Estudio del potencial de degradación de los hidrocarburos por ...

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COSTA RICA
ESCUELA DE BIOLOGÍA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
Informe de Práctica de Especialidad
Estudio del potencial de degradación de los
hidrocarburos por Acinetobacter sp. y
Pseudomonas putida para su aplicación
en la biorremediación de suelos contaminados
Cartago, 2004
Caroline Braibant Wayens

Estudio del potencial de degradación de los hidrocarburos
por Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida para
su aplicación en la biorremediación de suelos contaminados
Informe presentado a la Escuela de Biología del Instituto Tecnológico
de Costa Rica como requisito parcial para optar al grado de
Bachiller en Ingeniería en Biotecnología
Miembros del Tribunal
_________________________
Dra. Silvia Soto Córdoba
Profesora Asesora
____________________ _____________________
MSc. Nancy Hidalgo Dittel Dr. Miguel Rojas
Lectora Lector

ÍNDICE GENERAL
RESUMEN i
DEDICATORIA ii
AGRADECIMIENTOS iii
INDICE DE CUADROS iv
INDICE DE FIGURAS v
INDICE DE ANEXOS viii
INTRODUCCIÓN 1
La contaminación con hidrocarburos 2
El petróleo y sus hidrocarburos 4
Tratamientos físicos, químicos y biológicos 5
Tratamientos físicos 6
Tratamientos químicos 6
Tratamientos biológicos 7
Los microorganismos que degradan los hidrocarburos 8
Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida 9
Microorganismos Genéticamente Modificados (MGM) 10
Biodisponibilidad del agente contaminante : surfactantes naturales y sintéticos 11
El metabolismo de los hidrocarburos 12
Parámetros indicadores de la metabolización de los hidrocarburos 15
REVISIÓN DE LITERATURA 17
La biodegradación de los hidrocarburos 18
Bioaumentación con Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida 19
Resultados de una bioestimulación con nutrientes inorgánicos y
orgánicos 20
Potencial de la biorremediación de los suelos contaminados con
hidrocarburos por Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida 20
OBJETIVO 22
Objetivo general 23
Objetivos específicos 23

MATERIALES Y MÉTODOS 24
Material biológico, medios de cultivo y precultivos y
preparación de los inóculos 25
Material biológico 25
Medios de cultivo 25
Precultivos y preparaciones de los inóculos 28
Pruebas de biorremediación en medio líquido 28
Pruebas en erlenmeyers de 250 ml 28
Pruebas en reactor de dos litros 28
Lectura del pH 29
Lectura directa de la densidad óptica 29
Lectura indirecta de la densidad óptica 29
Medida de viabilidad 29
Pesos Secos 30
Determinación del consumo de hidrocarburo por el método gravimétrico 30
Determinación de la concentración del hidrocarburo por el kit enzimático Total
Petroleum Hydrocarbures (TPH) Immunoassay Method (HACH) para muestras
acuosas 30
Determinación del consumo de glucosa por Accuntrend® alpha 31
Determinación del consumo de glucosa por Cromatografía Líquida de Alto
Rendimiento (HPLC) 31
Pruebas sobre suelo artificialmente contaminado con diesel 32
Origen de la tierra y determinación de sus características físico-químicas 32
Medida del pH y de la conductividad eléctrica de la tierra 32
Determinación del contenido en materia seca de la tierra 32
Medidas de la densidad y el volumen de la tierra 32
Pretratamiento de la tierra : tamizado, contaminación artificial e inoculación 33
Lectura de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) : Principio de los
métodos VELP Scientifica y OxiTop® OC110 33
Análisis de la evolución de la microbiología 34
Determinación de la concentración del hidrocarburo por el kit enzimático Total
Petroleum Hydrocarbures (TPH) Immunoassay Method (HACH) para las
muestras de tierra 35
RESULTADOS 36
Cultivo de los microorganismos sobre medio enriquecido 37
Degradación del los hidrocarburos en erlenmeyers de 250 ml 39

Degradación efectuada por Acinetobacter sp. LMG 1056 40
Degradaciones efectuadas por Pseudomonas putida LMG 2257, P. putida
ATCC 39213, P. putida DSMZ 6414 y P. putida DSMZ 6899 41
Degradación de los hidrocarburos en reactores de dos litros 46
Degradaciones efectuadas por Acinetobacter sp. LMG 1056 46
Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre hexadecano (C16H34) 47
Degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG 1056 49
Degradación del decano (C10H22) por Acinetobacter sp. LMG 1056 51
Degradación del tolueno (C7H8) por Acinetobacter sp. LMG 1056 52
Degradación del tolueno (C7H8) por Acinetobacter sp. LMG 1056 en presencia de glucosa 54
Degradación del octano (C8H18) por Acinetobacter sp. LMG 1056 56
Degradación del octano (C8H18) por Acinetobacter sp. LMG 1056 en presencia de glucosa 57
Degradaciones realizadas por Pseudomonas putida LMG 2257 59
Degradación del tolueno por Pseudomonas putida LMG 2257 59
Degradación del diesel por Pseudomonas putida LMG 2257 59
Degradación del diesel sobre un suelo artificialmente
contaminado 61
Características de la tierra 61
Evaluación de la actividad de degradación de Acinetobacter sp. LMG 1056 en
una tierra artificialmente contaminada con diesel 61
Evolución de la Demanda Bioquímica de Oxígeno medida en los ensayos en tierra 61
Evolución de la viabilidad de las poblaciones presentes en las tierras 63
Cuantificación de la concentración de diesel presente en las tierras por el método 10050 TPH
Immunoassay method de HACH 64
Evaluación de la actividad de degradación de Acinetobacter sp. LMG 1056 en
un slurry que contiene tierra artificialmente contaminada con diesel 65
Evolución de la Demanda Bioquímica de Oxígeno medida en los ensayos en slurry 66
Evolución de la viabilidad de las poblaciones presentes en los slurries 67
Cuantificación de la concentración de diesel presente en los slurries por el método 10050 TPH
Immunoassay method de HACH 67
DISCUSIÓN 69
Condiciones de crecimiento y parámetros controlados 70
La importancia del pH como parámetros indicador de la actividad metabólica 70
La importancia de la temperatura para el crecimiento bacteriano 71
Importancia de la disponibilidad de oxígeno para la actividad metabólica y el
crecimiento 71
La importancia de la disponibilidad de la fuente de carbono y de energía para
el metabolismo y el crecimiento bacterianos 72

Medida de la viabilidad de las poblaciones 74
La densidad óptica 74
Los plaqueos 74
El peso seco 75
Medida de la degradación de los hidrocarburos puros y del
diesel 75
Método gravimétrico 75
Método enzimático 76
La degradación de los hidrocarburos por Pseudomonas putida
en medio acuoso 76
La degradación de los hidrocarburos por Acinetobacter sp.
LMG 1056 77
Degradación de los hidrocarburos por Acinetobacter sp. LMG 1056 en medio
acuoso 78
Degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG 1056 en tierra y lodo 79
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 81
ANEXOS 83
BIBLIOGRAFÍA 94

Estudio del potencial de degradación de los hidrocarburos por
Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida para
su aplicación en la biorremediación de suelos contaminados
RESUMEN
Caroline Braibant Wayens *
El petróleo constituye una fuente de energía de capital importancia en la sociedad
actual. La explotación de este combustible natural implica el vertido voluntario o involuntario
de hidrocarburos en el agua, el suelo y el aire. En lo que respecta el suelo, los hidrocarburos
tienden a adsorberse a las partículas y pueden, como en el caso de los aromáticos, contaminar
las napas freáticas. Esta contaminación puede tratarse por medios físicos, químicos y
biológicos.
El tratamiento biológico de una contaminación recibe el nombre de biorremediación.
Este tratamiento puede llevarse a cabo in situ o ex situ y por bioatenuación, bioestimulación o
bioaumentación. Los microorganismos que se utilizan usualmente en este último caso para la
degradación de los hidrocarburos son las bacterias gram negativo.
Acinetobacter sp. es un cocobacilo gram negativo aeróbico reconocido por su
capacidad para degradar las fracciones alifáticas del petróleo. Pseudomonas putida es un bacilo
gram negativo aeróbico reconocido por su capacidad para degradar las fracciones aromáticas
del petróleo. Estas bacterias presentan las condiciones necesarias para constituir la base para el
diseño de un consorcio bacteriano para la degradación de contaminación por hidrocarburos en
el suelo.
Se determinó el potencial de degradación de una cepa de Acinetobacter sp. y cuatro
cepas de Pseudomonas putida sobre nueve hidrocarburos puros y diesel en medio acuoso a
pequeña (erlenmeyer de 100 ml) y mediana (reactor de dos litros) escala, así como en medio
sólido (suelo) y semi-sólido (lodo o slurry). Se tomaron en cuenta la densidad óptica, el peso
seco y la viabilidad expresada en UFC/ml para controlar el crecimiento bacteriano. El
metabolismo se verificó mediante los parámetros de pO2, pH, consumo de ácido o base así
como la desaparición del hidrocarburo del medio a lo largo del tiempo medido por un método
gravimétrico y por el método enzimático TPH Immunoassay Method 10050 de HACH.
En lo que respecta los ensayos en medio acuoso, mientras que P. putida aparece en la
literatura como un microorganismo capaz de degradar el tolueno, se observó una muerte
instantánea al colocar a estas bacterias en presente del hidrocarburo. Sin embargo, su pudo
observar un ligero crecimiento sobre diesel. Por su lado, Acinetobacter sp. degradó el diesel, el
hexadecano y el decano y creció sobre el tolueno. El octano constituyó un sustrato tóxico para
la cepa. Los ensayos en suelo y lodo se evaluaron de acuerdo con los cambios de DBO, de
viabilidad y de la concentración del diesel en 28 días de estudio. Se obtuvo una desaparición
más importante del diesel en los ensayos con lodo que en aquellos preparados con tierra seca.
Mientras que Acinetobacter sp. LMG 1056 resultó constituir un microorganismo
prometedor para el diseño del consorcio, las diferentes Pseudomonas putida no mostraron las
capacidades esperadas. Se recomienda estudiar la capacidad de degradación del diesel que
presentarían las dos especies trabajando en complementariedad.
* Informe de Práctica de Especialidad para optar al grado de bachiller en Ingeniería en
Biotecnología, Escuela de Biología, Instituto Tecnológico de Costa Rica. Cartago, Costa Rica.
2004.
vii

DEDICATORIA
A mis abuelos, mis padres
y mis hermanos por confiar en mí
A Federico por su apoyo
a través de la distancia
ii

AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer de todo corazón al equipo de la Unité de Biotechnologie
del Institut Meurice por haberme dado la oportunidad de probarme a mí
misma y de descubrir mi país natal desde una nueva perspectiva.
Agradezco también a mis profesores asesores, el Sr. Durieux y la Dra.
Soto, por el apoyo que me dieron cada uno a su manera, para hacer de
este trabajo algo enriquecedor.
Gracias también a la Sra. Hidalgo por las recomendaciones y los ideales
ambientalistas que ella y la Sra. Soto confirmaron en mí.
Finalmente, a mis cinco amigas por las estudiadas y las risas constantes
durante los últimos años de universidad especialmente.
iii

ÍNDICE DE CUADROS
Número Título Página
1
2
3
4
5
6
7
8
Características de los crecimientos de las cepas bacterianas
sobre medio LB enriquecido (pH inicial = 7). 38
Relación de viabilidad expresada en UFC/ml con respecto a
una densidad óptica unitaria para las cinco cepas cultivadas en
medio rico. 39
Evolución de los pH de los cultivos de Acinetobacter sp. LMG
1056 en medio MM2 que contiene glucosa o hidrocarburos
puros (pH inicial = 7). 41
Evolución de los pH de los cultivos de Pseudomonas putida
LMG 2257 en medio MM2 que contiene glucosa o
hidrocarburos puros (pH inicial = 7). 42
Evolución de los pH de los cultivos Pseudomonas putida
ATCC 39213 en medio MM2 con glucosa o hidrocarburos
(pH inicial = 7). 43
Evolución de los pH de los cultivos de Pseudomonas putida
DSMZ 6414 en el medio MM2 con glucosa o hidrocarburos
(pH inicial = 7). 44
Evolución de los pH de los cultivos de Pseudomonas putida
DSMZ 6899 en el medio MM2 con glucosa o hidrocarburos
(pH inicial = 7). 45
Propiedades físicas de la tierra utilizada para los ensayos de
biodegradación en medio sólido, después del tamizado. 61
iv

ÍNDICE DE FIGURAS
Número Título Página
1 Distribución de la contaminación en el medio ambiente 3
2
Rutas de degradación de los alcanos por oxidación del grupo
metil terminal, subterminal y biterminal 13
3 Transformación de un ácido graso en el Ciclo de Krebs 14
4 Reacción de degradación del benceno, del tolueno y del xileno 15
5
6
7
8
9
10
11
Curvas de crecimiento de las cinco cepas bacterianas
estudiadas (D.O. directa a 660 nm en función del tiempo) 37
Evolución de la densidad óptica de los cultivos en erlenmeyers
de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre diversos hidrocarburos 40
Evolución de la densidad óptica a 660 nm de los cultivos en
erlenmeyers de Pseudomonas putida LMG 2257 sobre
diversos hidrocarburos 42
Evolución de la densidad óptica a 660 nm de los cultivos en
erlenmeyers de Pseudomonas putida ATCC 39213 sobre
diversos hidrocarburos 43
Evolución de la densidad óptica a 660 nm de los cultivos en
erlenmeyers de Pseudomonas putida DSMZ 6414 sobre
diversos hidrocarburos 44
Evolución de la densidad óptica a 600 nm de los cultivos en
erlenmeyers de Pseudomonas putida DSMZ 6899 sobre
diversos hidrocarburos 45
Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056
en un medio que contiene HEXADECANO como única fuente
de carbono y de energía (concentración inicial = 3,89 g/l) 47
12 Crecimiento de las células bacteriana de la cepa Acinetobacter 47
v

13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
sp. LMG 1056 sobre las emulsiones de hexadecano (1000X)
Evolución de los parámetros indicadores de la metabolización
del HEXADECANO por Acinetobacter sp. LMG 1056 48
Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056
en un medio que contiene DIESEL como única fuente de
carbono y de energía (concentración inicial = 4,13 g/l) 49
Crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre las
emulsiones de diesel (1000X) 50
Consumo de base (NaOH 2 M) como indicador del
metabolismo del DIESEL por Acinetobacter sp. LMG 1056 50
Crecimiento de las células bacterianas de la cepa
Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre emulsiones de decano
(1000X) 51
Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056
en un medio que contiene DECANO como única fuente de
carbono y de energía (concentración inicial = 3,65 g/l) 52
Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056
en un medio que contiene TOLUENE como única fuente de
carbono y de energía (concentración inicial = 4,33 g/l) 53
Evolución de los parámetros indicadores de la metabolización
del TOLUENO por Acinetobacter sp. LMG 1056 54
Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056
en un medio que contiene TOLUENO (concentración inicial =
4,33 g/l) y 2 g/l de GLUCOSA 55
Evolución de los parámetros indicadores de la actividad
metabólica de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio que
contiene TOLUENO en presencia de GLUCOSA 56
Viabilidad de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio que
contiene OCTANO como única fuente de carbono y de
energía (concentración inicial = 3,51 g/l) 57
vi

24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056
en un medio que contiene OCTANO (concentración inicial =
3,51 g/l) y 2 g/l de GLUCOSA 58
Evolución de los parámetros indicadores de la actividad
metabólica de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio que
contiene OCTANO en presencia de GLUCOSA 58
Evaluación del crecimiento de Pseudomonas putida LMG
2257 en un medio que contiene DIESEL como única fuente de
carbono y de energía (concentración inicial = 4,13 g/l) 59
Evolución de los parámetros indicadores de la metabolización
del DIESEL por Pseudomonas putida LMG 2257 60
Evolución de la Demanda Bioquímica de Oxígeno de los
sistemas de degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG
1056 sobre una tierra artificialmente contaminada 62
Evolución de la población microbiana total en las muestras de
tierra a lo largo de los 28 días de seguimiento 63
Concentración de diesel en el momento inicial y después de
28 días de seguimiento de la actividad de Acinetobacter sp.
LMG 1056 en tierra 65
Demanda Bioquímica de Oxígeno de los sistemas de
degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG 1056 en
lodo 66
Evolución de la población microbiana total de las muestras de
lodo a lo largo de los 28 días del seguimiento 67
Concentración del diesel en el tiempo inicial y después de 28
días del seguimiento de la actividad de Acinetobacter sp.
LMG 1056 en lodo 68
34 Elementos constitutivos de la biorremediación 70
vii

ÍNDICE DE ANEXOS
Número Título Página
1 Medios de cultivo empleados en la investigación 84
2 Biorreactor BIOSTAT®B de dos litros 85
3 Autoclave y olla de presión empleadas para la esterilización 86
4 Espectrofotómetro utilizado para las lecturas de absorbancia 87
5
Utensilios utilizados para el sembrado o plaqueo de las
bacterias 88
6 Centrifugadoras empleadas durante el estudio 89
7 Rotavapor utilizado para el método gravimétrico 90
8 Detalles del método enzimático 91
9 Roller Bottle para homogeneizar el diesel en el suelo 93
10
Sistemas de lectura de Demanda Bioquímica de Oxígeno
(DBO) 94
viii

I. INTRODUCCIÓN
9

I.1. LA CONTAMINACIÓN CON HIDROCARBUROS
El petróleo y sus derivados constituyen una importante fuente de contaminación.
Se estima que de 0,08 % a 0,46 % (más de tres millones de toneladas) de la
producción total del petróleo termina formando parte, bajo diversas formas, de la
contaminación ambiental (Jacobucci et al., 2000). Una de las formas de controlar
los derrames de petróleo es utilizando la biorremediación. Al respecto, la USEPA
(United States Environment Protection Agency) indica que un 30 % de esta
contaminación en los Estados Unidos se combate por biorremediación (Olson et
al., 1999).
El petróleo contamina el ambiente en las diferentes etapas de su explotación,
extracción, transporte y refinado (Vasudevan ; Rajaram, 2001). Existen dos tipos
de contaminación : 1) la involuntaria, que ocurre por defectos mecánicos, la
corrosión de las tuberías y las fugas durante las etapas de transferencia y la
contaminación y 2), la voluntaria, que se da con las prácticas de incineración y los
vertidos en suelo y agua (Stelmack ; Gray ; Pickard, 1998).
La contaminación con hidrocarburos generalmente no se considera un problema en
el suelo ; esta percepción está basada en los últimos accidentes importantes que
implicaron el vertido de grandes cantidades de petróleo en el mar (el Erika en
1999, el Exxon Valdez en 2001 (Marchand, 2001) y el Prestige en 2002). Sin
embargo, la contaminación del suelo existe principalmente concentrada en los
alrededores de las refinadoras, pozos de petróleo, depósitos de petróleo,
aeropuertos, bases militares y estaciones gasolineras (Jacobucci et al., 2000).
Con respecto a las técnicas de tratamiento de los hidrocarburos utilizando
microorganismos, es relativamente más sencillo biorremediar la contaminación en
un ambiente acuoso, ya que el hidrocarburo se extiende horizontalmente sobre la
superficie del agua, donde es más accesible para los microorganismos. Además de
la biodegradación, el hidrocarburo puede mediante otros procesos físico-químicos
adicionales, evaporarse de manera que disminuya su concentración (Franzmann et
al., 2002).
En el suelo, la adsorción de la contaminación constituye una forma de
inmovilización que disminuye la toxicidad del contaminante pero aumenta su
longevidad y permanencia en este compartimiento ambiental. El desplazamiento
de la contaminación en el suelo, contrariamente al que ocurre en el agua, se
produce de manera vertical hasta alcanzar las fuentes de agua potable provocando
con ello serios problemas de degradación de los recursos naturales (Harris, 1997),
como lo presenta la figura 1.
10
Con formato: Español
(España - alfab. tradicional)
Con formato: Español
(España - alfab. tradicional)
Con formato: Español
(España - alfab. tradicional)
Con formato: Español
(España - alfab. tradicional)
Con formato: Español
(España - alfab. tradicional)

Fig. 1 : Distribución de la contaminación en el medio ambiente (Ballerini ;
Gatellier ; Vogel, 1998).
La contaminación del suelo con hidrocarburos impide la utilización de este para
actividades como la agricultura y la urbanización y adicionalmente pone en riesgo
las napas freáticas que en algunos países constituyen la fuente principal de agua
potable. He aquí la importancia primordial de remediar estos suelos (Hanson et
al., 1997).
El suelo es una matriz de partículas orgánicas e inorgánicas con diferentes
características físicas y químicas que dependen del clima, altitud y latitud. Estas
partículas están organizadas en forma de agregados particulares, que tienen
propiedades que explican la absorción y la adsorción de contaminantes (Weber ;
Young ; Hillers, 1998). Cuando los hidrocarburos entran en contacto con las
partículas del suelo, se adsorben a ellas y modifican las propiedades de las mismas
(fig. 1). Los agregados del suelo se vuelven más estables al endurecerse con el
tiempo y se vuelven menos porosos, más hidrofóbicos y su contenido en aire
disminuye (Cassidy ; Irvine, 1998). Los cambios causados por la contaminación
11

provocan un desequilibrio tal en el suelo, que toda clase de vida, vegetal como
microbiana, se ve limitada en cantidad y diversidad y puede inclusive desaparecer
rápidamente (Venosa et al., 1999).
Los agentes contaminantes pueden encontrarse bajo cuatro formas o fases en el
suelo y su presencia bajo una u otra de ellas implicará una disponibilidad y una
toxicidad determinadas (Harris, 1997). Un contaminante presenta por lo tanto, una
toxicidad relacionada con su estructura química, y una toxicidad de fase, que
depende de la presentación del contaminante en el medio (Schwartz ; Bar, 1995) :
• VP (Vapor Phase) : el contaminante presenta un carácter volátil de manera
que permanece aprisionado en los poros del suelo en fase gaseosa. La
disminución de la concentración de oxígeno reduce las posibilidades de
colonización del suelo por microorganismos capaces de consumir este
contaminante (Hanson et al., 1997).
• AP (Adsorbed Phase) : el contaminante es superficialmente adsorbido a las
partículas del suelo y queda difícilmente disponible para los microorganismos.
• DP (Dissolved Phase) : el contaminante se encuentra disuelto en la fase
acuosa del suelo según un equilibrio, donde es accesible para los
microorganismos (Harris, 1997).
• NAPL (Non-Aqueous-Phase Liquid) : el contaminante líquido en fase no
acuosa forma gotas o películas sobre las partículas del suelo. Esta fase es
característica de los hidrocarburos (Stelmack ; Gray ; Pickard, 1998).
I.2. EL PETRÓLEO Y SUS HIDROCARBUROS
El petróleo es un combustible natural compuesto de varios tipos de hidrocarburos, es
decir, de moléculas que contienen básicamente, carbono e hidrógeno. Estas
moléculas pueden estar formadas de cadenas de átomos de carbono largas o cortas y
que pueden adoptar diferentes estructuras. Los hidrocarburos del petróleo pueden
dividirse en cuatro categorías de compuestos :
I. Los saturados : los alcanos como el hexano, el octano, el decano, el
hexadecano, los isoalcanos y los cicloalcanos como el ciclohexano.
II. Los aromáticos : benceno, tolueno, xileno y naftaleno agrupados también
bajo la apelación BTEX y los poliaromáticos o PAHs (Rittman, 1994).
III. Las resinas : sólidos polares amorfos disueltos que contienen nitrógeno,
azufre y oxígeno.
IV. Los asfaltenos : grandes moléculas polares coloidales sin disolver que son
más resistentes a la biodegradación (Balba ; Al-Awadhi ; Al-Daher, 1998).
En términos generales, de un 70 a un 97% de los hidrocarburos del petróleo es
degradable (la fracción de hidrocarburos saturados y aromáticos) y el resto representa
los asfaltenos y las resinas esencialmente inertes (Prince et al., 1999).
12

