
Antisera may originate from different animal species. Don’t mix two different antisera vials, even with the same specificity, and ALWAYS change the
tip of the pipette when changing antiserum vials.
IMPORTANT: In order to avoid any contamination between reagents, be careful to replace the cap on each corresponding vial after each use.
Storage, stability and signs of deterioration
Store the antisera refrigerated (2 to 8 °C). They are stable until the expiration date indicated on the kit package or antisera vial labels.
Discard if they change in appearance, e.g., become cloudy due to microbial contamination.
NOTE : During transportation, the antisera can be kept without refrigeration (15 to 30 °C) for 15 days without any adverse effects on performance.
7. FIXATIVE SOLUTION (with PN 3220)
Preparation
Fixative solution is ready to use. It contains : acidic solution ; additives, nonhazardous at concentrations used, necessary for optimum performance.
For an easy identification and as an aid in monitoring its application, the fixative is colored with a non hazardous dye that matches the color of the vial
label (see Procedure, Section II. 6.).
Use
To fix electrophoreticaly separated proteins in the reference track (ELP).
NOTE : The fixative solution is specific for the immunofixation procedure with the 1 IF masks, SEBIA.
IMPORTANT: In order to avoid any contamination between reagents, be careful to replace the cap on each corresponding vial after each use.
Storage, stability and signs of deterioration
Store fixative solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or fixative solution vial
labels.
Fixative solution must be free of precipitate.
8. APPLICATORS
Use
Precut, single use applicators for sample application.
Storage
Store the applicators in a dry place at room temperature or refrigerated.
9. FILTER PAPERS – THIN
Use
Single use, thin absorbent paper pads for blotting excessive moisture off the gel surface before sample application.
Storage
Store the thin filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated.
10. FILTER PAPER COMBS
Use
Precut, single use, thick absorbent paper combs for blotting excess of fixative solution and antisera off the gel surface after immunofixation step.
11. FILTER PAPERS – THICK
Use
Single use, thick absorbent paper pads for blotting unprecipitated proteins off the gel after immunofixation step.
Storage
Store the thick filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated.
REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
1. ANTISERA AND FIXATIVE SOLUTION PACK (for 3031 kits)
The antisera and fixative solution pack for immunofixation IF, Standard mask, SEBIA, PN 4815, contains 5 antisera vials, anti-Ig G, anti-Ig A, anti-Ig M,
anti-Kappa (free and bound light chains) and anti-Lambda (free and bound light chains), 1 mL each, and 1 fixative solution vial, 2.5 mL. They are
specific for the immunofixation procedure with the 1 IF masks, SEBIA.
1.1 ANTISERA
See previous paragraph 6.
1.2 FIXATIVE SOLUTION
See previous paragraph 7.
2. SALINE
Preparation
Make 0.15 M (0.9 g/dL) NaCl solution in distilled or deionized water.
Use
For the wash of the gels after incubation with fixative solution and antisera.
Storage, stability and signs of deterioration
Store at room temperature or refrigerated. Discard after 3 months or if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination.
For longer storage periods, add sodium azide, 0.1 g/dL.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
3. AMIDOBLACK STAIN (SEBIA, PN 4554) (optional)
Preparation
The amidoblack concentrated stain is a visquous solution which may gelify. The integrity of the stock staining solution is not altered by the increase in
viscosity or solidification.
In all cases, to obtain a perfect reconstitution of the stain, we advise you to respect the following procedure:
1. Add 15 mL of stain diluent to the concentrated amidoblack vial.
2. Close carefully the vial.
3. Shake very vigorously the vial during approximately 5 seconds.
4. Pour this solution in the container for staining solution processing.
5. Repeat this step twice, three times if necessary.
6. Pour the remaining diluent in the container and complete the volume to 300 mL with distilled or deionized water.
7. Mix contents of stain cubitainer well for 5 to 10 minutes.
The staining solution is ready to use.
NOTE : An incomplete reconstitution of the stain will lead to an under-evaluation of albumin fraction (low percentage or white hole inside the fraction).
After dilution, the working staining solution contains: acid solution pH ≈ 2 ; amidoblack, 0.4 g/dL ; ethylene-glycol, 6.7 % ; additives, nonhazardous at
concentrations used, necessary for optimum performance.
WARNING: Harmful if swallowed.
Use
For staining gels after protein electrophoresis and immunofixation.
Storage, stability and signs of deterioration
Store both stock and working staining solutions at room temperature or refrigerated in closed containers to prevent evaporation. Stock staining solution
is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining vial labels. Working staining solution is stable for 1 month.
Do not store the working staining solution close to a heat source.
Store the stock staining solution diluent at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or
destaining solution vial labels. DO NOT FREEZE.
4. FLUIDIL
Preparation
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 vial, 5 mL) is ready to use.
Use
To dilute viscous or turbid samples, e.g., sera containing cryoglobulin or cryogel.
Storage, stability and signs of deterioration
Store at room temperature. It is stable until the expiration date indicated on the Fluidil vial label.
Fluidil must be free of precipitate.
EQUIPMENT AND ACCESSORIES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED
1. Power supply: GD 61 D SEBIA, PN 1300 ; GD 251 D SEBIA, PN 1301 ; MG 300 SEBIA, PN 1302 or MG 500 SEBIA, PN 1303.
2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, PN 1409, containing the HYDRAGEL K20 applicator carrier and the reagent application template 1 IF.
3. Wet Storage Chamber, PN 1270.
4. Electrophoresis chamber: K20 SEBIA, PN 1400.
5. Tanks and Gel Holders for processing of gel plates: HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, PN 1420.
6. Pipettes: 10 µL, 20 µL, 100 µL and 200 µL.
7. Incubator-Dryer: IS 80 SEBIA, PN 1430.
SAMPLES FOR ANALYSIS
Sample collection and storage
Fresh samples are recommended for analysis. Sera must be collected according to established procedures used in clinical laboratory testing.
Refrigerate samples (2 to 8 °C) as soon as possible after collection for up to one week. For longer storage periods, keep samples frozen (stable at
least one month).
Freezing serum samples with sodium azide, 0,02 g/dL improves the storage stability.
IMPORTANT: Avoid boric acid as preservative.
Thawed samples may give slight application marks due to protein or lipoprotein denaturation.
Sample preparation
Dilute sera prior to application to prevent prozononing at high level of antigen and mix well.
| TRACK | SERUM (µL) | DILUENT (µL) |
| Ig G Immunofixation track | 20 | 100 |
| ELP reference track and all other immunofixation tracks | 30 | 60 |
Special cases
• If total immunoglobulin level is > 2 g/dL (hypergammaglobulinemia), it is recommended to use higher dilutions of the samples (except ELP track) to
obtain normal immunoglobulins concentration.
• If total immunoglobulin level is < 0.5 g/dL (hypogammaglobulinemia), it is recommended to use lower dilutions of the samples.
• The patient’s serum or urine sample may also be tested for Bence Jones proteins ; then, it is recommended to use the " BENCE JONES " procedure.
The sample should be tested with the IF kit and with anti-kappa free light chains (SEBIA, PN 4610) and anti-lambda free light chains (SEBIA,
PN 4611) or with a HYDRAGEL BENCE JONES K20 kit (SEBIA, PN 3038).

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
In this case, dilute the serum in saline or in diluent for immunofixation previously diluted 1/4 (1 part diluent, 3 parts distilled or deionized water) 1/10
for ELP, GAM, K and L tracks (1 part serum, 9 parts diluted diluent or saline) and 1/3 (1 part serum, 2 parts diluted diluent or saline) for Kf and Lf
tracks.
If total immunoglobulin level is < 0.5 g/dL, it is recommended to less dilute the serum sample ; for example, 1/5 for ELP, GAM, K and L tracks, and
1/2 for Kf and Lf tracks.
• After refrigeration or freezing, some sera (particularly those containing cryoglobulin or cryogel) may become viscous or develop turbidity. Such sera
might present application problems due to hindered diffusion through the sample applicator teeth. In such case, add 25 µL Fluidil to 75 µL serum
and vortex for 15 seconds. Then follow the standard procedure.
• Some monoclonal proteins can polymerize resulting in a "monoclonal fraction" appearing on all immunofixed tracks. In this case (i) prepare 1 %
beta-mercaptoethanol in Fluidil, (ii) add 25 µL reducing solution to 75 µL neat serum, (iii) vortex and wait at least 15 minutes minimum (maximum
30 minutes) and then follow the standard procedure.
• For Ig D and/or Ig E analysis, apply the same dilutions as for kappa and lambda free and bound light chains.
Samples to avoid
• Avoid plasma samples. Fibrinogen gives a band in the reference track in the gamma zone that might be taken for a monoclonal protein.
• Avoid hemolyzed samples.
PROCEDURE
I. MIGRATION STEP
1. Place the HYDRAGEL K20 applicator carrier on a flat surface (Fig. 1) and raise the part of the applicator carrier with the numbered notches.
2. Pool 120 µL distilled or deionized water on the lower third of the frame printed on the HYDRAGEL K20 applicator carrier.
3. Unpack the HYDRAGEL agarose gel plate.
4. Roll quickly and uniformly one thin filter paper onto the gel surface to absorb the excess of liquid. Remove the paper immediately.
WARNING: Do not leave the filter paper for a too long contact with the gel to avoid its dehydration.
5. Place the gel plate (the gel side up) with its edge against the stop at the bottom of the printed frame (Fig. 2).
6. Bend the gel and lower it down onto the water pool (Fig. 2). Ensure that no air bubbles are trapped, water is spread underneath the entire gel
plate and the gel is lined up with the printed frame.
7. Lower the applicator carrier with the numbered notches down to the intermediate position with the switch in high position.
8. Place one applicator on a flat surface with the well numbers in the right-side-up position (Fig. 3).
9. Apply 10 µL of properly diluted serum into the applicator wells as follows. Load the applicator within 2 minutes.
| IMMUNOFIXATION TRACK | WELL No. |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5
| |
L | 6 |
- Use the applicator without any delay.
- For later use (up to 8 hours), place the applicator into the wet storage chamber with the teeth up [handle it by the plastic tooth protection
frame], keep the entire chamber under refrigeration and set-up the gel plate onto the HYDRAGEL K20 applicator carrier just before use.
See wet chamber package insert for further details.
10. Snap off the applicator teeth's protection frame.
11. Place the sample applicator into position No. 6 on the applicator carrier.
IMPORTANT: The numbers printed on the sample applicator must face the operator (Fig. 4).
12. Lower the applicator carrier so that the applicator contacts the gel surface. DO NOT FORCE THE CARRIERS ALL THE WAY DOWN.
13. After 1 minute, turn the switch to rise up the applicator, remove the applicator and discard.
14. Put the gel into an appropriate electrophoresis chamber, according to the polarity indicated on the gel. When using SEBIA K20 chamber, place
the HYDRAGEL on the bridge with the gel side facing down ; the gel should dip about 1 cm into the buffer on each side.
See K20 chamber package insert for further details.
15. Plug the chamber to the power supply.
| MIGRATION CONDITIONS | SEBIA K20 |
| Volume of buffer per compartment | 150 mL |
| Total buffer volume | 300 mL |
| Migration time | 20 minutes |
| Constant voltage | 100 V
| |
Initial current (one gel) | 16 ± 3 mA |
16. After migration, unplug the chamber and remove the gel plate.
The blue marker must be located at about 5 mm from the anodic side of the printed frame.
II. IMMUNOFIXATION STEP
1. Place the HYDRAGEL K20 applicator carrier on a flat surface.
2. Pool 120 µL distilled or deionized water, on the lower third of the frame printed on the HYDRAGEL K20 applicator carrier.
3. Place the gel plate (the gel side up) with its edge against the stop at the bottom of the printed frame (Fig. 2).
4. Bend the gel and lower it down onto the water pool (Fig. 2). Ensure that no air bubbles are trapped, water is spread underneath the entire gel
plate and the gel is lined up with the printed frame.

5. Set-up the reagent application template 1 IF as follows (Fig. 5):
- Position the application template on the anchoring clips.
- Hold the flap on the template and lower the template onto the gel.
- The troughs of the template must be perfectly aligned with the prints of the applicator’s teeth left on the gel.
6. Apply reagents as follows :
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
| TROUGH | VOLUME (µL) | REAGENT | COLOR |
| ELP | 40 | fixative solution | yellow |
| G | 25 | anti-gamma heavy chain antiserum | pink |
| A | 25 | anti-alpha heavy chain antiserum | dark blue |
| M | 25 | anti-mu heavy chain antiserum | yellow green |
| K | 25 | anti-kappa light chain (free & bound) antiserum | light green |
| L | 25 | anti-lambda light chain (free & bound) antiserum | light blue |
NOTE : To avoid mix-up, reagent colors are shown both on the vial labels and the application template wells.
- Take reagents without trapping any air bubbles in the pipette tip.
- Apply the reagents (Fig. 6) :
- Hold pipette vertically and rest its tip lightly at the bottom of the well.
- Inject reagent so it spreads through the trough without trapping any bubbles.
7. Incubate at room temperature for 5 minutes.
III. REAGENTS REMOVAL
1. Remove the excess of reagents with the filter paper comb (Fig. 7).
2. Remove reagents within 30 seconds.
- Insert the comb at a 30° angle into the slots at the lower end of the template troughs so that the teeth touch the vertical side away from the
operator.
- Allow the teeth to contact delicately the liquid by tilting each comb to a 45° angle enabling the teeth to wick off the liquid (Fig. 8).
IMPORTANT: The comb must stay inclined (45°). If it is straight up, it could damage the gel.
IV. REMOVAL OF THE UNPRECIPITATED PROTEINS
1. Remove the comb.
2. Check that the reagents are well absorbed as indicated by:
- the absence of reagents on the gel.
- the full lengths of the teeth are stained.
If the reagent absorption is incomplete, insert the same filter paper comb again (in the same position) and repeat manually the removal
procedure.
3. Grasp the reagent application template by the flap, lift it and remove it.
4. Apply one thick filter paper on the gel for 4 minutes. The thick filter paper must be in a uniform contact with the gel.
IMPORTANT: Press firmly on the whole surface of the filter paper to ensure perfect adherence on the gel.
5. Remove the filter paper. Wash the gel vertically in saline for 5 minutes. Place the gel in order that the ELP track is located at the bottom on
the gel holder.
6. Place the gel on a flat surface.
7. Apply a new thick filter paper on the gel. The thick filter paper must be in a uniform contact with the gel.
8. Dry the gel completely in the incubator-dryer at 80 °C until the filter paper is completely dry (for about 7 minutes), or without incubator-dryer,
leave the filter paper in a uniform contact with the gel for 5 minutes and dry the gel completely with hot air.
9. Clean the application template with a small brush (e.g., toothbrush). DO NOT USE ALCOHOL OR SOLVENTS. Ensure the template is
completely dry before re-use ; remove water droplets from the wells by tapping it on soft paper.
V. STAINING AND DESTAINING STEPS
1. After drying, immerse the completely dried gel vertically in saline for 3 minutes.
2. Immerse it vertically in the staining solution for 4 minutes.
3. Destain in three successive baths of destaining solution until the background is completely colorless and clear.
4. Dry the gel in a 80 °C air stream. If necessary, clean the back side (support side) with a damp soft paper.
RESULTS
Interpretation
Absence of monoclonal component
• A normal serum sample shows a light diffused staining of polyclonal immunoglobulins in all tracks.
• A hypergammaglobulinemia is characterized by a heavily stained, diffused zone and absence of any restricted bands.
Presence of a monoclonal component
• The presence of a monoclonal protein (gammopathy) is characterized by a monoclonal band detected with one of the anti-heavy chain antisera
(gamma, alpha or mu) and either with anti-kappa or anti-lambda light chain antiserum. The detected monoclonal band, typically sharp and
demarcated in appearance, must be located at the same migration distance as the suspect monoclonal band seen in the reference track (ELP).
• Absence of reaction with any of the applied anti-heavy chain antisera and reaction with one of the light chain antisera might indicate :
a) a very rare Ig D or Ig E gammopathy: confirm with anti-delta or anti-epsilon heavy chain antisera,
b) a light chain gammopathy: confirm with antisera anti-kappa or anti-lambda free light chains.
• Failure to observe a positive reaction with any of the applied anti-light chain antisera, while an anti-heavy chain antiserum reacts, might indicate a
very rare heavy chain gammopathy (gamma, alpha or mu).

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Presence of two or more monoclonal components
In rare cases, several clones of B-cells proliferate as indicated by several monoclonal bands revealed by immunofixation:
• A biclonal gammopathy is characterized by the presence of two bands of heavy chain (identical or different) and two bands of light chains (identical
or different).
• Polymerized immunoglobulins are characterized by several bands of the same type of heavy chain and one of the same type of the light chain. To
confirm the presence of a single monoclonal abnormality, it is necessary to depolymerize with beta-mercaptoethanol and repeat immunofixation (see
"SAMPLES FOR ANALYSIS").
• An oligoclonal gammopathy is characterized by the presence of multiple bands of one or more types of heavy chains and by one or two types of
light chains.
Special cases
• When a monoclonal type band is observed on serum electrophoresis (ELP track) but fails to be confirmed by immunofixation, fibrinogen (plasma
sample) should be the prime suspect.
• When a monoclonal type band is observed on all immunofixation tracks, cryoglobulin or polymerized Ig M should be suspected. Depolymerize with
a reducing agent and repeat the procedure (see "SAMPLES FOR ANALYSIS").
Limitations
See SAMPLES FOR ANALYSIS.
The use of antisera other than those specific for the immunofixation procedure with the standard mask may affect the results.
Due to the resolution and sensitivity limits of zone electrophoresis, it is possible that some monoclonal components may not be detected with this method.
Troubleshooting
Call Technical Service of the supplier when the test fails to perform while the instruction for the preparation and storage of materials, and for the
procedure were carefully followed.
Kit reagent Safety Data Sheets and informations on waste products elimination are available from the Technical Service of the supplier.
PERFORMANCE DATA
Standard materials, sample preparation and procedures were used. All electrophoregrams were evaluated visually.
Reproducibility within gel and specificity
Reproducibility within gel was demonstrated on two pathological serum samples with low and high level of monoclonal component respectively, and
one sample with two monoclonal components. Each sample was run on 2 gels from 2 lots using the acid violet staining procedure.
All tested samples gave identical results for the 2 lots showing patterns typical and as expected for the type of sample tested, with monoclonal bands
detected by immunofixation for each serum sample.
Reproducibility between gels and specificity
Reproducibility between gels was demonstrated on two pathological serum samples with low and high level of monoclonal component respectively.
Each sample was run on 20 gels from 2 lots using the acid violet staining procedure.
All tested samples gave identical results for the 2 lots showing patterns typical and as expected for the type of sample tested, with one monoclonal
band detected by immunofixation for each serum sample.
Accuracy
Thirty two different pathological serum samples and eight normal samples were run using the HYDRAGEL IF K20 kit and another commercially
available agarose gel immunofixation system. HYDRAGEL IF K20 procedure was tested with the acid violet staining procedure. Identical bands were
detected on all pathological samples with each system.
Sensitivity
Serial dilutions were prepared with 3 pathological serum samples all exhibiting monoclonal components and analyzed with HYDRAGEL IF K20
procedure using both acid violet and amidoblack staining procedures.
The results are summarized below.
| MONOCLONAL COMPONENT | DETECTION LIMIT (g/L) |
SAMPLE No. TYPE CONC. (g/L) ACID VIOLET AMIDOBLACK | | | | | |
| 1 | alpha | 5.33 | 0.25 | 0.25 |
| 1 | kappa | | 0.25 | 0.25 |
| 2 | mu | 10.9 | 0.12 | 0.12 |
| 2 | lambda | | 0.25 | 0.25 |
| 3 | gamma | 17.2 | 0.25 | 0.50
| |
3 | lambda | | 0.12 | 0.12 |
BIBLIOGRAPHY
For additional information on interpretation of immunofixation patterns refer to:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.

ANWENDUNGSBEREICH
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Der HYDRAGEL IF K20 Kit dient zum Nachweis von monoklonalen Proteinen in humanem Serum durch Immunfixations-Elektrophorese in alkalisch
gepufferten (pH 9,1) Agarosegelen. Die Serumproteine werden elektrophoretisch getrennt und durch Antiseren unterschiedlicher Spezifität gegen
Gamma- (Ig G), Alpha- (Ig A) und Mu-Schwerketten (Ig M), und gegen Kappa- und Lambda-Leichtketten (frei und gebunden) einer Immunfixation
unterzogen. Nach der Immunfixation werden die ausgefällten Proteine mit Säureviolett angefärbt. Die überschüssige Farbe wird mit einer sauren
Lösung entfernt.
Jedes Agarosegel im HYDRAGEL IF K20 Kit ist für eine Probe bestimmt.
Um unterschiedliche Anwender zufriedenzustellen sind die HYDRAGEL IF K20 Kits mit und ohne Antiseren und mit Säureviolett und ohne dieses
Reagenz erhältlich.
Nur für den diagnostischen in vitro Gebrauch.
TESTPRINZIP
Abnormale Banden in elektrophoretischen Mustern von Serumproteinen, vor allem jene in den Beta und Gamma Globulinfraktionen, sind immer
verdächtig, monoklonale Proteine zu sein und deshalb ein Indikator für Gammopathien. Zur Identifikation dieser abnormalen Banden wird die
Immunfixation eingesetzt.
Die Immunfixations-Elektrophorese ist eine einfache Technik, die eine in situ Fixierung eines Proteins nach einer Gelelektrophorese ermöglicht, indem
ein unlöslicher Komplex mit seinen Antikörpern gebildet wird. Die Technik wird in 4 Schritten durchgeführt:
1. Trennung der Proteine im Agarosegel.
2. Fixation und Immunfällung der aufgetrennten Proteine: Die Fixierlösung und die Antiseren werden direkt auf die Geloberfläche über den
entsprechenden elektrophoretischen Migrationsspuren aufgebracht. Die Fixierlösung und die Antiseren diffundieren in das Gel, wobei alle Proteine
und die entsprechenden Antigene ausgefällt werden.
3. Die nicht ausgefällten Proteine werden durch Abblotten und Waschen aus dem Gel entfernt. Das Präzipitat des Antigen-Antikörper Komplexes wird
in der Gelmatrix eingeschlossen.
4. Die ausgefällten Proteine werden durch Anfärben sichtbar gemacht. Die durch Immunfällung erhaltenen Banden werden dann mit den
entsprechenden abnormalen Banden im Elektrophoresemuster der Serumprobe verglichen.
Um verdächtige monoklonale Komponenten nachzuweisen und zu identifizieren werden die Proben gleichzeitig auf sechs Spuren elektrophoretisch
getrennt. Nach der Elektrophorese dient eine Spur (ELP) als Referenz, die das Elektrophoresemuster des Probenproteins zeigt. Die verbleibenden
fünf Spuren ermöglichen die Identifizierung der monoklonalen Komponente(n) durch ihre Reaktion(en) mit den Antiseren gegen Schwerketten des
Gamma – (Ig G), Alpha – (Ig A) und Mu Typs (Ig M) und gegen freie und gebundene Kappa- und Lambda-Leichtketten.
Diese einfache und schnelle Technik ergibt klare und einfach interpretierbare Befunde.
REAGENZIEN UND MITGELIEFERTE MATERIALIEN IN HYDRAGEL IF K20 KITS
| ARTIKEL | ART.-NR 3031 | ART.-NR 3220* |
| Agarose Gele (gebrauchsfertig) | 10 Gele | 100 Gele |
| Tris-Barbital Puffer (Stammlösung) | 3 Fl, jedes 75 ml | 30 Fl, je 75 ml |
| Säureviolett-Färbelösung (Stammlösung) | 1 Fläschchen, 75 ml | 3 Fläschchen, je 75 mL |
| Entfärbelösung (Stammlösung) | 1 Fläschchen, 100 ml | 1 Fläschchen, 100 ml |
| Verdünnungslösung (gebrauchsfertig) | 1 Fläschchen, 3,2 ml | 1 Fläschchen, 32 ml |
| Fixierlösung (gebrauchsfertig) | | 1 Fläschchen, 14,4 ml |
| Säugetierimmunglobuline gegen | | |
| humane Gamma-Schwerketten (gebrauchsfertig) | | 1 Fläschchen, 2,5 ml |
| Säugetierimmunglobuline gegen humane | | |
| Alpha-Schwerketten (gebrauchsfertig) | | 1 Fläschchen, 2,5 ml |
| Säugetierimmunglobuline gegen humane | | |
| Mu-Schwerketten (gebrauchsfertig) | | 1 Fläschchen, 2,5 ml |
| Säugetierimmunglobuline gegen humane (freie und | | |
| gebundene) Kappa-Leichtketten (gebrauchsfähig) | | 1 Fläschchen, 2,5 ml |
| Säugetierimmunglobuline gegen humane (freie und | | |
| gebundene) Lambda-Leichtketten (gebrauchsfertig) | | 1 Fläschchen, 2,5 ml |
| Applikatoren 6 Zähne (gebrauchsfertig) | 1 Pack mit 10 | 10 Pack mit jeweils 10 |
| Filterpapiere –Dünn | 1 Pack mit 10 | 10 Pack mit je 10 |
| Filterpapierkämme | 1 Pack mit 10 | 10 Pack mit je 10 |
| Filterpapiere – Dick | 2 Pack mit 10 | 20 Pack mit je 10 |
* HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
Der MAXI-KIT enthält die Puffermenge, die zur gleichzeitigen Auftrennung von zwei Gelen benötigt wird. Der Puffer kann zur späteren Auftrennung
eines zweiten Gels aufgehoben werden.
HINWEIS: Die Fixierlösung und die Antiseren werden mit Ausnahme bei den MAXI-KITS getrennt von den Kits geliefert (SIEHE BENÖTIGTE ABER
NICHT MITGELIEFERTE REAGENZIEN).
FÜR OPTIMALE ERGEBNISSE
Alle Reagenzien eines Kits müssen immer zusammen, gemäß den Instruktionen der Packungsbeilage benutzt werden.
BITTE DIE PACKUNGSBEILAGE SORGFÄLTIG LESEN.
SEBIA ARBEITSANLEITUNG - Deutsch

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
1. AGAROSEGELE
Vorbereitung
Agarosegele sind gebrauchsfertig. Jedes Gel enthält: Agarose, 0,8 g/dl ; Tris-Barbital-Puffer pH 9,1 ± 0,1 ; Zusätze, ungefährlich bei den eingesetzten
Konzentrationen, nötig für die optimale Durchführung.
WARNUNG: Agarosegele enthalten 0,31 % Barbital und 0,34 % Natriumbarbital. Nicht verschlucken. Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat
einholen!
Gebrauch
Hilfsmittel zur elektrophoretischen Trennung der Proteine und Immunfixation.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Gele horizontal in der Originalverpackung bei Raumtemperatur oder gekühlt (2 – 8 °C) lagern. Die Gele sind bis zum Ablauf des Verfallsdatums
auf der Kitschachtel oder auf der Gelverpackung stabil. (Die Pfeile auf der Vorderseite des Kits müssen nach oben zeigen).
Offensichtliche Temperaturschwankungen vermeiden (z.B. nicht in der Nähe eines Fensters oder einer Hitzequelle lagern).
NICHT EINFRIEREN.
Das Gel verwerfen, wenn:
(I) sich Kristalle oder Präzipitate auf der Geloberfläche bilden oder die Geltextur sehr weich wird (dies alles resultiert vom Einfrieren des Gels) ;
(II) bakterielles - oder Pilzwachstum erscheint ;
(III) sich eine abnormale Flüssigkeitsmenge in der Gelschachtel befindet (Absonderungen von Puffer aus dem Gel durch nicht korrekte
Lagerbedingungen).
2. TRIS-BARBITAL-PUFFER
Vorbereitung
Der Inhalt jedes Fläschchens soll auf 1 Liter mit destilliertem Wasser oder deionisiertem Wasser verdünnt werden.
Die Pufferlösung enthält nach der Verdünnung: Tris-Barbital pH 9,2 ± 0,3 ; Natriumazid.
WARNUNG : Jedes Fläschchen mit Puffer-Stammlösung enthält 2,45 % Barbital, 13,73 % Natriumbarbital und 0,13 % Natriumazid. Nicht
Verschlucken. Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen! Beim Entsorgen Kontakt mit Säuren, Blei oder Kupfer vermeiden, da von
diesen bekannt ist, dass sie explosive oder giftige Verbindungen mit Natriumazid bilden. Beim Entsorgen immer mit viel Wasser
nachspülen.
Gebrauch
Elektrophoresepuffer.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Puffer-Stammlösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist für mehrere Jahre, mindestens bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der
Kitschachtel und auf dem Etikett der Pufferfläschchen stabil. Verdünnte Pufferlösung ist bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Flasche für
1 Jahr stabil.
Den Puffer verwerfen, wenn sich sein Aussehen verändert, z. B., wenn er durch mikrobielle Kontamination trübe wird.
3. SÄUREVIOLETTFÄRBUNG
Vorbereitung
Das Fläschchen mit der Säureviolett-Stammlösung muss bis auf 300 ml mit destilliertem oder deionisiertem Wasser verdünnt werden.
Nach Verdünnung enthält die gebrauchsfertige Färbelösung: saure Lösung pH ≈ 2 ; Säureviolett, 0,2 g/dl ; Äthylenglykol, 3,25 % ; Zusätze,
ungefährlich bei den eingesetzten Konzentrationen, nötig für die optimale Durchführung.
WARNUNG: Nicht Verschlucken! Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen!
Gebrauch
Zum Anfärben von Gelen nach der elektrophoretischen Trennung und Immunfixation.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Stammlösung und die verdünnte Färbelösung bei Raumtemperatur oder gekühlt in geschlossenen Behältern lagern, um ein Verdunsten zu
vermeiden. Die Stammlösung ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Fläschchen stabil. Die verdünnte Färbelösung ist für
6 Monate stabil.
4. ENTFÄRBELÖSUNG
Vorbereitung
Jedes Fläschchen der Entfärbe-Stammlösung muss auf 100 Liter mit destilliertem oder deionisiertem Wasser verdünnt werden. Es ist vorteilhaft,
jeweils nur 1 ml der Stammlösung auf 1 Liter zu verdünnen. Die verdünnte Entfärbelösung enthält Zitronensäure, 0,5 g/l.
Gebrauch
Zum Entfärben, d.h. zum Entfernen von überschüssigem Färbemittel und von Hintergrundfärbung aus den Gelen.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Stammlösung der Entfärbelösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Etikett
des Entfärbelösungs-Fläschchen stabil. Die verdünnte Entfärbelösung ist bis zu einer Woche bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Flasche
stabil. Kein Natriumazid zufügen.
Die verdünnte Entfärbelösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z. B., wenn sie durch mikrobielle Kontamination trübe wird.
Um mikrobielles Wachstum in der verdünnten Entfärbelösung bei Lagerung von mehr als einer Woche zu verhindern, sind 5 µl/dl ProClin 300 zu
zufügen.
Die mit ProClin versetzte, gebrauchsfertige Entfärbelösung ist in der verschlossenen Flasche bei Zimmertemperatur oder gekühlt bis zum
Verfallsdatum stabil, das auf der Verpackung oder auf den Flaschenetiketten angegeben ist.
5. VERDÜNNER
Vorbereitung
Die Verdünnungslösung ist gebrauchsfertig. Sie enthält: Puffer pH 7,5 ± 0,3 ; Bromphenolblau ; Zusätze, ungefährlich bei den eingesetzten
Konzentrationen, nötig für die optimale Durchführung.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Gebrauch
Zur Probenverdünnung. Das Bromphenolblau dient als angenehmer Auftragungs- und Migrationsmarker.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Verdünnungslösung bei Raumtemperatur oder gekühlt aufbewahren. Sie ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Etikett des
Verdünnungslösungs-Fläschchens stabil.
Die Verdünnungslösung muss frei von Ausfällungen sein.
6. ANTISEREN (mit Art.-Nr. 3220)
Vorbereitung
Gebrauchsfertig. Alle Antisera sind Säugetier Anti-Human-Gesamtimmunglobuline. Zur leichteren Identifikation der Antiseren und als Hilfe beim
Überwachen ihrer Anwendung sind die Antiseren mit bestimmten ungefährlichen Färbemitteln gefärbt, wie unter Durchführung, Abschnitt II. 6.
angegeben. Die Farben sind auf den Etiketten der Fläschchen angegeben.
Gebrauch
Zur Immunfixation von elektrophoretisch getrennten Proteinen.
HINWEIS: Die Antiseren sind speziell für die Immunfixationsprozedur mit der 1 IF Standard Maske, SEBIA, abgestimmt.
Antiseren können von verschiedenen Tierarten stammen. In keinem Fall dürfen zwei verschiedene Antiseren-Fläschchen gemischt werden, auch wenn
sie die gleiche Spezifität haben. Die Pipettenspitze muss IMMER dann gewechselt werden, wenn das Antiserum-Fläschchen gewechselt wird.
ACHTUNG: Um eine Kontamination der Reagenzien zu vermeiden, dürfen die Verschlußkappen der Gefäße nicht vertauscht werden.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Antiseren gekühlt (2 bis 8 °C) lagern. Sie sind bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf den Etiketten der Antiserenfläschchen stabil.
Die Antiseren verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z. B., wenn sie durch mikrobielle Kontamination trübe wird.
HINWEIS: Während des Transports können die Antiseren ungekühlt (bei 15 – 30 °C) für 15 Tage ohne nachteilige Effekte bei der Anwendung
aufbewahrt werden.
7. FIXIERLÖSUNG (mit Art.-Nr. 3220)
Vorbereitung
Die Fixierlösung ist gebrauchsfertig. Sie enthält Säurelösung ; Zusätze, ungefährlich bei den eingesetzten Konzentrationen, nötig für die optimale
Durchführung. Zur leichteren Identifikation und als Hilfe beim Überwachen der Anwendung ist die Fixierlösung mit einem ungefährlichen Färbemittel
versetzt, dessen Farbe der Farbe auf dem Etikett des Fläschchens entspricht (siehe Durchführung, Abschnitt II, 6).
Gebrauch
Zur Fixierung der elektrophoretisch getrennten Proteine auf der Referenzspur (ELP).
HINWEIS: Die Fixierlösung ist speziell für die Immunfixationsprozedur mit der 1 IF Standard Maske, SEBIA, abgestimmt.
ACHTUNG: Um eine Kontamination der Reagenzien zu vermeiden, dürfen die Verschlußkappen der Gefäße nicht vertauscht werden.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Die Fixierlösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Etikett des Fixierlösungs-
Fläschchen stabil.
Die Fixierlösung muss frei von Ausfällungen sein.
8. APPLIKATOREN
Gebrauch
Applikatoren für den einmaligen Gebrauch zum Probenauftrag.
Lagerung
Die Applikatoren an einem trockenen Platz bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern.
9. FILTERPAPIERE – DÜNN
Gebrauch
Für den einmaligen Gebrauch, um überschüssige Feuchtigkeit von der Geloberfläche vor der Probenaufgabe abzublotten.
Lagerung
dünnes Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.
10. FILTERPAPIERKÄMME
Gebrauch
Filterpapierkämme (einmaliger Gebrauch) zum Abblotten von überschüssiger Fixierlösung und Antiseren von der Geloberfläche nach dem
Immunfixationsschritt.
11. FILTER PAPIERE – DICK
Gebrauch
Dickes Filterpapier (einmaliger Gebrauch) zum Abblotten von nicht ausfällbarem Protein vom Gel nach der Immunfixation.
Lagerung
dickes Filterpapier vor Feuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren.
NICHT MITGELIEFERTE ABER BENÖTIGTE REAGENZIEN
1. ANTISEREN UND FIXIERLÖSUNGSPACKUNG (für Art.-Nr. 3031 Kits)
Die Antiseren und Fixierlösungspackung für die Immunfixation IF, Standard Maske, SEBIA, Bestell-Nr. 4815, enthält 5 Antiserenfläschchen mit Anti-Ig G,
Anti-Ig A, Anti-Ig M, Anti-Kappa (freie und gebundene Leichtketten) und Anti-Lambda (freie und gebundene Leichtketten), jeweils mit 1 ml Inhalt und ein
Fläschchen mit Fixierer, mit 2,5 ml. Sie sind speziell auf die Immunfixationsprozedur mit der 1 IF Standard Maske, SEBIA, abgestimmt.

