HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - Sebia Electrophoresis

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

Ref. 3010 

2005/03

UTILISATION 

- 1 - 

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - 2005/03 

Le kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 permet la séparation des hémoglobines normales (A et A 2 ) et la détection des principales hémoglobines 

anormales : S ou D et C ou E, par électrophorèse sur gel d’agarose. L’analyse est réalisée sur l’hémolysat de globules rouges lavés. Les hémoglobines 

sont séparées en tampon alcalin (pH 8,5), fixées par la chaleur ou en milieu alcool / acide et colorées par une solution d’amidoschwarz. L’excès de 

colorant est éliminé en milieu acide. 

Le gel est alors prêt pour l’identification des différentes hémoglobines. L’analyse qualitative des hémoglobines normales et anormales peut être 

réalisée. La densitométrie donne une quantification relative précise de chaque zone individualisée dont les hémoglobines présentant un intérêt 

particulier, telles que l’hémoglobine A 2 pour le diagnostic des ß thalassémies. L’électrophorèse sur gel acide du kit HYDRAGEL ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) K20, permet de confirmer l’identification des variants de l’hémoglobine, en particulier, de différencier l’hémoglobine S de 

l’hémoglobine D et l’hémoglobine E de l’hémoglobine C. 

Chaque gel d’agarose contenu dans le kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 est prévu pour l’analyse de 7 échantillons. 

À usage in vitro exclusivement. 

PRINCIPE DU TEST 

L’hémoglobine est une molécule complexe composée de quatre chaînes polypeptidiques, identiques deux à deux, chaque chaîne étant liée à l’hème, 

noyau tétrapyrrolique (porphyrine) lié à un atome de fer. L’hème est commun à toutes les hémoglobines. La partie protéique responsable du type 

d’hémoglobine est appelée globine. On connaît principalement les chaînes polypeptidiques α, ß, δ et γ. Chez l'homme, on peut trouver les 

hémoglobines normales suivantes : 

• hémoglobine A ................................... = α 2 ß 2 

• hémoglobine A 2 .................................. = α 2 δ 2 

• hémoglobine fœtale F ........................ = α 2 γ 2 

La chaîne α est commune à ces trois hémoglobines. 

La structure spatiale de l’hémoglobine (comme celle de toutes les protéines) dépend de la nature et de la séquence des acides aminés constituant 

les chaînes. Les liaisons qui se forment entre les différents acides aminés sont responsables de la forme de la molécule, de sa stabilité et de ses 

propriétés. Placées dans un champ électrique, les hémoglobines se déplacent en fonction de leur charge, de la taille de la molécule, de la force 

ionique, du pH du tampon et de la nature du support. Les variants de l’hémoglobine sont dus à des mutations de certains acides aminés entraînant 

des charges de surface différentes et donc des mobilités différentes en électrophorèse. 

Les anomalies de l’hémoglobine sont de deux sortes : 

• anomalies qualitatives ou de structure constituant le groupe des hémoglobinopathies ; 

• anomalies quantitatives ou de régulation constituant le groupe des thalassémies. 

RÉACTIFS FOURNIS DANS LE KIT HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

| COMPOSANTS | RÉF. N° 3010 | 

| Gels d’agarose (prêts à l’emploi) | 10 gels | 

| Tampon Tris-Barbital (solution concentrée) | 3 fl. de 75 mL | 

| Diluant colorant (solution concentrée) | 1 fl. de 60 mL | 

| Colorant amidoschwarz (solution concentrée) | 1 fl. de 20 mL | 

| Décolorant (solution concentrée) | 1 fl. de 100 mL | 

| Solution hémolysante (prête à l’emploi) | 1 fl. de 20 mL | 

| Applicateurs 7 dents (prêts à l’emploi) | 1 boîte de 10 

| 

| 

Papiers-filtres fins | 1 sachet de 10 | 

POUR DES RÉSULTATS OPTIMUMS 

Les éléments d’un même kit doivent être utilisés ensemble et selon les instructions de la notice. 

LIRE ATTENTIVEMENT LA NOTICE D’UTILISATION. 

1. GELS D’AGAROSE 

Préparation 

Les gels d’agarose sont prêts à l’emploi. Chaque gel contient : agarose, 8 g/L ; tampon alcalin, pH 8,5 ± 0,1 ; composants sans danger aux 

concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales. 

Utilisation 

Support pour l’électrophorèse des hémoglobines. 

Conservation, stabilité et signes de détérioration 

Les gels doivent être conservés à température ambiante (de 15 à 30 °C) ou au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Ils sont stables jusqu’à la date 

d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet du gel. Les gels doivent être conservés horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur 

le devant du kit doit être pointée vers le haut). Ne pas stocker les gels à proximité d’une fenêtre ou d’une source de chaleur. Éviter toute variation 

brutale de température. 

NE PAS CONGELER. 

Éliminer le gel dans les cas suivants : 

(i) apparition de cristaux, de précipité en surface du gel ou texture du gel très molle (indiquant que le gel a gelé) ; 

(ii) apparition de bactéries ou de moisissures ; 

(iii) présence anormale de liquide dans la boîte du gel (indiquant une exsudation du gel liée à de mauvaises conditions de conservation). 

NOTICE D’UTILISATION SEBIA - Français

- 2 - 


2. TAMPON TRIS-BARBITAL 

Préparation 

Chaque flacon de tampon concentré doit être complété à 1 litre avec de l’eau distillée ou déminéralisée. 

Après dilution, la solution contient : tampon tris-barbital, pH 9,2 ± 0,3 ; azoture de sodium. 

ATTENTION : Le tampon concentré contient 2,45 % de barbital, 13,73 % de barbital sodé et 0,13 % d’azoture de sodium. Ne pas avaler ! En cas 

d’ingestion, consulter immédiatement un médecin ! L’azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas de contact 

avec des acides, du plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des solutions, laver abondamment avec une grande quantité d’eau. 

Utilisation 

Tampon d’électrophorèse. 


Le tampon concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable pendant plusieurs années et au minimum jusqu’à 

la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de tampon. 

Le tampon dilué est stable pendant un an à température ambiante en flacon fermé. 

Éliminer le tampon dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. 

3. DILUANT COLORANT 

Préparation 

Le diluant colorant concentré doit être utilisé comme décrit dans le paragrahe " COLORANT AMIDOSCHWARZ ". Il contient une solution acide. 

Utilisation 

Pour la préparation du colorant amidoschwarz. 


Le diluant colorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le 

kit ou sur l’étiquette du flacon de diluant. NE PAS CONGELER. 

Ne pas ajouter d’azoture de sodium. 

4. COLORANT AMIDOSCHWARZ 

Préparation 

Le colorant amidoschwarz concentré est une solution visqueuse qui peut éventuellement gélifier, ce qui n’affecte absolument pas la qualité de la 

solution finale et son pouvoir de coloration. 

Dans tous les cas, pour obtenir une parfaite reconstitution du colorant, il faut respecter le protocole suivant : 

1. Ajouter environ 15 mL de diluant colorant au flacon d’amidoschwarz concentré. 

2. Refermer soigneusement le flacon. 

3. Agiter très vigoureusement le flacon pendant au minimum 5 secondes. 

4. Verser la solution obtenue dans le récipient de préparation de la solution de coloration. 

5. Renouveler cette opération deux fois, trois fois, si nécessaire. 

6. Verser le reste du diluant dans le récipient de préparation de la solution de coloration. 

7. Compléter à 300 mL avec de l’eau distillée ou déminéralisée. 

8. Agiter parfaitement cette solution pendant 5 à 10 minutes. 

Le colorant est prêt à l’emploi. 

Après dilution, la solution colorante contient : solution acide pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; éthylène-glycol, 6,7 % ; composants sans danger aux 

concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales. 

ATTENTION : Nocif en cas d’ingestion. 

Utilisation 

Pour la coloration des gels après séparation électrophorétique des protéines. 

IMPORTANT : Le colorant est uniquement destiné à la coloration de 10 gels. Renouveler le colorant après 10 utilisations. 


Les solutions de colorant concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés pour éviter 

l’évaporation. La solution concentrée est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de colorant. 

La solution diluée est stable pendant 1 mois. 

Ne pas stocker la solution de colorant diluée à proximité d’une source de chaleur. 

5. DÉCOLORANT 

Préparation 

Le flacon de décolorant concentré doit être dilué au 1/1000 avec de l’eau distillée ou déminéralisée, il permet d'obtenir 100 litres de solution 

décolorante. 

Prélever par quantité de 1 mL et compléter à 1 litre avec de l’eau distillée ou déminéralisée. 

Après dilution, la solution décolorante contient : acide citrique, 0,5 g/L. 

Utilisation 

Pour la décoloration, c’est-à-dire l’élimination de l’excès de colorant après coloration du gel. 


Le décolorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou 

sur l’étiquette du flacon de décolorant. 

Le décolorant dilué est stable pendant 1 semaine à température ambiante, en flacon fermé. 

Éliminer le décolorant dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. 

Ne pas ajouter d'azoture de sodium. 

En cas de conservation prolongée (au delà d’une semaine) de la solution diluée, ajouter 50 µL/L de ProClin 300 pour prévenir toute prolifération 

microbienne. 

Le décolorant dilué contenant du ProClin est stable en flacon fermé à température ambiante ou au réfrigérateur jusqu’à la date d’expiration indiquée 

sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de décolorant.

6. SOLUTION HÉMOLYSANTE 

- 3 - 


Préparation 

La solution hémolysante est prête à l’emploi. C’est un tampon avec des composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des 

performances optimales. 

Utilisation 

Pour l’hémolyse des globules rouges. 


La solution hémolysante peut être conservée à température ambiante ou au réfrigérateur. Elle est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le 

kit ou sur l’étiquette du flacon de solution hémolysante. 

Éliminer la solution hémolysante s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. 

7. APPLICATEURS 

Utilisation 

Applicateurs prédécoupés, à usage unique pour le dépôt des échantillons. 

Conservation 

Les applicateurs doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur. 

8. PAPIERS-FILTRES FINS 

Utilisation 

Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons. 

Conservation 

Les papiers-filtres fins doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur. 

RÉACTIFS NÉCESSAIRES NON FOURNIS 

1. EAU PHYSIOLOGIQUE 

Préparation 

Solution de NaCl 0,15 M (9 g/L) dans l’eau distillée ou déminéralisée. 

Utilisation 

Pour le lavage des globules rouges. 


La solution d’eau physiologique peut être conservée à température ambiante ou au réfrigérateur. 

Éliminer la solution après 3 mois ou s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. Pour une 

conservation prolongée, ajouter 1 g/L d’azoture de sodium. 

2. SOLUTION DE FIXATION (facultatif) 

Préparation 

Au minimum 15 minutes avant l’utilisation, préparer une solution contenant (vol./vol.) : 60 % d’éthanol, 10 % d’acide acétique et 30 % d’eau distillée 

ou déminéralisée. Bien mélanger. 

Utilisation 

Pour la fixation des hémoglobines séparées par électrophorèse en gel d’agarose. 


La solution de fixation doit être conservée à température ambiante dans un récipient hermétiquement fermé pour éviter l’évaporation. Éliminer la 

solution après 3 mois. 

Ne pas fixer plus de 4 gels dans 150 mL de solution de fixation. 

ÉQUIPEMENT ET ACCESSOIRES NÉCESSAIRES 

1. Générateur de courant : GD 61 D SEBIA, référence N° 1300 ; GD 251 D SEBIA, référence N° 1301 ; MG 300 SEBIA, référence N° 1302 ou 

MG 500 SEBIA, référence N° 1303. 

2. APPLICATEUR HYDRAGEL K20 SEBIA, référence N° 1409, contenant le porte-applicateur HYDRAGEL K20. 

3. Chambre humide, référence N° 1270. 

4. Cuve d’électrophorèse : K20 SEBIA, référence N° 1400. 

5. Bacs et portoirs pour le traitement des demi-gels : kit accessoires HYDRAGEL K20 SEBIA, référence N° 1420. 

6. Pipettes de 5 µL, 10 µL et 200 µL. 

7. Incubateur-sécheur : IS 80 SEBIA, référence N° 1430. 

8. Densitomètre / scanner capable de lire un film de 82 x 51 mm à 570 nm (filtre jaune) : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ou scanner équipé du logiciel 

PHORESIS SEBIA. Se reporter aux instructions de chaque appareil pour son utilisation et sa calibration. 

ÉCHANTILLONS À ANALYSER 

Prélèvement et conservation des échantillons 

L’analyse se fait sur sangs frais, prélevés sur anticoagulant (EDTA, citrate ou héparine). Éviter les anticoagulants contenant de l'iodoacétate. Les 

sangs doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire d’analyses cliniques. 

Les sangs peuvent être conservés moins de cinq jours au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C).

- 4 - 


Préparation des échantillons 

• Agiter le tube primaire avant de prélever le volume de sang total à traiter. 

• Centrifuger le sang total, pendant 5 minutes à 5 000 tr/min. 

• Éliminer le plasma. 

• Laver 2 fois les globules rouges par 10 volumes d’eau physiologique. Les volumes de globules rouges inférieurs à 10 µL doivent être manipulés 

avec précaution. 

• Éliminer l’excès d’eau physiologique à la surface du culot globulaire lavé, les agiter au vortex avant de prélever les 10 µL à hémolyser. 

• Hémolyser 10 µL de globules rouges par 130 µL de solution hémolysante. 

• Agiter au vortex pendant 10 secondes puis incuber 5 minutes à température ambiante. 

NOTES : 

- Pour des sujets anémiés, la quantité de globules rouges hémolysés peut-être augmentée : 

- 15 µL pour des sujets moyennement anémiés (environ 0,1 g/mL Hb) ; 

- 20 µL pour des sujets fortement anémiés (moins de 0,07 g/mL Hb) ; et 130 µL de solution hémolysante. 

L’intensité des fractions sera augmentée sans modifier la proportion de chaque fraction. 

- Il n’est pas nécessaire de filtrer ni de centrifuger les hémolysats. 

- La solution hémolysante n’affecte pas l’hémoglobine instable Bart. 

- En cas de suspicion d’hémoglobine H, il est conseillé de préparer un hémolysat plus concentré, par exemple 10 µL de globules rouges et 30 µL 

de solution hémolysante. 

TECHNIQUE 

I. MIGRATION 

1. Poser le porte-applicateur HYDRAGEL K20 à plat sur la paillasse (Fig. 1) et relever le chariot porte-applicateur. 

2. Déposer 120 µL d’eau distillée ou déminéralisée sur le plateau du porte-applicateur dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié. 

3. Sortir le gel de son emballage. 

4. Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin. 

ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation. 

5. Placer le gel (face orientée vers le haut) sur le plateau du porte-applicateur contre la barrette, à l’intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 2). 

6. Donner une forme concave au gel (Fig. 2) et le dérouler sur le plateau jusqu’au contact de la goutte d’eau qui doit se répartir sur toute la 

largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d’air éventuellement piégées, puis dérouler totalement le gel au contact du 

plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film. 

7. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en position intermédiaire, la manette située sur le côté du porte-applicateur en position haute. 

8. Poser un applicateur à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 3). 

9. Déposer 10 µL d’échantillon hémolysé dans chaque puits. Le chargement de l’applicateur ne doit pas excéder 2 minutes. 

L’applicateur doit être utilisé immédiatement après le chargement. 

Pour un dépôt différé (8 heures maximum), placer l’applicateur dans la chambre humide dents vers le haut (en manipulant l’applicateur par la 

protection en plastique), placer la chambre humide au réfrigérateur et ne placer le gel sur le porte-applicateur HYDRAGEL K20 qu’au moment 

de l’utilisation. 

Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation. 

10. Éliminer la protection des dents de l’applicateur. 

11. Placer l'applicateur en position n° 4 sur le porte-applicateur. 

IMPORTANT : Les numérotations de l’applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4). 

12. Abaisser le chariot porte-applicateur jusqu’en butée, à l’aide de la manette du porte-applicateur pour amener l’applicateur au contact du gel. 

NE PAS FORCER LA DESCENTE DU CHARIOT. 

13. Après 1 minute d’application, tourner la manette du porte-applicateur pour relever l’applicateur et le jeter. 

14. Placer le gel dans la cuve d’électrophorèse, selon la polarité indiquée sur le gel, bas du gel côté cathodique. 

Positionner l’HYDRAGEL sur le portoir de la cuve K20. La face gel est orientée vers le bas et le gel plonge dans le tampon sur une distance 

de 1 cm de chaque côté. 

Voir la notice de la cuve K20 pour les instructions d’utilisation. 

15. Brancher la cuve au générateur. 

| CONDITIONS DE MIGRATION | SEBIA K20 | 

| Volume de tampon par compartiment | 150 mL | 

| Volume total de tampon | 300 mL | 

| Temps de migration | 15 minutes | 

| Voltage constant | 165 V 

| 

| 

Ampérage de départ (par gel) | 7 ± 2 mA | 

16. Après migration, débrancher la cuve et sortir le gel. 

II. FIXATION 

Elle peut se faire de deux façons : fixation à la chaleur ou à l’aide de la solution de fixation. 

Fixation à la chaleur (uniquement avec l’incubateur-sécheur IS 80 SEBIA) : 

Sécher le gel sous air chaud à 80 °C dans l’incubateur-sécheur IS 80 jusqu'à séchage complet (pendant 10 minutes minimum).

Fixation avec la solution de fixation : 

1. Placer le gel dans un portoir (fourni dans le kit accessoires HYDRAGEL K20 SEBIA). 

2. Remplir un bac (fourni dans le kit accessoires HYDRAGEL K20 SEBIA) avec 150 mL de solution de fixation. 

3. Immerger le gel dans la solution de fixation pendant 15 minutes. 

4. Sortir le gel et le sécher sous air chaud à 80 °C dans l’incubateur-sécheur. 

IMPORTANT : Le gel doit être parfaitement sec. 

- 5 - 


III. COLORATION - DÉCOLORATION 

1. Immerger le gel sec et refroidi dans la solution colorante pendant 5 minutes. 

2. Décolorer par trois bains successifs minimum de décolorant jusqu’à obtention d’un fond parfaitement clair. 

3. Éliminer l’excès de liquide en surface du gel avec un papier ouaté et sécher le gel sous air chaud à 80 °C. Si nécessaire, nettoyer le dos du 

gel (support plastique) avec un papier ouaté humide. 

IV. LECTURE 

Lire au densitomètre / scanner avec un filtre jaune ou à 570 nm : sur les densitomètres HYRYS ou DVSE, positionner la fraction A 2 sur le repère 5 mm 

du plateau de lecture de façon à placer le zéro sur le point le plus bas entre la fraction anhydrase carbonique et la fraction A 2 . 

NOTE : Afin d’assurer les résultats les plus exacts et cohérents : 

- Ajuster la longueur de lecture à 30 mm de façon à inclure le profil électrophorétique entier. 

- Positionner les minima de façon à encadrer au plus près la fraction A 2 . 

Il est recommandé d’analyser les profils électrophorétiques le plus rapidement possible. Les gels conservés à l’obscurité, dans un endroit sec et à 

l’abri de toute source de chaleur peuvent être interprétés qualitativement dans un délai de trois mois. 

RÉSULTATS 

Contrôle Qualité 

Pour chaque série d’analyses, il est recommandé d’inclure un sang de contrôle ou un échantillon de contrôle contenant des hémoglobines A, F, S 

et C. 

Valeurs 

La lecture à 570 nm par densitométrie permet de définir les concentrations relatives (pourcentages) de chaque fraction. 

Les valeurs normales (moyennes ± 2 écarts types) pour chaque fraction dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, ont été établies à 

partir d’une population de 200 adultes (hommes et femmes), en bonne santé : 

Hémoglobine A ≥ 96,5 % 

Hémoglobine F < 2,0 % (*) 

Hémoglobine A2 ≤ 3,5 % 

(*) cf Interférences et limites 

Il est recommandé à chaque laboratoire d’établir ses propres valeurs normales. 

Interprétation 

1. Anomalies qualitatives : Hémoglobinopathies 

La plupart sont des anomalies de structure, dues au remplacement par mutation d'un acide aminé par un autre sur l'une ou l'autre chaîne. Les 

conséquences de la mutation varient suivant la position de l'acide aminé muté et de celui qui le remplace, l'intégrité de certaines parties de la molécule 

étant plus particulièrement nécessaire à sa viabilité et à son bon fonctionnement. 

Plus de 200 variants de l'hémoglobine adulte sont actuellement définis et décrits. Les premières hémoglobines anormales étudiées, et les plus 

nombreuses, sont dues à une modification de la charge électrique globale de la molécule, entraînant une détection facile par électrophorèse. 

Quatre hémoglobines anormales principales présentent un intérêt particulier, d'un point de vue anthropologique et médical : S, C, E et D. 

Le kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 est destiné à la détection des hémoglobinopathies et des thalassémies. Dès qu’une anomalie est détectée, 

il est conseillé de la confirmer à l’aide de tests complémentaires tels que l’électrophorèse sur gel acide. 

Hémoglobine S 

La plus fréquente, due à une mutation d’un acide glutamique de la chaîne ß (acide aminé acide) par une valine (acide aminé neutre) : la mobilité est 

dans ce cas diminuée. Dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, en tampon alcalin, l'hémoglobine S migre en position médiane entre 

les fractions A et A 2 . 

Hémoglobine C 

La mutation est due à un acide glutamique de la chaîne ß, remplacé par une Iysine (acide aminé basique), la mobilité est dans ce cas très réduite. 

Dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, les hémoglobines C et E se trouvent parfaitement superposées à la fraction A 2 . Quand cette 

fraction est supérieure à 15 %, la présence d’hémoglobines C et E peut alors être suspectée. 

Hémoglobine E 

Un acide glutamique de la chaîne ß est remplacé par une Iysine. Dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, cette hémoglobine migre 

exactement comme l'hémoglobine C. En tampon acide [technique HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20], elle ne se sépare pas des 

hémoglobines A et A 2 , ce qui permet de la différencier de l’hémoglobine C. 

Hémoglobine D 

Un acide glutamique de la chaîne ß est remplacé par une glutamine. Dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, cette hémoglobine migre 

exactement comme l'hémoglobine S. En tampon acide [technique HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20], elle ne se sépare pas des 

hémoglobines A et A 2 , ce qui permet de la différencier de l’hémoglobine S.

- 6 - 


2. Anomalies quantitatives : Thalassémies 

Elles constituent un groupe assez hétérogène d'affections génétiques caractérisées par la réduction du taux de synthèse d'une ou de plusieurs 

chaînes de l'hémoglobine. Le mécanisme de cette réduction à l'échelon moléculaire est encore mal connu. 

Il existe différents syndromes thalassémiques : 

Les alpha thalassémies 

Caractérisées par la diminution de synthèse des chaînes α, affectant par conséquent la synthèse des 3 hémoglobines physiologiques. L'excès de 

synthèse des chaînes ß et γ par rapport aux chaînes α provoque la formation de tétramères sans chaîne α : 

• hémoglobine Bart = γ 4, 

• hémoglobine H = ß 4. 

Les bêta thalassémies 

Caractérisées par la diminution de synthèse des chaînes ß. Seule la synthèse de l'hémoglobine A est affectée. 

Les pourcentages des hémoglobines F et A 2 sont donc augmentés par rapport à l’hémoglobine A. 

3. Profils électrophorétiques 

Migration des 

hémoglobines normales 

point d’application 

A0 : fraction non glyquée de l’hémoglobine adulte normale A. 

A1 : fraction glyquée de l’hémoglobine adulte normale A. 

A(A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) 

F 

S - D 

A2 A2 - C - E 

anhydrase carbonique anhydrase carbonique 

Interférences et limites 

• Ne pas utiliser d’échantillon hémolysé. 

• Lorsque la présence d’une hémoglobine anormale, présentant une mobilité électrophorétique différente de celle des variants majeurs de 

l’hémoglobine S, C, D et E, est détectée, il est recommandé d’utiliser d’autres techniques d’identification (par exemple, électrophorèse des chaînes 

de globine) ou de consulter un laboratoire spécialisé. 

• La mesure quantitative de l’hémoglobine F (Hb F) ou de toute autre hémoglobine mineure migrant à proximité des fractions majeures, est 

approximative quand leur concentration représente moins de 2 à 3 % de l’hémoglobine totale. 

• Les échantillons de certains patients ayant une hémoglobine S homozygote et traités à l’Hydrea® (hydroxycarbamide) peuvent présenter une 

hémoglobine F dont la synthèse a été induite par ce traitement. Sur quelques cas observés, cette hémoglobine F induite a une mobilité sur les gels 

HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) légèrement différente de celle de l’hémoglobine F native. 

• Sur certains échantillons conservés plus de 7 jours, il peut être observé une focalisation de la traînée située derrière la fraction Hb A, cette 

focalisation ne doit pas être confondue avec un variant de l’hémoglobine (tel que les hémoglobines H ou Bart). 

Assistance technique 

Contacter le Service Technique SEBIA en cas de test défectueux. 

Les fiches de données de sécurité des différents réactifs du kit ainsi que les informations relatives à l’élimination des déchets sont disponibles auprès 

du Service Technique SEBIA. 

PERFORMANCES 

Migration des hémoglobines 

anormales majeures 

Toutes les mesures densitométriques ont été effectuées à l’aide du densitomètre HYRYS SEBIA. De plus, les profils électrophorétiques ont été 

interprétés qualitativement à l’oeil nu. Les résultats suivants obtenus par analyse quantitative indiquent une très bonne répétabilité et reproductibilité 

du kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 pour tous les aspects testés, avec un coefficient de variation moyen de 2,2 %. 

Reproductibilté intra-essai 

Trois échantillons de sang (un échantillon normal, un échantillon à Hb A2 élevée et un échantillon à Hb C) ont été analysés en répétabilité dans la 

technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 sur des gels d’un même lot. Les profils électrophorétiques ont été analysés par densitométrie et le 

tableau suivant présente les valeurs moyennes (en %), écart-types (ET) et coefficients de variation (CV) obtenus pour chaque fraction de 

l’hémoglobine de ces 3 échantillons. 

NOTE : Quel que soit l’échantillon, aucune discordance n’a été mise en évidence : 

- Échantillon à taux normal en Hb A2 : toutes les valeurs sont normales ; 

- Échantillons à taux élevés en Hb A2 et Hb C : toutes les valeurs sont élevées 

| FRACTION Hb | MOYENNE | ET | CV (%) | 

| Sang normal | 

| Hb A | 97,4 | 0,1 | 0,1 | 

| Hb A | 2 2,6 | 0,1 | 5,3 | 

| Sang à Hb A2 élevée | 

| Hb A | 95,2 | 0,2 | 0,2 | 

| Hb A | 2 4,8 | 0,2 | 4,4 | 

| Sang à Hb C élevée | 

| Hb A | 56,7 | 0,4 | 0,8 | 

| Hb C | 43,3 | 0,4 | 1,0 |

- 7 - 


Reproductibilté inter-essais 

Des échantillons de sang ont été analysés dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 sur 10 gels d’un même lot. 

Parmi les échantillons analysés, se trouvaient 7 échantillons avec hémoglobines anormales (Hb S, Hb F ou Hb C), 2 échantillons avec un taux d’Hb A 2 

élevé, les autres échantillons étant normaux. Les valeurs moyennes (en %), écart-types (ET) et coefficients de variation (CV) ont été déterminés pour 

chaque fraction de l’hémoglobine des échantillons. Le tableau suivant présente les limites des valeurs moyennes, ET et CV, ainsi que le CV moyen 

représentant l’ensemble de chaque fraction. 

NOTE : Quel que soit l’échantillon, aucune discordance n’a été mise en évidence : 

- Échantillons à taux normal en Hb A 2 : toutes les valeurs sont normales ; 

- Échantillons à taux élevés en Hb A 2 : toutes les valeurs sont élevées. 

| FRACTION Hb | MOYENNE | ET | CV (%) | CV MOYEN (%) | 

| Hb A | 18,0 - 97,8 | 0,1 - 1,0 | 0,1 - 4,0 | 0,8 | 

| Hb F | 13,3 - 76,3 | 0,5 - 0,6 | 0,7 - 3,4 | 1,8 | 

| Hb C | 21,5 - 43,5 | 0,2 - 0,3 | 0,6 - 1,1 | 0,8 | 

| Hb S/D | 9,7 - 84,1 | 0,1 - 0,6 | 0,4 - 2,6 | 1,1 

| | 

Hb A | 2 2,2 - 5,7 | 0,1 - 0,2 | 2,3 - 7,6 | 4,0 | 

Exactitude - Détection d’hémoglobines anormales 

Soixante trois échantillons de sang ont été analysés dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 et sur un autre système en gel d’agarose 

disponible dans le commerce. Ces échantillons, accompagnés de leur diagnostic clinique établi par électrophorèses sur gel alcalin et sur gel acide 

et/ou par HPLC, ont été fournis par un centre hospitalier. Les résultats obtenus ont montré une parfaite corrélation entre les deux systèmes avec, pour 

la détection des hémoglobines anormales, une sensibilité de 100 % et une spécificité de 100 % par rapport à la technique de référence, calculées 

selon la méthode recommandée (Wendling, 1986). En effet, toutes les hémoglobines anormales ainsi que les taux anormaux d’hémoglobines 

normales ont été détectés dans la technique HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 en accord avec le second système de comparaison sur gel, les 

résultats hospitaliers et le diagnostic clinique. Quel que soit l’échantillon, aucune discordance entre les techniques n’a été mise en évidence, telle que 

la présence de faux positifs (détection d’une Hb anormale inexistante ou d’une Hb à taux normal détectée à un taux anormal). 

Exactitude - Détermination quantitative d’Hb A 2 

Cinquante et un échantillons de sang présentant des taux normaux ou élevés d’Hb A 2 ont été analysés en parallèle dans la technique HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20 et sur un autre système en gel d’agarose disponible dans le commerce, avec densitométrie des profils électrophorétiques 

obtenus. 

La corrélation entre ces deux techniques sur le taux d’Hb A 2 a été déterminée à l’aide d’outils statistiques : moyenne et coefficient de régression 

linéaire. Les paramètres de corrélation entre ces 2 systèmes d’analyse (y = HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20) sont présentés dans le tableau cidessous. 

| Coefficient de Corrélation | Intersection-y | Pente | Limites des valeurs de % | 

| | | | (système SEBIA) | 

| 0,973 | -0,344 | 0,963 | 1,5 - 5,7 | 

BIBLIOGRAPHIE 

1. Fairbanks V.F., ed. (1980) Hemoglobinopathies and thalassemia: Laboratory methods and case studies. Brian C. Decker, New York. 

2. Galacteros F. (1986) Thalassémie, drépanocytose et autres hémoglobinopathies. Techniques et Biologie, 3, 174-178. 

3. Huisman T.H.J. and. Jonxis J.H.P (1977) The hemoglobinopathies: techniques of identification. Marcel Dekker, New York. 

4. Krauss J.S., Drew P.A., Jonah M.H., Trinh M., Shell S., Black L. and Baisden C.R. (1986) Densitometry and microchromatography compared for 

determination of the hemoglobin C and A 2 proportions in hemoglobin C and hemoglobin SC disease and in hemoglobin C trait. Clin. Chem. 32, 5, 

860-863. 

5. Livingstone C. (1986) The hemoglobinopathies. Edit. London. 

6. Maier-Redelsberger M., Girot R. (1989) Diagnostic biologique des maladies de l’hémoglobine. Feuillets de biologie, 170. 

7. Schneider R.G. (1978) Methods for detection of hemoglobin variants and hemoglobinopathies in the routine clinical laboratory. CRC Crit. Rev. Clin. 

Lab. Sci. 9, 243-271. 

8. Vovan L., Lara-Russo D., Orsini A. (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, 780-789. 

9. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. 

Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.

INTENDED USE 

- 8 - 


The HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kit is designed for separation of the normal hemoglobins (A and A 2 ) and for the detection of the major 

hemoglobin variants: S or D and C or E, by electrophoresis on alkaline agarose gels. The resulting electrophoregrams are evaluated visually for pattern 

abnormalities. Densitometry can serve as an aid in the interpretation by providing relative concentrations of individual fractions. Electrophoresis on 

acidic gel, e.g., HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20 procedure, should follow to confirm the identification of hemoglobin variants, in particular, 

to differentiate hemoglobins S from D and E from C. 

Each agarose gel in the HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kit is intended to run 7 samples. 

For In Vitro Diagnostic Use. 

PRINCIPLE OF THE TEST 

Hemoglobin is a complex molecule composed of two pairs of polypeptide chains. Each chain is linked to the heme, a tetrapyrrolic nucleus (porphyrin) 

which chelates an iron atom. The heme part is common to all hemoglobins and their variants. The type of hemoglobin is determined by the protein 

part called globin. Polypeptide chains α, ß, δ and γ constitute the normal human hemoglobins: 

• hemoglobin A ..................................... = α 2 ß 2 

• hemoglobin A 2 .................................... = α 2 δ 2 

• fetal hemoglobin F ............................. = α 2 γ 2 

The α-chain is common to these three hemoglobins. 

