Anexo 1: Métodos analíticos - Osakidetza

Anexo 1:
Métodos
Analíticos

M
M é t o d o s A n a l í t i c o s
Selección y validación de los métodos
analíticos
M
M
Una de las etapas de la vigilancia de la seguridad química de los alimentos es la obtención de
datos acerca de los niveles de determinadas sustancias que pueden estar presentes en los
alimentos (contaminantes, residuos, aditivos y nutrientes). La obtención de estos datos es el
resultado de un proceso que comienza con la selección y validación de un método analítico,
cuya ejecución ha de ser permanentemente controlada.
El análisis de residuos y contaminantes en los alimentos supone la determinación de sustancias
que se encuentran en cantidades muy pequeñas (del orden de mg/kg o µg/kg) en matrices muy
complejas. Es preciso por tanto realizar en primer lugar una extracción cuantitativa de la sustancia
y purificar y/o concentrar el extracto obtenido antes de proceder a su detección y cuantificación.
Para la correcta selección de un método analítico, entendiendo como método el conjunto
sucesivo de las fases indicadas de extracción, purificación y determinación (detección y/o
cuantificación), es preciso considerar todos aquellos factores que pueden influir en la validez
del resultado, en relación a los motivos que han originado su demanda.
Uno de estos factores es el límite de detección y/o cuantificación requerido. La propia
naturaleza del estudio de dieta total que ha sido elegido (agrupación de los alimentos y análisis
de los grupos), hace que las sustancias aportadas por uno de los alimentos puedan sufrir un
efecto de dilución importante dentro de su grupo. Es preciso conseguir límites de determinación
muy bajos para realizar las cuantificaciones en estas circunstancias. Además, el método
aplicado para evaluar las ingestas utiliza con frecuencia la aproximación más conservadora en
la que los valores inferiores al límite de detección son considerados iguales a éste. Si los límites
de detección no son lo suficientemente bajos se produciría una sobreestimación tal que podría
invalidar las conclusiones de la evaluación. En otros casos, como por ejemplo en el análisis de
residuos de medicamentos veterinarios para los que se ha establecido un Límite Máximo de
Residuos (LMR), el límite de determinación necesario estará condicionado por el LMR de la
sustancia a analizar.
Este factor no sólo es fundamental en la selección del método analítico, sino que es determinante
en la dificultad que presentará la ejecución posterior, ya que trabajar con límites de determinación
muy bajos dificulta la obtención de una precisión y exactitud adecuadas a esos niveles.
Cualquier método analítico antes de ser utilizado es validado; es decir, se realizan las
comprobaciones que aseguran que el método es científicamente correcto en las condiciones en
que va a ser aplicado. En el proceso de validación se comprueban sus características técnicas en
cuanto a selectividad y especificidad, sensibilidad, linealidad, límites de detección,
m é t o d o s a n a l í t i c o s
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Métodos Analíticos
determinación o cuantificación, exactitud y precisión, siguiendo Normas internacionales 1 y/o
Directivas comunitarias 2,3,4,5 . El proceso para determinar la exactitud de los métodos se lleva a
cabo con materiales de referencia certificados, si es posible, o con muestras enriquecidas
artificialmente en el caso de no disponer de los materiales de referencia adecuados. La precisión
del método se calcula mediante el análisis repetido de una misma muestra.
Otro aspecto que interesa tener en cuenta es la practicabilidad del método analítico, es decir, la
capacidad de respuesta del método en las condiciones de disponibilidad de recursos del laboratorio
en el que se realiza. El número de muestras que se pueden analizar en un periodo de tiempo
concreto, así como el tiempo de respuesta desde que la muestra entra en el laboratorio, pueden
ser parámetros decisivos en aquellos casos en que la toma de muestras implica una retención
cautelar de productos hasta conocerse los resultados analíticos. Una estrategia analítica que
implique dos tipos de métodos: criba y confirmación es, en muchos casos, la mejor aproximación.
Por último es preciso verificar día a día los resultados analíticos obtenidos y, además, comprobar
que son comparables con los resultados de otros laboratorios. Para lograr ambos objetivos es
preciso disponer de un programa sistemático de control de calidad interno y participar en
ensayos de aptitud e intercomparación entre distintos laboratorios.