1.1 ANTISEREN
Siehe vorheriger Abschnitt 6.
1.2 FIXIERLÖSUNG
Siehe vorheriger Abschnitt 7.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
2. PHYSIOLOGISCHE KOCHSALZLÖSUNG
Vorbereitung
Stellen Sie eine 0,15 M (0,9 g/dl) NaCl-Lösung in destilliertem oder deionisiertem Wasser her.
Gebrauch
Zum Waschen der Gele nach der Inkubation mit der Fixierlösung und den Antiseren.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Die Lösung nach drei Monaten verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z. B., wenn sie durch
mikrobielle Kontamination trübe wird. Für längere Lagerperioden, Natriumazid zugeben, 0,1 g/dl.
3. AMIDOSCHWARZ FÄRBUNG (SEBIA, Art.-Nr 4554) (optional)
Vorbereitung
Das Amidoschwarz Färbekonzentrat ist eine hochviskose Flüssigkeit deren Viskosität sich durch Lagerung verändern kann. Die Qualität des
Färbekonzentrats wird durch höhere Viskosität nicht beeinträchtigt.
Bitte beachten Sie die folgende Anleitung zum Herstellen der Färbelösung :
1. 15 ml der Verdünnungslösung zu dem Amidoschwarz Färbekonzentrat geben.
2. Die Färbekonzentrat Flasche fest verschließen.
3. Die Flasche für etwa 5 Sekunden kräftig schütteln.
4. Den Inhalt der Flasche in den Färbecontainer überführen.
5. Schritt 1 – 4 zwei- bis dreimal wiederholen.
6. Die restliche Verdünnungslösung in den Färbecontainer überführen und mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 300 ml Gesamtvolumen
auffüllen.
7. Den Inhalt des Färbecontainers 5 – 10 Minuten mischen.
Im Anschluss daran ist die Färbelösung gebrauchsfertig.
ACHTUNG: Eine unvollständige Lösung des Amidoschwarz Konzentrats kann zu einer Unterbestimmung der Albuminfraktion und/oder zu
Auslöscheffekten der Albuminfraktion führen.
Nach der Verdünnung enthält die Färbelösung: Zitronensäurelösung pH ≈ 2, 4 g/l Amidoschwarz, 6,7 % Ethylenglykol, Additive, ungefährlich bei den
verwendeten Konzentrationen, notwendig für die optimale Wirkung.
WARNUNG: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen!
Gebrauch
Zum Anfärben der Gele nach elektrophoretischer Trennung der Proteine und Immunfixation.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Lagern Sie das Amidoschwarz-Konzentrat und die verdünnte Färbelösung gut verschlossen bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank, um
Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung zu vermeiden. Die Lösung ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem Kit oder auf dem Flaschenetikett)
haltbar. Die verdünnte Färbelösung ist 1 Monat stabil.
Die gebrauchsfertige Färbelösung nicht neben einer Wärmequelle aufbewahren.
Lagern Sie die Amidoschwarz-Verdünnunglösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank. Die Lösung ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf
dem Kit oder auf dem Flaschenetikett) haltbar. NICHT EINFRIEREN!
4. FLUIDIL
Vorbereitung
Fluidil (SEBIA, Art.-Nr. 4587, 1 Fläschchen, 5 ml) gebrauchsfertig.
Gebrauch
Zur Verdünnung von viskösen oder trüben Proben, z. B. Seren die Kryoglobulin oder Kryogel enthalten.
Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall
Lagerung bei Raumtemperatur. Es ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Etikett des Fluidils stabil.
Fluidil muss frei von Ausfällungen sein.
NICHT MITGELIEFERTES BENÖTIGTES EQUIPMENT UND ZUBEHÖR
1. Netzgerät: GD 61 D SEBIA, Art.-Nr. 1300 ; GD 251 D SEBIA, Art.-Nr. 1301 ; MG 300 SEBIA, Art.-Nr. 1302 oder MG 500 SEBIA, Art.-Nr. 1303.
2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, Art.-Nr. 1409, enthält den HYDRAGEL K20 Applikatorträger und die Reagenzauftragsschablone 1 IF.
3. Feuchte Kammer, Art.-Nr. 1270.
4. Elektrophorese Kammer: K20 SEBIA, Art.-Nr. 1400.
5. Behälter und Gelhalters zum Abarbeiten der Gele: HYDRAGEL K20 Zubehörkit SEBIA, Art.-Nr. 1420.
6. Pipetten: 10 µl, 20 µl, 100 µl and 200 µl.
7. Inkubator-Trockner: IS 80 SEBIA, Art.-Nr. 1430.
ANALYSENPROBEN
Probensammlung und Lagerung
Für die Analyse werden frische Serumproben empfohlen. Die Proben sollten gemäß den etablierten Regeln zur Probenentnahme für klinische Proben
gewonnen werden. Die Proben sollten nach der Entnahme so bald wie möglich bei 2 – 8 °C aufbewahrt werden und können für bis zu einer Woche
gelagert werden. Für eine längere Lagerung sollten die Proben eingefroren werden (mindesten für einen Monat stabil).
Das Einfrieren der Proben mit Natriumazid, 0,02 g/dl verbessert die Stabilität beim Lagern.
WICHTIG : Keine Borsäure als Konservierungsmittel verwenden.
Aufgetaute Proben können leichte Auftragsspuren hinterlassen, die durch denaturiertes Protein oder Lipoprotein hervorgerufen werden.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Probenvorbereitung
Die Proben sollten vor der Auftragung verdünnt werden, um einen Prozoneneffekt bei hohen Antigentitern zu vermeiden und gut gemischt werden.
| LAUFSPUR | SERUM (µl) | VERDÜNNER (µl) |
| Ig G Immunfixation Spur | 20 | 100 |
| ELP Referenzspur und alle anderen Immunfixationsspuren | 30 | 60 |
Spezielle Fälle
• Falls die Immunglobulin-Konzentration über 20 g/L liegt (Hypergammaglobulinämie) empfiehlt sich ein zusätzliches Verdünnen der Proben (die ELP
Bahn bleibt dabei ausgenommen) um ein normale Immunglobulin-Konzentration zu erstellen.
• Falls die Immunglobulin-Konzentration unter 5 g/L liegt (Hypogammaglobulinämie) empfiehlt sich ein geringeres Verdünnen der Proben.
• Für die Suche nach freien Leichtketten im Serum oder im Urin, empfehlen wir das Programm „BENCE-JONES“ zu benutzen.
Für die Testdurchführung werden dabei der Testkit IF zusammen mit den Antiseren „freies anti-kappa“ (SEBIA Art. Nr. 4610) und „freies anti-lambda“
(SEBIA Art. Nr. 4611) eingesetzt, oder aber mit dem Testkit HYDRAGEL BENCE-JONES K20 (SEBIA Art. Nr. 3038).
Im Falle der Suche nach freien Leichtketten im Serum verdünnen Sie die Seren bitte vor dem entsprechenden Auftragen in den Bahnen ELP, GAM,
K und L im Verhältnis 1/10 (1 Teil Serum + 9 Teile Verdünner), wobei Sie entweder physiologische Kochsalzlösung oder alternativ den
Probenverdünner für die Immunfixation als Verdünner benutzen - letzterer muss allerdings selbst 1/4 vorverdünnt werden (1 Teil Probenverdünner
IF + 3 Teile destilliertes oder entmineralisiertes Wasser). Eine zweite Verdünnung im Verhältnis 1/3 (1 Teil Serum + 3 Teile Verdünner) ist notwendig
für die Bahnen die mit den Anti-Seren „freies anti-kappa“ und „freies anti-lambda“ beschickt werden.
Falls die Immunglobulin-Konzentration unter 5 g/L liegt empfiehlt sich für die Suche nach freien Leichtketten ebenfalls geringeres Verdünnen, d.h.
also z.B. 1/5 für die Bahnen ELP, GAM, K und L, sowie1/2 für die Bahnen freies-K und freies-L.
• Gekühlte oder eingefrorene Seren (insbesondere diejenigen, die Kryoglobuline oder Kryogel enthalten) können viskös oder trübe werden. Solche
Seren können Auftragungsprobleme durch eine behinderte Diffusion durch die Applikatorzähne zeigen. In solchen Fällen 25 µl Fluidil zu 75 µl Serum
geben und für 15 Sekunden mischen. Anschließend mit der Standardprozedur fortfahren.
• Einige monoklonale Proteine können polymerisieren woraus sich eine „monoklonale Fraktion” bildet, die in allen immunfixierten Spuren erscheint.
In diesem Falle (i) eine 1 %ige Beta-Mercaptoethanollösung in Fluidil ansetzen, (ii) 25 µl des reduzierenden Reagenz zu 75 µl unverdünntem Serum
geben, (iii) mischen und mindestens 15 Minuten warten (maximal 30 Minuten) und anschließend mit der Standardprozedur fortfahren.
• Für eine Ig D und/oder Ig E Immunfixation sollte die Probe in der gleichen Verdünnung wie für die Spuren Kappa und Lambda (frei und gebunden)
eingesetzt werden.
Nicht verwendbare Proben
• Keine Plasmaproben verwenden. Fibrinogen erzeugt in der Referenzspur bei den Gammaglobulinen eine Bande, die für ein monoklonales Protein
gehalten werden könnte.
• Keine hämolysierten Proben verwenden.
PROZEDUR
I. MIGRATIONSSCHRITT
1. Den HYDRAGEL K20 Applikatorträger auf eine flache Oberfläche legen (Abb. 1) und den Applikatorträger hochklappen.
2. 120 µl destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser auf das untere Drittel des Rahmens geben, der auf dem HYDRAGEL K20
Applikatorträger aufgedruckt ist.
3. Das HYDRAGEL Agarosegel auspacken.
4. Ein dünnes Filterpapier vorsichtig und gleichmäßig auf die Oberfläche legen um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Das Filterpapier
sofort wieder entfernen.
WARNUNG: Das Filterpapier nicht zu lange mit dem Gel in Kontakt lassen, um ein Austrocknen des Gels zu vermeiden.
5. Das Gel (Gelseite nach oben) mit seinem Rand gegen den Halter am Boden des aufgedruckten Rahmens (Abb. 2) legen.
6. Das Gel biegen und auf den Wasservorrat legen (Abb. 2). Sicherstellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, dass sich Wasser
unter dem gesamten Gel befindet, und dass das Gel sich in einer Linie mit dem aufgedruckten Rahmen befindet.
7. Den Applikatorträger bis zur mittleren Position (mit hochgestelltem Hebel) herabsenken.
8. Einen Applikator so auf eine flache Oberfläche legen, dass die Nummern (Vertiefungen) nach oben zeigen (Abb. 3).
9. In die Vertiefungen des Applikators je 10 µl korrekt verdünntes Serum wie folgt auftragen: Den Applikator innerhalb von 2 Minuten beladen.
| IMMUNFIXATIONSSPUR | VERTIEFUNGSNUMMER |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5
| |
L | 6 |
- Den Applikator ohne Verzögerung verwenden.
- Bei späterem Gebrauch (bis zu 8 Stunden) den Applikator in der feuchten Kammer mit den Zähnen nach oben platzieren (die Applikatoren
am Zahnschutzrahmen anfassen). Die gesamte Kammer muss gekühlt aufbewahrt werden und das Gel soll erst unmittelbar vor Gebrauch
auf dem HYDRAGEL K20 Applikatorträger eingesetzt werden.
Für weitere Details siehe: Bedienungsanleitung „Feuchte-Kammer“.
10. Den Schutzrahmen für die Applikatorzähne abnehmen.
11. Den Applikator mit den Proben in die Position 6 auf dem Applikatorträger einlegen.
WICHTIG: Die aufgedruckten Nummern auf den Applikatoren müssen zum Bediener zeigen (Abb. 4).
12. Den Applikatorträger durch Drehen des Hebels absenken, sodass der Applikator die Geloberfläche berührt. DEN TRÄGER NICHT
VOLLSTÄNDIG HERUNTERDRÜCKEN.
13. Nach einer Minute den Applikator durch Drehen des Hebels hochfahren und verwerfen.
14. Das Gel in eine passende Elektrophoresekammer mit den Proben zur kathodischen Seite überführen. Beim Verwenden der SEBIA K20
Kammer, das HYDRAGEL auf die Brücke mit der Gelseite nach unten platzieren. Das Gel sollte an jeder Seite ungefähr 1 cm in den Puffer
eintauchen.
Für weitere Details siehe Bedienungsanleitung der Kammer K20.

15. Die Kammer mit dem Netzgerät verbinden.
| MIGRATIONS-BEDINGUNGEN | SEBIA K20 |
| Puffervolumen pro Kammer | 150 ml |
| Gesamtpuffervolumen | 300 ml |
| Migrationszeit | 20 Minuten |
| Konstante Spannung | 100 V
| |
Einschaltstrom (ein Gel) | 16 ± 3 mA |
16. Nach der Migration, den Stromfluss in der Kammer unterbrechen und das Gel entfernen.
Die blaue Markierung muss ungefähr 5 mm von der anodischen Seite des aufgedruckten Rahmens entfernt sein.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
II. IMMUNFIXATIONSSCHRITT
1. Den HYDRAGEL K20 Applikator auf eine ebene Fläche legen.
2. 120 µl destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser auf das untere Drittel des Rahmens geben, der auf dem HYDRAGEL K20
Applikatorträger aufgedruckt ist.
3. Das Gel (Gelseite nach oben) mit seinem Rand gegen den Halter am Boden des aufgedruckten Rahmens (Abb. 2) positionieren.
4. Das Gel biegen und auf den Wasservorrat legen (Abb. 2). Sicherstellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, dass sich Wasser
unter dem gesamten Gel befindet, und dass das Gel sich in einer Linie mit dem aufgedruckten Rahmen befindet.
5. Die Auftragungsschablone 1 IF wie folgt auf der Schablonenführung aufsetzen (Abb. 5):
- Die Führung für die Auftragungsschablone auf den Haltestiften positionieren.
- Die Verschlussklappe auf die Schablone halten und die Schablone auf das Gel absenken.
- Die Spuren der Schablonen müssen perfekt an den Abdrücken ausgerichtet werden, die durch die Applikatorzähne auf dem Gel
zurückgelassen werden.
6. Reagenzien wie folgt auftragen:
| SPUR | VOLUMEN (µl) | REAGENZ | FARBE |
| ELP | 40 | Fixierlösung | gelb |
| G | 25 | Antiserum gegen Gamma-Schwerketten | rosa |
| A | 25 | Antiserum gegen Alpha-Schwerketten | dunkelblau |
| M | 25 | Antiserum gegen Mu-Schwerketten | gelbgrün |
| K | 25 | Antiserum gegen Kappa-Leichtketten (freie und gebundene) | hellgrün
| |
L | 25 | Antiserum gegen Lambda-Leichtketten (freie und gebundene) | hellblau |
HINWEIS: Um Verwechslungen zu vermeiden sind die Farben der Reagenzien auf den Etiketten der Fläschchen und auf den Vertiefungen
der Auftragschablone abgebildet.
- Das Reagenz aufnehmen ohne jegliche Luftblasen in der Pipettenspitze einzuschließen.
- Die Reagenzien auftragen (Abb. 6):
- Die Pipette senkrecht halten und die Pipettenspitze leicht auf dem Boden der Vertiefung aufsetzen.
- Vorsichtig das Reagenz kontinuierlich ohne Luftblasen zu erzeugen unter die Schablone pipettieren.
7. Für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
III. ENTFERNEN DER REAGENZIEN
1. Den Überschuss der Reagenzien mit dem Filterpapierkamm entfernen (Abb. 7).
2. Die Reagenzien innerhalb von 30 Sekunden entfernen.
- Den Kamm im Winkel von 30° am unteren Ende der Schablonenrinnen einsetzen, so dass die Zähne die senkrechte Seite, dem Anwender
abgewandt, berühren.
- Mit den Zähnen vorsichtig die Flüssigkeit berühren, indem jeder Kamm bis zu einem Winkel von 45° schräg gestellt wird und den Zähnen
das Absaugen der Flüssigkeit ermöglicht wird (Abb. 8).
WICHTIG: Der Kamm muss schräggestellt bleiben (45°). Wenn er aufgerichtet wird kann dies das Gel beschädigen.
IV. ENTFERNEN DER NICHT AUSGEFÄLLTEN PROTEINE
1. Den Kamm entfernen.
2. Überprüfen ob die Reagenzien gut absorbiert wurden, was angezeigt wird durch:
- Die Abwesenheit von Reagenzien auf dem Gel.
- Vollständige Färbung der Zähne.
Wenn die Reagenzabsorption unvollständig ist, den gleichen Filter noch einmal (in der gleichen Position) einsetzen und erneut von Hand
absaugen.
3. Fassen Sie die Reagenzauftragsschablone an der Lasche an, heben Sie sie an und entfernen Sie sie!
4. Ein dickes Filterpapier für 4 Minuten auf das Gel legen. Das dicke Filterpapier muss gleichmäßigen Kontakt mit dem Gel haben.
ACHTUNG : Das dicke Filterpapier sollte fest auf die gesamte Geloberfläche angedrückt werden, um eine optimale Anhaftung an das
Gel zu ermöglichen.
5. Das Filterpapier entfernen. Das Gel senkrecht in physiologischer Kochsalzlösung für 5 Minuten waschen. Das Gel so in den Gelhalter
einlegen, daß die ELP-Spur des Gels im Gelhalter unten liegt.
6. Das Gel auf eine ebene Fläche legen.
7. Ein neues dickes Filterpapier auf das Gel legen. Das dicke Filterpapier muss gleichmäßigen Kontakt mit dem Gel haben.
8. Das Gel im Inkubator-Trockner IS80 bei 80 °C trocknen, bis das Filterpapier vollständig getrocknet ist (ungefähr 7 Minuten), oder ohne
Inkubator-Trockner IS80: das Gel mit dem gleichmäßig angedrückten Filterpapier für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, das
Filterpapier abnehmen und anschließend das Gel in einem Warmluft-Trockner vollständig trocknen.
9. Die Auftragschablone mit einer kleinen Bürste reinigen (z. B. Zahnbürste). KEINEN ALKOHOHL ODER LÖSUNGSMITTEL EINSETZEN. Vor
erneutem Gebrauch sicherstellen, dass die Schablone vollständig trocken ist ; verbliebene Wassertropfen aus den Vertiefungen entfernen,
indem man sie vorsichtig auf Saugpapier ausschlägt.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
V. FÄRBE- UND ENTFÄRBESCHRITTE
1. Nach dem Trocknen das vollständig getrocknete Gel für 3 Minuten senkrecht in physiologische Kochsalzlösung eintauchen.
2. Für 4 Minuten das Gel senkrecht in Färbelösung eintauchen.
3. Das Gel in drei aufeinanderfolgenden Bädern mit Entfärbelösung entfärben bis der Hintergrund vollständig farblos ist.
4. Das Gel in einem 80 °C warmen Luftstrom trocknen. Bei Bedarf die Rückseite des Gels (verstärkte Seite) mit einem feuchten Saugpapier
reinigen.
ERGEBNISSE
Interpretation
Abwesenheit von monoklonalen Komponenten
• Eine normale Serumprobe zeigt eine leicht diffuse Färbung von polyklonalen Immunglobulinen in allen Spuren.
• Eine Hypergammaglobulinämie wird durch eine stärkere Färbung, durch diffuse Banden und die Abwesenheit von jeglichen scharfen Banden
gekennzeichnet.
Anwesenheit von monoklonalen Komponenten
• Die Anwesenheit von monoklonalem Protein (Gammopathie) wird durch eine monoklonale Bande charakterisiert, die durch eine der Antiseren gegen
Schwerketten (Gamma, Alpha oder Mu) oder aber mit Antiseren gegen Kappa- oder Lambda-Leichtketten nachgewiesen werden. Die
nachgewiesene monoklonale Bande, typischerweise scharf und abgegrenzt, muss bei der gleichen Migrationdistanz positioniert sein, wie die
verdächtige monoklonale Bande, die in der Referenzspur erscheint (ELP).
• Die Abwesenheit einer Reaktion mit einem Antiserum gegen die Schwerketten und die Reaktion in einer der beiden Leichtkettenspuren kann auf
folgendes hindeuten:
a)eine sehr seltene Ig D oder Ig E Gammopathie, zu bestätigen mit Anti-Delta oder Anti-Epsilon Antiserum.
b)eine Leichtketten-Gammopathie, zu bestätigen mit dem Antiserum Anti-Kappa frei oder Anti-Lambda frei.
• Das Ausbleiben einer positiven Reaktion bei sämtlichen Antiseren gegen Leichtketten, während ein Antiserum gegen Schwerketten reagiert, kann
eine sehr seltene Gammopathie anzeigen (Gamma, Alpha oder Mu).
Anwesenheit von zwei oder mehr monoklonalen Komponenten
In seltenen Fällen, proliferieren mehrere B-Zellklone, was durch mehrere monoklonale Banden mittels Immunfixation angezeigt wird:
• Eine biklonale Gammopathie wird durch die Anwesenheit von zwei Banden bei den Schwerketten (identisch oder verschieden) und zwei Banden
bei den Leichtketten (identisch oder verschieden) charakterisiert.
• Polymerisierte Immunglobuline werden durch mehrere Banden von Schwerketten desselben Typs und eine Bande desselben Typs von Leichtketten
charakterisiert. Um die Anwesenheit einer einzelnen monoklonalen Abnormalie zu bestätigen, ist eine Depolymerisation mit Beta-Mercaptoethanol
und eine Wiederholung der Immunfixation notwendig (siehe "PROBEN FÜR DIE ANALYSE").
• Eine oligoklonale Gammopathie wird durch die Anwesenheit mehrerer Banden von Schwerketten eines Typs oder von mehreren Typen und von
Leichtketten eines Typs oder mehrerer Typen gekennzeichnet.
Spezielle Fälle
• Wenn eine monoklonale Bande bei der Serum-Elektrophorese (ELP Referenzspur) beobachtet wird, aber bei der Immunfixation nicht bestätigt
werden kann, kommt als erste Ursache Fibrinogen (Plasmaprobe) in Frage.
• Wenn ein monoklonaler Bandentyp in allen Immunfixationsspuren auftritt, kann Kryoglobulin oder polymerisiertes Ig M als Ursache vermutet werden.
Die Probe sollte mit einem reduzierenden Agens depolymerisiert und die Prozedur wiederholt werden (siehe ”PROBEN FÜR DIE ANALYSE").
Limitationen
Siehe PROBEN FÜR DIE ANALYSE.
Die Antiseren für die Verwendung mit der Standard Maske sind speziell auf diese abgestimmt. Die Verwendung von anderen Antiseren kann Ihre
Ergebnisse beeinträchtigen.
Es wird darauf hingewiesen, dass aufgrund der derzeitigen Kenntnis des zugrundeliegenden Analysenprinzips (Theorie der Zonenelektrophorese,
Auflösungsvermögen und Sensitivität) keine Garantie für ein 100 % Erkennen aller monoklonalen Komponenten gewährt werden kann.
Fehlersuche
Bitte rufen Sie den Technischen Service von SEBIA an, wenn der Test nicht richtig funktioniert, obwohl die Anweisungen zur Vorbereitung, Lagerung
und zur Durchführung sorgfältig beachtet wurden.
Datensicherheitsblätter sowie Informationen zur Abfallentsorgung sind bei SEBIA GmbH, Fulda zu erfragen.
CHARAKTERISTISCHE DATEN
Es werden Standard-Materialien, -Probenvorbereitungen und –Prozeduren eingesetzt. Alle Elektrophoreogramme werden visuell ausgewertet.
Reproduzierbarkeit innerhalb eines Laufs und Spezifizität
Die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Gels wurde mit zwei pathologischen Serumproben mit niedrigem und hohem Spiegel von monoklonalen
Komponenten und einer Probe mit zwei monoklonalen Komponenten demonstriert. Jede Probe wurde auf zwei Gelen auf zwei Spuren getestet und
mit Säureviolett gefärbt.
Alle getesteten Proben ergaben identische Resultate auf den zwei Laufspuren mit den typischen Mustern, wie für den entsprechenden Probentyp
erwartet, mit monoklonalen Banden, die bei sämtlichen Proben mit Immunfixation nachgewiesen wurden.
Reproduzierbarkeit und Spezifität bei unterschiedlichen Gelen
Die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Gelen wurde mit 2 pathologischen Serumproben, mit niedrigem und hohem Spiegel von
monoklonalen Komponenten demonstriert. Jede Probe wurde auf 20 Gelen auf jeweils zwei Spuren getestet und mit Säureviolett gefärbt.
Alle getesteten Proben ergaben identische Ergebnisse auf den zwei Laufspuren mit den typischen Mustern wie für den entsprechenden Probentyp
erwartet, mit einer monoklonalen Bande, die bei sämtlichen Serumproben mit Immunfixation nachgewiesen wurde.
Genauigkeit
Zweiunddreißig unterschiedliche pathologische Proben wurden mit dem HYDRAGEL IF K20 Kit und einem weiteren kommerziell erhältlichen
Agarosegel-Immunfixationssystem getestet. Bei der HYDRAGEL IF K20 Prozedur wurde die Säureviolettfärbung verwendet. Mit jedem System
wurden identische Banden bei allen pathologischen Proben verwendet.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Sensitivität
Reihenverdünnungen wurden mit 3 pathologischen Serumproben hergestellt, die alle monoklonale Komponenten zeigten und mit der HYDRAGEL IF
K20 Prozedur analysiert. Hiebei wurden beide Färbeprozeduren, Säureviolett und Amidoschwarz, eingesetzt.
Diese Ergebnisse werden unten zusammengefasst.
| MONOKLONALE KOMPONENTE | NACHWEISGRENZE (g/L) |
PROBEN-NR. TYP KONZ. (g/L) SÄUREVIOLETT AMIDOSCHWARZ | | | | | |
1 | | Alpha | 5,33 | 0,25 | 0,25 |
1 | | Kappa | | 0,25 | 0,25 |
2 | | Mu | 10,9 | 0,12 | 0,12 |
2 | | Lambda | | 0,25 | 0,25 |
3 | | Gamma | 17,2 | 0,25 | 0,50
| |
3 | Lambda | | 0,12 | 0,12 |
LITERATUR
Zur Interpretation von Immunfixationsmustern siehe auch:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd
ed., 1994, 397 pp.