The hemoglobin spatial structure and other molecular properties (as that of all proteins) depend on the nature and the sequence of the amino acids 

forming the chains. Substitution of amino acids by mutation is responsible for formation of hemoglobin variants which have different surface charge 

and consequently different electrophoretic mobilities, which also depend on the pH and ionic strength of the buffer. 

The resulting qualitative (or structural) abnormalities are called hemoglobinopathies. Decreased synthesis of one of the hemoglobin chains leads to 

quantitative (or regulation) abnormalities, called thalassemias. 

The assay is performed on hemolyzed washed red blood cells. The hemoglobins are separated by electrophoresis on alkaline gels and the fractions 

are visualized by staining with amidoblack. The dried gels are ready for interpretation. 

REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED IN THE HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 KIT 

| ITEMS | PN 3010 | 

| Agarose Gels (ready to use) | 10 gels | 

| Tris-Barbital Buffer (stock solution) | 3 vials, 75 mL each | 

| Staining solution diluent (stock solution) | 1 vial, 60 mL | 

| Amidoblack Stain (stock solution) | 1 vial, 20 mL | 

| Destaining Solution (stock solution) | 1 vial, 100 mL | 

| Hemolysing solution (ready to use) | 1 vial, 20 mL | 

| Applicators 7 teeth (ready to use) | 1 pack of 10 

| | 

Filter Papers -Thin | 1 pack of 10 | 

FOR OPTIMAL RESULTS 

All reagents from the same kit must be always used together and according to the package insert instructions. 

PLEASE READ THE PACKAGE INSERT CAREFULLY. 

1. AGAROSE GELS 

Preparation 

Agarose gels are ready to use. Each gel contains: agarose, 0.8 g/dL ; alkaline buffer pH 8.5 ± 0.1 ; additives, nonhazardous at concentrations used, 

necessary for optimum performance. 

Use 

Support medium for hemoglobin electrophoresis. 

Storage, stability and signs of deterioration 

Store the gels horizontally in the original protective packaging at room temperature (15 to 30 °C) or refrigerated (2 to 8 °C). (The arrow on the front of 

the kit box must be pointing upwards). Avoid obvious temperature fluctuations during storage (e.g., do not store close to a window or a heat source). 

The gels are stable until the expiration date indicated on the kit package or the gel package labels. 

DO NOT FREEZE. 

Discard gel when: 

(i) crystals or precipitate form on the gel surface or the gel texture becomes very soft (all these result from freezing the gel), 

(ii) bacterial or mold growth is indicated, 

(iii) abnormal liquid quantity is present in the gel box (as a result of buffer exudation from the gel due to improper storage conditions). 

2. TRIS-BARBITAL BUFFER 

Preparation 

Each vial of the stock buffer solution to be diluted up to 1 liter with distilled or deionized water. 

After dilution, the working solution contains : tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; sodium azide. 

WARNING: Each vial of the stock buffer contains 2.45 % barbital, 13.73 % sodium barbital and 0.13 % sodium azide. Do not ingest ! If 

ingested, consult physician immediately ! Prevent contact with acids, lead or copper, as these are known to form explosive or toxic 

compounds with sodium azide. Always flush with a large quantity of water when disposing. 

SEBIA INSTRUCTIONS - English

- 9 - 


Use 

Electrophoresis buffer. 


Store stock buffer solution at room temperature or refrigerated. Stock solution is stable for several years, at least until the expiration date indicated on 

the kit package or buffer vial labels. Diluted buffer solution is stable for one year at room temperature in a closed bottle. 

Discard diluted buffer if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination. 

3. STAINING SOLUTION DILUENT 

Preparation 

The stock staining solution diluent must be used as described in paragraph " AMIDOBLACK STAIN ". 

It contains an acidic solution. 

Use 

For the preparation of the amidoblack staining solution. 


Store the stock staining solution diluent at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining 

solution diluent vial labels. DO NOT FREEZE. 

Do not add any sodium azide. 

4. AMIDOBLACK STAIN 

Preparation 

The amidoblack concentrated stain is a visquous solution which may gelify. The integrity of the stock staining solution is not altered by the increase in 

viscosity or solidification. 

In all cases, to obtain a perfect reconstitution of the stain, we advise you to respect the following procedure: 

1. Add 15 mL of stain diluent to the concentrated amidoblack vial. 

2. Close carefully the vial. 

3. Shake very vigorously the vial during approximately 5 seconds. 

4. Pour this solution in the container for staining solution processing. 

5. Repeat this step twice, three times if necessary. 

6. Pour the remaining diluent in the container and complete the volume to 300 mL with distilled or deionized water. 

7. Mix contents of stain cubitainer well for 5 to 10 minutes. 

The staining solution is ready to use. 

After dilution, the working staining solution contains: acid solution pH ≈ 2 ; amidoblack, 0.4 g/dL ; ethylene-glycol, 6.7 % ; additives, nonhazardous at 

concentrations used, necessary for optimum performance. 

WARNING: Harmful if swallowed. 

Use 

For staining gels with electrophoretic protein separations. 

IMPORTANT : The staining solution is designed to stain only 10 gels. Change the solution after 10 staining steps. 


Store both stock and working staining solutions at room temperature or refrigerated in closed containers to prevent evaporation. Stock staining solution 

is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining vial labels. 

Working staining solution is stable for 1 month. 

Do not store the working staining solution close to a heat source. 

5. DESTAINING SOLUTION 

Preparation 

Each vial of stock destaining solution to be diluted up to 100 liters with distilled or deionized water. It is convenient to dilute only 1 mL of the stock 

solution to 1 liter. After dilution, the working destaining solution contains: citric acid, 0.05 g/dL. 

Use 

For destaining, that is removal of excess and background stain from the gels. 


Store the stock destaining solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or destaining 

solution vial labels. Working destaining solution is stable for one week at room temperature in a closed bottle. 

Discard working destaining solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination. 

Do not add any sodium azide. 

To prevent microbial proliferation in the diluted destaining solution to be stored more than one week, add 5 µL/dL of ProClin 300. 

Working destaining solution added with ProClin is stable in a closed bottle at room temperature or refrigerated until the expiration date indicated on 

the kit package or destaining solution vial labels. 

6. HEMOLYZING SOLUTION 

Preparation 

Hemolyzing Solution is ready to use. It is a buffer with additives, nonhazardous at the concentration used, necessary for optimum performance. 

Use 

To hemolyze red blood cells. 


Store Hemolyzing Solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or Hemolyzing Solution 

vial label. 

Discard Hemolyzing Solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination. 

7. APPLICATORS 

Use 

Precut, single use applicators for sample application.

Storage 

Store the applicators in a dry place at room temperature or refrigerated. 

8. FILTER PAPERS - THIN 

Use 

Single use, thin absorbent paper pads for blotting excessive moisture off the gel surface before sample application. 

Storage 

Store the thin filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated. 

REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 

- 10 - 


1. SALINE 

Preparation 

Make 0.15 M (0.9 g/dL) NaCl solution in distilled or deionized water. 

Use 

To wash red blood cells. 


Store saline at room temperature or refrigerated. Discard after 3 months or if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial 

contamination. For longer storage periods, add sodium azide, 0.1 g/dL. 

2. FIXATIVE SOLUTION (optional) 

Preparation 

At least 15 minutes before use, prepare a solution containing (vol. / vol.): 60 % ethanol ; 10 % acetic acid and 30 % distilled or deionized water. 

Mix well. 

Use 

To fix electrophoretic hemoglobin separations in agarose gel plates. 


Store fixative solution at room temperature tightly capped to prevent evaporation. Discard after 3 months. Do not fix more than 4 gels in each 150 mL 

of fixative solution. 

EQUIPMENT AND ACCESSORIES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 

1. Power supply: GD 61 D SEBIA, PN 1300 ; GD 251 D SEBIA, PN 1301 ; MG 300 SEBIA, PN 1302 or MG 500 SEBIA, PN 1303. 

2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, PN 1409, containing the HYDRAGEL K20 applicator carrier. 

3. Wet Storage Chamber, PN 1270. 

4. Electrophoresis chamber: K20 SEBIA, PN 1400. 

5. Tanks and Gel Holders for processing of gel plates: HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, PN 1420. 

6. Pipettes: 5 µL, 10 µL and 200 µL. 

7. Incubator-Dryer: IS 80 SEBIA, PN 1430. 

8. Densitometer / flat-bed scanner able to scan 82 x 51 mm gel plates at 570 nm (yellow filter) : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA or PHORESIS software 

for flat-bed scanner. Refer to manufacturer’s instructions for operation and calibration procedures. 

SAMPLES FOR ANALYSIS 

Sample collection and storage 

Fresh anticoagulated blood samples are recommended for analysis. Common anticoagulants such as those containing EDTA, citrate or heparin are 

acceptable ; avoid those with iodoacetate. Blood must be collected according to established procedures used in clinical laboratory testing. If needed, 

store samples at 2 to 8 °C for up to 5 days. 

Sample preparation 

• Mix the collection tube before taking the blood to prepare. 

• Centrifuge anticoagulated blood at 5 000 rpm for 5 minutes. 

• Discard the plasma. 

• Wash the red blood cells 2 times with 10 volumes of saline ; great care must be taken when processing volumes of red blood cells smaller than 

10 µL. 

• Discard the excess of saline over the red blood cells pellet and vortex them before taking 10 µL to hemolyze. 

• Hemolyze 10 µL packed red cells with 130 µL Hemolyzing Solution. 

• Vortex for 10 seconds and incubate 5 minutes at room temperature. 

NOTES: 

- To prepare hemolysate from subjects, mildly anemic (approximately 10 g/dL Hb) or severely anemic (< 7 g/dL Hb), the volume of packed 

RBC may be increased to 15 µL and 20 µL, respectively. The staining intensity will thus increase but relative concentrations of individual 

fractions will not change. 

- The hemolyzate need not be filtered or centrifuged. 

- The SEBIA’s hemolyzing solution does not affect the unstable hemoglobin Bart’s.

PROCEDURE 

- 11 - 


I. MIGRATION STEP 

1. Place the HYDRAGEL K20 applicator carrier on a flat surface (Fig. 1) and raise the part of the applicator carrier with the numbered notches. 

2. Pool 120 µL distilled or deionized water on the lower third of the frame printed on the HYDRAGEL K20 applicator carrier. 

3. Unpack the HYDRAGEL agarose gel plate. 

4. Roll quickly and uniformly one thin filter paper onto the gel surface to absorb the excess of liquid. Remove the paper immediately. 

WARNING: Do not leave the filter paper for a too long contact with the gel to avoid its dehydration. 

5. Place the gel plate (the gel side up) with its edge against the stop at the bottom of the printed frame (Fig. 2). 

6. Bend the gel and lower it down onto the water pool (Fig. 2). Ensure that no air bubbles are trapped, water is spread underneath the entire gel 

plate and the gel is lined up with the printed frame. 

7. Lower the applicator carrier with the numbered notches down to the intermediate position with the switch in high position. 

8. Place one applicator on a flat surface with the well numbers in the right-side-up position (Fig. 3). 

9. Apply 10 µL of hemolyzed sample into the applicator wells. Load the applicator within 2 minutes. 

- Use the applicator without any delay. 

- For later use (up to 8 hours), place the applicator into the wet storage chamber with the teeth up [handle it by the plastic tooth protection 

frame], keep the entire chamber under refrigeration and set-up the gel plate onto the HYDRAGEL K20 applicator carrier just before use. 

See wet chamber package insert for further details. 

10. Snap off the applicator teeth's protection frame. 

11. Place the sample applicator into position No. 4 on the applicator carrier. 

IMPORTANT: The numbers printed on the sample applicator must face the operator (Fig. 4). 

12. Lower the applicator carrier with the switch so that the applicator contacts the gel surface. DO NOT FORCE THE CARRIERS ALL THE WAY 

DOWN. 

13. After 1 minute, turn the switch to rise up the applicator, remove the applicator and discard. 

14. Put the gel into an appropriate electrophoresis chamber, according to the polarity indicated on the gel, the lower side of the gel on the cathodic 

side. 

When using SEBIA K20 chamber, place the HYDRAGEL on the bridge with the gel side facing down ; the gel should dip about 1 cm into the 

buffer on each side. 

See K20 chamber package insert for further details. 

15. Plug the chamber to the power supply. 

| MIGRATION CONDITIONS | SEBIA K20 | 

| Volume of buffer per compartment | 150 mL | 

| Total buffer volume | 300 mL | 

| Migration time | 15 minutes | 

| Constant voltage | 165 V 

| 

| 

Initial current (per gel) | 7 ± 2 mA | 

16. After migration, unplug the chamber and remove the gel plate. 

II. FIXATION 

Process gels according to one of the following procedures. 

Hot air fixation (recommended only with SEBIA IS 80 Incubator-Dryer) : 

Dry the gel completely in the incubator-dryer at 80 °C (for 10 minutes minimum). 

Fixation with fixative solution : 

1. Place the gel into a gel holder (supplied with SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kit) for further processing. 

2. Fill one tank (supplied with SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kit) with 150 mL of fixative solution. 

3. Immerse the gel in the fixative solution for 15 minutes. 

4. Remove the gel and dry it with hot 80 °C air flow in incubator-dryer IS 80. 

IMPORTANT : The gel must be perfectly dry. 

III. STAINING - DESTAINING 

1. Immerse the dried and cooled gel in the staining solution for 5 minutes. 

2. Destain in three successive baths of destaining solution until the background is completely colorless and clear. 

3. Soak up excess liquid on the gel surface with a tissue paper and dry the gel with hot 80 °C air. If needed, clean the back side (the plastic 

support side) of the dry film with a wet tissue paper. 

IV. SCANNING 

Scan using a densitometer / scanner at 570 nm or with a yellow filter. When using HYRYS or DVSE, densitometers, position the A 2 fraction on the 

5 mm mark of the scanning plate: the background zero is made between the A 2 and carbonic anhydrase fractions at the lowest point. 

NOTE : To assure the most accurate and consistent results, do the following: 

- Adjust the scan length to include the entire electrophoretic pattern (≈ 30 mm). 

- Make sure the minima on both sides of A 2 fraction are positioned at the very feet of the A 2 peak. 

It is a good practice to read the stained gels without delay. For future reference, they can be stored in a protective cover in a dry, dark place away from 

sources of heat and visually interpreted within at least 3 months.

RESULTS 

- 12 - 


Quality Control 

It is advised to include an assayed control blood or assayed blood sample containing hemoglobins A, F, C and S into each run of samples. 

Values 

Densitometer scanning of stained electrophoregrams yields relative concentrations (percentages) of individual hemoglobin zones. 

Normal values (mean ± 2 SD) using HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure have been established from a healthy population of 200 adults 

(men and women): 

Hemoglobin A ≥ 96.5 % 

Hemoglobin F < 2.0 % (*) 

Hemoglobin A2 ≤ 3.5 % 

(*) see Interference and Limitations 

It is recommended each laboratory establishes its own normal values. 

Interpretation 

1. Qualitative abnormalities: Hemoglobinopathies 

Most hemoglobinopathies are due to substitution by mutation of a single amino acid in one of the four types of polypeptide chains. The clinical 

significance of such a change depends on the type of amino acid and the site involved. In clinically significant disease, either the α-chain or the 

ß-chain is affected (even γ chains). 

More than 200 variants of adult hemoglobin have been described. The first abnormal hemoglobins studied and the most frequently occuring have an 

altered net electric charge, leading to an easy detection by electrophoresis. 

There are four main abnormal hemoglobins which present a particular clinical interest: S, C, E and D. 

The HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kits are intended for the preliminary identification of hemoglobinopathies and thalassemias. Once an 

abnormal pattern is indicated, its identity should be confirmed by appropriate discriminatory tests (e.g., electrophoresis on acidic agarose gels). 

Hemoglobin S 

Hemoglobin S is the most frequent. It is due to the replacement of one glutamic acid (an acidic amino acid) of the ß-chain by valine (a neutral amino 

acid). Its electrophoretic mobility is therefore slowed down. On alkaline buffered gels, HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, hemoglobin S migrates 

between A and A 2 fractions. 

Hemoglobin C 

One glutamic acid of the ß-chain is replaced by lysine (a basic amino acid): its mobility is strongly reduced. With HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

procedure, C, E and A 2 are superimposed. When this fraction is > 15 %, hemoglobins C and E must be suspected. 

Hemoglobin E 

One glutamic acid of the ß-chain is replaced by lysine: hemoglobin E migrates exactly like hemoglobin C using HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

procedure. Unlike hemoglobin C, it does not separate from hemoglobin A in acidic buffer [HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. This property 

allows to differentiate E and C. 

Hemoglobin D 

One glutamic acid of the ß-chain is replaced by glutamine. With HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure, this hemoglobin migrates exactly like 

hemoglobin S. Hemoglobin D does not separate from hemoglobin A in acidic buffer [HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20] ; this property allows 

to differenciate S and D. 

2. Quantitative abnormalities: Thalassemias 

Thalassemias constitute a quite heterogeneous group of genetic disorders characterized by decreased synthesis of one or several types of the 

polypeptide chains. The molecular mechanism of this decrease has not been fully described. 

There are two types of thalassemia syndromes: 

Alpha-thalassemias 

They are characterized by the decrease of synthesis of the α-chains, consequently affecting the synthesis of all normal hemoglobins. 

The excess of synthesis of the ß- and γ-chains in relation to α-chains chains induces the formation of tetrameres without any α-chain: 

• hemoglobin Bart = γ 4, 

• hemoglobin H = ß 4. 

Beta-thalassemias 

They are characterized by the decrease of synthesis of the ß-chains. Only hemoglobin A synthesis is affected. 

Therefore hemoglobin F and hemoglobin A 2 percentages are increased with respect to hemoglobin A. 

3. Migration patterns 

Migration of normal 

hemoglobins 

A(A0 + A1 ) A (A0 + A1 ) 

F 

S - D 

A2 A2 - C - E 

carbonic anhydrase carbonic anhydrase 

application point 

A0 : The non-glycated fraction of the normal adult hemoglobin A. 

A1 : The glycated fraction of the normal adult hemoglobin A. 

In the above patterns, the cathode is at the bottom the anode at the top. 

Migration of major abnormal 

hemoglobins

- 13 - 


Interference and Limitations 

• Do not use hemolyzed blood samples. 

• When an abnormal hemoglobin is detected, which behaves differently than the major hemoglobin variants S, C, D and E, use other means of 

identification (e.g., isoelectric focusing, globin chain electrophoresis), or consult or send sample to a specialized laboratory. 

• The densitometric assay of Hb F (or of any other minor hemoglobin that migrates in the proximity of major fractions) is semi-quantitative as the 

values become inaccurate at below 2 % - 3 % of the total hemoglobin. 

• Some homozygous "S" subjects receive a "Hydrea"® (hydroxyurea) treatment that can induce synthesis of foetal hemoglobin. The mobility of the 

induced hemoglobin F on HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) has been observed in some cases slightly different from the physiological hemoglobin F. 

• On samples stored more than 7 days, the smear located behind the Hb A fraction may become a concentrated fraction, do not interpret this fraction 

as an hemoglobin variant, e.g., H or Bart hemoglobins. 

Troubleshooting 

Call Technical Service of the supplier when the test fails to perform while the instruction for the preparation and storage of materials, and for the 

procedure were carefully followed. 

Kit reagent Safety Data Sheets and informations on waste products elimination are available from the Technical Service of the supplier. 

PERFORMANCE DATA 

All performance data are based on a study that included SEBIA HYDRAGEL materials and instruments compared to a commercially available agarose 

gel system. In addition, concordance studies were performed where the identity of hemoglobins and their values were established by other recognized 

methodologies. The results of representative examples of the performance studies are presented here. 

All electrophoregrams were interpreted visually. SEBIA’s HYRYS densitometer was used for all densitometric evaluations to complement the visual 

data as appropriate. 

Reproducibility Within Run 

Three blood samples were electrophoresed using HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure on gels from the same lot. Each sample was run in 

all the tracks of a single gel. The following table shows the means, SD and CV for each individual hemoglobin component in the three samples 

calculated from the densitometric per cent values for each track. In addition, none of the repeats showed false positive or false negative values. 

| COMPONENT | MEAN | SD | CV (%) | 

| Normal blood | 

| Hb A | 97.4 | 0.1 | 0.1 | 

| Hb A | 2 2.6 | 0.1 | 5.3 | 

| Elevated Hb A2 | 

| Hb A | 95.2 | 0.2 | 0.2 | 

| Hb A | 2 4.8 | 0.2 | 4.4 | 

| Elevated Hb C | 

| Hb A | 56.7 | 0.4 | 0.8 | 

| Hb C | 43.3 | 0.4 | 1.0 | 

Reproducibility In Between Runs 

Blood samples were electrophoresed using HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure on gels from a single lot. The samples analyzed included 

seven samples with an abnormal hemoglobin (Hb S, Hb F or Hb C), two samples with elevated Hb A 2 and the rest were normal blood samples. The 

means, SD and CV were calculated from the data obtained for each component in each sample. Ranges of the means, SD and CV, and the mean CV 

representing the pool of individual components are tabulated below. In addition, none of the repeats showed false positive or false negative values. 

| COMPONENT | MEAN | SD | CV (%) | MEAN CV (%) | 

| Hb A | 18.0 – 97.8 | 0.1 – 1.0 | 0.1 – 4.0 | 0.8 | 

| Hb F | 13.3 – 76.3 | 0.5 – 0.6 | 0.7 – 3.4 | 1.8 | 

| Hb C | 21.5 – 43.5 | 0.2 – 0.3 | 0.6 – 1.1 | 0.8 | 

| Hb S/D | 9.7 – 84.1 | 0.1 – 0.6 | 0.4 – 2.6 | 1.1 

| | 

Hb A | 2 2.2 – 5.7 | 0.1 – 0.2 | 2.3 – 7.6 | 4.0 | 

Accuracy - Detection of Hemoglobin Abnormalities 

Sixty three different blood samples were analyzed using HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure and another commercially available agarose 

gel system. The blood samples and their diagnostic assessment were provided by a hospital. The diagnosis was based on a routine alkaline gel and 

acid gel electrophoresis and/or HPLC. All abnormal hemoglobins or abnormal levels of normal hemoglobins detected with HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20 procedure were in agreement with the comparative gel system, hospital results and clinical diagnosis. There were no case 

observed of false positive, i.e., detection of an abnormal band or abnormal level of a normal band where no such abnormality existed. 

Accuracy - Quantitative Determination of Hb A 2 

The levels of Hb A 2 were measured in 51 blood samples with normal and elevated levels of Hb A 2 both by densitometry of the electrophoretic 

separations obtained using HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure. The measured values from both procedures were analyzed by a linear 

regression statistical procedure. The results of linear regression analysis are tabulated below (y = HYDRAGEL). 

| Correlation Coefficient | y-Intercept | Slope | Range of % Values | 

| | | | (SEBIA’s system) | 

| 0.973 | -0.344 | 0.963 | 1.5 – 5.7 |

BIBLIOGRAPHY 

- 14 - 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 

8. Vovan L, Lara-Russo D., Orsini A. (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, 780-789.

VERWENDUNGSZWECK 

- 15 - 


Der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Kit dient zur Abtrennung der normalen Hämoglobine (A und A 2 ) und zum Nachweis der 

Haupthämoglobinvarianten: S oder D und C oder E, durch Elektrophorese auf alkalischen Agarosegelen. Die erhaltenen Elektropherogramme werden 

visuell auf abnormale Muster untersucht. Die Densitometrie kann bei der Interpretation als Hilfe dienen, weil mit Ihr relative Konzentrationen 

individueller Banden gemessen werden können. Eine Elektrophorese auf sauren Gelen, z.B. mit der HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20 

Prozedur, sollte zur Bestätigung der identifizierten Hämoglobinvarianten folgen, insbesondere um die Hämoglobine S von D und E von C zu 

unterscheiden. 

Jedes Agarosegel im HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Kit ist für sieben Proben bestimmt. 

Nur für den diagnostischen in vitro Gebrauch. 

TESTPRINZIP 

Hämoglobin ist ein komplexes Molekül und besteht aus zwei Paaren von Polypeptidketten. Jede Kette ist mit der Häm-Gruppe, einem Tetrapyrrolkern 

(Porphyrin,) der als Chelat ein Eisenatom bindet, verbunden. Der Häm-Teil ist in allen Hämoglobinen und ihren Varianten gleich. Der Typ des 

Hämoglobins wird durch den Proteinteil, der Globin genannt wird, bestimmt. Die Polypeptidketten α, ß, δ und γ bilden die normalen Hämoglobine: 

• Hämoglobin A = α 2 ß 2 

• Hämoglobin A2 = α 2 δ 2 

• fötales Hämoglobin F = α 2 γ 2 

Die α-Kette ist bei diesen drei Hämoglobinen gleich. 

Die räumliche Struktur des Hämoglobins und andere molekulare Eigenschaften (wie bei allen Proteinen) hängt von der Natur und Sequenz der 

Aminosäuren ab, die die Ketten bilden. Das Ersetzen von Aminosäuren durch Mutationen, ist für die Bildung der Hämoglobinvarianten verantwortlich. 

Diese haben unterschiedliche Oberflächenladungen und dadurch bei Elektrophoresen eine unterschiedliche Beweglichkeit, die ebenso vom pH-Wert 

und der Ionenstärke des Puffers abhängt. 

Die resultierenden qualitativen (oder strukturellen ) Abnormitäten werden Hämoglobinopathien genannt. Die verminderte Synthese von einer der 

Hämoglobinketten führt zu quantitativen (Regulations-) Abnormitäten, die Thalassämien genannt werden. 

Der Assay wird mit gewaschenen hämolysierten Roten Blutzellen (Erythrozyten) durchgeführt. Die Hämoglobine werden auf alkalischen Gelen 

elektrophoretisch getrennt und die Fraktionen durch Färbung mit Amidoschwarz sichtbar gemacht. Die getrockneten Gele können direkt interpretiert 

werden. 

REAGENZIEN UND MITGELIEFERTE MATERIALIEN IM HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 KIT 

| ARTIKEL | ART.-NR. 3010 | 

| Agarosegele (gebrauchsfertig) | 10 Gele | 

| Tris-Barbital Puffer (Stammlösung) | 3 Fläschchen, jedes 75 mL | 

| Verdünnungslösung (konzentriert) | 1 Fläschchen, 60 mL | 

| Amidoschwarz Färbelösung (Stammlösung) | 1 Fläschchen, 20 mL | 

| Entfärbelösung (Stammlösung) | 1 Fläschchen, 100 mL | 

| Hämolyse-Lösung (gebrauchsfertig) | 1 Fläschchen, 20 mL | 

| Applikatoren 7 Zähne (gebrauchsfertig) | 1 Pack von 10 

| 

| 

Filterpapier - Dünn | 1 Pack von 10 | 

FÜR OPTIMALE ERGEBNISSE 

Alle Reagenzien eines Kits müssen immer zusammen, gemäß den Instruktionen der Packungsbeilage benutzt werden. 

BITTE DIE PACKUNGSBEILAGE SORGFÄLTIG LESEN. 

1. AGAROSEGELE 

Vorbereitung 

Agarosegele sind gebrauchsfertig. Jedes Gel enthält: Agarose, 0,8 g/dl ; alkalischen Puffer pH 8,5 ± 0,1 ; Zusätze, ungefährlich bei den eingesetzten 

Konzentrationen, nötig für die optimale Durchführung. 

Gebrauch 

Hilfsmittel für die Elektrophorese der Hämoglobine. 

Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall 

Die Gele horizontal in der Originalverpackung bei Raumtemperatur (15 - 30 °C) oder gekühlt (2 - 8 °C) lagern. (Die Pfeile auf der Vorderseite des Kits 

müssen nach oben zeigen). Offensichtliche Temperaturschwankungen vermeiden. (z.B. nicht in der Nähe eines Fensters oder einer Hitzequelle 

lagern). Die Gele sind bis zum Ablauf des Verfallsdatums auf der Kitschachtel oder auf der Gelverpackung stabil. 

NICHT EINFRIEREN. 

Das Gel verwerfen, wenn: 

(i) sich Kristalle oder Präzipitate auf der Geloberfläche bilden oder die Geltextur sehr weich wird (dies alles resultiert vom Einfrieren des Gels) ; 

(ii) bakterielles - oder Pilzwachstum erscheint, 

(iii) sich eine abnormale Flüssigkeitsmenge in der Gelschachtel befindet (Absonderungen von Puffer aus dem Gel durch nicht korrekte 

Lagerbedingungen). 

SEBIA ARBEITSANLEITUNG - Deutsch

- 16 - 


2. TRIS-BARBITAL-PUFFER 

Vorbereitung 

Der Inhalt jedes Fläschchens soll auf 1 Liter mit destilliertem Wasser oder deionisiertem Wasser verdünnt werden. 

Die Pufferlösung enthält nach der Verdünnung: Tris-Barbital pH 9,2 ± 0,3 ; Natriumazid. 

WARNUNG: Jedes Fläschchen mit Puffer-Stammlösung enthält 2,45 % Barbital, 13,73 % Natriumbarbital und 0,13 % Natriumazid. Nicht 

Verschlucken. Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen! Beim Entsorgen Kontakt mit Säuren, Blei oder Kupfer vermeiden, da von 

diesen bekannt ist, dass sie explosive oder giftige Verbindungen mit Natriumazid bilden. Beim Entsorgen immer mit viel Wasser 

nachspülen. 

Gebrauch 

Elektrophoresepuffer. 


Die Puffer-Stammlösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist für mehrere Jahre, mindestens bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der 

Kitschachtel und auf dem Etikett der Pufferfläschchen stabil. Verdünnte Pufferlösung ist bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Flasche für 

1 Jahr stabil. 

Den Puffer verwerfen, wenn sich sein Aussehen verändert, z.B., wenn er durch mikrobielle Kontamination trübe wird. 

3. VERDÜNNUNGSLÖSUNG 

Vorbereitung 

Die Amidoschwarz-Verdünnungslösung ist wie im Abschnitt “Amidoschwarz-Färbelösung” beschrieben zu verwenden. 

Die Lösung enthält Zitronensäure. 

Gebrauch 

Zum Herstellen der Amidoschwarz-Färbelösung. 


Konzentrierte Verdünnungslösung im Kühlschrank oder bei Raumtemperatur aufbewahren. Die Lösung ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem 

Kit oder auf dem Flaschenetikett) haltbar. NICHT EINFRIEREN! 

Geben Sie kein Natriumazid zu. 

4. AMIDOSCHWARZ FÄRBELÖSUNG 

Vorbereitung 

Das Amidoschwarz Färbekonzentrat ist eine hochviskose Flüssigkeit deren Viskosität sich durch Lagerung verändern kann. Die Qualität des 

Färbekonzentrats wird durch höhere Viskosität nicht beeinträchtigt. 

Bitte beachten Sie die folgende Anleitung zum Herstellen der Färbelösung : 

1. 15 ml der Verdünnungslösung zu dem Amidoschwarz Färbekonzentrat geben. 

2. Die Färbekonzentrat Flasche fest verschließen. 

3. Die Flasche für etwa 5 Sekunden kräftig schütteln. 

4. Den Inhalt der Flasche in den Färbecontainer überführen. 

5. Schritt 1 – 4 zwei- bis dreimal wiederholen. 

6. Die restliche Verdünnungslösung in den Färbecontainer überführen und mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 300 ml Gesamtvolumen 

auffüllen. 

7. Den Inhalt des Färbecontainers 5 – 10 Minuten mischen. 

Im Anschluss daran ist die Färbelösung gebrauchsfertig. 

Nach der Verdünnung enthält die Färbelösung: Zitronensäurelösung pH ≈ 2 ; 0,4 g/dl Amidoschwarz ; 6,7% Ethylenglycol ; zusätzliche Additive zur 

Optimierung (ungiftig in den verwendeten Konzentrationen). 

WARNUNG: Nicht verschlucken! Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen! 

Gebrauch 

Zum Färben der Agarose Gele nach elektrophoretischer Trennung. 

WICHTIG: Die Färbelösung ist für maximal 10 Färbungen konzipiert. Wechseln Sie deshalb die Färbelösung nach 10 Färbungen aus. 


Amidoschwarz- Konzentrat und verdünnte Färbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank verschlossen aufbewahren um Flüssigkeitsverlust durch 

Verdunstung zu vermeiden. Das Amidoschwarz-Konzentrat ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem Kit oder auf dem Flaschenetikett) haltbar. 

Verdünnte Färbelösung ist einen Monat haltbar. 

Die gebrauchsfertige Färbelösung nicht neben einer Wärmequelle aufbewahren. 

5. ENTFÄRBELÖSUNG 

Vorbereitung 

Jedes Fläschchen der Entfärbe-Stammlösung muss auf 100 Liter mit destilliertem oder deionisiertem Wasser verdünnt werden. Es ist vorteilhaft, 

jeweils nur 1 ml der Stammlösung auf 1,0 Liter zu verdünnen. Die verdünnte Entfärbelösung enthält Zitronensäure, 0,05 g/dl. 

