Fitopatología Molecular Curso 2012 BIOLOGÍA ... - FBMC
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<strong>Fitopatología</strong> <strong>Molecular</strong><br />
<strong>Curso</strong> <strong>2012</strong><br />
<strong>BIOLOGÍA</strong> MOLECULAR DE<br />
BACTERIAS FITOPATOGÉNICAS
Sumario<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Interacciones planta-bacteria<br />
La planta y su sistema defensivo<br />
Bacterias fitopatógenas<br />
Regulación de factores de virulencia<br />
Estrategias para desarrollar resistencia a<br />
bacterias mediante ingeniería genética<br />
Referencias<br />
- Genes de resistencia<br />
- Quorum quenching
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Interacciones planta-bacteria
Interacciones<br />
planta-bacteria<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Eventos de señalización<br />
que regulan la interacción planta-bacteria<br />
Modificado de: Keen, Nat. Biotechnol., 1999.
La interacción<br />
planta-bacteria<br />
no siempre<br />
determina el<br />
desarrollo de<br />
una enfermedad<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
• No se produce enfermedad cuando:<br />
- La planta atacada no puede proveer los requerimientos<br />
. necesarios para la multiplicación del patógeno (resistencia<br />
. de no-hospedante)<br />
- La planta posee defensas estructurales o bioquímicas<br />
. preformadas. Sólo los patógenos especializados<br />
. completan una infección exitosa<br />
- Se gatillan los mecanismos defensivos inducibles de la<br />
. planta y el patógeno resulta restringido en la zona inicial<br />
. de la infección (resistencia específica)<br />
- Las condiciones externas cambian y el patógeno muere<br />
. antes de llegar a una etapa en que la infección es<br />
. irreversible<br />
• Se produce enfermedad cuando:<br />
- Las condiciones externas son desfavorables<br />
- Las defensas preformadas son inadecuadas<br />
- La planta no detecta al patógeno y por ende no se producen<br />
. respuestas defensivas inducidas (o se producen tardíamente)
La especificidad<br />
del patógeno<br />
bacteriano y de<br />
los genes de<br />
resistencia de<br />
la planta<br />
determinan<br />
diferentes tipos<br />
de interacción<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Tomado de: Agrios, Plant Pathology, 1997.
El modelo gen<br />
por gen explica<br />
los casos de<br />
compatibilidad de<br />
incompatibilidad<br />
planta-patógeno<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
El modelo de resistencia “gen por gen” (Flor, ca. 1940)<br />
Modificado de: Keen, Ann. Rev. of Gen., 1990.<br />
Para que exista resistencia (incompatibilidad) se requiere un gen Avr<br />
del patógeno y un gen R de la planta, ambos dominantes. En presencia<br />
de los alelos recesivos ocurre la enfermedad (compatibilidad)
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
La planta y su sistema defensivo
El sistema inmune en plantas<br />
1) Inmunidad inducida por moléculas asociadas al patógeno (PTI):<br />
Receptores de membrana (PRRs) que reconocen MAMPS o PAMPs. Ej.<br />
Flagelina.<br />
2) Inmunidad inducida por efectores del patógeno (ETI):<br />
-Directo reconocimiento a través de NB-LRR proteínas (R)<br />
ETI es una respuesta tipo PTI pero acelerada y amplificada que induce<br />
resistencia y en general HR
Modelo de zigzag que cuantifica la respuesta de defensa<br />
Jones and Dangl, 2006 nature. 444: 323
Localización<br />
de proteínas<br />
de resistencia<br />
y esquema<br />
de sus<br />
dominios<br />
funcionales<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Modelo de interacción proteína R/factor de avirulencia:<br />
hipótesis de la “proteína guardiana”<br />
Interacción<br />
Adaptado de: Loh et al., Curr. Opin. in Biotechnol., 2002.
La planta y su sistema defensivo<br />
Respuesta Hipersensible (HR) y Resistencia Sistémica Adquirida (SAR)<br />
en el sistema de genes RPS2-avrRPt2/RPM1-avrRPM1<br />
Adaptado de: Mackey et al., Cell, 2003.