Los procedimientos correspondientes a todas estas acciones, deben ir enmarcados en el sistema
de aseguramiento de la calidad del laboratorio, que ha de ser implantado de acuerdo a normas
internacionales. Los requisitos que deben cumplir los laboratorios que se dedican al control
oficial de alimentos se contemplan en el artículo 3 de la Directiva 93/99 6
sobre medidas
adicionales de control oficial de productos alimenticios. En el punto 3.1 se señala, entre otras
medidas, la necesidad de cumplir con la norma europea EN 45001 7 . Esta Directiva fue
incorporada al ordenamiento jurídico español mediante el Real Decreto 1397/1995 8 .
El control de calidad interno se lleva a cabo a través del análisis de blancos, duplicados de
muestras y muestras de control en cada una de las tandas analíticas. Estas muestras de control
pueden ser materiales de referencia certificados, muestras evaluadas respecto a materiales de
referencia o muestras enriquecidas artificialmente. Los datos analíticos obtenidos se revisan en
relación a los resultados de esas muestras de control y teniendo en cuenta, cuando existen, los
criterios establecidos por la Unión Europea para la identificación y cuantificación de residuos 3,4,5 .
Respecto al control de calidad externo, el Laboratorio de Salud Pública del Departamento de
Sanidad del Gobierno Vasco considera que es fundamental participar en los ejercicios de
intercomparación y ensayos de aptitud que se organizan a nivel nacional e internacional en las
áreas analíticas de trabajo habitual del laboratorio.
Entre los ensayos de aptitud relacionados con la seguridad química de alimentos, el laboratorio
participa sistemáticamente en FAPAS R 9
en las siguientes áreas: serie II: residuos de
medicamentos veterinarios; serie IV: aflatoxinas; serie V: plaguicidas organoclorados; serie VII:
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elementos traza; serie IX: plaguicidas organofosforados y serie XV: nitratos. En 1990-91 participó
en “ Smalley Check Sample” para aflatoxina M 1 ,organizado por la American Oil Chemists’ Society
(AOCS). En 1991 y 1994 participó en “Aflatoxin Check Sample Survey Programme” organizado
por la OMS y en 1993 tomó parte en los ejercicios de aptitud organizados por GEMS/FOOD-EURO
para análisis de aflatoxinas, elementos traza, nitratos y plaguicidas.
Respecto a ejercicios de intercomparación, el laboratorio ha participado en los ensayos
organizados en 1990, 1991, 1992 y 1993 por la Sociedad Española de Química Analítica para
trazas de metales pesados y plaguicidas. Ha tomado parte en “Pesticides (N,P-compounds) in
cereals. Intercomparison studios” organizado en 1995 por el Community Bureau of Reference
(BCR) y participa en el “Collaborative study of CEN multiresidue methods for the enforcement
of EU-MRLs for pesticides in fruit, vegetables and grain” previsto para 1996. También participa
habitualmente en los ensayos organizados por el Centro Nacional de Alimentación (CNA) del
Instituto Carlos III para análisis de residuos de medicamentos veterinarios.
Metales pesados y arsénico
El mercurio yelarsénico se analizaron inicialmente en todos los grupos de la dieta. La
destrucción de la materia orgánica se realizó por vía húmeda con ácido nítrico y sulfúrico,
excepto en el grupo de pescado. El arsénico total se cuantificó por espectrofotometría de
absorción atómica con generación de hidruros (HAAS) y el mercurio por espectrofotometría de
absorción atómica con la técnica de vapor frío. Los límites de cuantificación para ambos
elementos oscilaron entre 1 y 5 µg/kg, según los grupos de la dieta. Una descripción detallada
de los parámetros de validación del método (materiales de referencia utilizados, precisión,
exactitud, etc.) ha sido previamente publicada 10 .
La destrucción de la materia orgánica para determinar el arsénico total en el grupo de pescado
se lleva a cabo por calcinación de las muestras a 450ºC utilizando Mg (NO 3 ) 2 .6H 2 O y MgO como
agente calcinante. La cuantificación se realiza por HAAS con un límite de cuantificación de
2 µg/kg. La determinación de mercurio en pescado se realiza por espectrofotometría de
absorción atómica con vapor frío utilizando un sistema de inyección de flujo, cuantificando con
un método de adición de patrones. Previamente se digiere la muestra con ácido nítrico y
peróxido de hidrógeno, en recipientes cerrados a presión dentro de un sistema de microondas.