Gebrauch 

Zum Entfärben, d.h. zum Entfernen von überschüssigem Färbemittel und von Hintergrundfärbung aus den Gelen. 


Die Stammlösung der Entfärbelösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Etikett 

des Entfärbelösungs-Fläschchen stabil. Die verdünnte Entfärbelösung ist bis zu einer Woche bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Flasche 

stabil. Kein Natriumazid zufügen. 

Die verdünnte Entfärbelösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z.B., wenn sie durch mikrobielle Kontamination trübe wird. 

Um mikrobielles Wachstum in der verdünnten Entfärbelösung bei Lagerung von mehr als einer Woche zu verhindern, sind 5 µl/dl ProClin 300 zu 

zufügen. 

Die mit ProClin versetzte, gebrauchsfertige Entfärbelösung ist in der verschlossenen Flasche bei Zimmertemperatur oder gekühlt bis zum 

Verfallsdatum stabil, das auf der Verpackung oder auf den Flaschenetiketten angegeben ist.

- 17 - 


6. HÄMOLYSE-LÖSUNG 

Vorbereitung 

Die Hämolyse-Lösung ist gebrauchsfertig. Sie eine Pufferlösung mit Zusätzen, ungefährlich bei den eingesetzten Konzentrationen, nötig für die 

optimale Durchführung. 

Gebrauch 

Zur Hämolyse der Erythrozyten. 


Die Hämolyse-Lösung bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Sie ist bis zum Verfallsdatum auf der Kitpackung oder auf dem Etikett des Hämolyse- 

Lösungs-Fläschchens stabil. 

Die Hämolyse-Lösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z.B., wenn sie durch mikrobielle Kontamination trübe wird. 

7. APPLIKATOREN 

Gebrauch 

Applikatoren für den einmaligen Gebrauch zum Probenauftrag. 

Lagerung 

Die Applikatoren an einem trockenen Platz bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. 

8. FILTERPAPIERE – DÜNN 

Gebrauch 

Für den einmaligen Gebrauch, um überschüssige Feuchtigkeit von der Geloberfläche vor der Probenaufgabe abzublotten. 

Lagerung 

Dünnes Filterpapier, vor Feuchtigkeit geschützt, bei Zimmertemperatur oder im Kühlschrank lagern. 

NICHT MITGELIEFERTE ABER BENÖTIGTE REAGENZIEN 

1. PHYSIOLOGISCHE KOCHSALZLÖSUNG 

Vorbereitung 

Stellen Sie eine 0,15 M (0,9 g/dl) NaCl-Lösung in destilliertem oder deionisiertem Wasser her. 

Gebrauch 

Zum Waschen der Erythrozyten. 


Bei Raumtemperatur oder gekühlt lagern. Die Lösung nach drei Monaten verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert, z.B., wenn sie durch 

mikrobielle Kontamination trübe wird. Für längere Lagerperioden, Natriumazid zugeben, 0,1 g/dl. 

2. FIXIERLÖSUNG (optional) 

Vorbereitung 

Mindestens 15 Minuten vor Gebrauch eine Lösung vorbereiten die folgende Volumenanteile enthält: 60 % Ethanol ; 10 % Essigsäure und 

30 % destilliertes oder deionisiertes Wasser. Gut mischen. 

Gebrauch 

Zur Fixierung elektrophoretisch getrennter Hämoglobine in Agarosegelen. 


Die Fixierlösung dicht verschlossen, um Verdampfungen zu verhindern, bei Raumtemperatur lagern. Nach 3 Monaten verwerfen. Nicht mehr als 4 Gele 

in jeweils 150 ml fixieren. 

NICHT MITGELIEFERTE ABER BENÖTIGTE AUSRÜSTUNG UND ZUBEHÖR 

1. Netzgerät: GD 61 D SEBIA, Art.-Nr. 1300 ; GD 251 D SEBIA, Art.-Nr. 1301 ; MG 300 SEBIA, Art.-Nr. 1302 oder MG 500 SEBIA, Art.-Nr. 1303. 

2. HYDRAGEL K20 APPLIKATOR SEBIA, Art.-Nr. 1409, enthält den HYDRAGEL K20 Applikatorträger. 

3. Feuchte Kammer, Art.-Nr. 1270. 

4. Elektrophorese-Kammer: K20 SEBIA, Art.-Nr. 1400. 

5. Behälter und Gelhalter zum Abarbeiten der Gele: HYDRAGEL K20 Zubehörkit SEBIA, Art.-Nr. 1420. 

6. Pipetten: 5 µl, 10 µl und 200 µl. 

7. Inkubator-Trockner: IS 80 SEBIA, Art.-Nr. 1430. 

8. Densitometer / Flachbett-Scanner um Gele von 82 x 51 mm bei 570 nm (Gelbfilter) einzulesen: HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA oder PHORESIS 

Software für Flachbett-Scanner. Zur Durchführung und für die Kalibrierung, siehe die Bedienungsanleitung des Herstellers. 

ANALYSENPROBEN 

Probensammlung und Lagerung 

Frische Blutproben mit Antikoagulantien werden für die Analyse empfohlen. Die üblichen Antikoagulantien solche die EDTA, Citrat oder Heparin 

enthalten sind akzeptabel. Keine Antikoagulantien mit Jodacetat verwenden. Die Blutproben sollten gemäß den etablierten Regeln zur 

Probenentnahme für klinische Proben gewonnen werden. Bei Bedarf können die Proben für bis zu 5 Tagen bei 2 – 8 °C gelagert werden. 

Probenvorbereitung 

• Das Probenröhrchen vor der Entnahme der Blutprobe mischen. 

• Blut mit Antikoagulanz bei 5 000 Upm für 5 Minuten zentrifugieren. 

• Das Plasma verwerfen.

- 18 - 


• Erythrozyten zweimal mit 10fachen Volumen physiologischer Kochsalzlösung waschen ; mit großer Sorgfalt vorgehen, wenn das zu verarbeitende 

Volumen der Erythrozyten kleiner als 10 µl ist. 

• Die überschüssige Salzlösung von den roten Blutkörperchen entfernen. Die Blutzellen mischen und 10 µl für die Hämolyse abnehmen. 

• Hämolysieren Sie 10 µl gepackte Erythrozyten mit 130 µl Hämolyse-Lösung. 

• Für 10 Sekunden mischen und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 

HINWEISE: 

- Um Hämolysate von Proben mit milder Anämie (ungefähr 10 g/dl Hb) oder mit starker Anämie (< 7 g/dL Hb) herzustellen, kann das Volumen von 

gepackten Eryzhrozyten auf 15 µl bzw. 20 µl erhöht werden. Die Intensität der Färbung wird dadurch erhöht, aber die relativen Konzentration 

individueller Banden werden nicht verändert. 

- Das Hämolysat muss nicht gefiltert oder zentrifugiert werden. 

- Die SEBIA Hämolyselösung beeinträchtigt das instabile Bart’s Hämoglobin nicht. 

PROZEDUR 

I. MIGRATIONSSCHRITT 

1. Den HYDRAGEL K20 Applikatorträger auf eine flache Oberfläche legen (Abb. 1) und den Applikatorträger hochklappen. 

2. 120 µl destilliertes Wasser oder deionisiertes Wasser auf das untere Drittel des Rahmens geben, der auf dem HYDRAGEL K20 

Applikatorträger aufgedruckt ist. 

3. Das HYDRAGEL Agarosegel auspacken. 

4. Ein dünnes Filterpapier vorsichtig und gleichmäßig auf die Oberfläche legen um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen. Das Filterpapier 

sofort wieder entfernen. 

WARNUNG: Das Filterpapier nicht zu lange mit dem Gel in Kontakt lassen, um ein Austrocknen des Gels zu vermeiden. 

5. Das Gel (Gelseite nach oben) mit seinem Rand gegen den Halter am Boden des aufgedruckten Rahmens (Abb. 2) legen. 

6. Das Gel biegen und in den Wasservorrat hineindrücken (Abb. 2). Sicherstellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden, dass sich 

Wasser unter dem gesamten Gel befindet, und dass das Gel sich in einer Linie mit dem aufgedruckten Rahmen befindet. 

7. Den Applikatorträger (mit hochgestelltem Hebel) bis zur mittleren Position herabsenken. 

8. Einen Applikator so auf eine flache Oberfläche legen, dass die Nummern (Vertiefungen) nach oben zeigen (Abb. 3). 

9. In die Vertiefungen des Applikators je 10 µl der hämolysierten Probe auftragen. Den Applikator innerhalb von 2 Minuten beladen. Den 

Applikator ohne Verzögerungen einsetzen. Bei späterem Gebrauch (bis zu 8 Stunden) muss der Applikator in der Feuchten Kammer mit 

Zähnen nach oben aufbewahrt werden (die Applikatoren am Zahnschutzrahmen anfassen). Die gesamte Kammer gekühlt lagern und das Gel 

erst unmittelbar vor Gebrauch auf den HYDRAGEL K20 Applikatorträger legen. 

Für weitere Details siehe: Bedienungsanleitung „Feuchte-Kammer“. 

10. Den Schutzrahmen für die Applikatorzähne abnehmen. 

11. Den Applikator mit den Proben in die Position 4 auf dem Applikatorträger einlegen. 

WICHTIG: Die aufgedruckten Nummern auf den Applikatoren müssen zum Bediener zeigen. (Abb. 4). 

12. Den Applikatorträger durch Drehen des Hebels absenken, sodass der Applikator die Geloberfläche berührt. Den Träger nicht vollständig 

herunterdrücken. 

13. Nach einer Minute die Applikatoren durch Drehen des Hebels hochfahren und verwerfen. 

14. Das Gel in eine passende Elektrophoresekammer mit den Proben zur kathodischen Seite überführen. Beim Verwenden der SEBIA K20 

Kammer, das HYDRAGEL auf die Brücke mit der Gelseite nach unten platzieren. Das Gel sollte an jeder Seite ungefähr 1 cm in den Puffer 

eintauchen. 

Für weitere Details siehe Bedienungsanleitung der Kammer K20. 

15. Die Kammer mit dem Netzgerät verbinden. 

| MIGRATIONS-BEDINGUNGEN | SEBIA K20 | 

| Puffervolumen pro Kammer | 150 ml | 

| Gesamtpuffervolumen | 300 ml | 

| Migrationszeit | 15 Minuten | 

| Konstante Spannung | 165 V 

| 

| 

Einschaltstrom (ein Gel) | 7 ± 2 mA | 

16. Nach der Migration, den Stromfluss in der Kammer unterbrechen und das Gel entfernen. 

II. FIXATION 

Die Gele nach einer der nachfolgenden Prozeduren weiterbehandeln. 

Heißluftfixierung (Nur mit dem SEBIA IS 80 Inkubator-Trockner empfohlen): 

Das Gel vollständig im Inkubator-Trockner bei 80 °C (für 10 Minuten) trocknen. 

Fixierung mit Fixierlösung: 

1. Das Gel im Gelhalter platzieren (enthalten im SEBIA HYDRAGEL K20 Zubehör Kit). 

2. Den Behälter mit (enthalten im SEBIA HYDRAGEL K20 Zubehör Kit) 150 ml Fixierlösung füllen. 

3. Das Gel für 15 Minuten in der Fixierlösung eintauchen. 

4. Das Gel herausnehmen und mit Heißluft bei 80 ° C im Inkubator-Trockner trocknen. 

WICHTIG: Das Gel muss vollständig trocken sein. 

III. FÄRBEN UND ENTFÄRBEN 

1. Das getrocknete und abgekühlte Gel für 5 Minuten in die Färbelösung eintauchen. 

2. In drei aufeinanderfolgenden Bädern mit Entfärbelösung das Gel entfärben bis der Hintergrund vollständig farblos und klar ist. 

3. Überschüssige Flüssigkeit von der Geloberfläche mit einem saugfähigem Papier absaugen und das Gel bei 80 °C mit Heißluft trocknen. Bei 

Bedarf die Rückseite (plastikverstärkte Seite) des Gels mit einem feuchten Tuch reinigen.

- 19 - 


IV. EINLESEN 

Das Gel mit einem Densitometer bei 570 nm oder mit einem Gelbfilter einlesen. Bei Verwendung von HYRYS oder DVSE Densitometern, die 

A 2 -Fraktion bei der 5 mm Markierung auf dem Scanfenster positionieren: die Nullstellung des Hintergrunds wird zwischen der A 2 - und der Carbo- 

Anhydrase-Fraktion beim niedrigsten Punkt durchgeführt. 

HINWEIS : Zur Erzielung bester Ergebnisse folgendes beachten: 

- Die Einleselänge einstellen um vollständige Elektrophoresemuster einzuschließen (≈ 30 mm). 

- Sicherstellen dass die Minima auf beiden Seiten der A 2 -Fraktion ganz am Fuß des A 2 –Peak positioniert sind. 

Es wird empfohlen das gefärbte Gel ohne Verzögerung einzulesen. Als Referenz für die Zukunft können sie in einer Schutzhülle an einem trocken 

dunklen Platz fern von Hitzequellen gelagert werden und innerhalb von mindestens 3 Monaten visuell interpretiert werden. 

ERGEBNISSE 

Qualitätskontrolle 

Es wird empfohlen bei jedem Lauf ein Kontrollblut oder ein bekanntes Blut, das die Hämoglobine A, F, C und S enthält, zur Kontrolle mitlaufenzulassen. 

Werte 

Durch das Einlesen von gefärbten Elektropherogrammen mit dem Densitometer werden relative Konzentrationen (Prozente) individueller 

Hämoglobinbanden erhalten. 

Normalwerte (Mittelwert ± 2 SD) wurden mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur von einer gesunden Population von 200 Erwachsenen 

(Männer und Frauen) bestimmt: 

Hämoglobin A ≥ 96,5 % 

Hämoglobin F < 2,0 % (*) 

Hämoglobin A2 ≤ 3,5 % 

(*) siehe Interferenz und Limitationen 

Jedem Labor wird empfohlen eigene Normalwerte festzulegen. 

Interpretation 

1. Qualitative Abnormitäten: Hämoglobinopathien 

Die meisten Hämoglobinopathien werden durch Mutationen verursacht, die zu einzelnen Aminosäureaustauschen in einem Typ der vier 

Polypeptidketten führen. Die klinische Signifikanz eines solchen Austauschen hängt vom Typ der Aminosäure und von der betroffenen Stelle ab. Bei 

klinisch signifikanten Erkrankungen ist entweder die α-Kette oder die ß-Kette (sogar die γ-Ketten) betroffen. 

Mehr als 200 Varianten des adulten Hämoglobins sind bislang beschrieben worden. Die ersten untersuchten abnormalen Hämoglobine und die am 

häufigsten vorkommenden haben eine veränderte elektrische Nettoladung, wodurch sie mit Elektrophorese einfach nachweisbar sind. 

Es gibt vier abnormale Haupt-Hämoglobine, welche von besonderem klinischen Interesse sind: S, C, E und D. 

Die HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Kits werden für eine vorläufige Identifikation von Hämoglobinopathien und Thalassämien. Sobald ein 

abnormales Muster festgestellt wird, sollte seine Identität mit entsprechenden ausschließenden Tests bestätigt werden (z. B. mit Gelelektrophoresen 

auf sauren Agarose Gelen). 

Hämoglobin S 

Das Hämoglobin S kommt am häufigsten vor. Es entsteht durch den Austausch eines Glutaminsäurerestes (saure Aminosäure) der Beta-Kette durch 

Valin (eine neutrale Aminosäure). Seine elektrophoretische Mobilität wird dadurch verlangsamt. Auf alkalisch gepufferten Gelen wie HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20 wandert das Hämoglobin S zwischen den Fraktionen A und A 2 . 

Hämoglobin C 

Ein Glutaminsäurerest der Beta-Kette wurde durch einen Lysinrest ersetzt (basische Aminosäure): seine Mobilität ist stark verringert. Bei der 

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur überlagern sich die Fraktionen C, E, und A 2 . Wenn diese Fraktion > 15 % beträgt, müssen die 

Hämoglobine C und E vermutet werden. 

Hämoglobin E 

Ein Glutaminsäurerest der Beta-Kette wird durch Lysin ersetzt. Bei der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur wandert das Hämoglobin E 

genau wie das Hämoglobin C. Aber im Unterschied zu Hämoglobin C, trennt es sich nicht vom Hämoglobin A in sauren Puffer [HYDRAGEL ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) K20]. Diese Eigenschaft erlaubt die Unterscheidung zwischen E und C. 

Hämoglobin D 

Ein Glutaminsäurerest der Beta-Kette wird durch einen Glutaminrest ersetzt. Bei der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur wandert dieses 

Hämoglobin ganz genau wie das Hämoglobin S. Das Hämoglobin D trennt sich in sauren Puffer nicht vom Hämoglobin A [HYDRAGEL ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) K20]. Diese Eigenschaft erlaubt die Unterscheidung zwischen S und D. 

2. Quantitative Abnormitäten: Thalassämien 

Thalassämien stellen eine sehr heterogene Gruppe von genetischen Störungen dar, die durch eine verminderte Synthese eines oder mehrerer Typen 

von Polypeptidketten gekennzeichnet sind. Der molekulare Mechanismus dieser Verminderung ist bis jetzt nicht vollständig beschrieben. 

Es gibt zwei Arten von Thalassämiesyndromen: 

Alpha-Thalassämien 

Sie werden durch eine verminderte Synthese der α-Ketten charakterisiert, was konsequenterweise die Synthese aller normalen Hämoglobine betrifft. 

Die überschüssige Synthese von ß-Ketten und γ-Ketten im Verhältnis zu α-Ketten induziert die Bildung von Tetrameren ohne jede α-Kette: 

• Hämoglobin Bart = γ 4, 

• Hämoglobin H = ß 4.

Beta-Thalassämien 

Sie werden durch eine verminderte Synthese der Beta-Kette gekennzeichnet. Nur das Hämoglobin A ist betroffen. 

Dafür sind die Prozentanteile von Hämoglobin F und A 2 im Vergleich zu Hämoglobin A erhöht. 

3. Migrationsmuster 

Migration bei normalen 

Hämoglobinen 

A(A0 + A1 ) A (A0 + A1 ) 

F 

S - D 

A2 A2 - C - E 

Anhydrase Anhydrase 

Auftragungspunkt 

A 0 : Die nicht-glykolisierte Fraktion des normalen adulten Hämoglobin A. 

A 1 : Die glykolisierte Fraktion des normalen adulten Hämoglobin A. 

Im obigen Muster befindet sich unten die Anode und oben die Kathode. 

- 20 - 


Interferenzen und Limitationen 

• Keine hämolysierten Blutproben verwenden. 

• Wenn ein abnormales Hämoglobin nachgewiesen wird, welches ein anderes Verhalten als die Haupthämoglobinvarianten S, C, D und E zeigt, 

sollten andere Eigenschaften für die Identifizierung herangezogen werden, (wie z.B.: Isoelektrische Fokussierung, Globinketten-Elektrophorese) 

oder ein spezialisiertes Labor konsultiert oder die Probe in ein spezialisiertes Labor gesendet werden. 

• Der densitometrische Assay von Hb F (oder irgend einem anderen geringem Hämoglobin, das in der Nähe der Hauphämoglobinfraktionen wandert) 

ist nur semiquantitative, da die Analyse bei Werten unterhalb von 2 % - 3 % vom Gesamthämoglobin ungenau wird. 

• Einige homozygote „S“ Patienten erhalten eine Behandlung mit Hydrea® (Hydroxyharnstoff), die zur Induktion der Synthese von fetalem 

Hämoglobin führen kann. In einigen Fällen wurde beobachtet, dass die Mobilität des induzierten Hämoglobin F auf HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) 

im Vergleich zu physiologischem Hämoglobin F leicht unterschiedlich ist. 

• Bei längerer Lagerung der Proben (über 7 Tage), kann sich der Hintergrund hinter der Hb A Fraktion als distinkte Fraktion darstellen. Interpretieren 

sie diese Fraktion nicht als Hämoglobin-Variante, z.B. als Hämoglobin H oder Bart. 

Fehlersuche 

Bitte rufen Sie den Technischen Service von SEBIA an, wenn der Test nicht richtig funktioniert, obwohl die Anweisungen zur Vorbereitung, Lagerung 

und zur Durchführung sorgfältig beachtet wurden. 

Datensicherheitsblätter sowie Informationen zur Abfallentsorgung sind bei SEBIA GmbH, Fulda zu erfragen. 

CHARAKTERISTISCHE DATEN 

Migration der wichtigsten 

anomalen Hämoglobine 

Alle charateristischen Daten basieren auf einer Studie, die durch vergleichende Untersuchungen von SEBIA HYDRAGEL Materialien und Geräte mit 

einem anderen kommerziell erhältlichen Gelelektrophoresesystem erhalten wurden. Zusätzlich wurden Konkordanz-Untersuchungen durchgeführt, 

wenn die Identifizierung der Hämoglobine und die Werte durch andere anerkannte Methoden ermittelt wurden. Die Ergebnisse von repräsentativen 

Beispielen werden hier aufgeführt. 

Alle Elektropherogramme wurden visuell interpretiert. Für alle densitometrischen Messungen wurde das HYRYS Densitometer von SEBIA verwendet, 

um die visuellen Daten angemessen zu vervollständigen. 

Reproduzierbarkeit innerhalb eines Laufs 

Drei Blutproben wurden mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur mit Gelen einer Charge untersucht. Jede Probe wurde auf sämtlichen 

Laufspuren eines Gels aufgetragen. Die folgende Tabelle zeigt die Mittelwerte, Standardabweichung und den Variationskoeffizient für jede individuelle 

Hämoglobinkomponente in den drei Proben, die mittels der densitometrischen Prozentwerte für jede einzelne Laufspur errechnet wurden. Weiterhin 

zeigten die Wiederholungen keine falsch positiven oder falsch negativen Werte. 

| KOMPONENTE | MITTELWERT | SD | CV (%) | 

| Normales Blut | 

| Hb A | 97,4 | 0,1 | 0,1 | 

| Hb A | 2 2,6 | 0,1 | 5,3 | 

| Erhöhtes Hb A2 | 

| Hb A | 95,2 | 0,2 | 0,2 | 

| Hb A | 2 4,8 | 0,2 | 4,4 | 

| Erhöhtes Hb C | 

| Hb A | 56,7 | 0,4 | 0,8 

| 

| 

Hb C | 43,3 | 0,4 | 1,0 | 

Reproduzierbarkeit innerhalb verschiedener Läufe 

Blutproben wurden mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur mit Gelen einer Charge elektrophoretisch getrennt. Unter den analysierten 

Proben befanden sich sieben Proben mit einem abnormalen Hämoglobin (Hb S, Hb F oder Hb C), zwei Proben mit erhöhtem Hb A 2 , die restlichen 

Proben waren normale Blutproben. Die Mittelwerte, Standardabweichung und die Variationskoeffizienten wurden aus den Daten für jede individuelle 

Hämoglobinkomponente aus jeder Probe berechnet. Der Wertebereich um die Mittelwerte, Standardabweichungen und um die Variationskoeffizienten 

und die Mittelwerte aus den Variationskoeffizienten, die die Gesamtheit der individuellen Komponenten repräsentieren sind unten in der Tabelle 

aufgeführt. Im übrigen zeigten die Wiederholungen keine falsch positiven oder falsch negativen Werte.

- 21 - 


| KOMPONENTE | MITTELWERTE | SD | VK (%) | MITTLERER | 

| | | | | VK (%) | 

| Hb A | 18,0 – 97,8 | 0,1 – 1,0 | 0,1 – 4,0 | 0,8 | 

| Hb F | 13,3 – 76,3 | 0,5 – 0,6 | 0,7 – 3,4 | 1,8 | 

| Hb C | 21.5 – 43,5 | 0,2 – 0,3 | 0,6 – 1,1 | 0,8 | 

| Hb S/D | 9,7 – 84,1 | 0,1 – 0,6 | 0,4 – 2,6 | 1,1 

| | 

Hb A | 2 2.2 – 5,7 | 0,1 – 0,2 | 2,3 – 7,6 | 4,0 | 

Genauigkeit Nachweis von Hämoglobin-Abnormitäten 

63 unterschiedliche Blutproben wurden mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur und einem anderen kommerziell erhältlichem 

Agarosegelsystem untersucht. Die Blutproben und ihre diagnostische Bewertung wurden von einem Krankenhaus zur Verfügung gestellt. Die 

Diagnose basierte auf Gelelektrophoresen auf alkalischen und sauren Gelen und/oder auf HPLC-Analysen. Alle abnormalen Hämoglobine oder 

abnormale Spiegel normaler Hämoglobine, die mit der HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur nachgewiesen wurden, waren in 

Übereinstimmung mit dem vergleichbaren System, den Krankenhaus Resultaten und der klinischen Diagnose. Es gab keinen Fall von falsch positivem 

Resultat, wie z.B. den Nachweis von abnormalen Banden oder abnormale Spiegel einer normalen Bande, bei denen keine Abnormalität existierte. 

Genauigkeit - Quantitative Bestimmung von Hb A 2 

Die Spiegel von 51 Blutproben mit normalen und erhöhten Spiegeln von Hb A 2 wurden beide durch Densitometrie der Gele, die mit der HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20 Prozedur abgearbeitet wurden, gemessen. Die gemessenen Werte von beiden Verfahren wurden durch Berechnung der 

linearen Regression miteinander verglichen. Die Ergebnisse der linearen Regression werden unten in der Tabelle aufgeführt: (y = HYDRAGEL) 

| Korrelationskoeffizient | y-Achsenabschnitt | Steigung | Wertebereich der % Werte | 

| | | | (System von SEBIA) | 

| 0,973 | -0,344 | 0,963 | 1,5 – 5,7 | 

LITERATUR 






860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 

8. Vovan L., Lara-Russo D., Orsini A. (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, 780-789.

GEBRUIKSINDICATIE 

- 22 - 


HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kit is ontwikkeld voor de scheiding van normale hemoglobine (A en A 2 ) en voor de detectie van de belangrijke 

hemoglobine varianten: S of D en C of E, door middel van elektroforese op alkalisch gebufferde agarose gels. De resulterende elektroforegrammen 

worden visueel geëvalueerd op afwijkende patronen. Densitometrie kan als hulpmiddel dienen bij de interpretatie door het leveren van relatieve 

concentraties van de afzonderlijke fracties. 

Elektroforese op een zure gel, bijvoorbeeld in de HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20 procedure is essentieel voor de bevestiging van de 

identificatie van de hemoglobine varianten, met name om de hemoglobinen S van D en E van C te onderscheiden. 

Iedere agarosegel in de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kit is bedoeld voor de analyse van 7 monsters. 

Voor gebruik bij in vitro diagnostiek. 

PRINCIPE VAN DE TEST 

Hemoglobine is een complex molecuul dat is samengesteld uit twee paar polypeptideketens. Elke keten is verbonden aan het haem, een 

tetrapyrollische kern (porfyrine) dat een ijzeratoom cheleert. Het haem deel komt bij alle hemoglobinen en hun varianten voor. Het type hemoglobine 

wordt vastgesteld op basis van het proteïnedeel dat globine genoemd wordt. Het normale menselijke hemoglobine wordt samengesteld uit de 

polypeptideketens α, ß, δ en γ: 

• hemoglobine A ................................... = α 2 ß 2 

• hemoglobine A 2 .................................. = α 2 δ 2 

• foetale hemoglobine F........................ = α 2 γ 2 

Deze drie hemoglobinen hebben de α-keten gemeenschappelijk. 

De open structuur van hemoglobine (zoals bij alle proteïnen) hangt samen met de soort en de volgorde van de aminozuren die de ketens vormen. De 

verbindingen tussen de verschillende aminozuren zijn verantwoordelijk voor de vorm van het molecuul, zijn stabiliteit en eigenschappen. Substitutie 

van aminozuren door mutatie is verantwoordelijk voor de formering van hemoglobinevarianten met een andere oppervlaktelading en dus een andere 

elektroforetische mobiliteit, hetgeen ook afhankelijk is van de pH en de ionische sterkte van de buffer. Bij een zure pH-waarde wordt de mobiliteit 

eveneens beïnvloed door elektrostatische interactie tussen de positief geladen hemoglobinemoleculen en de negatief geladen moieteiten in de agar. 

De resulterende kwalitatieve (of structurele) abnormaliteiten worden hemoglobinopathiën genoemd. De verminderde synthese van een van de 

hemoglobineketens voert tot kwantitatieve (of regulering) abnormaliteiten hetgeen thalassemie genoemd wordt. 

De toetsing wordt uitgevoerd op het hemolysaat van gewassen rode bloedlichaampjes. De hemoglobinen worden elektroforetisch gescheiden op zure 

gels en de fracties worden gevisualiseerd door kleuring met amidozwart. De gedroogde gels zijn gereed voor interpretatie. 

DE HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 KIT BEVAT DE VOLGENDE REAGENTIA EN ANDERE MATERIALEN 

| BESTANDDELEN | PRODUKTNR. 3010 | 

| Agarose-gels (klaar voor gebruik) | 10 gels | 

| Tris-Barbitalbuffer (concentraat) | 3 flesjes van 75 ml | 

| Verdunner voor de kleuroplossing (concentraat) | 1 flesje van 60 ml | 

| Amidozwart kleurstof (concentraat) | 1 flesje van 20 ml | 

| Ontkleuringoplossing (concentraat) | 1 flesje van 100 ml | 

| Hemolyserende oplossing (gebruiksklaar) | 1 flesje, 20 ml | 

| Applicatoren met 7 tanden (gebruiksklaar) | 1 pakje van 10 stuks 

| 

| 

Filterpapier - dun | 1 pakje van 10 stuks | 

VOOR OPTIMALE RESULTATEN 

Onderdelen uit dezelfde kit dienen altijd samen te worden gebruikt en in overeenstemming met de instructies op de bijsluiter. 

LEES DE GEBRUIKSAANWIJZING ALTIJD ZORGVULDIG DOOR. 

1. AGAROSE-GELS 

Voorbereiding 

De agarosegels zijn klaar voor gebruik. Iedere gel bevat: agarose, 8 g/l ; alkalische buffer, pH 8,5 ± 0,1 ; in de gebruikte concentraties niet schadelijke 

toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking. 

Gebruik 

Hulpmedium voor hemoglobinen-elektroforese. 

Opslag, stabiliteit en tekenen van verval 

De gels moeten horizontaal worden opgeslagen in de originele beschermende verpakking en bij kamertemperatuur (15 ° tot 30 °C) bewaard worden 

of gekoeld (2 ° tot 8 °C) (De pijl op de voorzijde van de verpakking moet naar boven wijzen.). Aanzienlijke temperatuurschommelingen moeten 

vermeden worden tijdens de periode van opslag (dus bijvoorbeeld niet bewaren in de buurt van een raam of een warmtebron). De gels zijn stabiel tot 

de houdbaarheidsdatum die op de verpakking, of op het verpakkingslabel van de gel, staat aangegeven. NIET BEVRIEZEN. 

Verwijder de gel wanneer er: 

(i) zich kristallen of neerslag op het oppervlak van de gel vormen, of wanneer de textuur van de oppervlakte van de gel erg zacht wordt (dit geeft aan 

dat de gel bevroren is geweest) ; 

(ii) bacteriële of schimmelgroei wordt waargenomen ; 

(iii) een abnormale hoeveelheid vloeistof in de gelbox aanwezig is (wijst er op dat afscheiding van buffer uit de gel heeft plaatsgevonden tijdens 

onjuiste opslagomstandigheden). 

SEBIA INSTRUCTIEBLAD - Nederlands

- 23 - 


2. TRIS-BARBITAL BUFFER 

Voorbereiding 

Elk flesje van het bufferconcentraat wordt verdund tot 1 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Na verdunning bevat de bufferoplossing : 

Tris-barbital pH 9,2 ± 0,3 ; natriumazide, 0,10 g/l ; en in de gebruikte concentraties niet schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een 

optimale werking. 

WAARSCHUWING: Elk flesje buffer bevat 2,45 % barbital, 13,73 % natriumbarbital en 0,13 % natriumazide. Niet voor inwendig gebruik! Bij 

abusievelijke inname dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Natriumazide kan explosieve of toxische verbindingen aangaan 

met zuren, lood of koper. Bij verwijdering altijd spoelen met een grote hoeveelheid water. 

Gebruik 

Elektroforese buffer. 


Het bufferconcentraat bij kamertemperatuur of gekoeld opslaan. Het blijft gedurende enige jaren stabiel, tenminste tot de houdbaarheidsdatum zoals 

aangegeven op de verpakking of de labels op de flesjes met buffer. De verdunde bufferoplossing is gedurende een jaar stabiel in een gesloten fles. 

Verwijder de verdunde buffer zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld wanneer deze troebel wordt als gevolg van besmetting met 

microben. 