GEBRUIKSINDICATIE
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
De HYDRAGEL IF K20 Kit is ontwikkeld voor de detectie van monoklonale proteïnen in menselijke serum door middel van immunofixatie-elektroforese
op een alkalisch gebufferde (pH 9.1) agarose-gels. De serumproteïnen ondergaan elektroforese en immunofixatie door antisera met verschillende
specificiteiten: anti-gamma (Ig G), alfa (Ig A) en mu (Ig M) zware ketens en anti-kappa en lambda (vrij en gebonden) lichte ketens. Na immunofixatie
worden de geprecipiteerde proteïnen met zuurviolet gekleurd. De overtollige kleurstof wordt met een zure oplossing verwijderd.
Iedere gel in de HYDRAGEL IF K20 Kit is bedoeld voor de analyse van 1 monster. Om aan de voorkeuren van verschillende gebruikers te voldoen
zijn de HYDRAGEL IF K20 kits zowel beschikbaar mèt als zonder antisera, en met of zonder zuurviolet.
Voor gebruik bij in vitro diagnostiek.
PRINCIPE VAN DE TEST
Abnormale banden in de elektroforetische patronen van serumproteïnen, en dan vooral die bij de bètaglobulinen- en gammaglobulinezones, kunnen
altijd monoklonaal zijn en zodoende een indicatie geven voor gammopathieën. Om deze banden te kunnen identificeren wordt de techniek van de
immunofixatie toegepast.
Immunofixatie-elektroforese is een eenvoudige techniek waarbij een proteïne na elektroforese in situ wordt gebonden door de vorming van een
onoplosbaar complex met zijn antilichaam.
Het wordt in vier fasen uitgevoerd:
1. Separatie van proteïnen door elektroforese op agarose gel.
2. Fixatie en immunoprecipitatie van de proteïnen na elektroforese: de fixeeroplossing en de antisera worden direct op het geloppervlak aangebracht
op de juiste elektroforetische migratiesporen. De fixeeroplossing en de antisera trekken in de gel terwijl zij respectievelijk al de proteïnen en de
corresponderende antigenen precipiteren.
3. De niet geprecipiteerde, oplosbare proteïnen worden door middel van deppen en spoelen van de gel verwijderd. De geprecipiteerde proteïnen
blijven vastzitten in de gel.
4. De geprecipiteerde proteïnen worden door middel van kleuring zichtbaar gemaakt. De immuno-geprecipiteerde banden worden vervolgens
vergeleken met de corresponderende abnormale banden die werden waargenomen in het elektroforetische patroon van het serummonster.
Om detectie en identificatie van de verdachte monoklonale componenten mogelijk te maken ondergaan de monsters simultaan in zes spleten
elektroforese. Na de elektroforese dient één spleet (ELP) als referentie, en deze geeft het elektroforetisch patroon van de monsterproteïnen te zien.
De overige vijf spleten maken de identificatie van de monoklonale component(en) uit hun reactie(s), of het ontbreken daarvan, met antisera tegen
gamma (Ig G), alfa (Ig A) en mu (Ig M) zware ketens en tegen vrije en gebonden lichte ketens kappa en lambda mogelijk.
Deze eenvoudige en snelle techniek levert een helder en gemakkelijk te interpreteren beeld op.
DE HYDRAGEL IF K20 KITS BEVATTEN DE VOLGENDE REAGENTIA EN ANDERE MATERIALEN
| BESTANDDELEN | NR. 3031 | NR. 3220* |
| Agarose-gels (gebruiksklaar) | 10 gels | 100 gels |
| Tris-barbital buffer (concentraat) | 3 flesjes, 75 ml elk | 30 flesjes, 75 ml elk |
| Zuurviolet kleurstof (concentraat) | 1 flesje, 75 ml elk | 3 flesjes, 75 ml elk |
| Ontkleuringoplossing (concentraat) | 1 flesje, 100 ml elk | 1 flesje, 100 ml elk |
| Verdunner (gebruiksklaar) | 1 flesje, 3,2 ml elk | 1 flesje, 32 ml elk |
| Fixeeroplossing (gebruiksklaar) | | 1 flesje, 14,4 ml elk |
| Dierlijke immuunglobulinen anti-menselijk gamma, | | |
| zware ketens (gebruiksklaar) | | 1 flesje, 2,5 ml elk |
| Dierlijke immuunglobulinen anti-menselijk alfa, | | |
| zware ketens (gebruiksklaar) | | 1 flesje, 2,5 ml elk |
| Dierlijke immuunglobulinen anti-menselijk mu, | | |
| zware ketens (gebruiksklaar) | | 1 flesje, 2,5 ml elk |
| Dierlijke immuunglobulinen anti-menselijk | | |
| kappa (vrij en gebonden), lichte ketens (gebruiksklaar) | | 1 flesje, 2,5 ml elk |
| Dierlijke immuunglobulinen anti-menselijk | | |
| lambda (vrij en gebonden), lichte ketens (gebruiksklaar) | | 1 flesje, 2,5 ml elk |
| Applicatoren met 6 tanden (gebruiksklaar) | 1 pakje van 10 stuks | 10 pakje van 10 stuks |
| Filterpapier – dun | 1 pakje van 10 stuks | 10 pakje van 10 stuks |
| Filterpapier – kam | 1 pakje van 10 stuks | 10 pakje van 10 stuks
|
|
Filterpapier – dik | 2 pakje van 10 stuks | 20 pakje van 10 stuks |
* HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
De hoeveelheid buffer in de MAXI-KIT is afgestemd op twee migraties. Bewaar de buffer voor gebruik op twee gels.
OPMERKING: De fixeeroplossing en de antisera worden los van de kits geleverd, behalve bij de MAXI-KIT (zie BENODIGDE MAAR NIET
BIJGELEVERDE REAGENTIA).
VOOR OPTIMALE RESULTATEN
Onderdelen uit dezelfde kit dienen altijd samen te worden gebruikt en in overeenstemming met de instructies op de bijsluiter.
LEES DE GEBRUIKSAANWIJZING ALTIJD ZORGVULDIG DOOR.
1. AGAROSE-GELS
Voorbereiding
De agarose-gels zijn klaar voor gebruik. Iedere gel bevat: agarose, 8 g/l ; tris-barbital buffer, pH 9,1 ± 0,1 ; additieven in de gebruikte concentraties
niet schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.
SEBIA INSTRUCTIEBLAD - Nederlands

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
WAARSCHUWING: De agarosegels bevatten 0,31 % barbital en 0,34 % natriumbarbital. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname
dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden!
Gebruik
Draagmedium voor elektroforese en immunofixatie van proteïnen.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De gels moeten horizontaal worden opgeslagen in de originele beschermende verpakking bij kamertemperatuur ( 15 tot 30 °C) of gekoeld (2 tot 8 °C)
bewaard worden. (De pijl op de voorzijde van de verpakking moet naar boven wijzen.) NIET INVRIEZEN. De gels zijn stabiel tot de
houdbaarheidsdatum die op de verpakking, of op het verpakkingslabel van de gel, staat aangegeven. Vermijdt opslag dichtbij een raam of een
warmtebron. Vermijdt ook grotere variaties in temperatuur tijdens de opslag.
Verwijder de gel wanneer:
(I) zich kristallen of neerslag op het oppervlak van de gel vormen, of wanneer de textuur van de oppervlakte van de gel erg zacht wordt (dit geeft aan
dat de gel bevroren is geweest) ;
(II) er bacteriële of schimmelgroei wordt waargenomen ;
(III) er een abnormale hoeveelheid vloeistof in de geldoos aanwezig is (wijst erop dat afscheiding van buffer uit de gel heeft plaatsgevonden tijdens
onjuiste opslagomstandigheden).
2. TRIS-BARBITAL BUFFER
Voorbereiding
Elk flesje van het bufferconcentraat wordt verdund tot 1 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Na verdunning bevat de oplossing: tris-barbital
buffer, pH 9,2 ± 0,3 ; natriumazide.
WAARSCHUWING: Het bufferconcentraat bevat 2,45 % barbital, 13,73 % natriumbarbital en 0,13 % natriumazide. Niet voor inwendig gebruik!
Bij abusievelijke inname dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Vermijd contact met zuren, lood of koper aangezien deze
stoffen explosieve of toxische verbindingen met natriumazide aangaan. Na gebruik altijd met ruim water afspoelen.
Gebruik
Elektroforese buffer.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Het bufferconcentraat bij kamertemperatuur of gekoeld opslaan. Het blijft gedurende enige jaren stabiel, ten minste tot de houdbaarheidsdatum zoals
aangegeven op de verpakking of de labels op de flesjes met buffer. De verdunde bufferoplossing is gedurende een jaar stabiel in een gesloten fles,
op kamertemperatuur.
Verwijder de verdunde buffer zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting met microben.
3. ZURE VIOLET KLEURSTOF
Voorbereiding
Elk flesje zuurviolet kleurstofconcentraat wordt verdund tot 300 ml met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Na verdunning bevat de werkzame
kleuringoplossing: zuuroplossing pH ≈ 2 ; zuurviolet, 2 g/l ; ethyleenglycol, 3.25 % ; additieven, in de gebruikte concentraties niet schadelijke
toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.
WAARSCHUWING : Inname is schadelijk.
Gebruik
Voor het kleuren van gels na elektroforetische proteïnescheiding en immunofixatie.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Zowel de concentraat- als de verdunde kleuroplossingen bij kamertemperatuur of gekoeld in afgesloten flessen opslaan om verdamping te voorkomen.
De concentraat-kleurstofoplossing blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of de labels op de flesjes met
kleuroplossing. De werkzame kleuroplossing is gedurende 6 maanden stabiel.
4. ONTKLEURINGSOPLOSSING
Voorbereiding
Elk flesje van het ontkleuringconcentraat wordt verdund tot 100 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Het is praktisch een verdunning van
een klein deel van het concentraat aan te maken, bijvoorbeeld 1 ml concentraat te verdunnen tot 1 liter. Na verdunning bevat de ontkleuringoplossing:
citroenzuur, 0,5 g/l.
Gebruik
Voor het ontkleuren van gels, d.w.z. het verwijderen van overtollige en achtergrondkleurstof van de gels.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De concentraat-ontkleuringsoplossing is stabiel bij kamertemperatuur of gekoeld tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of
de labels op de flesjes met ontkleuringoplossing. De werkzame ontkleuringoplossing is, in een afgesloten fles en bij kamertemperatuur, gedurende
1 week stabiel.
Verwijder de verdunde ontkleuringoplossing zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting
met microben. Om verspreiding van microben in de ontkleuringoplossing te voorkomen tijdens opslag gedurende een periode langer dan een week
wordt 50 µl/l ProClin 300 toegevoegd.
De verdunde, ProClin bevattende ontkleuringsoplossing blijft, indien bewaard in een afgesloten fles bij kamertemperatuur of in de koeling, stabiel tot
aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes ontkleuringsoplossing.
5. VERDUNNER
Voorbereiding
De verdunner is klaar voor gebruik. Hij bevat: alkalische buffer pH 7,5 ± 0,3 ; bromofenol blauw en in de gebruikte concentraties niet schadelijke
toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking.
Gebruik
Voor de verdunning van monsters. Het bromofenol blauw dient voor gemakkelijk aanbrengen en voor het toetsen van de kwaliteit van de migratie.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De verdunner bij kamertemperatuur of gekoeld opslaan. Hij blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of de labels
op de flesjes verdunner.
De verdunner mag geen precipitaat bevatten.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
6. ANTISERA (bij prod. nr. 3220)
Voorbereiding
De antisera zijn klaar voor gebruik. Alle antisera zijn dierlijke anti-menselijke totaal-immuunglobulinen. Ter vereenvoudiging van de identificatie van de
antisera en als hulpmiddel bij het volgen van hun toepassing worden de antisera met een kenmerkende, niet-gevaarlijke kleurstof gekleurd zoals
beschreven onder 'Procedure, Hoofdstuk II, 6'. De labels van de flesjes hebben dezelfde kleur.
Als het antiserum een lichte troebelheid vertoond dan laat u het flesje met antiserum bij kamertemperatuur gedurende tenminste 10 minuten staan.
Dit zou voldoende moeten zijn om de oplossing helder te laten worden. Als de troebelheid echter niet oplost, dan heeft dit geen invloed op de
immunologische reacties.
Gebruik
Voor de immunoprecipitatie van elektroforetisch gescheiden proteïnen.
OPMERKING: De antisera zijn specifiek voor de immunofixatieprocedure met de 1 IF maskers, SEBIA.
De antisera kunnen afkomstig zijn van verschillende diersoorten. Het is dan ook absoluut noodzakelijk om verschillende flesjes antisera goed
gescheiden te houden, en zelfs flesjes met dezelfde specificiteit niet te vermengen. Zorg ervoor dat u ALTIJD het mondstuk van de pipet vervangt
wanneer u van flesje antiserum wisselt.
BELANGRIJK: Opdat de verschillende reagentia niet met elkaar in contact zouden komen, moet men na gebruik de dop terug op de respectievelijke
flacon zetten.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De antisera worden gekoeld (2 tot 8 °C) bewaard. Zij zijn stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of de labels op de
flesjes met antiserum.
Verwijder de antisera zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als ze troebel worden als gevolg van besmetting met microben.
OPMERKING: Tijdens transport kunnen de antisera gedurende 15 dagen ongekoeld bewaard worden (bij 15 - 30 °C) gedurende 15 dagen zonder dat
er nadelige gevolgen optreden voor de kwaliteit van de test.
7. FIXEEROPLOSSING (bij prod. nr. 3220)
Voorbereiding
De fixeeroplossing is klaar voor gebruik. Het bevat: azijnzuur en in de gebruikte concentraties niet schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor
een optimale werking. Vanwege vereenvoudigde identificatie en als hulpmiddel bij het volgen van de toepassing wordt de fixeeroplossing met een
ongevaarlijke kleurstof gekleurd. Deze kleurstof komt overeen met de kleur op het etiket van het flesje (zie Procedure, Hoofdstuk II, 6).
Gebruik
Voor het fixeren van elektroforetisch gescheiden proteïnen in de referentiespleet (ELP).
OPMERKING : De fixeeroplossing is specifiek voor de immunofixatieprocedure met de 1 IF maskers, SEBIA.
BELANGRIJK: Opdat de verschillende reagentia niet met elkaar in contact zouden komen, moet men na gebruik de dop terug op de respectievelijke
flacon zetten.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
De fixeeroplossing bij kamertemperatuur of gekoeld opslaan. De fixeeroplossing blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de
verpakking of de labels op de flesjes fixeeroplossing.
De fixeeroplossing mag geen precipitaat bevatten.
8. MONSTER-MALPLAATJES
Gebruik
Voorgesneden strips, voor eenmalig gebruik, voor het aanbrengen van het monster op de gel.
Opslag
Bewaar deze malplaatjes op een droge plaats, gekoeld dan wel bij kamertemperatuur.
9. FILTERPAPIER - DUN
Gebruik
Velletjes filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het absorberen van overtollige vloeistof van het oppervlak van de gel na elektroforese, het
verwijderen van overtollig reagens na incubatie en het absorberen van niet-geprecipiteerde proteïnen na de immunofixatiefase.
Opslag
Bewaar de dunne velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.
10. FILTERPAPIERSTRIPS - KAM
Gebruik
Voorgesneden, dik absorberende papieren kammen, voor eenmalig gebruik, voor het absorberen van overtollige fixeervloeistof en antiserum van het
oppervlak van de gel na de immunofixatiefase.
11. FILTERPAPIER - DIK
Gebruik
Velletjes filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het opdeppen van niet-geprecipiteerde proteïnen na de immunofixatiefase.
Opslag
Bewaar de dikke velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling.
BENODIGDE, NIET BIJGELEVERDE REAGENTIA
1. PAKKET MET ANTISERA EN FIXEEROPLOSSING (voor de 3031 kits)
Het pakket antisera en fixeeroplossing voor immunofixatie IF, Standaard masker, SEBIA, PN 4815, bevat 5 antisera flesjes, anti-Ig G, anti-Ig A, anti-
Ig M, anti-Kappa (vrije en gebonden lichte ketens) en anti-Lambda (vrije en gebonden lichte ketens), 1 ml elk, en 1 flesje met fixeeroplossing, 2,5 ml.
Zij zijn specifiek voor de immunofixatieprocedure met de 1 IF maskers van SEBIA.

1.1 ANTISERA
Zie vorig hoofdstuk 6.
1.2 FIXEEROPLOSSING
Zie vorig hoofdstuk 7.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
2. FYSIOLOGISCHE ZOUTOPLOSSING
Voorbereiding
Maak een 0,15 M (9 g/l) NaCl oplossing met gedestilleerd of gedeïoniseerd water.
Gebruik
Voor het spoelen van gels na incubatie met fixeeroplossing en antisera.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Bij kamertemperatuur of gekoeld opslaan. Na 3 maanden verwijderen, of wanneer er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld troebeling als
gevolg van besmetting met microben. Voor langere perioden van opslag moet natriumazide worden toegevoegd, 1 g/l.
3. AMIDOZWART KLEURSTOF (SEBIA, productnummer 4554) (optioneel)
Voorbereiding
De geconcentreerde amidozwart kleuringoplossing is een viskeuze oplossing die kan geleren. De integriteit van de basisoplossing wordt niet beïnvloed
door de toename van de viscositeit of de hardwording.
In alle gevallen adviseren wij u de hieronder beschreven procedure te volgen om de perfecte kleuring te behouden:
1. Voeg 15 ml verdunningsmiddel aan het flesje met geconcerteerd amidozwart toe.
2. Sluit het flesje zorgvuldig.
3. Schut het flesje nu stevig gedurende ongeveer 5 seconden.
4. Giet de oplossing in de houder van waaruit de kleuroplossing verwerkt wordt.
5. Herhaal deze stap tweemaal, zo nodig driemaal.
6. Giet de resterende verdunner in de houder en vul het volume aan tot 300 ml met gedestilleerd of gedeioniseerd water.
7. Meng de inhoud van de cubitainer stevig gedurende 5 tot 10 minuten.
De kleuringoplossing is nu gereed voor gebruik.
OPMERKING : Een onvolledige oplossing van de kleurstof zal een onvolledige kleuring van de albuminefractie opleveren (een laag percentage of een
wit gat in de fractie).
Na verdunning bevat de werkzame verdunde kleuroplossing: zuuroplossing pH ≈ 2 ; amidozwart, 0.4 g/dl ; ethyleenglycol, 6.7 % ; additieven,
ongevaarlijk bij te toegepaste concentraties die nodig zijn voor optimale werking.
WAARSCHUWING: Schadelijk bij inname.
Gebruik
Voor het kleuren van gels na elektroforetische proteïnescheiding en immunofixatie.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Zowel de standaard als de gebruiksoplossingen dienen bij kamertemperatuur of gekoeld bewaard te worden in gesloten containers om verdamping
te voorkomen. De standaard kleuroplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op het
label van de flesjes met kleuroplossing.
De gebruiksoplossing is gedurende 1 maand stabiel.
De verdunde oplossing kleurstof niet in de buurt van een warmtebron bewaren.
De voorraad verdunner voor de kleuroplossing wordt bewaard bij kamertemperatuur of gekoeld. De verdunner is stabiel tot de houdbaarheidsdatum
zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op de labels van de flesjes met verdunner voor de kleuroplossing. DIT PRODUCT NIET
INVRIEZEN!
4. FLUIDIL
Voorbereiding
Fluidil (SEBIA, Productnummer 4587, 1 flesje, 5 ml) is gebruiksklaar.
Gebruik
Voor het verdunnen van viskeuze of troebele monsters bijvoorbeeld sera die cryoglobuline of cryogel bevatten.
Opslag, stabiliteit en tekenen van verval
Bij kamertemperatuur te bewaren.
De fluidiloplossing blijft stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of de labels op de flesjes.
Fluidil mag geen precipitaat bevatten.
BENODIGDE UITRUSTING EN ACCESSOIRES
1. Elektriciteitsvoorziening: GD 61 D SEBIA, prod. nr. 1300 ; GD 251 D SEBIA, prod. nr. 1301 ; MG 300 SEBIA, prod. nr. 1302 of MG 500 SEBIA,
prod. nr. 1303.
2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, prod. nr. 1409, bevat de HYDRAGEL K20 applicatordrager en de mal voor de applicatie van het reagens 1 IF.
3. Kamer voor natte opslag: K20 SEBIA, prod. nr. 1270.
4. Elektroforesekamer: K20 SEBIA, prod. nr. 1400.
5. Tanks, incubatieboxen en gelhouders voor de verwerking van HYDRAGEL gelplaten: HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, prod. nr. 1420.
6. Pipetten: 10 µl, 20 µl, 100 µl, en 200 µl.
7. Incubatordroger: IS 80 SEBIA, prod. nr. 1430.
MONSTERS VOOR ANALYSE
Verzameling en opslag van monsters
Verse serummonsters verdienen de voorkeur bij analyse. De sera moeten volgens vastgestelde procedures, zoals toegepast bij testen in klinische
laboratoria, verzameld worden. De sera moeten zo snel mogelijk na verzameling gekoeld worden tot 2 tot 8 °C en kunnen dan worden opgeslagen
gedurende een week. Voor langere opslagperiodes kunnen de monsters ingevroren worden. Ingevroren monsters zijn gedurende zeker één maand
stabiel. Het invriezen van monsters met natriumazide (0,2 g/l) bevordert de stabiliteit bij opslag.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
BELANGRIJK: Vermijdt boorzuur als houdbaarheidsmiddel.
Ontdooide monsters kunnen, bij het punt van applicatie, geringe sporen geven als gevolg van denaturatie van proteïnen of lipoproteïnen.
Voorbereiding van het monster
Om te vermijden dat zich zonefenomenen voordoen door hoge antigeenniveaus, dienen de monster vóór applicatie als volgt te worden verdund:
| SPLEET | SERUM (µl) | VERDUNNER (µl) |
| Ig G immunofixatiespleet | 20 | 100 |
| ELP referentiespleet en alle overige immunofixatiespleten | 30 | 60 |
Speciale gevallen
• Indien het totale immuunglobulineniveau > 20 g/l is (hypergammaglobulinemie), wordt aanbevolen de verdunningsfactor van de monsters te
vergroten (behalve in het ELP-spoor) teneinde een normale concentratie immuunglobulinen te verkrijgen.
• Indien het totale immuunglobulineniveau < 5 g/l is (hypogammaglobulinemie), wordt aanbevolen de verdunningsfactor van de monsters te verlagen.
• Om het serum- of urinemonster van de patiënt te testen op de aanwezigheid van vrije lichte ketens wordt aanbevolen de ‘BENCE JONES’-techniek
te gebruiken.
De test dient dan te worden uitgevoerd met behulp van de IF-kit en met anti-kappa vrije antisera (SEBIA, productnummer 4610) en anti-lambda vrije
antisera (SEBIA, productnummer 4611) of met een HYDRAGEL BENCE JONES K20-kit (SEBIA, productnummer 3038).
Voor het testen van serum op vrije ketens verdunt u het serum met fysiologische zoutoplossing of oplosmiddel voor immunofixatie dat van tevoren
is verdund in de verhouding 1/4 (1 deel oplosmiddel, 3 delen gedestilleerd of gedeïoniseerd water), 1/10 for ELP, GAM, K en L sporen (1 deel serum,
9 delen verdund oplosmiddel of fysiologische zoutoplossing) en 1/3 (1 deel serum, 2 delen verdund oplosmiddel of fysiologische zoutoplossing) voor
sporen die ontwikkeld zijn met anti-kappa vrije antisera en anti-lambda vrije antisera.
Indien het totale immuunglobulineniveau < 5 g/l is, wordt aanbevolen het serummonster minder te verdunnen; bijvoorbeeld: 1/5 voor ELP, GAM, K
en L sporen, en 1/2 voor Kf en Lf sporen.
• Na koeling of invriezing kunnen sommige monoklonale proteïnen (vooral proteïnen die cryoglobuline of cryogel bevatten) viskeus worden of een
troebeling vertonen. Dergelijke sera kunnen problemen vertonen bij de applicatie vanwege verstoorde diffusie door de ‘tanden’ van de
monsterapplicator. Voeg in dit geval 25 µl Fluidil aan 75 µl serum toe. Meng dit gedurende 15 seconden in de vortexmixer en laat maximaal 1 tot
2 minuten in contact staan. Volg verder de standaardprocedure.
• Sommige monoklonale proteïnen kunnen polymeriseren, hetgeen resulteert in een 'monoklonale fractie' die in alle spleten verschijnt na
immunofixatie. In dit geval (i) bereidt 1 % bèta-mercapto-ethanol in Fluidil, (ii) voeg 25 µl verdunner toe aan 75 µl onverdund serum toe, meng dit
in de vortexmixer en laat dit mengsel zeker 15 minuten (met een maximum van 30 minuten) staan. Volg verder de standaardprocedure.
• Voor een analyse van Ig D en/of Ig E hanteert u dezelfde verdunningen als voor kappa en lambda vrije en gebonden lichte ketens.
Te vermijden monster
• Vermijdt plasmamonsters. Fibrinogeen levert een band op die dicht bij het punt van applicatie ligt en voor een monoklonale immuunglobuline
gehouden kan worden.
• Vermijdt gehemoliseerde monsters.
PROCEDURE
I. MIGRATIE
1. Plaats de HYDRAGEL K20 applicatordrager op een plat oppervlak (Fig. 1) en til het gedeelte van de applicatordrager op dat genummerde
uitsparingen heeft.
2. Giet 120 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water op het onderste 1/3 deel van het frame dat op de HYDRAGEL K20 applicatordrager is gedrukt.
3. Neem de HYDRAGEL agarose gel uit de verpakking.
4. Rol het dunne filterpapier snel en gelijkmatig uit over het oppervlak van de gel zodat het teveel aan vloeistof geabsorbeerd kan worden.
Verwijder het filter papier direct.
WAARSCHUWING : Laat het filterpapier niet te lang in contact met de gel om dehydratatie te voorkomen!
5. Plaats de gelplaat (met de gelzijde naar boven) met een zijde tegen de rand aan de onderzijde van het gedrukte frame (Fig. 2).
6. Buig de gel en breng deze naar beneden in het eerder uitgegoten water (Fig. 2). Zorg er voor dat er geen luchtbellen onder de gel gevangen
worden, dat het water onder de gehele gelplaat wordt verdeeld en dat de gel gepositioneerd is conform het frame.
7. Breng de applicatordrager met de genummerde uitsparingen omlaag in de tussenpositie waarbij de schakelaar in de hoogste stand staat.
8. Plaats een applicator op een plat oppervlak zodat de putnummers zich in de 'rechterzijde omhoog' positie bevinden (Fig. 3)
9. Breng 10 µl op correcte wijze verdund serummonster aan in elke spleet. Laad de applicator binnen 2 minuten.
| IMMUNOFIXATIESPLEET | PUT NR. |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5
| |
L | 6 |
- Gebruik de applicator zonder vertraging
- Voor later gebruik (tot 8 uur later) plaatst u de applicator in een natte opslagruimte, met de ‘tanden’ omhoog (alleen aan het plastic frame
dat de tanden beschermd vastpakken). Zorg er voor dat de opslagruimte gekoeld is en plaats de gelplaat direct voorafgaand aan gebruik
op de HYDRAGEL K20 applicatiedrager.
Voor verdere informatie wordt u naar de bijsluiter van de natte opslagruimte verwezen.
10. Breek het beschermende plastic frame van de tanden af.
11. Plaats de monsterapplicator in positie nr. 6 op de applicatiedrager.
BELANGRIJK: De nummers die op de monsterapplicator zijn gedrukt moeten voor u zichtbaar zijn (Fig. 4).
12. Breng de applicatordrager naar beneden zodat de applicator in contact komt met het oppervlak van de gel. FORCEER DE CARRIERS NIET
HELEMAAL NAAR BENEDEN!
13. Na 1 minuut draait u de schakelaar om zodat de applicator omhoog gebracht kan worden. Verwijder de applicator.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
14. Plaats de gel in een geschikte elektroforesekamer, in overeenstemming met de polariteit die op de gel staat aangegeven. Bij gebruik van de
SEBIA K20 kamer, plaatst u de HYDRAGEL op de brug, waarbij de gelkant naar beneden gericht wordt ; de gel moet op een afstand van
ongeveer 1 cm van elke zijde in de buffer zakken.
Voor meer details wordt u verwezen naar de bijsluiter in de verpakking van de K20 kamer.
15. Sluit de kamer aan op de stroomvoorziening.
| MIGRATIECONDITIES | SEBIA K20 |
| Volume buffer per compartiment | 150 ml |
| Totaal buffervolume | 300 ml |
| Migratietijd | 20 minuten |
| Constant voltage | 100 V
| |
Initiële stroom (per gel) | 16 ± 3 mA |
16. Na migratie de kamer ontkoppelen en de gelplaat verwijderen.
De blauwe markeerkleur moet zich op ongeveer 5 mm van de anodische zijde van het geprinte frame bevinden.
II. IMMUNOFIXATIE
1. Plaats de HYDRAGEL K20 applicatordrager op een plat oppervlak.
2. Giet 120 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water op het onderste 1/3 deel van het frame dat op de HYDRAGEL K20 applicatordrager is gedrukt.
3. Plaats de gelplaat (met de gelzijde naar boven) met een zijde tegen de rand aan de onderzijde van het gedrukte frame (Fig. 2).
4. Buig de gel en breng deze naar beneden in het eerder uitgegoten water (Fig. 2). Zorg er voor dat er geen luchtbellen onder de gel gevangen
worden, dat het water onder de gehele gelplaat wordt verdeeld en dat de gel gepositioneerd is conform het frame.
5. Breng de applicatormal voor het reagens 1 IF als volgt in positie (Fig. 5):
- Plaats de applicatiemal op de bevestigingsclips ;
- Houdt de klep op de mal en breng de mal naar beneden op de gel ;
- De spleten op de mal moeten volledig parallel zijn met het frame dat is afgedrukt op de tanden van de applicator aan de linkerzijde van de
gel.
6. Breng het reagens als volgt aan:
| SPLEET | VOLUME (µl) | REAGENS | KLEUR |
| ELP | 40 | fixeeroplossing | geel |
| G | 25 | anti-gamma zware keten antiserum | roze |
| A | 25 | anti-alfa zware keten antiserum | donker blauw |
| M | 25 | anti-mu zware keten antiserum | geelgroen |
| K | 25 | anti-kappa lichte keten (vrij en gebonden) antiserum | lichtgroen
| |
L | 25 | anti-lambda lichte keten (vrij en gebonden) antiserum | lichtblauw |
OPMERKING: Om verwisseling te vermijden zijn de kleuren van het reagens zowel op de lables van de flesjes als op de applicatiemal bij de
putjes aangegeven.
- Neem het reagens zonder luchtbellen in het pipet te vangen ;
- Breng het reagens op de juiste plaats aan (Fig. 6) ;
- Houdt het pipet rechtop en laat het uiteinde licht op de bodem van het putje rusten ;
- Injecteer het reagens zodanig dat het zich door de spleet verspreidt zonder luchtbellen in te sluiten.
7. Incubeer nu gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
III. VERWIJDERING VAN HET REAGENS
1. Verwijder het teveel aan reagens met behulp van een kam van filterpapier (Fig. 7).
2. Verwijder dit reagens binnen 30 seconden.
- Breng de kam onder een hoek van 30° in de spleten aan en breng het eind van de spleten van de mal omlaag zodat de tanden de verticale
zijde raakt die het verst van u verwijderd is.
- Zorg er voor dat de tanden de vloeistof net raken door de kam tot een hoek van 45° omhoog te brengen zodat de tanden de vloeistof kunnen
opnemen (Fig. 8).
BELANGRIJK: De kam dient onder een hoek (van 45°) te blijven omdat anders beschadiging van de gel mogelijk is.
IV. VERWIJDERING VAN DE NIET-GEPRECIPITEERDE PROTEÏNEN
1. Verwijder de kam.
2. Controleer of het reagens goed geabsorbeerd is zoals wordt aangegeven door:
- de afwezigheid van reagens op de gel
- kleuring van de volledige lengte van de tanden van de kam.
Als de absorptie van het reagens niet volledig is dan brengt u dezelfde filterkam opnieuw (in dezelfde positie) aan en herhaald u de
verwijderingprocedure.
3. Neem de applicatiemal voor het reagens bij de klep en til deze weg.
4. Breng een dik filterpapier gedurende 4 minuten op de gel aan. Het dikke filterpapier moet gelijkmatig over de gel verdeeld zijn.
WAARSCHUWING: Goed aandrukken over het gehele oppervlak van het filterpapier zodat het papier goed aan de gel kan hechten.
5. Verwijder het filterpapier. Spoel de gel in verticale positie gedurende 5 minuten met een fysiologische zoutoplossing. Plaats de gel zodanig
dat de ELP-spleet zich aan de onderzijde van de gelhouder bevindt.
6. Plaats de gel op een plat oppervlak.
7. Breng een nieuw dik filterpapier op de gel aan. Het dikke filterpapier moet gelijkmatig over de gel verdeeld zijn.
8. Droog de gel volledig in de incubatordroger bij 80 °C (gedurende ongeveer 7 minuten) tot het filterpapier volledig droog is. Dit kan ook zonder
de incubatordroger, laat het filterpapier dan gedurende 5 minuten in gelijkmatig contact met de gel en droog de gel verder volledig met hete
lucht.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
9. Maak de applicatiemal schoon met een kleine borstel (bijv. een tandenborstel). GEBRUIK HIERBIJ GEEN ALCOHOL OF OPLOSMIDDELEN!).
Zorg er voor dat de mal voor hergebruik weer volledig droog is ; verwijder waterdruppeltjes van de putjes door met een zacht papiertje te
deppen.
V. KLEURING EN ONTKLEURING
1. Na droging dompelt u de volledig droge gel gedurende 3 minuten in verticale positie in een fysiologische zoutoplossing.
2. Vervolgens dompelt u de gel gedurende 4 minuten verticaal in de kleuroplossing.
3. Ontkleuring volgt in drie opeenvolgende dompelingen in een ontkleuringoplossing, net zo lang totdat de achtergrond volledig kleurloos en
helder is.
4. Droog de gel in hete lucht van 80 °C. Indien nodig maakt u de achterzijde (de ondersteunende zijde) met een vochtig en zacht papier (tissue)
schoon.
RESULTATEN
Interpretatie
Afwezigheid van de monoklonale component
• Een normaal serummonster geeft een licht gediffundeerde kleuring van polyklonale immuunglobulinen te zien in alle spleten.
• Een hypergammaglobulinemie wordt gekarakteriseerd door een intens gekleurde, gediffundeerde zone en de afwezigheid van scherp begrensde
banden.
Aanwezigheid van een monoklonale component
• De aanwezigheid van een monoklonaal proteïne (gammopathie) wordt gekarakteriseerd door een scherp begrensde monoklonale band,
gedetecteerd met een van de anti-zware keten antisera (gamma, alfa of mu) en ofwel met anti-kappa of anti-lambda lichte keten antisera. De
gedetecteerde monoklonale band, die typerend scherp begrensd is, moet op dezelfde migratieafstand gelokaliseerd zijn als de band die in de
referentie-track (ELP) werd waargenomen.
• Het uitblijven van een reactie bij een van de aangebrachte anti-zwareketen antisera, waarbij wel een reactie optreedt met een van de lichte keten
antisera, kan duiden op:
a) een uiterst zeldzame Ig D- of Ig E-gammopathie, bevestigd door anti-delta of anti-epsilon zwareketen antisera,
b) een lichteketen-gammopathie bevestigd door antisera anti-kappa of anti-lambda vrije lichte ketens.
• Het niet waarnemen van een positieve reactie met een van de toegevoegde anti-lichte keten antisera, terwijl een anti-zware keten antiserum
reageert, kan een indicatie zijn voor een zeer zeldzame zware keten gammopathie (gamma, alfa of mu).
Aanwezigheid van twee of meer monoklonale componenten
• In uitzonderlijke gevallen vermeerderen verschillende klonen van B-cellen zich zoals blijkt uit de verschillende monoklonale banden die door
immunofixatie worden aangetoond: Een bi-klonale gammopathie wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van twee banden van zware ketens
(identiek of verschillend) en twee banden van lichte ketens (identiek of verschillend).
• Gepolymeriseerde immuunglobulinen worden gekarakteriseerd door verschillende banden van hetzelfde type zware keten en een van hetzelfde type
lichte keten. Om de aanwezigheid van een enkele monoklonale afwijking te bevestigen is het nodig depolymerisatie met bèta-mercapto-ethanol uit
te voeren en immunofixatie te herhalen (zie 'MONSTERS VOOR ANALYSE').
• Een oligoklonale gammopathie wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid van veelvoudige banden van een of meer typen zware ketens en van
een of twee typen lichte ketens.
Speciale gevallen
• Als een monoklonaal type band bij de elektroforese van een serum wordt waargenomen (ELP-track) die echter niet door immunofixatie wordt
bevestigd, dan moet fibrinogeen (plasmamonster) als eerste mogelijke oorzaak worden aangewezen.
• Als een monoklonaal type band bij in alle immunofixatie-tracks, dan moet cryoglobuline of gepolymeriseerd IgM als mogelijke oorzaak worden
aangewezen. Depolymeriseren met een reducerende stof en de procedure herhalen (zie 'MONSTERS VOOR ANALYSE').
Beperkingen
Zie MONSTERS TER ANALYSE.
Het gebruik van antisera die niet specifiek zij voor de immunofixatieprocedure met het standaard masker kan de resultaten beïnvloeden.
Met het oog op de resolutie- en gevoeligheidsbeperkingen van zone-elektroforese is het mogelijk dat niet alle monoclonale componenten met deze
methode volledig worden gedetecteerd.
Troubleshooting
Als de uitvoering van een test in navolging van de instructies voor de preparatie en de opslag van materialen, niet lukt, terwijl de procedure stipt werd
gevolgd dan adviseren wij u om contact op te nemen met de Technische Dienst van uw leverancier.
De veiligheidsbladen behorend bij de reagentia in de Kit als ook informatie over de verwerking van afval of restproducten kunt u verkrijgen bij de
Technische Dienst van de leverancier.
TESTRESULTATEN
Standaardmaterialen werden gebruikt, de voorbereiding van het monster werd uitgevoerd en de procedures werden gevolgd. Alle elektroforegrammen
werden visueel geëvalueerd.
Reproduceerbaarheid op de gel en de specificiteit
De reproduceerbaarheid op de gel werd op twee pathologische serummonsters aangetoond met een hoog en een laag niveau monoklonale
component, respectievelijk een plasmamonster en twee monoklonale componenten. Elk monster werd op 2 partijen getest, waarbij de
kleuringprocedures met zuurviolet werden toegepast.
Alle geteste monsters produceerden identieke resultaten voor de 2 partijen en voor de kleuringprocedure waarbij de verwachte typerende patronen
verschenen voor het type monster dat werd getest, waarbij immunofixatie bij elk serummonster monoklonale banden liet zien.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Reproduceerbaarheid tussen gels en de specificiteit
De reproduceerbaarheid tussen de gels werd op twee pathologische serummonsters met respectievelijk een hoog en een laag niveau monoklonale
component aangetoond. Elk monster werd op 20 gels van 2 partijen getest, waarbij de kleuringprocedures met zuurviolet werden toegepast.
Alle geteste monsters produceerden identieke resultaten voor de 2 partijen en voor de kleuringprocedure waarbij de verwachte typerende patronen
verschenen voor het type monster dat werd getest, waarbij immunofixatie bij elk serummonster een monoklonale band liet zien.
Nauwkeurigheid
Dertig (30) verschillende serummonsters werden elk getest op de HYDRAGEL IF K20 Kit en een ander in de handel verkrijgbaar agarose-gelimmunofixatiesysteem.
De HYDRAGEL IF K20 procedure werd met de zuurviolet kleuringprocedure getest. Identieke banden werden bij alle
pathologische monsters vastgesteld met elk systeem of elke procedure.
Gevoeligheid
Er werden seriële verdunningen geprepareerd van 3 pathologische serummonsters, die alledrie een monoklonale component vertoonden. De
resultaten werden geanalyseerd volgens de HYDRAGEL IF K20 procedure waarbij gebruik gemaakt werd van zowel de zuurviolet als de amidozwart
kleuringprocedures.
De resultaten worden hieronder samengevat:
| MONOKLONALE COMPONENT | DETECTIELIMIET (g/L) |
MONSTER NR. TYPE CONC. (g/L) ZUURVIOLET AMIDOZWART | | | | | |
1 alfa 5,33 0,25 0,25 | | | | | |
1 kappa 0,25 0,25 | | | | | |
2 mu 10,9 0,12 0,12 | | | | | |
2 lambda 0,25 0,25 | | | | | |
3 gamma 17,2 0,25 0,50 | | | | | |
3 | lambda | | 0,12 | 0,12 |
BIBLIOGRAFIE
Voor aanvullende informatie met betrekking tot de interpretatie van immunofixatiepatronen wordt verwezen naar:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.