Las respuestas<br />
defensivas<br />
inducibles por<br />
patógenos<br />
comprenden<br />
diversos<br />
mecanismos<br />
moleculares<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Procesos defensivos inmediatos, locales y sistémicos<br />
comprendidos en una respuesta inducible<br />
Respuesta<br />
defensiva<br />
Adaptado de: Lamb et al., Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Mol. Biol., 1997.<br />
- Engrosamiento de la pared celular<br />
- Inducción de genes involucrados en la síntesis<br />
de metabolitos secundarios<br />
- Síntesis de tioninas<br />
- Síntesis de proteínas relacionadas con la defensa<br />
a patógenos<br />
- Síntesis de ácido salicilico Inducción de Resistencia<br />
Sistémica Adquirida (SAR)
Genes involucrados en resistencia local a patógenos<br />
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Genes involucrados en resistencia sistémica a patógenos<br />
Adaptado de: Hammond-Kosack and Parker, Curr. Opin. in Biotechnol., 2003.
Necrotroph resistance<br />
Biotroph susceptibility<br />
Jasmonic<br />
acid<br />
Ethylene<br />
Necrotrophic<br />
pathogen<br />
PDF 1.2<br />
Elicitor<br />
Detection<br />
Linear β 1-3 glucan Flagellin<br />
Biotrophic<br />
pathogen<br />
PR 1<br />
Salicylic<br />
acid<br />
Biotroph resistance<br />
Necrotroph susceptibility
Las Bacterias y los PAMPs (pathogenassociated<br />
molecular pattern) Inducen el cierre<br />
estomático<br />
Bacterias fitopatogenas<br />
Bacterias y PAMPs
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Bacterias fitopatógenas
Las TOP 10<br />
bacterias<br />
Fitopatógena<br />
s segun MPP<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Pseudomonas syringae pv.<br />
tomato<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol.<br />
<strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.<br />
Ralstonia solanacearum
Agrobacterium tumefaciens<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Xanthomonas oryzae (oryzae)<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Xanthomonas campestris pathovars<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
XANTHOMONAS AXONOPODIS<br />
Xanthomonas axonopodis pv. manihotis<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Infección por<br />
Xanthomonas<br />
axonopodis<br />
(cancro de<br />
los cítricos)<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Síntomas de cancrosis en fruto, hoja y ramas de un Citrus.<br />
Tomado de: Daniels. IRL Press, 1993.
Erwinia amylovora<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> ;13(:614-629.<br />
http://www.atlasplantpathogenicbacteria.it/Erwini<br />
a%20amylovora.pdf
Xylella fastidiosa<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Dickeya (dadantii and solani))<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Pectobacterium carotovorum (and P.<br />
atrosepticum)<br />
Mansfield et al., Mol Plant Pathol. <strong>2012</strong> Aug;13(6):614-629.
Esquema de<br />
una bacteria<br />
fitopatógena<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Principales componentes de la ultraestructura<br />
de una bacteria fitopatógena típica<br />
Adaptado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Bacterias fitopatógenas<br />
500<br />
nm<br />
Microscopía electrónica de barrido de células<br />
de Pseudomas syringae adheridas a la<br />
superficie de un fruto de peral. Pueden<br />
observarse las fimbrias que sirven como<br />
elementos de unión.<br />
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.<br />
Microscopía<br />
electrónica<br />
de una<br />
célula de<br />
Xhantomonas<br />
con un flagelo<br />
polar<br />
Microscopía<br />
electrónica<br />
de una<br />
célula de<br />
Pseudomonas<br />
con flagelos<br />
lofotricos
Ciclo biológico<br />
de una bacteria<br />
fitopatógena<br />
con fase epífita<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.