3. VERDUNNER VOOR DE KLEUROPLOSSING 

Bereiding 

De voorraad verdunner voor de kleuroplossing moet toegepast worden volgens de beschrijving in de paragraaf "AMIDOZWART KLEUROPLOSSING". 

Het bevat een zure oplossing. 

Toepassing 

Bij de preparatie van de amidozwart kleuroplossing. 


De voorraad verdunner voor de kleuroplossing wordt bewaard bij kamertemperatuur of gekoeld. De verdunner is stabiel tot de houdbaarheidsdatum 

zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op de labels van de flesjes met verdunner voor de kleuroplossing. DIT PRODUCT NIET 

INVRIEZEN! 

Geen natriumazide toevoegen. 

4. AMIDOZWART KLEUROPLOSSING 

Bereiding 

De geconcentreerde amidozwart kleuringoplossing is een viskeuze oplossing die kan geleren. De integriteit van de basisoplossing wordt niet beïnvloed 

door de toename van de viscositeit of de hardwording. 

In alle gevallen adviseren wij u de hieronder beschreven procedure te volgen om de perfecte kleuring te behouden: 

1. Voeg 15 ml verdunningsmiddel aan het flesje met geconcerteerd amidozwart toe. 

2. Sluit het flesje zorgvuldig. 

3. Schut het flesje nu stevig gedurende ongeveer 5 seconden. 

4. Giet de oplossing in de houder van waaruit de kleuroplossing verwerkt wordt. 

5. Herhaal deze stap tweemaal, zo nodig driemaal. 

6. Giet de resterende verdunner in de houder en vul het volume aan tot 300 ml met gedestilleerd of gedeioniseerd water. 

7. Meng de inhoud van de cubitainer stevig gedurende 5 tot 10 minuten. 

De kleuringoplossing is nu gereed voor gebruik. 

Na verdunning bevat de werkzame verdunde kleuroplossing: zuuroplossing pH ≈ 2 ; amidozwart, 0.4 g/dl ; ethyleenglycol, 6.7 % ; additieven, 

ongevaarlijk bij te toegepaste concentraties die nodig zijn voor optimale werking. 

WAARSCHUWING: Schadelijk bij inname. 

Toepassing 

Bij het kleuren van gels tijdens elektroforetische proteïneseparatie. 

BELANGRIJK : De kleuroplossing is ontwikkeld voor het kleuren van een maximum van 10 gels. Na het kleuren van 10 gels dient u de oplossing te 

vervangen. 


Zowel de standaard als de gebruiksoplossingen dienen bij kamertemperatuur of gekoeld bewaard te worden in gesloten containers om verdamping 

te voorkomen. De standaard kleuroplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op het 

label van de flesjes met kleuroplossing. 

De gebruiksoplossing is gedurende 1 maand stabiel. 

De verdunde oplossing kleurstof niet in de buurt van een warmtebron bewaren. 

5. ONTKLEURINGSOPLOSSING 

Voorbereiding 

Elk flesje ontkleuringconcentraat wordt verdund tot 100 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Het is praktisch om een verdunning van een 

klein deel, bijv. 1/1000 van het concentraat aan te maken, bijvoorbeeld 1 ml concentraat te verdunnen tot 1 liter. Na verdunning bevat de 

ontkleuringoplossing: citroenzuur, 0,5 g/l. 

Gebruik 

Voor het ontkleuren van gels, d.w.z. het verwijderen van overtollige en achtergrondkleur uit de gels. 


De concentraat-ontkleuringsoplossing is stabiel bij kamertemperatuur of gekoeld tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of 

de labels op de flesjes met ontkleuringoplossing. De verdunde ontkleuringoplossing is, in een afgesloten fles en bij kamertemperatuur, gedurende 

1 week stabiel. 

Verwijder de verdunde ontkleuringoplossing zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting 

met microben. 

Voeg geen natriumazide toe. 

Om besmetting met microben te voorkomen in een oplossing die langer dan een week bewaard moet worden voegt u 50 µl/l ProClin 300 toe. 

De verdunde, ProClin bevattende ontkleuringsoplossing blijft, indien bewaard in een afgesloten fles bij kamertemperatuur of in de koeling, stabiel tot 

aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes ontkleuringsoplossing.

- 24 - 


6. HEMOLYSERENDE OPLOSSING 

Voorbereiding 

De hemolyserende oplossing is gebruiksklaar. Dit is een buffer met toevoegingen, niet schadelijk in de gebruikte concentratie, doch noodzakelijk voor 

een optimale werking. 

Gebruik 

Voor de hemolyse van rode bloedcellen. 


Bewaar de hemolyserende oplossing gekoeld of bij kamertemperatuur. Deze oplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de 

verpakking of de labels op de flesjes met hemolyserende oplossing. 

Verwijder de hemolyserende oplossing zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting met 

microben. 

7. APPLICATORS 

Gebruik 

Voorgesneden applicatoren, voor eenmalig gebruik, voor het aanbrengen van de monsters. 

Opslag 

De applicatorstrips worden op een droge plaats bij kamertemperatuur of gekoeld bewaard. 

8. FILTERSTRIPS - DUN 

Gebruik 

Velletjes dun filterpapier, voor eenmalig gebruik, voor het opnemen van overtollige vloeistof van het geloppervlak vóór het aanbrengen van de 

monsters. 

Opslag 

Bewaar de dunne velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling. 

BENODIGDE, NIET BIJGELEVERDE REAGENTIA 

1. FYSIOLOGISCHE ZOUTOPLOSSING 

Voorbereiding 

Maak 0,15 M (9 g/l) NaCl-oplossing met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. 

Gebruik 

Voor het wassen van rode bloedcellen en voor de verdunning van hemolysaten. 


De zoutoplossing kan bij kamertemperatuur bewaard worden. Verwijder de oplossing na 3 maanden of wanneer er uiterlijke veranderingen optreden, 

bijvoorbeeld als hij troebel wordt als gevolg van besmetting met microben. Voor opslag gedurende langere perioden kan 1 g/l natriumazide worden 

toegevoegd. 

2. FIXEEROPLOSSING (optioneel) 

Voorbereiding 

Maak, ten minste 15 minuten vóór gebruik, een oplossing van de volgende bestanddelen (vol. / vol.): 60 % ethanol ; 10 % azijnzuur en 

30 % gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Goed mengen. 

Gebruik 

Voor het fixeren van door middel van elektroforese gescheiden proteïnen in agarose gels. 


De fixeeroplossing kan bij kamertemperatuur of gekoeld worden bewaard in een hermetisch afgesloten fles, om verdamping te voorkomen. Verwijder 

de oplossing na 3 maanden. Fixeer niet meer dan 4 gels per 150 ml fixeeroplossing. 

BENODIGDE UITRUSTING EN ACCESSOIRES 

1. Elektriciteitsvoorziening: GD 61 D SEBIA, Prod. nr. 1300 ; GD 251 D SEBIA, Prod. nr. 1301 ; MG 300 SEBIA, Prod. nr. 1302 of MG 500 SEBIA, 

Prod. nr. 1303. 

2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, prod. nr. 1409, bevat de HYDRAGEL K20 applicatordrager. 

3. Kamer voor natte opslag, Prod. nr. 1270. 

4. Elektroforesekamer: K20 SEBIA, prod. nr. 1400. 

5. Tanks en gelhouders voor de verwerking van gelplaten: HYDRAGEL K20 Accessory Kit SEBIA, Prod. nr. 1420. 

6. Pipetten: 5 µl, 10 µl en 200 µl. 

7. Incubatordroger: IS 80 SEBIA, prod. nr. 1430. 

8. Densitometer / flat-bed scanner die gels van 82 x 51 mm kan scannen bij 570 nm (geelfilter), bijv.: HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA of PHORESIS 

software voor flat-bed scanner. Voor de instructies met betrekking tot de installatie, werking en kalibratie wordt u naar de instructies van de 

fabrikant verwezen. 

MONSTERS VOOR ANALYSE 

Verzameling en opslag van monsters 

Verse bloedmonsters met anti-coaguleermiddel verdienen de voorkeur bij analyse (vermijd heparine jodiumacetaat als anti-coaguleermiddel). 

Algemeen toegepaste anti-coaguleermiddelen zoals de middel die EDTA, citroenzuur of heparine bevatten zijn geschikt ; vermijd het gebruik van 

middelen met jodiumacetaat. Het bloed moet volgens vastgestelde procedures, zoals toegepast bij testen in klinische laboratoria, verzameld worden. 

Indien nodig de monsters gekoeld (bij 2 tot 8 °C) opslaan gedurende 5 dagen.

- 25 - 


Voorbereiding van het monster 

• Het primaire buisje schudden voor u de totale hoeveelheid te behandelen bloed afneemt ; 

• Centrifugeer bloed met anticoaguleermiddel gedurende 5 minuten bij 5000 rpm ; 

• Verwijder het plasma ; 

• Spoel de rode bloedcellen 2 maal met 10 volumedelen fysiologische zoutoplossing ; zeer omzichtig dient men te werk te gaan bij de verwerking van 

volumedelen met rode bloedcellen kleiner dan 10 µl ; 

• Verwijder het surplus aan saline (fysiologische zoutoplossing) over de rode bloedcellen pellet en vortex deze alvorens 10 µL te nemen voor de 

hemolyse ; 

• Hemolyseer 10 µl rode bloedcellen met 130 µl hemolyserende oplossing ; 

• Meng dit gedurende 10 seconden in de vortexmixer, en laat het dan bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten incuberen. 

OPMERKINGEN: 

- Om hemolysaat te prepareren van proefpersonen die licht anemisch (ongeveer 10 g/dl Hb) of ernstig anemisch ( < 7 g/dl Hb), kan het volume van 

verpakte RBC verhoogd worden tot respectievelijk 15 µl en 20 µl. De keuringsintensiteit zal zodoende toenemen, maar de relatieve concentraties 

van de afzonderlijke fracties zal niet veranderen ; 

- Het hemolysaat hoeft niet gefilterd of gecentrifugeerd te worden. 

- De hemolyserende oplossing van SEBIA heeft geen invloed op het onstabiele hemoglobine van Bart. 

PROCEDURE 

I. MIGRATIE 

1. Plaats de HYDRAGEL K20 applicatordrager op een plat oppervlak (Fig. 1) en til het gedeelte van de applicatordrager op dat genummerde 

uitsparingen heeft. 

2. Giet 120 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water op het onderste 1/3 deel van het frame dat op de HYDRAGEL K20 applicatordrager is gedrukt. 

3. Neem de HYDRAGEL agarose gel uit de verpakking. 

4. Rol een dun filter voorzichtig en gelijkmatig over het oppervlak om zo het teveel aan vloeistof te absorberen. Verwijder het filterpapier direct. 

WAARSCHUWING: Laat het filterpapier niet te lang in contact met de gel om uitdroging te vermijden. 

5. Plaats de gelplaat (met de gelzijde naar boven) met een zijde tegen de rand aan de onderzijde van het gedrukte frame (Fig. 2). 

6. Buig de gel en breng deze naar beneden in het eerder uitgegoten water (Fig. 2). Zorg er voor dat er geen luchtbellen onder de gel gevangen 

worden, dat het water onder de gehele gelplaat wordt verdeeld en dat de gel gepositioneerd is conform het frame. 

7. Breng de applicatordrager met de genummerde uitsparingen in de tussenpositie waarbij de schakelaar in de hoogste stand staat. 

8. Plaats een applicator op een plat oppervlak zodat de putnummers zich in de ‘rechterzijde omhoog’ positie bevinden (Fig. 3) 

9. Breng 10 µl op correcte wijze verdund serummonster aan in elke spleet. Laad de applicator binnen 2 minuten. 

- Gebruik de applicator zonder vertraging 

- Voor later gebruik (tot 8 uur later) plaatst u de applicator in een natte opslagruimte, met de ‘tanden’ omhoog (alleen aan het plastic frame 

dat de tanden beschermd vastpakken). Zorg er voor dat de opslagruimte gekoeld is en plaats de gelplaat direct voorafgaand aan gebruik 

op de HYDRAGEL K20 applicatiedrager. 

Voor verdere informatie wordt u naar de bijsluiter van de natte opslagruimte verwezen. 

10. Breek het beschermende plastic frame van de tanden af. 

11. Plaats de monsterapplicator in positie nr. 4 op de applicatiedrager. 

BELANGRIJK: De nummers die op de monsterapplicator zijn gedrukt moeten voor u zichtbaar zijn (Fig. 4). 

12. Breng de applicatordrager naar beneden zodat de applicator in contact komt met het oppervlak van de gel. FORCEER DE CARRIERS NIET 

HELEMAAL NAAR BENEDEN! 

13. Na 1 minuut draait u de schakelaar om zodat de applicator omhoog gebracht kan worden. Verwijder de applicator. 

14. Plaats de gel in een geschikte elektroforesekamer, in overeenstemming met de polariteit die op de gel staat aangegeven, de onderzijde van 

de gel aan de kant van de kathode. Bij gebruik van de SEBIA K20 kamer, plaatst u de HYDRAGEL op de brug, waarbij de gelkant naar 

beneden gericht wordt ; de gel moet op een afstand van ongeveer 1 cm van elke zijde in de buffer zakken. 

Voor meer details wordt u verwezen naar de bijsluiter in de verpakking van de K20 kamer. 

15. Sluit de kamer aan op de stroomvoorziening. 

| MIGRATIECONDITIES | SEBIA K20 | 

| Volume buffer per compartiment | 150 ml | 

| Totaal buffervolume | 300 ml | 

| Migratietijd | 15 minuten | 

| Constant voltage | 165 V 

| | 

Initiële stroom (per gel) | 7 ± 2 mA | 

16. Na migratie de kamer ontkoppelen en de gelplaat verwijderen. 

II. FIXATIE 

Bewerk de gels volgens een van de hierna beschreven methoden. 

Fixatie doormiddel van hete lucht (bijvoorkeur alleen in combinatie met de SEBIA IS 80 Incubatordroger) : 

Droog de gel volledig in de incubatordroger bij een temperatuur van 80 °C (gedurende tenminste 10 minuten). 

Fixatie doormiddel van een fixeeroplossing : 

1. Plaats de gelplaat in een gelhouder (geleverd als onderdeel van de SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kit) voor verdere verwerking. 

2. Vul een container (geleverd als onderdeel van de SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kit) met 150 ml fixeeroplossing. 

3. Dompel de gedroogde en gekoelde gel gedurende precies 15 minuten onder in de fixeeroplossing. 

4. Verwijder de gel en droog deze met een hete luchtstroom in de incubatordroger type IS-80, bij een temperatuur van 80 °C. 

BELANGRIJK: De gel moet volledig droog zijn!

- 26 - 


III. KLEURING - ONTKLEURING 

1. Dompel de gedroogde en gekoelde gel gedurende 5 minuten onder in de kleuringoplossing. 

2. Ontkleur vervolgens in drie opeenvolgende baden met ontkleuringoplossing totdat de achtergrond volkomen kleurloos en helder is. 

3. Absorbeer de overtollige vloeistof op de gel met tissuepapier en droog de gel met hete lucht (80 °C). Indien nodig kunt u de achterzijde van 

de droge film met een natte tissue schoonmaken. 

IV. SCANNEN 

Scan met behulp van een densitometer / scanner met een geel filter of bij 570 nm. Bij het gebruik van de HYRYS of DVSE densitometers wordt de 

A 2 fractie op de 5 mm markering van de scanplaat geplaatst. De nulinstelling van de achtergrond wordt vastgesteld tussen de A 2 en de koolzure 

anhydrase fracties bij het laagste punt. 

OPMERKING : 

Om de meest nauwkeurige en consistente resultaten te garanderen, kunt u het volgende doen: 

- Stel de scanlengte bij zodat hij het gehele elektroforetische patroon omvat (30 mm) 

- De achtergrondnul wordt geplaatst vóór de koolzuur anhydrase fractie, op het laagste punt ; 

- Zorg ervoor dat de minima op de beide zijden van de A 2 fractie zich helemaal aan de basis van de A 2 piek bevinden. 

Het is een goede gewoonte om de gekleurde gels direct te interpreteren. Voor eventueel later gebruik kunnen de gels in een beschermende afdekking 

op een droge en donkere plaats, verwijderd van warmtebronnen bewaard worden en gedurende een periode van tenminste 3 maanden nog voor 

visuele interpretatie gebruikt worden. 

RESULTATEN 

Kwaliteitscontrole 

Het wordt aanbevolen een gekeurd controlebloedserum of een normaal controlebloedmonster dat de hemoglobinen A, F, C en S bevat, toe te voegen 

aan elke serie monsters. 

Waarden 

Scannen met de densitometer van gekleurde elektroforegrammen levert de relatieve concentraties (percentages) van de afzonderlijke proteïnezones op. 

Normale waarden (gemiddeld ± 2 SD) voor de afzonderlijke proteïnezones in HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20-gels zijn vastgesteld op basis van 

een gezonde populatie van 200 volwassenen (mannen en vrouwen): 

Hemoglobine A ≥ 96,5 % 

Hemoglobine F < 2 % (*) 

Hemoglobine A 2 ≤ 3,5 % 

(*) zie ook Interferentie en begrenzingen. 

Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium zijn eigen normaalwaarden vaststelt. 

Interpretatie 

1. Kwalitatieve afwijkingen: hemoglobinopathiën 

De meeste hemoglobinopathiën worden veroorzaakt door substitutie van een enkel aminozuur in een van de vier typen polypeptideketens als gevolg 

van mutatie. De klinische betekenis van dergelijke veranderingen hangt af van het type aminozuur en de betrokken locatie. Bij een klinisch belangrijke 

ziekte wordt of de α- of de ß-keten aangetast. 

Er zijn inmiddels meer dan 200 varianten van volwassenenhemoglobine beschreven. De eerste abnormale hemoglobinen die werden bestudeerd en 

die het meest frequent voorkomen, hebben een gewijzigde elektrische lading, hetgeen detectie door middel van elektroforese eenvoudig maakt. 

De vier belangrijkste abnormale hemoglobinen die in een bepaald klinisch belang vertegenwoordigen zijn: S, C, E en D. 

De HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 kits zijn bedoeld voor de voorlopige identificatie van hemoglobinopathiën en thalassemiën. Als er eenmaal een 

abnormaal patroon wordt vastgesteld dan moet de identiteit door middel van de juiste onderscheidende test zoals elektroforese op zure agarose gels, 

worden bevestigd. 

Hemoglobine S 

Hemoglobine S is het meest frequent. Het komt voort uit een vervanging van een glutaminezuur (een zuur aminozuur) van de ß-keten door valine (een 

neutraal aminozuur). Zijn elektroforetische mobiliteit wordt hierdoor geringer. Op alkalisch gebufferde gels, HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, 

migreert hemoglobine S tussen de A en A 2 fracties. 

Hemoglobine C 

Een glutaminezuur van de ß-keten wordt vervangen door lysine (een basisch aminozuur): de mobiliteit hiervan wordt sterk verminderd. Middels de 

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure worden C, E en A 2 gesuperponeerd. Wanneer deze fractie is > 15 %, dient men verdacht te zijn op de 

aanwezigheid van hemoglobinen C en E. 

Hemoglobine E 

Een glutaminezuur van de ß-keten wordt vervangen door lysine (een basisch aminozuur): hemoglobine E migreert op exact dezelfde wijze als 

hemoglobine C gebruikmakend van de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure. In tegenstelling tot hemoglobine C scheidt het zich echter niet 

af van hemoglobine A in een zure buffer [HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. Deze eigenschap maakt onderscheid van E en C mogelijk. 

Hemoglobine D 

Een glutaminezuur van de ß-keten wordt vervangen door glutamine. Dit hemoglobine migreert op exact dezelfde wijze als hemoglobine S via de 

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure. In tegenstelling tot hemoglobine S scheidt hemoglobine D zich echter niet af van hemoglobine A in 

een zure buffer [HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. Deze eigenschap maakt onderscheid van S en D mogelijk.

2. Kwantitatieve afwijkingen: thalassemie 

- 27 - 


Thalassemie omvat een vrij heterogene groep genetische afwijkingen die gekarakteriseerd worden door een afgenomen synthese van een type van 

de polypeptideketens. Het moleculaire mechanisme achter deze afname is nog niet geheel beschreven. 

Er zijn twee typen thalassemie-syndroom bekend: 

Alfa-thalassemie 

Deze worden gekarakteriseerd door een afname van de synthese van de α-ketens, hetgeen vervolgens de synthese van de 3 fysiologische 

hemoglobinen aantast. Het exces aan synthese van ß- en α-ketens ten opzichte van α-ketens zorgt voor de vorming van tetrameren zonder α-keten. 

• hemoglobine Bart = γ 4, 

• hemoglobine H = ß 4. 

Bèta-thalassemie 

Deze worden gekarakteriseerd door de afname van de synthese van de ß-ketens. Alleen de synthese van hemoglobine A wordt beïnvloed. Daarom 

zijn de percentages hemoglobine F en hemoglobine A 2 hoger ten opzichte van hemoglobine A. 

3. Migratiepatronen 

Migratie van normale 

hemoglobinen 

A(A0 + A1 ) A (A0 + A1 ) 

F 

S - D 

A2 A2 - C - E 

koolzure anhydrase koolzure anhydrase 

applicatiepunt 

A 0 : De niet-geglyceerde fractie van het normaal volwassenen hemoglobine A. 

A 1 : De geglyceerde fractie van het normaal volwassenen hemoglobine A. 

In de hierboven weergegeven patronen is de anodo beneden en de kathode aan de bovenzijde. 

Interferentie en begrenzingen 

• Gebruik geen gehemolyseerde bloedmonsters. 

• Als er een afwijkend hemoglobine wordt waargenomen dat zich anders gedraagt dan de belangrijkste hemoglobine varianten S, C, D en E, dan 

moeten andere identificatiemiddelen gebruikt worden (bijv. isoelectrische focussering, globine-keten elektroforese), of vraag advies bij of zend een 

monster aan, een gespecialiseerd laboratorium. 

• De densitometrische keuring van Hb F (of enig ander minder belangrijk hemoglobine dat in de buurt van de belangrijke fracties migreert) is semikwantitatief 

aangezien de waarden onnauwkeurig worden beneden de 2 - 3 % van het totale hemoglobine. 

• De monsters van bepaalde patiënten met een homozygote hemoglobine S, die behandeld zijn met Hydrea® (hydroxycarbamide) kunnen een 

hemoglobine F vertonen die door deze behandeling is gesynthetiseerd. Bij enkele gevallen heeft men kunnen waarnemen dat deze geïnduceerde 

hemoglobine F een mobiliteit heeft op de HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E)-gels die licht verschilt van die van de natuurlijke hemoglobine F. 

• Soms, wanneer monsters langer dan zeven dagen bewaard worden, kan er een geconcentreerde fractie worden waargenomen door de vlek die 

zich achter de Hb A-fractie bevindt. Deze fractie mag niet worden verward met een hemoglobinevariant, zoals bijvoorbeeld hemoglobine H of Bart. 

Troubleshooting 

Bel de technische dienst van de leverancier als de test mislukt terwijl de instructies voor de voorbereiding en opslag van materialen, en voor de 

procedure, nauwkeurig werden gevolgd. 

De veiligheidsbladen behorend bij de reagentia in de Kit als ook informatie over de verwerking van afval of restproducten kunt u verkrijgen bij de 

Technische Dienst van de leverancier. 

UITSLAGGEGEVENS 

Migratie van belangrijke 

afwijkende hemoglobinen 

Alle uitslaggegevens zijn gebaseerd op een studie in meerdere laboratoria waarbij de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure en een ander 

op de markt verkrijgbaar agarose gelsysteem werd toegepast. In aanvulling hierop werden concordantiestudies uitgevoerd waarbij de identiteit van de 

hemoglobinen en hun waarden werden vastgesteld met behulp van andere, geaccepteerde, methoden. De resultaten van representatieve voorbeelden 

van de studies worden hier gepresenteerd. 

Alle elektroforegrammen zijn visueel geïnterpreteerd. SEBIA’s HYRYS densitometer werd bij alle densitometrische evaluaties toegepast om waar 

nodig de visuele informatie aan te vullen. 

Reproduceerbaarheid binnen een serie 

Er werd elektroforese uitgevoerd op drie bloedmonsters, op een enkele partij gels gebruikmakend van de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

procedure. Elk van de monsters werd getest in alle tracks van een enkele gel. De onderstaande tabel toont de gemiddelden, SD en CV voor ieder 

afzonderlijk hemoglobinecomponent in de drie monsters, berekend aan de hand van de densitometrische percentage waarden voor ieder track. Verder 

zijn bij geen van de herhalingen valse negatieve of valse positieve waarden geconstateerd.

- 28 - 


| COMPONENT | GEMIDDELDE | SD | CV (%) | 

| Normaal bloed | 

| Hb A | 97.4 | 0.1 | 0.1 | 

| Hb A | 2 2.6 | 0.1 | 5.3 | 

| Verhoogd Hb A2 | 

| Hb A | 95.2 | 0.2 | 0.2 | 

| Hb A | 2 4.8 | 0.2 | 4.4 | 

| Verhoogd Hb C | 

| Hb A | 56.7 | 0.4 | 0.8 | 

| Hb C | 43.3 | 0.4 | 1.0 | 

Reproduceerbaarheid tussen series 

Er werd elektroforese uitgevoerd op bloedmonsters, gebruikmakend van de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure, op gels uit een enkele 

partij. Onder de geanalyseerde monsters bevonden zich zeven monsters met een afwijkend hemoglobine (Hb S, Hb F of Hb C), twee monsters met 

een verhoogd Hb A 2 , en de rest bestond uit normale bloedmonsters. De gemiddelden, SD en CV werden berekend aan de hand van de gegevens die 

verkregen waren voor iedere component in elk monster. De spreiding van de gemiddelden, SD en CV, en de gemiddelde CV die de verzamelde 

afzonderlijke componenten vertegenwoordigt, zijn in onderstaande tabel weergegeven. Verder zijn bij geen van de herhalingen valse negatieve of 

valse positieve waarden geconstateerd. 

| COMPONENT | GEMIDDELDE | SD | CV (%) | GEMIDDELDE CV (%) | 

| Hb A | 18.0 - 97.8 | 0.1 - 1.0 | 0.1 - 4.0 | 0.8 | 

| Hb F | 13.3 - 76.3 | 0.5 - 0.6 | 0.7 - 3.4 | 1.8 | 

| Hb C | 21.5 - 43.5 | 0.2 - 0.3 | 0.6 - 1.1 | 0.8 | 

| Hb S/D | 9.7 - 84.1 | 0.1 - 0.6 | 0.4 - 2.6 | 1.1 

| | 

Hb A | 2 2.2 - 5.7 | 0.1 - 0.2 | 2.3 - 7.6 | 4.0 | 

Nauwkeurigheid - detectie van hemoglobineafwijkingen 

Drieënzestig (63) verschillende bloedmonsters werden geanalyseerd met behulp van de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure en een ander 

op de markt verkrijgbaar agarose gelsysteem. De bloedmonsters en hun diagnostische beoordeling werden geleverd door een ziekenhuis. De 

diagnose was gebaseerd op een routine alkalische gel en zure gel elektroforese en/of HPLC. Alle afwijkende hemoglobinen of afwijkende niveaus van 

normale hemoglobinen die met de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure werden gedetecteerd, kwamen overeen met het vergelijkende 

gelsysteem, de ziekenhuisresultaten en de klinische diagnose. Er werden geen gevallen aangetroffen van incorrecte positieven, d.w.z. detectie van 

een afwijkende band of een afwijkend niveau van een normale band waar een dergelijke afwijking niet bestond in de realiteit. 

Nauwkeurigheid - kwantitatieve determinering van Hb A 2 

De Hb A 2 niveaus werden gemeten bij 51 bloedmonsters met normale en verhoogde Hb A 2 niveaus door middel van densitometrie van de 

elektroforetische scheidingen verkregen met de HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 procedure. De gemeten waarden uit de procedure werden 

geanalyseerd met een statistische lineaire regressie procedure en verscheidene statistische hulpmiddelen voor aanname/verwerping van de 

nulhypothese van geen verschil tussen twee procedures. De resultaten van de lineaire regressie analyse worden in onderstaande tabel weergegeven 

(y = HYDRAGEL). 

| Correlatie | y-Intercept | Helling | Spreiding van % waarden | 

| coëfficiënt | | | (SEBIA-systeem) | 

| 0.973 | -0.344 | 0.963 | 1.5 - 5.7 | 

BIBLIOGRAFIE 






860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


UTILIZZO 

- 29 - 


Il kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 è stato progettato per la separazione delle emoglobine normali (A e A 2 ) e per la rivelazione delle maggiori 

varianti dell’emoglobina: S o D e C o E mediante elettroforesi su gel di agarosio tamponato in mezzo alcalino. Gli elettroforegrammi risultanti sono 

interpretati visivamente per la valutazione dei quadri anormali. La densitometria trova applicazione pratica nell’aiuto all’interpretazione dei quadri 

elettroforetici, fornendo la quantificazione relativa delle singole frazioni. Per confermare l’identificazione delle emoglobine varianti, in particolare per 

differenziare l’emoglobina S dalla D e la E dalla C, dovrebbe essere eseguita l’elettroforesi su gel acido, utilizzando la metodica HYDRAGEL ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) K20. 

Ogni gel di agarosio del kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, permette di processare 7 campioni. 

Per uso diagnostico in vitro. 

PRINCIPIO DEL METODO 

L’emoglobina è una molecola complessa composta da due coppie di catene polipeptidiche. Ogni catena è collegata all’eme, un nucleo tetrapirrolico 

(porfirina) chelato ad un atomo di ferro. L’eme è comune a tutte le emoglobine e alle loro varianti. Il tipo di emoglobina è determinato dalla parte 

proteica chiamata globina. Le catene polipeptidiche α, ß, δ e γ costituiscono le emoglobine umane normali: 

• emoglobina A....................... = α 2 ß 2 

• emoglobina A 2 ..................... = α 2 δ 2 

• emoglobina fetale F............. = α 2 γ 2 

La catena α è comune a queste tre emoglobine. 

La struttura spaziale e le altre proprietà molecolari dell’emoglobina (come quelle di tutte le proteine), dipendono dalla natura e dalla sequenza degli 

aminoacidi che formano le catene. La sostituzione di un aminoacido per mutazione è responsabile della formazione di emoglobine varianti che hanno 

differenti cariche superficiali e quindi diversa mobilità elettroforetica, in funzione anche del pH e della forza ionica del tampone. 

Le risultanti anomalie qualitative (o strutturali) sono chiamate emoglobinopatie. La diminuzione di sintesi di una delle catene emoglobiniche, comporta 

anormalità di tipo quantitativo (o di regolazione), denominate talassemie. 

L’analisi è eseguita con emolisato di globuli rossi lavati. Le emoglobine sono separate elettroforeticamente su gels alcalini e le frazioni sono colorate 

con una soluzione di amidoschwarz. I gels essiccati sono pronti per l’interpretazione. 

REAGENTI E MATERIALI FORNITI NEL KIT HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

| COMPONENTI | PN 3010 | 

| Gels di Agarosio (pronti all’uso) | 10 gels | 

| Tampone tris-barbital (soluzione concentrata) | 3 flaconi da 75 mL | 

| Diluente per la soluzione colorante (soluzione concentrata) | 1 flacone da 60 mL | 

| Colorante Amidoschwarz (soluzione concentrata) | 1 flacone da 20 mL | 

| Soluzione decolorante (soluzione concentrata) | 1 flacone da 100 mL | 

| Soluzione emolizzante (pronta all’uso) | 1 flacone da 20 mL | 

| Applicatori a 7 dentini (pronti all’uso) | 1 confezione da 10 

| 

| 

Cartine da filtro – Sottili | 1 confezione da 10 | 

PER RISULTATI OTTIMALI 

I componenti di uno stesso kit devono sempre essere utilizzati insieme, in accordo con le istruzioni contenute nel kit. 

LEGGERE ATTENTAMENTE LE ISTRUZIONI PER L’USO. 

1. GELS DI AGAROSIO 

Preparazione 

I gels di agarosio sono pronti all’uso. Ogni gels di agarosio contiene: agarosio, 0.8 g/dL ; tampone alcalino pH 8.5 ± 0.1 ; additivi, non rischiosi alle 

concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi. 

Utilizzo 

Mezzo di supporto per elettroforesi delle emoglobine. 

Conservazione, stabilità e segni di deterioramento 

Conservare i gels orizzontalmente, nella confezione originale protettiva, a temperatura ambiente (15 - 30 °C) o in frigorifero (2 - 8 °C). I gels sono 

stabili fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sulla confezione del gel. (La freccia sulla scatola del kit deve essere rivolta verso l’alto). 

Evitare, durante la conservazione, significative variazioni di temperatura (es., non conservare in prossimità di finestre o di sorgenti di calore). 

NON CONGELARE. 

