La Proteómica, un reto constante en Biomedicina - Encuentros ...
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LA PROTEÓMICA, UN RETO CONSTANTE EN BIOMEDICINA<br />
Mª Luisa Hernáez Sánchez<br />
Responsable Técnico Unidad de Proteómica UCM-PCM<br />
Concha Gil García<br />
Catedrática de la UCM. Responsable Ci<strong>en</strong>tífico Unidad de Proteómica UCM-PCM<br />
PRESENTACIÓN<br />
<strong>La</strong> Unidad de Proteómica es <strong>un</strong>a Unidad de Desarrollo Tecnológico (UDT) de la F<strong>un</strong>dación<br />
Parque Ci<strong>en</strong>tífico de Madrid ubicada <strong>en</strong> la Facultad de Farmacia de la Universidad Complut<strong>en</strong>se de<br />
Madrid (UCM). Esta Unidad se creó <strong>en</strong> el año 2001 como <strong>un</strong>a ampliación del C<strong>en</strong>tro de Asist<strong>en</strong>cia a la<br />
Investigación de Secu<strong>en</strong>ciación de DNA, dando orig<strong>en</strong> al C<strong>en</strong>tro de G<strong>en</strong>ómica y Proteómica de la<br />
UCM. A finales de los años nov<strong>en</strong>ta nuestro grupo de investigación estaba participando <strong>en</strong> el Proyecto<br />
EUROFAN (Análisis f<strong>un</strong>cional del g<strong>en</strong>oma de la levadura). Uno de cuyos objetivos era la<br />
id<strong>en</strong>tificación de proteínas requeridas <strong>en</strong> la biogénesis de la pared celular. Dadas las características de<br />
nuestra muestra los procedimi<strong>en</strong>tos de id<strong>en</strong>tificación de proteínas disponibles (inm<strong>un</strong>odetección y<br />
secu<strong>en</strong>ciación amino terminal) no resultaban adecuados.<br />
Fue <strong>en</strong>tonces cuando alg<strong>un</strong>os grupos europeos estaban desarrollando otras estrategias para<br />
id<strong>en</strong>tificar proteínas basadas <strong>en</strong> la digestión <strong>en</strong>zimática o química de las proteínas y <strong>en</strong> el análisis de<br />
los péptidos mediante espectrometría de masas (MS). Utilizando dicha metodología <strong>en</strong> colaboración<br />
con el Dr. Blackstock (Glaxo-Wellcome) pudimos llevar a cabo nuestro objetivo, además de<br />
introducirnos <strong>en</strong> este apasionante campo de la proteómica. Por este motivo impulsamos la creación de<br />
la primera Unidad de Proteómica <strong>en</strong> <strong>un</strong>a <strong>un</strong>iversidad española para dar apoyo a los investigadores <strong>en</strong><br />
sus proyectos de Proteómica.<br />
Para ello se precisó de de equipami<strong>en</strong>tos tecnológicos de alto coste que fueron financiados por<br />
el Ministerio de Ci<strong>en</strong>cia y tecnología (Fondos FEDER y financiación para Parques Ci<strong>en</strong>tíficos) y de<br />
personal técnico cualificado (financiado por la UCM y el PCM). Este C<strong>en</strong>tro ha contado desde el<br />
principio con <strong>un</strong> importante apoyo de la Cátedra de G<strong>en</strong>ómica y Proteómica UCM-Merck-Sharp &<br />
Dohme, cuyo director es el Prof. César Nombela, y cuya misión es la de promocionar la doc<strong>en</strong>cia y la<br />
investigación <strong>en</strong> G<strong>en</strong>ómica y Proteómica <strong>en</strong> la UCM.<br />
Durante el año 2002, los servicios que desarrolla la Unidad de Proteómica de la UCM quedaron<br />
integrados d<strong>en</strong>tro del Parque Ci<strong>en</strong>tífico de Madrid. En el año 2005 se crea el Instituto Nacional de<br />
Proteómica, ProteoRed, que es <strong>un</strong>a plataforma de servicios proteómicos financiada por la F<strong>un</strong>dación<br />