Cada una de las categorías agrupa compuestos con características de solubilidad,
volatilidad y toxicidad propias. Desde un punto de vista de biodegradabilidad, los
hidrocarburos pueden ordenarse de mayor a menor biodegradabilidad en : alcanos
lineales > alcanos ramificados > aromáticos ligeros > alcanos cíclicos > aromáticos
pesados > compuestos polares (Olson, et al., 1999 ; Harris, 1997).
Los alcanos son moléculas químicamente muy estables en las que el esqueleto
carbonado se encuentra saturado de hidrógeno. Presentan estructuras lineales,
ramificadas o cíclicas. Los ramificados conforman la mayor parte del petróleo ; en
caso de una contaminación con petróleo, son degradados más lentamente y después
de haberse degradado los lineales (Rittman, 1994). Los de cadena corta son más
tóxicos que los de cadena larga, siendo estos últimos más hidrofóbicos (Balba ; Al-
Awadhi ; Al-Daher, 1998). El hexadecano, un alcano de 16 átomos de carbono, es un
sustrato selectivo ideal para aislar microorganismos capaces de degradar los alcanos
(Wrenn ; Venosa, 1996).
En la segunda categoría se encuentran los compuestos aromáticos y poliaromáticos
caracterizados por sus productos de degradación intermediarios muy contaminantes y
cancerígenos, estos compuestos son más solubles que otros hidrocarburos y
contaminan en general las aguas subterráneas (Burland ; Edwards, 1998). Por esta
razón, la USEPA los ha clasificado como contaminantes a tratar con prioridad. Están
conformados por tres o más núcleos bencénicos, eventualmente asociados con
cadenas carbonadas lineales. Se acumulan en el ambiente debido a su estabilidad
química, su baja solubilidad en el agua y su fuerte adsorción a las partículas del suelo
(Pothuluri ; Cerniglia, 1998).
El diesel y los otros combustibles son mezclas de hidrocarburos saturados, aromáticos
(33% m/m), poliaromáticos (8 % p/p) y azufre (400 ppm) (Olson et al., 1999). Según
las particularidades de cada composición, la gasolina es menos biodegradable que el
diesel o el queroseno ; estos últimos contienen una mayoría de hidrocarburos de
cadena larga mientras que la primera contiene en general hidrocarburos de cadena
corta (Harris, 1997). Sin embargo, las nuevas gasolinas producidas mediante
tecnologías modernas son más biodegradables que el diesel ; las investigaciones se
enfocan en reducir la cantidad de compuestos tóxicos contenidos en la gasolina
(Speidel ; Lightner ; Ahmed, 2000).
I.3. TRATAMIENTOS FÍSICOS, QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS
Desde un punto de vista económico, la descontaminación inmediata de zonas
afectadas implica el desplazamiento y la paralización de las actividades ejecutadas
sobre el terreno contaminado. Esto suma al desastre ecológico un costo adicional
13
Eliminado:

para la comunidad, debido al incidente financiero y social generado por la
contaminación (Harris, 1997).
Uno de los factores que limita la eliminación de los hidrocarburos contaminantes
es la tranferencia de masa. Los tratamientos de limpieza del suelo utilizan
usualmente métodos que permitan el arrastre de los hidrocarburos pero deben
vencer para ello, las fuerzas de adsorción sobre las partículas del suelo por
modificación de temperatura, de las interacciones químicas (extracción,
emulsificación) o de la tensión de vapor. En el caso de la contaminación con
hidrocarburos, se proponen tratamientos físicos, químicos y biológicos que pueden
ser utilizados en complementariedad (Thomassin-Lacroix et al., 2002).
14

I.3.a. Tratamientos físicos
Los tratamientos físicos recurren a técnicas que modifican o utilizan los
parámetros físicos, como la temperatura o la presión, para descontaminar el suelo.
Cuando el contaminante es recuperado, es tratado con el fin de disminuir el peligro
que representa. En el marco de una contaminación con hidrocarburos, existen
diferentes alternativas (Troquet ; Troquet, 2003) :
• La contención : es posible confinar o controlar el volumen de la
contaminación con materiales impermeables o agregando solidificantes como
el cemento, cenizas de silicio o calcio o polímeros orgánicos. Esta alternativa
no descontamina pero aísla la contaminación y evita su expansión.
• Bombeo (skimming, pump and treat) : cuando los hidrocarburos alcanzan las
napas freáticas y forman sobre el agua un sobrenadante insoluble, se
construye un pozo hasta el lugar de la contaminación. Esta es absorbida a lo
largo del pozo por bombeo con el fin de separarla de la napa y del suelo. En
algunos casos, esta contaminación es fácilmente separada del medio pero en
otros, la separación es imposible de realizar y debe de bombearse y tratarse
todo el contenido de la napa freática.
• Extracción bajo vacío (venting) : en el caso de los hidrocarburos volátiles,
provocar una depresión en el suelo permite aspirar los hidrocarburos,
adsorberlos a un soporte o en un recipiente para gases y transformarlos por
oxidación térmica o catalítica.
• Inyección de aire (air sparging) : para numerosos hidrocarburos es útil
inyectar aire hacia el fondo de las napas de manera que el aire arrastre los
contaminantes cuando asciende a través del agua y del suelo.
• Procedimiento eléctrico : en los suelos con una tasa de humedad mínima de
14 a 18 % es posible hacer migrar los contaminantes cargados utilizando
campos eléctricos.
• Desorción térmica : el suelo contaminado deber ser excavado y colocado a
600 - 800 °C con el fin de desorber su agua y sus contaminantes. Esto implica
el desplazamiento del suelo y constituye un tratamiento honeroso.
• Incineración : el suelo contaminado se coloca a 1000 - 1100 °C y el gas y las
cenizas restantes se tratan posteriormente. Por su aplicabilidad y su costo, es
una de las técnicas más utilizadas.
• Vitrificación : electrodos de carbono se colocan en el suelo y generan
temperaturas de 1500-1600 °C de modo que el suelo y su contenido se
derritan y vitrifiquen.
I.3.b. Tratamientos químicos
Los tratamientos químicos destruyen o transforman los contaminantes por reacción
química, es decir, las técnicas necesitan un compuesto químico que es agregado al
15
Eliminado:

suelo para reaccionar con el contaminante. A veces este reactivo puede constituir un
nuevo contaminante en caso de que sea demasiado recalcitrante o que se haya
agregado en cantidades excesivas. En el caso de los hidrocarburos, es por lo general
necesario agregar un emulsificante sintético que facilita el acceso a las moléculas
hidrófobas de hidrocarburo pero también existen otros métodos (Troquet ; Troquet,
2003) :
• Inmovilización química y quelación : algunos contaminanes pueden
estabilizarse formando un complejo con otras sustancias. Estas sustancias se
aplican sobre el suelo por inundación o nebulización y estabilizan los
contaminantes. De esta manera, es más fácil extraerlos y tratarlos pero en
general las sustancias estabilizantes utilizadas son también contaminantes.
• Extracción con fluidos supercríticos : algunos gases como el gas carbónico, el
propano y el butano, licuados a temperatura y presión críticas son inyectados
al suelo de manera que ocupen todo el espacio de este. Cuando recuperan su
estado gaseoso se volatilizan arrastrando los contaminantes.
• Oxidación química : fuertes oxidantes como el peróxido de hidrógeno y el
dióxido de cloro, se incorporan al suelo para que oxiden los contaminantes y
disminuyan su toxicidad.
I.3.c. Tratamientos biológicos
Los tratamientos biológicos representan usualmente la mejor alternativa. Además de
no implicar los costos de equipos, materiales, productos y maquinaria necesarios para
los tratamientos físicos y químicos, pueden aplicarse sobre el sitio mismo de la
contaminación, sin exigir el desplazamiento de los suelos contaminados. El
tratamiento biológico de descontaminación recibe también el nombre de
biorremediación.
La biorremediación constituye el nuevo medicamento contra el malestar ecológico
del ambiente (Samanta ; Singh ; Jain, 2002). Consiste en promover la conversión de
compuestos contaminantes en energía, masa celular y en productos biológicos
inofensivos. Esta conversión es efectuada por organismos vivos que presentan
funciones catabólicas que permiten el consumo de los contaminantes (Rahman et al.,
2001).
Los hidrocarburos provenientes de los productos petroleros pueden funcionar como
fuente de carbono y de energía para el crecimiento de diferentes microorganismos
que pueden de este modo, colonizar los sitios contaminados y degradar el agente
contaminante (Thomassin-Lacroix et al., 2002).
Según si el tratamiento biorremediativo se efectúe directamente sobre el sitio
contaminado o en otro sitio después de haber excavado los suelos contaminados, se
hablará respectivamente de una biorremediación in situ o una ex situ. Considerando
16

que el desplazamiento del suelo contaminado puede desequilibrar la capacidad
autorremediante de los ecosistemas, se recomienda por lo general la biorremediación
in situ, considerada también como el tratamiento menos invasor (Harris, 1997).
Puede llevarse a cabo bajo tres formas :
• La bioatenuación : seguimiento (monitoreo y documentación) de la
degradación natural por la flora y fauna endógenas al sitio contaminado
(Harris, 1997).
• La bioestimulación : estimulación de las micropoblaciones nativas por
adición de nutrientes esenciales para su actividad metabólica
(principalmente una fertilización inorgánica a base de nitrógeno, fósforo y
minerales u orgánica a base de compost) (Swannell et al., 1999).
• La bioaumentación : aporte de biomasa exógena especializada para la
degradación de los contaminantes (Balba ; Al-Awadhi ; Al-Daher, 1998).
La bioatenuación es la más favorable de las biorremediaciones visto que deja la
recuperación del equilibrio natural en manos de las poblaciones autóctonas. Sin
embargo, la persistencia de algunos compuestos tóxicos en el ambiente permite
suponer que la diversidad metabólica natural de los microorganismos autóctonos no
resulta suficiente para proteger al suelo de algunas contaminaciones (antropogénicas)
y el ser humano debe entonces intervenir (Pieper ; Reineke, 2000).
La biorremediación in situ presenta las ventajas siguientes :
• Es utilizable en el lugar mismo de la contaminación sin causar
perturbaciones irreversibles en los alrededores ; favorece la entera
destrucción de la contaminación sin causar perturbaciones colaterales.
• Elimina las contaminaciones antes consideradas recalcitrantes (poco
biodegradables).
• Se adapta a la heterogeneidad de la contaminación, a sus importantes
concentraciones así como a la variabilidad de las condiciones ambientales
durante la aplicación del tratamiento (Timmis ; Pieper, 1999).
La biorremediación ex situ, por otro lado, permite supervisar la degradación del
contaminante por los microorganismos bajo condiciones óptimas controladas. Todos
los parámetros de descomposición son examinadas con el fin de obtener un estudio
completo de cada caso de contaminación y poder dirigir con él, la biorremediación en
el sitio (Harris, 1997).
I.4. LOS MICROORGANISMOS QUE DEGRADAN LOS
HIDROCARBUROS
Los microorganismos se adaptan o desarrollan su metabolismo en función de los
parámetros físico-químicos (pH, temperatura, humedad) así como de los compuestos
químicos que se encuentran en su ambiente inmediato. El petróleo y los
17

hidrocarburos se encuentran naturalmente presentes en el suelo, lo que ha permitido a
muchos microorganismos acostumbrarse a su presencia y utilizarlos para sobrevivir.
En el caso de los hidrocarburos, las bacterias gram negativas parecen encontrarse más
adaptadas a estas fuentes de carbono (Venosa et al., 1999).
Diversos estudios permiten hoy en día establecer una lista de 160 géneros de
microorganismos que degradan los hidrocarburos (Prince et al., 1999), los consorcios
más empleados contienen las especies Flavobacterium, Achromobacter,
Rhodococcus, Micrococcus, Bacillus, Corynebacterium, Pseudomonas, Aeromonas,
Acinetobacter y en menos ocasiones Mycobacterium, Aspergillus, Fusarium,
Penicillium, Rhodotorula y Candida. Las bacterias son más empleadas que los
hongos y las levaduras (Balba ; Al-Adawadhi ; Al-Daher, 1998 ; Vasudevan ;
Rajaram, 2001 ; Rahman et al., 2001).
Es importante estudiar qué poblaciones existen en el suelo contaminado ya que estas
probablemente ya se habrán adaptado al ambiente contaminado (Hanson et al., 1997).
Las poblaciones nativas pueden ser sensibles a la presencia y la actividad de
poblaciones extranjeras especializadas. Estas poblaciones, visto las diferencias
metabólicas, producen en algunos casos metabolitos e intermediarios tóxicos para la
microflora nativa. Muchas veces también, estas poblaciones agregadas no se adaptan
a las condiciones del sitio contaminado y debido a ello, no realizan la
descontaminación con la misma eficiencia con la que lo hacen las poblaciones nativas
(Thomassin-Lacroix et al., 2002).
El suelo es un medio complejo orgánico y/o mineral en el que muchas condiciones
determinan la variabilidad de la microflora (Madigan ; Martinko ; Parker, 1998). La
biodegradación de los hidrocarburos se realiza de preferencia a una temperatura entre
15 y 30°C. Visto la complejidad del suelo, deben controlarse también el pH, los
nutrientes, la disponibilidad de oxígeno y del contaminante (Thomassin-Lacroix et
al., 2002).
La biodisponibilidad de los hidrocarburos es esencial para su descomposición. La
adición de agentes de superficie (surfactantes o emulsificantes) permite mejorar esta
disponibilidad (Harris, 1997). Cuando los microorganismos producen sus propios
surfactantes (biosurfactantes o bioemulsificantes), en general, al principio de la fase
estacionaria de crecimiento (Ron ; Rosenberg, 2002), se recomienda no agregar
emulsificantes sintéticos debido a que sus efectos sobre la actividad microbiana aún
no son claros (Stelmack ; Gray ; Pickard, 1998).
I.4.a. Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida
Las bacterias representan los microorganismos más numerosos en el suelo. Entre
ellas, Acinetobacter y Pseudomonas presentan un gran interés para la biodegradación
de xenobióticos (Davids ; Flemming ; Wilderer, 1998). Su actividad de
18

iodegradación es complementaria puesto que la degradación de los aromáticos por
Pseudomonas depende en algunos casos de los metabolitos producidos por la
degradación de los alcanos por Acinetobacter (Komukai-Nakamura, et al., 1996).
Acinetobacter es considerado como el componente ideal de los consorcios de
degradación de los hidrocarburos debido a que descompone un gran número de
alcanos además de producir un bioemulsificante que facilita el acceso a los
hidrocarburos para las demás cepas del consorcio (Ron ; Rosenberg, 2002).
Pseudomonas es un bacilo gram negativo aeróbico que existe en el suelo pero
también en el agua dulce y salada. Este género consume todo tipo de sustratos
orgánicos como los azúcares y aminoácidos, alcoholes, hidrocarburos, ácidos
húmicos e inclusive algunos plaguicidas sintéticos (Davids ; Flemming ; Wilderer,
1998). Los biosurfactantes de bajo peso molecular, como el ramnolípido, el lípido de
trehalosa y el lípido sofórico producidos por algunas cepas, están compuestos por
carbohidratos asociados con ácidos alifáticos de largas cadenas o lipopéptidos (Ron ;
Rosenberg, 2002).
Acinetobacter es un cocobacilo gram negativo aeróbico resistente a la ampicilina. Se
encuentra en el agua, el suelo y sobre la piel humana. Forma parte del grupo de
organismos que alteran la carne fresca, las aves y el pescado (Madigan ; Martinko ;
Parker, 1999). Su capacidad para consumir los hidrocarburos se ve relacionada con el
hecho de que produce un biosurfactante o bioemulsificante (Marín ; Pedregosa ;
Laborda, 1996). Este emulsificante de importante peso molecular está constituido por
polisacáridos, proteínas, lipopolisacáridos y lipoproteínas (Ron ; Rosenberg, 2002).
I.4.b. Microorganismos Genéticamente Modificados (MGM)
Estudios genéticos han demostrado que los genes que codifican para las enzimas
responsables de la metabolización de los hidrocarburos contaminantes se encuentran
generalmente en el ADN plasmídico de la bacteria. Por ejemplo, las enzimas
responsables de la conversión de los alcanos en acetyl-CoA son codificadas por genes
llamados Alk que se encuentran sobre los plásmidos de la cepa Acinetobacter sp.
ADP1. Estos genes portan el código de enzimas diferentes según la especie en la que
se encuentran (Ratajczak ; Geißdörfer ; Hillen, 1998). Este ADN puede transferirse
de un organismo a otro taxonómicamente cercano por transformación. De esta
manera natural se construyen poblaciones dotadas de las enzimas necesarias para la
degradación del contaminante (Harris, 1997). Si bien la frecuencia de transferencia
natural del material genético entre dos especies bacterianas es débil, (Nielsen ;
Smalla ; Van Elsas, 1999), las barreras pueden vencerse en laboratorio con la
producción de Microorganismos Genéticamente Modificados (MGM).
Como los microorganismos producen las enzimas según las condiciones de los
alrededores y son capaces de intercambiar naturalmente este material genético, se
recomienda aislar aquellos que sobreviven en el medio contaminado antes de
19

transformar genéticamente microorganismos para volverlos más especializados pero
seguramente menos adaptados (Prince et al., 1999).
Los MGM en biorremediación presentan un gran inconveniente en comparación con
los microorganismos naturales : la inestabilidad plasmídica no garantiza un
mantenimiento de los genes clonados en ausencia de contaminación como presión de
selección (Pieper ; Reineke, 2000). Su utilización para la degradación de los
hidrocarburos no ha sido aún profundizada y levanta muchas veces un debate ético
importante desde el punto de vista de la bioseguridad relativa a la utilización de los
MGM en el ambiente (O’Gara, 2002).
Además, las actividades microbianas naturales son y han sido siempre el punto de
partida para todas las aplicaciones de la biotecnología. Contrariamente a otros casos
de contaminación con productos xenobióticos, la contaminación con hidrocarburos
quizá no merezca todavía la intervención de MGM concebidos en laboratorio puesto
que los microorganismos naturales que presentan potencial para degradar los
contaminantes existen probablemente en suficiencia (Pieper ; Reineke, 2000).
I. 4.c. Biodisponibilidad del agente contaminante : Surfactantes naturales y
sintéticos
La bioacumulación de un agente contaminante en el suelo se ve directamente
relacionada con el carácter hidrófilo o hidrófobo (es decir, lipofóbico o lipofílico) de
su estructura química. Entre más soluble es en el agua más tóxico es, mientras que un
carácter lipofílico permite su acumulación y consecuentemente, su longevidad (De
Brouwer, 2002).
Los detergentes naturales o sintéticos emulsifican los hidrocarburos para incrementar
su dispersión ; las cadenas carbonadas hidrófobas exponen hacia el exterior funciones
hidrófilas que facilitan el contacto entre la contaminación y los microorganismos que
degradan esta última (Pennel ; Abriola, 1998). Los bioemulsificantes son en general
glicolípidos (con grupos hidrófobos e hidrófilos) de importante masa molecular que
envuelven las moléculas de hidrocarburos y modifican su orientación molecular de
manera que sean menos adsorbables por las partículas del suelo, y por lo tanto más
accesibles para los microorganismos. De esta manera, estos logran incorporarse a la
interfase donde el oxígeno y las demás condiciones son favorables para la actividad
de degradación realizada por las poblaciones microbianas (Abdel-El-Haleem, 2003).
Observaciones al microscopio han mostrado que Acinetobacter construye capas
membranosas amorfas sobre los sustratos hidrófobos para poder establecer un
contacto con estos últimos. Después del contacto, sucede un reconocimiento seguido
por una oxidación y transformación del hidrocarburo para prepararlo para las rutas
metabólicas de la célula (Marín ; Pedregosa ; Laborda, 1996). Los microorganismos
20

productores de emulsificantes lo utilizan para controlar las propiedades de su
superficie con el fin de anclarse a o liberarse de un sustrato determinado. La carencia
de nutrientes estimula muchas veces a las bacterias para que liberen emulsificantes y
aumenten las probabilidades de encontrar un sustrato adecuado para las necesidades
de crecimiento (Ron ; Rosenberg, 2002).
La mayoría de las cepas que consumen hidrocarburos secretan un bioemulsificante,
cuando esta secreción es inexistente, emulsificantes artificiales pueden ser añadidos al
sitio. Algunos ejemplos de estos emulsificantes son los detergentes aniónicos como
el Dodecil Sulfato de Sodio (SDS), catiónicos como el bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB), no-iónicos como el Tritón X-100 y los ramnolípidos.
Por razones aún desconocidas, algunos de estos emulsificantes sintéticos inhiben el
crecimiento e impiden la biodegradación (Hanson et al., 1996). Se recomienda
utilizar bioemulsificantes en lugar de surfactantes químicos debido a que los primeros
son más selectivos, menos estables y por lo tanto más compatibles desde un punta de
vista ambiental (Ron ; Rosenberg, 2002).
I.5. EL METABOLISMO DE LOS HIDROCARBUROS
Dado que Acinetobacter y Pseudomonas utilizadas a lo largo de este trabajo son
bacterias aeróbicas, únicamente serán consideradas las rutas aeróbicas de
metabolización de los hidrocarburos. Para que un hidrocarburo sea reconocido por un
microorganismo como sustrato utilizable por este mismo, los receptores localizados
sobre la membrana celular deben reconocer algunos grupos químicos con el fin de
adsorber las moléculas. Cuando un hidrocarburo es demasiado soluble, penetra la
membrana, la vuelve inestable y provoca una lisis celular. Por esta razón es que
muchos compuestos solubles son considerados tóxicos para las bacterias (Pieper ;
Reineke, 2000).
Por otro lado, los compuestos no tóxicos son transportados selectivamente
(reconocimiento bioquímico) hacia el citoplasma de la bacteria y toman diferentes
rutas de metabolización. Pasando por varias etapas, el compuesto puede ser parcial o
completamente degradado o mineralizado. La mineralización implica la
transformación total del reactivo en agua y dióxido de carbono (Harris, 1997).
La metabolización de compuestos tóxicos puede dividirse en dos fases donde la
polaridad del compuesto, y por lo tanto su solubilidad y su toxicidad, serán
modificadas :
1. Funcionalización : la polaridad del compuesto va aumentar por una
oxidación, reducción o hidroxilación de manera que pueda sufrir otras
transformaciones.
2. Conjugación : por asociación con un molécula polar, la polaridad del
contaminante se ve acentuada de manera que el compuesto se desintoxique y
que disminuyan las posibilidades de bioacumulación (De Brouwer, 2002).
21

Según las estructuras particulares de los hidrocarburos, diferentes enzimas se
encargan de su digestión y biodegradación ; existen varias rutas enzimáticas. Los
hidrocarburos alifáticos de tipo alcano lineal son oxidados en ácidos grasos
catabolizados por ß-oxidación (Rittman, 1994). La figura 2 presenta estas reacciones
bioquímicas :
Fig. 2 : Rutas de degradación de los alcanos por oxidación del grupo metil terminal,
subterminal y biterminal (van Beilen, et al., 2003).
La hidroxilasa, también llamada monooxigenasa, transfiere un solo átomo de la
molécula de oxígeno y transforma el alcano en alcohol primario oxidando al grupo
metil terminal. Las deshidrogenasas se encargan de los compuestos siguientes para
obtener un ácido graso que pueda ser oxidado de manera que el microorganismos
obtenga energía por medio del ciclo de Krebs y oxalato para fabricar materiales
celulares nuevos (figura 3) (Rittman, 1994).
Puede ocurrir también que los microorganismos degraden los hidrocarburos mediante
una oxidación del gurpo metil subterminal para producir un alcohol secundario en vez
del alcohol primario producido por la oxidación del grupo metil terminal. Esta
oxidación es realizada por lo general por aquellas cepas que co-oxidan los alcanos
durante su crecimiento sobre otros sustratos por co-metabolismo. La importancia de
los consorcios es clave visto que varias cepas diferentes son necesarias para
descomponer cada producto intermediario (Franzmann et al., 2002).
22