Non utilizzare il gel quando: 

(i) sono presenti cristalli o precipitati sulla superficie del gel oppure la struttura del gel è divenuta molto molle (entrambe conseguenze del 

congelamento del gel), 

(ii) è presente muffa o flora batterica, 

(iii) è presente, nella scatola che contiene il gel, una quantità anormale di liquido (risultato di una fuoriuscita del tampone dal gel dovuta a condizioni 

di conservazione improprie). 

2. TAMPONE TRIS-BARBITAL 

Preparazione 

Ogni flacone di soluzione tampone concentrata deve essere diluito ad 1 litro con acqua distillata o deionizzata. Dopo la diluizione, la soluzione di 

utilizzo contiene: tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; sodio azide. 

FOGLIO DI ISTRUZIONI SEBIA - Italiano

- 30 - 


AVVERTENZA: Ogni flacone di tampone in soluzione concentrata contiene 2.45 % di barbital, 13.73 % di barbital sodico e 0.13 % di sodio 

azide. Non ingerire! Se ingerito consultare immediatamente un medico! Evitare il contatto con acidi, piombo o rame poiché possono 

originare composti esplosivi o tossici con la sodio azide. Quando smaltito, fare scorrere un’abbondante quantità d’acqua. 

Utilizzo 

Tampone per elettroforesi. 


Conservare la soluzione concentrata a temperatura ambiente o refrigerata. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla 

confezione del kit o sull’etichetta del flacone di tampone. La soluzione tampone diluita è stabile per un anno se conservata a temperatura ambiente 

in un flacone chiuso. 

Eliminare la soluzione tampone diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche. 

3. DILUENTE PER LA SOLUZIONE COLORANTE 

Preparazione 

Il diluente per il colorante deve essere utilizzato come descritto nel paragrafo "COLORANTE AMIDOSCHWARZ". 

Contiene una soluzione acida. 

Utilizzo 

Per la preparazione della soluzione colorante amidoschwarz. 


Conservare il diluente concentrato per il colorante a temperatura ambiente o in frigorifero. E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola 

del kit o sull’etichetta del diluente. NON CONGELARE. 

Non aggiungere sodio azide. 

4. COLORANTE AMIDOSCHWARZ 

Preparazione 

Il colorante amidoschwarz concentrato è una soluzione viscosa, che può eventualmente gelificare, senza che la qualità della soluzione finale e del 

suo potere colorante siano minimamente alterati. 

Per ottenere una perfetta ricostituzione del colorante, bisogna rispettare il seguente protocollo. 

1. Aggiungere circa 15 mL di diluente del colorante al flacone di amidoschwarz concentrato. 

2. Chiudere accuratamente il flacone. 

3. Agitare con molto vigore il flacone per almeno 5 secondi. 

4. Versare la soluzione ottenuta nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione. 

5. Ripetere questa operazione due o tre volte se necessario. 

6. Versare il resto del diluente nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione. 

7. Completare a 300 mL con acqua distillata o demineralizzata. 

8. Agitare perfettamente questa soluzione per 5 - 10 minuti. 

Il colorante è pronto all’uso. 

Dopo la diluizione, la soluzione di colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; Etilen-glicol, 6,7 % ; componenti, non pericolosi 

alle concentrazioni utilizzate, necessarie per i risultati ottimali. 

AVVERTENZA: Nocivo in caso di ingestione. 

Utilizzo 

Per la colorazione dei gels dopo la separazione elettroforetica delle proteine. 

IMPORTANTE: La soluzione colorante è destinata alla colorazione di solamente 10 gels. Sostituire la soluzione colorante dopo 10 cicli di colorazione. 


Conservare sia la soluzione concentrata del colorante sia quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero, in contenitore chiuso per prevenire 

l’evaporazione. La soluzione concentrata del colorante è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del colorante. 

Il colorante diluito è stabile 1 mese. 

Non conservare la soluzione di colorante diluita in prossimità di una sorgente di calore. 

5. SOLUZIONE DECOLORANTE 

Preparazione 

Il flacone di soluzione decolorante deve essere diluito a 100 litri con acqua deionizzata o distillata. Per convenienza diluire 1 mL di soluzione 

concentrata ad un litro. 

Dopo la diluizione, la soluzione decolorante contiene: acido citrico, 0.05 g/dL. 

Utilizzo 

Come decolorante, ossia per rimuovere l’eccesso di colorante e la colorazione di fondo dal gel. 


Conservare la soluzione decolorante concentrata a temperatura ambiente o refrigerata. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza 

indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del decolorante. La soluzione diluita del decolorante è stabile per una settimana a temperatura ambiente 

in flacone chiuso. 

Eliminare la soluzione decolorante diluita se muta d’aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni microbiche. 

Non aggiungere sodio azide. 

Per periodi di conservazione superiori ad una settimana, prevenire i fenomeni di proliferazione microbica aggiungendo, nella soluzione decolorante 

diluita, 5 µL/dL di ProClin 300. 

La soluzione decolorante diluita addizionata con ProClin e conservata a temperatura ambiente o in frigorifero in bottiglia chiusa, è stabile fino alla data 

di scadenza indicata sulla confezione o sull’etichetta del flacone di decolorante. 

6. SOLUZIONE EMOLIZZANTE 

Preparazione 

La soluzione emolizzante è pronta all’uso. Costituita da tampone con additivi, non rischiosi alle concentrazioni utilizzate, necessari per ottimizzare 

l’analisi. 

Utilizzo 

Per emolizzare i globuli rossi.

- 31 - 


Conservazione 

Conservare la soluzione emolizzante a temperatura ambiente o refrigerata. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla 

scatola del kit o sull’etichetta del flacone. 

Eliminare la soluzione emolizzante se muta d’aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni microbiche. 

7. APPLICATORI 

Utilizzo 

Applicatori monouso pretagliati, per l’applicazione dei campioni sul gel. 

Conservazione 

Conservare gli applicatori in un luogo asciutto, a temperatura ambiente o in frigorifero. 

8. CARTINE DA FILTRO - SOTTILI 

Utilizzo 

Cartine assorbenti, monouso, per eliminare l’eccesso di liquido dalla superficie del gel, prima dell’applicazione del campione. 

Conservazione 

Conservare le cartine da filtro sottili in luogo secco a temperatura ambiente o in frigorifero. 

REAGENTI RICHIESTI MA NON FORNITI 

1. SOLUZIONE FISIOLOGICA 

Preparazione 

Preparare una soluzione 0.15 M (0.9 g/dL) di NaCl in acqua distillata o deionizzata. 

Utilizzo 

Per il lavaggio dei globuli rossi. 


Conservare a temperatura ambiente o refrigerata. Eliminare comunque dopo 3 mesi oppure se muta di aspetto, es., diviene torbida a causa di 

contaminazione microbica. Per una conservazione più lunga aggiungere sodio azide, 0.1 g/dL. 

2. SOLUZIONE FISSATIVA (facoltativa) 

Preparazione 

Almeno 15 minuti prima dell’utilizzo preparare una soluzione contenente (vol./vol.): 60 % etanolo, 10 % acido acetico, e 30 % acqua distillata o 

deionizzata. Agitare bene. 

Utilizzo 

Per fissare le emoglobine separate elettroforeticamente su gel di agarosio. 


Conservare a temperatura ambiente in flacone chiuso, per evitare l’evaporazione. Non fissare più di quattro gel con i medesimi 150 mL di fissativo. 

Eliminare dopo tre mesi. 

APPARECCHIATURE ED ACCESSORI RICHIESTI MA NON FORNITI 

1. Alimentatore: GD61D SEBIA, PN 1300 ; GD251D SEBIA, PN 1301 ; MG300 SEBIA, PN 1302 o MG500 SEBIA, PN 1303. 

2. APPLICATORE HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1409, contenente il porta applicatori HYDRAGEL K20. 

3. Camera umida di conservazione, PN 1270. 

4. Camera elettroforetica: K20 SEBIA, PN 1400. 

5. Vaschette e telai porta gel per processare le lastrine di gel: Kit Accessori HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420. 

6. Pipette: 5 µL, 10 µL e 200 µL. 

7. Essiccatore-incubatore: IS 80 SEBIA, PN 1430. 

8. Densitometro / Scanner in grado di effettuare la scansione di gels 82 x 51 mm a 570 nm (filtro giallo): HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA o programma 

PHORESIS per Scanner a piano fisso. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per le procedure di lavoro e di calibrazione. 

CAMPIONI PER L’ANALISI 

Raccolta e conservazione del campione 

Per l’analisi sono consigliati campioni di sangue freschi trattati con anticoagulante. Sono utilizzabili i comuni anticoagulanti, come quelli contenenti 

EDTA, citrato o eparina ; evitare gli anticoagulanti con iodoacetato. I campioni di sangue devono essere prelevati seguendo la procedura 

convenzionale per i tests clinici di laboratorio. Se necessario conservare i campioni a 2 - 8 °C fino ad un massimo di 5 giorni. 

Preparazione del campione 

• Agitare la provetta primaria prima di prelevare il volume di sangue totale da trattare. 

• Centrifugare il sangue con anticoagulante a 5000 rpm per 5 minuti. 

• Eliminare il plasma. 

• Lavare i globuli rossi 2 volte con 10 volumi di soluzione fisiologica ; grande cura deve essere posta quando si trattano volumi di globuli rossi inferiori 

a 10 µl. 

• Eliminare l’eccesso di soluzione fisiologica sovranatante ai globuli rossi impaccati, quindi agitare con vortex prima di prelevare i 10 µL da emolisare. 

• Emolizzare 10 µl di globuli rossi impaccati con 130 µl di soluzione emolizzante. 

• Agitare per 10 secondi ed incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.

- 32 - 


NOTA: 

- Per preparare emolisati di soggetti lievemente anemici (Hb di circa 10 g/dL) o gravemente anemici (Hb < 7 g/dL), il volume di globuli rossi 

impaccati deve essere incrementato rispettivamente a 15 µl e a 20 µl. L’intensità della colorazione risulterà aumentata, ma le concentrazioni 

relative delle singole frazioni non cambieranno. 

- L’emolisato non deve essere filtrato o centrifugato. 

- La Soluzione Emolizzante SEBIA non ha effetti sulla stabilità dell’emoglobina Bart’s. 

PROCEDURA 

I. MIGRAZIONE 

1. Posizionare il porta applicatore HYDRAGEL K20 su una superficie piana (Fig. 1) ed alzare la cornice porta applicatore (quella con le fessure 

numerate). 

2. Dispensare 120 µL di acqua distillata o deionizzata sul terzo inferiore del riquadro stampato sul porta applicatore HYDRAGEL K20. 

3. Estrarre il gel HYDRAGEL dalla confezione. 

4. Eliminare rapidamente l’eccesso di liquido in superficie, tamponando il gel con una carta assorbente sottile 

ATTENZIONE : Fate attenzione a non lasciare la carta da filtro troppo a lungo a contatto con il gel per evitarne la disidratazione. 

5. Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 2) 

6. Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia d’acqua (Fig. 2). Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere 

uniformemente stratificata sotto la lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato. 

7. Abbassare la cornice porta applicatore fino alla posizione intermedia, con la manopola ruotata in alto. 

8. Posizionare un applicatore su di una superficie piana con i numeri dei pozzetti orientati correttamente verso l’alto (Fig. 3). 

9. Applicare in ogni pozzetto 10 µL di campione emolizzato. Caricare l’applicatore entro 2 minuti. 

- Utilizzare l’applicatore senza alcun ritardo. 

- Per un utilizzo successivo (fino ad 8 ore), inserire l’applicatore nella camera umida di conservazione, con i dentini rivolti verso l’alto 

(maneggiare il depositore mediante la cornice protettiva in plastica), mantenendo l’intera camera in frigorifero e preparando la lastrina di gel, 

sul porta applicatore HYDRAGEL K20, appena prima dell’uso. 

Consultare l’inserto all’interno della confezione della camera umida per ulteriori dettagli. 

10. Staccare la cornice protettiva dei dentini dell’applicatore. 

11. Inserire l’applicatore sulla cornice mobile in posizione No. 4. 

IMPORTANTE: I numeri stampati sull’applicatore devono essere rivolti verso l’operatore (Fig. 4). 

12. Abbassare la cornice porta applicatore in modo che l’applicatore entri in contatto con la superficie del gel. NON FORZARE LA CORNICE AD 

ABBASSARSI ULTERIORMENTE. 

13. Dopo 1 minuto, ruotare la manopola per sollevare l’applicatore, rimuovere l’applicatore ed eliminarlo. 

14. Mettere il gel in un’appropriata camera elettroforetica, in accordo alla polarità indicata sul gel. Quando è utilizzata la camera SEBIA K20, 

posizionare il gel sul ponte in modo che la superficie del gel sia rivolta verso il basso ; il gel deve essere immerso per circa 1 cm nel tampone 

su entrambi i lati. 

Per ulteriori dettagli consultare l’inserto contenuto nella camera K20. 

15. Collegare la camera all’alimentatore. 

| CONDIZIONI DI MIGRAZIONE | SEBIA K20 | 

| Volume di tampone per compartimento | 150 mL | 

| Volume totale di tampone | 300 mL | 

| Tempo di migrazione | 15 minuti | 

| Voltaggio costante | 165 V 

| 

| 

Amperaggio iniziale (un gel) | 7 ± 2 mA | 

16. Dopo la migrazione, scollegare la camera e rimuovere la lastrina di gel. 

II. FISSAZIONE 

Trattare i gels con una delle seguenti procedure. 

Fissazione con aria calda (raccomandata solo con essiccatore-incubatore SEBIA IS 80): 

Essiccare completamente il gel nell’incubatore-essiccatore ad 80 °C (per un minimo di 10 min.). 

Fissazione con soluzione fissativa 

1. Posizionare il gel nel telaio porta gel (fornito con il Kit Accessori HYDRAGEL K20 SEBIA) per i trattamenti successivi. 

2. Riempire una vaschetta (fornita con il Kit Accessori HYDRAGEL K20 SEBIA) con 150 mL di soluzione fissativa. 

3. Immergere verticalmente il gel nella soluzione fissativa per 15 minuti. 

4. Rimuovere il gel ed essiccarlo con un flusso di aria calda ad 80 °C nell’incubatore-essiccatore IS 80. 

IMPORTANTE: Il gel deve essere perfettamente essiccato. 

III. COLORAZIONE - DECOLORAZIONE 

1. Dopo l’essiccazione immergere verticalmente il gel asciugato e raffreddato nella soluzione colorante per 5 minuti. 

2. Decolorare in tre successivi bagni di soluzione decolorante fino a quando il gel è privo di colorazione di fondo. 

3. Rimuovere l’eccesso di liquido sulla superficie del gel con una cartina assorbente ed essiccare il gel con aria calda ad 80 °C. Se necessario 

pulire il retro della lastrina (faccia di supporto) con carta morbida inumidita.

- 33 - 


IV. SCANSIONE 

Effettuare la scansione usando un densitometro / scanner con filtro giallo o a 570 nm. 

Quando si utilizza uno dei densitometri HYRYS o DVSE, posizionare la frazione A 2 sul segno dei 5 mm della piastra di lettura: lo zero è effettuato, nel 

punto più basso, tra le frazioni A 2 e anidrasi carbonica. 

NOTA: Per assicurare i risultati più accurati e precisi, attenersi alla seguente procedura: 

- Regolare la lunghezza di scansione per includere l’intero quadro elettroforetico (30 mm). 

- Assicurarsi che i minimi, su ambedue i lati della frazione A 2 , siano posti ai piedi del picco. 

E’ buona prassi leggere i gels colorati senza ritardi. Per consultazioni successive, possono essere conservati in un astuccio protettivo, all’asciutto, 

protetti dalla luce e lontani da fonti di calore ed interpretati visivamente entro 3 mesi. 

RISULTATI 

Controllo Qualità 

Si consiglia di includere, in ogni gruppo di campioni processati, un sangue di controllo o un campione di sangue noto contenente emoglobine A, F, C e S. 

Valori 

La lettura densitometrica degli elettroforegrammi colorati, fornisce le concentrazioni relative (percentuali) delle singole zone proteiche. 

I valori normali (media ± 2 DS), utilizzando la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, sono stati determinati su una popolazione sana di 

200 adulti (uomini e donne) : 

Emoglobina A ≥ 96,5 % 

Emoglobina F < 2,0 % (*) 

Emoglobina A2 ≤ 3,5 % 

(*) vedi Interferenze e limitazioni 

Si raccomanda ad ogni laboratorio di stabilire i propri valori normali. 

Interpretazioni 

1. Anomalie qualitative: Emoglobinopatie 

La maggior parte delle emoglobinopatie sono dovute alla sostituzione, per mutazione, di un singolo aminoacido in una dei quattro tipi di catene 

polipeptidiche. Il significato clinico della mutazione varia in funzione del tipo di aminoacido e della posizione coinvolti. Nelle malattie clinicamente 

significative, è affetta la catena α o la catena ß (talvolta la catena γ). 

Più di 200 varietà di emoglobine adulte sono già state descritte. Le prime emoglobine anomale studiate, nonché le più numerose, presentano 

un’alterata carica elettrica netta e ciò ne consente una semplice individuazione attraverso l’elettroforesi. 

Sono quattro le principali emoglobine anomale che presentano un particolare interesse clinico: S, C, E e D. 

Il kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, è rivolto alla identificazione preliminare delle emoglobinopatie e delle talassemie. Quando si evidenzia un 

quadro anormale, l’identificazione deve essere confermata da un test discriminatorio appropriato (es., elettroforesi su gel di agarosio acido). 

Emoglobina S 

L’emoglobina S è la più frequente. E’ dovuta alla sostituzione di un acido glutammico (aminoacido acido) della catena ß, con valina (aminoacido 

neutro). La sua mobilità elettroforetica è quindi rallentata. Su HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 tamponato in mezzo alcalino, l’emoglobina S migra 

fra le frazioni A e A 2 . 

Emoglobina C 

Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla lisina (aminoacido basico): la sua mobilità è fortemente ridotta. Con la metodica HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20, le emoglobine C, E ed A 2 sono sovrapposte. Quando questa frazione è superiore al 15 % deve essere sospettata la presenza 

di emoglobine C ed E. 

Emoglobina E 

Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla lisina: con la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, l’emoglobina E migra esattamente 

come la C. Diversamente dalla C, non si separa dalla A in tampone acido (HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20). Questa proprietà permette 

di differenziare la E e la C. 

Emoglobina D 

Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla glutammina: su HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, l’emoglobina D migra esattamente come 

la S. Diversamente dall’emoglobina S, la D non si separa dalla A in tampone acido (HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20). Questa proprietà 

permette di differenziare la S e la D. 

2. Anomalie quantitative: Talassemie 

Le talassemie costituiscono un gruppo pressoché eterogeneo di affezioni genetiche caratterizzate dalla riduzione del livello di sintesi di uno o più tipi 

di catena polipeptidica. Il meccanismo molecolare di questa riduzione non è stato ancora completamente descritto. 

Ci sono due tipi di sindromi talassemiche: 

Alfa-talassemie 

Sono caratterizzate da una ridotta sintesi delle catene α che, quindi, condiziona la sintesi di tutte le emoglobine normali. 

L’eccesso di sintesi delle catene ß e γ rispetto alla catena α, induce la formazione di tetrameri senza nessuna catena α: 

• Emoglobina Bart = γ 4, 

• Emoglobina H = ß 4.

- 34 - 


Beta-talassemie 

Sono caratterizzate da una riduzione di sintesi delle catene ß. Solo la sintesi dell’emoglobina A è compromessa. Ne consegue che la percentuale delle 

emoglobine F ed A 2 risulta incrementata rispetto alla A. 

3. Quadri di migrazione 

Migrazione di 

emoglobine normali 

A(A0 + A1 ) A (A0 + A1 ) 

F 

S - D 

A2 A2 - C - E 

anidrasi anidrasi 

punto di applicazione 

A 0 : la frazione non glicata dell’emoglobina adulta normale A. 

A 1 : la frazione glicata dell’emoglobina adulta normale A. 

Nei quadri riprodotti, il catodo è in basso e l’anodo in alto 

Interferenze e limitazioni 

• Non utilizzare campioni di sangue emolizzati. 

• Quando è rilevata un’emoglobina anomala, che migra differentemente dalle principali emoglobine varianti S, C, D ed E, utilizzare un metodo 

d’identificazione diverso (es., isoelettrofocalizzazione, elettroforesi delle catene globiniche), o consultare o inviare il campione ad un laboratorio 

specializzato. 

• Il dosaggio densitometrico della Hb F (o di qualunque altra emoglobina minore che migri in prossimità di una frazione maggiore) è semi-quantitativo, 

poiché il valore diventa inaccurato quando inferiore al 2 - 3 % dell’emoglobina totale. 

• I campioni di alcuni pazienti con emoglobina omozigote “S”, trattati con Hydrea® (idrossiurea), possono presentare una emoglobina F dovuta alla 

sintesi indotta dal trattamento. Su HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), in alcuni casi, è stata osservata una mobilità dell’emoglobina F indotta 

leggermente diversa da quella dell’emoglobina F fisiologica. 

• In campioni conservati per più di 7 giorni, può essere osservata una focalizzazione dell’addensamento localizzato dietro alla frazione Hb A, che non 

deve essere interpretato come una variante emoglobinica, es., emoglobine H o Bart. 

Eliminazione errori 

Contattare il Servizio di Assistenza Tecnica del fornitore quando, nonostante siano state seguite accuratamente le istruzioni per la preparazione e 

conservazione dei materiali e per la procedura di impiego, i risultati del test non rispettino le caratteristiche. 

Le Schede di Sicurezza dei componenti del kit e le informazioni per lo smaltimento dei rifiuti sono disponibili presso il Servizio di Assistenza Tecnica 

SEBIA. 

DATI SULLE PRESTAZIONI 

Migrazione delle principali 

emoglobine anormali 

Tutti i dati sulle prestazioni, sono basati su uno studio che comprende materiali e strumenti SEBIA HYDRAGEL, comparati ad un sistema in agarosio 

reperibile in commercio. Inoltre, sono stati eseguiti studi di correlazione quando l’identificazione delle emoglobine e dei loro valori erano stati stabiliti 

con altre metodiche validate. Di seguito sono presentati esempi rappresentativi degli studi sulle prestazioni. Tutti gli elettroforegrammi sono stati 

interpretati visivamente. Per le valutazioni densitometriche è stato utilizzato il densitometro SEBIA HYRYS. 

Riproducibilità nella serie 

Tre campioni di sangue sono stati processati con la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 su gels dello stesso lotto. Ogni campione è stato 

processato in tutte le piste del singolo gel. La tabella seguente riporta media, SD e CV di ogni componente emoglobinica dei tre campioni, calcolati 

dai valori percentuali densitometrici. Inoltre, nessuna ripetizione ha fornito dati falsamente positivi o negativi. 

| COMPONENTE | MEDIA | SD | CV (%) | 

| Campione normale | 

| Hb A | 97.4 | 0.1 | 0.1 | 

| Hb A | 2 2.6 | 0.1 | 5.3 | 

| Elevata Hb A2 | 

| Hb A | 95.2 | 0.2 | 0.2 | 

| Hb A | 2 4.8 | 0.2 | 4.4 | 

| Elevata Hb C | 

| Hb A | 56.7 | 0.4 | 0.8 

| 

| 

Hb C | 43.3 | 0.4 | 1.0 | 

Riproducibilità tra serie 

Campioni di sangue sono stati processati elettroforeticamente con la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, su gels di un singolo lotto. I 

campioni studiati ne includevano sette con emoglobine anormali (S, F o C), due con emoglobina A 2 elevata e i rimanenti normali. Le medie, SD e CV 

sono stati calcolati dai dati di ciascuna componente di ogni campione. Nella tabella seguente sono riportate le oscillazioni della media, della DS e del 

CV, oltre al CV medio, relative ai dati aggregati delle componenti. Inoltre, nessuna ripetizione ha fornito dati falsamente positivi o negativi

- 35 - 


| COMPONENTE | MEDIA | DS | CV (%) | MEDIA CV (%) | 

| Hb A | 18.0 – 97.8 | 0.1 – 1.0 | 0.1 – 4.0 | 0.8 | 

| Hb F | 13.3 – 76.3 | 0.5 – 0.6 | 0.7 – 3.4 | 1.8 | 

| Hb C | 21.5 – 43.5 | 0.2 – 0.3 | 0.6 – 1.1 | 0.8 | 

| Hb S/D | 9.7 – 84.1 | 0.1 – 0.6 | 0.4 – 2.6 | 1.1 

| | 

Hb A | 2 2.2 – 5.7 | 0.1 – 0.2 | 2.3 – 7.6 | 4.0 | 

Accuratezza - Rilevamento delle Anomalie Emoglobiniche 

Utilizzando la metodica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 ed un diverso sistema su gel di agarosio reperibile in commercio, sono stati analizzati 

63 campioni di sangue. I campioni di sangue e le loro valutazioni diagnostiche, sono stati forniti da un ospedale. Le diagnosi erano basate sui dati 

ottenuti da elettroforesi eseguite su gels acidi ed alcalini e/o da HPLC. Tutte le emoglobine anomale o i livelli alterati di emoglobine normali rilevate 

con HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, sono risultati concordanti con il sistema su gel di comparazione, con i risultati e le diagnosi cliniche 

dell’ospedale. Non sono stati osservati casi di falsa positività, per esempio, il rilevamento di una frazione anomala o di un livello alterato di una frazione 

normale, dove non esistevano anormalità. 

Accuratezza - Determinazione Quantitativa della Hb A 2 

Utilizzando sia le letture densitometriche di elettroforesi ottenute con HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, sia le letture con HPLC, sono stati misurati 

i livelli di Hb A 2 in 51 campioni di sangue con valori normali ed elevati di Hb A 2 . I valori misurati con le due tecniche sono stati analizzati con un test 

statistico di regressione lineare. I risultati della regressione lineare sono riportati in tabella (y = HYDRAGEL). 

| Coefficiente di correlazione | y- Intercetta | Pendenza | Variazione dei valori % | 

| | | | (sistema SEBIA) | 

| 0.973 | -0.344 | 0.963 | 1.5 – 5.7 | 

BIBLIOGRAFIA 






860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


ESPECIFICACIONES DE USO 

- 36 - 


El kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 está diseñado para la separación de las hemoglobinas normales (A y A 2 ) y para la detección de las 

principales variantes de la hemoglobina: S ó D y C ó E, mediante electroforesis en geles de agarosa alcalinos. Las separaciones electroforéticas 

resultantes son evaluadas visualmente para la detección de anomalías en el patrón. La densitometría puede usarse como una ayuda en la 

interpretación al proporcionar las concentraciones relativas de las fracciones individuales. La electroforesis en geles ácidos, por ejemplo, el 

procedimiento HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20, debería utilizarse para confirmar la identificación de las variantes de hemoglobina y, en 

concreto, para diferenciar las hemoglobinas S de las D y las E de las C. 

Cada gel de agarosa en el kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 está destinado para analizar 7 muestras. 

Para Uso Diagnóstico In Vitro. 

PRINCIPIO DEL TEST 

La hemoglobina es una molécula compleja compuesta por dos pares de cadenas polipeptídicas. Cada cadena está ligada a un hemo, un núcleo 

tetrapirrólico (porfirina) al que está coordinado un átomo de hierro. La estructura hemo es común a todas las hemoglobinas y sus variantes. El tipo 

de hemoglobina está determinado por la parte proteica, llamada globina. Las cadenas polipeptídicas α, ß, δ y γ constituyen las hemoglobinas humanas 

normales: 

• hemoglobina A ................. = α 2 ß 2 

• hemoglobina A 2 ................ = α 2 δ 2 

• hemoglobina fetal F ......... = α 2 γ 2 

La cadena α es común a estas tres hemoglobinas. 

La estructura espacial de la hemoglobina y otras propiedades moleculares (como en todas las proteínas) depende de la naturaleza y la secuencia de 

los aminoácidos que forman las cadenas. La sustitución de aminoácidos por mutación es responsable de la formación de las variantes de la 

hemoglobina, que tienen una carga superficial diferente y, por consiguiente, movilidades electroforéticas diferentes, que también dependen del pH y 

de la fuerza iónica del tampón. 

Las anomalías cualitativas (o estructurales) resultantes se denominan hemoglobinopatías. La síntesis disminuida de una de las cadenas de la 

hemoglobina conlleva anomalías cuantitativas (o de regulación), denominadas talasemias. 

La técnica se realiza con glóbulos rojos lavados y hemolizados. Las hemoglobinas se separan mediante electroforesis en geles alcalinos y las 

fracciones se visualizan mediante tinción con negro amido. Los geles secos están listos para ser interpretados. 

REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

| ARTÍCULOS | PN 3010 | 

| Geles de Agarosa (listos para usar) | 10 geles | 

| Tampón Tris-Barbital (solución stock) | 3 viales de 75 mL | 

| Diluyente del colorante (solución stock) | 1 vial, 60 mL | 

| Colorante Negro Amido (solución stock) | 1 vial, 20 mL | 

| Solución Decolorante (solución stock) | 1 vial, 100 mL | 

| Solución Hemolizante (lista para usar) | 1 vial, 20 mL | 

| Aplicadores de 7 dientes (listos para usar) | 1 caja de 10 

| | 

Papeles de Filtro - Finos | 1 paquete de 10 | 

PARA OBTENER RESULTADOS ÓPTIMOS 

Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y según las instrucciones incluidas. 

LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES. 

1. GELES DE AGAROSA 

Preparación 

Los geles de agarosa están listos para su uso. Cada gel contiene: agarosa, 0.8 g/dL ; tampón alcalino pH 8.5 ± 0.1 ; aditivos, inocuos a las 

concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo. 

Uso 

Medio de soporte para la electroforesis de hemoglobinas. 

Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro 

Almacene los geles horizontalmente en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente (15 a 30 °C) o refrigerados (2 a 8 °C). (la flecha 

situada en la cara frontal de la caja del kit debe apuntar hacia arriba). Evite fluctuaciones de temperatura evidentes durante el almacenaje (por 

ejemplo, no los almacene cerca de una ventana o de una fuente de calor). Los geles son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja 

del kit o en las etiquetas de sus recipientes protectores. 

NO LOS CONGELE. 

Deseche el gel cuando: 

(i) se formen cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda (consecuencias de la congelación del gel), 

(ii) se observe crecimiento bacteriano o fúngico, 

(iii) haya una cantidad de líquido excesiva en el estuche del gel (consecuencia de la exudación del tampón debida a un almacenamiento inadecuado). 

2. TAMPÓN TRIS-BARBITAL 

Preparación 

Cada vial de la solución stock del tampón se diluye hasta 1 litro con agua destilada o desionizada. 

Después de la dilución, la solución de trabajo contiene: tris-barbital pH 9.2 ± 0.3 ; azida sódica. 

INSTRUCCIONES SEBIA - Español

- 37 - 


ADVERTENCIA: Cada vial de la solución stock del tampón contiene un 2.45 % de barbital, un 13.73 % de barbital sódico y un 0.13 % de 

azida sódica. ¡No lo ingiera! ¡Si lo ha ingerido consulte a un médico inmediatamente! Evite el contacto del producto con ácidos, plomo o 

cobre, ya que se conoce su tendencia a formar compuestos explosivos o tóxicos en contacto con la azida sódica. Lave siempre con gran 

cantidad de agua al desechar el producto. 

Uso 

Tampón de electroforesis. 


Almacene la solución stock del tampón a temperatura ambiente o refrigerada. La solución stock es estable durante varios años, por lo menos hasta 

la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las etiquetas del vial de tampón. La solución diluida del tampón es estable durante un año a 

temperatura ambiente en una botella cerrada. 

Deseche el tampón diluido si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbio debido a contaminación microbiana. 

3. DILUYENTE DEL COLORANTE 

Preparación 

El diluyente del colorante concentrado debe ser usado como se ha descrito en el párrafo "COLORANTE NEGRO AMIDO". Contiene una solución 

ácida. 

Uso 

Para la preparación del colorante negro amido. 

Conservación, estabilidad y señales de deterioro 

El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en la nevera. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada 

en el kit o en la etiqueta del vial de diluyente. NO LO CONGELE. 

No le añada azida sódica. 

4. COLORANTE NEGRO AMIDO 

Preparación 

El colorante negro amido concentrado es una solución viscosa que puede gelificarse, lo que no afecta de ningún modo a la calidad de la solución 

final y su capacidad de coloración. 

Para obtener una perfecta reconstitución del colorante, siempre hay que prepararlo como se indica a continuación : 

1. Añada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado. 

2. Cierre el vial con cuidado. 

3. Agite el vial intensamente durante un mínimo de 5 segundos. 

4. Vierta la solución obtenida en el recipiente de preparación de la solución de coloración. 

5. Repita esta operación dos veces, o tres veces si es necesario. 

6. Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparación de la solución de coloración. 

7. Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada. 

8. Agite esta solución de 5 a 10 minutos. 

El colorante está listo para usar. 