Bacterias fitopatógenas observadas al microscopio de barrido<br />
Ingreso y dispersión de fitobacterias por aperturas naturales<br />
2 m<br />
Tomado de: Llacer et al., Patología Vegetal, 1996.<br />
Microscopía de barrido de la superficie<br />
del envés de una hoja de peral.<br />
Se observan numerosas bacterias<br />
colonizandola cavidad subestomática<br />
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.<br />
Pseudomonas syringae pv. morsprunorum exudando<br />
de los estomatas de hojas de cerezo infectadas
Micrografías de bacterias fitopatógenas<br />
La mayor parte de las bacterias fitopatógenas se acumula<br />
en el espacio extracelular o en el tejido vascular<br />
A B A B<br />
Microscopía electrónica de Xanthomonas<br />
campestris colonizando una hoja<br />
de Brassica. Las bacterias están<br />
generalmente rodeadas de un polisacárido<br />
extracelular (EPS) y proliferan en estrecho<br />
contacto con las paredes celulares (CW)<br />
Tomado de: Agrios, Plant pathology, 1997.<br />
Microscopía electrónica de una sección longitudinal (A)<br />
y transversal (B) de Pseudomonas syringae pv tabaci<br />
en el espacio intercelular del mesófilode hojas de tabaco.
Factores bacterianos requeridos<br />
EXOPOLISACARIDOS<br />
para la patogenicidad<br />
SIDEROFOROS<br />
EXOENZIMAS<br />
BACTERIA<br />
BACTERIOCINAS<br />
FITOTOXINAS<br />
FITOHORMONAS<br />
GENES<br />
hrp
Genes hrp<br />
Büttner D, Bonas U EMBO J. 2002 Oct 15;21(20):5313-22.
Genes hrp<br />
Büttner D, Bonas U EMBO J. 2002 Oct 15;21(20):5313-22.
Conocidos efectores de Xanthomonas y otros fitopatogenos<br />
Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:37–43
Sabine Kay and Ulla Bonas. Current Opinion in Microbiology 2009, 12:37–43
Código de unión al ADN de los efectores TAL<br />
Heidi Scholze and Jens Boch. 2010. Virulence 1:5, 428-432
Las Bacterias y los PAMPs (pathogenassociated<br />
molecular pattern) Inducen el cierre<br />
estomático
Fitotoxinas producidas por Pseudomonas spp<br />
Bender et al., MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS,1999, p. 266–292
Los estomas entonces….<br />
-Las células guardianas pueden percibir a las bacterias y para ello el<br />
receptor FLS2<br />
-Para evitar la respuesta inmune que involucra a las células guardianas la<br />
bacteria produce factores de virulencia específicos que le permiten reabrir<br />
los estomas como una estrategia importante de patogenicidad.<br />
-Los estomas, como parte de un sistema inmune integral, actúan como<br />
barreras de infecciones bacterianas.
Síntomas de algunas enfermedades bacterianas<br />
Infección de tubérculos de papa<br />
por Streptomyces scabies (escaras)<br />
Infección de tubérculos de papa por Erwinia<br />
carotovora subsp. atroséptica (podredumbre blanda)<br />
Tomado de: Scnaad et al. APS Press, 2001.
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Regulación de factores de virulencia
Un gran número<br />
de bacterias<br />
Gram – se<br />
comunican<br />
sintetizando,<br />
secretando y<br />
respondiendo a<br />
compuestos<br />
difusibles<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Quorum sensing<br />
• Mecanismo de comunicación comunitario detectado<br />
. para diversas especies de bacterias<br />
• Capacidad de los microorganismos de percibir y<br />
. responder a la densidad poblacional a través de la<br />
. producción de moléculas difusibles de reducido peso<br />
. molecular<br />
Moléculas señal: acil-homoserin lactonas (AHSLs)
El incremento de una población bacteriana determina una<br />
elevada concentración de factores difusibles<br />
Regulación génica dependiente de la densidad poblacional<br />
Modificado de: Fuqua et al., Curr. Opin. in Microbiol. 1998.