Los métodos analíticos para ambos elementos en el grupo del pescado fueron validados
utilizando los materiales de referencia certificados (CRM) por el BCR números 422 y 278. La
exactitud, expresada como porcentaje de recuperación, es superior al 99% en el caso del
arsénico y al 96% en el del mercurio. La imprecisión, expresada como coeficiente de variación,
es inferior al 8% para el mercurio y del 6% para el arsénico, calculada en este caso para
concentraciones superiores a 1000 µg/kg.
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Métodos Analíticos
La especiación de arsénico fue realizada en el Department of Environmental Sciences, University
of Plymouth, Reino Unido. El método utilizado 11 consiste en la digestión de la muestra con
tripsina, seguida de la dilución y sedimentación de la mezcla digerida para separar en el
sobrenadante las distintas formas de arsénico. Esta separación se realiza por cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) en columna de intercambio aniónico, utilizando como detector
un sistema de plasma de acoplamiento inductivo asociado a espectrometría de masas (ICP-MS).
La cuantificación de las formas reducibles de arsénico se realiza por HAAS con un método de
adiciones, previa digestión con ácido nítrico y peróxido de hidrógeno.
El cadmio y el plomo se analizan por espectrofotometría de absorción atómica con ionización
en horno de grafito. La materia orgánica se destruye previamente en un horno de mufla con un
gradiente de temperatura. El límite de cuantificación del método de análisis de cadmio oscila
entre 0.5 y 3 µg/kg según los grupos de alimentos de la dieta. Para el plomo este límite se sitúa
entre 3 y 5 µg/kg. Una descripción más detallada de los métodos ha sido previamente
publicada 10 .
Plaguicidas
La determinación de los plaguicidas organoclorados se lleva a cabo por cromatografía de gases
con detector de captura electrónica. La extracción y purificación previas se realizan mediante
diferentes procedimientos según el tipo de muestra. En los grupos de huevos, leche y derivados
lácteos la extracción se realiza por el método de Stijve and Cardinale 12
con algunas
modificaciones. En los grupos de carne, derivados cárnicos y pescado la extracción se lleva a
cabo de acuerdo al método de la AOAC edición 1984 sec. 29.012 13 y en el resto (excepto aceites
y grasas) por el procedimiento referido en la sec. 29.011 14 . Las muestras del grupo de aceites y
grasas se someten directamente a la purificación. Los extractos de todos los grupos excepto los
de bebidas alcohólicas se purifican por cromatografía de gel de permeación (GPC). Los límites
de cuantificación se sitúan entre 1 y 5 µg/kg excepto para el grupo de aceites y grasas que es
10 µg/kg. Los porcentajes de recuperación obtenidos varían según las diferentes combinaciones
plaguicida/grupo de alimentos pero siempre se mantienen en el intervalo 80-120%. Los
coeficientes de variación, calculados sobre adiciones a nivel del límite de cuantificación, oscilan
entre 4 y 19%. Todos los residuos superiores al límite de determinación se confirman por
espectrometría de masas.
La extracción para el análisis de los plaguicidas organofosforados se realiza de acuerdo al
método AOAC 985.22, edición 1990 15 . El extracto se purifica por GPC según el método S19
descrito en DFG Manual of Pesticide Residue Analysis 16 , adaptado a los plaguicidas que se
determinan. La cuantificación en los extractos purificados se lleva a cabo por cromatografía de
gases capilar con detector fotométrico de llama. El límite de cuantificación es de 10 µg/kg. Las
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ecuperaciones estimadas sobre muestras enriquecidas al nivel del límite de determinación
oscilan entre el 80 y el 120% según la sustancia analizada, con coeficientes de variación
inferiores al 12%. Al igual que en el caso de plaguicidas organoclorados todos los residuos
superiores al límite de determinación se confirman por cromatografía de gases espectrometría
de masas (GC-MS).