UTILIZZO
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Il kit HYDRAGEL IF K20 è stato progettato per l’identificazione di proteine monoclonali nel siero umano, mediante elettroforesi ed immunofissazione
su gel d’agarosio tamponato in mezzo alcalino (pH 9.1).
Le sieroproteine sono fatte migrare ed immunofissate mediante antisieri con differenti specificità: anti catene pesanti gamma (Ig G), alfa (Ig A) e mu
(Ig M) ed anti catene leggere kappa e lambda (libere e legate). Dopo l’immunofissazione, le proteine precipitate sono colorate con violetto acido.
L’eccesso di colorante è rimosso con una soluzione acida.
Ogni gel del kit HYDRAGEL IF K20 permette di processare un campione.
Per soddisfare le esigenze dei vari utilizzatori i kits HYDRAGEL IF K20 sono disponibili sia con sia senza gli antisieri, ed entrambi sia con sia senza
il colorante Violetto Acido.
Per uso diagnostico in vitro.
PRINCIPIO DEL METODO
Bande anomale nel quadro elettroforetico sieroproteico, in particolare nella zona delle beta-globuline e delle gamma-globuline, sono sempre presunte
proteine monoclonali e pertanto un indice di gammapatie. Per identificare tali bande anomale si utilizza la tecnica dell’immunofissazione.
L’elettroforesi, seguita dall’immunofissazione, è una semplice tecnica che permette di fissare una proteina in situ dopo l’elettroforesi, formando un
complesso insolubile con anticorpi specifici.
Tale tecnica consta di quattro fasi:
1. Separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel d’agarosio.
2. Fissazione ed immunoprecipitazione delle proteine migrate: soluzione fissativa ed antisieri sono stratificati direttamente sulla superficie del gel
nelle appropriate corsie di migrazione. Soluzione fissativa ed antisieri diffondono, nel gel, precipitando rispettivamente tutte le proteine ed i
corrispondenti antigeni.
3. Le proteine non precipitate e quindi solubili, sono rimosse dal gel mediante asciugatura e lavaggio. Il complesso antigene-anticorpo precipitato è
intrappolato all’interno della matrice del gel.
4. Le proteine precipitate sono evidenziate con la colorazione. Le bande immunoprecipitate sono poi comparate con le corrispondenti bande anomale
presenti nel quadro elettroforetico di riferimento del siero.
Per evidenziare ed identificare le presunte componenti monoclonali i campioni sono fatti migrare, contemporaneamente, in sei corsie. Dopo
l’elettroforesi, una corsia (ELP) serve da riferimento, mostrando il quadro elettroforetico delle proteine del campione. Le rimanenti cinque corsie
permettono la caratterizzazione della componente(i) monoclonale(i) mediante la reazione o la mancanza di reazione con gli antisieri anti catene
pesanti gamma (Ig G), alfa (Ig A) e mu (Ig M) ed anti catene leggere kappa e lambda (libere e legate).
Questa semplice e rapida tecnica fornisce un quadro chiaro e facilmente interpretabile.
REAGENTI E MATERIALI FORNITI NEI KITS HYDRAGEL IF K20
| COMPONENTI DEL KIT | PN 3031 | PN 3220* |
| Gels di Agarosio (pronti all’uso) | 10 gels | 100 gels |
| Tampone tris-barbital (soluzione concentrata) | 3 flaconi da 75 mL | 30 flaconi da 75 mL |
| Colorante Violetto Acido (soluzione concentrata) | 1 flacone da 75 mL | 3 flaconi da 75 mL |
| Soluzione Decolorante (soluzione concentrata) | 1 flacone da 100 mL | 1 flacone da 100 mL |
| Diluente (pronto all’uso) | 1 flacone da 3.2 mL | 1 flacone da 32 mL |
| Soluzione Fissativa (pronta all’uso) | | 1 flacone da 14.4 mL |
| Immunoglobuline anti catene pesanti umane | | |
| gamma (pronte all’uso) | | 1 flacone da 2.5 mL |
| Immunoglobuline anti catene pesanti umane | | |
| alfa (pronte all’uso) | | 1 flacone da 2.5 mL |
| Immunoglobuline anti catene pesanti umane | | |
| mu (pronte all’uso) | | 1 flacone da 2.5 mL |
| Immunoglobuline anti catene leggere (libere e legate) | | |
| umane kappa (pronte all’uso) | | 1 flacone da 2.5 mL |
| Immunoglobuline anti catene leggere (libere e legate) | | |
| umane lambda (pronte all’uso) | | 1 flacone da 2.5 mL |
| Applicatori a 6 dentini (pronti all’uso) | 1 confezione da 10 | 10 confezioni da 10 |
| Cartine da filtro - sottili | 1 confezione da 10 | 10 confezioni da 10 |
| Pettini di carta da filtro | 1 confezione da 10 | 10 confezioni da 10 |
| Cartine da filtro - spesse | 2 confezioni da 10 | 20 confezioni da 10 |
*HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
La quantità di tampone fornita nel MAXI-KIT è destinata a due cicli di migrazione. Conservare il tampone per processare due gels.
NOTA: La soluzione fissativa e gli antisieri sono forniti separatamente dal kit ad esclusione del MAXI-KIT (Vedi REAGENTI RICHIESTI MA NON
FORNITI).
PER RISULTATI OTTIMALI
I componenti di uno stesso kit devono sempre essere utilizzati insieme, in accordo con le istruzioni contenute nel kit.
LEGGERE ATTENTAMENTE LE ISTRUZIONI PER L’USO.
FOGLIO DI ISTRUZIONI SEBIA - Italiano

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
1. GELS DI AGAROSIO
Preparazione
I gels di agarosio sono pronti all’uso. Ogni gels di agarosio contiene: agarosio, 0.8 g/dL ; tampone tris-barbital pH 9.1 ± 0.1 ; additivi, non rischiosi alle
concentrazioni usate, necessari per migliorare l’analisi.
AVVERTENZA: I gels di agarosio contengono 0.31 % di barbital e 0.34 % di barbital sodico. Non ingerire! Se ingerito consultare un medico
immediatamente!
Utilizzo
Mezzo di supporto per elettroforesi ed immunofissazioni proteiche.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare i gels orizzontalmente nella confezione originale protettiva a temperatura ambiente (15 - 30 °C) o in frigorifero (2 - 8 °C). I gels sono stabili
fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sulla confezione del gel. (La freccia sulla scatola del kit deve essere rivolta verso l’alto). Evitare
la conservazione in prossimità di finestre o di sorgenti di calore. Evitare brusche e/o significative variazioni di temperatura durante la conservazione.
NON CONGELARE.
Non utilizzare il gel quando:
(I) sono presenti cristalli o precipitati sulla superficie del gel, oppure la struttura del gel è divenuta molto molle (entrambe conseguenze del
congelamento del gel),
(II) è presente muffa o flora batterica,
(III) è presente, nella scatola che contiene il gel, una quantità anormale di liquido (risultato di una fuoriuscita del tampone dal gel, dovuta a condizioni
di conservazione improprie).
2. TAMPONE TRIS-BARBITAL
Preparazione
Ogni flacone di soluzione tampone concentrata deve essere diluito ad 1 litro con acqua distillata o deionizzata. Dopo la diluizione, la soluzione di
utilizzo contiene: tris-barbital pH 9.2 ± 0.3, sodio azide.
AVVERTENZA: Ogni flacone di soluzione tampone concentrata contiene 2.45 % di barbital, 13.73 % barbital sodico e 0.13 % sodio azide.
Non ingerire! Se ingerito consultare immediatamente un medico! Evitare il contatto con acidi, piombo o rame poiché possono originare
composti esplosivi o tossici con la sodio azide. Quando smaltito fare scorrere una abbondante quantità di acqua.
Utilizzo
Tampone per elettroforesi.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare la soluzione concentrata a temperatura ambiente o in frigorifero. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata
sulla confezione del kit o sulla etichetta del flacone di tampone. La soluzione tampone diluita è stabile per un anno se conservata a temperatura
ambiente in un flacone chiuso.
Eliminare la soluzione tampone diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni microbiche.
3. COLORANTE VIOLETTO ACIDO
Preparazione
Il flacone di colorante violetto acido in soluzione concentrata deve essere diluito a 300 mL con acqua distillata o deionizzata.
Dopo la diluizione, la soluzione di colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; violetto acido, 2 g/l ; Etilen-glicol, 3,25 % ; componenti non pericolosi
alle concentrazioni utilizzate necessarie per i risultati ottimali.
ATTENZIONE: Nocivo in caso di ingestione.
Utilizzo
Colorazione dei gels dopo l’elettroforesi e l’immunofissazione delle proteine.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare sia la soluzione concentrata del colorante che quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero in contenitore chiuso per prevenire
l’evaporazione. La soluzione concentrata del colorante è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del colorante. Il
colorante diluito è stabile 6 mesi.
4. SOLUZIONE DECOLORANTE
Preparazione
Il flacone di soluzione decolorante deve essere diluito a 100 litri con acqua deionizzata o distillata. Per convenienza diluire 1 mL di soluzione
concentrata a 1 litro.
Dopo la diluizione la soluzione decolorante contiene: acido citrico, 0.05 g/dL.
Utilizzo
Come decolorante, ossia per rimuovere l’eccesso di colorante e la colorazione di fondo dal gel.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare la soluzione decolorante concentrata a temperatura ambiente o in frigorifero. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza
indicata sulla scatola del kit o sulla etichetta del decolorante. La soluzione diluita del decolorante è stabile per una settimana a temperatura ambiente
in flacone chiuso. Non aggiungere sodio azide.
Eliminare la soluzione decolorante diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni microbiche.
Per periodi di conservazione superiori ad una settimana, prevenire i fenomeni di proliferazione microbica aggiungendo, nella soluzione decolorante
diluita, 5 µL/dL di ProClin 300.
La soluzione decolorante diluita addizionata con ProClin e conservata a temperatura ambiente o in frigorifero in bottiglia chiusa, è stabile fino alla data
di scadenza indicata sulla confezione o sull’etichetta del flacone di decolorante.
5. DILUENTE
Preparazione
Il diluente è pronto all’uso e contiene: tampone pH 7,5 ± 0.3 ; blu di bromofenolo ; additivi non rischiosi alle concentrazioni utilizzate, necessari per
ottimizzare l’analisi.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Utilizzo
Per la diluizione dei campioni. Il blu di bromofenolo serve da marcatore del punto di applicazione e della migrazione.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare il diluente a temperatura ambiente o in frigorifero. Il diluente è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o sulla
etichetta del diluente.
Il diluente deve essere privo di precipitato.
6. ANTISIERI (con PN 3220)
Preparazione
Pronti all’uso. Tutti gli antisieri sono di mammifero, anti immunoglobuline totali umane.
Per una facile identificazione degli antisieri e per un aiuto nel controllo della loro corretta applicazione, gli antisieri sono colorati con differenti coloranti
atossici come descritto in PROCEDURA, Sezione II. 6. Le etichette dei flaconi hanno i medesimi colori degli antisieri.
Utilizzo
Per l’immunofissazione delle proteine separate elettroforeticamente.
NOTA: Questo antisiero è specifico per le tecniche di immunofissazione realizzate con le maschere 1 IF, SEBIA.
Gli antisieri possono originare da specie animali diverse. Non miscelare due diversi flaconi di antisiero, anche se con la stessa specificità e sostituire
sempre il puntale della pipetta quando si cambia flacone di antisiero.
IMPORTANTE : Per evitare la contaminazione tra i diversi reagenti, si raccomanda di rimettere ogni tappo sul flacone corrispondente dopo ogni
utilizzo.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare gli antisieri in frigorifero (2 - 8 °C). Sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o sull’etichetta degli antisieri.
Eliminare se mutano di aspetto, per esempio, se diventano torbidi a causa di contaminazione microbica.
NOTA: Durante il trasporto, gli antisieri possono essere mantenuti a temperatura non refrigerata (15 - 30 °C) per 15 giorni, senza effetti negativi sulle
prestazioni.
7. SOLUZIONE FISSATIVA (con PN 3220)
Preparazione
La soluzione fissativa è pronta all’uso. Contiene: soluzione acida ; additivi, non rischiosi alle concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi.
Per una facile identificazione e come aiuto nel controllo della sua corretta applicazione, il fissativo è colorato con un colorante atossico, tale colore è
riportato sull’etichetta del flacone (vedi PROCEDURA, sezione II.6.).
Utilizzo
Per fissare le proteine separate mediante l’elettroforesi nella pista di riferimento (ELP).
NOTA : La soluzione fissativa è specifica per la tecnica di immunofissazione realizzata con le maschere 1 IF, SEBIA.
IMPORTANTE : Per evitare la contaminazione tra i diversi reagenti, si raccomanda di rimettere ogni tappo sul flacone corrispondente dopo ogni
utilizzo.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare la soluzione fissativa a temperatura ambiente o in frigorifero. Il fissativo è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del
kit o sull’etichetta del flacone del fissativo.
La soluzione fissativa deve essere priva di precipitato.
8. APPLICATORI
Utilizzo
Applicatori monouso pretagliati, per l’applicazione dei campioni sul gel.
Conservazione
Conservare gli applicatori in un luogo asciutto a temperatura ambiente o in frigorifero.
9. CARTINE DA FILTRO - SOTTILI
Utilizzo
Cartine assorbenti, monouso, per l’eliminazione, dalla superficie del gel, dell’eccesso di liquido, prima dell’applicazione del campione.
Conservazione
Conservare le cartine da filtro sottili in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.
10. PETTINI DI CARTA DA FILTRO
Utilizzo
Pettini di carta assorbente spessa, pretagliati, monouso, per l’eliminazione dell’eccesso di soluzione fissativa e di antisiero dalla superficie del gel,
dopo l’incubazione.
11. CARTINE DA FILTRO - SPESSE
Utilizzo
Cartine assorbenti spesse monouso, per eliminare le proteine non precipitate dopo la fase della immunofissazione.
Conservazione
Conservare le cartine da filtro spesse in luogo secco a temperatura ambiente o refrigerata.
REAGENTI RICHIESTI MA NON FORNITI
1. KIT ANTISIERI E SOLUZIONE FISSATIVA IF (per i kits 3031)
Il kit antisieri e soluzione fissativa per immunofissazione IF, maschera standard (SEBIA, ref 4815) contiene cinque flaconi di antisieri, anti-Ig G, anti-
Ig A, anti-Ig M, anti-kappa (catene leggere libere e legate) e anti-Lambda (catene leggere libere e legate) di 1 ml ognuno, e un flacone di soluzione
fissativa di 2.5 ml, specifici per la tecnica di immunofissazione realizzata con le maschere 1 IF, SEBIA.
1.1 ANTISIERI
Vedere paragrafo precedente 6.
1.2 SOLUZIONE FISSATIVA
Vedere paragrafo precedente 7.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
2. SOLUZIONE FISIOLOGICA
Preparazione
Preparare una soluzione 0.15 M (0,9 g/dL) di NaCl in acqua distillata o deionizzata.
Utilizzo
Per il lavaggio dei gels dopo l’incubazione con la soluzione fissativa e gli antisieri.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare a temperatura ambiente o in frigorifero. Eliminare comunque dopo 3 mesi oppure se muta di aspetto, es., diviene torbida a causa di
contaminazione microbica. Per una conservazione più lunga aggiungere sodio azide, 0,1 g/dL.
3. COLORANTE AMIDOSCHWARZ (SEBIA, Ref. 4554) (facoltativo)
Preparazione
Il colorante amidoschwarz concentrato è una soluzione viscosa, che può eventualmente gelificare, senza che la qualità della soluzione finale e del
suo potere colorante siano minimamente alterati.
Per ottenere una perfetta ricostituzione del colorante, bisogna rispettare il seguente protocollo.
1. Aggiungere circa 15 mL di diluente del colorante al flacone di amidoschwarz concentrato.
2. Chiudere accuratamente il flacone.
3. Agitare con molto vigore il flacone per almeno 5 secondi.
4. Versare la soluzione ottenuta nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.
5. Ripetere questa operazione due o tre volte se necessario.
6. Versare il resto del diluente nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione.
7. Completare a 300 mL con acqua distillata o demineralizzata.
8. Agitare perfettamente questa soluzione per 5 - 10 minuti.
Il colorante è pronto all’uso.
NOTA : Una risospensione incompleta del colorante può causare una cattiva colorazione della frazione albumina (percentaule bassa di albumina o
svuotamento al centro della frazione).
Dopo diluizione, la soluzione colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; etilen-glicole, 6,7% ; additivi senza pericolo alle
concentrazioni utilizzate, necessari per delle rese ottimali.
ATTENZIONE: Nocivo in caso di ingestione.
Utilizzo
Colorazione dei gels dopo l’elettroforesi e l’immunofissazione delle proteine.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Le soluzioni di colorante concentrate e diluite possono essere conservate a temperatura ambiente o nel frigorifero in flaconi chiusi per evitare
l’evaporazione. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata sul kit o sull’etichetta di flacone di colorante.
La soluzione diluita è stabile per un mese.
Non conservare la soluzione di colorante diluita in prossimità di una sorgente di calore.
Il diluente del colorante concentrato può essere conservato a temperatura ambiente o al frigorifero. E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sul kit
o sull’etichetta del flacone del diluente del colorante. NON CONGELARE.
4. FLUIDIL
Preparazione
Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 flacone, 5 mL) è pronto all’uso.
Utilizzo
Per diluire campioni viscosi o torbidi, per esempio, sieri contenenti criogloguline o criogel.
Conservazione, stabilità e segni di deterioramento
Conservare a temperatura ambiente. Fluidil è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone.
Fluidil deve essere privo di precipitato.
APPARECCHIATURE ED ACCESSORI RICHIESTI MA NON FORNITI
1. Alimentatore: GD61D SEBIA, PN 1300 ; GD251D SEBIA, PN 1301 ; MG300 SEBIA, PN 1302 o MG500 SEBIA, PN 1303.
2. APPLICATORE HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1409, contenente il porta applicatori HYDRAGEL K20 e la maschera di applicazione reagenti 1 IF.
3. Camera umida di conservazione, PN 1270.
4. Camera elettroforetica: K20 SEBIA, PN 1400.
5. Vaschette e telai porta gel per processare le lastrine di gel: Kit Accessori HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420.
6. Pipette: 10 µL, 20 µL, 100 µL e 200 µL.
7. Essiccatore-incubatore: IS 80 SEBIA, PN 1430.
CAMPIONI PER L’ANALISI
Raccolta e conservazione del campione
Per l’analisi sono raccomandati campioni di siero freschi. I sieri devono essere prelevati seguendo la procedura per i tests clinici di laboratorio. Dopo
il prelievo refrigerare i campioni (tra 2 e 8 °C) al più presto, per conservazioni sino ad una settimana. Per periodi di conservazione più lunghi,
mantenere i campioni congelati. I campioni congelati sono stabili per almeno 1 mese.
Il congelamento dei campioni con sodio azide, 0.02 g/dL, migliora la stabilità di conservazione.
IMPORTANTE: Evitare l’uso di acido borico come conservante.
I campioni scongelati possono dare luogo a leggeri segni di deposito causati dalla denaturazione delle proteine o delle lipoproteine.

Preparazione del campione
Per prevenire l’effetto prozona ad alti livelli di antigene, diluire i campioni, prima della applicazione, come segue:
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
| PISTE | SIERO (µL) | DILUENTE (µL) |
| Pista di immunofissazione Ig G | 20 | 100 |
| Pista del riferimento ELP e tutte le altre piste di immunofissazione | 30 | 60 |
Casi particolari:
• Quando il livello di immunoglobuline totali è superiore a 2 g/dL (ipergammaglobulinemia) si raccomanda di aumentare il fattore di diluizione del
campione (ad esclusione della pista ELP) per ottenere una concentrazione normale di immunoglobuline.
• Quando il livello di immunoglobuline totali è inferiore a 0,5 g/dL (ipogammaglobulinemia) si raccomanda di diminuire il fattore di diluizione del
campione.
• Per ricercare la proteina di Bence Jones nel siero o nelle urine del paziente, si raccomanda l’uso della procedura "BENCE JONES".
Il campione può essere processato utilizzando il kit IF, l’antisiero ANTI-KAPPA LIBERE (SEBIA, PN 4610) e l’antisiero ANTI-LAMBDA LIBERE
(SEBIA, PN 4611), oppure utilizzando il kit HYDRAGEL BENCE JONES K20 (SEBIA, PN 3038).
In caso di ricerca delle catene leggere libere nel siero, diluire il siero in soluzione fisiologica o in diluente per immunofissazione, preventivamente
diluito 1/4 (1 parte di diluente, 3 parti di acqua distillata o deionizzata), 1/10 per le piste ELP, GAM, K e L (1 parte di siero, 9 parti di diluente diluito
o soluzione fisiologica) e 1/3 per le piste rivelate con gli antisieri Kf e Lf (1 parte di siero, 2 parti di diluente diluito o soluzione fisiologica).
Quando il livello di immunoglobuline totali è inferiore a 0,5 g/dL, si raccomanda di diminuire il fattore di diluizione del siero; per esempio, 1/5 per le
piste ELP, GAM, K e L, 1/2 per le piste Kf e Lf.
• Dopo la refrigerazione o il congelamento, alcuni campioni (particolarmente quelli contenenti crioglobuline o criogel) possono diventare viscosi o
sviluppare torbidità. Tali campioni possono presentare problemi di applicazione dovuti alla ostacolata diffusione del campione nei dentini
dell’applicatore. In questi casi, aggiungere 25 µL di Fluidil a 75 µL di siero ed agitare per 15 secondi. Seguire quindi la procedura standard.
• Alcune proteine monoclonali possono polimerizzare dando luogo ad una “frazione monoclonale” che si presenta in tutte le piste di
immunofissazione. In questo caso (i) preparare una diluizione 1 % di beta-mercaptoetanolo in Fluidil (ii) aggiungere 25 µL di soluzione riducente a
75 µL di siero non diluito (iii) agitare ed attendere almeno 15 minuti (massimo 30 minuti), quindi seguire la procedura standard.
• Per l’analisi delle Ig D e/o Ig E, applicare la stessa diluizione preparata per le catene leggere libere e legate.
Campioni da evitare
• Evitare campioni di plasma. Il fibrinogeno dà luogo ad una banda nella zona gamma della pista di riferimento che può essere scambiata per una
immunoglobulina monoclonale.
• Evitare campioni emolizzati.
PROCEDURA
I. MIGRAZIONE
1. Posizionare il porta applicatore HYDRAGEL K20 su una superficie piana (Fig. 1) ed alzare la cornice porta applicatore (quella con le fessure
numerate).
2. Dispensare 120 µL di acqua distillata o deionizzata sul terzo inferiore del riquadro stampato sul porta applicatore HYDRAGEL K20.
3. Estrarre il gel HYDRAGEL dalla confezione.
4. Eliminare rapidamente l’eccesso di liquido in superficie, tamponando il gel con una carta assorbente sottile
ATTENZIONE : Fate attenzione a non lasciare la carta da filtro troppo a lungo a contatto con il gel per evitarne la disidratazione.
5. Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 2)
6. Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia d’acqua (Fig. 2). Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere
uniformemente stratificata sotto alla lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato.
7. Abbassare la cornice porta applicatore fino alla posizione intermedia, con la manopola ruotata in alto.
8. Posizionare un applicatore su di una superficie piana con i numeri dei pozzetti orientati correttamente verso l’alto (Fig. 3).
9. Applicare in ogni pozzetto 10 µL di siero opportunamente diluito come segue. Caricare l’applicatore entro 2 minuti.
| PISTE DI IMMUNOFISSAZIONE | POZZETTI No. |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5
| |
L | 6 |
- Utilizzare l’applicatore senza alcun ritardo.
- Per un utilizzo successivo (fino ad 8 ore), inserire l’applicatore nella camera umida di conservazione, con i dentini rivolti verso l’alto
(maneggiare il depositore mediante la cornice protettiva in plastica), mantenendo l’intera camera in frigorifero e preparando la lastrina di gel,
sul porta applicatore HYDRAGEL K20, appena prima dell’uso.
Consultare l’inserto all’interno della confezione della camera umida per ulteriori dettagli.
8. Staccare la cornice protettiva dei dentini dell’applicatore.
9. Inserire l’applicatore sulla cornice mobile in posizione No. 6.
IMPORTANTE: I numeri stampati sull’applicatore devono essere rivolti verso l’operatore (Fig. 4).
12. Abbassare la cornice porta applicatore in modo che l’applicatore entri in contatto con la superficie del gel. NON FORZARE LA CORNICE AD
ABBASSARSI ULTERIORMENTE.
13. Dopo 1 minuto, ruotare la manopola per sollevare l’applicatore, rimuovere l’applicatore ed eliminarlo.
14. Mettere il gel in un’appropriata camera elettroforetica, in accordo alla polarità indicata sul gel. Quando è utilizzata la camera SEBIA K20,
posizionare il gel sul ponte in modo che la superficie del gel sia rivolta verso il basso ; il gel deve essere immerso per circa 1 cm nel tampone
su entrambi i lati.
Per ulteriori dettagli consultare l’inserto contenuto nella camera K20.