El mecanismo<br />
de quorum<br />
sensing es<br />
mediado por<br />
moleculas<br />
difusibles<br />
como las acil-<br />
homoserin<br />
lactonas<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Modelo simplificado de la transducción<br />
de señales en quorum sensing<br />
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.<br />
Célula bacteriana: proteína I (azul), responsable de la síntesis de las señales<br />
difusibles de acil-homoserin lactona (A-HSL; óvalos verdes). La proteína R<br />
(rojo), sufre un cambio conformacional cuando se une a la señal A-HSL; actúa<br />
entonces como regulador transcripcional, alterando su afinidad por secuencias<br />
promotoras específicas de los genes regulados por HSLs (“lux” box) .
Componentes<br />
de la red<br />
sensorial de<br />
regulación<br />
en Ralstonia<br />
solanacearum<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Regulación de factores de virulencia<br />
en Ralstonia solanacearum<br />
Modificado de: Scel, Annu. Rev. Phytopathol.,2000.
Otros sistemas de regulación de virulencia en bacterias<br />
Regulación en Xanthomonas campestris<br />
Gentileza de J. Maxwell Dow
RpfC<br />
RpfG<br />
Baja densidad celular<br />
No/bajo DSF<br />
H-<br />
D-<br />
D- Rec<br />
HD-GYP<br />
HisK<br />
Rec<br />
HPt<br />
H<br />
RpfF<br />
RpfC<br />
RpfG<br />
Alta densidad celular<br />
DSF<br />
D- Rec<br />
HD-GYP<br />
HisK<br />
Rec<br />
HPt<br />
Baja produccion de DSF Autoinduccion de DSF sintesis<br />
o sintesis de factores de virulencia<br />
De<br />
Factores de virulencia<br />
H-<br />
D-<br />
H-<br />
DSF<br />
RpfF
RpfG<br />
di-GMP Cíclico<br />
Formación o dispersión<br />
de Biofilm<br />
D- Rec<br />
HD-GYP<br />
Degradación enzimática<br />
Reduce los niveles de di-GMP cíclico<br />
di-GMP Cíclico<br />
Sínthesis de enzimas extracelulares ,<br />
síntesis de EPS<br />
Formación de biofilm<br />
Motility<br />
Ryan et al 2006. PNAS 103: 1123-1134.
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Estrategias para desarrollar resistencia<br />
a bacterias mediante ingeniería genética
La expresión del gen BS2 en tomate confiere<br />
resistencia a Xanthomonas campestris pv vesicatoria<br />
Crecimiento bacteriano [log ufc/cm 2 )]<br />
Días después de la inoculación<br />
Control Transgénico BS2<br />
Tomado de: Tai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999.<br />
Xcv (+ avrBS2) Xcv (+ avrBS2)
Transformación<br />
de arroz<br />
con el gen<br />
de resistencia<br />
Xa21<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
control<br />
transgénicas<br />
control<br />
transgénicas<br />
Resistencia a la<br />
infección de<br />
Xanthomonas oryzae pv.<br />
oryzae en plantas<br />
transformadas con el<br />
gen Xa21<br />
A: cultivar Minghui 63-12<br />
B: cultivar IR72-82<br />
C<br />
Tomado de: Zhang et al., Nature Biotech. 2000.
La interferencia<br />
de la<br />
comunicación<br />
entre bacterias<br />
es una posible<br />
estrategia<br />
de resistencia<br />
antimicrobiana<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
Posibles blancos y estrategias para interferir en la<br />
comunicación entre bacterias (quorum quenching)<br />
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Mecanismos que afectan la regulación<br />
mediada por homoserin lactonas<br />
Organismo<br />
Variovax paradoxus<br />
Bacillus sp. 240B1<br />
Delisea pulchra<br />
Plantas superiores<br />
( arroz , arveja, etc)<br />
Salmonella enterica<br />
( patógeno humano )<br />
Enzimas degradadoras de A- - HSLs<br />
Molécula<br />
Actividad aminoacilasa<br />
A - HSLs lactonasa<br />
Gen aiiA<br />
Moléculas imitadoras de las A - HSLs<br />
Furanonas halogenadas<br />
Diferentes compuestos<br />
Organismos A - HSLs oportunistas<br />
Homólogos de proteína Lux - R<br />
No producen A - HSLs<br />
Función<br />
Degrada A - HSLs<br />
Degrada A - HSLs<br />
Se unen a receptores de A - HSLs<br />
Inhiben quorum sensing<br />
Afectan sistema de quorum<br />
sensing<br />
Reconocen las A - HSLs<br />
producidas por otros org.<br />
Modificado de: Loh et al., Curr. Opin. in Plant Biol. 2002.