Fig. 3 : Transformación de un ácido graso en el Ciclo de Krebs (Caprette, 2000)
Los alcanos ramificados son sustratos muy pobres pero constituyen una gran parte del
petróleo y de sus productos refinados. Su oxidación comienza por una hidroxilación
y deshidrogenaciones sucesivas. La estructura ramificada no permite obtener una
oxidación eficiente de los ácidos producidos por lo cual pocos microorganismos los
logran utilizar como única fuente de carbono y energía.
Los hidrocarburos alicíclicos son más difíciles de degradar puesto que las enzimas
responsables de su metabolización son más especializadas y por entonces, raras. Los
consorcios, como en el caso de los alcanos ramificados, constituyen la mejor opción
de degradación debido a que cada especie interviene a un nivel diferente de
desintoxicación del contaminante (Aitken, 1998). Por ejemplo, Nocardia sp. y
Pseudomonas sp. logran degradar juntas (por la actividad de sus monooxigenasas
particulares) al ciclohexano (Rittman, 1994).
23

En el caso de los hidrocarburos aromáticos, la degradación del benceno es similar a la
de los otros aromáticos. El benceno es digerido por las dioxigenasas que provocan la
ruptura del núcleo por hidroxilación de manera que la molécula sea químicamente
más accesible. Esta reacción se presenta en la figura 4 (Rittman, 1994).
Fig. 4 : Reacción de degradación del benceno, del tolueno y del xileno (Rittman,
1994).
I.5.a. Parámetros indicadores de la metabolización de los hidrocarburos
Como lo indican las figuras anteriores, la oxidación de los hidrocarburos produce
ácidos grasos que son utilizados por las bacterias o liberadas en el medio. Si este es
el caso, el pH del medio disminuye. Esta acidificación se emplea como parámetro
para evaluar la degradación, junto con :
o El incremento de la población microbiana a lo largo del tiempo es el resultado
del consumo de los hidrocarburos como fuente de carbono y energía. Este
24

aumento de población puede visualizarse al medir la turbidez del medio (la
densidad óptica), la evolución de la materia seca y la viabilidad (UFC/ml) en
el tiempo.
o La disminución de la concentración de hidrocarburo en el medio puede ser un
segundo indicador de la degradación. Si la población logra utilizar el
contaminante como fuente de carbono, la concentración del mismo debe
disminuir con el tiempo y ser reemplazado en el medio por nuevos
metabolitos. La determinación de la concentración puede hacerse por
métodos analíticos (cromatografía, absorción IR) o de Immunoassay (kit
enzimáticos).
o La evolución de la Demanda Bioquímica de Oxígeno puede también constituir
un indicador de la actividad de degradación que realizan los microorganismos
sobre las fuentes de carbono empleando al oxígeno como aceptor de
electrones. Una prueba respirométrica puede llevarse a cabo sobre un suelo
contaminado en presencia de microorganismos (Balba et al., 1998).
25

II. REVISIÓN DE LITERATURA
26

II.1. LA BIODEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS
Los hidrocarburos presentan la particularidad de adsorberse rápida y fuertemente a las
partículas del suelo. Esta peculiaridad junto con la gran variedad de hidrocarburos
hace necesario concebir consorcios bacterianos que logran trabajar juntos para la
descomposición natural de los contaminantes. Rahman et al. (2001) mostraron que la
degradación de la gasolina alcanza un nivel óptimo al combinar apropiadamente los
microorganismos, nutrientes inorgánicos y orgánicos y surfactantes, el todo asociado
con buenas condiciones de oxigenación.
Hace diez años, el tolueno y otros compuestos volátiles se consideraban como muy
poco tolerados por las cepas de Pseudomonas, Achromobacter y Nocardia
disponibles en ese momento ; para el benceno, ninguna cepa tolerante se conocía aún
(Moriya ; Horikoshi, 1993). Desde entonces, muchos estudios han demostrado que
los compuestos volátiles son metabolizados por algunas cepas en medio anaerobio,
relacionado con las reducciones de nitratos, sulfatos, hierro, óxido de manganeso y
con la producción de metano. Diferentes alternativas de aceptores de electrones
como el fumarato, el humus y las quinonas han sido igualmente propuestas (Burland ;
Edwards, 1998 ; Cervantes et al., 2001 ; Franzmann et al., 2002).
En medio aerobio, métodos paralelos como la condensación, la absorción sobre
carbono activado y la oxidación térmica se aplican para captar y degradar los
hidrocarburos volátiles (Li et al., 2001). Estos métodos aprovechan que los
microorganismos que se encuentran inmovilizados sobre algunas superficies ideales
bajo forma de biofilms, se encuentran menos expuestos a la toxicidad de los
compuestos volátiles y soportan concentraciones mayores del agente contaminante
(Franzmann et al., 2002).
Existe una diferencia entre las tasas de degradación de los contaminantes en estado
puro y aquellos que forman parte de una mezcla de hidrocarburos, como en el caso
del diesel y la gasolina (Greene et al., 2000). Algunas pruebas han permitido
verificar que mezclados, el tolueno es degradado antes que el benceno (fenómeno
llamado preferential biodegradation) (Franzmann et al., 2002). Para una degradación
más rápida y completa es preferible degradarlos a partir de su forma pura antes que en
presencia de otros hidrocarburos (Greene et al., 2000).
La baja solubilidad de los hidrocarburos en medio acuoso necesita la acción de
surfactantes para incrementar su biodisponibilidad y su metabolización por los
microorganismos (Harris, 1997). Como el efecto de los emulsificantes químicos sobre
las bacterias y la dispersión de los hidrocarburos no está muy claro, es preferible
trabajar con cepas que producen un bioemulsificante a la vez que degradan los
hidrocarburos. Ha sido comprobado por varios autores que los surfactantes de origen
químico pueden provocar una inhibición del crecimiento de los microorganismos y
una disminución del rendimiento de la biodegradación. Su fuerte actividad
tensoactiva disminuye la estabilidad de las membranas celulares y produce una lisis
27

celular. Sin embargo, los biosurfactantes producidos por los microorganismos
degradadores no son tóxicos para estos (Lepo et al., 2001).
Debe también considerarse el problema de la concentración residual de los
contaminantes después de su degradación. Este residuo permanece sin importar el
tratamiento aplicado pero debe ser minimizado. Por esto, Nocentini, Pinelli y Fava
(2000) recomiendan los consorcios bacterianos en vez de los cultivos puros. Juntas,
varias bacterias pueden degradar varios hidrocarburos del diesel o del petróleo hasta
obtener un residuo mínimo.
II.2. BIOAUMENTACIÓN CON Acinetobacter sp. Y Pseudomonas putida
Visto que son originarias del suelo, que degradan respectivamente alcanos y
compuestos aromáticos y que producen sus propios surfactantes, Acinetobacter sp. y
Pseudomonas putida son excelentes candidatas para la constitución de consorcios
bacterianos especializados en la biorremediación de suelos contaminados con
hidrocarburos (Komukai-Nakamura, 1996).
La utilización de los alcanos de largas cadenas por Acinetobacter sp. fue estudiada en
la Facultad de Agricultura de la Universidad de Kyoto. Los resultados muestran que
la cepa M-1 aislada de una muestra de suelo, crecía utilizando varios hidrocarburos
(C13-C44) como única fuente de carbono (Sakai et al., 1994). En 1997, Hanson et al.
obtuvieron un 60% de consumo de los BHCO (Bombay High Crude Oils) por la cepa
A-3 de Acinetobacter sp. en erlenmeyers agitados. Un diez por ciento adicional del
BHCO es eliminado por evaporación o reacciones foto- y geo-químicas (Komukai-
Nakamura, 1996).
Las fracciones volátiles (compuestos de en general menos de 12 átomos de carbono y
que presentan una presión de vapor superior a 0,0007 atm) como el tolueno (que
conforma de un 5 a un 7% de la gasolina (Cervantes et al., 2001)), el xileno y el
benceno desaparecen por evaporación y terminan en el aire. Es fundamental trabajar
con cepas capaces de metabolizar rápidamente los compuestos volátiles antes de que
estos escapen y formen el smog (Li et al., 2001). Pseudomonas putida presenta las
dioxigenasas necesarias para la degradación de estos compuestos aromáticos y puede
de este modo trabajar en complementariedad con Acinetobacter sp. en la degradación
del diesel y otras mezclas de hidrocarburos (Samanta ; Singh ; Jain, 2002).
El Marine Biotechnology Institut de Japón obtuvo pruebas sobre la actividad
complementaria entre Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida para la degradación
de las fracciones de alcanos y aromáticos del Arabian Light Crude Oil (ALCO).
Acinetobacter sp. consumiría los alcanos (C8-C20) y los alquilbencenos de largas
cadenas laterales y liberaría los productos de la ß-oxidación (8-feniloctanoato, 6fenilhexanoato
y 4-fenilbutirato) en el medio ; estos últimos servirían de co-sustratos
28

para P. putida para que pueda consumir, a su vez, el benceno y los alquilbencenos de
cadenas laterales cortas del ALCO (Komukai-Nakamura et al., 1996).
II.3. RESULTADOS DE UNA BIOESTIMULACION CON NUTRIENTES
INORGANICOS Y ORGANICOS
Los hidrocarburos deben presentar una dispersión óptima de manera que su emulsión
sea facilitada y se garantice su descomposición (Prince et al., 1999). Si se agregan
nutrientes, es importante verificar que no favorezcan únicamente el crecimiento de
los microorganismos sino también la degradación del contaminante. Vasudevan y
Rajaram (2001) observaron que el compost agregado sobre un suelo contaminado con
hidrocarburos, por ejemplo, no mejora la degradación de estos últimos sino que
únicamente aumenta el crecimiento de los microorganismos.
En la Universidad de Alcalá de Henares se aisló la cepa MM5 de Acinetobacter
calcoaceticus y demostró que esta producía un surfactante que permitía su adhesión a
los hidrocarburos del petróleo y a los compuestos alifáticos y aromáticos puros. No
se recomienda por lo tanto agregar agentes de superficie sino elementos que
estimulen la producción del surfactante natural para garantizar el correcto desarrollo
de los procedimientos específicos de interacción de las células, la colonización de
sustratos, su oxidación y transformación (Marín ; Pedregosa ; Laborda, 1996).
En 1996, la Facultad de Ciencias de la Universidad de Baroda preconiza una adición
de fuentes de nitrógeno y fósforo. Cuando existe una contaminación con
hidrocarburos, la proporción entre las concentraciones de carbono, nitrógeno y
fósforo sufre por lo general un desequilibrio. Puede ser interesante agregar los
elementos faltantes con el fin de reequilibrar las proporciones naturales (100 C : 10
N : 1 P) por bioaumentación (Ballerini ; Gatellier ; Vogel, 1998).
II.4. POTENCIAL DE LA BIORREMEDIACION DE LOS SUELOS
CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS POR Acinetobacter sp. Y
Pseudomonas putida.
Los suelos contaminados son, por lo general, colonizados por diferentes especies que
se adaptaron a las fuentes de energía presentes en el sitio. Para esto, los aislamientos
de bacterias realizados sobre muestras de suelos contaminados permiten obtener
varias cepas interesantes. Marín et al. (1995) aislaron más de 20 cepas bacterianas a
partir de una muestra de suelo contaminado con hidrocarburos ; De ellas, 15
degradaban los hidrocarburos puros, en presencia y en ausencia de glucosa ; entre
ellas Pseudomonas, Staphylococcus y Acinetobacter. El hecho de que ya compartan
un ambiente sugiere que han creado relaciones simbióticas para sobrevivir en él.
29

Los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que las bacterias Acinetobacter
sp. y Pseudomonas putida serían excelentes candidatas para el saneamiento de suelos
contaminados con hidrocarburos. Queda por verificar, visto las diferencias que
existe de una cepa a otra en una misma especie y según las condiciones de
crecimiento, si estas bacterias pueden degradar individualmente hidrocarburos puros
en fermentadores (reactores) y erlenmeyers agitados en vista de utilizarlas para la
biorremediación de los suelos contaminados.
30

III. OBJETIVO
31

III.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar los potenciales de las cepas Acinetobacter sp. LMG 1056, Pseudomonas
putida LMG 2257, P. putida DSMZ 6414, P. putida DSMZ 6899 y P. putida ATCC
39213 para la degradación del benceno, el tolueno, el xileno, el ciclohexano, el
hexano, el octano, el decano, el hexadecano y el diesel en erlenmeyers agitados, en
reactor así como en un suelo y un lodo artificialmente contaminados.
III.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
III.2.a. Realizar un seguimiento de la degradación de nueve hidrocarburos en fase
líquida al :
III.2.a.i. Determinar el crecimiento de cinco cepas de bacterias en
medios de cultivo agitados que contienen hidrocarburos
contaminantes a escala de erlenmeyer y reactor mediante la
medida de densidad óptica directa e indirecta, la medida de
peso seco y por conteo de Unidades Formadoras de Colonias
por mililitro de cultivo (UFC/ml).
III.2.a.ii. Evaluar los cambios de pH, pO2 así como de consumo de ácido
y base como indicadores del consumo de los hidrocarburos
agregados como única fuente de carbono en los medios de
cultivo.
III.2.a.iii. Medir el consumo de los hidrocarburos en medio acuoso por
método gravimétrico tras una extracción al hexano y por el
método 10050 del kit enzimático de Immunoassay para
detección de TPH (Total Petroleum Hydrocarbons) de la
empresa HACH.
III.2.b. Realizar un seguimiento de la degradación del diesel efectuado por
Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre un suelo contaminado artificialmente
con 5000 ppm de diesel mediante la medida de la Demanda Bioquímica de
Oxígeno (DBO), la evolución de la microbiología y la concentración del
diesel en cuatro semanas.
32

IV. MATERIALES Y MÉTODOS
33

IV.1. MATERIAL BIOLÓGICO, MEDIOS DE CULTIVO Y PRECULTIVOS Y
PREPARACIÓN DE LOS INÓCULOS
IV.1.a. Material biológico
Las diferentes cepas utilizadas se obtuvieron de las tres colecciones siguientes :
• Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (Laboratorio de
Microbiología de la Universidad de Gand), Gand, Bélgica : Acinetobacter sp.
LMG 1056 y Pseudomonas putida LMG 2257.
• Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Colección
Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares), Braunschweig,
Alemania : Pseudomonas putida DSMZ 6414 y P. putida DSMZ 6899.
• American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo de los
Estados Unidos) Manassas-Virginia, Estados Unidos : Pseudomonas putida
ATCC 39213.
Todas las cepas se cultivaron inicialmente en 100 ml de medio líquido Luria Bertani
(LB) líquido en erlenmeyers de 250 ml con agitación durante una noche. El día
siguiente, la pureza del cultivo fue verificada al microscopio y el cultivo puro se
repartió en pequeños tubos con glicerol al 40% v/v para conservarlo a –80°C en las
refrigeradoras REVCO.
Las cinco cepas fueron cultivadas en medio LB líquido con el fin de realizar un
seguimiento de la densidad óptica a 660 nm, del pH y de la viabilidad (UFC/ml) de
las cepas en un transcurso de 24 horas. Estos datos permitieron construir una curva
de crecimiento para cada cepa y calcular el tiempo de generación (g) así como la
velocidad específica de crecimiento (µ) de cada una por un método gráfico a partir de
la curva semi-logarítmica de la evolución de la densidad óptica en el tiempo.
IV.1.b. Medios de cultivo (Anexo 1)
Los precultivos y plaqueos se realizaron sobre un medio LB compuesto por :
• 10 g/l de triptona (DIFCO)
• 5 g/l de extracto de levadura (MERCK)
• 10 g/l de NaCl (MERCK)
• 15 g/l de agar para la preparación del medio sólido
Las pruebas con hidrocarburos se realizaron sobre medio mineral líquido MM2
compuesto por :
• 0,1 g/l de MgSO4*7H2O (MERCK)
• 3 g/l de KH2PO4 (MERCK)
34

• 3 g/l de (NH4)2SO4 (MERCK)
• 2 g/l de NaCl (MERCK)
• 0,2 ml/l de Tween 80 (SIGMA)
• 2 g/l de Yeast Nitrogen Base sin aminoácidos ni (NH4)2SO4 compuesto por
vitaminas, sales y elementos traza (DIFCO) :
Vitaminas : Elementos traza : Sales :
- 2 µg/l Biotina - 500 µg/l Ácide Bórico - 1 g/l Monohidrogenofosfato de
Potasio
- 400 µg/l Pantotenato de Calcio - 40 µg/l Sulfato de Cobre - 0,5 g/l Sulfato de Magnesio
- 2 µg/l Ácido Fólico - 100 µg/l Ioduro de Potasio - 0,1 g/l Cloruro de Sodio
- 2000 µg/l Inositol - 200 µg/l Cloruro de Hierro - 0,1 g/l Cloruro de Calcio
- 400 µg/l Niacina - 400 µg/l Sulfato de Magnesio
- 200 µg/l Ácido p-Aminobenzoico - 200 µg/l Molybdato de Sodio
- 400 µg/l Hidrocloruro de Piridoxina - 400 µg/l Sulfato de Zinc
- 200 µg/l Riboflavina
- 400 µg/l Hidrocloruro de Tiamina
Los testigos positivos y algunas pruebas de metabolismo en presencia de glucosa se
prepararon agregando 2 g/l de una solución al 50% de glucosa estéril al medio MM2.
Todos los medios se prepararon con agua desmineralizada y fueron autoclavados
durante 20 minutos a 121°C. El medio LB presenta un pH neutro desde su
preparación pero el medio MM2 fue neutralizado (pH 7) antes de su esterilización,
con una solución de NaOH 2 M.
Los hidrocarburos siguientes fueron agregados al medio MM2 esterilizado con una
concentración de 0,5% v/v con el fin de probar la biodegradación realizada por las
diferentes cepas :
o Benceno (C6H6) :
• Fabricación : RPL-UCB (Bélgica)
• Masa Molecular : 78,12 g/mol
• Densidad : 0,8765 g/ml
• Temperatura de ebullición : 80,1°C
• Tensión de Vapor : 0,100 atm
• Solubilidad en el agua : 0,188 % m/m (à 23,5 °C)
o Ciclohexano (C6H12) :
• Fabricación : Merck
• Masa Molecular : 84,16 g/mol
• Densidad : 0,7786 g/ml
35

• Temperatura de ebullición : 80,7 °C (760)
• Solubilidad en el agua : 0,0052 % p/p (a 23,5 °C) ; 0,055 g/l
o Decano (C10H22) :
• Fabricación : Merck-Schuchardt
• Masa Molecular : 142,29 g/mol
• Densidad : 0,729-0,731 g/ml
• Temperatura de ebullición : 174,10 °C
• Solubilidad en el agua : 5,2 x 10 -5 g/l
o Diesel
• Fabricación : Total Fina Elf (Total, S.A.)
• Densidad : 0,825 g/ml
• Temperatura de ebullición : 160 – 370 °C
• Solubilidad en el agua : 2,6 x 10 -3 g/l
o Hexadecano (C6H34) :
• Fabricación : Sigma Chemical
• Masa Molecular : 226,4 g/mol
• Densidad : 0,7749 - 0,7770 g/ml
• Temperatura de ebullición : 285 - 287 °C
• Solubilidad en el agua : 5 x 10 -8 g/l
o Hexano (C6H14) :
• Fabricación : May & Baker (Inglaterra)
• Masa Molecular : 86,177 g/mol
• Densidad : 0,6593 g/ml
• Temperatura de ebullición : 68,95 °C
• Solubilidad en el agua : insoluble ; 9,5 x 10 -3 g/l
o Octano (C8H18) :
• Fabricación : Riedel-de Haën
• Masa Molecular : 114,23 g/mol
• Densidad : 0,7027-0,7040 g/ml
• Temperatura de ebullición : 125,6 °C
• Solubilidad en el agua : insoluble ; 6,6 x 10 -4 g/l
o Tolueno (C7H8) :
• Fabricación : Merck
• Masa Molecular : 92,14 g/mol
• Densidad : 0,8669 g/ml
• Temperatura de ebullición : 110,6 °C
• Solubilidad en el agua : 0,067 % p/p (a 23,5 °C) ; 0,515 g/l
o Xileno (C6H10) :
• Fabricación : RPL-UCB (Bélgica)
• Masa Molecular : 106,17 g/mol
• Densidad : 0,860 g/ml
• Temperatura de ebullición : 139,3 °C
36

• Solubilidad en el agua : insoluble ; 0,198 g/l
IV.1.c. Precultivos y preparaciones de los inóculos
Doce horas antes de inocular los erlenmeyers o el reactor, se lanzaron dos precultivos
por cepa. Para esto, 1 ml del glicerol que contiene la cepa de interés se adicionaron a
100 ml de medio LB líquido y el todo se incubó a 30°C bajo una agitación de 200
rpm. Los precultivos se observaron al microscopio para asegurarse de su pureza y se
midió la densidad óptica (D.O.). Los precultivos se mezclaron y se centrifugaron tres
veces 10 minutos a 12000 rpm en una centrífuga Sorvall® RC-5B (DuPont
Instruments) con el fin de lavar las células y de eliminar todo residuo del medio de
precultivo. Después de las dos primeras centrifugaciones, el precipitado se
resuspendió en 200 ml de solución fisiológica estéril (9 g/l NaCl), después de la
última en 50 ml para concentrar la población. Los erlenmeyers se inocularon con 2
ml de esta suspensión y los reactores se inocularon con la suspensión completa.
IV.2. PRUEBAS DE BIORREMEDIACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO
IV.2.a. Pruebas en erlenmeyers de 250 mililitros
Un testigo positivo se preparó con 100 ml de medio MM2 y 1 ml de la solución de
glucosa al 50% m/v en un erlenmeyer de 250 ml ; el testigo se preparó con
únicamente 100 ml de medio MM2 y sin fuente de carbono. Los erlenmeyers para las
pruebas se prepararon con 100 ml de medio MM2 y 0,5 ml del hidrocarburo de
interés. Todos los erlenmeyers se agitaron a 200 rpm y se incubaron a 30°C. Una
muestra de cada uno se tomó cada hora para realizar un examen microscópico, medir
el pH y leer la densidad óptica directa o indirecta según la presencia de hidrocarburo
en el medio de cultivo.
IV.2.b. Pruebas en reactor de dos litros
Se prepararon dos litros de medio de cultivo MM2 sin hidrocarburo en un reactor de
tipo BIOSTAT®B 2 L (Anexo 2). Después de esterilizarlo a 121°C durante 20
minutos (Anexo 3), el fermentador se conectó, las condiciones de cultivo se ajustaron
a 30°C, 500 rpm, pH 7 y una inyección contínua de aire a un débito de 1 l/min.
Después del ajuste, se agregaron 10 ml del hidrocarburo por probar. El pH se verificó
y la pO2 se calibró al cero y 100% de saturación de oxígeno por medio de una
inyección de aire. Los consumos de ácido (H3PO4 10 %v/v) y base (NaOH 2 M) se
calibraron en cero antes de inocular. Una vez que se inoculó, el registro continuo de
los parámatros de fermentación (temperatura, pH, consumo de ácido y de base, pO2 y
velocidad de agitación) se realizó con el software Micro Fermentation Control
37