G<strong>en</strong>oma España (2005-2010) y desde el año 2010 por el Instituto de Salud Carlos III. <strong>La</strong> red de<br />
Proteómica cu<strong>en</strong>ta con seis nodos geográficos, <strong>un</strong>o de ellos con sede <strong>en</strong> Madrid, de la que es miembro<br />
la Unidad de Proteómica UCM-PCM. El objetivo principal de ProteoRed es coordinar y desarrollar<br />
Servicios ya exist<strong>en</strong>tes, ofreci<strong>en</strong>do esta plataforma a los grupos de investigación españoles y<br />
fom<strong>en</strong>tando el desarrollo de nuevas aplicaciones tecnológicas y la estandarización y perfeccionami<strong>en</strong>to<br />
de las técnicas exist<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> los 21 laboratorios que integran este proyecto.<br />
<strong>La</strong>s principales f<strong>un</strong>ciones son: la implem<strong>en</strong>tación tecnológica, las recom<strong>en</strong>daciones sobre el<br />
manejo y almac<strong>en</strong>ami<strong>en</strong>to de muestras, la promoción de experim<strong>en</strong>tos multic<strong>en</strong>tro, el soporte<br />
bioinformático, el establecimi<strong>en</strong>to de los precios y la organización f<strong>un</strong>cional, la promoción y difusión<br />
de las técnicas de proteómica <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral mediante cursos y seminarios, la internacionalización y<br />
conexión con plataformas europeas y, finalm<strong>en</strong>te, la evaluación de las nuevas técnicas biomédicas.<br />
<strong>La</strong> Unidad de Proteómica UCM-PCM ti<strong>en</strong>e como objetivo principal fom<strong>en</strong>tar la investigación<br />
ci<strong>en</strong>tífica y el desarrollo tecnológico <strong>en</strong> el área de la Proteómica, ofreci<strong>en</strong>do a los grupos de<br />
1
investigación, hospitales y empresas difer<strong>en</strong>tes servicios de proteómica, asesorami<strong>en</strong>to <strong>en</strong> sus<br />
proyectos, así como seminarios y cursos de formación. El personal de la Unidad de Proteómica ti<strong>en</strong>e<br />
como objetivos f<strong>un</strong>dam<strong>en</strong>tales: dar servicio de proteómica a la com<strong>un</strong>idad ci<strong>en</strong>tífica y desarrollar y<br />
poner a p<strong>un</strong>to nuevas metodologías que se están desarrollando <strong>en</strong> dicho campo. Además participa <strong>en</strong><br />
cursos de técnicas proteómicas organizados por difer<strong>en</strong>tes instituciones. Por supuesto, el personal de la<br />
Unidad está implicado activam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los difer<strong>en</strong>tes grupos de trabajo de ProteoRed, además son<br />
miembros f<strong>un</strong>dadores de la SeProt, <strong>un</strong>a asociación de carácter multidisciplinar, cuyo objetivo es<br />
impulsar el desarrollo de la Proteómica <strong>en</strong> España y han formado parte del Comité organizador del IV<br />
Congresos de Proteómica (New Tr<strong>en</strong>ds in Proteomics, Segovia, 2011). Además la directora ci<strong>en</strong>tífica<br />
forma parte del Comité directivo de la EuPA (European Proteomics Association), ha coordinado el<br />
Comité de Educación y actualm<strong>en</strong>te coordina el Comité de Congresos y Com<strong>un</strong>icación.<br />
¿QUÉ ES LA PROTEÓMICA?<br />
El término “proteoma” fue utilizado por primera vez <strong>en</strong> 1995 por Mark Wilkins, <strong>un</strong> ci<strong>en</strong>tífico<br />
Australiano, para describir el conj<strong>un</strong>to de PROTEínas expresadas por <strong>un</strong> g<strong>en</strong>OMA, <strong>un</strong>a célula o <strong>un</strong><br />