El análisis de ditiocarbamatos se realiza a través de la cuantificación por espacio de cabeza y
cromatografía de gases con detector de captura de electrones del sulfuro de carbono generado
con la hidrólisis de los compuestos 17 . El límite de determinación se estableció en 0.1 mg/kg de
CS 2 . La recuperación del método, obtenida sobre muestras enriquecidas, se sitúa entre el 70 y el
100% según la sustancia. La imprecisión, expresada como coeficiente de variación oscila entre
el 6 y el 17%.
Los N-metil carbamatos se analizan según el método descrito por de Kok et al. 18 , con algunas
modificaciones. El límite de cuantificación se estableció en 6 µg/kg. La recuperación, calculada
sobre muestras enriquecidas, es superior al 78% para todos los compuestos. Los coeficientes de
variación oscilan entre el 2 y el 18%. Todos los residuos detectados por encima del límite de
cuantificación se confirman por GC-MS, con inyección directa en el caso de algunos
compuestos o tras derivatización con anhídrico heptafluorobutírico en el de otros 19 .
Dibenzodioxinas y dibenzofuranos
policlorados (PCDDs y PCDFs) y
Bifenilos policlorados (PCBs)
Las Dioxinas y los PCBs se analizaron en el Central Science Laboratory (CSL) del Ministry of
Agriculture, Fisheries and Food del Reino Unido. El método utilizado (Krokos et al. 20 ) consiste en
una extracción y fraccionamiento integrados, mediante una columna de carbón activo acoplada
a otra de sílice modificada. Las distintas fracciones se purificaron en columna de sílice y tras la
adición de los estándares internos conteniendo 13 C 12 , se analizaron por cromatografía de gases
espectrometría de masas de baja resolución (GC-LRMS). En la determinación de los PCBs
ortosustituidos y debido a la presencia de interferencias químicas en el extracto, se llevó a cabo
también el análisis por espectrometría de masas de alta resolución. Los límites de determinación
de la técnica son 0.01 ng/kg para PCDDs y PCDFs (excepto para el grupo de grasas y aceites), 0.1
ng/kg para los PCBs no orto sustituidos y 10 ng/kg para el resto de los PCBs analizados. Todos
los datos se evalúan en relación con el cumplimiento de los criterios de aceptación de datos
analíticos publicados para PCDDs y PCDFs 21 , y de acuerdo a criterios análogos para PCBs.
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Métodos Analíticos
Micotoxinas: Aflatoxinas
El análisis de Aflatoxina M 1 en leche y derivados lácteos y de Aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 en
frutos secos se realiza por cromatografía líquida de alta resolución con detector de
fluorescencia tras la purificación de las muestras con una columna de inmunoafinidad. La
aflatoxina M 1 se extrae de la leche de acuerdo al procedimiento descrito por Mortimer et al. 22 .
En el grupo de derivados lácteos se utiliza para la extracción el procedimiento de Sharman
et al. 23 . Los límites de cuantificación son 0.010 µg/kg en leche y 0.025 µg/kg en derivados
lácteos. El método ha sido validado utilizando los materiales de referencia certificados por el
BCR CRM-282, 283, 284 and 285. Los resultados de los ejercicios de validación han sido
previamente publicados 24 . Las aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 y G 2 se extraen de los frutos secos con una
mezcla de metanol:agua, excepto en los pistachos, donde se utiliza una mezcla de cloroformo
y agua, y posteriormente se realiza una partición en hexano:tampón fosfato 25 . Los límites de
detección son de 1 µg/kg para aflatoxina B 1 , 2 µg/kg para aflatoxina G 1 y 0.1 µg/kg para las
aflatoxinas B 2 y G 2 . El método fue validado en cacahuetes pelados utilizando los materiales
de referencia certificados por el BCR números 385 y 401. En el resto de alimentos (pistachos,
maiz, higos secos...) la validación se realizó con muestras enriquecidas. Las recuperaciones
obtenidas se sitúan entre 63 y 78% para aflatoxina B 1 , entre 85 y 101% para aflatoxina G 1 y
entre 52 y 71% para las aflatoxinas B 2 y G 2 , según la matriz analizada. Los coeficientes de
variación del método oscilan entre un 8 y un 15%, en función de la matriz y de los niveles
de cuantificación.