System (MFCS) de B. Braun con el fin de obtener un gráfico sobre la evolución de
las condiciones del cultivo. En el momento de la inoculación, cada hora durante las
primeras seis horas y todas las 24 horas durante una semana, se tomó una muestra del
cultivo para medir el pH, la D.O. indirecta y observar el cultivo al microscopio. El
peso seco y la viabilidad del cultivo también se revisaron repetidas veces.
IV.2.c. Lectura del pH
Las muestras de los erlenmeyers o del fermentador se recogieron en tubos de ensayo
y después de homogeneizarlos sobre un Vortex-Génie 2 (Scientific Industries), se
leyó el pH en un aparato Consort P 307 (Microcomputer Ionmeter).
IV.2.d. Lectura directa de la Densidad Optica
La medida de la D.O. directa se realizó para las muestras tomadas sobre los testigos
positivos y negativos (que no contienen hidrocarburos) de las pruebas en
erlenmeyers. Se vertieron aproximadamente dos mililitros de la muestra en una celda
10 x 10 x 45 mm (Greiner Labortechnik) y se llevó a cabo la lectura de la turbiedad à
660 nm sobre un espectrofotómetro Jenway 6100 (Anexo 4). Al valor obtenido se le
sustrajo el valor de la turbidez del medio de cultivo solo con el fin de obtener un valor
representativo de la turbidez producida por la población bacteriana en unidades de
densidad óptica (u. D.O.). Cuando la lectura sobrepasó las 0,600 u. D.O., se
prepararon diluciones de la muestra en solución fisiológica, de manera que los valores
se mantuvieran en la zona de linealidad definida por la ley de Beer & Lambert (de
0,200 a 0,600 u. D.O.). En este caso la lectura se multiplicó por el factor de dilución.
IV.2.e. Lectura indirecta de la Densidad Optica
En el caso de las muestras de los cultivos que contienen hidrocarburos, la emulsión
formada por los hidrocarburos se eliminó debido a que interfiere con la medida de
turbidez relacionada con la población bacteriana. Para esto, cinco mililitros de la
muestra se centrifugaron durante diez minutos en una centrífuga Sorvall® GLC-2B
(DuPont Instruments) a 6000 rpm. El sobrenadante se descartó y el precipitado se
resuspendió en cinco mililitros de solución fisiológica sobre el vortex. La lectura de
turbidez de esta resuspensión se realizó a 660 nm sobre un espectrofotómetro
siguiendo el mismo procedimiento que el de la lectura de D.O. directa.
IV.2.f. Medida de viabilidad
Para las pruebas en fermentador, se prepararon diluciones decimales (en solución
fisiológica estéril) de las muestras en el momento de la inoculación, después de seis,
38

24 y 48 horas. Tres veces 0,1 ml de las diluciones se sembraron en tres placas de
Petri mediante un rastrillo de vidrio anteriormente esterilizado a la llama
(procedimiento llamado plaqueo) (Anexo 5). Las cajas de Petri de cada dilución se
incubaron a 30°C durante 24 horas con el fin de obtener entre 30 y 300 colonias por
caja. El conteo de las colonias permitió construir una curva representativa de las
Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/ml) en el medio contra el
tiempo.
IV.2.g. Pesos secos
Después de cinco, 24 y 48 horas, dos muestras de 50 ml se tomaron del reactor y se
centrifugaron tres veces a 12000 rpm durante 15 minutos para eliminar los residuos
del medio de cultivo. El precipitado se resuspendió las dos primeras veces en 100 ml
de agua fisiológica y en 15 ml de agua destilada después de la última centrifugación
(Anexo 6). Este volumen se trasvasó a un beaker de 30 ml anteriormente tarado y se
coloca en la estufa a 105°C durante 24 horas. El peso seco se expresó en gramos por
litro (g/l).
IV.2.h. Determinación del consumo del hidrocarburo por método gravimétrico
Este método aprovecha la afinidad que existe entre los diferentes hidrocarburos
estudiados y el hexano. En el momento de la inoculación, a la hora seis, 24 y 48,
muestras de 10 ml se tomaron sobre el fermentador y se congelaron inmediatamente a
–80°C. Para la extracción, las muestras se centrifugaron cinco minutos a 6000 rpm
con el fin de eliminar la biomasa y el sobrenadante se trasvasó a un beaker de 50 ml.
Veinte mililitros de hexano se agregaron y se mezclaron con el sobrenadante con
agitación magnética durante diez minutos. Después de la agitación, la fase orgánica
se trasvasó a un balón de fondo redondo o bombillo anteriormente tarado y la fase
acuosa se volvió a mezclar con 20 ml de hexano. La fase orgánica de la segunda
extracción se trasvasó al balón que ya contenía la primera extracción. Este balón se
colocó sobre un rotavapor Büchi R 110 a 70°C conectado a un sistema de vacío. La
evaporación se llevó a cabo hasta la recuperación completa del hexano (Anexo 7).
Seguidamente el balón se pesó para obtener los gramos por litro de hidrocarburo
restante en el medio. Esta técnica se aplicó para los ensayos con los compuestos poco
volátiles.
IV.2.i. Determinación de la concentración del hidrocarburo por el kit
enzimático Total Petroleum Hydrocarbures (TPH) Immunoassay Method
(HACH) para muestras acuosas (Anexo 8)
En el momento de la inoculación, a la hora seis, 24 y 48, una muestra de 10 ml se
tomó del reactor y se congelaron inmediatamente a –80°C. Estas muestras se
39

centrifugaron por 10 minutos a 6000 rpm. El sobrenadante se recuperó en un tubo de
ensayo y el precipitado que contenía la biomasa se desechó. Seguidamente se
prepararon diluciones de los sobrenadantes y se siguió el procedimiento del kit
enzimático indicado en el método de immunoassay 10050 definido por HACH. Este
constituye una prueba de resultados semi-cuantitativos que se obtienen sobre un
espectrofotómetro HACH DR 4000. Para el método, se pipeteó medio mililitro de
cada muestra en una celda cuyo interior se encuentra cubierto por un anticuerpo
(celda-anticuerpo) individual en la que se adicionan metanol y un conjugado
enzimático. La reacción entre el anticuerpo y la muestra dura diez minutos a
temperatura ambiente. Después de este tiempo, fue necesario vaciar y lavar repetidas
veces la celda con agua desmineralizada para agregar seguidamente una solución que
actúa durante diez minutos adicionales para permitir el desarrollo del color. Una vez
transcurrido este tiempo, la Stop Solution detuvo la reacción y estabilizó el color para
realizar una lectura de abosrbancia a 450 nm sobre el espectrofotómetro. Los valores
de absorbancia de las muestras se compararon con los que se obtienen de las celdas
que contienen las soluciones calibradas (Calibrators) del kit TPH Immunoassay
Method. La intensidad de la absorbancia a 450 nm es mayor conforme disminuye la
concentración en hidrocarburos. Este método enzimático permitió obtener un
intervalo de concentración para todas las muestras evaluadas.
IV.2.j. Determinación del consumo de glucosa por Accutrend® alpha.
En algunos casos, las cepas fueron probadas sobre medios que contenían
hidrocarburos y 2 g/l de glucosa. Para las pruebas, el consumo de glucosa como
prueba del metabolismo de las bacterias fue comprobado por medio de un test
Accutrend® alpha 4289. Se tomaron dos muestras de 1,5 ml en tubos Eppendorf®
cada hora durante las seis primeras horas de funcionamiento del fermentador. Los
tubos con las muestras se centrifugaron inmediatamente cinco minutos a 14000 rpm
en una centrífuga Hawksley MBC para precipitar y eliminar la biomasa. El
sobrenadante se trasvasó a un tubo Eppendorf® nuevo y una gota se analizó por
Accutrend® alpha con el fin de obtener la concentración de glucosa que sigue en el
medio en mg/dl.
IV.2.k. Determinación del consumo de glucosa por Cromatografía Líquida de Alto
Rendimiento (HPLC).
Se tomaron dos muestras de 1,5 ml cada hora durante las seis primeras horas del
fermentador. Los tubos con las muestras se centrifugaron inmediatamente cinco
minutos a 14000 rpm en una centrífuga Hawksley MBC para precipitar y eliminar la
biomasa. El sobrenadante se trasvasó a un tubo Eppendorf® nuevo y 25 µl de cada
muestra se inyectaron (inyector automático 717) a una columna Sugar PaK 1 Waters
termostatizada a 90 °C y la glucosa es detectada por un refractómetro 410
40

termostatizado a 40 °C. La muestra recorre la columna en una solución de EDTA-Ca
50 mg/l con un débito 0,5 ml/min mediante una bomba 515 Waters durante
aproximadamente 20 min. Los cromatogramas permitieron obtener las
concentraciones de glucosa en los medios de cultivo a lo largo del tiempo.
IV. 3. PRUEBAS SOBRE SUELO ARTIFICIALMENTE CONTAMINADO
CON DIESEL
IV.3.a. Origen del suelo y determinación de sus características físico-químicas
El suelo se tomó de los alrededores del lago del campus del CERIA en
Anderlecht, Bélgica. La medida del pH, de la conductividad eléctrica, de la materia
seca, de la densidad y del volumen así como la determinación de la capacidad de
retención de agua y aire se llevaron a cabo según los procedimientos propuestos por
la empresa Norland de Bélgica (Euronature Group), productora de sustratos naturales.
IV.3.a.i. Medida del pH y de la conductividad eléctrica del suelo
Una muestra de 100 gramos de suelo se diluyó y homogeneizó en 500 ml de agua
desmineralizada por agitación magnética durante 15-20 minutos. El pH se leyó sobre
un aparato Consort P 307 (Microcomputer ionmeter) y la conductividad sobre un
conductivimetro Consort K 810.
IV.3.a.ii. Determinación del contenido en materia seca del suelo
Un beaker de 200 ml se taró sobre balanza analítica (m) y 100 gramos de suelo (m1)
fresca se colocaron en él. El todo se colocó en la estufa a 105°C durante una noche y
se dejó enfriar al día siguiente en un desecador. Una vez fríos el beaker y su
contenido, el todo se vuelve a pesar sobre la misma balanza analítica (m2). La
materia seca se calcula de acuerdo con la acuación matemática siguiente : [(m2 – m) /
(m1 – m)] * 100% y se exprime en porcentaje.
IV.3.a.iii. Medidas de la densidad y el volumen del suelo
Se colocó una muestra de 100 gramos analíticos del suelo tamizado en una probeta de
200 ml y después de haber estabilizado el nivel de suelo, el volumen en mililitros se
leyó sobre la graduación de la probeta. La densidad se obtuvo dividiendo el peso
(100 g) entre el volumen (en ml).
41
Eliminado: TIERRA

IV.3.b. Pretratamiento del suelo : tamizado, contaminación artificial e
inoculación
Inicialmente se filtró el suelo por un tamiz Endecotts de 18 Mesh (1 mm) con el fin
de eliminar piedritas o raíces. Quinientos gramos de suelo tamizado se colocaron en
una botella de tres litros de capacidad. Con una agitación manual constante se
agregaron seis veces 0,5 ml de diesel (un total de 3 ml (2,5 g) con el fin de obtener
una concentración final de 10 000 ppm de diesel). La botella herméticamente cerrada
se colocó sobre un Roller Bottle (CEL-GRO Rotator, LAB-LINE) (Anexo 9) con una
velocidad de rotación de 8 rpm durante tres días con el fin de homogeneizar al
máximo la contaminación. Las respectivas pruebas de biorremediación en suelos y
lodos se prepararon al adicionar los compuestos siguiente en los recipientes VELP
Scientifica (testigos) y OxiTop® OC110 (otras pruebas) :
• Testigo Negativo de Suelo : 10 g de suelo tamizada sin contaminar + 1 ml de
agua estéril.
• Testigo Positivo de Suelo : 10 g de suelo tamizada contaminada + 1 ml de
agua estéril.
• Suelo 10 6 UFC/g : 10 g de suelo tamizado contaminado + 1 ml de suspensión
con 10 7 UFC/ml de Acinetobacter sp. LMG 1056 (en duplicado).
• Testigo Negativo de Lodo : 10 g de suelo tamizado sin contaminar + 90 ml de
agua estéril (con agitación magnética de 300-500 rpm por el sistema VELP
Scientifica).
• Testigo Positivo de Lodo : 10 g de suelo tamizado contaminado + 90 ml de
agua estéril (con agitación magnética de 300-500 rpm por el sistema VELP
Scientifica).
• Lodo 10 4 UFC/ml : 10 g de suelo tamizado contaminado + 90 ml de agua
estéril + 1 ml de suspensión con 10 6 UFC/ml de Acinetobacter sp. LMG 1056
(en duplicado y con agitación magnética de 300-500 rpm sobre base
VarioMag® (Electronicrührer Multipoint HP 15)).
• Lodo 10 5 UFC/ml : 10 g de suelo tamizado contaminado + 90 ml de agua
estéril + 1 ml de suspensión con 10 7 UFC/ml de Acinetobacter sp. LMG 1056
(en duplicado y con agitación magnética de 300-500 rpm sobre base
VarioMag® (Electronicrührer Multipoint HP 15)).
IV.3.c. Lectura de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) : Principio de los
métodos VELP Scientifica y OxiTop® OC110 (Anexo 10)
Los recipientes de todas las pruebas se cerraron herméticamente con el fin de
garantizar la eficacia del método respirométrico. Los testigos se conectaron a un
aparato VELP Scientifica sobre el cual el consumo de oxígeno se leyó sobre una
escala de mercurio a lo largo de una columna graduada. La actividad aeróbica de los
microorganismos implicó un consumo de oxígeno y una liberación de CO2 en el
recipiente. Este último fue atrapado por 10 g de pastillas de KOH y el consumo de
42

oxígeno causó entonces una despresurización en el recipiente. La despresurización
permitió el ascenso del mercurio en función de la disminución de presión por un
capilar graduado en mg/l de oxígeno. Todos los días a la misma hora durante 28 días,
el nivel alcanzado por el mercurio en el capilar se leyó sobre la escala.
Las muestras restantes se conectaron al sistema electrónico OxiTop® OC110 en el
que la lectura del consumo de oxígeno es efectuado automáticamente por una cabeza
en la que se encuentra un sistema de detección que memoriza los datos cada dos horas
durante 28 días y que permite la construcción de gráficos sobre la evolución de la
DBO de cada muestra. El principio de ambos aparatos es el mismo con la excepción
de que el último realiza las lecturas y trata los datos automáticamente según la
ecuación matemática siguiente :
Donde :
DBO = MO2 . [ Vt – Vi + α Tm ] . ∆pO2
R . Tm Vi T0
MO2 : Masa molecular del O2 (32 000 mg/mol)
R : Constante de los gases (83,144 L.mbar/mol.K)
T0 : Temperatura de referencia (273,15 K)
Tm : Temperatura de medidad (ambiente)
Vt : Volumen de la botella (volumen nominal en ml)
Vi : Volumen de la muestra (en ml)
α : Coeficiente de absorción de Bunsen (0,03103)
∆pO2 : Diferencia de presión parcial del O2 (mbar)
IV.3.d. Análisis de la evolución de la microbiología
Para cada prueba se preparó y lanzó en paralelo, un equivalente en erlenmeyers de un
litro de capacidad con el objetivo de poder tomar muestras semanales para realizar
plaqueos sobre medio LB. Estas muestras no podían ser tomadas de los cultivos
conectados a los sistemas VELP y OxiTop® OC110 debido a que el abrirlos provoca
un cambio de aire y presión contenidos en ellos y falsearía los datos de consumo de
oxígeno. Por esto, se prepararon pruebas paralelas en erlenmeyers de las que
resultaría posible obtener una idea de la evolución de la comunidad bacteriana total.
Aunque paralelas, las pruebas para microbiología variaron en que el CO2 no era
capturado por KOH, la agitación magnética se llevó a cabo sobre bases IKAMag®
Reo (IKA® Werke, Drehzahl Electronic) y el cierre no era hermético.
Para los lodos, un mililitro de los cultivos se diluyeron y sembraron sobre medio LB
mediante un rastrillo de vidrio esterilizado a la llama. La incubación se llevó a cabo
durante 24 horas a 30°C. Para los suelos, un gramo se colocó en una bolsa para
extracción en Stomacher (IUL 50 Hz) con 10 ml de agua estéril. Una extracción al
Stomacher se realizó durante cinco minutos después de los cuales las muestras se
43

dejaron decantar durante 10 minutos. Un mililitro del sobrenadante se recuperó para
preparar las diluciones y realizar la siembra del modo que se hizo para los lodos. El
resultado se expresó en microorganismos totales por mililitro de lodo o por gramo de
suelo.
IV.3.e. Determinación de la concentración del hidrocarburo por el kit enzimático
Total Petroleum Hydrocarbures (TPH) Immunoassay Method (HACH) para las
muestras de suelo
Este método sigue el mismo principio que para las muestras acuosas (IV.2.i.) con la
diferencia de que los hidrocarburos contenidos en las muestras de suelo fueron
anteriormente extraídos de estas antes de preparar la dilución y de proceder como lo
define el método 10050 de HACH. Para esto, diez gramos de cada muestra fueron
mezclados con cinco gramos de sulfato de sodio y diez mililitros de solución
extractora, el todo fue vigorosamente agitado durante un minuto. Después de la
decantación de la mezcla, un mililitro del sobrenadante fue recuperado en un
recipiente a filtración y movido a través de un filtro. El producto de la filtración fue
diluido y la solución resultante fue utilizado en el procedimiento de cuantificación del
kit enzimático TPH Immunoassay Method (HACH) para las muestras de suelo.
44

V. RESULTADOS
45

V.I. CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS SOBRE MEDIO
ENRIQUECIDO
La evaluación de los crecimientos sobre medio enriquecido permitió obtener
información sobre las poblaciones bacterianas que servirán ulteriormente de inóculo
en los medios que contienen los hidrocarburos. El objetivo fue conocer las
velocidades específicas de crecimiento con el fin de determinar el tiempo de
precultivo necesario para poder reducir toda posibilidad de latencia en el momento
de transferirlo a un medio fresco.
Los seguimientos del crecimiento dan una idea del tiempo que toma la población
en adaptarse a los compuestos del medio de cultivo (fase de latencia), del tiempo
que toma en dividirse (fase exponencial) y del tiempo durante el que se mantiene
antes de entrar en fase de mortalidad (fase estacionaria). Las curvas de
crecimiento de las cepas utilizadas se presentan en la figura 5.
Densidad Óptica Directa a 660 nm
(u. D.O.)
10.000
1.000
0.100
Acinetobacter sp. LMG 1056 P. putida LMG 2257
P. putida ATCC 39213 P. putida DSMZ 6414
P. putida DSMZ 6899
0.010
0 5 10 15
Tiempo (h)
20 25 30
Fig. 5 : Curvas de crecimiento de las cinco cepas bacterianas estudiadas (D.O.
directa a 660 nm en función del tiempo).
De acuerdo con la ley definida por Beer & Lambert, una relación lineal puede
establecerse entre la viabilidad de una población microbiana y la opacidad (de
0,200 a 0,600 u. D.O.) del medio de cultivo en el que se encuentra esta población
en crecimiento. Las curvas de la figura 5 se obtienen a partir de cultivos
46

inoculados con bacterias colectadas después de una noche de precultivo.
Después de este precultivo, las células se refrescan en un medio LB nuevo
(tiempo 0) y se encuentran rápidamente en fase exponencial de crecimiento.
Actuar de esta manera para preparar los inóculos permite asegurarse de que las
bacterias inoculadas presenten un estado fisiológico favorable para el
crecimiento inmediato.
Sin embargo, incluso si el medio LB contiene todos los compuestos de base
necesarios para permitir el aumento en biomasa, una vez en el medio MM2 que
servirá para el crecimiento en presencia de hidrocarburos, las bacterias deben
readaptarse a los compuestos minerales contenidos en este. Una población
inoculada en fase de latencia o estacionaria puede tomar más tiempo en
adaptarse al medio de cultivo y sobre todo a la presencia de un hidrocarburo,
que aquella población en fase exponencial. El cuadro 1 presenta las
características de crecimiento de las diferentes cepas utilizadas.
Cuadro 1 : Características de los crecimientos de las cepas bacterianas sobre
medio LB enriquecido (pH inicial = 7).
CEPA
D.O. inicial
(t = 0 h)
D.O. final
(t = 24 h)
pH final
(t = 24 h)
Acinetobacter sp. LMG 1056 0,073 6,315 8,77
P. putida LMG 2257 0,021 3,088 7,76
P. putida ATCC 39213 0,204 3,375 7,94
P. putida DSMZ 6414 0,091 2,895 7,95
P. putida DSMZ 6899 0,088 4,002 7,94
Una alcalinización del medio se observa en todos los casos. Este aumento de pH
se ve ligado a una desaminación oxidativa de los aminoácidos del medio en el
momento de su metabolización. El cuadro 1 permite observar una primera
diferencia entre el metabolismo de Acinetobacter sp. y los de Pseudomonas
putida : en 24 horas, el aumento de la densidad óptica y del pH del medio de
cultivo son más fuertes para Acinetobacter sp. LMG 1056.
La turbiedad del medio puede resultar de células vivas o muertas así como de
desechos celulares. La medida de la viabilidad es indispensable para evaluar la
toxicidad del medio o de los potenciales de crecimiento de una suspensión
celular, razón por la cual la medida de D.O. es complementada por
observaciones al microscopio y plaqueos. Estos últimos permiten verificar que
47

la D.O. de la muestra corresponde con la opacidad producida por la presencia
de células viables en el medio.
48

Cuadro 2 : Relación de viabilidad expresada en UFC/ml con respecto a una
densidad óptica unitaria para las cinco cepas cultivadas en medio rico.
CEPA
1 u. D.O. =
(UFC/ml)
Acinetobacter sp. LMG 1056 2,55 x 10 8
Pseudomonas putida LMG 2257 2,56 x 10 8
Pseudomonas putida ATCC 39213 1,22 x 10 8
Pseudomonas putida DSMZ 6414 3,51 x 10 7
Pseudomonas putida DSMZ 6899 6,52 x 10 8
* g = tiempo de generación o de duplicación de la población bacteriana.
** µ = velocidad específica de crecimiento de la población bacteriana.
g* (h) µ** (h -1 )
1,40 0,50
1,90 0,40
1,40 0,50
2,60 0,30
1,80 0,40
El tiempo de generación puede calcularse a partir de un gráfico semi-logarítmico
que represente la evolución de la densidad óptica del cultivo a lo largo del
tiempo. Los valores del cuadro 2 muestran que las cepas Acinetobacter sp. LMG
1056 y Pseudomonas putida ATCC 39213 presentan un crecimiento más rápido
que las demás cepas. Pseudomonas putida DSMZ 6414 presenta el crecimiento
más lento. Es probable que estos comportamientos se presenten de igual manera
en el medio MM2 en presencia de hidrocarburos.
En el medio MM2, la glucosa o los hidrocarburos constituyen una fuente de
energía carbonada. En este caso, otra maquinaria enzimática se utiliza y los
tiempos de generación pueden variar con respecto a los que se obtuvieron en el
medio LB. Considerando que las condiciones de crecimiento son probablemente
menos favorables en el medio MM2, es probable que las bacterias tomen más
tiempo para crecer en este.
V.II. DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS EN ERLENMEYERS
DE 250 ml
Con respecto a un estudio anterior (Ngabonziza, 2003), se probó un mayor panel de
hidrocarburos puros para estudiar sus biodegradabilidades respectivas por
Acinetobacter sp. LMG 1056 y las cuatro cepas de Pseudomonas putida. Todas las
cepas probadas fueron preseleccionadas a partir de listas provenientes de los bancos
de cepas como utilizadoras potenciales de hidrocarburos.
Las pruebas en erlenmeyers permiten obtener una idea preliminar, a pequeña escala,
de los potenciales de degradación de los hidrocarburos por las bacterias. Sólo la D.O.
49

y el pH han sido medidos en los cultivos en erlenmeyers. Una evolución de la D.O.
representa un cambio de la turbiedad del medio, muchas veces indicador de un
crecimiento bacteriano. En el caso del testigo positivo, el consumo de glucosa
implica la liberación de ácidos orgánicos en el medio, lo que provoca una
disminución del pH. Para las pruebas en presencia de hidrocarburos, la evolución de
la turbiedad así como la disminución del pH, atribuida a la liberación de ácidos grasos
en el medio, pueden confirmar la metabolización de los hidrocarburos debido a que
los microorganismos no disponen de otras fuentes de carbono o de energía en este
medio.
Con el fin de evitar toda interferencia en la medida de la densidad óptica por la
presencia de la emulsión que forman los hidrocarburos, un método indirecto fue
desarrollado y descrito en el capítulo Materiales y Métodos (IV.2.e.).
V.II.a. Degradación efectuada por Acinetobacter sp. LMG 1056
La evolución del cultivo de la cepa LMG 1056 en presencia de glucosa (testigo
positivo), de diferentes hidrocarburos puros así como en ausencia de fuente de
energía (testigo negativo) se presenta en la figura 6.
Densidad Óptica a 660 nm (u. D.O.)
Testigo Positivo (Glucosa) Testigo Negativo Benceno
Tolueno Xileno Ciclohexano
Hexano Octano Decano
Hexadecano
10.000
1.000
0.100
0.010
0 50 100
Tiempo (h)
150 200
Fig. 6 : Evolución de la densidad óptica de los cultivos en erlenmeyers de
Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre diversos hidrocarburos.
50