tejido. Así, surgió la disciplina d<strong>en</strong>ominada Proteómica, que consiste <strong>en</strong> el estudio a gran escala del<br />
proteoma con el fin de obt<strong>en</strong>er <strong>un</strong>a visión global e integrada de los procesos celulares.<br />
<strong>La</strong> proteómica proporciona <strong>un</strong> conj<strong>un</strong>to de herrami<strong>en</strong>tas muy poderosas para el estudio a gran<br />
escala de la f<strong>un</strong>ción de las proteínas, de su estructura, localización, modificaciones postraduccionales e<br />
interacciones. Hubo dos factores decisivos para el desarrollo de la proteómica:<br />
1. Por <strong>un</strong> lado la secu<strong>en</strong>ciación de los g<strong>en</strong>omas a gran escala (se conoce la secu<strong>en</strong>cia de los<br />
g<strong>en</strong>es pero no su f<strong>un</strong>ción) y su anotación <strong>en</strong> las bases de datos de secu<strong>en</strong>cias de proteínas.<br />
2. Y por otro lado, el desarrollo de técnicas de separación y análisis de proteínas<br />
(Electroforesis Bidim<strong>en</strong>sional y Espectrometría de Masas que más adelante se detallarán.<br />
<strong>La</strong> secu<strong>en</strong>ciación del g<strong>en</strong>oma humano ha permitido conocer el número de g<strong>en</strong>es que poseemos<br />
y que dicho número no es muy difer<strong>en</strong>te al de otros organismos. <strong>La</strong> complejidad de los organismos<br />
parece radicar <strong>en</strong> las proteínas, ya que la información que está cont<strong>en</strong>ida <strong>en</strong> los g<strong>en</strong>es se traduce <strong>en</strong><br />
proteínas, que son las que llevan a cabo las f<strong>un</strong>ciones del organismo. A difer<strong>en</strong>cia del g<strong>en</strong>oma, que es<br />
más o m<strong>en</strong>os <strong>constante</strong>, el proteoma es altam<strong>en</strong>te dinámico, ya que <strong>en</strong> distintos tipos de células se<br />
expresan g<strong>en</strong>es difer<strong>en</strong>tes y además las proteínas varían dep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do de las condiciones del <strong>en</strong>torno<br />
donde se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tr<strong>en</strong>, de determinadas señales bioquímicas, del estado fisiológico de las células, por lo<br />
que <strong>en</strong> cada mom<strong>en</strong>to y para cada tipo de célula, el proteoma será difer<strong>en</strong>te.<br />
Además, la complejidad del estudio del proteoma reside <strong>en</strong> que <strong>un</strong> g<strong>en</strong> puede dar lugar a<br />
difer<strong>en</strong>tes formas proteicas (“splicing” o procesami<strong>en</strong>to alternativo). Además las proteínas van a sufrir<br />
difer<strong>en</strong>tes modificaciones post-traduccionales, existi<strong>en</strong>do más de 200 (fosforilación, acetilación,<br />
glicosilación, desaminación, miristoilación…). Ambas fu<strong>en</strong>tes de complejidad increm<strong>en</strong>tan<br />
sustancialm<strong>en</strong>te el número de proteínas difer<strong>en</strong>tes que pued<strong>en</strong> existir: se estima que a partir de los<br />
20.000 g<strong>en</strong>es que codifican proteínas <strong>en</strong> el g<strong>en</strong>oma humano, podrían g<strong>en</strong>erarse <strong>un</strong> número de proteínas<br />
difer<strong>en</strong>tes que oscilaría <strong>en</strong>tre 500.000-1.000.000.<br />
Así la era post-g<strong>en</strong>ómica ha dado lugar al desarrollo de la Proteómica, que alg<strong>un</strong>os<br />