Radionucleidos
La determinación de la actividad específica de los radionucleidos 89 Sr y 90 Sr se llevó a cabo en
el Laboratorio Ambiental-Nuclenor, situado en Medina de Pomar, Burgos. El método utilizado
determina cuantitativamente cada uno de los isótopos radiactivos mediante una separación
radioquímica y contaje de sus emisiones ß con un contador ß de anticoincidencias, de bajo
fondo. El límite inferior de detección es 0.12 Bq/kg.
El análisis isotópico de emisores g se realizó en el Centro de Investigaciones Energéticas,
Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT) de Madrid. La identificación y cuantificación de los
isótopos 134 Cs, 137 Cs y 40 K se llevó a cabo por espectrometría g. El límite de detección de la técnica
oscila entre 0.01 y 0.15 Bq/kg.
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Nitrato y nitrito
Los iones nitrato y nitrito se analizan por HPLC con columna de intercambio aniónico y
detección ultravioleta, previa extracción en caliente, desproteinización y purificación del
extracto con fase sólida C18, de acuerdo al método descrito por Dennis et al. 26 . El límite de
cuantificación es de 5 mg/kg. La recuperación, calculada sobre muestras enriquecidas, se sitúa
entre el 98 y el 106%. La imprecisión, expresada como coeficiente de variación, es inferior al 5%.
Aditivos
La determinación de sulfito se realiza por el método de Monier-Williams 27 , con un límite de
cuantificación de 10 mg/kg. La exactitud, expresada como porcentaje de recuperación calculada
sobre muestras enriquecidas, es superior al 88% con un coeficiente de variación inferior al 6%.
El ácido bórico se determina mediante el método de la quinalizarina 28 en aquellas muestras con
resultado “positivo” al test del papel de cúrcuma. El límite de cuantificación es de 20 mg/Kg.
Nutrientes
El hierro y el zinc se determinan por espectrofotometría de absorción atómica con ionización
por llama tras la obtención de cenizas en un horno de mufla. Los límites de cuantificación del
método son 0.5 mg/kg para hierro y 0.2 mg/kg para zinc. Para validar el método se utilizaron los
materiales de referencia certificados por el BCR, CRM-184,185,189,191 y el certificado por el
National Institute of Standards and Technology (NIST), SRM-1568 (Standard Reference
Material). En el caso del hierro se utilizaron también los CRM-150 y 151. La exactitud,
expresada como porcentaje de recuperación, se sitúa entre el 97 y el 106% para el hierro, y entre
el 100 y el 106% para el zinc según los grupos de la dieta. La imprecisión, expresada como
coeficientes de variación osciló entre el 2 y el 11% en el análisis de hierro y entre entre el 1 y
el 11% en el caso del zinc.
La técnica analítica para la determinación de selenio comienza con la digestión de la muestra
por vía húmeda con una mezcla de ácidos nítrico, sulfúrico y perclórico, seguida de la reducción
con ácido clorhídrico y cuantificación por HAAS 29 . Los límites de cuantificación oscilan entre 0.3
y 2 µg/kg según los grupos de alimentos de la dieta. El método fue validado utilizando los
materiales de referencia certificados por el BCR-CRM-183,185,186,189,281,287 y los SRM
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1577 y 1568 certificados por NIST. Las recuperaciones obtenidas oscilaron entre el 95 y el 115%
según la matriz, con coeficientes de variación inferiores al 10%.
Residuos de medicamentos de uso
veterinario
Para la determinación de tiouracilos y mercaptoimidazol en tiroides se utiliza la técnica descrita
por Verbeke y Brabender 30 , que consiste en una extracción con metanol, seguida de purificación
con una columna selectiva mercuriada. La detección se realiza por cromatografía en capa fina de
alta resolución (HPTLC) previa derivatización con NBD-Cl (7-cloro-4-nitrobenzofurano). El límite
de detección es de 100 µg/kg para cada una de las sustancias analizadas.