Después de la dilución, la solución colorante contiene: solución ácida pH ≈ 2 ; negro amido, 4 g/L ; etilén-glicol, 6,7 % ; aditivos inocuos a las 

concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo. 

ATENCIÓN: Nocivo en caso de ingestión. 

Uso 

Para la coloración de los geles después de la separación electroforética de las proteínas. 

IMPORTANTE: El colorante está destinado para colorear sólo 10 geles. Cambie el colorante después de 10 usos. 

Conservación, estabilidad y señales de deterioro 

Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera, en contenedores cerrados para evitar 

la evaporación. La solución concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante. 

La solución diluida es estable durante 1 mes. 

No almacene la solución de colorante diluida cerca de una fuente de calor. 

5. SOLUCIÓN DECOLORANTE 

Preparación 

Cada vial de la solución decolorante stock se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada. Es conveniente diluir sólo 1 mL de la solución 

stock hasta 1 litro. Después de la dilución, la solución de trabajo del decolorante contiene: ácido cítrico, 0.05 g/dL. 

Uso 

Para decolorar, esto es, eliminar el exceso de tinción y la coloración de fondo de los geles. 


Almacene la solución decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en 

las etiquetas del vial de decolorante. La solución decolorante de trabajo es estable durante una semana a temperatura ambiente en una botella 

cerrada. 

Deseche la solución decolorante de trabajo si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana. 

No añada azida sódica. 

Para evitar la proliferación microbiana en la solución decolorante diluida que se vaya a almacenar durante más de una semana, añada 5 µL/dL de 

ProClin 300. 

El decolorante diluido al que se ha añadido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de 

caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante. 

6. SOLUCIÓN HEMOLIZANTE 

Preparación 

La Solución Hemolizante está lista para su uso. Es un tampón con aditivos, inocuos a las concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento 

óptimo.

Uso 

Para hemolizar los glóbulos rojos. 

- 38 - 



Almacene la Solución Hemolizante a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las 

etiquetas del vial de Solución Hemolizante. 

Deseche la Solución Hemolizante si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia debido a contaminación microbiana. 

7. APLICADORES 

Uso 

Aplicadores precortados, de un solo uso, para la aplicación de las muestras. 

Almacenamiento 

Almacene los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados. 

8. PAPELES DE FILTRO - FINOS 

Uso 

Papeles de filtro finos absorbentes, de un solo uso, para absorber el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicación de las 

muestras. 

Conservación 

Conserve los papeles de filtro finos en un lugar seco a temperatura ambiente o en nevera. 

REACTIVOS NECESARIOS PERO NO SUMNINISTRADOS 

1. SALINA 

Preparación 

Prepare una solución de NaCl 0.15 M (0.9 g/dL) con agua destilada o desionizada. 

Uso 

Para lavar los glóbulos rojos. 


Almacene la salina a temperatura ambiente o refrigerada. Deséchela después de 3 meses o si cambia su aspecto, por ejemplo, se vuelve turbia 

debido a contaminación microbiana. Para periodos de almacenaje más prolongados, añada azida sódica, 0.1 g/dL. 

2. SOLUCIÓN FIJADORA (opcional) 

Preparación 

Por lo menos 15 minutos antes de usarla, prepare una solución que contenga (vol. / vol.): 60 % de etanol ; 10 % de ácido acético y 30 % de agua 

destilada o desionizada. 

Mézclela bien. 

Uso 

Para fijar las separaciones electroforéticas de hemoglobina en geles de agarosa. 


Almacene la solución fijadora a temperatura ambiente cerrada herméticamente para evitar la evaporación. Deséchela después de 3 meses. No fije 

más de 4 geles por cada 150 mL de solución fijadora. 

EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 

1. Fuente de alimentación: GD 61 D SEBIA, PN 1300 ; GD 251 D SEBIA, PN 1301 ; MG 300 SEBIA, PN 1302 ó MG 500 SEBIA, PN 1303. 

2. APLICADOR HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1409, que contiene el soporte del aplicador HYDRAGEL K20. 

3. Cámara de Almacenaje Húmeda, PN 1270. 

4. Cubeta de electroforesis: K20 SEBIA, PN 1400. 

5. Tanques y Soportes de Geles para el procesamiento de los geles: Kit de Accesorios HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420. 

6. Pipetas: 5 µL, 10 µL y 200 µL. 

7. Estufa-Secador: IS 80 SEBIA, PN 1430. 

8. Densitómetro / escáner de sobremesa capaz de escanear geles de 82 x 51 mm a 570 nm (filtro amarillo): HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA o el 

programa PHORESIS para escáner de sobremesa. Consulte las instrucciones del fabricante para los procedimientos de funcionamiento y 

calibración. 

MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS 

Extracción y almacenamiento de las muestras 

Se recomienda analizar muestras frescas de sangre no coagulada. Los anticoagulantes comunes, como los que contiene EDTA, citrato o heparina 

son aceptables ; no utilice los que contengan yodoacetato. La sangre debe obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en el 

laboratorio clínico. Si es necesario, almacene las muestras entre 2 y 8 °C hasta 5 días. 

Preparación de las muestras 

• Agite el tubo primario antes de tomar el volumen de sangre total que se va a tratar. 

• Centrifugue la sangre no coagulada a 5.000 r.p.m. durante 5 minutos. 

• Deseche el plasma. 

• Lave los glóbulos rojos 2 veces con 10 volúmenes de salina ; tenga mucho cuidado al procesar volúmenes de glóbulos rojos inferiores a 10 µL.

- 39 - 


• Elimine el exceso de solución salina que hay en la superficie del coágulo de glóbulos rojos lavados, y agítelo en el vórtex antes de pipetear los 

10 µL que se van a hemolizar. 

• Hemolice 10 µL de glóbulos rojos lavados con 130 µL de Solución Hemolizante. 

• Agite la mezcla en el vórtex durante 10 segundos e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. 

NOTAS: 

- Para preparar el hemolizado de sujetos levemente anémicos (aproximadamente 10 g/dL Hb) o gravemente anémicos (< 7 g/dL Hb), el 

volumen de glóbulos rojos lavados puede aumentarse hasta 15 µL y 20 µL, respectivamente. La intensidad de la tinción aumentará pero 

las concentraciones relativas de las fracciones individuales no cambiará. 

- El hemolizado no necesita ser filtrado o centrifugado. 

- La solución hemolizante de SEBIA no afecta a la inestable hemoglobina de Bart. 

PROCEDIMIENTO 

I. MIGRACIÓN 

1. Coloque el soporte del aplicador HYDRAGEL K20 en una superficie plana (Fig. 1) y eleve la parte del soporte del aplicador con las muescas 

numeradas. 

2. Dispense 120 µL de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco impreso en el soporte del aplicador HYDRAGEL K20. 

3. Saque el gel de agarosa HYDRAGEL de su envoltorio. 

4. Extienda un papel de filtro fino de manera rápida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de líquido. Retire el papel 

inmediatamente. 

ADVERTENCIA: Para evitar que se deshidrate, no deje que el papel de filtro contacte con el gel durante mucho tiempo. 

5. Ponga el gel (con el lado de agarosa hacia arriba) con su borde inferior contra el tope situado debajo del marco impreso (Fig. 2). 

6. Doble el gel y haga que contacte con el agua (Fig. 2). Asegúrese de que no se formen burbujas de aire, de que el agua esté extendida bajo 

toda la superficie del gel y de que éste esté alineado con el marco impreso. 

7. Baje el soporte del aplicador con las muescas numeradas hasta la posición intermedia con el interruptor en posición elevada. 

8. Coloque un aplicador en una superficie plana con los números de los pocillos hacia arriba (Fig. 3). 

9. Aplique 10 µL de muestra hemolizada en los pocillos del aplicador. Cargue cada aplicador en menos de 2 minutos. Use el aplicador sin 

demora. Para un uso posterior (hasta 8 horas después), ponga el aplicador en la cámara de almacenaje húmeda con los dientes hacia arriba 

[cójalo por el marco protector de plástico de los dientes], mantenga la cámara entera refrigerada y prepare el gel sobre el soporte del aplicador 

HYDRAGEL K20 justo antes de usarlo. 

Consulte la hoja de instrucciones de la cámara húmeda para más detalles. 

10. Rompa el marco protector de los dientes del aplicador. 

11. Ponga el aplicador de muestra en la posición No. 4 del soporte del aplicador. 

IMPORTANTE: Los números impresos en el aplicador de muestra deben quedar de cara al operario (Fig. 4). 

12. Baje el soporte del aplicador con el interruptor de forma que el aplicador contacte con la superficie del gel. NO FUERCE LOS SOPORTES 

HACIA ABAJO. 

13. Después de 1 minuto, gire el interruptor para elevar el aplicador, saque el aplicador y deséchelo. 

14. Ponga el gel en una cubeta de electroforesis apropiada, de acuerdo con la polaridad indicada en el gel. Al usar la cubeta SEBIA K20, coloque 

el HYDRAGEL en el puente con el lado de agarosa hacia abajo ; el gel debe sumergirse en el tampón alrededor de 1 cm por cada lado. 

Consulte al hoja de instrucciones de la K20 para más detalles. 

15. Conecte la cubeta a la fuente de alimentación. 

| CONDICIONES DE MIGRACIÓN | SEBIA K20 | 

| Volumen de tampón por compartimento | 150 mL | 

| Volumen total de tampón | 300 mL | 

| Tiempo de migración | 15 minutos | 

| Voltaje constante | 165 V 

| | 

Corriente inicial (por gel) | 7 ± 2 mA | 

16. Después de la migración, desconecte la cubeta y saque el gel. 

II. FIJACIÓN 

Procese los geles utilizando uno de los procedimientos siguientes. 

Fijación con aire caliente (recomendada sólo con la Estufa-Secador SEBIA IS 80) : 

Seque el gel completamente en la estufa-secador a 80 °C (durante un mínimo de 10 minutos). 

Fijación con solución fijadora: 

1. Ponga el gel en un soporte de gel (suministrado con el Kit de Accesorios SEBIA HYDRAGEL K20) para el procesamiento posterior. 

2. Llene un tanque (suministrado con el Kit de Accesorios SEBIA HYDRAGEL K20) con 150 mL de solución fijadora. 

3. Sumerja el gel en la solución fijadora durante 15 minutos. 

4. Saque el gel y séquelo con una corriente de aire caliente a 80 °C en la estufa-secador IS 80. 

IMPORTANTE: El gel debe estar perfectamente seco. 

III. TINCIÓN - DECOLORACIÓN 

1. Sumerja el gel seco y enfriado en la solución de tinción durante 5 minutos. 

2. Decolore en tres baños sucesivos de solución decolorante hasta que la coloración de fondo sea completamente incolora y clara. 

3. Absorba el exceso de líquido de la superficie del gel con un pañuelo de papel y seque el gel con aire caliente a 80 °C. Si es necesario, limpie 

el reverso del gel seco (el lado de soporte de plástico) con un pañuelo de papel humedecido.

- 40 - 


IV. LECTURA 

Escanee usando un densitómetro / escáner a 570 nm o con un filtro amarillo. Al usar los densitómetros HYRYS ó DVSE, coloque la fracción A 2 en la 

marca de 5 mm de la placa de lectura: el cero de lectura se realiza entre las fracciones de A 2 y de anhidrasa carbónica, en el punto más bajo. 

NOTA: Para asegurar que se obtienen los resultados más exactos y constantes posibles, haga lo siguiente: 

- Ajuste la longitud de lectura para incluir el patrón electroforético entero (≈ 30 mm). 

- Asegúrese de que los mínimos situados a ambos lados de la fracción A 2 están colocados en los pies del pico de A 2 . 

Es una buena práctica efectuar la lectura densitométrica de los geles teñidos sin demora. Para consultas futuras, se pueden guardar en una cubierta 

protectora en un lugar seco y oscuro, alejado de fuentes de calor y se pueden interpretar visualmente durante 3 meses por lo menos. 

RESULTADOS 

Control de Calidad 

Se aconseja incluir una sangre control valorada o una muestra de sangre valorada que contengan hemoglobinas A, F, C y S en cada análisis de 

muestras. 

Valores 

La lectura densitométrica de las separaciones electroforéticas teñidas proporciona las concentraciones relativas (porcentajes) de las fracciones 

individuales de hemoglobina. 

Los valores normales (media ± 2 SD) usando el procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 han sido establecidos a partir de una población 

sana de 200 adultos (hombres y mujeres): 

Hemoglobina A ≥ 96.5 % 

Hemoglobina F < 2.0 % (*) 

Hemoglobina A2 ≤ 3.5 % 

(*) consulte Interferencias y Limitaciones 

Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de normalidad. 

Interpretación 

1. Anomalías cualitativas: Hemoglobinopatías 

La mayoría de hemoglobinopatías son debidas a la sustitución por mutación de un solo aminoácido en uno de los cuatro tipos de cadenas 

polipeptídicas. La importancia clínica de un cambio así depende del tipo de aminoácido involucrado y de su posición. En enfermedades clínicamente 

significativas pueden estar afectadas las cadenas α o las ß (incluso las cadenas γ). 

Se han descrito más de 200 variantes de hemoglobina en adultos. Las primeras hemoglobinas anormales estudiadas y de aparición más frecuente 

tienen una carga eléctrica neta alterada, lo que facilita su detección mediante electroforesis. 

Hay cuatro hemoglobinas anormales principales que presentan un interés clínico particular: S, C, E y D. 

Los kits HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 están pensados para la identificación preliminar de las hemoglobinopatías y talasemias. Al observarse 

un patrón anormal, su identidad debería ser confirmada mediante las pruebas discriminatorias apropiadas (por ejemplo, electroforesis en geles de 

agarosa ácidos). 

Hemoglobina S 

La hemoglobina S es la más frecuente. Es debida a la sustitución de un ácido glutámico (un aminoácido ácido) de la cadena ß por una valina (un 

aminoácido neutro). Su movilidad electroforética se ve, por tanto, disminuida. En geles tamponados alcalinos, como el HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) 

K20, la hemoglobina S migra entre las fracciones A y A 2 . 

Hemoglobina C 

Un ácido glutámico de la cadena ß está sustituido por una lisina (un aminoácido básico): su movilidad se ve fuertemente reducida. Con el 

procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, C, E y A 2 están superpuestas. Cuando esta fracción es > 15 %, debe sospecharse la presencia 

de hemoglobinas C y E. 

Hemoglobina E 

Un ácido glutámico de la cadena ß está sustituido por una lisina: la hemoglobina E migra exactamente como la hemoglobina C usando el 

procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20. A diferencia de la hemoglobina C, no se separa de la hemoglobina A en tampón ácido 

[HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. Esta propiedad permite diferenciar E y C. 

Hemoglobina D 

Un ácido glutámico de la cadena ß está sustituido por una glutamina. Con el procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 esta hemoglobina 

migra exactamente como la hemoglobina S. La hemoglobina D no se separa de la hemoglobina A en tampón ácido [HYDRAGEL ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) K20] ; esta propiedad permite diferenciar S y D. 

2. Anomalías cuantitativas: Talasemias 

Las talasemias constituyen un grupo bastante heterogéneo de enfermedades genéticas caracterizadas por la disminución en la síntesis de uno o 

varios tipos de cadenas polipeptídicas. El mecanismo molecular de esta disminución no ha sido completamente descrito. 

Hay dos tipos de síndromes talasémicos: 

Talasemias Alfa 

Se caracterizan por la disminución en la síntesis de las cadenas α, lo que afecta a la síntesis de todas las hemoglobinas normales. 

El exceso de síntesis de cadenas ß y γ en relación con la de las cadenas α induce la formación de tetrámeros sin ninguna cadena α: 

• hemoglobina Bart = γ 4, 

• hemoglobina H = ß 4.

Beta-talasemias 

Se caracterizan por una disminución en la síntesis de las cadenas ß. Sólo se ve afectada la síntesis de la hemoglobina A. 

Por tanto, los porcentajes de hemoglobina F y hemoglobina A 2 están incrementados respecto a los de la hemoglobina A. 

3. Patrones de migración 

Migración de 

hemoglobinas normales 

A(A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) 

F 

S - D 

A2 A2 - C - E 

anhidrasa anhidrasa 

punto de aplicación 

A 0 : Fracción no glicada de la hemoglobina A normal del adulto. 

A 1 : Fracción glicada de la hemoglobina A normal del adulto. 

En los patrones de encima, el cátodo está abajo y el ánodo arriba. 

- 41 - 


Interferencias y Limitaciones 

• No use muestras de sangre hemolizadas. 

• Cuando se detecte una hemoglobina anormal que se comporte de forma diferente a como los hacen las variantes principales de la hemoglobina 

S, C, D y E, use otros métodos de identificación (por ejemplo, isoelectroenfoque, electroforesis de las cadenas de globina), o consulte o envíe la 

muestra a un laboratorio especializado. 

• La valoración densitométrica de la Hb F (o de cualquier otra hemoglobina minoritaria que migre en la proximidad de las fracciones principales) es 

semicuantitativa en la medida en que los valores se vuelven imprecisos por debajo de un 2 % - 3 % de la hemoglobina total. 

• Las muestras de ciertos pacientes con una hemoglobina S homocigota y tratados con Hydrea® (hydroxycarbamida) pueden presentar una 

hemoglobina F, cuya síntesis ha sido inducida por el tratamiento. En algunos casos se ha observado que esta hemoglobina F inducida tiene una 

movilidad, en los geles HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), ligeramente diferente a la de la hemoglobina F nativa. 

• En algunas muestras que hayan sido conservadas más de 7 días, el rastro situado detrás de la fracción Hb A puede concentrarse, aunque esta 

fracción no debe confundirse con una variante de la hemoglobina, por ejemplo, las hemoglobinas H o Bart. 

Resolución de problemas 

Llame al Servicio de Atención Técnica de su distribuidor cuando la prueba no funcione pese a haber seguido cuidadosamente las instrucciones para 

la preparación y el almacenaje de los materiales, y para el procedimiento. 

Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit, así como las informaciones relativas a la eliminación de los desechos, están disponibles 

en el Servicio de Asistencia Técnica de su distribuidor. 

CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS 

Migración de las hemoglobinas 

anormales principales 

Todos los datos de funcionamiento están basados en un estudio que incluía materiales e instrumentos SEBIA HYDRAGEL, comparándolos con un 

sistema comercial de geles de agarosa. Además, se hicieron estudios de concordancia en los que la identidad de las hemoglobinas y sus valores fueron 

establecidos mediante otros métodos reconocidos. Los resultados de ejemplos representativos de los estudios de funcionamiento se presentan aquí. 

Todas las separaciones electroforéticas se interpretaron visualmente. El densitómetro HYRYS de SEBIA se utilizó en todas las evaluaciones 

densitométricas para complementar los datos visuales. 

Reproducibilidad Intraanálisis (Intraserial) 

Tres muestras de sangre se sometieron a electroforesis usando el procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 en geles del mimo lote. Cada 

muestra se analizó en todos los carriles de un único gel. La tabla siguiente muestra las medias, SD y CV de cada componente individual de la 

hemoglobina en las tres muestras, calculados a partir de los valores densitométricos en tanto por ciento de cada carril. Además, ninguna de las 

réplicas mostró valores falsos positivos o falsos negativos. 

| COMPONENTE | MEDIA | SD | CV (%) | 

| Sangre normal | 

| Hb A | 97.4 | 0.1 | 0.1 | 

| Hb A | 2 2.6 | 0.1 | 5.3 | 

| Hb A2 elevadas | 

| Hb A | 95.2 | 0.2 | 0.2 | 

| Hb A | 2 4.8 | 0.2 | 4.4 | 

| Hb C elevada | 

| Hb A | 56.7 | 0.4 | 0.8 | 

| Hb C | 43.3 | 0.4 | 1.0 | 

Reproducibilidad Interanálisis (Interserial) 

Se sometieron a electroforesis muestras de sangre usando el procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 en geles de un único lote. Las 

muestras analizadas incluían siete muestras con una hemoglobina anormal (Hb S, Hb F ó Hb C), dos muestras con la Hb A 2 elevada y el resto eran 

muestras de sangre normales. Se calcularon las medias, SD y CV a partir de los datos obtenidos para cada componente en cada muestra. Los rangos 

de las medias, SD y CV, y el CV medio, que representa la suma de los componentes individuales, está tabulados debajo. Además, ninguna de las 

réplicas mostró valores falsos positivos o falsos negativos.

- 42 - 


| COMPONENTE | MEDIA | SD | CV (%) | CV MEDIO (%) | 

| Hb A | 18.0 – 97.8 | 0.1 – 1.0 | 0.1 – 4.0 | 0.8 | 

| Hb F | 13.3 – 76.3 | 0.5 – 0.6 | 0.7 – 3.4 | 1.8 | 

| Hb C | 21.5 – 43.5 | 0.2 – 0.3 | 0.6 – 1.1 | 0.8 | 

| Hb S/D | 9.7 – 84.1 | 0.1 – 0.6 | 0.4 – 2.6 | 1.1 

| | 

Hb A | 2 2.2 – 5.7 | 0.1 – 0.2 | 2.3 – 7.6 | 4.0 | 

Exactitud – Detección de Anomalías de la Hemoglobina 

Se analizaron 63 muestras de sangre diferentes usando el procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 y otro sistema comercial de geles de 

agarosa. Las muestras de sangre y su evaluación diagnóstica fueron proporcionados por un hospital. El diagnóstico estaba basado en una 

electroforesis de rutina en gel alcalino y en gel ácido y/o HPLC. Todas las hemoglobinas anormales o los niveles anormales de hemoglobinas 

normales detectados con el procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 coincidieron con el sistema de geles comparado, los resultados del 

hospital y el diagnóstico clínico. No se observó ningún caso de falso positivo, esto es, la detección de una banda anormal o de un nivel anormal de 

una banda normal donde no existía tal anomalía. 

Exactitud – Determinación Cuantitativa de la Hb A 2 

Se midieron los niveles de Hb A 2 en 51 muestras de sangre con niveles normales y elevados de Hb A 2 , mediante densitometría de las separaciones 

electroforéticas obtenidas, usando el procedimiento HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20. Los valores medidos a partir de ambos procedimientos se 

analizaron mediante un procedimiento estadístico de regresión lineal. Los resultados del análisis de regresión lineal están tabulados debajo 

(y = HYDRAGEL). 

| Coeficiente de Correlación | Punto de corte en y | Pendiente | Rango de valores en % | 


| 0.973 | -0.344 | 0.963 | 1.5 – 5.7 | 

BIBLIOGRAFÍA 






860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


UTILIZAÇÃO 

- 43 - 


O HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 destina-se à separação das hemoglobinas normais (A e A 2 ) e à detecção das principais hemoglobinas 

anómalas: S ou D e C ou E, por electroforese em geles de agarose. A electroforese é feita no hemolisado da lavagem dos glóbulos vermelhos. As 

hemoglobinas são separadas em meio alcalino (pH 8,5), fixadas pelo calor ou em meio alcool/ácido e coradas com uma solução de negro de amido. 

O excesso de corante é eliminado com uma solução ácida. As electroforeses resultantes podem ser analisadas visualmente ou ser avaliadas por 

densitómetria, o que dá uma quantificação relativa e precisa das hemoglobinas com interesse particular, tais como a hemoglobina A 2 no diagnóstico 

da ß-talassémia. A electroforese em meio ácido como, por exemplo, o HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20, permite confirmar a identificação 

das variantes da hemoglobina, em especial para diferenciar a Hb S da Hb D e a Hb E da Hb C. 

Cada gel de agarose poderá analisar 7 amostras no kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20. 

Para diagnóstico in vitro. Registado no INFARMED. 

PRINCÍPIO DO TESTE 

A hemoglobina é uma molécula complexa composta por quatro cadeias polipeptídicas, idênticas duas a duas. Cada cadeia está ligada ao heme, um 

núcleo tetrapirrólico (porfirina), ligado a um átomo de ferro. A parte do heme é comum a todas as hemoglobinas e suas variantes. A parte proteica 

responsável pelo tipo de hemoglobina é dechamada globina. As cadeias polipeptídicas α, ß, δ e γ constituem as hemoglobinas humanas normais: 

• hemoglobina A ………………… = α 2 β 2 

• hemoglobina A 2 ……………… = α 2 δ 2 

• hemoglobina fetal F…………… = α 2 γ 2 

A cadeia α é comum a estas três hemoglobinas. 

A estrutura espacial da hemoglobina (como as de todas as proteínas) depende da natureza e da sequência dos aminoácidos que formam as cadeias. 

As ligações que se formam entre os diferentes amoinoácidos são responsáveis pela forma da molécula, pela estabilidade e suas propriedades. A 

substituição dos aminoácidos por mutação é responsável pela formação de variantes de hemoglobina, que têm diferentes cargas superficiais e, 

consequentemente, diferentes mobilidades electroforéticas, também dependentes do pH, da força iónica do tampão e da natureza do suporte. 

As anomalias das hemoglobinas são de dois tipos: 

• anomalias qualitativas (ou estruturais) resultantes são designadas por hemoglobinopatias ; 

• anomalias quantitativas (ou de regulação), provocadas por diminuição da síntese de uma das cadeias de hemoglobina, são designadas por 

talassémias. 

REAGENTES FORNECIDOS NOS KITS HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

| ITEM | REF. N° 3010 | 

| Geles de agarose (prontos a usar) | 10 geles | 

| Tampão Tris-Barbital (solução concentrada) | 3 frascos de 75 ml | 

| Diluente da solução corante (solução concentrada) | 1 frasco, 60 ml | 

| Negro de amido (solução concentrada) | 1 frasco, 20 ml | 

| Descorante (solução concentrada) | 1 frasco de 100 ml | 

| Solução hemolisante (pronto a usar) | 1 frasco, 20 ml | 

| Aplicadores 7 dentes (prontos a usar) | 1 caixa de 10 

| 

| 

Papéis de filtro finos | 1 pacote de 10 | 

PARA OPTIMIZAÇÃO DOS RESULTADOS 

Os elementos de um mesmo kit devem ser utilizados em conjunto, e de acordo com as instruções de utilização. 

LER ATENTAMENTE AS INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO. 

1. GELES DE AGAROSE 

Preparação 

Os geles de agarose estão prontos a usar. Cada gel contém: agarose, 8 g/l ; tampão alcalino pH 8,5 ± 0,1 ; aditivos, não perigosos nas concentrações 

usadas, necessários para optimizar o ensaio. 

Utilização 

Meio de suporte para a electroforese das hemoglobinas. 

Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração 

Armazenar os geles horizontalmente, na embalagem protectora de origem, à temperatura ambiente (15 - 30 °C) ou no frigorífico (2 - 8 °C). (A seta 

existente na parte da frente da caixa do kit deve estar voltada para cima). São estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit e nos rótulos 

das embalagens dos geles. Evitar variações da temperatura durante o armazenamento (ex: não armazenar perto de uma janela ou de uma fonte de 

calor). 

NÃO CONGELAR! 

Deitar fora o gel quando: 

(i) houver cristais ou precipitados na superfície do gel ou quando a textura do mesmo for muito macia (isto sucede se o gel for congelado) ; 

(ii) há desenvolvimento de bactérias ou fungos ; 

(iii) estiver presente uma quantidade anormal de líquido na embalagem do gel (resultante da exsudação do gel devido a condições de 

armazenamento inadequadas). 

INSTRUÇÕES DE USO SEBIA - Português

- 44 - 


2. TAMPÃO TRIS-BARBITAL 

Preparação 

Cada frasco de tampão concentrado deve ser completado a 1 litro com água destilada ou desmineralizada. Após diluição, a solução contém: tampão 

tris-barbital pH 9,2 ± 0,2 ; azida de sódio. 

ATENÇÃO: O tampão concentrado contém 2,45 % de barbital, 13,73 % de barbital sódico e 0,13 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingerida, 

consultar imediatamente um médico! Quando em contacto com ácidos, chumbo ou cobre a azida de sódio pode levar à formação de 

compostos explosivos ou tóxicos. Quando deitar fora lavar abundantemente com grandes quantidades de água. 

Utilização 

Tampão da electroforese. 


Armazenar o tampão concentrado à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável por vários anos, pelo menos até ao fim da validade indicada 

na caixa do kit ou no rótulo do frasco. A solução diluída é estável por um ano, à temperatura ambiente, num frasco rolhado. Deitar fora se o seu 

aspecto se alterar ou se ficar turva devido a contaminação microbiana. 

3. DILUENTE DA SOLUÇÃO CORANTE 

Preparação 

O diluente da solução corante deverá ser utilizado como está descrito no parágrafo " SOLUÇÃO CORANTE NEGRO DE AMIDO ". 

Contém uma solução ácida. 

Utilização 

Para a preparação das soluções de corante negro de amido. 


Armazenar o diluente à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. NÃO 

CONGELAR. 

Não adicionar azida de sódio. 

4. CORANTE NEGRO DE AMIDO 

Preparação 

O corante negro de amido concentrado, é uma solução viscosa que pode eventualmente gelificar, o que não afecta nada a qualidade da solução final 

e o seu poder de coloração. 

Em qualquer caso, para obter uma perfeita reconstituição do corante, é necessário que seja respeitado o procedimento seguinte: 

1. Adicionar cerca de 15 ml do diluente do corante ao frasco do negro de amido concentrado. 

2. Fechar cuidadosamente o frasco. 

3. Agitar muito vigorosamente o frasco durante pelo menos 5 segundos. 

4. Transferir esta solução para o recipiente de preparação da solução de coloração. 

5. Repetir esta etapa duas vezes ou se necessário 3 vezes. 

6. Transferir o diluente restante para o recipiente de preparação da solução de coloração. 

7. Completar o volume para 300 ml com água destilada ou desmineralizada. 

8. Agitar muito bem esta solução durante 5 a 10 minutos. 

A solução corante está pronta a utilizar. 

Após diluição, a solução de corante contém: solução ácida pH ≈ 2 ; negro de amido, 4 g/l ; etilenoglicol, 6,7% ; aditivos, não perigosos nas 

concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio. 

AVISO: Nocivo em caso de ingestão. 

Utilização 

Para corar geles depois da electroforese das proteínas. 

IMPORTANTE : A solução corante é unicamente destinada à coloração de 10 geles. Recomenda-se a renovação da solução após as 10 utilizações. 


Armazenar a solução de corante concentrada e a solução diluída à temperatura ambiente ou no frigorífico em frascos fechados para evitar a 

evaporação. 

A solução concentrada é estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos. 

A solução diluída de corante é estável por um mês. 

Não guardar a solução de trabalho do corante próximo de uma fonte de calor. 

5. SOLUÇÃO DESCORANTE 

Preparação 

Cada frasco de solução descorante concentrada deve ser diluída a 1/1000 com água destilada ou desmineralizada e permite obter 100 litros de 

solução total. Diluir 1 ml da solução concentrada em 1 litro com água destilada ou desmineralizada. Após diluição, a solução descorante contém: 

ácido cítrico ; 0,5 g/l. 

Utilização 

Na descoloração, isto é, remoção do excesso de corante do gel. 


Armazenar a solução descorante concentrada à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou 

no rótulo do frasco da solução descorante. A solução descorante diluída é estável por uma semana à temperatura ambiente, quando conservada em 

recipiente fechado. 

Deitar fora a solução diluída se se notarem alterações no seu aspecto, por exemplo, se se tornar turva devido a contaminação microbiana. 

Não adicionar azida de sódio. 

Em caso de conservação mais prolongada da solução diluída (superior a uma semana), adicionar 50 µl/l de ProClin 300 para evitar qualquer 

proliferação microbiana. 

A solução descorante diluída contendo ProClin é estável à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C). É estável até ao 

fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco do descolorante. 

6. SOLUÇÃO HEMOLISANTE 

Preparação 

A solução hemolisante vem pronta a ser utilizada. Trata-se de um tampão com aditivos, não perigosos nas concentrações utilizadas, necessários para 

optimizar o ensaio.

- 45 - 


Utilização 

Para hemolisar os glóbulos vermelhos do sangue. 


Armazenar a solução hemolisante à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do 

frasco da solução hemolisante. 

Deitar fora a solução hemolisante se o seu aspecto se alterar, isto é, se ficar turva devido a contaminação microbiana. 

7. APLICADORES 

Utilização 

Aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras. 

Armazenamento 

Armazenar os aplicadores em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico. 

8. PAPEIS DE FILTRO FINOS 

Utilização 

Pré-cortados, de utilização única, estes finos papéis absorventes destinam-se à absorção do excesso de líquido da superfície do gel antes da 

aplicação da amostra. 

Armazenamento 

Armazenar os papéis de filtro finos num local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico. 

REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 

1. SORO FISIOLÓGICO 

Preparação 

Preparar uma solução a 0,15 M (9 g/l) de NaCl em água destilada ou desmineralizada. 

Utilização 

Para lavar os glóbulos vermelhos. 


Armazenar à temperatura ambiente ou no frigorífico. Deitar fora após 3 meses ou se notar alterações no seu aspecto, por exemplo, se se tornar turva 

devido a contaminação microbiana. Para conservar por períodos de tempo mais alargado, adicionar azida de sódio (1 g/l). 