investigadores la incluy<strong>en</strong> d<strong>en</strong>tro de la g<strong>en</strong>ómica f<strong>un</strong>cional j<strong>un</strong>to con otras disciplinas “ómicas” como<br />
la transcriptómica y la metabolómica.<br />
2
METODOLOGÍAS PROTEÓMICAS<br />
<strong>La</strong> proteómica surgió como consecu<strong>en</strong>cia de los avances <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes técnicas de separación<br />
de proteínas, principalm<strong>en</strong>te de las basadas <strong>en</strong> gel y por la aplicación de la espectrometría de masas a<br />
la caracterización de las proteínas.<br />
Vamos a com<strong>en</strong>tar brevem<strong>en</strong>te las técnicas proteómicas mas usadas.<br />
<strong>La</strong> tecnología más utilizada para la separación de proteínas es la electroforesis <strong>en</strong> geles de<br />
poliacrilamida. Para muchas aplicaciones proteómicas, la electroforesis <strong>en</strong> <strong>un</strong>a dim<strong>en</strong>sión es el método<br />
de elección. <strong>La</strong>s proteínas se separan de acuerdo a su masa y las proteínas son solubilizadas <strong>en</strong> dodecil<br />
sulfato sódico (SDS). Es <strong>un</strong>a técnica s<strong>en</strong>cilla, reproducible y permite la separación de proteínas de 10-<br />
300 kDa. Una de las aplicaciones más com<strong>un</strong>es de la 1-DE es la caracterización de proteínas después<br />
de realizar algún tipo de purificación previa.<br />
Uno de los pilares de la proteómica fue el desarrollo de la electroforesis bidim<strong>en</strong>sional 2D-<br />
PAGE, que permite separar hasta miles de proteínas <strong>en</strong> <strong>un</strong> sólo experim<strong>en</strong>to, y está basada <strong>en</strong> <strong>un</strong>a<br />
separación de las proteínas <strong>en</strong> f<strong>un</strong>ción de la carga, seguida de <strong>un</strong>a separación de las proteínas <strong>en</strong><br />
f<strong>un</strong>ción de su masa molecular. <strong>La</strong> separación de la primera dim<strong>en</strong>sión se realiza mediante<br />
isoelectro<strong>en</strong>foque, durante el cual las proteínas son separadas <strong>en</strong> <strong>un</strong> gradi<strong>en</strong>te de pH hasta alcanzar <strong>un</strong>a<br />
posición <strong>en</strong> la que su carga neta es cero, es decir, su p<strong>un</strong>to isoeléctrico. En <strong>un</strong>a seg<strong>un</strong>da dim<strong>en</strong>sión, las<br />
proteínas son separadas mediante electroforesis <strong>en</strong> pres<strong>en</strong>cia de SDS. <strong>La</strong> alta resolución de la técnica<br />
se debe a que las dos separaciones se basan <strong>en</strong> parámetros indep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes. En cuanto a la detección de<br />
las proteínas, tradicionalm<strong>en</strong>te se ha v<strong>en</strong>ido empleando la tinción con azul de Coomassie, o con plata,<br />
o tinciones fluoresc<strong>en</strong>tes para conseguir mayor s<strong>en</strong>sibilidad.<br />
<strong>La</strong> principal herrami<strong>en</strong>ta de la investigación proteómica es la Espectrometría de Masas (EM),<br />
<strong>un</strong>a técnica analítica que mide la relación masa/carga de <strong>un</strong>a molécula ioniazada. A finales de los años<br />
och<strong>en</strong>ta, los ci<strong>en</strong>tíficos Tanaka y J. F<strong>en</strong>n desarrollaron dos nuevos métodos de ionización suave de<br />
macromoléculas, MALDI, del inglés Matrix Asisted <strong>La</strong>ser Desorption Ionization y ESI del inglés<br />
electroespray ionization. El método de ionización por electrospray permite la ionización de moléculas<br />