La D.O. evoluciona para los cultivos en presencia de glucosa y de hexadecano
debido a que las poblaciones utilizan estos compuestos carbonados como fuentes
de energía. Esta metabolización, contrariamente a lo que ocurre en los medios
del testigo negativo y en aquellos que contienen los hidrocarburos, implica
cambios de pH que se presentan en el cuadro 3.
Cuadro 3 : Evolución de los pH de los cultivos de Acinetobacter sp. LMG 1056
en medio MM2 que contiene glucosa o hidrocarburos puros (pH inicial = 7).
MEDIO pH inicial (t = 0 h) pH (t = 24 h) pH final (t = 168 h)
MM2 (testigo negativo) 6,81 6,79 6,72
MM2 + Glucosa (testigo positivo) 6,81 4,18 4,90
MM2 + Benceno 6,79 6,77 6,74
MM2 + Tolueno 6,81 6,77 6,74
MM2 + Xileno 6,81 6,75 6,72
MM2 + Ciclohexano 6,79 6,74 6,72
MM2 + Hexano 6,81 6,75 6,71
MM2 + Octano 6,79 6,75 6,72
MM2 + Decano 6,78 6,76 6,72
MM2 + Hexadecano 6,80 6,47 4,36
Contrariamente a lo que presentaba la figura 6, la digestión de la glucosa parece
empezar antes del de hexadecano debido a que la disminución de pH en el medio
que la contiene inicia antes que en el medio que contiene el hidrocarburo (pH a t
= 24 h), incluso si el cultivo en presencia de glucosa parece entrar inicialmente
en una fase de latencia.
Después de 48 horas, sólo la glucosa y el hexadecano han sido utilizados como
fuentes de carbono. El hecho de que no se haya observado variación
significativa alguna de la D.O. o del pH en los medios que contenían otros
hidrocarburos además del hexadecano, impide concebir una utilización de estos
hidrocarburos como únicas fuentes de carbono y de energía para el crecimiento.
Ha de precisarse que el carácter volátil de algunos hidrocarburos engendra una
eliminación gradual de los compuestos del medio. Esto limita en el transcurso
del tiempo, las posibilidades de crecimiento para los microorganismos.
51

V.II.b. Degradaciones efectuadas por Pseudomonas putida LMG 2257, P. putida
ATCC 39213, P. putida DSMZ 6414 y P. putida DSMZ 6899
Las diferentes cepas de Pseudomonas putida presentaron un comportamiento similar
sobre todos los hidrocarburos probados. Los resultados se presentan en las cuatro
figuras siguientes (figuras 7, 8, 9 y 10) :
Densidad Óptica (u. D.O.)
10.000
1.000
0.100
0.010
Testigo Positivo (Glucosa) Testigo Negativo
Benceno Tolueno
Xileno Ciclohexano
Hexadecano
0.001
0 25 50 75 100 125
Tiempo (h)
Fig. 7 : Evolución de la densidad óptica a 660 nm de los cultivos en erlenmeyers de
Pseudomonas putida LMG 2257 sobre diversos hidrocarburos.
La cepa LMG 2257 parece crecer únicamente sobre la glucosa y en 48 horas, ninguno
de los otros sustratos es metabolizado por la misma. El aumento de la D.O. debido al
consumo de la glucosa comienza inmediatamente después de la inoculación. Debido
a que la evolución de la densidad óptica de los cultivos sobre los hidrocarburos
presenta el comportamiento de la curva del testigo negativo (sin fuente carbonada)
parecería que Pseudomonas putida LMG 2257 no es capaz de utilizar los BTX o los
alcanos probados como únicas fuentes de energía y carbono o que estos sustratos
tienen un efecto tóxico sobre esta cepa.
52

Cuadro 4 : Evolución de los pH de los cultivos de Pseudomonas putida LMG 2257
en medio MM2 que contiene glucosa o hidrocarburos puros (pH inicial = 7).
MEDIO pH inicial (t = 0 h) pH (t = 24 h) pH final (t = 120 h)
MM2 (testigo negativo) 6,74 6,79 6,82
MM2 + Glucosa (testigo positivo) 6,73 5,42 4,41
MM2 + Benceno 6,74 6,79 6,83
MM2 + Tolueno 6,82 6,83 6,87
MM2 + Xileno 6,83 6,82 6,86
MM2 + Ciclohexano 6,82 6,83 6,84
MM2 + Hexadecano 6,82 6,82 6,82
Los valores del cuadro 4 confirman que la cepa LMG 2257 no reconoce ninguno de
los sustratos carbonados propuestos como fuentes de energía, fuera de la glucosa. La
cepa ATCC 39213 presenta, como lo indica la figura 8, un comportamiento muy
similar al de la primera Pseudomonas putida probada.
Densidad Óptica (u. D.O.)
10.000
1.000
0.100
0.010
Testigo Positivo (Glucosa) Testigo Negativo
Benceno Tolueno
Xileno Ciclohexano
Hexano Octano
Decano Hexadecano
Diesel
0.001
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
Fig. 8 : Evolución de la densidad óptica a 660 nm de los cultivos en erlenmeyers de
Pseudomonas putida ATCC 39213 sobre diversos hidrocarburos.
Para la cepa ATCC 39213, la variación de D.O. es importante únicamente en el caso
del testigo positivo que contiene la glucosa. Los cultivos en presencia de los
hidrocarburos exponen un comportamiento similar al del cultivo en ausencia de
53

fuente de energía. La evolución del pH (cuadro 5) confirma nuevamente que sólo la
glucosa es metabolizada por Pseudomonas putida ATCC 39213.
Cuadro 5 : Evolución de los pH de los cultivos Pseudomonas putida ATCC 39213 en
medio MM2 con glucosa o hidrocarburos (pH inicial = 7).
MEDIO pH inicial (t = 0 h) pH (t = 24 h) pH final (t = 48 h)
MM2 (testigo negativo) 6,80 6,77 6,77
MM2 + Glucosa (testigo positivo) 6,82 5,61 5,32
MM2 + Benceno 6,84 6,79 6,77
MM2 + Tolueno 6,82 6,77 6,75
MM2 + Xileno 6,83 6,78 6,76
MM2 + Ciclohexano 6,78 6,76 6,75
MM2 + Hexano 6,76 6,75 6,80
MM2 + Octano 6,83 6,80 6,75
MM2 + Decano 6,82 6,77 6,74
MM2 + Hexadecano 6,76 6,75 6,76
MM2 + Diesel 6,76 6,77 6,72
El crecimiento de una tercera cepa de Pseudomonas putida fue estudiado sobre los
mismos hidrocarburos puros pero la misma no parece metabolizar tampoco los
hidrocarburos presentes en el medio MM2 (figura 9).
54

Densidad Óptica (u. D.O.)
Testigo Positivo (Glucosa)
Benceno
Testigo Negativo
Tolueno
Xileno
Hexano
Ciclohexano
Octano
Decano
Diesel
10.000
Hexadecano
1.000
0.100
0.010
0.001
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
Fig. 9 : Evolución de la densidad óptica a 660 nm de los cultivos en erlenmeyers de
Pseudomonas putida DSMZ 6414 sobre diversos hidrocarburos.
Esta tercera cepa de Pseudomonas putida, usualmente destacada por su potencial de
degradación del tolueno, no logra degradar este último ni los demás hidrocarburos
propuestos. Sólo el testigo positivo presenta una evolución de D.O. inmediata. Los
pH presentados en el cuadro 6 confirman los valores presentados en la figura 9. En
esta, el benceno y el tolueno parecen tener un efecto de toxicidad sobre la poblaciones
de la cepa P. putida DSMZ 6414 que implica una disminución de la densidad óptica
en el tiempo, como resultados de una posible lisis celular. Esto debería confirmarse
con una disminución de la viabilidad expresada en UFC/ml.
55

Cuadro 6 : Evolución de los pH de los cultivos de Pseudomonas putida DSMZ 6414
en el medio MM2 con glucosa o hidrocarburos (pH inicial = 7).
MEDIO pH inicial (t = 0 h) pH (t = 24 h) pH final (t = 48 h)
MM2 (testigo negativo) 6,80 6,80 6,70
MM2 + Glucosa (testigo positivo) 6,83 6,27 6,47
MM2 + Benceno 6,79 6,78 6,70
MM2 + Tolueno 6,81 6,80 6,69
MM2 + Xileno 6,80 6,76 6,48
MM2 + Ciclohexano 6,77 6,77 6,66
MM2 + Hexano 6,75 6,75 6,67
MM2 + Octano 6,82 6,79 6,73
MM2 + Decano 6,80 6,77 6,73
MM2 + Hexadecano 6,75 6,76 6,70
MM2 + Diesel 6,75 6,76 6,70
La figura 10 presenta la evolución de la D.O. de los cultivos en erlenmeyers de P.
putida DSMZ 6899 sobre diversos hidrocarburos.
Densidad Óptica (u. D.O.)
10.000
1.000
0.100
Testigo Positivo (Glucosa) Testigo Negativo
Benceno Tolueno
Xileno Ciclohexano
Hexano Octano
Decano Hexadecano
Diesel
0.010
0 10 20 30 40 50
Tiempo (h)
Fig. 10 : Evolución de la densidad óptica a 600 nm de los cultivos en erlenmeyers de
Pseudomonas putida DSMZ 6899 sobre diversos hidrocarburos.
La última cepa de P. putida no parece metabolizar tampoco los hidrocarburos
agregados a los medios de cultivo. Sólo un crecimiento sobre la glucosa y un
56

mantenimiento de las D.O. sobre los hidrocarburos puros y el diesel se observan para
la cepa DSMZ 6899 (figura 10). El benceno, como para la cepa DSMZ 6414, parece
provocar una disminución de la D.O. que podría asociarse con una lisis celular a lo
largo del tiempo.
Cuadro 7 : Evolución de los pH de los cultivos de Pseudomonas putida DSMZ 6899
en el medio MM2 con glucosa o hidrocarburos (pH inicial = 7).
MEDIO pH inicial (t = 0 h) pH (t = 24 h) pH final (t = 48 h)
MM2 (testigo negativo) 6,83 6,74 6,63
MM2 + Glucosa (testigo positivo) 6,83 5,95 6,46
MM2 + Benceno 6,84 6,82 6,71
MM2 + Tolueno 6,83 6,78 6,70
MM2 + Xileno 6,82 6,74 6,79
MM2 + Ciclohexano 6,78 6,77 6,68
MM2 + Hexano 6,77 6,77 6,77
MM2 + Octano 6,82 6,77 6,71
MM2 + Decano 6,80 6,77 6,71
MM2 + Hexadecano 6,77 6,76 6,71
MM2 + Diesel 6,76 6,76 6,74
Además de la glucosa, ninguna variación importante se observa tanto en el caso de
los seguimientos de la D.O. como para los del pH. La evaporación de los
hidrocarburos es limitada por la presencia de tapones herméticos sobre los
erlenmeyers. Es probable que sean tolerantes a la presencia de los hidrocarburos pero
que no posean la maquinaria enzimática para degradarlos. La ausencia de
metabolización indica por entonces una incapacidad de las cepas de Pseudomonas
putida para utilizar estos hidrocarburos puros como única fuente de carbono y de
energía. Esta incapacidad puede explicarse por :
• Una toxicidad que se traduce por una disminución de la viabilidad con
respecto al testigo negativo.
• La necesidad de disponer de otro sustrato como fuente de carbono y de
energía para metabolizar los hidrocarburos.
• La demanda de una cantidad importante de oxígeno para la metabolización de
los hidrocarburos, que no puede satisfacerse con la realización del cultivo en
erlenmeyers cerrados agitados.
Estas diferentes cepas de Pseudomonas putida no serán consideradas en un futuro
para la formulación de un consorcio degradador de hidrocarburos.
57

V.III. DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS EN REACTORES DE
DOS LITROS
V.III.a. Degradaciones efectuadas por Acinetobacter sp. LMG 1056
Los cultivos en reactor permiten controlar las condiciones de agitación, aireación,
temperatura y pH del medio con el fin de optimizar el metabolismo de la cepa. La
pO2 (presión parcial en oxígeno) así como el consumo de ácido y de base se siguen
continuamente.
La realización de cultivos en reactor con inyección continua de aire permite una
mejor transferencia de oxígeno de la fase gaseosa hacia la fase líquida para los
cultivos en erlenmeyers.
En vez de mantener un seguimiento del crecimiento a partir de la evolución de la
D.O. indirecta solamente, es posible obtener muestras con el fin de seguir también la
viabilidad y la concentración de biomasa expresada en cantidad de materia seca por
unidad de volumen. El volumen superior de cultivo (dos litros en lugar de 100 ml en
erlenmeyers) permite tomar muestras para cuantificar la concentración del
hidrocarburo en el medio con el fin de verificar su consumo.
58

V.III.a.i. Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre hexadecano (C16H34)
Las medidas de D.O., los plaqueos y las determinaciones de materia seca para el
cultivo de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre hexadecano se representan en la
figura 11.
Viabilidad de la
población
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecte à 660 nm
Peso Seco (g/l) Concentración del hexadecano (g/l)
1.00E+10
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
0.0
0 50 100 150
Tiempo (h)
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
Densidad Óptica,
Concentración de
biomasa y de
hexadecano
Fig. 11 : Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio
que contiene HEXADECANO como única fuente de carbono y de energía
(concentración inicial = 3,89 g/l).
La figura 11 permite observar el aumento de la densidad óptica que se traduce por un
aumento del número de células viables (dos log) y de la concentración en materia
seca.
Fig. 12 : Crecimiento de las células bacteriana de la cepa Acinetobacter sp. LMG
1056 sobre las emulsiones de hexadecano (1000X).
Las fotografías permiten visualizar las bacterias en la interfase hexadecano/agua que
favorece la accesibilidad con respecto al sustrato carbonado para su metabolización.
59

El crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 en el medio depende de un consumo
del hidrocarburo presente en este debido a que la concentración del hexadecano
disminuye de manera proporcional al aumento de los parámetros indicadores de
crecimiento. Aún cuando el hexadecano no presenta un carácter volátil, la
concentración agregada no logra cuantificarse enteramente con la técnica
gravimétrica probablemente debido a una pérdida durante la extracción con el
hexano.
La figura 13 presenta los consumos de base y la evolución de la pO2 del cultivo de
Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre el hexadecano.
Consumo de Base (ml)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0 50 100 150
Tiempo (h)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Presión parcial de oxígeno (%)
NaOH 2 M
Fig. 13 : Evolución de los parámetros indicadores de la metabolización del
HEXADECANO por Acinetobacter sp. LMG 1056.
El metabolismo del hexadecano por Acinetobacter sp. LMG 1056 implica la
liberación de ácidos orgánicos en el medio, que es compensado por un consumo de
base con el fin de mantener el pH en 7. Este consumo es claramente visible en la
figura 13 y puede correlacionarse con la evolución de los parámetros indicadores de
viabilidad y la disminución de la concentración en hexadecano presentados en la
figura 12.
El metabolismo aeróbico de Acinetobacter sp. LMG 1056 implica una disminución
de la saturación de oxígeno en el medio, lo cual es visible sobre la curva roja de la
figura 13.
De acuerdo con el comportamiento de los parámetros indicadores, es posible
confirmar que Acinetobacter sp. LMG 1056 degrada rápidamente el hexadecano bajo
condiciones controladas de reactor.
pO2
60

V.III.a.ii. Degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG 1056
El diesel constituye una mezcla de hidrocarburos alifáticos y aromáticos. Como
lo indican los parámetros de cultivo presentados en la figura 14, Acinetobacter
sp. LMG 1056 logra utilizar algunos compuestos de la mezcla como fuentes de
carbono y de energía.
Crecimiento bacteriano
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecta a 660 nm
Pesos Secos (g/l) Concentración de diesel (g/l)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 50 100
Tiempo (h)
0.0
150
Fig. 14 : Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio
que contiene DIESEL como única fuente de carbono y de energía (concentración
inicial = 4,13 g/l).
Las evoluciones crecientes de las curvas de densidad óptica, de viabilidad expresada
en UFC/ml (1 Log) y de peso secos indican que ocurre un ligero crecimiento.
Efectivamente, durante las primeras horas de cultivo aparece un aumento de la D.O. y
de las UFC/ml correspondientes a una disminución de la concentración de diesel en el
medio. Puede considerarse que el crecimiento se asocia con este consumo de diesel
(figura 16).
Densidad Óptica, Concentración
de biomasa y del diesel
61

Fig. 15 : Crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre las emulsiones de diesel
(1000X).
La figura 15 presenta las emulsiones de diesel en el medio. Las bacterias se
encuentran próximas de las emulsiones o en su superficie para degradar el diesel.
La disminución de la concentración de diesel en el transcurso de las primeras horas
de cultivo puede explicarse con una eliminación parcial de las fracciones volátiles del
diesel por el aire inyectado continuamente al reactor. El consumo de base como
parámetro indicador de la actividad metabólica sobre el diesel se presenta en la figura
16.
Consumo de base (ml)
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
100 120 140 160
Fig. 16 : Consumo de base (NaOH 2 M) como indicador del metabolismo del
DIESEL por Acinetobacter sp. LMG 1056.
Debido a que la sonda de pO2 presentó problemas de detección durante el cultivo de
Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre el diesel, sólo el consumo de base pudo tomarse
62

en consideración como indicador del metabolismo de esta mezcla de hidrocarburos.
El consumo creciente de base para neutralizar los ácidos orgánicos liberados en el
medio confirma que la cepa Acinetobacter sp. LMG 1056 metaboliza una fracción de
los hidrocarburos presentes en el diesel.
V.III.a.iii. Degradación del decano (C10H22) por Acinetobacter sp. LMG 1056
La figura 18 presenta el crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre el
decano. Decenas de células aparecen sobre la emulsión de decano hasta que esta
desaparece del medio.
Fig. 17 : Crecimiento de las células bacterianas de la cepa Acinetobacter sp. LMG
1056 sobre emulsiones de decano (1000X).
Los cocobacilos que aparecen sobre el decano parecen reconocer este hidrocarburo
como sustrato de crecimiento. Sin embargo, los parámetros que deberían indicar este
crecimiento, como la evolución de la densidad óptica y de la concentración de
biomasa (UFC/ml o gramos de materia seca/l), muestran que no hay ninguna
variación significativa (figura 18).
63

Crecimiento de la población
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecta a 660 nm
Pesos Secos (g/l) Concentración de Decano (g/l)
0 10 20 30
Tiempo (h)
40 50 60
Fig. 18 : Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un
medio que contiene DECANO como única fuente de carbono y de energía
(concentración inicial = 3,65 g/l).
Puede apreciarse una débil disminución de la concentración del decano (medido
por el método gravimétrico) en el medio a lo largo del tiempo. Es probable que
esta disminución no se encuentre ligado con una degradación debido a que
ningún consumo de base fue medido en este cultivo en reactor. Además, el
método cualitativo (TPH Immunoassay method 10050 de HACH) confirma que
la presencia del decano se mantiene constante a lo largo de todo el seguimiento.
La baja disminución de decano determinada por gravimetría podría deberse a la
imprecisión del método. La pO2 no pudo medirse.
Incluso si la degradación no pudo ser probada, Acinetobacter sp. LMG 1056
puede considerarse como una cepa tolerante a la presencia del decano ya que la
viabilidad se mantuvo a lo largo del tiempo.
V.III.a.iv. Degradación del tolueno (C7H8) por Acinetobacter sp. LMG 1056
La figura 19 presenta el crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre el tolueno
así como la concentración de este en el medio MM2 a lo largo del tiempo.
3.500
3.000
2.500
2.000
1.500
1.000
0.500
0.000
Densidad Óptica, Concentración
de la biomasa y del decano
64

Crecimiento de la población
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecta a 660 nm Concentración de Tolueno (g/l)
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
0 50 100
Tiempo (h)
150
Fig. 19 : Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio
que contiene TOLUENO como única fuente de carbono y de energía (concentración
inicial = 4,33 g/l).
Con respecto a la biomasa inicial (10 5 a 10 6 UFC/ml) en el momento de la
inoculación, una baja concentración en células viables se obtiene durante las
primeras horas de fermentación (3 x 10 4 UFC/ml), lo cual indicaría una
mortalidad. Las células sobrevivientes parecen haberse adaptado al tolueno y lo
habrían parcialmente utilizado como fuente de energía y de carbono, como lo
muestra el aumento de la concentración en células viables durantes las primeras
24 horas (de 10 4 a 10 7 UFC/ml). Esta concentración celular es demasiado débil
como para tener una incidencia sobre la densidad óptica y la concentración en
materia seca.
La concentración en tolueno a lo largo del tiempo no pudo determinarse por el
método de extracción con hexano seguido por una evaporación al vacío hasta
sequedad. El tolueno presenta una volatilidad demasiado importante y se evaporó
con el hexano. Pareciera aún así que menos de 1500 ppm de tolueno siempre se
encuentran en el medio después de cinco días de incubación de acuerdo con los
resultados del análisis cualitativo (TPH Immunoassay method 10050 de HACH). La
volatilización del tolueno en el reactor se ve limitada por la presencia de la columna
refrigerante en el circuito de salida de aire sobre la cual el tolueno evaporado puede
condensarse y reintegrarse al medio.
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Densidad Óptica y Concentración del
Tolueno
65

La figura 20 presenta el consumo de base y la evolución de la pO2 del medio de
cultivo que contiene a la cepa LMG 1056 en presencia de tolueno.
Consumo de Base (ml)
35
30
25
20
15
10
5
0
0 50 100
Tiempo (h)
150
120
100
80
60
40
20
0
Presión Parcial de Oxígeno (%)
NaOH 2 M
Fig. 20 : Evolución de los parámetros indicadores de la metabolización del
TOLUENO por Acinetobacter sp. LMG 1056.
Un importante consumo de base así como de demanda en oxígeno indican una
actividad metabólica de la cepa Acinetobacter sp. LMG 1056 en presencia de tolueno.
V.III.a.v. Degradación del tolueno (C7H8) por Acinetobacter sp. LMG 1056 en
presencia de glucosa
La degradación del tolueno fue probada en presencia de glucosa, con la esperanza de
que Acinetobacter sp. LMG 1056 podría degradar este hidrocarburo en presencia de
una fuente de carbono más asimilable. Los resultados D.O., viabilidad expresada en
UFC/ml, pesos secos, consumo del tolueno y de la glucosa se presentan en la figura
21.
pO2
66

Crecimiento de la población
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecta a 660 nm
Pesos Secos (g/l)
Concentración de la glucosa (g/l)
Concentración del Tolueno (g/l)
0 20 40 60
Tiempo (h)
80 100 120
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Densidad Óptica, Concentración de
la biomasa, del tolueno y de la
glucosa
Fig. 21 : Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio
que contiene TOLUENO (concentración inicial = 4,33 g/l) y 2 g/l de GLUCOSA.
Los resultados presentados en la figura 21 son muy diferentes de los de la figura 19
cuando se trata de la misma cepa en presencia del mismo hidrocarburo. En presencia
de glucosa, la población bacteriana aumenta directamente de 10 5 a 10 7 UFC/ml. La
densidad óptica inicialmente elevada no permite observar una variación muy
significativa. Este crecimiento persiste más allá de la desaparición de la glucosa y
aumenta de un factor logarítmico (10 7 a 10 8 ) cuando sólo el tolueno queda disponible
como fuente de carbono.
De acuerdo con los resultados presentados en la figura 22, puede confirmarse la
presencia de una actividad metabólica sobre la glucosa, el tolueno o ambos.
67