15. Collegare la camera all’alimentatore.
| CONDIZIONI DI MIGRAZIONE | SEBIA K20 |
| Volume di tampone per compartimento | 150 mL |
| Volume totale di tampone | 300 mL |
| Tempo di migrazione | 20 minuti |
| Voltaggio costante | 100 V
|
|
Amperaggio iniziale (un gel) | 16 ± 3 mA |
16. Dopo la migrazione, scollegare la camera e rimuovere la lastrina di gel.
Il marcatore blu deve essere localizzato a circa 5 mm dal lato anodico del riquadro stampato.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
II. FASI DELLA IMMUNOFISSAZIONE
1. Posizionare il porta applicatore HYDRAGEL K20 su una superficie piana.
2. Dispensare 120 µL di acqua distillata o deionizzata sul terzo inferiore del riquadro stampato sul porta applicatore HYDRAGEL K20.
3. Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 2)
4. Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia di acqua (Fig. 2). Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere
uniformemente stratificata sotto alla lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato.
5. Posizionare la maschera 1 IF per l’applicazione dei reattivi come segue (Fig. 5):
- Posizionare la maschera di applicazione sugli spinotti di ancoraggio.
- Tenendo l’aletta della maschera, abbassare la maschera sul gel.
- Le piste della maschera devono essere perfettamente allineate ai segni lasciati sul gel dai dentini dell’applicatore.
6. Applicare i reattivi come segue:
| PISTE | VOLUME (µL) | REATTIVO | COLORE |
| ELP | 40 | soluzione fissativa | giallo |
| G | 25 | antisiero anti catene pesanti gamma | rosa |
| A | 25 | antisiero anti catene pesanti alfa | blu notte |
| M | 25 | antisiero anti catene pesanti mu | verde scuro |
| K | 25 | antisiero anti catene leggere kappa (libere e legate) | verde brillante
| |
L | 25 | antisiero anti catene leggere lambda (libere e legate) | azzurro |
NOTA: Per evitare possibili scambi, i colori dei reattivi sono indicati sia sulle etichette dei flaconi, sia sui pozzetti di applicazione della
maschera.
- Prelevare i reagenti evitando di intrappolare bolle di aria nel puntale della pipetta.
- Applicare i reattivi (Fig. 6):
- Tenere la pipetta verticale ed appoggiare leggermente il puntale alla base del pozzetto.
- Iniettare il reattivo in modo che si stratifichi lungo tutta la pista senza intrappolare bolle di aria.
7. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
III. RIMOZIONE DEI REATTIVI
1. Rimuovere l’eccesso di antisiero utilizzando il pettine di carta da filtro (Fig. 7).
2. Rimuovere i reattivi entro 30 secondi.
- Inserire il pettine con un angolo di 30°, nelle fessure sottostanti le piste della maschera, in modo che i dentini ne tocchino il lato verticale,
opposto all’operatore.
- Permettere ai dentini di entrare delicatamente in contatto con il liquido, inclinando il pettine a 45° e consentendo così ai dentini di aspirare
il liquido (Fig. 8).
IMPORTANTE: Il pettine deve rimanere inclinato a 45°. Se tenuto in posizione verticale, potrebbe danneggiare il gel.
IV. ELIMINAZIONE DELLE PROTEINE NON FISSATE
1. Rimuovere il pettine.
2. Controllare che gli antisieri siano stati correttamente assorbiti come indicato da:
- assenza di reattivi sul gel.
- colorazione dei dentini in tutta la loro lunghezza.
Se l’assorbimento dei reattivi risultasse incompleto, inserire nuovamente il medesimo pettine nella stessa posizione e ripetere la procedura di
eliminazione.
3. Afferrare la maschera per la deposizione dei reattivi mediante l’aletta, sollevarla e rimuoverla.
4. Applicare una cartina da filtro spessa sul gel per 4 minuti. La cartina deve essere in uniforme contatto con la superficie del gel.
ATTENZIONE: Premere sull’intera superficie della carta da filtro, per assicurare la perfetta aderenza tra il gel e la carta.
5. Rimuovere la carta da filtro. Lavare il gel verticalmente per 5 minuti in soluzione fisiologica. Posizionare il gel in modo che la pista ELP sia
nella parte inferiore del porta gel.
6. Posizionare il gel su una superficie piana.
7. Applicare sul gel una nuova cartina da filtro spessa. La cartina deve essere in uniforme contatto con la superficie del gel.
8. Essiccare completamente il gel nell’incubatore-essiccatore a 80 °C fino a che la carta da filtro non sia completamente asciutta (per circa
7 minuti), o senza l’incubatore-essiccatore, lasciare la carta da filtro a contatto uniforme del gel per 5 minuti, quindi essiccare completamente
il gel con aria calda.
9. Pulire la maschera con acqua ed uno spazzolino (es., spazzolino da denti). NON USARE ALCOOL O SOLVENTI. Assicurarsi che la maschera
sia completamente asciutta prima di utilizzarla nuovamente ; rimuovere le gocce di acqua dai pozzetti scuotendola leggermente su carta
assorbente soffice.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
V. FASI DI COLORAZIONE E DECOLORAZIONE
1. Dopo l’essiccazione immergere verticalmente il gel completamente essiccato in soluzione fisiologica per 3 minuti.
2. Immergere il gel verticalmente nella soluzione del colorante per 4 minuti.
3. Decolorare in tre successivi bagni di soluzione decolorante fino a quando il gel risulta essere privo di colorazione di fondo.
4. Essiccare il gel con un flusso di aria a 80 °C. Se necessario, pulire il retro della lastrina (faccia di supporto) con della carta morbida inumidita.
RISULTATI
Interpretazione
Assenza di componenti monoclonali
• Un campione di siero normale mostra una leggera e diffusa colorazione di immunoglobuline policlonali in ogni pista.
• L’ipergammaglobulinemia è caratterizzata dalla presenza di una zona diffusa, marcatamente colorata e dall’assenza di bande nette.
Presenza di una componente monoclonale
• La presenza di una proteina monoclonale (gammapatia) è caratterizzata da una banda monoclonale rivelata sia con uno degli antisieri anti catena
pesante (gamma, alfa o mu) che con l’antisiero anti catena leggera (kappa o lambda). La banda monoclonale evidenziata, solitamente ben delimitata
e netta, deve essere localizzata alla stessa distanza di migrazione della presunta banda monoclonale vista nel profilo proteico (ELP).
• L’assenza di reazione con gli antisieri anti-catena pesante applicati e la reazione con uno degli antisieri anti-catena leggera, può indicare:
a) la presenza di una rarissima gammopatia Ig D o Ig E, da confermare con antisieri anti-catene pesanti delta e epsilon,
b) la presenza di una catena leggera libera, da confermare con antisieri anti-catene leggere libere kappa o lambda.
• La mancanza di reazione con gli antisieri anti catene leggere e la contemporanea presenza di reazione con l’antisiero anti catene pesanti può
indicare la rarissima malattia da catene pesanti (gamma, alfa o mu).
Presenza di due o più componenti monoclonali
In rari casi, diversi cloni di linfociti B proliferano dando luogo a distinte bande monoclonali evidenziate mediante l’immunofissazione:
• La gammapatia biclonale è caratterizzata dalla presenza di due bande relative alla catena pesante (uguali o differenti) e di due bande relative alla
catena leggera (uguali o differenti).
• Le immunoglobuline polimerizzate sono caratterizzate da varie bande dello stesso tipo di catena pesante e di un tipo di catena leggera. Per
confermare la presenza di una singola componente monoclonale è necessario depolimerizzare con beta-mercaptoetanolo e ripetere
l’immunofissazione (vedi "CAMPIONI PER ANALISI").
• La gammapatia oligoclonale è caratterizzata dalla presenza di bande multiple di uno o più tipi di catene pesanti e di uno o due tipi di catene leggere.
Casi particolari
• Quando una banda di tipo monoclonale è osservabile sulla elettroforesi del siero (pista ELP) ma non viene confermata dall’immunofissazione, il
principale sospetto è che si tratti di fibrinogeno (campione di plasma).
• Quando una banda di tipo monoclonale è osservabile su tutte le piste di immunofissazione, è sospettabile la presenza di crioglobuline o di IgM
polimerizzate. Depolimerizzare con un’agente riducente e quindi ripetere la procedura (vedi “CAMPIONI PER ANALISI”).
Limitazioni
Vedi CAMPIONI PER L’ANALISI.
L’utilizzo di antisieri diversi da quelli specifici per la tecnica di immunofissazione realizzata con la maschera standard può alterare la qualità dei risultati.
Per i limiti di risoluzione e sensibilità dell’elettroforesi zonale, è possibile che alcune componenti monoclonali possano non essere rilevate con questo
metodo.
Eliminazione errori
Contattare il Servizio di Assistenza Tecnica del fornitore quando, nonostante siano state seguite accuratamente le istruzioni per la preparazione e la
conservazione dei materiali e per la procedura di impiego, i risultati del test non rispettino le caratteristiche.
Le Schede di Sicurezza dei componenti del kit e le informazioni per lo smaltimento dei rifiuti sono disponibili presso il Servizio di Assistenza Tecnica
SEBIA.
DATI SULLE PRESTAZIONI
Sono stati utilizzati materiali, preparazione dei campioni e procedure standard. Tutti gli elettroforegrammi sono stati interpretati visivamente.
Riproducibilità nel gel e specificità
La riproducibilità è stata dimostrata su due campioni di siero patologico con un livello di componente monoclonale rispettivamente alto e basso, e un
campione con due componenti monoclonali. Ogni campione è stato processato su 2 gels di 2 lotti usando la procedura di colorazione con il violetto
acido.
Tutti i campioni provati hanno fornito, per i 2 lotti, identici risultati, mostrando i quadri tipici ed attesi per il tipo di campione analizzato, con le bande
monoclonali rivelate dall’immunofissazione per ciascun campione di siero.
Riproducibilità tra gel e specificità
La riproducibilità tra gels è stata dimostrata su due campioni di siero patologico con un livello di componente monoclonale rispettivamente alto e basso.
Ogni campione è stato processato su 20 gels di 2 lotti usando la procedura di colorazione con il violetto acido.
Tutti i campioni provati hanno fornito, per i 2 lotti, identici risultati, mostrando i quadri tipici ed attesi per il tipo di campione analizzato, con una banda
monoclonale rivelata dall’immunofissazione per ciascun campione di siero.
Accuratezza
Trentadue differenti campioni di siero patologici sono stati processati usando il kit HYDRAGEL IF K20 ed un altro kit di immunofissazione su gel di
agarosio, reperibile in commercio. Per HYDRAGEL IF K20 è stata usata la colorazione in violetto acido. Le stesse bande sono state evidenziate su
tutti i campioni patologici con entrambi i sistemi usati.
Sensibilità
Sono state preparate delle diluizioni scalari con 3 campioni di siero patologici, tutti con componenti monoclonali, analizzati con la metodica
HYDRAGEL IF K20 utilizzando sia la procedura di colorazione in violetto acido che quella in amidoschwarz.
I risultati sono riportati nella tabella che segue.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
| COMPONENTE MONOCLONALE | LIMITE DI SENSIBILITÀ (g/L) |
CAMPIONE N° TIPO CONC. (g/L) VIOLETTO ACIDO AMIDOSCHWARZ | | | | | |
| 1 | Alfa | 5.33 | 0,25 | 0,25 |
| 1 | Kappa | | 0.25 | 0.25 |
| 2 | Mu | 10.9 | 0.12 | 0.12 |
| 2 | Lambda | | 0.25 | 0.25 |
| 3 | Gamma | 17.2 | 0.25 | 0.50
| |
3 | Lambda | | 0.12 | 0.12 |
BIBLIOGRAFIA
Per ulteriori informazioni sull’interpretazione dei quadri immunofissativi consultare:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd
ed., 1994, 397 pp.

ESPECIFICACIONES DE USO
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
El kit HYDRAGEL IF K20 está diseñado para la detección de proteínas monoclonales en suero humano mediante electroforesis e inmunofijación en
geles de agarosa alcalinos (pH 9.1). Las proteínas séricas son sometidas a electroforesis y después son inmunofijadas con antisueros con diferentes
especificidades: anti-cadenas pesadas gamma (Ig G), alfa (Ig A) y mu (Ig M), y anti-cadenas ligeras kappa y lambda (libres y unidas). Después de la
inmunofijación, las proteínas precipitadas se tiñen con violeta ácido. El exceso de colorante se elimina con una solución ácida.
Cada gel de agarosa en el kit HYDRAGEL IF K20 está pensado para analizar una muestra.
Para adaptarse a las diversas preferencias de los usuarios, los kits HYDRAGEL IF K20 están disponibles con o sin antisueros, y con o sin violeta ácido.
Para Uso Diagnóstico In Vitro.
PRINCIPIO DEL TEST
Las bandas anormales en los patrones electroforéticos de las proteínas séricas, principalmente aquellas que aparecen en las fracciones de betaglobulinas
y gamma-globulinas, son siempre sospechosas de ser proteínas monoclonales y, por lo tanto, son un indicio de gammapatías. Para
identificar esas bandas anormales se utiliza la técnica de la inmunofijación.
La electroforesis seguida de inmunofijación es una técnica sencilla que permite que una proteína sea fijada in situ después de la electroforesis,
mediante la formación de un complejo insoluble con su anticuerpo. Se realiza en cuatro etapas:
1. Separación de las proteínas mediante electroforesis en gel de agarosa.
2. Fijación e inmunoprecipitación de las proteínas separadas mediante electroforesis: la solución fijadora y los antisueros se dispensan directamente
sobre la superficie del gel en los carriles de migración electroforética apropiados. La solución fijadora y los antisueros difunden en el gel
precipitando toas las proteínas y los antígenos correspondientes, respectivamente.
3. Las proteínas solubles no precipitadas son eliminadas del gel mediante absorción con papel y lavado. La precipitina del complejo antígenoanticuerpo
queda atrapada en la matriz del gel.
4. Las proteínas precipitadas son visualizadas mediante tinción. Las bandas inmunoprecipitadas son entonces comparadas con las bandas
anormales correspondientes que aparecen en el patrón electroforético de la muestra de suero.
Para detectar e identificar los componentes monoclonales sospechosos, las muestras son sometidas a electroforesis en seis carriles
simultáneamente. Después de la electroforesis, un carril (ELP) sirve como referencia ya que muestra el patrón electroforético de las proteínas de la
muestra. Los cinco carriles restantes permiten la identificación del(los) componente(s) monoclonal(es) a partir de su(s) reacción(es), o falta de ésta,
con los antisueros frente a cadenas pesadas gamma (Ig G), alfa (Ig A) y mu (Ig M), y frente a cadenas ligeras kappa y lambda libres y unidas.
Esta técnica sencilla y rápida proporciona una imagen clara y fácilmente interpretable.
REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL IF K20
| ARTÍCULOS | REF. N° 3031 | REF. N° 3220* |
| Geles de Agarosa (listos para usar) | 10 geles | 100 geles |
| Tampón Tris-Barbital (solución stock) | 3 viales de 75 mL | 30 viales de 75 m |
| Colorante Violeta Ácido (solución stock) | 1 vial de 75 mL | 3 viales de 75 mL |
| Solución Decolorante (solución stock) | 1 vial de 100 mL | 1 vial de 100 mL |
| Diluyente (listo para usar) | 1 vial de 3.2 mL | 1 vial de 32 mL |
| Solución Fijadora (listo para usar) | | 1 vial de 14.4 mL |
| Inmunoglobulinas de mamífero anti-cadenas | | |
| pesadas gamma humanas (listo para usar) | | 1 vial de 2.5 mL |
| Inmunoglobulinas de mamífero anti-cadenas | | |
| pesadas alfa humanas (listo para usar) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Inmunoglobulinas de mamífero anti-cadenas | | |
| pesadas mu humanas (listo para usar) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Inmunoglobulinas de mamífero anti-cadenas | | |
| ligeras kappa (libres y unidas) humanas (listo para usar) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Inmunoglobulinas de mamífero anti-cadenas | | |
| ligeras lambda (libres y unidas) humanas (listo para usar) | | 1 vial, 2.5 mL |
| Aplicadores de 6 dientes (listos para usar) | 1 caja de 10 | 10 cajas de 10 |
| Papeles de Filtro - Finos | 1 paquete de 10 | 10 paquetes de 10 |
| Peines de Papel de Filtro | 1 paquete de 10 | 10 paquetes de 10 |
| Papeles de Filtro - Gruesos | 2 paquetes de 10 | 20 paquetes de 10 |
* HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
El volumen de tampón suministrado en el MAXI-KIT es para dos migraciones. Conservar el tampón para utilizarlo en dos geles.
NOTA: La solución fijadora y los antisueros se comercializan por separado excepto en el MAXI-KIT (consulte REACTIVOS NECESARIOS NO
SUMINISTRADOS).
PARA OBTENER RESULTADOS ÓPTIMOS
Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y según las instrucciones incluidas.
LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES.
1. GELES DE AGAROSA
Preparación
Los geles de agarosa están listos para su uso. Cada gel contiene: agarosa, 0.8 g/dL ; tampón tris-barbital pH 9.1 ± 0.1 ; aditivos, inocuos a las
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.
ADVERTENCIA: Los geles de agarosa contienen un 0.31 % de barbital y un 0.34 % de barbital sódico. ¡No los ingiera! ¡Si los ha ingerido
consulte a un médico inmediatamente!
INSTRUCCIONES SEBIA - Español

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Uso
Medio de soporte para la electroforesis de proteínas y la inmunofijación posterior.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacene los geles horizontalmente en su envoltorio protector original a temperatura ambiente (15 a 30 °C) o refrigerados (2 a 8 °C). Son estables hasta
la fecha de caducidad indicada en la caja del kit y en las etiquetas del envoltorio. (La flecha situada en la cara frontal del kit debe apuntar hacia arriba).
Evite el almacenaje cerca de una ventana o de una fuente de calor. Evite variaciones de temperatura importantes durante el almacenamiento.
NO LOS CONGELE.
Deséchelos cuando:
(I) se formen cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda (consecuencias de la congelación del gel),
(II) se observe crecimiento bacteriano o fúngico,
(III) haya una cantidad anormal de líquido en la caja del gel (como resultado de la exudación del tampón debida a un almacenamiento inadecuado).
2. TAMPÓN TRIS-BARBITAL
Preparación
Cada vial de la solución stock del tampón se diluye hasta 1 litro con agua destilada o desionizada.
Después de la dilución, la solución de trabajo contiene: tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; azida sódica.
ADVERTENCIA: Cada vial de la solución stock del tampón contiene un 2.45 % de barbital, un 13.73 % de barbital sódico y un 0.13 % de
azida sódica. ¡No lo ingiera! ¡Si lo ha ingerido consulte a un médico inmediatamente! Evite el contacto con ácidos, plomo o cobre, ya que
se conoce su tendencia a formar compuestos explosivos o tóxicos con la azida sódica. Lave siempre con una gran cantidad de agua al
desechar el producto.
Uso
Tampón de electroforesis.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacene la solución stock del tampón a temperatura ambiente o refrigerada. La solución stock es estable durante varios años, por lo menos hasta
la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial. La solución diluida del tampón es estable durante un año a temperatura
ambiente en una botella cerrada.
Deseche la solución diluida del tampón si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.
3. COLORANTE VIOLETA ÁCIDO
Preparación
El vial del colorante violeta ácido stock se diluye hasta 300 mL con agua destilada o desionizada.
Después de la dilución, la solución de trabajo del colorante contiene: solución ácida pH ≈ 2 ; violeta ácido, 0.2 g/dL ; etilén-glicol, 3.25 % ; aditivos,
inocuos a las concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.
ADVERTENCIA: Es perjudicial si se ingiere.
Uso
Para teñir los geles después de la electroforesis de proteínas e inmunofijación posterior.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacene las soluciones stock y de trabajo del colorante a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados para evitar la evaporación.
La solución stock del colorante es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial. La solución de trabajo
del colorante es estable durante 6 meses.
4. SOLUCIÓN DECOLORANTE
Preparación
Cada vial de la solución decolorante stock se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada. Es conveniente diluir sólo 1 mL de la solución
stock hasta 1 litro. Después de la dilución, la solución de trabajo del decolorante contiene: ácido cítrico, 0.05 g/dL.
Uso
Para decolorar, es decir, para eliminar el exceso de tinción y la coloración de fondo de los geles.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacene la solución decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en
las etiquetas del vial. La solución de trabajo del decolorante es estable durante una semana a temperatura ambiente en una botella cerrada. No le
añada azida sódica.
Deseche la solución de trabajo del decolorante si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana.
Para evitar la proliferación microbiana en la solución decolorante diluida que se vaya a almacenar durante más de una semana, añada 5 µL/dL de
ProClin 300.
El decolorante diluido al que se ha añadido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de
caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante.
5. DILUYENTE
Preparación
El diluyente está listo para usar. Contiene: tampón pH 7.5 ± 0.3 ; azul de bromofenol ; aditivos, inocuos a las concentraciones usadas, necesarios
para un funcionamiento óptimo.
Uso
Para diluir las muestras. El azul de bromofenol se utiliza como un marcador conveniente de la aplicación y la migración.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacene el diluyente a temperatura ambiente o refrigerado. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del
vial.
El diluyente debe estar exento de precipitados.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
6. ANTISUEROS (con PN 3220)
Preparación
Están listos para su uso. Todos los antisueros son inmunoglobulinas de mamífero totales anti-humanas. Par una fácil identificación de los antisueros
y como ayuda para controlar su aplicación, los antisueros están coloreados con distintos colorantes no tóxicos como se indica en el Procedimiento,
Sección II. 6. Los colores de las etiquetas de los viales coinciden con los del antisuero correspondiente.
Uso
Para inmunofijar las proteínas separadas mediante electroforesis.
NOTA: Los antisueros son específicos de la técnica de inmunofijación realizada con las plantillas 1 IF, SEBIA.
Los antisueros pueden ser de orígenes animales diferentes. Por ello es muy importante no mezclar dos frascos diferentes de antisueros, incluso de
la misma especificidad, y SIEMPRE cambiar la punta de la pipeta después de pipetear en cada frasco.
IMPORTANTE: Para evitar cualquier contaminación entre los diferentes reactivos, es imperativo poner cada tapón sobre el vial correspondiente
después de usarlo.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacene los antisueros refrigerados (2 a 8 °C). Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas de los viales
de antisuero.
Deséchelos si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelven turbios debido a contaminación microbiana.
NOTA: Durante el transporte, los antisueros pueden permanecer sin refrigeración (15 a 30 °C) durante 15 días sin ningún efecto adverso en su
funcionamiento.
7. SOLUCIÓN FIJADORA (con PN 3220)
Preparación
La solución fijadora está lista para su uso. Contiene: solución ácida ; aditivos, inocuos a las concentraciones usadas, necesarios para un
funcionamiento óptimo. Para una fácil identificación y como ayuda para controlar su aplicación, la solución fijadora está coloreada con un colorante
no tóxico cuyo color coincide con el de la etiqueta del vial (vea Procedimiento, Sección II. 6.).
Uso
Para fijar las proteínas separadas mediante electroforesis en el carril de referencia (ELP).
NOTA: La solución fijadora es específica de la técnica de inmunofijación realizada con las plantillas 1 IF, SEBIA.
IMPORTANTE: Para evitar cualquier contaminación entre los diferentes reactivos, es imperativo poner cada tapón sobre el vial correspondiente
después de usarlo.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacene la solución fijadora a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las
etiquetas del vial.
La solución fijadora debe estar exenta de precipitados.
8. APLICADORES
Uso
Aplicadores precortados de un solo uso para la aplicación de la muestra.
Almacenamiento
Almacene los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados.
9. PAPELES DE FILTRO – FINOS
Uso
Papeles de filtro finos absorbentes, de un solo uso, para absorber el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicación de la muestra.
Conservación
Les papeles de filtro finos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.
10. PEINES DE PAPEL DE FILTRO
Uso
Peines precortados de papel de filtro grueso, de un solo uso, para absorber el exceso de solución fijadora y antisueros de la superficie del gel después
de la inmunofijación.
11. PAPELES DE FILTRO – GRUESOS
Uso
Papeles de filtro gruesos absorbentes, de un solo uso, para absorber las proteínas no precipitadas del gel después de la inmunofijación.
Conservación
Los papeles de filtro gruesos deben conservarse en un lugar seco a temperatura ambiente o en la nevera.
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. CAJA DE ANTISUEROS Y SOLUCIÓN FIJADORA PARA IF (para los kits 3031)
La caja de Antisueros y Solución Fijadora para inmunofijación IF, Plantilla estándar (SEBIA, referencia N° 4815) contiene cinco viales de antisueros,
anti-Ig G, anti-Ig A, anti-Ig M, anti-Kappa (cadenas ligeras libres y ligadas) y anti-Lambda (cadenas ligeras libres y ligadas) de 1 ml cada uno, y un vial
de solución fijadora de 2.5 ml, específicos de la técnica de inmunofijación realizada con las plantillas 1 IF, SEBIA.
1.1 ANTISUEROS
Ver el párrafo 6.
1.2 SOLUCIÓN FIJADORA
Ver el párrafo 7.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
2. SALINA
Preparación
Prepare una solución de NaCl 0.15 M (0.9 g/dL) con agua destilada o desionizada.
Uso
Para lavar los geles después de la incubación con solución fijadora y antisueros.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacénela a temperatura ambiente o refrigerada. Deséchela después de 3 meses o si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a
contaminación microbiana. Para períodos de almacenaje más prolongados, añada azida sódica, 0.1 g/dL.
3. COLORANTE NEGRO AMIDO (SEBIA, PN 4554) (opcional)
Preparación
El colorante negro amido concentrado es una solución viscosa que puede gelificarse, lo que no afecta de ningún modo a la calidad de la solución
final y su capacidad de coloración.
Para obtener una perfecta reconstitución del colorante, siempre hay que prepararlo como se indica a continuación :
1. Añada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado.
2. Cierre el vial con cuidado.
3. Agite el vial intensamente durante un mínimo de 5 segundos.
4. Vierta la solución obtenida en el recipiente de preparación de la solución de coloración.
5. Repita esta operación dos veces, o tres veces si es necesario.
6. Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparación de la solución de coloración.
7. Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada.
8. Agite esta solución de 5 a 10 minutos.
El colorante está listo para usar.
NOTA : Una reconstitución incompleta del colorante puede implicar una mala coloración de la fracción albúmina (disminución de su porcentaje o
aparición de un agujero blanco en el centro de la fracción).
Después de la dilución, la solución colorante contiene: solución ácida pH ≈ 2 ; negro amido, 4 g/L ; etilén-glicol, 6,7 % ; aditivos inocuos a las
concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo.
ATENCIÓN: Nocivo en caso de ingestión.
Uso
Para teñir los geles después de la electroforesis de proteínas y la inmunofijación posterior.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en nevera, en contenedores cerrados para evitar
la evaporación. La solución concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante. La solución
diluida es estable durante 1 mes.
No almacene la solución de colorante diluida cerca de una fuente de calor.
El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en nevera. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en
el kit o en la etiqueta del vial del diluyente del colorante. NO LO CONGELE.
4. FLUIDIL
Preparación
El Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 vial, 5 mL) está listo para su uso.
Uso
Para diluir muestras viscosas o turbias, por ejemplo, sueros que contengan crioglobulina o criogel.
Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro
Almacénelo a temperatura ambiente. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta del vial de Fluidil.
El Fluidil debe estar exento de precipitados.
EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Fuente de alimentación: GD 61 D SEBIA, PN 1300 ; GD 251 D SEBIA, PN 1301 ; MG 300 SEBIA, PN 1302 ó MG 500 SEBIA, PN 1303.
2. APLICADOR HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1409, que contiene el soporte del aplicador HYDRAGEL K20 y la plantilla de aplicación de reactivos 1 IF.
3. Cámara de Almacenaje Húmeda, PN 1270.
4. Cubeta de electroforesis: K20 SEBIA, PN 1400.
5. Tanques y Soportes de Geles para el procesamiento de los geles: Kit de Accesorios HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420.
6. Pipetas: 10 µL, 20 µL, 100 µL y 200 µL.
7. Estufa-Secador: IS 80 SEBIA, PN 1430.
MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS
Extracción y conservación de las muestras
Se recomienda analizar muestras frescas. Los sueros deben obtenerse según los procedimientos establecidos de uso en el laboratorio clínico.
Refrigere las muestras (2 a 8 °C) tan pronto como sea posible después de su obtención, durante una semana como máximo. Para períodos de
conservación más prolongados congele las muestras (así son estables un mes por lo menos).
Congelar las muestras de suero con azida sódica 0,02 g/dL mejora la estabilidad del almacenaje.
IMPORTANTE: No utilice ácido bórico como conservante.
Las muestras descongeladas pueden dar lugar a ligeras marcas de aplicación debidas a la desnaturalización de proteínas o lipoproteínas.

Preparación de las muestras
Diluya el suero antes de la aplicación para evitar el efecto prozona que se da a altos niveles de antígeno y mézclelo bien.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
| CARRIL | SUERO (µL) | DILUYENTE (µL) |
| Carril de inmunofijación de Ig G | 20 | 100 |
| Carril de referencia ELP y el resto de carriles de inmunofijación | 30 | 60 |
Casos especiales
• Si la tasa de inmunoglobulinas es superior a 20 g/L (caso de hipergammaglobulinemia), se recomienda aumentar el factor de dilución de las
muestras (excepto para el recorrido ELP), con el fin de obtener una concentrasción normal de inmunoglobulinas.
• Si la tasa de inmunoglobulinas es inferior a 5 g/L (caso de hipogammaglobulinemia), se recomienda disminuir el factor de dilución de las muestras.
• Para la investigación de cadenas ligeras libres séricas o urinarias, se recomienda utilizar la técnica " BENCE JONES ".
Para ello, el test podrá realizarse con el kit IF y con los antisueros ANTI-KAPPA LIBRE (SEBIA, referencia N° 4610) y ANTI-LAMBDA LIBRE (SEBIA,
referencia N° 4611) o con el kit HYDRAGEL BENCE JONES K20 (SEBIA, referencia N° 3038).
En caso de búsqueda de cadenas libres séricas, diluir la muestra en suero fisiológico, o en diluyente para inmunofijación prediluido a 1/4 (1 volumen
de diluyente + 3 volúmenes de agua destilada o desmineralizada), a 1/10 para los recorridos ELP, GAM, K y L (1 volumen de muestra + 9 volúmenes
de diluyente prediluido o suero fisiológico) y a 1/3 (1 volumen de muestra + 2 volúmenes de diluyente prediluido o suero fisiológico) para los
recorridos revelados con antisueros anti-kappa libre y anti-lambda libre.
Si la tasa de inmunoglobulinas es inferior a 5 g/L, se recomienda diluir menos la muestra; por ejemplo a 1/5 para los recorridos ELP, GAM, K y L,
y a 1/2 para los recorridos Kl y Ll.
• Después de refrigerarlos o congelarlos, algunos sueros (especialmente aquellos que contengan crioglobulina o criogel) pueden volverse viscosos
o desarrollar turbidez. Tales sueros pueden presentar problemas de aplicación debidos a la difusión dificultada a través de los dientes del aplicador
de muestras. En tal caso, añada 25 µL de Fluidil a 75 µL de suero y agítelo en el vórtex durante 15 segundos. Siga entonces con el procedimiento
usual.
• Algunas proteínas monoclonales pueden polimerizar dando lugar a una “fracción monoclonal" que aparece en todos los carriles inmunofijados. En
este caso (i) prepare una solución al 1 % de beta-mercaptoetanol en Fluidil, (ii) añada 25 µL de esta solución reductora a 75 µL de suero neto,
(iii) agite la mezcla en el vórtex y espere 15 minutos como mínimo (máximo 30 minutos) y continúe entonces con el procedimiento habitual.
• Para análisis de Ig D y/o de Ig E, aplicar las mismas diluciones que para las cadenas ligeras libres y ligadas.
Muestras a descartar
• No utilice muestras de plasma. El fibrinógeno da lugar a una banda en el carril de referencia en la fracción gamma que puede ser tomada por una
proteína monoclonal.
• No utilice muestras hemolizadas.
PROCEDIMIENTO
I. MIGRACIÓN
1. Coloque el soporte del aplicador HYDRAGEL K20 en una superficie plana (Fig. 1) y eleve la parte del soporte del aplicador con las muescas
numeradas.
2. Dispense 120 µL de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco impreso en el soporte del aplicador HYDRAGEL K20.
3. Saque el gel de agarosa HYDRAGEL de su envoltorio.
4. Extienda un papel de filtro fino de manera rápida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de líquido. Retire el papel
inmediatamente.
ADVERTENCIA: Para evitar que se deshidrate, no deje que el papel de filtro contacte con el gel durante mucho tiempo.
5. Ponga el gel (con el lado de agarosa hacia arriba) con su borde inferior contra el tope situado debajo del marco impreso (Fig. 2).
6. Doble el gel y haga que contacte con el agua (Fig. 2). Asegúrese de que no se formen burbujas de aire, de que el agua esté extendida bajo
toda la superficie del gel y de que éste esté alineado con el marco impreso.
7. Baje el soporte del aplicador con las muescas numeradas hasta la posición intermedia con la rueda giratoria en posición elevada.
8. Ponga una aplicador en una superficie plana con los números de los pocillos hacia arriba (Fig. 3).
9. Aplique 10 µL de suero diluido correctamente en los pocillos del aplicador como sigue. Cargue el aplicador en menos de 2 minutos.
| CARRIL DE INMUNOFIJACIÓN | POCILLO No |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5
| |
L | 6 |
- Use el aplicador sin demora.
- Para un uso posterior (hasta 8 horas después), coloque el aplicador en la cámara de almacenaje húmeda con los dientes hacia arriba
[cójalo por el marco protector de plástico de los dientes], guarde la cámara entera refrigerada y prepare el gel en el soporte del aplicador
HYDRAGEL K20 justo antes de usarlo.
Consulte la hoja de instrucciones de la cámara húmeda para más detalles.
10. Rompa el marco protector de los dientes del aplicador.
11. Coloque el aplicador de muestra en la posición No. 6 del soporte del aplicador.
IMPORTANTE: Los números impresos en el aplicador de muestra deben quedar de cara al usuario (Fig. 4).
12. Baje el soporte del aplicador hasta que el aplicador contacte con la superficie del gel. NO FUERCE LOS SOPORTES HACIA ABAJO.
13. Cuando haya pasado 1 minuto, gire la rueda giratoria para elevar el aplicador, saque el aplicador y deséchelo.
14. Ponga el gel en una cubeta de electroforesis apropiada, de acuerdo con la polaridad indicada en el gel. Al usar la cubeta SEBIA K20, coloque
el HYDRAGEL en el puente con el lado de agarosa hacia abajo ; el gel debe sumergirse en el tampón alrededor de 1 cm por cada lado.
Consulte la hoja de instrucciones de la cubeta K20 para más detalles.