2. FIXADOR (facultativo) 

Preparação 

Pelo menos 15 minutos antes da utilização, preparar o fixador (v/v): 60 % de etanol ; 10 % de ácido acético ; 30 % de água destilada ou 

desmineralizada. Misturar bem. 

Utilização 

Fixação das proteínas separadas por electroforese em geles de agarose. 


Armazenar à temperatura ambiente em frasco bem rolhado para evitar a evaporação. Deitar fora passados 3 meses. Não fixar mais que 4 geles em 

cada 150 ml de fixador. 

EQUIPAMENTO E ACESSÓRIOS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 

1. Fonte de alimentação, ex: GD 61 D SEBIA, ref. n° 1300 ; GD 251 D SEBIA, ref. n° 1301 ; MG 300 SEBIA, ref. n° 1302 ou MG 500 SEBIA, 

ref. n° 1303. 

2. APPLICATEUR HYDRAGEL K20 SEBIA, ref. n° 1409, que contém o suporte-aplicador HYDRAGEL K20. 

3. Câmara húmida, ref. n° 1270. 

4. Câmara de electroforese: K20 SEBIA, ref. n° 1400. 

5. Tinas e suportes para o tratamento de geles de 7 amostras: kit de acessórios HYDRAGEL K20 SEBIA ref. n° 1420. 

6. Pipetas: 5 µl, 10 µl e 200 µl. 

7. Incubador-secador: IS 80 SEBIA, ref. n° 1430. 

8. Densitómetro/scanner capaz de ler geles de 82 x 51 mm a 570 nm (filtro amarelo): HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ou scanner equipado com logiciel 

PHORESIS SEBIA. Seguir as instruções de cada aparelho na sua utilização e calibração. 

AMOSTRAS A ANALIZAR 

Colheita e conservação das amostras 

É recomendada a utilização de amostras de sangue frescas colhidas com anticoagulante. Podem ser usados tubos de colheita contendo como 

anticoagulante EDTA, citratos ou heparina ; evitar os que contenham iodoacetato. O sangue deve ser colhido de acordo com os métodos utilizados 

nos laboratórios de análises clínicas. Se necessário, armazenar o sangue entre 2 - 8 °C até cinco dias. 

Preparação das amostras 

• Homogeneize o tubo de colheita antes de retirar o sangue total a preparar. 

• Centrifugar o sangue com anticoagulante a 5000 rpm durante 5 minutos. 

• Deitar fora o plasma. 

• Lavar as glóbulos vermelhos 2 vezes com 10 volumes de soro fisiológico: deve ser tomado o maior cuidado quando se estiver a manipular volumes 

de glóbulos vermelhos inferiores a 10 µl.

- 46 - 


• Elimine o excesso de solução salina que se encontra como sobrenadante dos glóbulos vermelhos e agite-os no vórtex antes de extrair 10 µL para 

hemólise. 

• Hemolisar 10 µl de glóbulos vermelhos com 130 µl de solução hemolisante. 

• Agitar no vortex durante 10 segundos e incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 

NOTAS: 

- Para preparar um hemolisado de indivíduos anémicos o volume de glóbulos vermelhos (obtidos após centrifugação), pode ser aumentado : 

- 15 µl para indivíduos levemente anémicos (aproximadamente 0,1 g/ml de Hb) 

- 20 µl para indivíduos muito anémicos (< 0,07 g/ml de Hb), e 130 µl de solução hemolisante. 

Como consequência, a intensidade da coloração vai aumentar sem modificar a proporção de cada fracção. 

- Não é necessário filtrar ou centrifugar o hemolisado. 

- A solução hemolisante SEBIA não afecta a hemoglobina instável de Bart. 

TÉCNICA 

I. MIGRAÇÃO 

1. Colocar o suporte-aplicador HYDRAGEL K20 sobre a bancada (Fig. 1) e erguer a parte móvel do mesmo (suporte dos aplicadores). 

2. Colocar 120 µl de água destilada ou desmineralizada no terço inferior do quadro impresso no suporte-aplicador. 

3. Retirar o gel da embalagem. 

4. Eliminar rapidamente o excesso de líquido da superfície do gel com a ajuda de um papel de filtro fino. 

ATENÇÃO: Não deixar o papel de filtro em contacto prolongado com o gel, para evitar a sua desidratação. 

5. Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso no suporte-aplicador (Fig. 2). 

6. Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 2) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura do 

gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal. A gota de água 

deve-se repartir sobre toda a superfície do gel. 

7. Baixar o suporte dos aplicadores até uma posição intermédia, com o botão, situado lateralmente, voltado para cima. 

8. Colocar um aplicador numa superfície plana, com os números dos poços virados para cima. 

9. Aplicar 10 µl de amostra hemolisada em cada poço. A pipetagem das amostras não deve ultrapassar os 2 minutos. 

O aplicador deve ser utilizado imediatamente após a colocação das amostras. 

Para uma utilização posterior (8 horas no máximo), colocar o aplicador na câmara húmida com os dentes voltados para cima (segure-o pela 

protecção de plástico), pôr a câmara húmida no frigorífico e só colocar o gel no suporte-aplicador HYDRAGEL K20 no momento da sua 

utilização. 

Ver as instruções de utilização da câmara húmida para mais detalhes. 

10. Quebrar e retirar a protecção dos dentes. 

11. Colocar o aplicador na posição n° 4 do suporte-aplicador. 

IMPORTANTE: Os números impressos no aplicador devem ficar virados para o operador (Fig. 4). 

12. Baixar o suporte do aplicador rodando o botão lateral de modo a que o aplicador fique em contacto com o gel. NÃO FORÇAR A DESCIDA 

DO SUPORTE DOS APLICADORES. 

13. Após 1 minuto de aplicação, rodar o botão lateral para levantar o aplicador. Retirar o aplicador e deitar fora. 

14. Colocar o gel na câmara de electroforese, segundo a polaridade indicada no gel,com as amostras no lado do cátodo. 

Posicionar o HYDRAGEL no suporte da tina K20 com o lado do gel voltado para baixo ; o gel deve mergulhar cerca de 1cm no tampão, de 

cada lado. 

Ver instruções da câmara K20 para mais pormenores. 

15. Ligar a tina à fonte de alimentação. 

| CONDIÇÕES DE MIGRAÇÃO | SEBIA K20 | 

| Volume de tampão por compartimento | 150 mL | 

| Volume total de tampão | 300 mL | 

| Tempo de migração | 15 minutes | 

| Voltagem constante | 165 V 

| 

| 

Corrente inicial (por gel) | 7 ± 2 mA | 

16. Após migração, desligar a tina e retirar o gel. 

II. FIXAÇÃO DAS PROTEÍNAS 

Pode-se fazer de duas maneiras : fixação pelo calor ou com solução de fixação. 

Fixação pelo calor (só com o incubador-secador IS 80 SEBIA) : 

Secar o gel sob ar quente a 80 °C no incubador-secador IS 80 até secagem completa (durante 10 minutes mínimo). 

Fixação com solução de fixação: 

1. Colocar o gel num suporte para geles (fornecido com o kit de acessórios SEBIA HYDRAGEL K20). 

2. Encher uma tina (fornecida com o kit de acessórios SEBIA HYDRAGEL K20) com 150 ml de solução de fixação. 

3. Imergir o gel verticalmente no fixador durante 15 minutos. 

4. Retirar o gel e secá-lo sob ar quente a 80 °C no incubador-secador IS 80. 

IMPORTANTE : O gel deve estar perfeitamente seco.

- 47 - 


III. COLORAÇÃO-DESCOLORAÇÃO 

1. Imergir o gel, frio e seco, na solução corante durante 5 minutos. 

2. Proceder à remoção do excesso de corante em três banhos sucessivos de descorante, até que o fundo surja limpo e incolor. 

3. Retirar o excesso de líquido da superfície do gel com um papel macio e secar o gel sob ar quente a 80 °C. Se necessário, limpar a parte de 

trás do gel (suporte plástico) com um papel macio humedecido. 

IV. LEITURA 

Ler com um densitómetro / scanner a 570 nm ou com filtro amarelo. 

Se utilizar os densitómetros HYRYS ou DVSE, posicione a fracção A 2 na marca de 5 mm da placa de leitura, de modo a colocar o zero no ponto mais 

baixo entre a fracção A 2 e a fracção anidrase carbónica. 

NOTA: Para garantir resultados mais precisos e coerentes : 

- Regular o comprimento de leitura a 30 mm, de forma a incluir todo o perfil electroforético. 

- Posicionar as mínimas de modo a rodearem o valor da fracção A 2 . 

Recomenda-se analisar os perfis electroforéticos o mais rapidamente possível. Os geles, conservados no escuro, em ambiente seco e ao abrigo de 

todas as fontes de calor, podem ser interpretados qualitativamente num período de 3 meses. 

RESULTADOS 

Controlo de qualidade 

É aconselhável incluir uma amostra de sangue de controlo contendo as hemoglobinas A, F, C e S, em cada série de amostras. 

Valores 

A leitura a 570 nm por densitómetria permite definir as concentrações relativas (percentagens) de cada fracção. 

Os valores normais (médios mais 2 DP), para cada fracção, nos geles HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 foram estabelecidos a partir de uma 

população saudável de 200 adultos (homens e mulheres): 

Hemoglobina A ≥ 96,5 % 

Hemoglobina F < 2,0 % (*) 

Hemoglobina A2 ≤ 3,5 % 

(*) Ver Interferências e Limitações 

Recomenda-se que cada laboratório estabeleça os seus próprios valores normais. 

Interpretação 

1. Anomalias qualitativas: hemoglobinopatias 

A maioria das hemoglobinopatias deve-se à substituição por mutação de um único aminoácido num dos quatro tipos de cadeias polipeptídicas. O 

significado clínico de tal alteração depende do tipo de aminoácido e do local envolvidos. Em doenças clinicamente significativas, a cadeia α ou a cadeia 

ß estão afectadas. 

Foram descritas mais de 200 variantes de hemoglobina no adulto. As primeiras hemoglobinas anómalas estudadas e as que ocorrem mais frequentemente 

têm a sua carga eléctrica alterada, o que leva a uma fácil detecção por electroforese. 

Existem quatro hemoglobinas anómalas principais que apresentam um interesse clínico particular, do ponto de vista antropológico e médico: S, C, E e D. 

O kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 destina-se à detecção das hemoglobinopatias e talassémias. Uma vez detectado um perfil electroforético 

anómalo, este deve ser confirmado por electroforese em meio ácido, em geles de agarose. 

Hemoglobina S 

A hemoglobina S é a mais frequente. Deve-se à substituição de um ácido glutâmico da cadeia ß (um aminoácido ácido) por uma valina (aminoácido 

neutro): a sua mobilidade electroforética vai diminuir. Nos geles HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 em meio alcalino, a hemoglobina S migra em 

posição central, entre as fracções A e A 2 . 

Hemoglobina C 

Um ácido glutâmico da cadeia ß é substituído por uma lisina (aminoácido básico): a sua mobilidade vai diminuir muito. No HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20 as fracções C e E ficam sobrepostas à fracção A 2 . Quando esta fracção é superior a 15 %, deve-se suspeitar das 

hemoglobinas C e E. 

Hemoglobina E 

Um ácido glutâmico da cadeia ß é substituído por uma lisina: a hemoglobina E migra exactamente como a hemoglobina C no HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20. Ao contrário do que sucede com a hemoglobina C, não se separa das hemoglobinas A e A 2 em meio ácido [HYDRAGEL 

ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. Esta propriedade permite diferenciar as hemoglobinas E e C. 

Hemoglobina D 

Um ácido glutâmico da cadeia ß é substituído por uma glutamina. No HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 esta hemoglobina migra exactamente como 

a hemoglobina S. Ao contrário da hemoglobina S, a hemoglobina D não se separa das hemoglobinas A e A 2 em meio ácido [HYDRAGEL ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) K20] ; esta propriedade permite diferenciar as hemoglobinas S e D. 

2. Anomalias quantitativas: Talassémias 

As talassémias constituem um grupo bastante heterogéneo de distúrbios genéticos, caracterizadas por uma diminuição da síntese de um dos tipos 

de cadeias polipeptídicas. O mecanismo molecular desta diminuição ainda está mal conhecido. 

Existem dois tipos de síndromes talassémicos:

- 48 - 


Alfa-talassémias 

Caracterizam - se pela diminuição da síntese das cadeias α, afectando consequentemente a síntese das 3 hemoglobinas fisiológicas. O excesso de 

síntese das cadeias ß e γ em relação às cadeias a leva à formação de tetrâmeros sem cadeia α: 

• Hemoglobina Bart = γ 4 

• hemoglobina H = ß 4 

Beta-talassémias 

Caracterizam-se pela diminuição da síntese de cadeias ß. Apenas a síntese da hemoglobina A é afectada. As percentagens de hemoglobina F e A 2 

aumentam em relação à da hemoglobina A. 

3. Perfis electroforéticos 

Migração das 

hemoglobinas normais 

A(A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) 

F 

S - D 

A 2 

A2 - C - E 

anidrase carbónica anidrase carbónica 

ponto de aplicação 

A0: fracção não glicosilada da hemoglobina A normal do adulto. 

A1: fracção glicosilada da hemoglobina A normal do adulto. 

Interferências e limitações 

• Não usar amostras de sangue hemolisadas. 

• Quando uma hemoglobina anómala é detectada, apresentando uma mobilidade electroforética diferente da das principais variantes de 

hemoglobinas S, C, D e E, deve-se utilizar outros meios de identificação (ex: electroforese das cadeias de globinas), ou consultar um laboratório 

especializado. 

• O doseamento da hemoglobina Fetal (Hb F), ou de qualquer outra hemoglobina menor que migra na proximidade de fracções principais, é 

aproximado quando a sua concentração representa menos de 2 a 3 % da hemoglobina total. 

• As amostras de certos doentes apresentam uma hemoglobina S homozigótica ; quando tratadas com Hydrea® (hidroxicarbamida) podem 

apresentar uma hemoglobina F, cuja síntese foi induzida por este tratamento. Em alguns dos casos observados, esta hemoglobina F induzida 

apresentou uma mobilidade nos geles HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) ligeiramente diferente da apresentada pela hemoglobina F fisiológica. 

• Nas amostras armazenadas há mais de 7 dias, pode observar-se uma banda concentrada em frente à fracção Hb A. Esta banda concentrada não 

deverá ser confundida e interpretada como uma variante da hemoglobina (por exemplo, Hemoglobinas H ou Bart). 

Assistência técnica 

Em caso de maus resultados contactar os serviços técnicos do fornecedor. 

Estão disponíveis nos Serviços Técnicos da SEBIA fichas de dados de segurança dos diversos reagentes do kit, bem como informação relativa à 

eliminação dos desperdícios. 

CARACTERÍSTICAS DO ENSAIO 

Migração das principais 

hemoglobinas anómalas 

Todas as leituras densitométricas foram efectuadas com o densitómetro HYRYS da SEBIA. Os perfis electroforéticos foram interpretados a olho nú. 

Os resultados obtidos por análise quantitativa indicam uma boa repetibilidade e reproductibilidade da técnica HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 em 

relação a todos os aspectos testados, com um coeficiente de variação médio de 2,2 %. 

Reprodutibilidade intra-ensaio 

Três amostras de sangue (uma normal, uma com valores elevados de Hb A2 e uma amostra com Hb C) foram analisadas repetidamente em geles 

de um mesmo lote HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20. Os perfis electroforéticos foram analisados por densitómetria e a tabela seguinte apresenta 

os valores médios (em %), DP e CV, obtidos para cada fracção de hemoglobina de cada uma das 3 amostras. 

NOTA: Os resultados foram concordantes para todas as amostras: 

- Amostras com valores normais de Hb A2 apresentaram todos os valores normais. 

- Amostras com valores elevados de Hb C e Hb A2 apresentaram todos os valores elevados. 

| FRACÇÃO DE Hb | MÉDIA | DP | CV (%) | 

| Sangue normal | 

| Hb A | 97,4 | 0,1 | 0,1 | 

| Hb A | 2 2,6 | 0,1 | 5,3 | 

| Sangue com Hb A2 elevado | 

| Hb A | 95,2 | 0,2 | 0,2 | 

| Hb A | 2 4,8 | 0,2 | 4,4 | 

| Sangue com Hb C elevado | 

| Hb A | 56,7 | 0,4 | 0,8 

| 

| 

Hb C | 43,3 | 0,4 | 1,0 | 

Reprodutibilidade inter-ensaio 

Foram analisadas amostras de sangue, em 10 geles HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 de um mesmo lote. As amostras ensaiadas incluíam 

7 amostras com uma hemoglobina anormal (Hb S, Hb F ou Hb C) e 2 amostras com um nível elevado de Hb A 2 . Os valores médios (em %), DP e CV 

foram calculados para cada fracção de hemoglobina das amostras. Os limites dos valores médios, DP e CV, e a média dos CV representando o 

conjunto de cada fracção, estão indicados na tabela abaixo.

NOTA: Os resultados foram concordantes para todas as amostras: 

- Amostras com valores normais de Hb A2 apresentaram todos os valores normais. 

- Amostras com valores elevados de Hb A2 apresentaram todos os valores elevados. 

- 49 - 


| FRACÇÃO Hb | MÉDIA | DP | CV (%) | MÉDIA CV (%) | 

| Hb A | 18,0 – 97,8 | 0,1 – 1,0 | 0,1 – 4,0 | 0,8 | 

| Hb F | 13,3 – 76,3 | 0,5 – 0,6 | 0,7 – 3,4 | 1,8 | 

| Hb C/E | 21,5 – 43,5 | 0,2 – 0,3 | 0,6 – 1,1 | 0,8 | 

| Hb S/D | 9,7 – 84,1 | 0,1 – 0,6 | 0,4 – 2,6 | 1,1 

| | 

Hb A | 2 2,2 – 5,7 | 0,1 – 0,2 | 2,3 – 7,6 | 4,0 | 

Precisão - Detecção das anomalias da hemoglobina 

Foram analisadas 63 amostras de sangue com o kit HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 e com outro sistema em gel de agarose disponível 

comercialmente. As amostras de sangue e o respectivo diagnóstico clinico, estabelecido por electroforese em geles alcalino e ácido e/ou HPLC, foram 

fornecidas por um hospital. 

Os resultados obtidos mostraram uma correlação perfeita entre os dois sistemas com, para a detecção de hemoglobinas normais, uma sensibilidade 

de 100 % e uma especificidade de 100 % em relação à técnica de referência, calculados segundo o método recomendado (Wendling, 1986). 

Todas as hemoglobinas anómalas, assim como hemoglobinas as normais, detectadas com o HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 estavam de acordo 

com o sistema de geles comparativo, com os resultados do hospital e com o diagnóstico clínico. Não foram observados casos de falsos positivos, 

isto é, detecção de fracções anómalas quando não existia a anomalia inerente. Também não se observaram casos de falsos positivos (detecção de 

uma Hb anómala inexistente ou de uma Hb de valor normal detectada numa taxa anormal). 

Precisão - Determinação quantitativa de Hb A 2 

51 amostras de sangue, com níveis normais e elevados de Hb A 2 , foram analisadas em paralelo por densitómetria dos perfis electroforéticos, obtidos 

em geles HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, e com outro gel disponível comercialmente. 

A correlação entre as duas técnicas foi analisada por regressão linear e outros métodos estatísticos (média e coeficiente de regressão linear). Os 

parâmetros de correlação entre os 2 sistemas de análise (y = HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20) estão apresentados no quadro seguinte: 

| COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO | INTERSECÇÃO EM Y | DECLIVE | GAMA DE VALORES % | 


| 0,973 | -0,344 | 0,963 | 1,5 – 5,7 | 

BIBLIOGRAFIA 






860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 

8. Vovan L., Lara-Russo D., Orsini A. (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, 780-789. 

9. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. 

Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97.

ΠΡΒΛΕΠΜΕΝΗ ΡΗΣΗ 

- 50 - 


Τo κιτ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 είναι σεδιασµένo για τ διαωρισµ των υσιλγικών αιµσαιρινών (A και A 2 ) και για την 

ανίνευση των κύριων παραλλαγών της αιµσαιρίνης: S ή D και C ή E και της εµρυϊκής αιµσαιρίνης F, µε ηλεκτρρηση σε αλκαλική 

γέλη αγαρης. Τα πρκύπτντα ηλεκτρρήµατα αιλγύνται πτικά. Η πυκνµέτρηση πρσέρει σετική πστικπίηση των 

επιµέρυς ωνών. Θα πρέπει να ακλυθήσει ηλεκτρρηση σε ιν gel π.. HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20 για την 

επιεαίωση της ταυτπίησης τυ τύπυ της αιµσαιρίνης, ειδικά για τη διαρπίηση της αιµσαιρίνης S απ την D και της E απ 

την C. 

Κάθε gel αγαρης στ κιτ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 πρρίεται για την ανάλυση 7 δειγµάτων. 

Για In Vitro διαγνωστική ρήση. 

ΑΡΗ ΤΗΣ ∆ΚΙΜΑΣΙΑΣ 

Η αιµσαιρίνη είναι ένα σύµπλκ µρι απτελύµεν απ δύ εύγη πλυπεπτιδικών αλυσίδων. Κάθε αλυσίδα συνδέεται µε την αίµη, 

έναν τετραπυρρλικ πυρήνα (πρυρίνη) πυ συνδέεται ηλικά µε ένα άτµ σιδήρυ. Τ µρι αίµης είναι κιν για λες τις 

αιµσαιρίνες και τις πικιλίες τυς. τύπς της αιµσαιρίνης πρσδιρίεται απ τ πρωτεϊνικ τµήµα πυ νµάεται σαιρίνη. ι 

πλυπεπτιδικές αλυσίδες, α, , γ και δ συγκρτύν τις υσιλγικές ανθρώπινες αιµσαιρίνες: 

• αιµσαιρίνη A ............................................................= α 2 2 

• αιµσαιρίνη A 2 ...........................................................= α 2 δ 2 

• εµρυϊκή αιµσαιρίνη F...........................................= α 2 γ 2 

Η αλυσίδα α είναι κινή στις τρεις αυτές αιµσαιρίνες. 

Η τρισδιάστατη δµή της αιµσαιρίνης και ι άλλες µριακές της ιδιτητες (πως λων των πρωτεϊνών) εαρτώνται απ τη ύση και την 

ακλυθία των αµινέων πυ συγκρτύν τις αλυσίδες. Η αντικατάσταση αµινέων µε µετάλλαη είναι υπεύθυνη για τ σηµατισµ 

µρίων αιµσαιρίνης µε διαρετικ επιανειακ ρτί και συνεπώς διαρετική ηλεκτρρητική κινητικτητα, η πία επίσης 

εαρτάται απ τ pH και την ιντική ισύ τυ ρυθµιστικύ διαλύµατς. Σε ιν pH, η κινητικτητα επηρεάεται επίσης απ την 

ηλεκτρστατική αλληλεπίδραση µεταύ των θετικά ρτισµένων µρίων αιµσαιρίνης και των αρνητικά ρτισµένων µάδων στ άγαρ. 

ι πρκύπτυσες πιτικές (ή δµικές) ανωµαλίες νµάνται αιµσαιρινπάθειες. Η µειωµένη σύνθεση κάπιας απ τις αλυσίδες της 

αιµσαιρίνης δηγεί σε πστικές ανωµαλίες, πυ νµάνται θαλασσαιµίες. 

Η ανάλυση πραγµατπιείται σε αιµλυµα απ πλυµένα ερυθρκύτταρα. ι αιµσαιρίνες διαωρίνται µε ηλεκτρρηση σε αλκαλικά 

gel και τα κλάσµατα γίννται ρατά µε ρώση µε amidoblack. Τα στεγνωµένα gel είναι έτιµα για ερµηνεία. 

ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΑΡΕΜΕΝΑ ΜΕ Τ ΚΙΤ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 

| ΕΙ∆Σ | 

| PN 3010 | 

Gel αγαρης (έτιµα πρς ρήση) | 

| 10 gel | 

Ρυθµιστικ διάλυµα Tris-Barbital (πυκν διάλυµα) | 

| 3 ιαλίδια των 75 mL | 

Μέσ αραίωσης διαλύµατς ρώσης (πυκν διάλυµα) | 

| 1 ιαλίδι, 60 mL | 

ρωστική amidoblack (πυκν διάλυµα) | 


∆ιάλυµα απρωµατισµύ (πυκν διάλυµα) | 

| 1 ιαλίδι, 100 mL | 

Αιµλυτικ διάλυµα (έτιµ πρς ρήση) | 


Εαρµγείς (7 δντια) (έτιµι πρς ρήση) | ∆ιηθητικά αρτιά 

| 

1 συσκ. των 10 

1 συσκ. των 10 

| 

ΓΙΑ ΑΡΙΣΤΑ ΑΠΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 

λα τα αντιδραστήρια απ ίδι κιτ πρέπει να ρησιµπιύνται πάντα µαί και σύµωνα µε τις δηγίες ρήσης. 

ΠΑΡΑΚΑΛΥΜΕ ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΣΕΚΤΙΚΑ Τ ΦΥΛΛ ∆ΗΓΙΩΝ. 

1. GEL ΑΓΑΡΗΣ 

Πρετιµασία 

Τα gel αγαρης είναι έτιµα πρς ρήση. Κάθε gel περιέει: αγαρη, 0.8 g/dL, αλκαλικ ρυθµιστικ διάλυµα pH 8.5 ± 0.1, πρσθετα, µη 

επιλαή στις ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απδση. 

ρήση 

Μέσ για ηλεκτρρηση αιµσαιρίνης. 

Φύλαη, σταθερτητα και σηµεία αλλίωσης 

Φυλάσσετε τα gel ριντια εντς της συσκευασίας τυς σε θερµκρασία δωµατίυ (15 έως 30 °C) ή στη συντήρηση (2 έως 8 °C). (Τ έλς 

στην πρσθια επιάνεια τυ κυτιύ τυ κιτ πρέπει να δείνει πρς τα άνω). Απύγετε την απθήκευση κντά σε παράθυρ ή σε πηγή 

θερµτητας. Απύγετε τις µεγάλες διακυµάνσεις θερµκρασίας κατά τη ύλαη. Τα gel είναι σταθερά µέρι την ηµερµηνία λήης πυ 

αναγράεται στη συσκευασία τυ κιτ ή των gel. 

ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΕΤΕ. 

Πετάτε τα gel ταν: 

(i) σηµατιστύν κρύσταλλι ή ίηµα στην επιάνεια τυ gel ή αν η υή τυ gel γίνει πλύ µαλακή (λα αυτά πρκύπτυν αν τ gel 

καταψυθεί), 

(ii) αναπτυθύν ακτήρια ή µύλα, 

(iii) υπάρει µεγαλύτερη απ τ υσιλγικ πστητα στ κυτί τυ gel (απτέλεσµα της είδρωσης τυ ρυθµιστικύ διαλύµατς απ τ 

gel λγω ακατάλληλων συνθηκών ύλαης). 

∆ΗΓΙΕΣ SEBIA - Ελληνικά

- 51 - 


2. ΡΥΘΜΙΣΤΙΚ ∆ΙΑΛΥΜΑ TRIS-BARBITAL 


Κάθε ιαλίδι τυ πυκνύ διαλύµατς αραιώνεται µε έως 1 λίτρ απεσταγµένυ ή απινισµένυ ύδατς. 

Μετά την αραίωση, τ διάλυµα εργασίας περιέει : tris-barbital pH 9.2 ± 0.3, αίδι τυ νατρίυ. 

ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Τ ρυθµιστικ διάλυµα στις ταινίες περιέει 2.45 % αριτάλη, 13.73 % νατριύ αριτάλη και 0.13 % αίδι τυ 

νατρίυ. Μην τ καταπίνετε! Αν τ καταπιείτε, συµυλευτείτε αµέσως ιατρ ! ταν τ πετάτε απύγετε επαή µε έα, µλυδ ή 

αλκ, καθώς µπρεί να σηµατιστύν εκρηκτικές ή τικές ενώσεις µε τ αίδι τυ νατρίυ. 

ρήση 

Ρυθµιστικ διάλυµα για ηλεκτρρηση. 


Φυλάσσετε τ διάλυµα πρ της αραίωσης σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Τ πυκν διάλυµα είναι σταθερ για αρκετά ρνια και 

τυλάιστν µέρι την ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων τυ διαλύµατς. 

Τ αραιωµέν διάλυµα είναι σταθερ για ένα έτς σε θερµκρασία δωµατίυ σε κλειστ δεί. 

Πετάτε τ αραιωµέν διάλυµα αν µεταληθεί η ψη τυ, π.. θλωση λγω µικριακής επιµλυνσης. 

3. ΜΕΣ ΑΡΑΙΩΣΗΣ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΣ ΡΩΣΗΣ 


Τ πυκν µέσ αραίωσης διαλύµατς ρωστικής πρέπει να ρησιµπιείται πως περιγράεται στην παράγρα “ΡΩΣΤΙΚΗ 

AMIDOBLACK“. 

Περιέει ιν διάλυµα. 

ρήση 

Για την παρασκευή τυ διαλύµατς ρωστικής amidoblack. 


Φυλάσσετε τ πυκν µέσ αραίωσης διαλύµατς ρωστικής σε θερµκρασία δωµατίυ ή στψυγεί. Είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία 

λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΕΤΕ. 

Μην πρσθέτετε αίδι τυ νατρίυ. 

4. ΡΩΣΤΙΚΗ AMIDOBLACK 


Η πυκνή ρωστική amidoblack είναι ένα ιώδες διάλυµα τ πί ενδέεται να µετατραπεί σε γέλη. Η καταλληλτητα τυ πυκνύ 

διαλύµατς ρωστικής δεν επηρεάεται απ την αύηση της γλιτητάς τυ ή τη στερεπίησή τυ. 

Σε λες τις περιπτώσεις, για να επιτύετε τέλεια ανασύσταση της ρωστικής, σας συνιστύµε να ακλυθήσετε την εής διαδικασία : 

1. Πρσθέστε 15 mL τυ µέσυ αραίωσης ρωστικής στ ιαλίδι τυ πυκνύ διαλύµατς. 

2. Κλείστε πρσεκτικά τ ιαλίδι. 

3. Ανακινήστε έντνα τ ιαλίδι για περίπυ 5 δευτερλεπτα. 

4. Αδειάστε αυτ τ διάλυµα στ δεί πυ πρρίεται για την επεεργασία τυ διαλύµατς ρωστικής. 

5. Επαναλάετε αυτ τ ήµα δύ ρές, ή τρεις αν ρειάεται. 

6. Αδειάστε τ υπλιπ µέσ αραίωσης στ δεί και συµπληρώστε µε απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ έως γκυ 300 mL. 

7. Ανακινήστε καλά τα περιεµενα τυ δείυ για 5 - 10 λεπτά. 

Τ διάλυµα ρωστικής είναι έτιµ πρς ρήση. 

Μετά την αραίωση, τ διάλυµα εργασίας της ρωστικής περιέει: ιν διάλυµα pH ≈ 2, amidoblack, 0.4 g/dL, αιθυλενγλυκλη, 6.7 %, 

πρσθετα, µη επιλαή στις ρησιµπιύµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απδση. 

ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Επιλαές αν καταπθεί. 

ρήση 

Για τη ρώση των gel µετά απ ηλεκτρρητικ διαωρισµ πρωτεϊνών. 

ΣΗΜΑΝΤΙΚ: Τ διάλυµα ρωστικής είναι σεδιασµέν για ρώση µν 10 gel. Αλλάτε τ διάλυµα µετά απ 10 διαδικασίες ρώσης. 


Φυλάσσετε τα διαλύµατα πρ και µετά την αραίωση σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί σε κλειστύς περιέκτες για να απτραπεί η 

εάτµιση. Τ πυκν διάλυµα ρωστικής είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας 

τυ κιτ και των ιαλιδίων. 

Τ διάλυµα εργασίας είναι σταθερ για 1 µήνα. 

Μην απθηκεύετε τ διάλυµα ρώσης κντά σε πηγή θερµτητας. 

5. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΑΠΡΩΜΑΤΙΣΜΥ 


Κάθε ιαλίδι ∆ιαλύµατς Απρωµατισµύ αραιώνεται µε έως 100 λίτρα απεσταγµένυ ύδατς. Είναι ευερές να αραιώνεται µν 1 mL 

τυ διαλύµατς σε 1 λίτρ. Μετά την αραίωση τ διάλυµα απρωµατισµύ περιέει: κιτρικ ύ 0.05 g/dL. 

ρήση 

Για απρωµατισµ, δηλαδή ααίρεση της περίσσειας ρωστικής απ τη γέλη. 

Για καθαρισµ τυ τµήµατς ρώσης. 