Consumo de base (ml)
60
50
40
30
20
10
0
0 50 100
Tiempo (h)
150
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Presión Parcial de Oxígeno
(%)
NaOH 2 M
pO2
Fig. 22 : Evolución de los parámetros indicadores de la actividad metabólica de
Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio que contiene TOLUENO en presencia de
GLUCOSA.
La acidificación del medio durantes las seis primeras horas de cultivo se asocia con el
consumo de la glucosa presenta en el medio. A partir del momento en el que sólo
queda tolueno, el consumo de base surge como necesidad de neutralizar los ácidos
orgánicos producidos durante la metabolización de este último con el fin de mantener
el pH neutro en el medio. Como este consumo persiste a lo largo del tiempo y que el
tolueno constituye la única fuente de energía y carbono restante en el medio, es
probable que el tolueno del medio sea degradado por Acinetobacter sp. LMG 1056.
Comparativamente con los resultados obtenidos del cultivo de Acinetobacter sp.
sobre el tolueno como única fuente de carbono y de energía, la presencia de glucosa
permite obtener una mayor concentración bacteriana pero la dificultad para
cuantificar el tolueno con precisión, incita prudencia en cuanto a su utilización
simultánea como fuente de carbono y de energía.
V.III.a.vi. Degradación del octano (C8H18) por Acinetobacter sp. LMG 1056
Mientras que las observaciones al microscopio muestran que las bacterias se
encuentran en la interfase octano/fase acuosa, de acuerdo con los resultados
presentados en la figura 23, ninguna evolución significativa de los parámetros de
estimación de la biomasa permite considerar cualquier crecimiento.
68

Crecimiento de la población
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecta a 660 nm
Pesos Secos (g/l) Concentración del Octano (g/l)
1.00E+05
0 20 40 60
Tiempo (h)
80 100 120
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
Densidad Óptica,
Concentración de la biomasa y
del octano
Fig. 23 : Viabilidad de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio que contiene
OCTANO como única fuente de carbono y de energía (concentración inicial = 3,51
g/l).
La viabilidad de la cepa en presencia de octano parece disminuir a lo largo del
tiempo. Mientras que los valores de D.O. y de materia seca se mantienen, el
número de células vivas que pueden formar colonias disminuye de manera
importante durante las primeras horas y se mantiene constante a lo largo del
resto del estudio. Esto puede indicar que el octano presenta un efecto tóxico
sobre la población bacteriana.
El octano no pudo cuantificarse con precisión debido a su volatilidad. Únicamente un
dosaje cualitativo (TPH Immunoassay method 10050 de HACH) ha permitido
evidenciar que la concentración de octano se mantuvo en menos de 500 ppm durante
todo el cultivo en reactor.
De acuerdo con los resultados de la figura 23, el octano parece tener un efecto tóxico
sobre Acinetobacter sp. LMG 1056.
V.III.a.vii. Degradación del octano (C8H18) por Acinetobacter sp. LMG 1056 en
presencia de glucosa
De igual manera que para el tolueno, la degradación simultánea del octano y de la
glucosa fue evaluada (figura 24).
69

Viabilidad
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecta a 660 nm
Pesos Secos (g/l)
Concentración de Glucosa (g/l)
Concentración de Octano (g/l)
1.00E+03
0.0
0 10 20 30 40
Tiempo (h)
50 60 70 80
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Densidad Óptica,
Concentración de la
biomasa, del octano y de la
glucosa
Fig. 24 : Evaluación del crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio
que contiene OCTANO (concentración inicial = 3,51 g/l) y 2 g/l de GLUCOSA.
El método de dosaje cualitativo (TPH Immunoassay method 10050 de HACH)
confirma la presencia de octano tras el consumo completo de glucosa. Ninguna
variación de la concentración celular, después del agotamiento de la glucosa, fue
observada. La desaparición del octano a lo largo del tiempo se explica por su
volatilidad y no por su metabolización.
La figura 25 presenta el consumo de base así como la evolución de la pO2 del medio.
Consumo de base (ml)
25
20
15
10
5
0
0
0 20 40
Tiempo (h)
60 80
100
80
60
40
20
Presión Parcial de Oxígeno
(%)
NaOH 2 M
pO2
Fig. 25 : Evolución de los parámetros indicadores de la actividad metabólica de
Acinetobacter sp. LMG 1056 en un medio que contiene OCTANO en presencia de
GLUCOSA.
70

Un consumo de base es necesario para neutralizar los ácidos orgánicos producidos
por el metabolismo de la glucosa pero no continúa una vez que esta se ha agotado.
Ningún cambio significativo no aparece para la pO2. Al parecer, la degradación del
octano no es funcional.
V.III.b. Degradaciones realizadas por Pseudomonas putida LMG 2257
V.III.b.i. Degradación del tolueno por Pseudomonas putida LMG 2257
Una mortalidad de la población se observa desde el primer contacto entre la cepa
Pseudomonas putida LMG 2257 y el tolueno y se acompaña de una lisis celular.
V.III.b.ii. Degradación del diesel por Pseudomonas putida LMG 2257
La figura 26 presenta los diferentes parámetros que indican el crecimiento de
Pseudomonas putida LMG 2257 en presencia de diesel como única fuente de carbono
y de energía.
Viabilidad
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
Viabilidad (UFC/ml) u. D.O. indirecta a 660 nm
Pesos Secos Concentración de Diesel
1.00E+00
0
0 10 20 30
Tiempo (h)
40 50 60
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
Densidad óptica,
concentración de l biomasa y
del diesel (g/l)
Fig. 26 : Evaluación del crecimiento de Pseudomonas putida LMG 2257 en un
medio que contiene DIESEL como única fuente de carbono y de energía
(concentración inicial = 4,13 g/l).
Inicialmente la población bacteriana viable es menor que la población normalmente
inoculada (10 6 a 10 7 UFC/ml), lo cual indica una mortalidad parcial de la biomasa
71

seguida por una adaptación de esta al diesel. Incluso si la densidad óptica parece
permanecer constante a lo largo del seguimiento, la curva de viabilidad (expresada en
UFC/ml) presenta una evolución positiva. Este crecimiento de la viabilidad (aumento
de 2 Log) no permite indicar un aumento significativo de a concentración en biomasa
en el medio y está probablemente ligado con el consumo de una fracción de diesel.
Después de 24 horas, la concentración de UFC/ml así como de diesel en el medio se
mantiene. Puede ser que en este momento, la fracción metabolizable por
Pseudomonas putida LMG 2257 se haya agotado y que la parte restante no sea
susceptible de metabolizarse. La figura 27 presenta las indicaciones del metabolismo
de la cepa LMG 2257 sobre el diesel.
Consumo de base (ml)
20
18
16
100
14
12
80
10
60
8
6
40
4
2
20
0
0
0 10 20 30
Tiempo (h)
40 50 60
Presión Parcial de Oxígeno (%)
NaOH 2 M
Fig. 27 : Evolución de los parámetros indicadores de la metabolización del DIESEL
por Pseudomonas putida LMG 2257.
Mientras que un aumento de las UFC/ml y una ligera disminución de la concentración
de diesel tienen lugar en el medio, la pO2 no varía significativamente. El consumo de
base aparece hasta al final del seguimiento lo cual sugiere una secreción tardía de
ácidos orgánicos por la cepa. La velocidad de metabolización del diesel por
Pseudomonas putida LMG 2257 es demasiado lenta como para provocar cambios de
pO2 considerando que un aporte continuo de oxígeno se realiza por inyección de aire.
Sin embargo, es posible decir que la cepa LMG 2257 crece sobre una fracción del
diesel.
pO2
72

V.III. DEGRADACIÓN DEL DIESEL SOBRE UN SUELO CONTAMINADO
ARTIFICIALMENTE
V.III.a. Características del suelo
El cuadro 8 presenta las características del suelo utilizado para los ensayos de
degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG 1056.
Cuadro 8 : Propiedades físicas del suelo utilizada para los ensayos de biodegradación
en medio sólido, después del tamizado.
Color y textura
Café claro, suelo
limosa/arenosa
Materia seca
(%)
Humedad
(%)
Densidad
(g/ml)
Volumen de
100 g de suelo
(± 2,0 ml)
pH
(u. pH)
Conductivitdad
eléctrica
(µS/cm)
78 22 0,82 122,0 6,80 145
El suelo presenta una tasa de humedad y un pH compatibles con una actividad
microbiológica ; casi un cuarto del peso del suelo constituye agua y el pH es próximo
a la neutralidad con el fin de evitar todo estrés sobre las poblaciones presentes.
Este suelo fue artificialmente contaminada como se describió en el capítulo VI.3.b. de
la parte Materiales y Métodos. No sufrió tratamiento térmico alguno de modo que se
mantuvo la población microbiana original.
V.III.b. Evaluación de la actividad de degradación de Acinetobacter sp. LMG
1056 en una suelo artificialmente contaminada con diesel
La actividad de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre el diesel en reactor se ve
favorecida por el control de varios parámetros necesarios para su crecimiento. Sin
embargo, en el caso de una verdadera contaminación en el suelo, donde las
condiciones son mucho más variables, es fundamental poder prever la actividad de
degradación in situ de la cepa LMG 1056 sobre el diesel. Los ensayos sobre el suelo
fueron realizados con el fin de conocer la actividad potencial de Acinetobacter sp. en
un sitio contaminado con diesel.
V.III.b.i. Evolución de la Demanda Bioquímica de Oxígeno medida en los ensayos
en suelo
Los recipientes VELP Scientifica et OxiTop® OC110 representan un sistema aislado
que contiene suelo, agua, aire y diesel como fuente de carbono y de energía. En este
sistema el consumo de oxígeno puede utilizarse como testigo de la actividad de
73

degradación de la cepa LMG 1056 al seguir la evolución de la presión a lo largo del
tiempo, automáticamente convertida a demanda bioquímica de oxígeno.
Diez gramos de suelo contaminado fueron inoculados con una suspensión que
contenía 10 7 UFC/ml de Acinetobacter sp. LMG 1056. La DBO de este suelo fue
medida a lo largo del tiempo y fue comparada con la DBO del suelo contaminada sin
inocular (testigo positivo suelo) con el fin de determinar la contribución de la cepa a
las fluctuaciones de DBO. Un testigo negativo, constituido por diez gramos de suelo
sin contaminar y sin inocular, permitió conocer la contribución de la flora microbiana
y la carga orgánica naturales del suelo a la evolución de la DBO.
DBO (mg O 2/l)
1400
1200
1000
800
600
400
200
Testigo Positivo Tierra Testigo Negativo Tierra
Tierra 10E+06 UFC/g (A) Tierra 10E+06 UFC/g (B)
0
0 5 10 15
Tiempo (d)
20 25
Fig. 28 : Evolución de la Demanda Bioquímica de Oxígeno de los sistemas de
degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre un suelo
artificialmente contaminado.
La baja evolución de la DBO de los cultivos testigos muestra que existe
originalmente una población activa en el suelo. Esta población no parece verse
significativamente alterada por la presencia de la contaminación debido a que las
curvas de los cultivos del testigo positivo y negativo siguen un comportamiento
similar. Debido a que el cultivo testigo negativo no contiene diesel pero que una
oxidación de materia orgánica tiene lugar, es probable que otras fuentes de carbono y
de energía estén disponibles en el suelo.
Para los cultivos que contienen la cepa LMG 1056, la figura 28 muestra que un
consumo creciente de oxígeno tiene lugar durante los primeros cinco días. Parecería
que la actividad metabólica se ha detenido después de estos primeros días debido a :
• El agotamiento de la fuente biodegradable.
• La inhibición progresiva de la cepa por los productos de la degradación.
• El consumo completo del oxígeno disponible en los sistemas herméticos.
74

El consumo de oxígeno de los dos testigos permanece inferior al que registran los
suelos inoculados e indica que Acinetobacter sp. es aparentemente responsable por
una gran parte del consumo del oxígeno del sistema debido a la degradación del
diesel, previamente confirmado durante los ensayos en reactor.
V.III.b.ii. Evolución de la viabilidad de las poblaciones presentes en los suelos
La figura 29 presenta la viabilidad de Acinetobacter sp. LMG 1056 y de las
poblaciones inicialmente presentes en el suelo durante los 28 días del seguimiento.
La concentración inicial de microorganismos totales en los suelos (10 8 a 10 9 UFC/g)
es considerablemente superior a la cantidad aportada por la inoculación con
Acinetobacter (10 6 UFC/g). Desde un punto de vista cuantitativo, el agregar el
inóculo no tendría tener una incidencia significativa sobre las poblaciones totales.
Además, estas varían de aproximadamente un factor logarítmico a lo largo de los 28
días de seguimiento, lo cual no permite observar una diferencia significativa entre las
tres muestras.
Viabilidad (UFC/g)
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
Testigo Positivo Tierra Testigo Negativo Tierra
Tierra 10e6 UFC/g
1.00E+04
0 5 10 15
Tiempo (d)
20 25 30
Fig. 29 : Evolución de la población microbiana total en las muestras de suelo a lo
largo de los 28 días de seguimiento.
La contaminación del suelo utilizado para preparar el testigo positivo y la muestra
inoculada con la cepa LMG 1056 se realizó al homogeneizar tres mililitros de diesel
en 500 g de suelo durante tres días a 30 °C. Durante este tiempo, contrariamente a las
poblaciones presentes en la suelo sin contaminar, el crecimiento de las poblaciones
del suelo contaminado fue favorecido por la temperatura y la disponibilidad de una
fuente potencial de carbono y de energía. Esto podría explicar la diferencia de un
75

factor logarítmico que existe entre la población inicial del testigo negativo y la de las
otras dos muestras.
Sin embargo, en el tiempo inicial y con base en la observación de las colonias
cultivadas cada semana, una población de naturaleza más variada fue observada en el
suelo sin contaminar con respecto a la población encontrada en el suelo contaminada
(nueve contra cinco morfologías diferentes, respectivamente). Es posible que la
toxicidad del diesel haya eliminado algunos tipos de microorganismos sin por ello
haber tenido efectos significativos sobre la concentración total de la microflora.
En el caso de la muestra de suelo que contenía la cepa LMG 1056, la proporción de
las colonias características de esta población bacteriana parece aumentar a lo largo
del tiempo, indicando que los hidrocarburos contenidos en el diesel están siendo
consumidos. El aumento de Acinetobacter sp. parece verse acompañado por una
disminución de otros microorganismos, probablemente ligado a la toxicidad del
contaminante o de los derivados de su metabolismo. El mantenimiento de los
microorganismos inicialmente presentes en el suelo que contiene diesel no significa
necesariamente que este último es metabolizado por los microorganismos pero que
algunos de estos toleran su presencia en su ambiente.
V.III.b.iii. Cuantificación de la concentración de diesel presente en los suelos por el
método 10050 TPH Immunoassay method de HACH
La cuantificación del diesel en el suelo contaminada en el momento de la inoculación
y 28 días después de esta fue realizada con el método enzimático 10050 para
detección de los TPH, precedida por una separación física y química de los
hidrocarburos de la matriz del suelo. La figura 30 presenta la concentración de diesel
presente en las muestras en el momento de la inoculación y después de cuatro
semanas de seguimiento.
76

Concentración de diesel (ppm)
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
3.5 3.5
Testigo Negativo
Tierra
5000 5000
3500
Testigo Positivo
Tierra
Muestras
2000
Tierra 10e6 UFC/g
0 día
28 días
Fig. 30 : Concentración de diesel en el momento inicial y después de 28 días de
seguimiento de la actividad de Acinetobacter sp. LMG 1056 en suelo.
La especificidad del dosaje por el kit enzimático TPH Immunoassay method (HACH)
fue demostrada por la ausencia de detección de diesel en el testigo negativo. Las
muestras que contienen el suelo contaminado presentaron ambas una disminución de
la concentración del diesel. Esto sugiere que la población natural presenta una
capacidad para degradar el diesel inferior a la capacidad desarrollada por
Acinetobacter sp., con cuya presencia aparece una desaparición más importante del
diesel inicialmente mezclado con el suelo.
Debido a que la DBO no presentaba más variaciones importantes después de los
cinco primeros días del seguimiento, es probable que la concentración de diesel
restante esté constituida por hidrocarburos recalcitrantes ante una metabolización por
Acinetobacter sp. o que una carencia en nitrógeno o en fósforo impiden el desarrollo
de la actividad metabólica.
V.III.c. Evaluación de la actividad de degradación de Acinetobacter sp. LMG
1056 en un lodo que contiene suelo artificialmente contaminado con diesel
Puesto que el suelo es un medio poco homogéneo y que posee una importante
capacidad de adsorción de los hidrocarburos, constituye un ambiente en el los
microorganismos no logran necesariamente llevar a cabo su tarea de degradación.
Tratamientos ex situ en lodo son entonces propuestos con el fin de aumentar la
disponibilidad de los sustratos con la desventaja de aumentar también el volumen a
tratar, en el que el agente contaminante se encuentra diluido.
77

V.III.c.i. Evolución de la Demanda Bioquímica de Oxígeno medida en los ensayos
en lodo
Dos tasas de inoculación del lodo por Acinetobacter sp. LMG 1056 fueron aplicados
(10 4 y 10 5 UFC/ml). El lodo fue preparado con diez gramos de suelo suspendidos en
90 ml de agua estéril. De la misma manera que para el suelo, la actividad de
degradación fue evaluada por el seguimiento de la DBO con el fin de comparar la
evolución de esta en los ensayos que contienen la cepa LMG 1056 con los testigos
positivo (que contiene suelo contaminado sin inocular) y negativo (que contiene suelo
sin contaminar y sin inocular) (figura 31).
DBO (mg O 2/l)
2500
2000
1500
1000
500
0
Testigo Positivo Lodo Testigo Negativo Lodo Lodo 10E+04 UFC/ml (A)
Lodo 10E+04 UFC/ml (B) Lodo 10E+05 UFC/ml (A) Lodo 10E+05 UFC/ml (B)
0 5 10 15
Tiempo (d)
20 25 30
Fig. 31 : Demanda Bioquímica de Oxígeno de los sistemas de degradación del diesel
por Acinetobacter sp. LMG 1056 en lodo.
Como en el caso de los ensayos en suelo, los cultivos testigos presentan una
evolución de DBO inferior a aquellos cultivos que contienen Acinetobacter sp. LMG
1056. Sin embargo, la actividad respiratoria de la población natural presente en el
suelo sin contaminar parece ser similar a la de la población en presencia del diesel.
Es probable que en lodo, la toxicidad del diesel sea superior que en el suelo seco
debido a una mayor biodisponibilidad. Los microorganismos son probablemente más
sensibles a su presencia en medio acuoso. Al no poder utilizar el diesel, la población
se comporta como una población presente en el testigo negativo.
Una demanda en oxígeno para los dos lodos inoculados es detectada durante diez
días. Seguidamente parece detenerse la actividad metabólica. No existe diferencia
significativa entre la evolución de la DBO para los lodos inoculados con 10 4 y 10 5
UFC/ml. Debido a que los lodos pueden considerarse como sistemas mucho más
78

homogéneos que el suelo, las variaciones de las curvas de DBO de los cultivos en
lodo pueden atribuirse a la precisión de la medida.
V.III.c.ii. Evolución de la viabilidad de las poblaciones presentes en los lodos
La figura 32 presenta la evolución de la viabilidad de las poblaciones naturales y
Acinetobacter sp. LMG 1056 en los lodos.
Viabilidad (UFC/ml)
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
Testigo Positivo Slurry Testigo Negativo Slurry
Slurry 10e4 UFC/ml Slurry 10e5 UFC/ml
1.00E+03
0 5 10 15
Tiempo (d)
20 25 30
Fig. 32 : Evolución de la población microbiana total de las muestras de lodo a lo
largo de los 28 días del seguimiento.
Igual que para los suelos, las poblaciones iniciales medidas para los diferentes lodos
(10 7 y 10 8 UFC/ml) son superiores a las cantidades aportadas por la inoculación con
Acinetobacter sp. LMG 1056 (10 4 y 10 5 UFC/ml). El comportamiento general
después de 28 días indica una disminución de dos Log de la población total para todas
las muestras de lodos. La evolución de las viabilidades entre las preparaciones no
permite observar una diferencia significativa entre estas.
V.III.c.iii. Cuantificación de la concentración de diesel presente en los lodos por el
método 10050 TPH Immunoassay method de HACH
La figura 33 presenta la concentración de diesel presente en las muestras de lodo en el
momento de la inoculación y después de cuatro semanas de seguimiento.
79

Concentración del diesel (ppm)
600
500
400
300
200
100
0
0.35 0.35
Testigo Negativo
Lodo
500 500 500
350
< 200
< 200
Testigo Positivo Lodo Lodo 10e4 UFC/ml Lodo 10e5 UFC/ml
Muestras
0 día
28 días
Fig. 33 : Concentración del diesel en el tiempo inicial y después de 28 días del
seguimiento de la actividad de Acinetobacter sp. LMG 1056 en lodo.
Como para el caso de las muestras de suelo, el inóculo de Acinetobacter sp. LMG
1056 realiza la mayor parte de la actividad de degradación del diesel.
Comparativamente a la degradación obtenida en suelo, la concentración del diesel en
los lodos disminuyó de manera más importante (hasta poco más de 300 ppm).
Mientras que su biodisponibilidad puede constituir una causa de toxicidad, esta
última puede verse atenuada por la tasa de dilución del diesel en el lodo y las
poblaciones tolerarían más fácilmente la presencia del sustrato, accediendo al mismo
tiempo al mismo para degradarlo de una manera más eficaz.
80

VI. DISCUSIÓN
81

VI.1. CONDICIONES DE CRECIMIENTO Y PARÁMETROS
CONTROLADOS
El crecimiento de las poblaciones bacterianas depende en gran medida de los
parámetros físico-químicos. Por esta razón, fueron controlados diferentes parámetros
durante los ensayos en medio acuoso o semisólido. Dan una idea de los eventos
dominantes del cultivo así como de las condiciones a las que se ven expuestas las
bacterias (Prescott ; Harley ; Klein, 1995).
Dado que el objetivo de este trabajo era estudiar el potencial de cuatro cepas de
Pseudomonas putida y de Acinetobacter sp. LMG 1056 en la mira de aplicarlas en la
biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos, es necesario considerar
los elementos que condicionan el éxito de un sistema de biorremediación (figura 35).
MICROORGANISMOS
FUENTE ACEPTOR DE
DE ENERGÍA ELECTRONES
HUMEDAD pH
NUTRIMENTOS TEMPERATURA
AUSENCIA ELIMINACIÓN DE AUSENCIA
DE TOXICIDAD LOS METABOLITOS DE COMPETENCIA
BIORREMEDIACIÓN
Fig. 34 : Elementos constitutivos de la biorremediación (Cookson, 1995).
VI.1.a. La importancia del pH como parámetros indicador de la actividad
metabólica
El pH de los medios se ajusta a 7 debido a que las bacterias de los géneros
Acinetobacter y Pseudomonas son neutrófilas y que su pH óptimo de crecimiento es
7. La mayoría de las bacterias crecen a este pH debido a que es equivalente al pH
interno de las células, que se mantiene por medio de un intercambio de iones entre el
medio y la célula con el fin de mantener un equilibrio osmótico (Madigan ;
Martinko ; Parker, 1999).
El pH del medio es por lo general modificado por los microorganismos contenidos en
este. Según las fuentes de energía disponibles y su metabolismo, el medio puede
acidificarse o alcalinizarse. El pH puede disminuir si existe un metabolismo que
genere ácidos orgánicos como en el caso de la metabolización de los hidrocarburos ;
82

puede aumentar si se produce amoníaco tras el consumo de aminoácidos (Prescott ;
Harley ; Klein, 1995).
Como se describió, la actividad metabólica de los microorganismos puede ser
responsable del cambio de pH y este cambio puede desde entonces utilizarse como
indicador de un cambio metabólico en el cultivo. Para los ensayos en erlenmeyers,
sólo los consumos de glucosa por Pseudomonas putida y los de hexadecano y glucosa
por Acinetobacter fueron confirmados mediante un cambio de pH.
Contrariamente a los ensayos en erlenmeyers, los ensayos en reactor permitieron
regular varios parámetros. La modificación del pH en los medios se corrige al
agregar base, la cual se convierte en el parámetro que permite cuantificar la actividad
metabólica. Incluso si la viabilidad no aumenta significativamente, los mililitros de
base agregados confirman que un metabolismo tiene lugar.
VI.1.b. La importancia de la temperatura para el crecimiento bacteriano
La temperatura juega un papel importante para el crecimiento de las bacterias.
Constituyen microorganismos unicelulares poiquilotérmicos muy sensibles a los
cambios de temperatura debido a que la estabilidad de sus proteínas de membrana y
de la actividad enzimática interna depende de la temperatura del medio (Prescott ;
Harley ; Klein, 1995). Durante los cultivos en erlenmeyers o en reactor la
temperatura se mantienen a 30 °C. En un ambiente natural como el suelo, pueden
observarse grandes fluctuaciones de temperatura.
Con el fin de simular las condiciones de cultivo a las que se encontrarían presentes en
un sitio contaminado sujeto a las fluctuaciones de temperatura, los ensayos en suelo
fueron realizados a 20 °C (± 5 °C). La temperatura influencia las velocidades de las
reacciones fisiológicas así como las características físico-químicas que conllevan
consecuencias sobre la actividad metabólica de los microorganismos y, de este modo,
sobre las actividades de biotransformación de los sustratos (su velocidad se duplica
porc ada aumento de 10 °C entre 5 y 30 °C) (Ballerini ; Gatellier ; Vogel, 1998). Las
fluctuaciones de las curvas de DBO y de viabilidad pueden, como consecuencia,
asociarse con las fluctuaciones de temperatura en el laboratorio, entre otros,.
VI.1.c. Importancia de la disponibilidad de oxígeno para la actividad metabólica
y el crecimiento
La oxigenación constituye también un factor importante en lo que concierne el
metabolismo de degradación de los hidrocarburos por las cepas aerobias como
Acinetobacter sp. y Pseudomonas putida. El oxígeno constituye un aceptor de
electrones que debe inyectarse al medio líquido de manera que la población contenida
en este último pueda activar su metabolismo y sobrevivir (Ballerini ; Gatellier ;
83