15. Conecte la cubeta a la fuente de alimentación.
| CONDICIONES DE MIGRACIÓN | SEBIA K20 |
| Volumen de tampón por compartimento | 150 mL |
| Volumen total de tampón | 300 mL |
| Tiempo de migración | 20 minutos |
| Voltaje constante | 100 V
| |
Corriente inicial (un gel) | 16 ± 3 mA |
14. Después de la migración, desconecte la cubeta y saque el gel.
El marcador azul debe estar situado a unos 5 mm del lado anódico del marco impreso.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
II. IMMUNOFIJACIÓN
1. Coloque el soporte del aplicador HYDRAGEL K20 en una superficie plana.
2. Dispense 120 µL de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco impreso en el soporte del aplicador HYDRAGEL K20.
3. Ponga el gel (con el lado de agarosa hacia arriba) con su borde contra el tope situado debajo del marco impreso (Fig. 2).
4. Doble el gel y haga que contacte con el agua (Fig. 2). Asegúrese de que no se formen burbujas de aire, de que el agua esté extendida bajo
toda la superficie del gel y de que éste esté alineado con el marco impreso.
5. Prepare la plantilla de aplicación de reactivos 1 IF como sigue (Fig. 5):
- Coloque la plantilla de aplicación en las horquillas de sujeción.
- Sostenga la solapa de la plantilla y haga descender la plantilla sobre el gel.
- Los canales de la plantilla deben estar perfectamente alineados con las huellas de los dientes del aplicador que han quedado en el gel.
6. Aplique los reactivos como sigue:
| CANAL | VOLUMEN (µL) | REACTIVO | COLOR |
| ELP | 40 | solución fijadora | amarillo |
| G | 25 | antisuero anti-cadenas pesadas gamma | rosa |
| A | 25 | antisuero anti-cadenas pesadas alfa | azul oscuro |
| M | 25 | antisuero anti-cadenas pesadas mu | verde amarillento |
| K | 25 | antisuero anti-cadenas ligeras kappa (libres y unidas) | verde claro |
| L | 25 | antisuero anti-cadenas ligeras lambda (libres y unidas) | azul claro |
NOTA: Para evitar confusiones, los colores de los reactivos aparecen tanto en las etiquetas del vial como en los pocillos de la plantilla de
aplicación.
- Aspire los reactivos sin atrapar burbujas de aire en la punta de la pipeta.
- Aplique los reactivos (Fig. 6):
- Sostenga la pipeta verticalmente y apoye su punta suavemente en el fondo del pocillo.
- Dispense el reactivo de manera que se extienda por el canal sin que se formen burbujas de aire.
7. Incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
III. ELIMINACIÓN DE LOS REACTIVOS
1. Elimine el exceso de reactivos con el peine de papel de filtro (Fig. 7).
2. Elimine los reactivos en menos de 30 segundos.
- IInserte el peine formando un ángulo de 30° en las ranuras del extremo inferior de los canales de la plantilla de forma que los dientes toquen
el lado vertical más alejado del operario.
- Permita que los dientes contacten suavemente con el líquido inclinando cada peine un ángulo de 45°, permitiendo así que los dientes
absorban el líquido (Fig. 8).
IMPORTANTE: El peine debe permanecer inclinado (45°). Si se pone recto podría dañar el gel.
IV. ELIMINACIÓN DE LAS PROTEÍNAS NO PRECIPITADAS
1. Saque el peine.
2. Compruebe que los reactivos se han absorbido bien, lo que es indicado por:
- la ausencia de reactivos sobre el gel.
- toda la extensión de los dientes está teñida.
Si la absorción de los reactivos es incompleta, inserte de nuevo el mismo peine de papel de filtro (en la misma posición) y repita
manualmente el procedimiento de eliminación.
3. Coja la plantilla de aplicación de reactivos por la solapa, elévela y sáquela.
4. Aplique un papel de filtro grueso sobre el gel durante 4 minutos. El papel de filtro grueso debe contactar con el gel de forma uniforme.
ATENCIÓN : Asegurarse de apoyar correctamente toda la superficie de la hoja de papel de filtro, para conseguir un perfecto contacto
entre el gel y el papel.
5. Retire el papel de filtro. Lave el gel verticalmente en salina durante 5 minutos. Coloque el gel de manera de que el carril ELP esté situado en
la parte inferior del soporte del gel.
6. Ponga el gel en una superficie plana.
7. Coloque un nuevo papel de filtro grueso sobre el gel. El papel de filtro grueso debe contactar con el gel de forma uniforme.
8. Seque el gel completamente en la estufa-secador IS 80 a 80 °C hasta que el papel de filtro esté completamente seco (unos 7 minutos) o, si
no dispone de la estufa-secador IS 80, deje el papel de filtro en contacto uniforme con el gel durante 5 minutos y seque el gel completamente
con aire caliente.
9. Limpie la plantilla de aplicación con un cepillo pequeño (por ejemplo, un cepillo de dientes). NO UTILICE ALCOHOL O DISOLVENTES.
Asegúrese de que la plantilla esté completamente seca antes de volver a usarla ; elimine las gotitas de agua de los pocillos golpeando
ligeramente la plantilla sobre papel suave.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
V. TINCIÓN Y DECOLORACIÓN
1. Después del secado, sumerja el gel completamente seco verticalmente en salina durante 3 minutos.
2. Sumérjalo después verticalmente en la solución de tinción durante 4 minutos.
3. Decolore en tres baños sucesivos de solución decolorante hasta que la coloración de fondo sea completamente incolora y clara.
4. Seque el gel en una corriente de aire a 80 °C. Si es necesario, limpie el reverso del gel (el lado de soporte de plástico) con un papel suave
humedecido.
RESULTADOS
Interpretación
Ausencia de componente monoclonal
• Una muestra de suero normal presenta una tinción leve y difusa de las inmunoglobulinas policlonales en todos los carriles.
• Una hipergammaglobulinemia se caracteriza por una zona difusa fuertemente teñida y por la ausencia de bandas claramente definidas.
Presencia de un componente monoclonal
• La presencia de una proteína monoclonal (gammapatía) se caracteriza por la presencia de una banda monoclonal detectada con uno de los
antisueros anti-cadenas pesadas (gamma, alfa o mu) y con cualquiera de los antisueros anti-cadenas ligeras kappa o lambda. La banda monoclonal
detectada, normalmente de apariencia definida y demarcada, debe estar localizada a la misma distancia de migración que la banda monoclonal
sospechosa que aparece en el carril de referencia (ELP).
• La ausencia de reacción con una de las anti-cadenas pesadas aplicadas, pero con presencia de una cadena ligera, puede significar:
a) Presencia de una gammapatía Ig D ó Ig E que es conveniente confirmar con anti-cadenas pesadas delta o épsilon.
b) La presencia de una cadena ligera libre que es conveniente confirmar con los antisueros específicos anti-cadenas ligeras libres kappa o lambda.
• El no observar una reacción positiva con cualquiera de los antisueros anti-cadenas ligeras aplicados, mientras un antisuero anti-cadenas pesadas
reacciona, podría indicar una muy poco frecuente gammapatía de cadenas pesadas (gamma, alfa o mu).
Presencia de dos o más componentes monoclonales
En casos excepcionales, varios clones de células B proliferan, lo que es indicado por varias bandas monoclonales reveladas mediante la
inmunofijación:
• Una gammapatía biclonal se caracteriza por la presencia de dos bandas de cadenas pesadas (idénticas o diferentes) y dos bandas de cadenas
ligeras (idénticas o diferentes).
• Las inmunoglobulinas polimerizadas se caracterizan por la presencia de varias bandas del mismo tipo de cadena pesada y una del mismo tipo de
cadena ligera. Para confirmar la presencia de una única anomalía monoclonal, es necesario despolimerizar con beta-mercaptoetanol y repetir la
inmunofijación (consulte "MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS").
• Una gammapatía oligoclonal se caracteriza por la presencia de múltiples bandas de uno o más tipos de cadenas pesadas y por uno o dos tipos de
cadenas ligeras.
Casos especiales
• Cuando una banda de tipo monoclonal se observa en la electroforesis de suero (carril ELP) pero no es confirmada por la inmunofijación, el
fibrinógeno (muestra de plasma) debería ser el primer sospechoso.
• Cuando una banda de tipo monoclonal se observa en todos los carriles de inmunofijación, debe sospecharse la existencia de crioglobulina o Ig M
polimerizada. Despolimerice con un agente reductor y repita el procedimiento (consulte "MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS").
Limitaciones
Vea MUESTRAS PARA ANILISIS.
La utilización de antisueros distintos a los especificados para la técnica de inmunofijación realizada con la plantilla estándar puede afectar a la calidad
de los resultados.
Teniendo en cuenta los principios analíticos de las técnicas actuales (principios de la electroforesis de zona, resolución y sensibilidad), no puede darse
ninguna garantía respecto a la detección de la totalidad de todos los componente monoclonales.
Resolución de problemas
Llame al Servicio de Atención Técnica de su distribuidor cuando la prueba no funcione pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para
la preparación y el almacenaje de los materiales y para el procedimiento.
Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit, así como las informaciones relativas a la eliminación de los desechos, están disponibles
en el Servicio de Asistencia Técnica de su distribuidor.
CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS
Se utilizaron materiales, preparación de la muestra y procedimientos estándar. Todas las electroforesis fueron evaluadas visualmente.
Reproducibilidad intrageles (intraserial) y especificidad
La reproducibilidad intrageles fue demostrada con dos muestras de suero patológicas con un nivel bajo y elevado de componente monoclonal
respectivamente, y con una muestra con dos componentes monoclonales. Cada muestra se analizó en 2 geles procedentes de 2 lotes usando el
procedimiento de tinción con violeta ácido.
Todas las muestras analizadas proporcionaron resultados idénticos con los 2 lotes, mostrando los patrones típicos y según lo esperado para el tipo
de muestra analizado, detectándose bandas monoclonales mediante inmunofijación en cada muestra de suero.
Reproducibilidad intergeles (interserial) y especificidad
La reproducibilidad intergeles fue demostrada con dos muestras de suero patológicas con un nivel bajo y elevado de componente monoclonal
respectivamente. Cada muestra se analizó en 20 geles procedentes de 2 lotes usando el procedimiento de tinción con violeta ácido.
Todas las muestras analizadas proporcionaron resultados idénticos con los 2 lotes mostrando los patrones típicos y según lo esperado para el tipo
de muestra analizada, con una banda monoclonal detectada mediante inmunofijación en cada muestra de suero.
Exactitud
Treinta y dos muestras de suero patológicas diferentes fueron analizadas usando el kit HYDRAGEL IF K20 y otro sistema comercial de inmunofijación
en geles de agarosa. El procedimiento HYDRAGEL IF K20 fue probado con el procedimiento de tinción con violeta ácido. Se detectaron bandas
idénticas en todas las muestras patológicas con cada sistema.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Sensibilidad
Se prepararon diluciones seriales con 3 muestras de suero patológicas que presentaban componentes monoclonales y se analizaron con el
procedimiento HYDRAGEL IF K20 usando el procedimiento de tinción tanto con violeta ácido como con negro amido.
Los resultados están resumidos debajo.
| COMPONENTE MONOCLONAL | LÍMITE DE DETECCIÓN (g/L) |
MUESTRA No. TIPO CONC. (g/L) VIOLETA ÁCIDO NEGRO AMIDO | | | | | |
| 1 | alfa | 5.33 | 0.25 | 0.25 |
| 1 | kappa | | 0.25 | 0.25 |
| 2 | mu | 10.9 | 0.12 | 0.12 |
| 2 | lambda | | 0.25 | 0.25 |
| 3 | gamma | 17.2 | 0.25 | 0.50
| |
3 | lambda | | 0.12 | 0.12 |
BIBLIOGRAFÍA
Para información adicional o interpretación de resultados consultar :
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd
ed., 1994, 397 pp.

UTILIZAÇÃO
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
O kit HYDRAGEL IF K20 e destina-se à detecção de proteínas monoclonais no soro humano, por electroforese em gel de agarose. As proteínas são
separadas por electroforese em meio alcalino (pH 9,1) e depois imunoprecipitadas com antisoros de especificidades diferentes: anti-cadeias pesadas
gama (Ig G), alfa (Ig A) e mu (Ig M), e anti-cadeias leves kapa e lambda (livres e ligadas).
Após imunofixação, as proteínas imunoprecipitadas são coradas com violeta ácido. O excesso de corante é eliminado em meio ácido.
Cada gel de agarose poderá analisar 1 amostra no kit HYDRAGEL IF K20.
Para satisfazer as preferências dos diferentes utilizadores, os kits estão disponíveis com ou sem antisoros e com o corante violeta ácido.
Para diagnóstico in vitro. Registado no INFARMED.
PRINCÍPIO DO TESTE
As imunoglobulinas monoclonais, marcadores das gamapatias, são detectadas por electroforese das proteínas. Elas apresentam-se sob a forma de
bandas anormais situadas essencialmente nas zonas das beta ou gama globulinas. A imunofixação efectuada com a ajuda de antisoros
monoespecíficos permite a identificação das bandas monoclonais despistadas por electroforese.
A técnica é feita em quatro etapas:
1. Separação das proteínas por electroforese em gel de agarose.
2. Fixação e imunoprecipitação das proteínas separadas por electroforese: aplicação do fixador e dos antisoros directamente sobre o gel, ao nível
das pistas de migração. Estes últimos difundem-se no gel, o fixador precipita todas as proteínas e os anticorpos precipitam os antigénios
correspondentes.
3. As proteínas solúveis, não precipitadas, são removidas do gel por lavagem e absorção com papel de filtro. As proteínas precipitadas ficam retidas
no interior da matriz do gel.
4. Coloração das proteínas e comparação da posição das bandas imunoprecipitadas com as bandas anómalas observadas após electroforese das
proteínas.
Para identificar de forma precisa a natureza das bandas monoclonais, as amostras são testadas simultaneamente em seis pistas. Depois da
electroforese, a pista ELP serve como referência, mostrando o perfil electroforético das proteínas da amostra. As restantes cinco pistas permitem a
caracterização da(s) bandas(s) monoclonal(is) graças aos anticorpos específicos anti-cadeias pesadas gama (Ig G), alfa (Ig A) e mu (Ig M), e anticadeias
leves kapa e lambda (livres e ligadas). Esta técnica simples e rápida dá uma imagem clara e muito fácil de interpretar.
REAGENTES E MATERIAIS FORNECIDOS NO KIT HYDRAGEL IF K20
| KIT HYDRAGEL IF K20 | REF. N° 3031 | REF. N° 3220* |
| Geles de agarose (prontos a usar) | 10 geles | 100 geles |
| Tampão Tris-Barbital (solução concentrada) | 3 frasco, 75 ml | 30 frasco, 75 ml |
| Corante violeta ácido (solução concentrada) | 1 frasco, 75 ml | 3 frasco, 75 ml |
| Descorante (solução concentrada) | 1 frasco, 100 ml | 1 frasco, 100 ml |
| Diluente (pronto a usar) | 1 frasco, 3,2 ml | 1 frasco, 32 ml |
| Fixador (pronto a usar) | | 1 frasco, 14,4 ml |
| Imunoglobulinas totais de mamífero anti-cadeias | | |
| pesadas gama (prontas a usar) | | 1 frasco, 2,5 ml |
| Imunoglobulinas totais de mamífero anti-cadeias | | |
| pesadas alfa (prontas a usar) | | 1 frasco, 2,5 ml |
| Imunoglobulinas totais de mamífero anti-cadeias | | |
| pesadas um (prontas a usar) | | 1 frasco, 2,5 ml |
| Imunoglobulinas totais de mamífero, anti-cadeias | | |
| leves kapa (livres e ligadas) (prontas a usar) | | 1 frasco, 2,5 ml |
| Imunoglobulinas totais de mamífero, anti-cadeias | | |
| leves lambda (livres e ligadas) (prontas a usar) | | 1 frasco, 2,5 ml |
| Aplicadores 6 dentes (prontos a usar) | 1 caixa de 10 | 10 caixas de 10 |
| Papéis de filtro finos | 1 pacote de 10 | 10 pacotes de 10 |
| Pentes de papel de filtro | 1 pacote de 10 | 10 pacotes de 10 |
| Papéis de filtro espessos | 2 pacote de 10 | 20 pacotes de 10 |
* HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
A quantidade de tampão fornecida com o MAXI-KIT destina-se a duas migrações. Conservar o tampão para dois geles.
NOTA: O Fixador e os Antisoros são fornecidos separadamente, excepto para o MAXI-KIT (ver REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO
FORNECIDOS).
PARA OPTIMIZAÇÃO DOS RESULTADOS
Os elementos de um mesmo kit devem ser utilizados em conjunto, e de acordo com as instruções de utilização.
LER ATENTAMENTE AS INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO.
1. GELES DE AGAROSE
Preparação
Os geles de agarose estão prontos a usar. Cada gel contém: agarose, 8 g/l ; tampão tris-barbital pH 9,1 ± 0,1 ; aditivos, não perigosos nas
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.
AVISO: Os geles de agarose contêm 0,31 % de barbital e 0,34 % de barbital sódico. Não ingerir! Se ingerido, consultar imediatamente um
médico!
INSTRUÇÕES DE USO SEBIA - Português

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Utilização
Suporte para electroforese e imunofixação das proteínas.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar os geles horizontalmente, nas embalagens protectoras de origem, à temperatura ambiente (15 - 30 °C) ou no frigorífico (2 - 8 °C) (a seta
existente na parte da frente da caixa do kit deve ficar voltada para cima). Os geles são estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou
nos rótulos das embalagens dos geles. Evitar variações da temperatura durante o armazenamento (ex: não armazenar perto de uma janela ou de
uma fonte de calor). NÃO CONGELAR!
Deitar fora o gel quando:
(i) houver cristais ou precipitados na superfície do gel ou quando a textura do mesmo fôr muito macia (isto sucede se o gel for congelado) ;
(ii) há desenvolvimento de bactérias ou fungos ;
(iii) estiver presente uma quantidade anormal de líquido na embalagem do gel (resultante da exsudação do gel devido a condições de
armazenamento inadequadas).
2. TAMPÃO TRIS-BARBITAL
Preparação
Cada frasco de tampão concentrado deve ser diluído até 1 litro com água destilada ou desionisada. Após diluição a solução contem: tris-barbital
pH 9,2 ± 0,3 ; azida de sódio ; aditivos, não perigosos nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.
AVISO: Cada frasco da solução concentrada contem 2,45 % de barbital, 13,73 % de barbital sódico e 0,13 % de azida de sódio. Não ingerir!
Se ingerida, consultar imediatamente um médico! Quando deitar fora a solução evitar o seu contacto com ácidos, chumbo ou cobre, já que
estes elementos formam compostos explosivos ou tóxicos com a azida de sódio. Usar sempre grande quantidade de água, quando deitar
fora.
Utilização
Tampão para a electroforese.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar o tampão concentrado à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável por vários anos, pelo menos até ao fim da validade indicada
na caixa do kit ou no rótulo do frasco. A solução diluída é estável por um ano, à temperatura ambiente, num frasco rolhado. Deitar fora se o seu
aspecto se alterar ou se ficar turva devido a contaminação microbiana.
3. CORANTE VIOLETA ÁCIDA
Preparação
A solução de corante concentrado, deve ser diluída até ao volume de 300 ml com água destilada ou desmineralizada. Após diluição, a solução de
corante contém: solução ácida pH ≈ 2 ; violeta ácida, 2 g/l ; etilenoglicol, 3,25 % ; aditivos, não perigosos nas concentrações usadas, necessários
para optimizar o ensaio.
AVISO: Nocivo em caso de ingestão.
Utilização
Para corar geles depois da electroforese e imunofixação das proteínas.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar a solução de corante concentrada e a solução diluída à temperatura ambiente ou no frigorífico em frascos fechados para evitar a
evaporação.
A solução concentrada é estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos. A solução diluída de corante é estável
por 6 meses.
4. SOLUÇÃO DESCORANTE
Preparação
Cada frasco de solução descorante concentrada deve ser diluído a 1/1000 com água destilada ou desmineralizada ; permite obter 100 litros de
solução total.
É conveniente diluir apenas 1 ml da solução concentrada de cada vez, para o volume final de 1 litro.
Após diluição, a solução descorante contém: ácido cítrico, 0,5 g/l.
Utilização
Na descoloração, isto é, remoção do excesso de corante do gel.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar a solução descorante concentrada à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou
no rótulo do frasco.
A solução descorante diluída é estável por um mês à temperatura ambiente, quando conservada em frasco fechado. Deitar fora se o seu aspecto se
alterar, isto é, se ficar turvo devido a contaminação microbiana.
Não adicionar azida de sódio.
Em caso de conservação mais prolongada da solução diluída (superior a uma semana), adicionar 50 µl/l de ProClin 300 para evitar qualquer
proliferação microbiana.
A solução descorante diluída contendo ProClin é estável à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C). É estável até ao
fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco do descolorante.
5. DILUENTE
Preparação
O diluente é fornecido pronto a usar. Contém tampão alcalino pH 7,5 ± 0,3 ; azul de bromofenol ; aditivos, não perigosos nas concentrações usadas,
necessários para optimizar o ensaio.
Utilização
Para diluição das amostras. O azul de bromofenol permite verificar a qualidade da aplicação das amostras e da migração.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar o diluente à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. O
diluente deve apresentar-se livre de precipitados.

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6. ANTISOROS (Ref. n° 3220)
Preparação
Prontos a usar. Todos os antisoros são imunoglobulinas totais de mamífero anti-humanas. Cada um tem uma cor específica para evitar todos os erros
de utilização (ver Técnica, Capítulo II.6). Os rótulos dos frascos têm a mesma cor que as soluções.
Se os antisoros apresentarem uma ligeira turvação, basta, normalmente, pôr os antisoros à temperatura ambiente durante 10 minutos antes da sua
utilização. No entanto, se a turvação persistir, não perturba em nada a reacção imunológica.
Utilização
Para imunoprecipitação das proteínas previamente separadas por electroforese.
NOTA : O antisoro é específico da técnica de imunofixação com as máscaras 1 IF, SEBIA.
Os antisoros podem ter origem em animais diferentes. É assim fundamental que não se misturem dois frascos de antisoros diferentes, mesmo que
apresentem a mesma especificidade e que se mude SEMPRE a ponta da pipeta quando se muda de frasco de antisoro.
IMPORTANTE: Para evitar qualquer contaminação entre os diferentes reagentes, é imperativo voltar a colocar a tampa do frasco correspondente,
após utilização.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar os antisoros no frigorífico (2 - 8 °C). São estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos de antisoro.
Deitar fora se verificar que o seu aspecto sofreu alteração ou se ficou turvo devido a contaminação microbiana.
NOTA: Durante o transporte, os antisoros podem ser mantidos à temperatura ambiente (15 - 30 °C) durante 15 dias sem que isso afecte a qualidade
do teste.
7. FIXADOR (Ref. n° 3220)
Preparação
O fixador vem pronto a usar. Contém: solução ácida ; aditivos, não perigosos nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.
Tem uma cor específica para evitar todos os erros de utilização. A cor é igual à do rótulo do frasco (ver Técnica, Capítulo II.6.).
Utilização
Para fixar as proteínas separadas por electroforese na pista de referência (ELP).
NOTA : A solução fixadora é específica da técnica de imunofixação com as máscaras 1 IF, SEBIA.
IMPORTANTE: Para evitar qualquer contaminação entre os diferentes reagentes, é imperativo voltar a colocar a tampa do frasco correspondente,
após utilização.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar o fixador à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. O
fixador deve estar livre de precipitados.
8. APLICADORES
Utilização
Aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras.
Armazenamento
Armazenar os aplicadores em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.
9. PAPÉIS DE FILTRO FINOS
Utilização
Pré-cortados, de utilização única, destinam-se a absorver o excesso de humidade da superfície do gel antes da aplicação da amostra.
Armanezamento
Armazenar os papéis de filtro finos em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.
10. PENTES DE PAPEL DE FILTRO
Utilização
Pré-cortados, de utilização única, estes pentes de papel de filtro espesso destinam-se a absorver o excesso de reagentes da superfície do gel depois
da fase da imunofixação.
11. PAPÉIS DE FILTRO ESPESSO
Utilização
De utilização única, destinam-se a absorver as proteínas não precipitadas da superfície do gel depois da fase da imunofixação.
Armanezamento
Armazenar os papéis de filtro espessos em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico.
REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
1. ANTISOROS E FIXADOR (para os kits com ref. nº 3031)
O Kit de antisoros e fixador para imunofixação IF, máscara padrão (SEBIA ref. nº 4815) contém 5 frascos de antisoros, anti-Ig G, anti-Ig A, anti-Ig M,
anti-Kappa (cadeias leves livre e ligadas) e anti-Lambda (cadeias leves livres e ligadas) com 1 ml cada e um de solução fixadora, com 2,5 ml. São
específicos para a realização do procedimento de imunofixação com as máscaras 1 IF, SEBIA.
1.1 ANTISOROS
Ver parágrafo 6 anterior.
1.2 FIXADOR
Ver parágrafo 7 anterior.
2. SORO FISIOLÓGICO
Preparação
Solução de NaCl 0,15 M (9 g/l) em água destilada ou desmineralizada.
Utilização
Para lavagem do gel após incubação com o fixador e os antisoros.

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Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
A solução de soro fisiológico pode ser conservada à temperatura ambiente ou no frigorifico.
Eliminar a solução após 3 meses ou se o seu aspecto sofreu alteração ou se ficou turvo devido a contaminação microbiana. Para uma conservação
prolongada, adicionar 1 g/l de azida de sódio.
3. CORANTE NEGRO DE AMIDO (SEBIA, ref. n° 4554)
Preparação
O corante negro de amido concentrado, é uma solução viscosa que pode eventualmente gelificar, o que não afecta nada a qualidade da solução final
e o seu poder de coloração.
Em qualquer caso, para obter uma perfeita reconstituição do corante, é necessário que seja respeitado o procedimento seguinte:
1. Adicionar cerca de 15 ml do diluente do corante ao frasco do negro de amido concentrado.
2. Fechar cuidadosamente o frasco.
3. Agitar muito vigorosamente o frasco durante pelo menos 5 segundos.
4. Transferir esta solução para o recipiente de preparação da solução de coloração.
5. Repetir esta etapa duas vezes ou se necessário 3 vezes.
6. Transferir o diluente restante para o recipiente de preparação da solução de coloração.
7. Completar o volume para 300 ml com água destilada ou desmineralizada.
8. Agitar muito bem esta solução durante 5 a 10 minutos.
A solução corante está pronta a utilizar.
NOTA : Uma reconstituição incompleta do corante pode provocar uma má coloração da fracção de albumina (baixa da percentagem ou lacuna dentro
da fracção).
Após diluição, a solução de corante contém: solução ácida pH ≈ 2 ; negro de amido, 4 g/L ; etilenoglicol, 6,7 % ; aditivos, não perigosos nas
concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio.
AVISO: Nocivo em caso de ingestão.
Utilização
Para corar os geles após a separação por electroforese das proteínas.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar a solução de corante concentrada e a solução diluída à temperatura ambiente ou no frigorífico em frascos fechados para evitar a
evaporação.
A solução concentrada é estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos. A solução diluída de corante é estável
por um mês.
Não guardar a solução de trabalho do corante próximo de uma fonte de calor.
Armazene a solução concentrada de diluente de corante à temperatura ambiente ou no frigorífico. A solução é estável até ao fim da validade indicada
na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos. NÃO CONGELAR.
4. FLUIDIL
Preparação
O Fluidil (SEBIA ref. n° 4587, 1 frasco de 5 ml) vem pronto a ser usado.
Utilização
Destina-se a diluir amostras viscosas ou turvas, por exemplo, soro contendo uma crioglobulina ou um criogel.
Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração
Armazenar à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco de Fluidil. O Fluidil não deve conter
quaisquer precipitados.
EQUIPAMENTO E ACESSÓRIOS NECESSÁRIOS
1. Fonte de alimentação, ex: GD 61 D SEBIA, ref. n° 1300 ; GD 251 D SEBIA, ref. n° 1301 ; MG 300 SEBIA, ref. n° 1302 ou MG 500 SEBIA,
ref. n° 1303.
2. APPLICATEUR HYDRAGEL K20 SEBIA, ref. n° 1409, que contém o suporte-aplicador HYDRAGEL K20 e a máscara 1 IF.
3. Câmara húmida, ref. n° 1270.
4. Câmara de electroforese: K20 SEBIA, ref. n° 1400.
5. Tinas e suportes para o tratamento de geles de 7 amostras: kit de acessórios HYDRAGEL K20 SEBIA ref. n° 1420.
6. Pipetas: 10 µl, 20 µl, 100 µl e 200 µl.
7. Incubador-secador: IS 80 SEBIA, ref. n° 1430.
AMOSTRAS
Colheita e conservação das amostras
É recomendada a utilização de amostras frescas. Os soros devem ser colhidos de acordo com os métodos utilizados nos laboratórios de análises
clínicas. As amostras devem ser refrigeradas (2 - 8 °C) o mais depressa possível após colheita, até uma semana. Para conservações prolongadas,
congelar as amostras. As amostras congeladas são estáveis durante pelo menos um mês. O congelamento das amostras de soro com azida de sódio
a 0,2 g/l, aumenta a estabilidade do armazenamento.
IMPORTANTE: Não usar ácido bórico como conservante.
As amostras descongeladas podem levar ao aparecimento de ligeiras bandas no ponto de aplicação, devido à desnaturação das proteínas ou
lipoproteínas.
Preparação das amostras
Para evitar fenómenos de zona por excesso de antigénio, diluir o soro antes da aplicação, conforme a tabela seguinte:
| PISTA | SORO (µl) | DILUENTE (µl) |
| Pista de referência ELP e outras pistas imunológicas | 30 | 60 |
| Pista imunológica G | 20 | 100 |

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Casos especiais
• Se a taxa de imunoglobulinas fôr superior a 20 g/l (no caso de uma hipergamaglobulinémia), recomenda-se aumentar o factor de diluição das
amostras (excepto para a pista ELP), de modo a obter uma concentração normal de imunoglobulinas.
• Se a taxa de imunoglobulinas fôr inferior a 5 g/l, (no caso de uma hipogamaglobulinémia), recomenda-se diminuir o factor de diluição das amostras.
• Para pesquisar cadeias leves livres séricas ou urinárias, recomenda-se a utilização do programa "BENCE JONES".
O teste poderá realizar-se com o kit IF e com os antisoros ANTI-KAPPA LIBRE (SEBIA, ref. nº 4610) e ANTI-LAMBDA LIBRE (SEBIA, ref. nº 4611)
ou com o kit HYDRAGEL BENCE JONES K20 (SEBIA, ref. n° 3038).
Em caso de pesquisa de cadeias livres séricas, deve-se diluir o soro em soro fisiológico ou com diluente para imunofixação pré-diluído a 1/4
(1 volume de diluente + 3 volumes de água destilada ou desionizada) para 1/10 nas pistas ELP, GAM, K e L (1 volume de soro + 9 volumes de
diluente pré-diluído ou de soro fisiológico) e a 1/3 (1 volume de soro + 2 volumes de diluente pré-diluído ou de soro fisiológico) para as pistas pistas
reveladas com os antisoros anti-kapa livres e anti-lambda livres.
Se a taxa de imunoglobulinas fôr inferior a 5 g/l, recomenda-se diluir menos o soro ; por exemplo, a 1/5 para as pistas ELP, GAM, K e L e a 1/2
para as pistas Kl e Ll.
• Após conservação a 2 - 8 °C ou congelamento, alguns soros (especialmente os que contêm uma crioglobulina ou um criogel) podem tornar-se
viscosos ou turvos. Estes soros podem apresentar problemas na aplicação porque difundem com muita dificuldade pelos dentes do aplicador de
amostras. Neste caso, adicionar 25 µl de Fluidil a 75 µl de soro e agitar no vortex durante 15 segundos. Depois, seguir a técnica normal.
• Certas paraproteínas estão polimerizadas, o que resulta no aparecimento de uma "banda monoclonal" em todas as pistas. Neste caso preparar
uma solução de ß-mercaptoetanol a 1 % em Fluidil. Adicionar 25 µl de solução redutora a 75 µl de soro puro, agitar no vortex e aguardar pelo
menos 15 minutos (máximo de 30 minutos) e depois seguir o método normal.
• Para análise das Ig D e/ou das Ig E, utilizar as mesmas diluições que para as cadeias leves livres e ligadas.
Amostras a evitar
• Não utilizar amostras hemolisadas.
• Não utilizar amostras de plasma. O fibrinogénio leva ao aparecimento de uma banda perto do ponto de aplicação que pode ser confundida com
uma gamapatia monoclonal e aumentar a percentagem da zona correspondente.
TÉCNICA
I. MIGRAÇÃO
1. Colocar o suporte-aplicador HYDRAGEL K20 sobre a bancada (Fig. 1) e erguer a parte móvel do mesmo (suporte dos aplicadores).
2. Colocar 120 µl de água destilada ou desmineralizada no terço inferior do quadro impresso no suporte-aplicador.
3. Retirar o gel da embalagem.
4. Eliminar rapidamente o excesso de líquido da superfície do gel com a ajuda de um papel de filtro fino.
ATENÇÃO: Não deixar o papel de filtro em contacto prolongado com o gel, para evitar a sua desidratação.
5. Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso no suporte-aplicador (Fig. 2).
6. Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 2) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura do
gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal. A gota de água
deve-se repartir sobre toda a superfície do gel.
7. Baixar o suporte dos aplicadores até uma posição intermédia, com o botão, situado lateralmente, voltado para cima.
8. Colocar um aplicador numa superfície plana, com os números dos poços virados para cima.
9. Aplicar 10 µl de soro em cada poço. A pipetagem das amostras não deve ultrapassar os 2 minutos.
| PISTAS | POÇO No |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5
|
|
L | 6 |
- O aplicador deve ser utilizado imediatamente após a colocação das amostras.
- Para uma utilização posterior (8 horas no máximo), colocar o aplicador na câmara húmida com os dentes voltados para cima (segure-o
pela protecção de plástico), pôr a câmara húmida no frigorífico e só colocar o gel no suporte-aplicador HYDRAGEL K20 no momento da
sua utilização.
Ver as instruções de utilização da câmara húmida para mais detalhes.
10. Quebrar e retirar a protecção dos dentes.
11. Colocar o aplicador na posição n° 6 do suporte-aplicador.
IMPORTANTE: Os números impressos no aplicador devem ficar virados para o operador (Fig. 4).
12. Baixar o suporte do aplicador rodando o botão lateral de modo a que o aplicador fique em contacto com o gel. NÃO FORÇAR A DESCIDA
DO SUPORTE DOS APLICADORES.
13. Após 1 minuto de aplicação, rodar o botão lateral para levantar o aplicador. Retirar o aplicador e deitar fora.
14. Colocar o gel na tina de electroforese, segundo a polaridade indicada no gel, com as amostras no lado do cátodo.
Posicionar o HYDRAGEL no suporte da tina K20 com o lado do gel voltado para baixo ; o gel deve mergulhar cerca de 1 cm no tampão, de
cada lado.
Ver instruções da câmara K20 para mais pormenores.