Los estilbenos dietilestilbestrol (DES) y dienestrol (DE), la trenbolona, la nortestosterona y el
zeranol se analizan en orina con la técnica recomendada por el CNA 31 . La técnica consiste en la
hidrólisis enzimática con glucuronidasa, la extracción mediante fase sólida C18 y la purificación
con fraccionamiento por HPLC. Finalmente los anabolizantes se detectan por HPTLC
bidimensional. Los límites de detección son 5 µg/L para DES, 10 µg/L para DE, 0.5 µg/L para
trenbolona y 5 µg/L para zeranol y nortestosterona, partiendo de 10 ml de orina. A partir de
1993 la identificación y cuantificación de los estilbenos (DE, DES y hexestrol-HEX) se lleva a
cabo por cromatografía de gases espectrometría de masas, previa hidrólisis de la orina y
extracción en fase sólida (columnas Bond Elut Certify R ). El límite de detección es 2 µg/L para
todos los estilbenos. Una descripción detallada del método ha sido previamente publicada 32 .
Las hormonas naturales se determinan en suero mediante radioinmunoanálisis competitivo con
marcador 125 I. Los límites de detección son de 0.2 µg/L para la testosterona, 0.1 µg/L para la
progesterona y 0.02 µg/L para el 17ß-estradiol.
Para la determinación de agentes inhibidores se utiliza la técnica microbiológica de cribado de
las cuatro placas 33,34 . Esta técnica se basa en la determinación del halo de inhibición de un
cultivo bacteriano debido a la difusión de los antibióticos presentes en una muestra de tejido
animal que se pone en contacto con el agar de la placa.
El cloranfenicol en músculo se analiza por HPLC con detector visible-UV, previa extracción con
acetato de etilo y purificación en fase sólida-sílice, siguiendo el método recomendado por el
CNA 35 . El límite de detección es de 10 µg/kg, partiendo de 10 g de muestra. La recuperación
estimada sobre muestras enriquecidas al nivel del límite de cuantificación (20 µg/kg) es superior
al 73%, con un coeficiente de variación inferior al 10%.
Durante 1992 y 1993 la determinación de sulfamidas en tejidos animales se realizó por HPLC
con detector de diodos, siguiendo el método de extracción recomendado por el CNA 36 . En 1994
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se desarrolló un nuevo método de extracción por dispersión de matriz en fase sólida (MSPD) 37
que permite la determinación simultánea de sulfamidas (14 sustancias) y cloranfenicol, con un
límite de determinación de 50 µg/kg. Una descripción detallada del método ha sido previamente
publicada 38 .
El clenbuterol se analiza en orina por HPTLC, siguiendo el método recomendado por el CNA 39 .
La cuantificación se lleva a cabo por densitometría. El límite de detección es de 1 µg/L,
partiendo de 10 ml de orina. Cuando el número de muestras es grande, se realiza una criba
previa mediante enzimoinmunoanálisis. Para el análisis de clenbuterol en hígado se realiza una
extracción con tampón acetato pH 4.8. Posteriormente se alcaliniza el extracto y se purifica
mediante fase sólida C18. La determinación se lleva a cabo por HPTLC como en el caso del
análisis en orina. El límite de detección es 1 µg/kg cuando se parte de 5 g de muestra. La
determinación de clenbuterol en retina se realiza en los mataderos con un método de criba
mediante enzimoinmunoanálisis de lectura visual. Las muestras positivas se analizan en el
laboratorio por HPTLC, siguiendo el método de análisis de clenbuterol en hígado, simplificando
algunos de los pasos de la purificación.
El clenproperol se analiza en orina con la misma técnica que el clenbuterol. El límite de
detección es de 1µg/L. La técnica multiresiduo para el análisis de ß-agonistas en orina
(mabuterol, cimaterol, salbutamol, terbutalina, clenproperol y clenbuterol) se realiza por GC-
MS. Previamente la muestra de orina se somete a una hidrólisis enzimática, se purifica en
columna (Bond Elut Certify R ) y se derivatiza para transformar los ß-agonistas en
trimetilsililderivados. El desarrollo del método se verifica con la adición de estándares internos
deuterados. Los límites de detección son de 2 µg/L para mabuterol, salbutamol, terbutalina y
clenbuterol, 1.5 µg/L para clenproperol y 4 µg/L para el cimaterol.
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Métodos Analíticos
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