Vogel, 1998). La transferencia de oxígeno de la fase gaseosa a las fase líquida se ve
favorecida por una agitación (presente a 200 rpm para los erlenmeyers y a 500 rpm
para los reactores). Una velocidad de agitación demasiado elevada puede dificultar la
estabilización de las bacterias sobre los sustratos por degradar (Hori, et al., 2002).
En erlenmeyer, la disponibilidad de aire puede maximizarse mediante una agitación
constante pero sobre todo, utilizando una proporción suficientes entre el volumen de
medio y el de aire. Mientras que una proporción de 1:4 se utiliza en la mayoría de los
artículos, una proporción de 1:1 fue utilizada en este estudio. La ausencia de
crecimiento en los erlenmeyers podría explicarse por una limitación de la cantidad de
oxígeno presente en estos (Moriya ; Horikoshi, 1993 ; Marín et al., 1995 ; Leahy ;
Tracy ; Eley, 2003).
En los reactores, el aire estéril se inyecta con un débito de un litro por minuto. Si la
velocidad de metabolización de la fuente de energía es superior a la velocidad de
transferencia del oxígeno al medio, una disminución de la concentración en oxígeno
disuelto puede observarse. Esta se detecta mediante una sonda para pO2 (Bréand,
1998). La medida de la pO2 puede por lo tanto considerarse como un parámetro
indicador de una actividad metabólica de las bacterias sobre los hidrocarburos
probados.
La demanda bioquímica de oxígeno (DBO) consiste en una medida indirecta de la
cantidad de materia orgánica oxidable por los microorganismos presentes en un
medio (Madigan ; Martinko ; Parker, 1999). Constituye un parámetro que indica si
está ocurriendo una actividad metabólica o no en un sistema herméticamente cerrado.
Para los ensayos en el suelo, la aireación no es indispensable debido a que los poros
que existen entre las partículas de suelo y entre los agregados formados por las
primeras, contienen normalmente, humedad y aire en suficiencia. Un problema de
disponibilidad de oxígeno o de aire puede sin embargo existir según la textura del
suelo debido a que algunos tipos de partículas (suelo arcilloso) tiene tienden a formar
agregados más compactos que otros (suelo arenoso). Si un suelo se compone de
varios tipos de partículas, la actividad de los microorganismos puede ser diferente
según si el inóculo se localiza en una zona más o menos compacta del suelo
(Ballerini ; Gatellier ; Vogel, 1998).
VI.1.d. La importancia de la disponibilidad de la fuente de carbono y de energía
para el metabolismo y el crecimiento bacterianos
Una última condición esencial para el crecimiento de los microorganismos es la
disponibilidad de la fuente de energía. Incluso si todas las condiciones anteriores son
óptimas, si el hidrocarburo no se encuentra disponible para los microorganismos, no
se observará ningún crecimiento. El carácter hidrófobo de los hidrocarburos
dificultan su degradación (Hori, et al., 2002). En el caso de los hidrocarburos
84

volátiles, los ensayos fueron realizados en erlenmeyers herméticamente cerrados con
el fin de mantener la fuente de carbono en el medio. Sin embargo, su baja solubilidad
en el agua provoca que una gran parte del hidrocarburo no se disuelve en el medio de
cultivo sino que se presenta más bien bajo una forma de emulsión (Schwartz ; Bar,
1995). Los compuestos volátiles pasan a la fase gaseosa y dejan de estar disponibles
para los microorganismos.
Un emulsificante puede ser sintetizado y actuar sobre el sustrato con el fin de
aumentar la superficie de intercambio con la fase acuosa. Este emulsificante se
produce por lo general al final de la fase exponencial de crecimiento, después de que
las bacterias sean estimuladas por el contacto con un sustrato hidrófobo (Ron ;
Rosenberg, 2002). Las figuras 12, 15 y 17 presentan las bacterias Acinetobacter sp.
LMG 1056 sobre las emulsiones de hidrocarburo. Este contacto constituye la primera
etapa para la degradación y le sigue a este una producción de biosurfactante que
modificará el comportamiento de los hidrocarburos y de las bacterias con :
• La formación de micelas que aumentan la solubilidad acuosa aparente de los
hidrocarburos y los vuelven de esta manera también, más accesibles para las
células de superficie esencialmente hidrófila.
• El aumento de la hidrofobia de la superficie celular (por la liberación de los
lipopolisacáridos de la membrana exterior) que aumenta la adhesión de las
células a los sustratos hidrófobos. Las células hidrófobas tienden a formar
agregados para evitar el contacto con el medio acuoso (Al-Tahhan, et al.,
2000).
En el caso de los ensayos sobre suelo, los hidrocarburos se encuentran sólidamente
adsorbidos a las partículas del suelo y su movilidad así como su accesibilidad
disminuyen fuertemente (Márquez ; Hernández ; Lamela, 2001 ; Cassidy ; Irvine,
1998). Además, la estabilización de las bacterias sobre la superficie de las partículas
del suelo que presentan una adsorción de hidrocarburos se vuelve más difícil
(Ballerini ; Gatellier ; Vogel, 1998).
En lo que concierne la interacción entre el agente contaminante y el microorganismo,
deben de tomarse en cuenta varias posibilidades : si las moléculas se encuentran
demasiado expuestas, pueden ser tóxicas para los microorganismos ; por otro lado, si
la contaminación está fuertemente adsorbida a las partículas del suelo, las células
podrían degradarla con menos eficacia. Este particularidad podría explicar en parte,
la diferencia que aparece entre los cultivos en suelo y aquellos en lodo (Schwartz ;
Bar, 1995).
Sobre el suelo, no hay una agitación que garantice la homogeneidad del sistema, y la
contaminación se encuentra probablemente adsorbida a las partículas de suelo. El
agente contaminante se encuentra por lo tanto menos expuesto al metabolismo de
Acinetobacter sp. pero este se encuentra sobre todo menos expuesto a la toxicidad del
contaminante (Stelmack ; Gray ; Pickard, 1999). Es probable que una fracción
85

esidual de la contaminación persista en el suelo después de la intervención de la
bacteria debido a la adsorción del contaminante sobre las partículas del suelo
(Nocentini ; Pinelli ; Fava, 2000).
En el caso de los lodos, la agitación y la dilución del suelo contaminado favorecen la
resuspensión del contaminante. La población presenta en el lodo dos opciones de
degradación : un consumo del contaminante accesible bajo forma acuosa y un
consumo del contaminante adsorbido a las partículas del suelo. Presentan sin
embargo, un acceso gradual al contaminante y logran degradarlo más eficazmente
(Schwartz ; Bar, 1995).
VI.2. MEDIDA DE LA VIABILIDAD DE LAS POBLACIONES
La viabilidad constituye un parámetro determinante para el estudio de la
biorremediación. Descubrir cepas de bacterias que toleren la presencia de los
contaminantes es casi igual de importante que encontrar microorganismos que
degradan los hidrocarburos. Si existe una población tolerante a la contaminación,
esta contaminación puede participar en la recuperación del equilibrio del sitio
contaminado (Davids ; Flemming ; Wilderer, 1998). Sin embargo, el objetivo de este
trabajo fue utilizar cepas que toleraran y degradaran la contaminación así como
cuantificar esta degradación. Lo ideal sería obtener una degradación sin necesidad de
agregar fuentes de carbono suplementarias o inductores de degradación y solamente
los nutrimentos inorgánicos necesarios para el metabolismo (Leahy ; Tracy ; Eley,
2003).
VI.2.a. La densidad óptica
La densidad óptica constituye la capacidad de una sustancia material para disminuir
la intensidad de un haz luminoso con determinada longitud de onda que la atraviese
(ULP, 2003). El crecimiento de una población arrastra la opacificación del medio de
cultivo de manera tal que sólo una parte de la intensidad del rayo de luz incidente sea
transmitida por el medio. Esta medida permite conocer la cinética de crecimiento de
una población pero presenta el inconveniente de que el espectrofotómetro presenta un
punto mínimo de detección que no detecta el crecimiento antes de que la
concentración supere los 10 6 UFC/ml (Bréand, 1998).
VI.2.b. Los plaqueos
Los plaqueos permiten conocer la evolución de la concentración en células viables de
los medios de cultivo. La variación de la viabilidad permite evidenciar el crecimiento
y de este modo la metabolización de los hidrocarburos. Permite también evaluar la
toxicidad de los agentes contaminantes (Madigan ; Martinko ; Parker, 1999).
86

El metabolismo de los hidrocarburos implica la producción de un emulsificante que
tiende a cambiar la hidrofobia de las superficies celulares de manera que las células
se ensamblen formando agregados (Al-Tahhan, et al., 2000). Resulta imposible
prever cómo serán distribuidos los agregados del cultivo en las diluciones sucesivas
realizadas para medir la viabilidad.
En lo que respecta los plaqueos efectuados a partir de las muestras tomadas de los
suelos y los lodos, otro error puede aparecer y se atribuye a la adsorción de la
biomasa sobre las partículas del suelo.
VI.2.c. El peso seco
El aumento de la densidad óptica y del número de UFC/ml disponibles en el medio a
lo largo del tiempo muestra que existe una población en crecimiento en el medio. Sin
embargo, este crecimiento que tiene lugar debido al consumo del hidrocarburo
presente como única fuente de carbono y de energía, debe acompañarse de un
aumento de la concentración de biomasa expresada en gramos por litro de materia
seca. La determinación de los pesos secos permite verificar que la energía aportada
por el hidrocarburo es suficiente para la producción de biomasa.
VI.3. MEDIDA DE LA DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS PUROS Y
DEL DIESEL
El pH, el consumo de base y la pO2 ya fueron presentados como parámetros
indicadores del metabolismo de las bacterias sobre los hidrocarburos presentes en los
diferentes medios. Sin embargo, es la disminución de la concentración de este
hidrocarburo a lo largo del tiempo lo que permitirá confirmar que los cambios de los
parámetros mencionados se encuentren ligados a una actividad metabólica específica.
Esta disminución fue cuantificada por dos métodos : el método gravimétrico y el
método enzimático 10050 de HACH.
VI.3.a. Método gravimétrico
Este método aprovecha la miscibilidad entre los hidrocarburos probados y el hexano.
Cuando este último se agrega a la muestra del medio de cultivo, separa y acapara el
hidrocarburo del medio. La concentración inicial de los hidrocarburos podría
recuperarse si tres extracciones fueran realizadas en vez de dos. Sin embargo, el
problema reside esencialmente en la toma de muestra a partir de una fase heterogénea
que no permite una extracción cuantitativa. El método enzimático es preferible para
87

la cuantificación de los hidrocarburos volátiles pero presenta igualmente algunos
inconvenientes.
VI.3.b. Método enzimático
El método de immunoassay para TPH permite detectar la presencia de bajas
concentraciones de hidrocarburo presentes en las muestras acuosas o de suelo. El
hidrocarburo contenido en la muestra reacciona, en presencia de metanol y de un
conjugado enzimático, con el anticuerpo que cubre el interior de las celdas. Los
productos de esta reacción pueden colorearse con una solución de desarrollo de color
seguido por una solución fijadora con el fin de realizar una lectura al
espectrofotómetro.
Esta técnica es muy simple y permite tratar varias muestras a la vez y obtener
resultados en menos de media hora. Sin embargo, la técnica presente un
inconveniente debido a su sensibilidad. Debido a que el kit fue concebido para
detectar trazas de TPH de 1,5 a 10 ppm, según el hidrocarburo, las muestras deben
diluirse previo a la prueba. Esta dilución arrastra una imprecisión debido a la
heterogeneidad de las muestras.
En cuanto a los ensayos en suelo, debido a la ausencia de técnicas tradicionales de
cuantificación de los hidrocarburos, el método 10050 de HACH constituye una
excelente herramienta de medida semi-cuantitativa debido a que sólo proporciona un
rango de concentración con respecto a los resultados de los estándares.
VI.4. LA DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS POR Pseudomonas
putida EN MEDIO ACUOSO
Las cepas DSMZ 6414, DSMZ 6899 y ATCC 39213 son presentadas en los catálogos
de las colecciones como capaces de utilizar y metabolizar el tolueno. Las dos
primeras serían incluso capaces para degradar el benceno y el xileno, respectivamente
(DSMZ, 1998 ; ATCC, 1992). La cepa LMG 2257 es seleccionada como capaz de
degradar los hidrocarburos aromáticos (sin especificar) (BELSPO, 2003).
Las especies del género Pseudomonas son en general utilizadas para la degradación
de los hidrocarburos (Al-Tahhan, et al., 2000) y reconocidas más particularmente
para sus capacidades para degradar los hidrocarburos aromáticos monocíclicos como
el benceno y el tolueno debido a que presentan las oxigenasas que catalizan las etapas
iniciales aerobias de degradación de estos hidrocarburos. Como mencionado, la falta
de oxígeno es probablemente responsable por la ausencia de resultados significativos
en los cultivos de las Pseudomonas putida en erlenmeyers (Allen, et al., 1999).
88

Incluso si varios autores coinciden sobre la capacidad de Pseudomonas putida para
degradar el tolueno, Schwartz y Bar (1995) mostraron que esta especie puede
degradar el tolueno inyectado al reactor en forma de fase gaseosa pero que desaparece
en el momento en el que se encuentra en presencia de tolueno en fase líquida. La
presencia de tolueno sin disolver en el reactor sería suficiente para eliminar
inmediatamente la población de la cepa LMG 2257, lo cual explicaría los resultados
obtenidos.
Otra explicación podría ser que la metabolización de estos hidrocarburos necesita
fases de adaptación más largas para inducir la síntesis de la maquinaria enzimática.
La información que codifica para la degradación del tolueno podría también estar
contenida en un plásmido inestable en ausencia de la presión de selección en los
precultivos utilizados para preparar los gliceroles.
La actividad metabólica de las bacterias sobre el tolueno implica su degradación así
como en parte también, su acumulación en la célula. Cuando la concentración de
tolueno es demasiada elevada, este podría resultar tóxico incluso para los
microorganismos capaces de degradarlo debido a que los límites de acumulación
celular fueron sobrepasados. Es probable que la concentración de tolueno del medio
haya sido demasiado elevada con respecto a la capacidad de acumulación de
Pseudomonas putida LMG 2257 y que la acumulación excesiva haya provocado una
lisis casi inmediata (Hubert ; Shen ; Voordouw, 1999).
Visto el carácter altamente volátil del tolueno, su degradación debería probarse en
presencia de un microorganismo anaerobio de manera que el tolueno sea enteramente
degradado son riesgos de pérdida por la aireación (Beller et al., 1996 ; Burland ;
Edwards, 1999 ; Cervantes et al., 2001). También debe ser concebible la puesta en
marcha de un tratamiento aerobio utilizando una trampa con carbono activado u otra
estructura similar de manera que el tolueno se atrape y libere gradualmente al medio
(Li et al., 2002).
En el caso del diesel, Pseudomonas putida LMG 2257 probablemente utilizó una
fracción de este como fuente de carbono y de energía. Es importante mencionar que
el diesel contiene varias formas de hidrocarburos (Olson et al., 1999) y que la cepa
posee la maquinaria enzimática para utilizar algunos compuestos del diesel.
VI.5. LA DEGRADACIÓN DE LOS HIDROCARBUROS POR Acinetobacter
sp. LMG 1056
Varias cepas de Acinetobacter sp. son reconocidas por poseer la maquinaria
enzimática para degradar los alcanos líquidos y sólidos que contienen de 13 a 44
átomos de carbono (Sakai et al., 1994) en su estado puro o bajo forma de mezclas
(Marín et al., 1995 ; Hanson et al., 1996 ; Hanson et al., 1997).
89

VI.5.a. Degradación de los hidrocarburos por Acinetobacter sp. LMG 1056 en
medio acuoso
La capacidad de utilizar los alcanos lineares de más de 10-12 átomos de carbono
gracias a la producción de emulsificante es típica de las cepas de Acinetobacter
(Marín ; Pedregosa ; Laborda, 1996). Los alcanos son los hidrocarburos más
susceptibles a la biodegradación (Olson et al., 1999). Entre ellos, el hexadecano
acostumbra utilizarse como sustrato selectivo para aislar cepas que degraden los
alcanos (Wrenn ; Venosa, 1996 ; Lepo et al., 2001). Este alcano también se utiliza
para estudiar el comportamiento de las cepas productoras de bioemulsificantes (Al-
Tahhan et al., 2000). La accesibilidad de las bacterias al hexadecano explica el
importante crecimiento de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre este alcano.
Siendo la accesibilidad de la cepa a la fuente de carbono una condición indispensable
a la degradación de este, es extraño no haber observado una evolución significativa
de los parámetros del cultivo de la cepa LMG 1056 en presencia de decano. La figura
17 presenta sin embargo claramente la presencia de Acinetobacter sp. sobre las
emulsiones de decano. Hori, et al. (2002) señalan que Acinetobacter sp. se instala
sobre las grandes emulsiones de los hidrocarburos para degradarlos. Esta adhesión se
ve complementada con la producción de un emulisificante que permite el ensamble
de un biofilm estabilizado sobre el hidrocarburo por degradar (Marín ; Pedregosa ;
Laborda, 1996). El decano no constituye, al parecer, un sustrato utilizable por
Acinetobacter sp. bajo las condiciones propuestas. Puede ser que en presencia de un
alcano que contiene más átomos de carbono, como el tetradecano (C14H30), la
degradación del decano haya podido favorecerse (Cookson, 1995).
El cometabolismo consiste en un metabolismo concomitante de dos sustratos, uno de
ellos permite a la célula obtener energía para el crecimiento mientras que el otro es
metabolizado en paralelo sin que aporte ningún elemento indispensable para esta. Si
los sustratos son de naturaleza similar, ocurrirá una degradación preferencial y el
sustrato principal puede en mismo tiempo preparar a la bacteria para la degradación
del co-sustrato (Allen, et al., 1999).
La glucosa y los hidrocarburos constituyen dos fuentes de energía carbonadas de
modo que no puede hablarse de un verdadero cometabolismo. La glucosa es un
sustrato completamente hidrófilo mientras que el hidrocarburo es de naturaleza
hidrófoba y menos accesible para los microorganismos. Sería preferible utilizar un
alcano de fácil degradación en vez de la glucosa, ya que esta última no indujo al
parecer la bacteria a producir el emulsificante que le permita degradar el tolueno o el
octano (Franzmann et al., 2002).
Leahy, Tracy et Eley (2003) aislaron una cepa de Acinetobacter sobre un medio
enriquecido con tolueno y estireno. Este género puede por lo tanto contener la
maquinaria enzimática necesaria para descomponer el tolueno. Con el fin de
mantener este hidrocarburo en el medio, ensayos de degradación fueron realizados
90

sobre mezclas binarias de solventes orgánicos, es decir, agregando al cultivo que
contiene tolueno, una fracción despreciable de hexadecano. Este compuesto poco
volátil no se presentó en suficiencia en el medio como para garantizar el crecimiento
de los microorganismos pero en cantidad suficiente como para mantener el tolueno en
el cultivo (Hubert ; Shen ; Voordouw, 1999). Esto podría probarse para
Acinetobacter sp. LMG 1056.
VI.5.b. Degradación del diesel por Acinetobacter sp. LMG 1056 en suelo y lodo
Como lo mostraron las observaciones durante el seguimiento del crecimiento de
Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre suelo o lodo artificialmente contaminados con
diese, cuando una contaminación tiene lugar sobre un sitio, la diversidad de la
población disminuye a lo largo del tiempo (Venosa et al., 1999).
En lo que concierne la degradación del diesel presente en el suelo y en el lodo, el
residuo después de 28 días de seguimiento es inferior en este último, lo cual sugiere
que se da una degradación más rápida y eficaz del diesel por la población presente en
un medio acuoso más homogéneo. Ha de considerarse que cualquier contaminación
presenta una residualidad potencial (de Carvalho, 2002). La ventaja de un
tratamiento en lodo es que la mezcla en agua implica una dilución de la concentración
del diesel y reduce la toxicidad. El lodo constituye un tratamiento ex situ que implica
un costo y un volumen superior por tratar que en un tratamiento in situ (Ballerini ;
Gatellier : Vogel, 1998).
La mayor parte de la contaminación con hidrocarburos se encuentra en la fase líquida
no-acuosa (NAPL) del suelo y forma sobre las partículas de suelo, gotas o películas
difícilmente accesibles para los microorganismos, contrariamente a la fracción de
hidrocarburos disuelta en la fase acuosa del suelo. Sin embargo pueden separarse de
la NAPL de manera que pueda establecerse una interacción directa entre los
microorganismos y la contaminación. Esta separación se ve favorecida por la
presencia de un surfactante que puede ser nociva para la microflora del suelo
(Stelmack ; Gray ; Pickard, 1999).
El éxito de la degradación realizada por los microorganismos en el suelo depende de
varios factores que favorecen esta actividad. Ante todo, una población inoculada en
un suelo es susceptible al ataque de protozoarios contenidos en este (Acea ; Moore ;
Alexander, 1988). Además de esta susceptibilidad de los microorganismos antes los
predadores del suelo, es probable que no utilicen el contaminante sino una fuente
alternativa de energía presente en el medio o que sean incapaces de moverse en el
suelo par buscar del contaminante por degradar.
En general, cuando una bioaumentación no presenta resultados satisfactorios, no son
las capacidades biorremediantes de la cepa las que son puestas en duda sino sobre
todo, la biodisponibilidad del contaminante, la cual en el caso de los hidrocarburos, se
91

encuentra limitada por la transferencia de masa (Márquez ; Hernández ; Lamela,
2001). La difusión de los hidrocarburos depende de la formación de micelas así
como de la interacción entre las células y estas últimas. En el suelo, las bacterias
deben tener acceso a los hidrocarburos disueltos en la fase acuosa o presentarse en la
interfase NAPL-agua (Stelmack ; Gray ; Pickard, 1999).
Con el fin de probar la degradación del diesel por bioestimulación, sería interesante
agregar un emulsificante capaz de liberar las moléculas de hidrocarburo adsorbidos
sobre las partículas del suelo (Rahman, et al., 2001) o considerar una fertilización
orgánica o inorgánica que satisfaga las necesidades de la población microbiana
(Swannell et al., 1999).
92