15. Ligar a tina à fonte de alimentação.
| CONDIÇÕES DE MIGRAÇÃO | SEBIA K20 |
| Volume de tampão por compartimento | 150 mL |
| Volume total de tampão | 300 mL |
| Tempo de migração | 20 minutes |
| Voltagem constante | 100 V
| |
Corrente inicial (por gel) | 16 ± 3 mA |
16. Após migração, desligar a tina e retirar o gel.
O traço azul deve-se encontrar aproximadamente a 5 mm do bordo anódico do quadro serigráfico.
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
II. IMUNOFIXAÇÃO
1. Colocar o suporte-aplicador HYDRAGEL K20 sobre a bancada.
2. Colocar 120 µl de água destilada ou desmineralizada no terço inferior do quadro impresso no suporte-aplicador.
3. Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso no suporte-aplicador (Fig. 2).
4. Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 2) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura do
gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal. A gota de água
deve-se repartir sobre toda a superfície do gel.
5. Colocar em posição a máscara 1 IF de aplicação dos reagentes no suporte-aplicador da seguinte forma (Fig. 5):
- Colocar os encaixes da máscara sobre os grampos do suporte segurando a máscara pela pega.
- Baixar a máscara sobre o gel.
- Assegurar de que as pistas da máscara estejam completamente centradas sobre as marcas deixadas pelos dentes do aplicador no gel.
6. Aplicar os reagentes da seguinte forma:
| PISTA | VOLUME (µl) | REAGENTE | COR |
| ELP | 40 | Fixador | amarelo |
| G | 25 | Antisoro anti-cadeias pesadas gama | rosa |
| A | 25 | Antisoro anti-cadeias pesadas alfa | azul escuro |
| M | 25 | Antisoro anti-cadeias pesadas mu | verde amarelado |
| K | 25 | Antisoro anti-cadeias leves (livres e ligadas) kapa | verde claro
| |
L | 25 | Antisoro anti-cadeias leves (livres e ligadas) lambda | azul claro |
NOTA: Para evitar enganos, as cores dos reagentes são as mesmas tanto nos rótulos dos seus frascos como nos respectivos poços na
máscara de aplicação.
- Pipetar os reagentes, evitando introduzir bolhas de ar na ponta da pipeta.
- Aplicar os reagentes (Fig. 6).
- Segure a pipeta na vertical e assente levemente a sua ponta no fundo do poço.
- Cuidadosa e progressivamente, injectar o antisoro de forma a que se espalhe pela pista.
7. Deixar incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos.
III. REMOÇÃO DOS ANTISOROS
1. Retirar o excesso de antisoro usando o pente de papel de filtro (Fig. 7).
2. A eliminação dos antisoros não deve ultrapassar os 30 segundos.
- Colocar o pente num ângulo de 30° (em relação ao plano horizontal) e introduzi-lo nas fendas existentes na parte inferior das pistas de
incubação, segundo o seu plano inclinado ;
- Deslizar lentamente os dentes do pente de papel de filtro ao longo da parede vertical oposta à fenda ; os dentes ficam em contacto com
os antisoros, que são absorvidos por capilaridade ; se há dificuldade na absorção do liquido, carregar ligeiramente no pente de modo a que
este fique em contacto com o liquido (Fig. 8).
IMPORTANTE: Cada pente deve permanecer inclinado (45°), para não danificar o gel.
IV. ELIMINAÇÃO DAS PROTEÍNAS RESIDUAIS
1. Retirar o pente de papel de filtro.
2. Verificar se os antisoros foram bem absorvidos, o que é indicado por:
- ausência de reagentes no gel,
- os dentes do pente estão corados em todo o seu comprimento.
Se a absorção dos reagentes tiver sido incompleta, voltar a inserir o mesmo pente de papel de filtro (na mesma posição) e repetir o
procedimento de remoção dos antisoros, manualmente.
3. Segure na máscara de aplicação dos reagentes pela pega, levante-a e retire-a.
4. Aplicar uma folha de papel de filtro espesso sobre toda a superfície do gel e deixar absorver durante 4 minutos.
ATENÇÃO: Pressionar uniformemente toda a folha de papel de filtro, para assegurar um contacto perfeito entre o gel e o papel.
5. Retirar o papel de filtro e lavar o gel verticalmente em soro fisiológico durante 5 minutos colocando-o de modo a que a pista ELP esteja
posicionada para baixo no suporte para meio-gel.
6. Colocar o gel horizontalmente na bancada.
7. Aplicar uma folha de papel de filtro espesso sobre toda a superfície do gel
8. Colocar no incubador-secador IS 80 a 80 °C até secagem completa do papel de filtro (aproximadamente 7 minutos) ou, em ausência do IS 80,
deixar o papel em contacto com o gel 5 minutos depois secar totalmente o gel sob ar quente.
9. Limpar a máscara de aplicação com uma pequena escova sob água corrente (ex: escova de dentes). NÃO UTILIZAR ÁLCOOL OU
SOLVENTES. Assegure-se de que a máscara de aplicação está completamente seca antes de a reutilizar: remover as gotas de água dos
poços batendo com ela levemente sobre papel macio e enxugar.

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V. COLORAÇÃO – DESCOLORAÇÃO
1. Após secagem, submergir verticalmente o gel perfeitamente seco em soro fisiológico durante 3 minutos no mínimo.
2. Submergir depois o gel na solução corante durante 4 minutos.
3. Descorar em 3 banhos sucessivos de descorante até à obtenção de um fundo completamente claro.
4. Secar o gel sob ar quente a 80 °C. Se necessário, limpar o parte de trás do gel (parte plástica ) com um papel macio humedecido.
RESULTADOS
Interpretação
Ausência de banda monoclonal
• Uma amostra de soro normal apresenta uma zona corada difusa de imunoglobulinas policlonais em todas as pistas.
• Uma hipergamaglobulinémia é caracterizada por uma zona difusa fortemente corada, sem apresentar bandas estreitas.
Presença de uma banda monoclonal
• Uma gamapatia (presença de uma imunoglobulina monoclonal) é caracterizada por uma banda estreita detectada com um dos antisoros anticadeias
pesadas (gama, alfa ou mu) e com um dos antisoros anti-cadeias leves, kapa ou lambda. A banda monoclonal detectada, geralmente
estreita e bem visível, deve estar localizada ao mesmo nível de migração que a banda presente na pista de referência (ELP).
• A ausência de reacção com um dos anti-cadeias pesadas aplicado, juntamente com a presença de uma cadeia leve pode significar :
a) a presença de uma gamapatia Ig D ou Ig E, que é necessário confirmar com os anti-cadeias pesadas delta ou epsilon,
b) a presença de uma cadeia leve livre, que é necessário confirmar com os antisoros específicos anti-cadeias leves livres kapa ou lambda.
• Quando não se observa reacção com qualquer dos antisoros anti-cadeias leves, mas existe uma cadeia pesada, pode indicar uma gamapatia de
cadeias pesadas (gama, alfa ou mu), muito rara. Devará ser confirmada a presença de uma doença de cadeias gama, alfa ou um.
Presença de duas ou mais bandas monoclonais
• A mesma interpretação é aplicada à presença de múltiplas bandas monoclonais. Estes casos raros, proliferam vários clones de células B, conforme
é verificado pela presença de várias bandas monoclonais reveladas na imunofixação.
Uma gamapatia biclonal caracteriza-se pela presença de duas cadeias pesadas (idênticas ou diferentes) e duas cadeias leves (idênticas ou
diferentes).
• As imunoglobulinas polimerizadas caracterizam-se pela presença de várias bandas sobre uma mesma cadeia pesada e uma mesma cadeia leve.
Para confirmar a presença de uma anomalia monoclonal, é necessário despolimerizar a amostra com b-mercaptoetanol e repetir a imunofixação
(ver "AMOSTRAS").
• Uma gamapatia oligoclonal caracteriza-se pela presença de múltiplas bandas de um ou mais tipos de cadeias pesadas e por um ou dois tipos de
cadeias leves.
Casos especiais
• Quando uma fracção do tipo monoclonal é observada na electroforese do soro (faixa ELP) mas não é confirmada por imunofixação, deve-se
suspeitar, antes do mais, da presença de fibrinogénio (amostra de plasma).
• Quando uma fracção do tipo monoclonal é observada em todas as pistas da imunofixação e ao mesmo nível, deve-se suspeitar da presença de
uma crioglobulina ou de uma Ig M polimerizada. Despolimerizar com um agente redutor e repetir a técnica (ver "AMOSTRAS").
Limitações
Ver AMOSTRAS.
O uso de outros antisoros que não o específico para a técnica de imunofixação com máscara padrão, pode afectar os resultados.
De acordo com os princípios analíticos das técnicas actuais (princípios de electroforese de zona, resolução e sensibilidade), não pode ser dada
qualquer garantia quanto à detecção total de todos os compostos monoclonais.
Assistência técnica
Em caso de maus resultados contactar os serviços técnicos do fornecedor ainda que tenham sido seguidas, escrupulosamente, as instruções para
a preparação e armazenamento dos reagentes, assim como as instruções de utilização da técnica.
Estão disponíveis nos Serviços Técnicos da SEBIA fichas de dados de segurança dos diversos reagentes do kit, bem como informação relativa à
eliminação dos desperdícios.
CARACTERÍSTICAS DO ENSAIO
Reprodutibilidade intra-ensaio e especificidade
Sujeitaram-se a migração 3 amostras de soros patológicos: um soro com uma alta gamapatia, um soro com uma baixa gamapatia e um soro com
duas paraproteínas. A migração e imunofixação de cada amostra foram realizadas em 2 lotes diferentes de geles HYDRAGEL, seguidos por coloração
com violeta ácido.
Todas as amostras ensaiadas deram resultados idênticos para os 2 lotes, mostrando perfis típicos para cada tipo de amostra testada. A imunofixação
detectou a banda monoclonal nas amostras patológicas e revelou as duas fracções monoclonais esperadas na terceira amostra.
Reproductibilidade inter-ensaio e especificidade
Migração de duas amostras de soro patológicas: um soro com uma fraca gamapatia monoclonal e um soro com uma alta gamapatia monoclonal. A
migração e a imunofixação de cada amostra foram realizadas em 20 geles de 2 lotes diferentes, seguidos por coloração com violeta ácido.
Todas as amostras ensaiadas originaram os mesmos resultados para os dois lotes de geles testados. Os perfis obtidos são típicos das amostras
testadas, ou seja, a imunofixação detectou cada banda monoclonal para cada uma das duas amostras.
Exactidão
Trinta e duas amostras diferentes de soro patológico e oito amostras normais foram analisadas em paralelo com os geles HYDRAGEL, e com outro
sistema de imunofixação em geles de agarose disponível comercialmente. Os geles foram corados com violeta ácido. Os resultados obtidos mostram
uma perfeita correlação entre os dois sistemas de análise e são postas em evidência as mesmas bandas para todos os soros patológicos analisados,
com uma sensibilidade de 100 % e uma especificidade de 100 % em relação a esta última técnica, calculados segundo o método recomendado
(Wendling, 1986).

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Sensibilidade
3 amostras de soro com gamapatias foram diluídas em série e foram analisadas usando a técnica HYDRAGEL IF K20. Utilizou-se como corante tanto
o violeta ácido como o negro de amido. Os resultados são indicados no quadro abaixo
| BANDA MONOCLONAL | LIMITE DE DETECÇÃO (g/l) |
N° AMOSTRA TIPO | | | CONCENTRAÇÃO (g/l) VIOLETA ÁCIDO NEGRO DE AMIDO | | |
| 1 | Alfa | 5,33 | 0,25 | 0,25 |
| 1 | Kapa | | 0,25 | 0,25 |
| 2 | mu | 10,9 | 0,12 | 0,12 |
| 2 | lambda | | 0,25 | 0,25 |
| 3 | Gama | 17,2 | 0,25 | 0,50
| |
3 | lambda | | 0,12 | 0,12 |
BIBLIOGRAFIA
Para informação adicional sobre a interpretação dos perfis obtidos por imunofixação, consultar:
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd
ed., 1994, 397 pp.
(3) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité.
Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97.

ΠΡΒΛΕΠΜΕΝΗ ΡΗΣΗ
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Τo κιτ HYDRAGEL IF K20 είναι σεδιασµέν για την ανίνευση µνκλωνικών πρωτεϊνών στν ανθρώπιν ρ µε ηλεκτρρηση σε
αλκαλικά ρυθµισµένα (pH 9.1) gel αγαρης. ι πρωτεΐνες διαωριµενες µε ηλεκτρρηση επωάνται µε µεµνωµένυς αντιρύς
ειδικύς έναντι γάµµα (Ig G), άλα (Ig A) και µι (Ig M) αρέων αλυσίδων καθώς και κάππα (ελεύθερων και συνδεδεµένων) και λάµδα
(ελεύθερων και συνδεδεµένων) ελαρών αλυσίδων, αντίστια. Μετά την ανσκαθήλωση, ι κατακρηµνισθείσες πρωτεΐνες άνται µε
ινη ιώδη ρωστική. Η περίσσεια της ρώσης απµακρύνεται µε ιν διάλυµα.
Κάθε gel αγαρης στ κιτ HYDRAGEL IF K20 πρρίεται για την ανάλυση ενς δείγµατς.
Για την ικανπίηση διαρετικών πρτιµήσεων απ τυς ρήστες τα κιτ HYDRAGEL IF K20 διατίθενται µε ή ωρίς τυς αντιρύς και µε
ή ωρίς την ινη ιώδη ρωστική.
Για in vitro διαγνωστική ρήση.
ΑΡΗ ΤΗΣ ∆ΚΙΜΑΣΙΑΣ
ι µη υσιλγικές ώνες στα ηλεκτρρήµατα των πρωτεϊνών τυ ρύ, ιδιαίτερα εκείνες πυ αντιστιύν σε - και γ-σαιρίνες, είναι
πάντα ύππτες ως πιθανές µνκλωνικές πρωτεΐνες (Μ-πρωτεΐνες, παραπρωτεΐνες, µνκλωνικές ανσσαιρίνες) και επµένως ως
ένδειη µνκλωνικής γαµµαπάθειας. Για την ταυτπίηση αυτών των µη υσιλγικών ωνών, εαρµεται η τενική της
ανσκαθήλωσης.
Η ηλεκτρρηση µε ανσκαθήλωση είναι µια απλή τενική, η πία επιτρέπει τη σταθερπίηση in situ των πρωτεϊνών µετά την
ηλεκτρρηση, καθώς σηµατίνται µη διαλυτά συµπλέγµατα των πρωτεϊνών µε τυς αντίστιυς αντιρύς. Η διαδικασία
πραγµατπιείται σε τέσσερα ήµατα:
1. ∆ιαωρισµς πρωτεϊνών µε ηλεκτρρηση σε γέλη αγαρης.
2. Ανσκαθήλωση (ανσκαθίηση) των ηλεκτρρηµένων πρωτεϊνών – τα ηλεκτρρητικά ίνη καλύπτνται µε κάθε µεµνωµέν
αντιρ και µνιµπιητικ διάλυµα. ι αντιρί διαένται στ gel και πρκαλύν καθίηση των αντίστιων αντιγνων ταν αυτά
είναι παρντα.
3. ι µη κατακρηµνισθείσες διαλυτές πρωτεΐνες απµακρύννται απ τ gel µε στύπωµα και έκπλυνση. Τ ίηµα τυ συµπλέγµατς
αντιγνυ – αντισώµατς παγιδεύεται στ στρώµα τυ gel.
4. ι κατακρηµνισθείσες πρωτεΐνες γίννται ρατές µε ρώση. ι ανσκαθηλωµένες ώνες συγκρίννται στη συνέεια µε τις
αντίστιες µη υσιλγικές ώνες στ ηλεκτρρητικ πρίλ τυ δείγµατς.
Για την ανίνευση και ταυτπίηση τυ ύππτυ µνκλωνικύ κλάσµατς, τ δείγµα ηλεκτρρείται ταυτρνα σε έι ίνη. Μετά την
ηλεκτρρηση, ένα ίνς (ELP) ρησιµεύει ως ίνς αναράς παρέντας τ ηλεκτρρητικ πρίλ των πρωτεϊνών τυ δείγµατς.
Τα υπλιπα πέντε ίνη επιτρέπυν αρακτηρισµ τυ µνκλωνικύ κλάσµατς µε άση την αντίδρασή τυ ή απυσία αυτής, µε τυς
αντιρύς έναντι γάµµα (Ig G), άλα (Ig A) και µι (Ig M) αρέων αλυσίδων καθώς και κάππα (ελεύθερων και συνδεδεµένων) και λάµδα
(ελεύθερων και συνδεδεµένων) ελαρών αλυσίδων.
Η απλή και ταεία αυτή τενική δίνει µια σαή και ευερώς αιλγήσιµη εικνα.
ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΑΡΕΜΕΝΑ ΜΕ ΤΑ ΚΙΤ HYDRAGEL IF K20
| ΕΙ∆Σ |
| PN 3031 | PN 3220* |
Gel αγαρης (έτιµα πρς ρήση) |
| 10 gel | 100 gel |
Ρυθµιστικ διάλυµα Tris-Barbital (πυκν διάλυµα) |
| 3 ιαλίδια των 75 mL | 30 ιαλίδια των 75 mL |
ινη ιώδης ρωστική (πυκν διάλυµα) |
| 1 ιαλίδι, 75 mL | 3 ιαλίδια των 75 mL |
∆ιάλυµα απρωµατισµύ (πυκν διάλυµα) |
| 1 ιαλίδι, 100 mL | 1 ιαλίδι, 100 mL |
∆ιάλυµα αραίωσης (έτιµ πρς ρήση) |
| 1 ιαλίδι, 3,2 mL | 1 ιαλίδι, 32 mL |
Μνιµπιητικ διάλυµα (έτιµ πρς ρήση) |
| | 1 ιαλίδι, 14,4 ml |
Αντιανθρώπειες ανσσαιρίνες απ θηλαστικά |
| | |
έναντι γάµµα αλυσίδων (έτιµ πρς ρήση) |
| | 1 ιαλίδι, 2,5 ml |
Αντιανθρώπειες ανσσαιρίνες απ θηλαστικά |
| | |
έναντι άλα αλυσίδων (έτιµ πρς ρήση) |
| | 1 ιαλίδι, 2,5 ml |
Αντιανθρώπειες ανσσαιρίνες απ θηλαστικά |
| | |
έναντι µι αλυσίδων (έτιµ πρς ρήση) |
| | 1 ιαλίδι, 2,5 ml |
Αντιανθρώπειες ανσσαιρίνες απ θηλαστικά κάππα |
(ελεύθερων και συνδεδεµένων) ελαρών αλυσίδων (έτιµ πρς ρήση) |
| 1 ιαλίδι, 2,5 ml |
Αντιανθρώπειες ανσσαιρίνες απ θηλαστικά λάµδα |
(ελεύθερων και συνδεδεµένων) ελαρών αλυσίδων (έτιµ πρς ρήση) |
| 1 ιαλίδι, 2,5 ml |
Εαρµγείς µε 6 δντια (έτιµι πρς ρήση) |
| 1 συσκ. των 10 | 10 συσκ. των 10 |
∆ιηθητικά αρτιά – Λεπτά |
| 1 συσκ. των 10 | 10 συσκ. των 10 |
∆ιηθητικά αρτιά κτενειδή | ∆ιηθητικά αρτιά – Αδρά
|
1 συσκ. των 10
2 συσκ. των 10
|
10 συσκ. των 10
20 συσκ. των 10
|
* HYDRAGEL IF K20 MAXI-KIT
γκς τυ ρυθµιστικύ διαλύµατς πυ διατίθεται µε τ MAXI-KIT πρρίεται για δύ ηλεκτρρήσεις. Φυλάτε τ ρυθµιστικ
διάλυµα για να τρέετε δύ gel.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τ µνιµπιητικ διάλυµα και ι αντιρί παρένται ωριστά απ τα κιτ µε εαίρεση τ MAXI-KIT (Βλέπε ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ
ΑΠΑΙΤΥΜΕΝΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΜΕΝΑ).
ΓΙΑ ΑΡΙΣΤΑ ΑΠΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
λα τα αντιδραστήρια απ ίδι κιτ πρέπει να ρησιµπιύνται πάντα µαί και σύµωνα µε τις δηγίες ρήσης.
ΠΑΡΑΚΑΛΥΜΕ ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΣΕΚΤΙΚΑ Τ ΦΥΛΛ ∆ΗΓΙΩΝ.
∆ΗΓΙΕΣ SEBIA - Ελληνικά

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
1. GEL ΑΓΑΡΗΣ
Πρετιµασία
Τα gel αγαρης είναι έτιµα πρς ρήση. Κάθε gel περιέει: αγαρη, 0.8 g/dL, ρυθµιστικ διάλυµα tris-αριτάλη pH 9.1 ± 0.1, πρσθετα,
µη επιλαή στις ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απδση.
ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Τα gel αγαρης περιέυν 0.31 % αριτάλη και 0.34 % νατριύ αριτάλη. Μην τ καταπίνετε! Αν τ καταπιείτε,
συµυλευτείτε αµέσως ιατρ !
ρήση
Μέσ για ηλεκτρρηση και ανσκαθήλωση πρωτεϊνών.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τα gel ριντια εντς της συσκευασίας τυς σε θερµκρασία δωµατίυ (15 έως 30 °C) ή στη συντήρηση (2 έως 8 °C). (Τ έλς
στην πρσθια επιάνεια τυ κυτιύ τυ κιτ πρέπει να δείνει πρς τα άνω). Απύγετε την απθήκευση κντά σε παράθυρ ή σε πηγή
θερµτητας. Απύγετε τις µεγάλες διακυµάνσεις θερµκρασίας κατά τη ύλαη.
ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΕΤΕ.
Πετάτε τα gel ταν:
(i) σηµατιστύν κρύσταλλι ή ίηµα στην επιάνεια τυ gel ή αν η υή τυ gel γίνει πλύ µαλακή (λα αυτά πρκύπτυν αν τ gel
καταψυθεί),
(ii) αναπτυθύν ακτήρια ή µύλα,
(iii) υπάρει µεγαλύτερη απ τ υσιλγικ πστητα στ κυτί τυ gel (απτέλεσµα της είδρωσης τυ ρυθµιστικύ διαλύµατς απ τ
gel λγω ακατάλληλων συνθηκών ύλαης).
2. ΡΥΘΜΙΣΤΙΚ ∆ΙΑΛΥΜΑ TRIS-BARBITAL
Πρετιµασία
Κάθε ιαλίδι τυ πυκνύ διαλύµατς αραιώνεται µε έως 1 λίτρ απεσταγµένυ ή απινισµένυ ύδατς.
Μετά την αραίωση, τ διάλυµα εργασίας περιέει : tris-barbital pH 9.2 ± 0.3, αίδι τυ νατρίυ, πρσθετα, µη επιλαή στις
ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απδση.
ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Κάθε ιαλίδι περιέει 2.45 % αριτάλη, 13.73 % νατριύ αριτάλη και 0.13 % αίδι τυ νατρίυ. Μην τ
καταπίνετε! Αν τ καταπιείτε, συµυλευτείτε αµέσως ιατρ ! ταν τ πετάτε απύγετε επαή µε έα, µλυδ ή αλκ, καθώς µπρεί
να σηµατιστύν εκρηκτικές ή τικές ενώσεις µε τ αίδι τυ νατρίυ.
ρήση
Ρυθµιστικ διάλυµα για ηλεκτρρηση.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τ διάλυµα πρ της αραίωσης σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Τ πυκν διάλυµα είναι σταθερ για αρκετά ρνια και
τυλάιστν µέρι την ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων τυ διαλύµατς.
Τ αραιωµέν διάλυµα είναι σταθερ για ένα έτς σε θερµκρασία δωµατίυ σε κλειστ δεί.
Πετάτε τ αραιωµέν διάλυµα αν µεταληθεί η ψη τυ, π.. θλωση λγω µικριακής επιµλυνσης.
3. ΙΝΗ ΙΩ∆ΗΣ ΡΩΣΤΙΚΗ
Πρετιµασία
Φιαλίδι µε πυκνή ινη ιώδη ρωστική πρς αραίωση στα 300 mL µε απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ.
Μετά την αραίωση, τ αραιωµέν διάλυµα της ρωστικής περιέει: ιν διάλυµα pH ≈ 2, ιώδη ρωστική, 0.2 g/dL, αιθυλενγλυκλη,
3.25 %, πρσθετα, µη επιλαή στις ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απδση.
ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Επιλαές αν καταπθεί.
ρήση
Για τη ρώση των gel µετά απ ηλεκτρρηση πρωτεϊνών και ανσκαθήλωση.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τα διαλύµατα πρ και µετά την αραίωση σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί σε κλειστύς περιέκτες για να απτραπεί η
εάτµιση. Τ πυκν διάλυµα είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και
των ιαλιδίων της ρωστικής. Τ αραιωµέν διάλυµα είναι σταθερ για 6 µήνες.
4. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΑΠΡΩΜΑΤΙΣΜΥ
Πρετιµασία
Κάθε ιαλίδι ∆ιαλύµατς Απρωµατισµύ αραιώνεται µε έως 100 λίτρα απεσταγµένυ ύδατς. Είναι ευερές να αραιώνεται µν 1 mL
τυ διαλύµατς σε 1 λίτρ, τν γκ τυ περιέκτη τυ διαλύµατς απρωµατισµύ. Μετά την αραίωση τ διάλυµα απρωµατισµύ
περιέει: κιτρικ ύ 0.05 g/dL.
ρήση
Για απρωµατισµ, δηλαδή ααίρεση της περίσσειας ρωστικής απ τη γέλη.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τ διάλυµα πρ της αραίωσης σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Τ πυκν διάλυµα είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία
λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων τυ διαλύµατς.Τ αραιωµέν διάλυµα είναι σταθερ
για µια εδµάδα σε θερµκρασία δωµατίυ σε κλειστ δεί. Μην πρσθέτετε αίδι τυ νατρίυ.
Πετάτε τ διάλυµα αν µεταληθεί η ψη τυ, π.. θλωση λγω µικριακής επιµλυνσης.
Για να απτρέψετε πλλαπλασιασµ µικρίων στ αραιωµέν διάλυµα απρωµατισµύ αν πρκειται να τ υλάετε για περισστερ
απ µια εδµάδα, πρσθέστε 5 µL/dL ProClin 300.
Τ διάλυµα εργασίας στ πί έει πρστεθεί ProClin είναι σταθερ σε κλειστ δεί σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί µέρι την
ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
5. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΑΡΑΙΩΣΗΣ
Πρετιµασία
Έτιµ πρς ρήση. Περιέει: αλκαλικ ρυθµιστικ διάλυµα pH 7.5 ± 0.3, κυαν ρωµαινλης, πρσθετα, µη επιλαή στις
ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απδση.
ρήση
Για την αραίωση των δειγµάτων. Τ κυαν ρωµαινλης ρησιµεύει ως δείκτης.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τ διάλυµα σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις
ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων τυ διαλύµατς αραίωσης.
Πρέπει να είναι ελεύθερ ιήµατς.
6. ΑΝΤΙΡΙ (µε τα PN 3220)
Πρετιµασία
Έτιµι πρς ρήση. λι ι αντιρί είναι πρερµενες απ θηλαστικά πλήρεις αντι-ανθρώπειες ανσσαιρίνες. Για την εύκλη
αναγνώριση των αντιρών και την παρακλύθηση της ρήσης τυς, ι αντιρί είναι ρωµατισµένι µε ευδιάκριτες µη επιλαείς
ρωστικές ι πίες ταιριάυν µε τ ρώµα της ετικέττας τυ ιαλιδίυ. ταν αντιρς παρυσιάει ελαρά θλερτητα, αήστε τ
ιαλίδι τυ αντιρύ σε θερµκρασία δωµατίυ για τυλάιστν 10 min. Με τν τρπ αυτ θα πρέπει τ διάλυµα να αναγίνει διαυγές.
Ωστσ, αν η θλερτητα παραµένει, δεν θα επηρεάσει την ανσλγική αντίδραση.
ρήση
Για ανσκαθήλωση ηλεκτρρηµένων πρωτεϊνών.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: ι αντιρί είναι ειδικί για τη διαδικασία ανσκαθήλωσης µε τις καλύπτρες 1 IF, SEBIA.
ι αντιρί µπρεί να πρέρνται απ διαρετικά είδη ώων. Μην αναµιγνύετε δύ αντιρύς απ διαρετικά ιαλίδια, ακµη και µε
την ίδια ειδικτητα, και αλλάετε ΠΑΝΤΑ τ ρύγς της πιπέττας ταν αλλάετε ιαλίδια αντιρύ.
ΠΡΣΗ: Πρς απυγή πιασδήπτε ανάµιης των αντιδραστηρίων, τπθετήστε πρσεκτικά τ καπάκι στ αντίστι ιαλίδι µετά
απ κάθε ρήση.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τυς αντιρύς στη συντήρηση τυ ψυγείυ (2 έως 8 °C). Παραµένυν σταθερί µέρι την ηµερµηνία λήης η πία
σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων αντιρύ.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Κατά τη µεταρά, ι αντιρί µπρύν να διατηρύνται εκτς ψυγείυ (στυς 15 ως 30 °C) για 15 ηµέρες ωρίς δυσµενή
επίδραση στην απδσή τυς.
7. ΜΝΙΜΠΙΗΤΙΚ ∆ΙΑΛΥΜΑ (µε τα PN 3220)
Πρετιµασία
Έτιµ πρς ρήση. Περιέει: ιν διάλυµα, πρσθετα, µη επιλαή στις ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη
απδση. Για την εύκλη αναγνώρισή τυ και την παρακλύθηση της ρήσης τυ, τ µνιµπιητικ διάλυµα είναι ρωµατισµέν µε µη
επιλαή ρωστική.
ρήση
Για τη µνιµπίηση των ηλεκτρρητικά διαωρισµένων πρωτεϊνών τυ ίνυς αναράς (ELP).
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τ µνιµπιητικ διάλυµα είναι ειδικ για τη διαδικασία ανσκαθήλωσης µε τις καλύπτρες 1 IF, SEBIA.
ΠΡΣΗ: Πρς απυγή πιασδήπτε ανάµιης των αντιδραστηρίων, τπθετήστε πρσεκτικά τ καπάκι στ αντίστι ιαλίδι µετά
απ κάθε ρήση.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τ µνιµπιητικ διάλυµα σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Παραµένει σταθερ µέρι την ηµερµηνία λήης η πία
σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ ή των ιαλιδίων τυ διαλύµατς.
Τ διάλυµα πρέπει να είναι ελεύθερ ιήµατς.
8. ΕΦΑΡΜΓΕΙΣ
ρήση
Έτιµι, εαρµγείς µιας ρήσης για τπθέτηση των δειγµάτων.
Φύλαη
Φυλάσσετε τυς εαρµγείς σε ηρ µέρς σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί.
9. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΑΡΤΙΑ - ΛΕΠΤΑ
ρήση
Μιας ρήσης απρρητικά αρτιά για στύπωµα της υγρασίας απ την επιάνεια τυ gel πριν την τπθέτηση των δειγµάτων.
Φύλαη
Φυλάσσνται σε ηρ µέρς σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί.
10. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΑΡΤΙΑ - ΚΤΕΝΕΙ∆Η
ρήση
Μιας ρήσης κτενειδή απρρητικά αρτιά για στύπωµα της περίσσειας µνιµπιητικύ διαλύµατς και αντιρών απ την επιάνεια
τυ gel µετά την ανσκαθήλωση.
11. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΑΡΤΙΑ - Α∆ΡΑ
ρήση
Μιας ρήσης αδρά απρρητικά αρτιά για στύπωµα των µη κατακρηµνισθεισών πρωτεϊνών απ την επιάνεια τυ gel µετά την
ανσκαθήλωση.
Φύλαη
Φυλάσσνται σε ηρ µέρς σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί.

ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΜΕΝΑ
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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
1. ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ ΑΝΤΙΡΩΝ ΚΑΙ ΜΝΙΜΠΙΗΤΙΚΥ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΣ (για τα κιτ 3031)
Η συσκευασία των αντιρών και διαλύµατς µνιµπίησης για IF µε απλή κάλυψη, SEBIA PN 4815, περιέει 5 ιαλίδια αντιρύ, αντι-Ig G,
αντι-Ig A, αντι-Ig M, αντι-κάππα (ελεύθερες και συνδεδεµένες ελαρές αλυσίδες) και αντι-λάµδα (ελεύθερες και συνδεδεµένες ελαρές
αλυσίδες) (1 mL έκαστ) και 1 ιαλίδι διαλύµατς µνιµπίησης, 2.5 mL. ι αντιρί είναι ειδικί για τη διαδικασία ανσκαθήλωσης µε
τις καλύπτρες 1 IF, SEBIA.
1.1 ΑΝΤΙΡΙ
Βλ. πρηγύµενη παράγρα 6.
1.2 ΜΝΙΜΠΙΗΤΙΚ ∆ΙΑΛΥΜΑ
Βλ. πρηγύµενη παράγρα 7.
2. ΛΩΡΙΝΑΤΡΙΥ ∆ΙΑΛΥΜΑ
Πρετιµασία
Πρετιµάστε διάλυµα 0.15 M (0.9 g/dL) NaCl σε απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ.
ρήση
Για την αραίωση δειγµάτων.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσεται σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Πετάτε τ διάλυµα µετά 3 µήνες ή αν µεταληθεί η ψη τυ, π.. θλωση λγω
µικριακής επιµλυνσης. Για µεγαλύτερη περίδ διατήρησης πρσθέστε αίδι τυ νατρίυ, 0.1 g/dL.
3. ΡΩΣΗ AMIDOBLACK (SEBIA, PN 4554) (πραιρετική)
Πρετιµασία
Η πυκνή ρωστική amidoblack είναι ένα ιώδες διάλυµα τ πί ενδέεται να µετατραπεί σε γέλη. Η καταλληλτητα τυ πυκνύ
διαλύµατς ρωστικής δεν επηρεάεται απ την αύηση της γλιτητάς τυ ή τη στερεπίησή τυ.
Σε λες τις περιπτώσεις, για να επιτύετε τέλεια ανασύσταση της ρωστικής, σας συνιστύµε να ακλυθήσετε την εής διαδικασία :
1. Πρσθέστε 15 mL τυ µέσυ αραίωσης ρωστικής στ ιαλίδι τυ πυκνύ διαλύµατς.
2. Κλείστε πρσεκτικά τ ιαλίδι.
3. Ανακινήστε έντνα τ ιαλίδι για περίπυ 5 δευτερλεπτα.
4. Αδειάστε αυτ τ διάλυµα στ δεί πυ πρρίεται για την επεεργασία τυ διαλύµατς ρωστικής.
5. Επαναλάετε αυτ τ ήµα δύ ρές, ή τρεις αν ρειάεται.
6. Αδειάστε τ υπλιπ µέσ αραίωσης στ δεί και συµπληρώστε µε απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ έως γκυ 300 mL.
7. Ανακινήστε καλά τα περιεµενα τυ δείυ για 5 - 10 λεπτά.
Τ διάλυµα ρωστικής είναι έτιµ πρς ρήση.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η ατελής ανασύσταση της ρωστικής θα δηγήσει σε υπεκτίµηση τυ κλάσµατς της αλυµίνης.
Μετά την αραίωση, τ διάλυµα εργασίας της ρωστικής περιέει: ιν διάλυµα pH ≈ 2, amidoblack, 0.4 g/dL, αιθυλενγλυκλη, 6.7 %,
πρσθετα, µη επιλαή στις ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απδση.
ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Επιλαές αν καταπθεί.
ρήση
Για τη ρώση των gel µετά απ ηλεκτρρηση πρωτεϊνών και ανσκαθήλωση.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσετε τα διαλύµατα πρ και µετά την αραίωση σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί σε κλειστύς περιέκτες για να απτραπεί η
εάτµιση. Τ πυκν διάλυµα ρωστικής είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας
τυ κιτ και των ιαλιδίων. Τ διάλυµα εργασίας είναι σταθερ για 1 µήνα.
Μην απθηκεύετε τ διάλυµα ρώσης κντά σε πηγή θερµτητας.
Φυλάσσετε τ πυκν µέσ αραίωσης διαλύµατς ρωστικής σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία
λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΕΤΕ.
4. FLUIDIL
Πρετιµασία
Τ Fluidil (SEBIA, PN 4587, 1 ιαλίδι, 5 mL) είναι έτιµ πρς ρήση.
ρήση
Για τη διάλυση ιωδών ή θλών δειγµάτων, π.. ρί µε κρυσαιρίνες.
Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης
Φυλάσσεται σε θερµκρασία δωµατίυ. Είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στην ετικέτα τυ ιαλιδίυ τυ
Fluidil.
Τ Fluidil πρέπει να είναι ελεύθερ ιήµατς.
ΕΠΛΙΣΜΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΕΑΡΤΗΜΑΤΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΜΕΝΑ
1. Τρδτικ ρεύµατς: GD 61 D SEBIA, PN 1300, GD 251 D SEBIA, PN 1301, MG 300 SEBIA, PN 1302 ή MG 500 SEBIA, PN 1303.
2. Εαρµγέας HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1409, µε τ ρέα τυ εαρµγέα HYDRAGEL K20 και τη µήτρα εαρµγής αντιδραστηρίων
1 IF.
3. Θάλαµς Υγρής Φύλαης, PN 1270.
4. Θάλαµς ηλεκτρρησης: K20 SEBIA, PN 1400.
5. ∆εαµενές και στατήρες gel για την επεεργασία πλακών gel : Κιτ συµπληρωµατικών εαρτηµάτων HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420.
6. Πιπέττες: 10 µL, 20 µL, 100 µL και 200 µL.
7. Κλίανς επώασης - στεγνώµατς: IS 80 SEBIA, PN 1430.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΣ ΑΝΑΛΥΣΗ
Λήψη και διατήρηση δειγµάτων
Η ανάλυση συνιστάται να γίνεται γενικά σε ρέσκα δείγµατα. Πρέπει να συλλέγνται σύµωνα µε τις καθιερωµένες διαδικασίες κλινικής
εργαστηριακής πρακτικής. ∆ιατηρήστε τα δείγµατα στ ψυγεί στυς 2 ως 8 °C για έως µια εδµάδα. Για µακρτερη διατήρηση,
διατηρήστε τα κατεψυγµένα (σταθερά για τυλάιστν ένα µήνα).
Κατεψυγµένα δείγµατα ρύ µε αίδι τυ νατρίυ, 0.02 g/dL, παρυσιάυν µεγαλύτερη σταθερτητα κατά τη διατήρηση.
ΣΗΜΑΝΤΙΚ: Απύγετε τ ρικ ύ ως συντηρητικ.
Τα απψυγµένα δείγµατα πιθανν να δίνυν ελαρά σηµάδια στ σηµεί εαρµγής λγω µετυσίωσης πρωτεϊνών ή λιππρωτεϊνών.
Πρετιµασία των δειγµάτων
Αραιώστε τν ρ πριν την εαρµγή για την απυγή τυ αινµένυ πρώνης σε υψηλά επίπεδα αντιγνυ και αναµίτε ήπια.
| ΙΝΣ | ρς (µL) | ∆ιάλυµα αραίωσης (µL) |
| Ίνς για IgG ανσκαθήλωση | 20 | 100
| |
Ίνς αναράς ELP και λα τα άλλα ίνη | 30 | 60 |
Ειδικές περιπτώσεις
• Αν τ επίπεδ λικής ανσσαιρίνης είναι > 2 g/dL, συνιστάται να ρησιµπιύνται µεγαλύτερες αραιώσεις των δειγµάτων (εκτς για
τ ίνς ELP).
• Αν τ επίπεδ λικής ανσσαιρίνης είναι < 0.5 g/dL, συνιστάται να ρησιµπιύνται µικρτερες αραιώσεις των δειγµάτων.
• Τ δείγµα τυ ασθενύς µπρεί επίσης να αναλυθεί για πρωτεΐνες Bence Jones. Στην περίπτωση αυτή συνιστάται να ρησιµπιείται τ
κιτ “BENCE JONES“.
Τ δείγµα θα πρέπει να αναλύεται µε τ κιτ IF και µε τν αντιρ αντι-κάππα ελεύθερες ελαρές αλυσίδες (SEBIA, PN 4610) και αντιλάµδα
ελεύθερες ελαρές αλυσίδες (SEBIA, PN 4611) ή µε τα κιτ HYDRAGEL BENCE JONES K20 (SEBIA, PN 3038).
Στην περίπτωση αυτή, αραιώστε τν ρ µε υσιλγικ ρ ή µε διάλυµα αραίωσης πρηγυµένως αραιωµέν 1/4 (1 µέρς διάλυµα
αραίωσης, 3 µέρη απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ) 1/10 για τα ίνη ELP, GAM, K και L (1 µέρς ρς, 9 µέρη αραιωµέν διάλυµα για
αραίωση ή υσιλγικς ρς) και 1/3 (1 µέρς ρς, 2 µέρη αραιωµέν διάλυµα για αραίωση ή υσιλγικς ρς) για τα ίνη Kf και
Lf.
Αν η λική ανσσαιρίνη είναι < 0.5 g/dL, συνιστάται να αραιώνεται λιγτερ τ δείγµα ρύ. Π.. 1/5 για τα ίνη ELP, GAM, K και L και
1/2 για τα ίνη Kf και Lf.
• Μετά απ ψύη ή κατάψυη, µερικί ρί (ιδιαίτερα εκείνι πυ περιέυν κρυσαιρίνες) µπρεί να γίνυν ιώδεις ή να αναπτύυν
θλερτητα. Τέτιι ρί µπρεί να παρυσιάσυν πρλήµατα εαρµγής λγω παρακώλυσης της διάυσης στα δντια τυ
εαρµγέα δείγµατς. Σε αυτήν την περίπτωση, πρσθέστε 25 µL Fluidil σε 75 µL ρύ και περιδινήστε για 15 sec. Στη συνέεια
ακλυθήστε την τυπική διαδικασία.
• Μερικές µνκλωνικές πρωτεΐνες µπρεί να πλυµεριστύν δίνντας ένα «µνκλωνικ κλάσµα» τ πί εµανίεται σε λα τα ίνη
µετά απ ανσκαθήλωση. Στην περίπτωση αυτή (i) ετιµάστε 1 % ήτα-µερκαπταιθανλη (BME ή 2- µερκαπταιθανλη, 2 ME) σε
Fluidil, (ii) πρσθέστε 25 µL αυτύ τυ µέσυ σε 75 µL ρύ, (iii) περιδινήστε (vortex ) και περιµένετε τυλάιστν 15 min (max. 30 min)
και στη συνέεια ακλυθήστε την τυπική διαδικασία.
• Για ανάλυση Ig D και/ή Ig E, εαρµστε τις ίδιες αραιώσεις µε εκείνες για τις ελεύθερες και συνδεδεµένες κάππα και λάµδα ελαρές
αλυσίδες.
∆είγµατα πρς απυγή
• Απύγετε δείγµατα πλάσµατς. Τ ινωδγν δίνει µια ώνη στ ίνς αναράς στη ώνη γάµµα, η πία θα µπρύσε να εκληθεί
ως µνκλωνική ανσσαιρίνη.
• Απύγετε αιµλυµένα δείγµατα.
∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ
I. ΣΤΑ∆Ι ΗΛΕΚΤΡΦΡΗΣΗΣ
1. Τπθετήστε τν ρέα τυ εαρµγέα HYDRAGEL K20 σε επίπεδη επιάνεια (Εικ. 1) και σηκώστε τ τµήµα τυ ρέα µε τις
αριθµηµένες εγκπές.
2. Εισαγάγετε 120 µL απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ µέρι τ κατώτερ τρίτ της κλίµακας πυ είναι τυπωµένη στ ρέα
HYDRAGEL K20.
3. Ανίτε τη συσκευασία τυ HYDRAGEL.
4. Περάστε γρήγρα και µιµρα ένα διηθητικ αρτί στην επιάνεια τυ gel για να απρρήσει την περίσσεια υγρύ.
Ααιρέστε τ αρτί αµέσως.
ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Μην αήνετε τ διηθητικ αρτί σε επαή µε τ gel επί µακρν για να µην αυδατωθεί.
5. Τπθετήστε την πλακέτα τυ gel (µε την επιάνεια τυ gel πρς τα άνω) µε τ άκρ της να αγγίει τ stop στ κάτω τµήµα της
τυπωµένης κλίµακας (Εικ. 2).
6. Λυγίστε τ gel και αµηλώστε τ επί της επιάνειας τυ νερύ. (Εικ. 3). Βεαιωθείτε τι δεν έυν παγιδευτεί υσαλίδες αέρα, τι
τ νερ έει απλωθεί κάτω απ λκληρη την πλακέτα τυ gel και τ gel είναι ευθυγραµµισµέν µε την τυπωµένη κλίµακα.
7. Κατεάστε τ ρέα στην ενδιάµεση θέση µε τ διακπτη στην υψηλή θέση.
8. Τπθετήστε έναν εαρµγέα σε µια επίπεδη επιάνεια µε τυς αριθµύς των θρίων στη δειά πλευρά (Εικ. 3).
9. Τπθετήστε 10 µL κατάλληλα αραιωµένυ ρύ στα θρία τυ εαρµγέα ως κάτωθι. Φρτώστε τν εαρµγέα εντς 2 min.
| ΙΝΣ ΑΝΣΚΑΘΗΛΩΣΗΣ | ΒΘΡΙ No |
| ELP | 1 |
| G | 2 |
| A | 3 |
| M | 4 |
| K | 5
| |
L | 6 |

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
- ρησιµπιήστε τν εαρµγέα αµέσως.
- Για ύστερη ρήση (ως 8 ώρες), τπθετήστε τν εαρµγέα στ θάλαµ υγρής ύλαης µε τα δντια πρς τα άνω (κρατήστε τν
απ τ πλαστικ πρστατευτικ κάλυµµα των δντιών), διατηρήστε λ τν θάλαµ στ ψυγεί και τπθετήστε τ gel στ
ρέα HYDRAGEL K20 λίγ πριν τη ρήση.
Βλέπε τ ύλλ δηγιών τυ θαλάµυ υγρής ύλαης για περισστερες λεπτµέρειες.
10. Απσπάστε τ πρστατευτικ κάλυµµα των δντιών τυ εαρµγέα.
11. Τπθετήστε τν εαρµγέα στη θέση No 6 τυ ρέα.
ΣΗΜΑΝΤΙΚ: ι τυπωµένι αριθµί στν εαρµγέα πρέπει να είναι στραµµένι πρς τν ειριστή (Εικ. 4).
12. αµηλώστε τ ρέα τυ εαρµγέα µε τ διακπτη έτσι ώστε να έρθει εαρµγέας σε επαή µε την επιάνεια τυ gel. ΜΗΝ
ΠΙΕΕΤΕ ΤΥΣ ΦΡΕΙΣ ΤΕΛΕΙΩΣ ΠΡΣ ΤΑ ΚΑΤΩ.
13. Μετά απ 1 min, γυρίστε τ διακπτη για να σηκώσετε τν εαρµγέα, ααιρέστε και πετάτε τν εαρµγέα.
14. Τπθετήστε τ gel σε κατάλληλ θάλαµ ηλεκτρρησης, σύµωνα µε την πλικτητά τυ, µε την κατώτερη πλευρά τυ gel
πρς την κάθδ. ταν ρησιµπιείτε τ θάλαµ SEBIA K20, τπθετήστε τ HYDRAGEL στη γέυρα µε την πλευρά τυ gel πρς
τα κάτω. Τ gel πρέπει να υθίεται περίπυ 1 cm στ διάλυµα σε κάθε πλευρά.
Βλέπε τ ύλλ δηγιών τυ θαλάµυ K20 για περαιτέρω λεπτµέρειες.
15. Συνδέστε τ θάλαµ µε την παρή ρεύµατς.
| Συνθήκες ηλεκτρρησης | SEBIA K20 |
| γκς ρυθµιστικύ διαλύµατς ανά τµήµα | 150 mL |
| λικς γκς ρυθµιστικύ διαλύµατς | 300 mL |
| ρνς ηλεκτρρησης | 20 min |
| Σταθερή τάση | 100 V
| |
Αρικ ρεύµα (ανά gel) | 16 ± 3 mA |
16. Μετά την ηλεκτρρηση, απσυνδέστε τ θάλαµ απ τ τρδτικ και ααιρέστε τ gel.
µπλε δείκτης πρέπει να ρίσκεται περίπυ 5 mm απ την ανδική πλευρά τυ τυπωµένυ περιθωρίυ.
II. ΣΤΑ∆Ι ΑΝΣΚΑΘΗΛΩΣΗΣ
1. Τπθετήστε τ ρέα τυ εαρµγέα σε επίπεδη επιάνεια και ανίτε τ σκέπασµα.
2. Εισαγάγετε 120 µL απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ στ κατώτερ τρίτ της κλίµακας πυ είναι τυπωµένη στ ρέα της µήτρας.
3. Τπθετήστε την πλακέτα τυ gel (µε την επιάνεια τυ gel πρς τα άνω) µε τ άκρ της να αγγίει τ stop στ κάτω τµήµα της
τυπωµένης κλίµακας (Εικ. 2).
4. Λυγίστε τ gel και αµηλώστε τ επί της επιάνειας τυ νερύ. (Εικ. 2). Βεαιωθείτε τι δεν έυν παγιδευτεί υσαλίδες αέρα, τι
τ νερ έει απλωθεί κάτω απ λκληρη την πλακέτα τυ gel και τ gel είναι ευθυγραµµισµέν µε την τυπωµένη κλίµακα.
5. Τπθετήστε τη µήτρα εαρµγής αντιδραστηρίων 1 IF στ ρέα της µήτρας ως εής (Εικ. 5):
- Τπθετήστε τη µήτρα εαρµγής στα clip συγκράτησης.
- Κρατήστε τ ωτί της µήτρας και αµηλώστε την πάνω στ gel.
6. Εαρµστε τα αντιδραστήρια ως εής:
| ΙΝΣ | ΓΚΣ (µl) | ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙ | ELP | 40 |
| ΡΩΜΑ |
µνιµπιητικ διάλυµα |
| κίτριν |
G | 25 | αντιρς αντι-γάµµα αρείες αλυσίδες | A | 25 |
| ιώδες |
αντιρς αντι-άλα αρείες αλυσίδες |
| πράσιν |
M | 25 | αντιρς αντι-µι αρείες αλυσίδες | K | 25 |
| µπλε |
αντιρς αντι-κάππα ελαρές αλυσίδες (ελεύθερες και συνδεδεµένες) | L | 25 | αντιρς αντι-λάµδα ελαρές αλυσίδες (ελεύθερες και συνδεδεµένες)
|
πρτκαλί
κκκιν
|
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για να απευθύν λανθασµένες εαρµγές, τα ρώµατα των αντιδραστηρίων εµανίνται στις ετικέτες των
ιαλιδίων και στα θρία της µήτρας εαρµγής.
- Αναρρήστε τα αντιδραστήρια ωρίς να παγιδευτύν υσαλίδες στ ρύγς της πιπέττας.
- Εγύστε τα αντιδραστήρια (Εικ. 6) :
- Κρατήστε την πιπέττα κατακρυα και ακυµπήστε τ ρύγς της ελαρά στ θρί της µήτρας.
- Πρσεκτικά εγύστε τ αντιδραστήρι ώστε να απλωθεί στ θρί ωρίς να παγιδευτύν υσαλίδες.
7. Επωάστε σε θερµκρασία δωµατίυ επί 5 min.
III. ΑΠΜΑΚΡΥΝΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ
1. Απµακρύνετε την περίσσεια αντιδραστηρίων µε τ κτενειδές διηθητικ αρτί (Εικ. 7).
2. Απµακρύνετε τα αντιδραστήρια εντς 30 sec.
- Εισαγάγετε τ διηθητικ αρτί υπ γωνία 30° στις σισµές στ κάτω άκρ των θρίων της µήτρας ώστε τα δντια να αγγίυν
την κάθετη πλευρά µακριά απ τ ειριστή.
- Αήστε τα δντια να ακυµπήσυν µαλακά στ υγρ δίνντας κλίση 45° στ κτενειδές διηθητικ αρτί (Εικ. 8).
ΣΗΜΑΝΤΙΚ : Τ κτενειδές διηθητικ αρτί πρέπει να είναι υπ κλίση (45°). Αν είναι κάθετ µπρεί να πρκαλέσει λάη στ gel.
IV. ΑΠΜΑΚΡΥΝΣΗ ΤΩΝ ΜΗ ΣΥΓΚΛΛΗΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ
1. Ααιρέστε τ διηθητικ αρτί.
2. Ελέγτε αν τα αντιδραστήρια απρρήθηκαν, πως µαρτυρύν:
- η απυσία αντιδραστηρίων απ gel.
- λ τ µήκς των δντιών έει ρωµατιστεί.
Αν η απρρηση των αντιδραστηρίων είναι ατελής, επαναλάετε τη διαδικασία µε τ κτενειδές διηθητικ αρτί.
3. Κρατώντας τη µήτρα εαρµγής αντιδραστηρίων απ τ ωτί, σηκώστε την και ααιρέστε την.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
4. Τπθετήστε ένα αδρ διηθητικ αρτί στ gel για 4 min. Τ αδρ διηθητικ αρτί πρέπει να ρίσκεται σε µιµρη επαή µε
τ gel.
ΣΗΜΑΝΤΙΚ: Πιέστε σταθερά σε λη την επιάνεια τυ gel ώστε να εασαλιστεί καλή πρσκλληση.
5. Ααιρέστε τ διηθητικ αρτί. Πλύνετε τ gel κατακρυα σε υσιλγικ ρ επί 5 min. Τπθετήστε τ gel έτσι ώστε τ ίνς
ELP να ρίσκεται πρς τα κάτω στ στατήρα των gel.
6. Τπθετήστε τ gel σε επίπεδη επιάνεια.
7. Τπθετήστε ένα νέ αδρ διηθητικ αρτί στ gel. Τ αδρ διηθητικ αρτί πρέπει να ρίσκεται σε µιµρη επαή µε τ gel.
8. Στεγνώστε τ gel στυς 80 °C στν κλίαν επώασης-στεγνώµατς µέρι τ διηθητικ αρτί να στεγνώσει εντελώς (για περίπυ
7 min) ή ωρίς τν κλίαν αήστε τ διηθητικ αρτί σε επαή µε τ gel επί 5 min και στεγνώστε τ gel εντελώς µε θερµ αέρα.
9. Καθαρίστε τη µήτρα µε µικρή ύρτσα (π.. δντυρτσα). ΜΗ ΡΗΣΙΜΠΙΕΙΤΕ ΑΛΚΛΗ Ή ∆ΙΑΛΥΤΕΣ. Πριν την
αναρησιµπιήσετε, εαιωθείτε τι η µήτρα είναι τελείως στεγνή.
V. ΡΩΣΗ - ΑΠΡΩΜΑΤΙΣΜΣ
1. Μετά τ στέγνωµα, υθίστε τ στεγν gel κατακρυα σε υσιλγικ ρ επί 3 min.
2. Βυθίστε τ κατακρυα στ διάλυµα ρώσης επί 4 min.
3. Απρωµατίστε µε τρία διαδικά λυτρά στ διάλυµα απρωµατισµύ µέρι τ background να είναι τελείως άρωµ και διαυγές.
4. Στεγνώστε τ gel µε θερµ αέρα 80 °C. Αν ρειάεται, καθαρίστε την πίσω (πλαστική) επιάνεια τυ στεγνύ ιλµ µε υγρ αρτί.
ΑΠΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Ερµηνεία
Απυσία µνκλωνικύ κλάσµατς
• Ένα υσιλγικ δείγµα ρύ παρυσιάει µια ελαριά διάυτη ρώση των πλυκλωνικών ανσσαιρινών σε λα τα ίνη.
• Η υπεργαµµασαιριναιµία αρακτηρίεται απ έντνα ρωµατισµένη διάυτη ώνη γάµµα και απυσία περιρισµένων ωνών.
Παρυσία µνκλωνικύ κλάσµατς
• Η παρυσία µνκλωνικής πρωτεΐνης (γαµµαπάθεια) αρακτηρίεται απ µια µνκλωνική ώνη ανινευµενη µε κάπιν απ τυς
αντιρύς έναντι αρέων αλυσίδων (γάµµα, άλα ή µι) και είτε απ τν αντι-κάππα είτε τν αντι-λάµδα αντιρ. Η ανινευµενη
µνκλωνική ώνη, τυπικά στενή και καλώς διαωριµενη στην εµάνιση, πρέπει να ρίσκεται στην ίδια απσταση κίνησης µε την
ύππτη µνκλωνική ώνη πυ αίνεται στ ίνς αναράς (ELP).
• Απυσία αντίδρασης µε κάπιν απ τυς αντιρύς έναντι αρέων αλυσίδων και αντίδραση µε κάπιν απ τυς αντιρύς έναντι
ελαρών αλυσίδων θα µπρύσε να σηµαίνει :
a) µια πλύ σπάνια Ig D ή Ig E γαµµαπάθεια gammopathy: επιεαιώστε µε αντι-δέλτα ή αντι-έψιλν αντιρύς,
b) γαµµαπάθεια ελαρών αλύσων: επιεαιώστε µε αντιρύς έναντι ελεύθερων ελαρών αλυσίδων.
• Απυσία αντίδρασης µε κάπιν απ τυς αντιρύς έναντι ελαρών αλύσων, ενώ παρατηρείται αντίδραση µε αντιρ έναντι αρέων
αλυσίδων, µπρεί να σηµαίνει µια πλύ σπάνια γαµµαπάθεια αρέων αλύσων (γάµµα, άλα ή µι).
Παρυσία δύ ή περισστερων µνκλωνικών κλασµάτων
Σε σπάνιες περιπτώσεις, πλλί κλώνι B-κυττάρων πλλαπλασιάνται πως αίνεται απ πλλαπλές µνκλωνικές ώνες πυ
απκαλύπτνται µε την ανσκαθήλωση:
• Μια δικλωνική γαµµαπάθεια αρακτηρίεται απ παρυσία δύ ωνών αρέων αλυσίδων (ίδιων ή διαρετικών) και δύ ωνών ελαρών
αλυσίδων (ίδιων ή διαρετικών).
• ι πλυµερισµένες ανσσαιρίνες αρακτηρίνται απ πλλαπλές (συνήθως δύ) ώνες τυ ίδιυ τύπυ αριάς αλύσυ και µιας
ώνης τυ ίδιυ τύπυ ελαράς αλύσυ.
Για να επιεαιωθεί η παρυσία µιας µνκλωνικής ανωµαλίας, είναι απαραίτητς αππλυµερισµς µε -µερκαπταιθανλη (BME ή
2ME) και επανάληψη της ανσκαθήλωσης (Βλ. «∆είγµατα πρς ανάλυση»).
• Μια λιγκλωνική γαµµαπάθεια αρακτηρίεται απ την παρυσία πλλαπλών, συνήθως αδύναµων ωνών ενς ή περισστέρων τύπων
αρέων αλύσων και ενς ή δύ τύπων ελαρών αλύσων.
Ειδικές περιπτώσεις
• ταν παρατηρείται µνκλωνική ώνη στην ηλεκτρρηση τυ ρύ (ίνς ELP) αλλά δεν επιεαιώνεται µε την ανσκαθήλωση, τ
ινδωγν (δείγµα πλάσµατς) είναι πρώτς ύππτς.
• ταν παρατηρείται µνκλωνική ώνη σε λα τα ίνη, θα πρέπει να υπψιαστείτε κρυσαιρίνη ή πλυµερισµένη Ig M. Αππλυµερίστε
και επαναλάετε (Βλ. «∆είγµατα πρς ανάλυση»).
Περιρισµί
Βλέπε ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΣ ΑΝΑΛΥΣΗ.
Η ρήση άλλων αντιρών απ τυς ειδικύς για τη διαδικασία ανσκαθήλωσης µε απλή κάλυψη µπρεί να επηρεάσει τα απτελέσµατα.
Λγω των ρίων διακριτικής ικαντητας και ευαισθησίας της ηλεκτρρησης ώνης, είναι πιθαν κάπια µνκλωνικά στιεία να µην
ανινεύνται µε αυτήν τη µέθδ.
Αντιµετώπιση πρληµάτων
Καλέστε την Τενική Υπηρεσία τυ πρµηθευτή αν η ανάλυση δεν λειτυργεί παρλ πυ ι δηγίες πρετιµασίας και ύλαης των
υλικών και ι δηγίες λειτυργίας τηρύνται πρσεκτικά.
Τα Φύλλα ∆εδµένων Ασαλείας των αντιδραστηρίων των κιτ και πληρρίες για την ασαλή απρριψή τυς διατίθενται επίσης απ την
Τενική Υπηρεσία τυ πρµηθευτή.
∆Ε∆ΜΕΝΑ ΑΠ∆ΣΗΣ
λα τα ηλεκτρρήµατα ερµηνεύθηκαν πτικά.

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HYDRAGEL IF K20 - 2005/03
Αναπαραγωγιµτητα στ ίδι gel και ειδικτητα
Αναπαραγωγιµτητα στ ίδι gel καταδείθηκε σε δύ διαρετικά παθλγικά δείγµατα µε υψηλ και αµηλ επίπεδ ενς
µνκλωνικύ κλάσµατς αντίστια. Κάθε δείγµα έτρεε σε 2 gel απ 2 παρτίδες µε ρήση της διαδικασίας ρώσης µε ινη ιώδη
ρωστική.
λα τα εετασθέντα δείγµατα έδωσαν µια απτελέσµατα στις δύ παρτίδες παρυσιάντας τυπικά και αναµενµενα πρίλ για τν
τύπ τυ εεταµενυ δείγµατς.
Αναπαραγωγιµτητα µεταύ των gel και ειδικτητα
Αναπαραγωγιµτητα στ ίδι gel καταδείθηκε σε δύ διαρετικά παθλγικά δείγµατα µε υψηλ και αµηλ επίπεδ ενς
µνκλωνικύ κλάσµατς αντίστια. Κάθε δείγµα έτρεε σε 20 gel απ 2 παρτίδες µε ρήση της διαδικασίας ρώσης µε ινη ιώδη
ρωστική.
λα τα εετασθέντα δείγµατα έδωσαν µια απτελέσµατα στις δύ παρτίδες παρυσιάντας τυπικά και αναµενµενα πρίλ για τν
τύπ τυ εεταµενυ δείγµατς.
Ακρίεια
Τριάντα δύ παθλγικά δείγµατα ρύ έτρεαν σε HYDRAGEL IF K20 και σε παρµια εµπρικά διαθέσιµη διαδικασία ανσκαθήλωσης
σε gel αγαρης. Τα απτελέσµατα µε τις δύ µεθδυς ρίσκνταν σε συµωνία και ι ίδιες ώνες ανινεύθηκαν σε λα τα παθλγικά
δείγµατα και µε τα δύ συστήµατα.
Ευαισθησία
Σειριακές αραιώσεις 3 παθλγικών δειγµάτων ρύ µε µνκλωνικά κλάσµατα αναλύθηκαν µε τ HYDRAGEL IF K20. ∆κιµάστηκαν τσ
η ρώση µε ινη ιώδη ρωστική σ και η ρώση µε amidoblack.
Τα απτελέσµατα συνψίνται παρακάτω.
| Μνκλωνικ κλάσµα | ρι ανίνευσης (g/L) |
∆είγµα No Τύπς Συγκ. (g/L) ινη ιώδης amidoblack | | | | | |
| 1 | άλα | 5.33 | 0.25 | 0.25 |
| 1 | κάππα | | 0.25 | 0.25 |
| 2 | µι | 10.9 | 0.12 | 0.12 |
| 2 | λάµδα | | 0.25 | 0.25 |
| 3 | γάµµα | 17.2 | 0.25 | 0.50
| |
3 | λάµδα | | 0.12 | 0.12 |
ΒΙΒΛΙΓΡΑΦΙΑ
(1) Le Carrer Didier, "Électrophorèse des Protéines et Immunofixation : Guide d’interprétation", Laboratoires SEBIA, 1994, Hatier - Paris.
(2) Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA,
2nd ed., 1994, 397 pp.
(3) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage, sensibilité, spécificité.
Impact-Internat, 1986, Sept : 93-97.

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SCHÉMAS / FIGURES
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SCHÉMAS / FIGURES
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