Transformación de plantas de papa con el gen<br />
de acil homoserin lactonasa (aiiA) de Bacillus spp.<br />
Tomado de: Dong et al., Nature, 2001.<br />
Cortes transversales de tubérculos de papa<br />
inoculados con Erwinia carotovora.<br />
A la izquierda: tubérculo de planta no transformada.<br />
A la derecha: tubérculo de planta transformada con el<br />
gen aiiA.<br />
Inoculación de hojas con Erwinia carotovora SCG1.<br />
Arriba: hojas de plantas de tabaco transformadas con el gen aiiA<br />
Abajo: hojas de plantas de tabaco control no transformadas
Las plantas<br />
que expresan<br />
N-acil-homo<br />
serin lactona<br />
exhiben<br />
mayor<br />
resistencia<br />
a Erwinia<br />
carotovora<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
A B<br />
Tomado de: Mae et al., MPMI, 2001.<br />
A: detalle de una hoja<br />
de una planta<br />
transgénica infectada<br />
con Erwinia carotovora<br />
B: hoja de una planta<br />
luego de la infección<br />
Porcentajes de<br />
infección observados<br />
para dos líneas<br />
transgénicas (barras<br />
verde y anaranjada) y<br />
de una planta control,<br />
no transgénica (barra<br />
violeta).
Referencias<br />
Resistencia<br />
a bacterias<br />
fitopatógenas<br />
1. Carmona, M.J., Molina, A., Fernández, J.A., López-Fando, J. J. and<br />
García Olmedo, F. Expression of the thionin gene from barley in tobacco<br />
confers enhanced resistance to bacterial pathogens. The Plant Journal,<br />
3:457-462, 1993.<br />
2. De Gray, G., Rajasekaran, K., Smith, F., Sanford, J. and Daniell, H.<br />
Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to<br />
control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology, 127:852-<br />
862, 2001.<br />
3. Dong, Y.H., Wang, L.H., Xu, J.L., Zhang, H.B. and Zhang, L.H.<br />
Quenching quorum-sensing-dependent bacterial Infection by an N-acyl<br />
homoserine lactonase. Nature, 411:813-817, 2001.<br />
4. Fray, R.G. Altering Plant-Microbe interactions through artificially<br />
manipulating bacterial Quorum-sensing. Annals of Botany, 89:245-248,<br />
2002.<br />
5. Loh, J., Pierson, E.A., Pierson, L.S., Stacey, G. and Chatterjee, A.<br />
Quorum sensing in plant-associated bacteria. Current Opinion in Plant<br />
Biology, 5:1369-1375, 2002.<br />
6. Mae, A., Montesano, M., Koiv, M. and Palva, E.T. Transgenic Plants<br />
producing the bacterial pheromone N-acyl-homoserine lactone exhibit<br />
enhanced resistance to the bacterial phytopathogen Erwinia carotovora.<br />
<strong>Molecular</strong> Plant-Microbe Interactions, 14:1035-1042, 2001.<br />
7. Tai, T.H., Dahlbeck, D., Clark, E.T., Gajiwala, P., Pasion, R., Whalen,<br />
M.C., Stall, R.E. and Staskawicz, B.J. Expression of the Bs2 pepper<br />
gene confers resistance to bacterial spot disease in tomato. Proceedings<br />
of the Natural Academy of Sciences U.S.A., 96:14153-14158, 1999.
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