Φυλάσσετε τ διάλυµα πρ της αραίωσης σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Τ πυκν διάλυµα είναι σταθερ µέρι την ηµερµηνία 

λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων τυ διαλύµατς.Τ αραιωµέν διάλυµα είναι σταθερ 

για µια εδµάδα σε θερµκρασία δωµατίυ σε κλειστ δεί. 

Μην πρσθέτετε αίδι τυ νατρίυ. 

Πετάτε τ διάλυµα αν µεταληθεί η ψη τυ, π.. θλωση λγω µικριακής επιµλυνσης. 

Για να απτρέψετε πλλαπλασιασµ µικρίων στ αραιωµέν διάλυµα απρωµατισµύ αν πρκειται να τ υλάετε για περισστερ 

απ µια εδµάδα, πρσθέστε 5 µL/dL ProClin 300. 

Τ διάλυµα εργασίας στ πί έει πρστεθεί ProClin είναι σταθερ σε κλειστ δεί σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί µέρι την 

ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και των ιαλιδίων. 

6. ΑΙΜΛΥΤΙΚ ∆ΙΑΛΥΜΑ 


Τ αιµλυτικ διάλυµα είναι έτιµ πρς ρήση. Είναι ένα ρυθµιστικ διάλυµα µε πρσθετα, µη επιλαή στις ρησιµπιύµενες 

συγκεντρώσεις, απαραίτητα για άριστη απδση.

- 52 - 


ρήση 

Για την αιµλυση των ερυθρκυττάρων. 


Φυλάσσετε τ αιµλυτικ διάλυµα σε θερµκρασία δωµατίυ (15 έως 30 °C) ή στη συντήρηση (2 έως 8 °C). Παραµένει σταθερ µέρι την 

ηµερµηνία λήης η πία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας τυ κιτ και της συσκευασίας τυ διαλύµατς. 

Πετάτε τ αιµλυτικ διάλυµα αν µεταληθεί η ψη τυ, π.. θλωση λγω µικριακής επιµλυνσης. 

7. ΕΦΑΡΜΓΕΙΣ 

ρήση 

Έτιµι, εαρµγείς µιας ρήσης για τπθέτηση των δειγµάτων. 

Φύλαη 

Φυλάσσετε τυς εαρµγείς σε ηρ µέρς σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. 

8. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΑΡΤΙΑ - ΛΕΠΤΑ 

ρήση 

Μιας ρήσης απρρητικά αρτιά για στύπωµα της υγρασίας απ την επιάνεια τυ gel πριν την τπθέτηση των δειγµάτων. 

Απθήκευση 

Τα λεπτά διηθητικά αρτιά απθηκεύνται σε στεγν µέρς, σε θερµκρασία δωµατίυ ή σε ψύη. 

ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΜΕΝΑ 

1. ΛΩΡΙΝΑΤΡΙΥ ∆ΙΑΛΥΜΑ 


Πρετιµάστε διάλυµα 0.15 M (0.9 g/dL) NaCl σε απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ. 

ρήση 

Για την έκπλυνση ερυθρκυττάρων και αραίωση των αιµλυµάτων. 


Φυλάσσεται σε θερµκρασία δωµατίυ ή στ ψυγεί. Πετάτε τ διάλυµα µετά 3 µήνες ή αν µεταληθεί η ψη τυ, π.. θλωση λγω 

µικριακής επιµλυνσης. Για µεγαλύτερη περίδ διατήρησης πρσθέστε αίδι τυ νατρίυ, 0.1 g/dL. 

2. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΜΝΙΜΠΙΗΣΗΣ (πραιρετικ) 


Τυλάιστν 15 min πριν τη ρήση, παρασκευάστε διάλυµα µε (vol. / vol.): 60 % αιθανλη, 10 % ικ ύ και 30 % απεσταγµέν ή 

απινισµέν ύδωρ. 

Αναµίτε καλά. 

ρήση 

Για τη µνιµπίηση ηλεκτρρηµάτων αιµσαιρίνης σε gel. 


Φυλάσσεται σε θερµκρασία δωµατίυ καλά κλεισµέν για να απύγετε την εάτµιση. Πετάτε τ µετά απ 3 µήνες. Μην µνιµπιείτε 

περισστερα απ 4 gel σε κάθε 150 mL µνιµπιητικύ διαλύµατς. 

ΕΠΛΙΣΜΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΕΑΡΤΗΜΑΤΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΜΕΝΑ 

1. Τρδτικ ρεύµατς: GD 61 D SEBIA, PN 1300, GD 251 D SEBIA, PN 1301, MG 300 SEBIA, PN 1302 ή MG 500 SEBIA, PN 1303. 

2. ΕΦΑΡΜΓΕΑΣ HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1409, µε τ ρέα τυ εαρµγέα HYDRAGEL K20. 

3. Θάλαµς Υγρής Φύλαης, PN 1270. 

4. Θάλαµς ηλεκτρρησης: K20 SEBIA, PN 1400. 

5. ∆εαµενές και στατήρες gel για την επεεργασία πλακών gel : Κιτ συµπληρωµατικών εαρτηµάτων HYDRAGEL K20 SEBIA, PN 1420. 

6. Πιπέττες: 5 µL, 10 µL και 200 µL. 

7. Κλίανς επώασης - στεγνώµατς: IS 80 SEBIA, PN 1430. 

8. Πυκνµετρ / σαρωτής µε δυναττητα σάρωσης gel 82 x 51 mm στα 570 nm (κίτριν ίλτρ) : λγισµικ HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ή 

PHORESIS για σαρωτή flat-bed. Ανατρέτε στις δηγίες ρήσης και αθµνµησης τυ κατασκευαστή. 

∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΣ ΑΝΑΛΥΣΗ 

Λήψη και διατήρηση δειγµάτων 

Συνιστάται να ρησιµπιύνται δείγµατα ρέσκυ αίµατς µε αντιπηκτικ. Τα κινά αντιπηκτικά πως EDTA, κιτρικ ή ηπαρίνη είναι 

απδεκτά. Απύγετε εκείνα πυ περιέυν ιωδεικ ύ. Τ αίµα πρέπει να συλλέγεται σύµωνα µε τις καθιερωµένες διαδικασίες 

κλινικής εργαστηριακής πρακτική. Αν ρειάεται, διατηρήστε τα δείγµατα στυς 2 ως 8 °C για έως 5 ηµέρες. 

Πρετιµασία των δειγµάτων 

• Ανακινήστε τ σωλήνα συλλγής πριν τη µεταρά τυ αίµατς για πρετιµασία. 

• Φυγκεντρήστε αίµα µε αντιπηκτικ στις 5 000 rpm για 5 min. 

• Πετάτε τ πλάσµα. 

• Πλύνετε τα ερυθρκύτταρα 2 ρές µε 10 γκυς υσιλγικύ ρύ. Ιδιαίτερη ρντίδα ρειάεται ταν επεεργάεστε γκυς 

ερυθρκυττάρων µικρτερυς των 10 µL. 

• Απρρίψτε την περίσσεια τυ διαλύµατς υσιλγικύ ρρύ πάνω απ τ σαιρίδι των ερυθρών αιµσαιρίων και ανακινήστε τα, 

πριν απ την λήψη 10 µL για αιµλυση. 

• Αιµλύστε 10 µL συµπυκνωµένων ερυθρών µε 130 µL αιµλυτικύ διαλύµατς. 

• Περιδινήστε στ vortex για 10 sec και επωάστε για 5 min σε θερµκρασία δωµατίυ.

- 53 - 


ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: 

- Για να ετιµάσετε αιµλυµα απ άτµα, ελαρά αναιµικά (περίπυ 10 g/dL Hb) ή αριά αναιµικά (< 7 g/dL Hb), γκς των 

συµπυκνωµένων ερυθρών µπρεί να αυηθεί στα 15 µL και 20 µL αντίστια. Η ένταση της ρώσης θα αυηθεί έτσι αλλά ι 

σετικές συγκεντρώσεις των επιµέρυς κλασµάτων δεν θα αλλάυν. 

- Τ αιµλυµα δεν ρειάεται διήθηση ή υγκέντρηση. 

- Τ αιµλυτικ διάλυµα της SEBIA δεν επηρεάει την ασταθή αιµσαιρίνη Bart’s. 

∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ 

I. ΣΤΑ∆Ι ΗΛΕΚΤΡΦΡΗΣΗΣ 

1. Τπθετήστε τν ρέα τυ εαρµγέα HYDRAGEL K20 σε επίπεδη επιάνεια (Εικ. 1) και σηκώστε τ τµήµα τυ ρέα µε τις 

αριθµηµένες εγκπές. 

2. Εισαγάγετε 120 µL απεσταγµέν ή απινισµέν ύδωρ µέρι τ κατώτερ τρίτ της κλίµακας πυ είναι τυπωµένη στ ρέα 

HYDRAGEL K20. 

3. Ανίτε τη συσκευασία τυ HYDRAGEL. 

4. Περάστε γρήγρα και µιµρα ένα διηθητικ αρτί στην επιάνεια τυ gel για να απρρήσει την περίσσεια υγρύ. 

Ααιρέστε τ αρτί αµέσως. 

ΠΡΕΙ∆ΠΙΗΣΗ: Μην αήνετε τ διηθητικ αρτί σε επαή µε τ gel επί µακρν για να µην αυδατωθεί. 

5. Τπθετήστε την πλακέτα τυ gel (µε την επιάνεια τυ gel πρς τα άνω) µε τ άκρ της να αγγίει τ stop στ κάτω τµήµα της 

τυπωµένης κλίµακας (Εικ. 2). 

6. Λυγίστε τ gel και αµηλώστε τ επί της επιάνειας τυ νερύ (Εικ. 3). Βεαιωθείτε τι δεν έυν παγιδευτεί υσαλίδες αέρα, τι 

τ νερ έει απλωθεί κάτω απ λκληρη την πλακέτα τυ gel και τ gel είναι ευθυγραµµισµέν µε την τυπωµένη κλίµακα. 

7. Κατεάστε τ ρέα στην ενδιάµεση θέση µε τ διακπτη στην υψηλή θέση. 

8. Τπθετήστε έναν εαρµγέα σε µια επίπεδη επιάνεια µε τυς αριθµύς των θρίων στη δειά πλευρά (Εικ. 3). 

9. Τπθετήστε 10 µL απ τα αιµλυµένα δείγµατα στα θρία τυ εαρµγέα. Φρτώστε τν εαρµγέα εντς 2 min. 

- ρησιµπιήστε τν εαρµγέα αµέσως. 

- Για ύστερη ρήση (ως 8 ώρες), τπθετήστε τν εαρµγέα στ θάλαµ υγρής ύλαης µε τα δντια πρς τα άνω (κρατήστε τν 

απ τ πλαστικ πρστατευτικ κάλυµµα των δντιών), διατηρήστε λ τν θάλαµ στ ψυγεί και τπθετήστε τ gel στ 

ρέα HYDRAGEL K20 λίγ πριν τη ρήση. 

Βλέπε τ ύλλ δηγιών τυ θαλάµυ υγρής ύλαης για περισστερες λεπτµέρειες. 

10. Απσπάστε τ πρστατευτικ κάλυµµα των δντιών τυ εαρµγέα. 

11. Τπθετήστε τν εαρµγέα στη θέση No 4 τυ ρέα. 

ΣΗΜΑΝΤΙΚ: ι τυπωµένι αριθµί στν εαρµγέα πρέπει να είναι στραµµένι πρς τν ειριστή (Εικ. 4) 

12. αµηλώστε τ ρέα τυ εαρµγέα µε τ διακπτη έτσι ώστε να έρθει εαρµγέας σε επαή µε την επιάνεια τυ gel. ΜΗΝ 

ΠΙΕΕΤΕ ΤΥΣ ΦΡΕΙΣ ΤΕΛΕΙΩΣ ΠΡΣ ΤΑ ΚΑΤΩ. 

13. Μετά απ 1 min, γυρίστε τ διακπτη για να σηκώσετε τν εαρµγέα, ααιρέστε και πετάτε τν εαρµγέα. 

14. Τπθετήστε τ gel σε κατάλληλ θάλαµ ηλεκτρρησης, σύµωνα µε την πλικτητά τυ, µε την κατώτερη πλευρά τυ gel πρ 

ταν ρησιµπιείτε τ θάλαµ SEBIA K20, τπθετήστε τ HYDRAGEL στη γέυρα µε την πλευρά τυ gel πρς τα κάτω. Τ gel 

πρέπει να υθίεται περίπυ 1 cm στ διάλυµα σε κάθε πλευρά. 

Βλέπε τ ύλλ δηγιών τυ θαλάµυ K20 για περαιτέρω λεπτµέρειες. 

15. Συνδέστε τ θάλαµ µε την παρή ρεύµατς. 

| 

Συνθήκες ηλεκτρρησης | SEBIA K20 | 

γκς ρυθµιστικύ διαλύµατς ανά τµήµα | 

| 150 mL | 

λικς γκς ρυθµιστικύ διαλύµατς | 

ρνς ηλεκτρρησης 

Σταθερή τάση 

Αρικ ρεύµα (ανά gel) 

| 

300 mL 

15 min 

165 V 

7 ± 2 mA 

| 

16. Μετά την ηλεκτρρηση, απσυνδέστε τ θάλαµ απ τ τρδτικ και ααιρέστε τ gel. 

II. ΜΝΙΜΠΙΗΣΗ 

Υπάλετε τα gel σε µια απ τις ακλυθες επεεργασίες. 

Μνιµπίηση µε θερµ αέρα (συστήνεται µν µε τν Κλίαν επώασης-στεγνώµατς SEBIA IS 80) : 

Στεγνώστε τ gel τελείως στν κλίαν στυς 80 °C (για 10 min τυλάιστν). 

Μνιµπίηση µε διάλυµα µνιµπίησης : 

1. Τπθετήστε τ gel σε στατήρα (παρέεται µε τ Κιτ συµπληρωµατικών εαρτηµάτων SEBIA HYDRAGEL K20). 

2. Γεµίστε µια δεαµενή (παρέεται µε τ Κιτ συµπληρωµατικών εαρτηµάτων SEBIA HYDRAGEL K20) µε 150 mL διαλύµατς 

µνιµπίησης. 

3. Βυθίστε τ gel στ διάλυµα µνιµπίησης για 15 min. 

4. Ααιρέστε τ gel και στεγνώστε τ µε θερµ 80 °C ρεύµα αέρα στν Κλίαν επώασης-στεγνώµατς IS 80. 

ΣΗΜΑΝΤΙΚ : Τ gel πρέπει να είναι τελείως στεγν. 

III. ΡΩΣΗ - ΑΠΡΩΜΑΤΙΣΜΣ 

1. Βυθίστε τ στεγν και ψυρ gel στ διάλυµα ρώσης για 5 min. 

2. Απρωµατίστε µε τρία διαδικά λυτρά σε διάλυµα απρωµατισµύ µέρι τ background να γίνει τελείως άρωµ και διαυγές. 

3. Σκυπίστε τ υπεράλλν υγρ απ την επιάνεια τυ gel µε απρρητικ αρτί και στεγνώστε τ gel µε θερµ αέρα 80 °C. Αν 

ρειαστεί, καθαρίστε την πίσω (πλαστική) επιάνεια τυ στεγνύ ιλµ µε υγρ απρρητικ αρτί.

- 54 - 


IV. ΣΑΡΩΣΗ 

Σαρώστε µε πυκνµετρ / σαρωτή στα 570 nm ή µε κίτριν ίλτρ. ταν ρησιµπιείτε πυκνµετρα HYRYS ή DVSE, τπθετήστε τ 

κλάσµα A2 στ σηµεί των 5 mm της πλάκας σάρωσης: τ σηµεί µηδενισµύ τπθετείται ανάµεσα στ κλάσµα A2 και της καρνικής 

ανυδράσης στ κατώτερ σηµεί. 

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για να εασαλίσετε πι ακριή και σταθερά απτελέσµατα: 

- Πρσαρµστε τ µήκς σάρωσης ώστε να περιλάετε λ τ ηλεκτρρητικ ίνς (≈ 30 mm). 

- Βεαιωθείτε τι ι περιριστές στις δύ πλευρές τυ κλάσµατς A2 είναι τπθετηµένι στις ρίες της αιµής A2 . 

Καλ είναι να διαάετε τα ρωµατισµένα gel ωρίς καθυστέρηση. Για µελλντική αναρά, µπρύν να διατηρηθύν σε πρστατευτικ 

κάλυµµα σε µέρς ηρ και σκτειν, µακριά απ πηγές θερµτητας. 

ΑΠΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 

Πιτικς έλεγς 

Συνιστάται να περιλαµάνεται ένα δείγµα ελέγυ περιέν αιµσαιρίνες A, F, C και S σε κάθε σειρά δειγµάτων. 

Τιµές 

Η πυκνµετρική σάρωση κερωσµένων ηλεκτρρηµάτων παρέει σετικές συγκεντρώσεις (πσστά) των επιµέρυς ωνών της 

αιµσαιρίνης. 

ι υσιλγικές τιµές (µ.. ± 2 SD) στα gel ΗYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) έυν εαθεί απ ένα υγιή πληθυσµ 200 ενηλίκων (ανδρών 

και γυναικών): 

Αιµσαιρίνη A ≥ 96.5 % 

Αιµσαιρίνη F < 2.0 % (*) 

Αιµσαιρίνη A2 ≤ 3.5 % 

(*) λ. Παρεµλές και Περιρισµί 

Συνιστάται κάθε εργαστήρι να διαµρώνει τις δικές τυ υσιλγικές τιµές. 

Ερµηνεία 

1. Πιτικές διαταραές: Αιµσαιρινπάθειες 

ι περισστερες αιµσαιρινπάθειες είλνται σε µετάλλαη αντικατάστασης ενς αµινές σε µια απ τις πλυπεπτιδικές αλυσίδες. 

Η κλινική σηµασία µιας τέτιας αλλαγής εαρτάται απ τν τύπ τυ αµινές και τη θέση. Σε κλινικά σηµαντική νσ, επηρεάεται είτε 

η α αλυσίδα είτε η . 

Περισστερες απ 200 πικιλίες αιµσαιρίνης ενηλίκυ έυν περιγραεί. ι πρώτες πυ µελετήθηκαν και ι συντερα απαντώµενες 

έυν αλλαγµέν καθαρ ηλεκτρικ ρτί, µε απτέλεσµα την εύκλη ανίνευσή τυς µε ηλεκτρρηση. 

Υπάρυν τέσσερις κύριες παθλγικές αιµσαιρίνες ι πίες παρυσιάυν ειδικ κλινικ ενδιαέρν: S, C, E και D. 

Τα κιτ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 πρρίνται για την πρκαταρκτική ταυτπίηση αιµσαιρινπαθειών και θαλασσαιµιών. ταν 

διαπιστωθεί παθλγικ ηλεκτρρητικ πρίλ, θα πρέπει να διερευνάται µε κατάλληλες δκιµασίες (π.. ηλεκτρρηση σε ινη 

γέλη αγαρης). 

Αιµσαιρίνη S 

Η αιµσαιρίνη S είναι η συντερη. είλεται σε αντικατάσταση ενς γλυταµικύ ές (ένα ιν αµινύ) στη ß-αλυσίδα απ αλίνη 

(ένα υδέτερ αµινύ). Η ηλεκτρρητική της κινητικτητα είναι επµένως µειωµένη. Στ αλκαλικ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, 

η αιµσαιρίνη S κινείται µεταύ των κλασµάτων A και A 2 . 

Αιµσαιρίνη C 

Ένα γλυταµικ ύ της ß-αλυσίδας αντικαθίσταται απ λυσίνη (ένα ασικ αµινύ): η κινητικτητά της είναι σηµαντικά µειωµένη. Στ 

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, ι C, E και A 2 συµπίπτυν. ταν τ κλάσµα είναι > 15 %, πρέπει να τίθεται υπψία αιµσαιρινών C και 

E. 

Αιµσαιρίνη E 

Ένα γλυταµικ ύ της ß-αλυσίδας αντικαθίσταται απ λυσίνη: η αιµσαιρίνη E κινείται πως η αιµσαιρίνη C στ HYDRAGEL 

HEMOGLOBIN(E) K20. Αντίθετα µε την αιµσαιρίνη C, δεν διαωρίεται απ την αιµσαιρίνη A σε ιν διάλυµα [HYDRAGEL ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) K20]. Αυτή η ιδιτητά της επιτρέπει τ διαωρισµ της E απ τη C. 

Αιµσαιρίνη D 

Ένα γλυταµικ ύ της ß-αλυσίδας αντικαθίσταται απ γλυταµίνη. Στ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20, η αιµσαιρίνη κινείται 

ακριώς πως η αιµσαιρίνη S. Αντίθετα µε την αιµσαιρίνη S, η αιµσαιρίνη D δεν διαωρίεται απ την αιµσαιρίνη A σε ιν 

διάλυµα [HYDRAGEL ACID(E) HEMOGLOBIN(E) K20]. Αυτή η ιδιτητά της επιτρέπει τ διαωρισµ της S απ την D. 

2. Πστικές διαταραές: Θαλασσαιµίες 

ι θαλασσαιµίες απτελύν µια ετεργενή µάδα γενετικών διαταραών αρακτηριµενων απ µειωµένη σύνθεση κάπιας απ τις 

πλυπεπτιδικές αλυσίδες της αιµσαιρίνης. µριακς µηανισµς αυτής της µείωσης δεν έει πλήρως περιγραεί. 

Υπάρυν δύ τύπι θαλασσαιµικών συνδρµων:

- 55 - 


Άλα θαλασσαιµίες 

αρακτηρίνται απ µείωση της σύνθεσης των α-αλυσίδων, µε απτέλεσµα επίπτωση στη σύνθεση λων των υσιλγικών 

αιµσαιρινών. 

Η περίσσεια των ß- και γ- αλυσίδων σε σέση µε τις α-αλυσίδες δηγεί στ σηµατισµ τετραµερών ωρίς α-αλυσίδες : 

• αιµσαιρίνη Bart = γ 4, 

• αιµσαιρίνη H = ß 4. 

Βήτα θαλασσαιµίες 

αρακτηρίνται απ µείωση της σύνθεσης των -αλυσίδων. Επηρεάεται µν η σύνθεση της αιµσαιρίνης A. 

Επµένως αυάννται τα πσστά των αιµσαιρινών F και A 2 σε σέση µε την αιµσαιρίνη A. 

3. Ηλεκτρρητικά πρίλ 

Ηλεκτρρητική 

κίνηση υσιλγικών 

αιµσαιρινών 

A(A 0 + A 1 ) A (A 0 + A 1 ) 

F 

S - D 

A 2 

A2 - C - E 

καρνική ανυδράση καρνική ανυδράση 

σηµεί εαρµγής 

A 0 : Τ µη γλυκυλιωµέν κλάσµα της υσιλγικής αιµσαιρίνης τυ ενηλίκυ A. 

A 1 : Τ γλυκυλιωµέν κλάσµα της υσιλγικής αιµσαιρίνης τυ ενηλίκυ A. 

Στα παραπάνω πρίλ, η κάθδς είναι κάτω και η άνδς επάνω. 

Παρεµλές και περιρισµί. 

• Μην ρησιµπιείτε αιµλυµένα δείγµατα αίµατς. 

• ταν ανινεύεται µια παθλγική αιµσαιρίνη, η πία κινείται διαρετικά απ τιςκύριες παραλλαγές αιµσαιρίνης S, C, D και E, 

ρησιµπιήστε άλλα µέσα ταυτπίησης (π..ισηλεκτρική εστίαση, ηλεκτρρηση αλυσίδων σαιρίνης) ή συµυλευτείτε ή στείλτε 

τ δείγµα σε εειδικευµέν εργαστήρι. 

• Η πυκνµέτρηση της Hb F (ή πιασδήπτε άλλης ελάσσνς αιµσαιρίνης η πία κινείται κντά στα µείνα κλάσµατα) είναι 

ηµιπστική καθώς ι τιµές γίννται ανακριής κάτω απ τ 2 % - 3 % της λικής αιµσαιρίνης. 

• Μερικί µυγι “S” λαµάνυν θεραπεία µε “Hydrea”® (υδρυυρία) η πία µπρεί να επάγει παραγωγή εµρυϊκής αιµσαιρίνης. 

Η κινητικτητα της επαγµενης αιµσαιρίνης F στ HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) έει σε ρισµένες περιπτώσεις διαπιστωθεί 

διαρετική απ τη υσιλγική αιµσαιρίνη F. 

• Σε δείγµατα τα πία έυν υλαθεί επί περισστερες απ 7 ηµέρες, τ απρν ίνς πίσω απ τ κλάσµα Hb A µπρεί να µετατραπεί 

σε καλώς εντπισµέν κλάσµα. Μην ερµηνεύετε τ κλάσµα αυτ ως πικιλία αιµσαιρίνης, π.. αιµσαιρίνες H ή Bart. 

Αντιµετώπιση πρληµάτων 

Καλέστε την Τενική Υπηρεσία τυ πρµηθευτή αν η ανάλυση δεν λειτυργεί παρλ πυ ι δηγίες πρετιµασίας και ύλαης των 

υλικών και ι δηγίες λειτυργίας τηρύνται πρσεκτικά. 

Τα Φύλλα ∆εδµένων Ασαλείας των αντιδραστηρίων των κιτ και πληρρίες για την ασαλή απρριψή τυς διατίθενται επίσης απ την 

Τενική Υπηρεσία τυ πρµηθευτή. 

∆Ε∆ΜΕΝΑ ΑΠ∆ΣΗΣ 

Ηλεκτρρητική κίνηση 

κύριων παθλγικών 

αιµσαιρινών 

λα τα δεδµένα απδσης ασίνται σε µια µελέτη η πία περιελάµανε υλικά και ργανα SEBIA HYDRAGEL και άλλ συγκρίσιµ 

εµπρικά διαθέσιµ σύστηµα µε gel αγαρης. Επιπρσθέτως, πραγµατπιήθηκαν µελέτες συµωνίας πυ η ταυτπίηση και η 

πστικπίηση των αιµσαιρινών έγιναν µε HPLC ή άλλες καθιερωµένες µεθδυς. Αντιπρσωπευτικά απτελέσµατα παρυσιάνται 

παρακάτω. λα τα ηλεκτρρήµατα ερµηνεύτηκαν πτικά. Τ πυκνµετρ SEBIA HYRYS ρησιµπιήθηκε για λες τις πυκνµετρήσεις 

συµπληρωµατικά πρς τα πτικά δεδµένα πυ κρίθηκε απαραίτητ. 

Αναπαραγωγιµτητα εντς της σειράς ανάλυσης 

Τρία δείγµατα αίµατς ηλεκτρρήθηκαν σε gel HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 απ την ίδια παρτίδα. Κάθε δείγµα έτρεε και στα 

15 ίνη κάθε gel. ακλυθς πίνακας δείνει τις µέσες τιµές, τις SD και τυς CV για κάθε αιµσαιρινικ κλάσµα στα τρία δείγµατα για 

τις εκατστιαίες τιµές για κάθε ίνς. Επιπλέν, καµία απ τις επαναλήψεις δεν έδωσε ψευδώς θετικ ή αρνητικ απτέλεσµα. 

| ΚΛΑΣΜΑ | Μ. | SD | CV (%) | 

| Φυσιλγικ αίµα | 

| Hb A | 97.4 | 0.1 | 0.1 | 

| Hb A | 2 2.6 | 0.1 | 5.3 | 

| Αυηµένη Hb A2 | 

| Hb A | 95.2 | 0.2 | 0.2 | 

| Hb A | 2 4.8 | 0.2 | 4.4 | 

| Αυηµένη Hb C | 

| Hb A | 56.7 | 0.4 | 0.8 

| 

| 

Hb C | 43.3 | 0.4 | 1.0 |

- 56 - 


Αναπαραγωγιµτητα µεταύ σειρών ανάλυσης 

∆είγµατα αίµατς ηλεκτρρήθηκαν σε gel HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 απ µια παρτίδα. Τα αναλυθέντα δείγµατα περιελάµαναν 

επτά δείγµατα µε µια παθλγική αιµσαιρίνη (Hb S, Hb F ή Hb C) και δύ δείγµατα µε αυηµένη Hb A2 . ι µέσες τιµές, SD και CV 

υπλγίστηκαν απ τα δεδµένα για κάθε κλάσµα σε κάθε δείγµα. Τ εύρς των µέσων τιµών, SD και CV και µέσς CV απ τα 

συγκεντρωµένα δεδµένα για τα επιµέρυς κλάσµατα παρυσιάνται παρακάτω. Επιπλέν, καµία απ τις επαναλήψεις δεν έδωσε 

ψευδώς θετικ ή αρνητικ απτέλεσµα. 

| ΚΛΑΣΜΑ | Μ. | SD | CV (%) | ΜΕΣΣ CV (%) | 

| Hb A | 18.0 – 97.8 | 0.1 – 1.0 | 0.1 – 4.0 | 0.8 | 

| Hb F | 13.3 – 76.3 | 0.5 – 0.6 | 0.7 – 3.4 | 1.8 | 

| Hb C/E | 21.5 – 43.5 | 0.2 – 0.3 | 0.6 – 1.1 | 0.8 | 

| Hb S/D | 9.7 – 84.1 | 0.1 – 0.6 | 0.4 – 2.6 | 1.1 

| | 

Hb A | 2 2.2 – 5.7 | 0.1 – 0.2 | 2.3 – 7.6 | 4.0 | 

Ακρίεια – Ανίνευση ανωµαλιών της αιµσαιρίνης 

Εήντα τρία (63) διαρετικά δείγµατα αίµατς αναλύθηκαν µε HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 και άλλ συγκρίσιµ εµπρικά διαθέσιµ 

σύστηµα gel αγαρης. Τα δείγµατα αίµατς και η διαγνωστική τυς αιλγηση πρσέρθηκαν απ νσκµεί. Η διάγνωση ασιταν 

σε ηλεκτρρηση σε αλκαλικ και ιν gel και/ή HPLC. λες ι παθλγικές αιµσαιρίνες ή τα παθλγικά επίπεδα υσιλγικών 

αιµσαιρινών πυ ανινεύθηκαν µε τ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 ρίσκνταν σε συµωνία µε τ συγκρίσιµ σύστηµα, τα 

απτελέσµατα απ τ νσκµεί και την κλινική διάγνωση. ∆εν υπήρε περίπτωση ψευδώς θετικύ, δηλ. ανίνευση µιας παθλγικής 

ώνης εκεί πυ δεν υπήρε τέτια ανωµαλία. 

Ακρίεια – Πστικς πρσδιρισµς της Hb A2 Τα επίπεδα Hb A2 µετρήθηκαν σε 51 δείγµατα αίµατς µε υσιλγικά και αυηµένα επίπεδα Hb A2 µετρήθηκαν µε πυκνµέτρηση των 

ηλεκτρρηµάτων πυ ελήθησαν µε τ HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 και άλλ συγκρίσιµ εµπρικά διαθέσιµ σύστηµα gel 

αγαρης. ι τιµές απ τις δύ διαδικασίες αναλύθηκαν µε στατιστική επεεργασία γραµµικής παλινδρµησης. Τα απτελέσµατα της 

ανάλυσης παρυσιάνται παρακάτω (y = HYDRAGEL). 

| Συντελεστής συσέτισης | Τµή τυ y | Κλίση | Εύρς % τιµών | 

| | | | (Σύστηµα της SEBIA) 

| | 

0.973 | -0.344 | 0.963 | 1.5 – 5.7 | 

ΒΙΒΛΙΓΡΑΦΙΑ 






860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


For en dansk version af dette pakningsvedlæg, henvend Dem til den danske distributør af produkter fra SEBIA : 

ILS ApS Gydevang 22A DK-3450 Allerød 

Tlf : +45 48 14 18 50 

Fax : +45 48 14 18 60 

e-mail : ils@ilsdk.dk 

- 57 - 


SEBIA INSTRUKTION - Dansk

1 2 3 4 5 6 7 

SCHÉMAS / FIGURES 

Figure 1 Figure 2 

Figure 3 Figure 4 

- 58 - 


1 2 3 4 5 6 7 

1 2 3 4 5 6 7 

1 2 3 4 5 6 7

Parc Technologique Léonard de Vinci 

Rue Léonard de Vinci 

CP 8010 Lisses 

91008 EVRY CEDEX - FRANCE 

ISO 13485 

Benelux s.a. / n.v. 

Rue de la Fusée, 62 

Raketstraat, 62 

1130 Bruxelles / Brussel 

BELGIQUE / BELGIË 

GmbH 

Michael Henkel Straße 4-6 

36043 Fulda 

DEUTSCHLAND 

Hispania S.A. 

C/Sicilia, 394 

08025 Barcelona 

ESPAÑA 

Italia s.r.l. 

Via Antonio Meucci, 15/a 

Località Ponte a Ema 

50012 Bagno a Ripoli, Firenze 

ITALIA 

Inc. 

400-1705 Corporate Drive 

Norcross, Georgia 30093 

U.S.A.

HYDRAGEL HEMOGLOBIN(E) K20 - Sebia Electrophoresis

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?