VIII. CONCLUSIONES Y
PERSPECTIVAS
93

La construcción de un consorcio de bacterias que pueda restaurar el equilibrio de un
sitio contaminado con hidrocarburos implica la adaptación de las cepas a las
diferentes condiciones ambientales presentes y sobre todo, a la accesibilidad a la
fuente de carbono y de energía. Con el fin de evitar la utilización de agentes de
superficie sintéticos, se recomienda utilizar cepas que produzcan bioemulsificantes
que faciliten el acceso a las moléculas hidrófobas y así su degradación.
Los estudios en erlenmeyers presentan un inconveniente con respecto a la
disponibilidad de oxígeno y la posibilidad de medida de diferentes parámetros. Por el
contrario, los cultivos en reactor pueden estudiarse al controlar varios parámetros que
permiten determinar la presencia de un crecimiento bacteriano así como de una
actividad metabólica de degradación de los hidrocarburos. En lo que concierne los
estudios en suelo y en lodo, el control de los parámetros sobre estos sistemas resulta
menos cómodo pero el seguimiento de la DBO y de la concentración en
hidrocarburos permiten determinar el potencial de degradación de las bacterias
seleccionadas en el caso de un tratamiento por biorremediación in situ y ex situ.
La degradación de los hidrocarburos sigue siendo el parámetro más difícil de
determinar debido a la volatilidad de algunos hidrocarburos y la adsorción de otros a
las partículas del suelo. Resta por conocer qué fracción(es) del diesel es(son)
metabolizada(s) y cuáles son los productos de la actividad metabólica sobre los
hidrocarburos estudiados. Sin embargo, el método enzimático TPH Immunoassay
method (HACH) constituye una herramienta que satisface las necesidades de
cuantificación.
Aunque Pseudomonas putida aparece en la literatura como una de las responsables de
la degradación de varios hidrocarburos aromáticos monocíclicos, ninguna
manifestación de esta capacidad pudo ser determinada en este trabajo. Sería
recomendado realizar cultivos sucesivos en presencia de hidrocarburos para poder
mantener la presión de selección con respecto a la actividad metabólica deseada. La
cepa LMG 2257 podría sin embargo participar en la degradación de una fracción del
diesel.
Fue posible detectar la actividad metabólica de Acinetobacter sp. LMG 1056 sobre el
hexadecano y el tolueno en reactor así como sobre el diesel en reactor y sobre un
suelo contaminada artificialmente. El octano parece constituir un hidrocarburo tóxico
para esta cepa pero la degradación del decano podría lograrse en presencia de un cosustrato
hidrófobo con más átomos de carbono.
La capacidad de degradación de los hidrocarburos por Pseudomonas putida podría
probarse en presencia de Acinetobacter sp.. Los diferentes ensayos realizados
confirman que esta cepa constituiría un candidato ideal para la composición de
consorcios bacterianos capaces de degradar los hidrocarburos en medio acuoso o
sólido.
94

VIII. ANEXOS
95

De izquierda a derecha :
Anexo 1
Medios de cultivo empleados en la investigación
Dos veces 100 ml de medio LB líquido en erlenemeyers de 250 ml
Medio MM2 para los ensayos con hidrocarburos en los erlenmeyers y
biorreactores
Placas de Petri desechables con 20 ml de medio LB sólido cada una
96

Anexo 2
Biorreactor BIOSTAT®B de dos litros
El biorreactor está dividido en dos partes:
Recipiente de dos litros (izquierda):
Rotor (arriba en negro y gris)
Refrigerante (doble pared del recipiente y columna central del recipiente)
Sondas de pH, temperatura y pO2 (cableado negro con etiquetas amarilla y roja)
Inyección de aire estéril (tubería blanca con filtro)
Sistema de suministro de ácido-base-antiespumante por goteo (botellitas frente al
recipiente y conectadas a este por medio de tuberías delgadas)
Sistema de calibrado y lectura (derecha)
Pantalla que muestra condiciones de cultura (espacio verde oscuro)
Motores reguladores del suministro de ácido-base-antiespumante (en columna,
casillas grises con interruptores negros)
Regulador del suministro de aire estéril (columna amarilla bajo la manecilla roja de
encendido)
97

Anexo 3
Autoclave y Olla de presión empleadas para la esterilización
Autoclave
Olla de presión
98

Anexo 4
Espectrofotómetro utilizado para las lecturas de absorbancia
99

Anexo 5
Utensilios utilizados para el sembrado o plaqueo de las bacterias
De izquierda a derecha :
Vortex azul para homogeneizar las muestras y las diluciones
Pipetas de 1 ml para preparar las diluciones
Pipetas de 0,5 ml para sembrar 0,1 ml por placa de Petri
Tubos de ensayo para preparar las diluciones
Mechero Bünsen para esterilización a la flama
Placas de Petri sobre mesa rotatoria
Beaker con alcohol puro para esterilización del rastrillo
100

Anexo 6
Centrifugadoras empleadas durante el estudio
Para densidad óptica indirecta
Para determinar glucosa
Para lavado y peso seco
101

De izquierda a derecha :
Anexo 7
Rotavapor utilizado para el método gravimétrico
Botella de hexano
Agitador magnético
Balón de fondo redondo tarado
Rotavapor
102

Anexo 8
Detalles del método enzimático
Reactivos, calibradores y pipetas
Resultado de la reacción colorimétrica
Espectrofotómetro HACH
103

Anexo 9
Roller Bottle para homogeneizar diesel en el suelo
104

Anexo 10
Sistemas de lectura de Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO)
OxiTop® OC110
VELP Scientifica
105

IX. BIBLIOGRAFÍA
106

A
1. ABDEL-EL-HALEEM, D.. 2003. Acinetobacter : environmental and
biotechnological applications. African Journal of Biotechnology. 2(4):71-
74.
2. ACEA, M. ; MOORE, C. ; ALEXANDER, M.. 1988. Survival and growth of
bacteria introduced into soil. Soil Biol. Biochem.. 20(4):509-515.
3. AITKEN, M.. 1998. Mechanisms of organic pollutant transformation and
degradation by microorganisms. En : Bioremediation : Principles and
Practice. Volumen I : Fundamentals and Applications. Editado por Sikdar,
S. e Irvine, R.. Technomic Publication. Pennsylvania, Estados Unidos. p.
333-383.
4. ALLEN, C. ; BOYD, D. ; HEMPENSTALL, F. ; LARKIN, M. ; SHARMA,
N.. 1999. Contrasting effects of a nonionic surfactant on the
biotransformation of polycyclic aromatic hydrocarbons to cis-dihydrodiols
by soil bacteria. Applied and Environmental Microbiology. Estados
Unidos. 65(3):1335-1339.
5. AL-TAHHAN, R. ; SANDRIN, T. ; BODOUR, A. ; MAIER, R.. 2000.
Rhamnolipid-induced removal of lipopolysaccharide from Pseudomonas
aeruginosa : Effect on cell surface properties and interaction with
hydrophobic substrates. Applied and Environmental Microbiology. Estados
Unidos. 66(8):3262-3268.
6. ATCC. 1992. Catalogue of bacteria & bacteriophages. 18ème ed. American
Type Culture. Maryland, Estados Unidos. p. 260.
B
7. BALBA, M. ; AL-AWADHI, N. ; AL-DAHER, R.. 1998. Bioremediation of
oil-contaminated soil : microbiological methods for feasibility assessment
and field evaluation. Journal of Microbiological Methods. 32:155-164.
8. BALLERINI, D. ; GATELLIER, C. ; VOGEL, T.. 1998. Techniques de
traitement par voie biologique de sols pollués. Agence de l’Environnement
et de la Maîtrise de l’Energie. Angers, Francia. p. 18-157.
9. BELLER, H. ; SPORMANN, A. ; SHARMA, P. ; COLE, J. ; REINHARD, M..
1996. Isolation and characterization of a novel toluene-degrading sulphatereducing
bacterium. Applied and Environmental Microbiology. Estados
Unidos. 62(4):1188-1196.
10. BELSPO. 2003. Pseudomonas putida (Trevisan 1889) Migula 1895 AL.
Strains Details, Belgian Federal Science Policy Office. Bruselas, Bélgica.
Consultado el 25 de noviembre del 2003. Disponible en
http://www.belspo.be/bccm/db/bacteria_details2.asp?NUM=2257.
107

11. BREAND, S.. 1998. Etude biométrique de la réponse d’une population
bactérienne à une variation défavorable de température ou de pH :
Applications en microbiologie prévisionnelle alimentaire. Laboratoire
Biométrie – Génétique et Biologie des Populations, Université Claude
Bernard. Lyon, Francia. Consultado el 19 de noviembre del 2003.
Disponible en http://biomserv.univlyon1.fr/txtdoc/THESES/BREAND/TheseBRES.pdf.
12. BURLAND, S.; EDWARDS, E.. 1998. Anaerobic benzene biodegradation
linked to nitrate reduction. Applied and Environmental Microbiology.
Estados Unidos. 65(2):592-533.
C
13. CAPRETTE, D.. 2000. Substrate oxidation : Krebs reaction. Rice Unix
Facility, Rice University. Houston, Estados Unidos. Consultado el 9 de
diciembre del 2003. Disponible en
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/mitochondria/mitokrebs.html.
14. CASSIDY, D. ; IRVINE, R.. 1998. Interactions between organic contaminants
and soil affecting bioavailability. En : Bioremediation : Principles and
Practice. Volumen I : Fundamentals and Applications. Editado por Sikdar,
S. e Irvine, R.. Technomic Publication. Pennsylvania, Estados Unidos. p.
259-282.
15. CERVANTES, F. ; DIJKSMA, W. ; DUONG-DAC, T. ; IVANOVA, A. ;
LETTINGA, G. ; FIELD, J.. 2001. Anaerobic mineralization of toluene by
enriched sediments with quinines and humus as terminal electron acceptors.
Applied and Environmental Microbiology. Estados Unidos. 67(10):4471-
4478.
16. COOKSON, J.. 1995. Bioremediation engineering : design and application.
McGraw-Hill. Estados Unidos. p. 15, 96-109.
D
17. DAVIDS, L. ; FLEMMING, H.C. ; WILDERER, P.. 1998. Microorganisms
and their role in soil. En : Bioremediation : Principles and Practice.
Volumen I : Fundamentals and Applications. Editado por Sikdar, S. e
Irvine, R.. Technomic Publication. Pennsylvania, Estados Unidos. p. 283-
332.
18. DE BROUWER, C.. 2002. Métabolisme des substances toxiques. Faculté de
Médecine, Université Libre de Bruxelles. Bruselas, Bélgica. Consultado el
23 de octubre del 2003. Disponible en
http://www.ulb.ac.be/esp/lsttm/courscdb/metabolisme.html.
108

19. DE CARVALHO, J.. 2002. Atividade microbiana e diversidades metabólica e
genética em solo de mangue contaminado com petróleo. Escuela Superior
de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidad de Sao Paulo. Piracicaba,
Brasil.
20. DSMZ. 1998. Catalogue of strains. 6ème ed. Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen. Brauschweig, Alemania. p. 134, 295,
302.
F
21. FRANZMANN, P. ; ROBERTSON, W. ; ZAPPIA, L. ; DAVIS, G.. 2002. The
role of microbial populations in the containment of aromatic hydrocarbons
in the subsurface. Biodégradation. Países Bajos. 13:65-78.
G
22. GREENE, A. ; KAY, J. ; JABER, K. ; STEHMEIER, L. ; VOORDOUW, G..
2000. Composition of soil microbial communities enriched on a mixture of
aromatic hydrocarbons. Applied and Environmental Microbiology. Estados
Unidos. 66(12):5282-5289.
H
23. HANSON, K. ; ANURANJINI, N. ; KAPADIA, M. ; DESAI, A.. 1996. Crude
oil degradation by Acinetobacter sp. A3 as influenced by nitrogen,
phosphorus and surfactants. Indian Journal of Experimental Biology.
34(12):1276-1278.
24. HANSON, K. ; ANURANJINI, N. ; MADHAVI, K. ; ANJANA, D.. 1997.
Bioremediation of crude oil contamination with Acinetobacter sp. A3.
Current Microbiology. Baroda, India. 35:191-193.
25. HARRIS, S.. 1997. Hydrocarbon bioremediation. No se encontró más
información. Material proporcionado por Marc Gesnot en el lugar de
realización de la práctica.
26. HORI, K. ; MATSUZAKI, Y. ; TANJI, Y. ; UNNO, H.. 2002. Effect of
dispersing oil phase on the biodegradability of a solid alkane dissolved in
non-biodegradable oil. App. Microbiol. Biotechnol.. 2002(59)574-579.
27. HUBERT, C. ; SHEN, Y. ; VOORDOUW, G.. 1999. Composition of toluenedegrading
microbial communities from soil at different concentrations of
toluene. Applied and Environmental Microbiology. Estados Unidos.
65(7):3064-3070.
109

J
28. JACOBUCCI, D. ; VASCONCELOS, C. ; MATSUURA, A. ; FALCONI, F. ;
DURRANT, L.. 2000. Degradation of diesel oil by biosurfactantsproducing
bacterial strains. Contaminated Soil Sediment and Water.
Association of Environmental Health and Sciences.
K
29. KAMUKAI-NAKAMURA, S. ; SUGIURA, K. ; YAMAUCHI-INOMATA,
Y. ; TOKI, H. ; VENKATESWARAN, K. ; YAMAMOTO, S. ;
TANAKA, H. ; HARAYAMA, S.. 1996. Construction of bacterial
consortes that degrade arabian light crude oil. Journal of fermentation and
bioengineering. 82(6):570-574.
30. KARAMANEV, D. ; CHAVARIE, C. ; SAMSON, R.. 1997. Soil
immobilization : New concept for biotreatment of soil contaminants.
Department of Chemical Engineering, Ecole Polytechnique. Montréal,
Canadá.
L
31. LEAHY, J. ; TRACY, K. ; ELEY, M.. 2003. Degradation of volatile
hydrocarbons form steam-classified solid waste by a mixture of aromatic
hydrocarbon-degrading bacteria. Biotechnology Letters. Países Bajos.
25:479-483.
32. LEPO, J. ; HANCOCK, P. ; ZULEGER, C. ; ROUPP-EDWARDS, K.. 2001.
Effectiveness and safety of biosurfactants as agents of oil spill response.
Center for Environmental Diagnostics and Bioremediation, University of
West Florida. Pensacola, Estados Unidos. Consultado el 24 de junio del
2003. Disponible en
http://www.kmprc.or.kr/dataroom/2001iosc/PDF/00609.pdf.
33. LI, G. ; HU, H. ; HAO, J. ; FUJIE, K.. 2002. Use of biological activated
carbon to treat mixed gas of toluene and benzene in biofilter.
Environmental Technology. 23:467-477.
110

M
34. MADIGAN, M. ; MARTINKO, J. ; PARKER, J.. 1999. Brock : Biología de
los Microorganismos. 8 ed. Prentice Hall Iberia. Madrid, España. 986 p.
35. MARCHAND, M.. 2001. Les pollutions accidentelles des eaux au-delà du
pétrole brut : maîtriser le risque et gérer la réponse. Les journées
d’information du Cèdre. Institut Français de Recherche pour l’exploitation
de la Mer. Nantes, Francia. Consultado el 12 de octubre del 2003.
Disponible en http://www.le-cedre.fr/fr/publication/coll/ji01_10.pdf.
36. MARIN, M. ; PEDREGOSA, A. ; RIOS, S. ; ORTIZ, M. ; LABORDA, F..
1995. Biodegradation of diesel and heating oil by Acinetobacter
calcoaceticus MM5 : its possible applications on bioremediation.
International Biodeterioration and Biodegradation. 269-285.
37. MARIN, M. ; PEDREGOSA, A. ; LABORDA, F.. 1996. Emulsifier
production and microscopial study of emulsions and biofilms formed by the
hydrocarbon-utilising bacteria Acinetobacter calcoaceticus MM5. Applied
Microbiology Biotechnology. 44:660–667.
38. MARQUEZ, F. ; HERNANDEZ, V. ; LAMELA, T.. 2001. Biodegradation of
diesel oil in soil by a microbial consortium. Water, Air and Soil Pollution.
Países Bajos. 128:313-320.
39. MORIYA, K. ; HORIKOSHI, K.. 1993. Isolation of a benzene-tolerant
bacterium and its hydrocarbon degradation. Journal of Fermentation and
Bioengineering. 76(3):168-173.
N
40. NGABONZIZA, E.. 2003. Sélection et mise en oeuvre de microorganismes
dégradant les hydrocarbures dans l’optique d’une application dans le secteur
de la bioremédiation. Institut Meurice, Haute Ecole Lucia de Brouckère.
Bruselas, Bélgica.
41. NIELSEN, K. ; SMALLA, K. ; VAN ELSAS, J.. 2000. Natural
transformation of Acinetobacter sp., Pseudomonas fluorescens, and
Burkholderia cepacia in soil microcosms. Applied and Environmental
Microbiology. 66(1):206-212.
42. NOCENTINI, M. ; PINELLI, D. ; FAVA, F.. 2000. Bioremediation of a soil
contaminated by hydrocarbon mixtures : the residual concentration
problem. Chemosphere. 41(2000):1115-1123.
43. NSCA. 2003. What are cleaner fuels? National Society for Clean Air.
Brighton, Reino Unido. Consultado el 18 de noviembre del 2003.
Disponible en http://www.nsca.org.uk/fs16-1.htm.
111

O
44. O’GARA, F.. 2002. Plantes et microorganismes génétiquement modifiés en
agriculture. Bioweb : Biotechnologie information. Consultado el 24 de
junio del 2003. Disponible en http://www.bioweb.ch/fr/focus/bios/12.
45. OLSON, J. ; MILLS, G. ; HERBERT, B. ; MORRIS, P.. 1999. Biodegradation
rates of separated diesel components. Environmental Toxicology and
Chemistry 18(11):2448-2453.
P
46. PENNEL, K. ; ABRIOLA, L.. 1998. Surfactant-enhanced aquifer remediation:
Fundamental processes and applications. En : Bioremediation : Principles
and Practice. Volumen I : Fundamentals and Applications. Editado por
Sikdar, S. e Irvine, R.. Technomic Publication. Pennsylvania, Estados
Unidos. p. 693-750.
47. PIEPER, D. ; REINEKE, W.. 2000. Engineered bacteria for bioremediation.
Current Opinion in Biotechnology. 11:262-270.
48. POTHULURI, J. ; CERNIGLIA, C.. 1998. Current aspects on polycyclic
aromatic hydrocarbon biodegradation processes. En : Bioremediation :
Principles and Practice. Volumen I : Fundamentals and Applications.
Editado por Sikdar, S. e Irvine, R.. Technomic Publication. Pennsylvania,
Estados Unidos. p. 461-520.
49. PRESCOTT, M. ; HARLEY, J. ; KLEIN, D.. 1995. Microbiologie. 2 ème ed.
Traducido por Bacq-Calberg, C. ; Coyette, J. ; Hoet, P ; Nguyen-Distèche,
M.. De Boeck-Wesmael, S.A.. Bruselas, Bélgica. p. 122–128.
50. PRINCE, R. ; VARADARAJ, R. ; FIOCCO, R. ; LESSARD, R.. 1999.
Bioremediation as an oil spill response tool. Environmental Technology.
20:891-896.
R
51. RAHMAN, K. ; BANAT, I. ; THAHIRA, J. ; THAYUMANAVAN, T. ;
LAKSHMANAPERUMALSAMY, P.. 2001. Bioremediation of gasoline
contaminated soil by a bacterial consortium amended with poultry litter, coir
pith and rhamnolipid biosurfactant. Bioresource Technology. 81:25-32.
52. RATAJCZAK, A. ; GEIßDÔRFER, W. ; HILLEN, W.. 1998. Alkane
hydroxylase from Acinetobacter sp. Strain ADP1 is encoded by alkM and
belongs to a new family of bacterial integral-membrane hydrocarbon
hydroxylases. Applied and Environmental Microbiology. 64(4):1175-1179.
112

53. RITTMAN, B.. 1994. In situ bioremediation. 2 ed. Noyes Publication. New
Jersey, Estados Unidos. 255 p.
54. RON, E. ; ROSENBERG, E.. 2002. Biosurfactants and oil bioremediation.
Current Opinion in Biotechnology. 13:249-252.
S
55. SAKAI, Y. ; MAENG, J. ; TANI, Y. ; KATO, N.. 1994. Use of long-chain nalkanes
(C13 – C44) by an isolate, Acinetobacter sp. M-1. Biosci. Biotech.
Biochem. Kyoto, Japón. 58(11):2128-2130.
56. SAMANTA, S. ; SINGH, O. ; JAIN, R.. 2002. Polycyclic aromatic
hydrocarbons : environmental pollution and bioremediation. Trends in
Biotechnology. 20(6):243-248.
57. SCHWARTZ, A. ; BAR, R.. 1995. Cyclodextrin-enhanced degradation of
toluene and p-toluic acid by Pseudomonas putida. Applied and
Environmental Microbiology. Estados Unidos. 61(7):2727-2731.
58. SPEIDEL, H. ; LIGHTNER, R. ; AHMED, I.. 2000. Biodegradability of new
engineered fuels compared to conventional petroleum fuels and alternative
fuels in current use. Applied Biochemistry and Biotechnology. 84-86:879-
897.
59. STELMACK, P. ; GRAY, M.; PICKARD, M.. 1999. Bacterial adhesion to soil
contaminants in the presence of surfactants. Applied and Environmental
Microbiology. Estados Unidos. 65(1):163-168.
60. SWANNELL, R. ; MITCHELL, D. ; WATERHOUSE, J. ; MISKIN, I. ;
HEAD, I. ; PETCH, S. ; JONES, D. ; WILLIS, A. ; LEE, K. ; LEPO, J..
1999. Impact of bioremediation treatments on the biodegradation of buried
oil and predominant bacterial populations. Microbial Biosystems: New
Frontiers. Atlantic Canada Society for Microbial Ecology. Halifax,
Canadá.
T
61. THOMASSIN-LACROIX, E. ; ERIKSSON, M. ; REIMER, K. ; MOHN, W..
2002. Biostimulation for on-site treatment of weathered diesel fuel in Arctic
soil. Applied Microbiology Biotechnology. Quebec, Canadá. 59:551-556.
62. TIMMIS, K. ; PIEPER, D.. 1999. Bacteria designed for bioremediation.
Tibtech. 17:201-204.
63. TROQUET, J. ; TROQUET, M.. 2003. Les méthodes de dépollution des sols
contaminés par les hydrocarbures. Environmental Engineering and
Consulting, Parc Technologique de La Pardieu. Paris, Francia.
113

U
64. ULP. 2003. Les Travaux Dirigés de Biochimie : Densité Optique (Beer-
Lambert). Faculté des Sciences de la Vie, Université Louis Pasteur.
Strasbourg, Francia. Consultado el 19 de noviembre del 2003. Disponible
en http://ulpmultimedia.u-strasbg.fr/biochimie/didac15/dico/densiopt.htm.
V
65. VAN BEILEN, J. ; DUETZ, W. ; SMITS, T. ; WITHOLT, B.. 2003. Diversity
of alkane hydroxylase systems in the environment. Oil & Gas Science and
Technology. 58:427-440.
66. VASUDEVAN, N. ; RAJARAM, P.. 2001. Bioremediation of oil sludgecontaminated
soil. Environment International. 26:409-411.
67. VENOSA, A. ; STEPHEN, J. ; MACNAUGHTON, S. ; CHANG, Y. ; WHITE,
D.. 1999. Microbial populations changes during bioremediation of an
experimental oil spill. Microbial Biosystems: New Frontiers. Atlantic
Canada Society for Microbial Ecology. Halifax, Canadá.
W
68. WEBER, W. ; YOUNG, T.; HILLERS, A.. 1998. Microscale heterogeneities
in soil properties and their effects on contaminant sorption and
bioavailability. En : Bioremediation : Principles and Practice. Volumen I :
Fundamentals and Applications. Editado por Sikdar, S. e Irvine, R..
Technomic Publication. Pennsylvania, Estados Unidos. p. 221-257.
69. WRENN, B. ; VENOSA, A.. 1996. Selective enumeration of aromatic and
aliphatic hydrocarbon degrading bacteria by a most-probable-number
procedure. Can. J. Microbiol.. Canadá. 42:252-258.
114