a partir de <strong>un</strong>a solución acuosa, al hacerla pasar por <strong>un</strong> capilar metálico bajo la aplicación de alto<br />
voltaje, mi<strong>en</strong>tras que la ionización por MALDI produce iones mediante pulsos de láser aplicados a<br />
muestras <strong>en</strong> estado sólido embebidas <strong>en</strong> matrices cristalizables.<br />
Estas metodologías solucionaron la dificultad de g<strong>en</strong>erar iones a partir de macromoléculas<br />
polares y no volátiles, como las proteínas y péptidos, sin que se fragm<strong>en</strong>taran. Desde <strong>en</strong>tonces, la EM<br />
es la técnica de elección para la id<strong>en</strong>tificación de proteínas, debido a su s<strong>en</strong>sibilidad (pmol-fmol),<br />
exactitud (100-5ppm) y rapidez (minutos-seg<strong>un</strong>dos), variando de acuerdo con la complejidad del<br />
análisis y el equipo utilizado. Los espectrómetros de masas constan de tres compon<strong>en</strong>tes<br />
f<strong>un</strong>dam<strong>en</strong>tales: la fu<strong>en</strong>te de ionización, el analizador y el detector. De la combinación de estos<br />
elem<strong>en</strong>tos dep<strong>en</strong>d<strong>en</strong> los difer<strong>en</strong>tes tipos de espectrómetros de masas y sus aplicaciones.<br />
El analizador de masas sirve para separar y analizar los iones según su masa/carga, que se han<br />
formado <strong>en</strong> la fu<strong>en</strong>te de ionización. Hay difer<strong>en</strong>tes tipos de analizadores, TOF (Tiempo de vuelo, <strong>en</strong><br />
inglés, Time of Flight), cuadrupolo y trampa de iones, que van desde el más s<strong>en</strong>cillo, compuesto por<br />
fu<strong>en</strong>te de iones tipo MALDI y analizador tipo tiempo de vuelo, MALDI-TOF, hasta los espectrómetros<br />
de masas <strong>en</strong> tandem, donde se combinan varios analizadores <strong>en</strong> el espacio (TOF/TOF, triple<br />
cuadrupolo, cuadrupolo-TOF), o <strong>en</strong> el tiempo como la trampa de iones.<br />
En la id<strong>en</strong>tificación de proteínas exist<strong>en</strong> dos flujos de trabajo indep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes:<br />
a) Basado <strong>en</strong> gel.<br />
3
) En solución o libre de gel.<br />
a) El más clásico, común y s<strong>en</strong>cillo es el basado <strong>en</strong> gel, o proced<strong>en</strong>te de la escuela europea.<br />
Consiste <strong>en</strong> recortar las manchas de proteínas directam<strong>en</strong>te del gel bidim<strong>en</strong>sional donde han sido<br />
aisladas, y se digier<strong>en</strong> con <strong>un</strong>a proteasa, g<strong>en</strong>eral<strong>en</strong>te tripsina, que produce <strong>un</strong> conj<strong>un</strong>to de péptidos.<br />
Estos péptidos se analizan mediante espectrometría de masas tipo MALDI-TOF, y se obti<strong>en</strong>e el<br />
espectro de masas del conj<strong>un</strong>to de péptidos, también d<strong>en</strong>ominado “huella peptídica”. <strong>La</strong>s huellas<br />
peptídicas son características y específicas de cada <strong>un</strong>a de las proteínas, y permit<strong>en</strong> id<strong>en</strong>tificarlas <strong>un</strong>a a<br />
<strong>un</strong>a las proteínas por comparación de la huella peptídica experim<strong>en</strong>tal con las huellas peptídicas<br />
teóricas que hay <strong>en</strong> las bases de datos de proteínas, mediante técnicas bioinformáticas, siempre y<br />
cuando la secu<strong>en</strong>cia de la proteína esté depositada <strong>en</strong> <strong>un</strong>a base de datos de acceso público.<br />
Dado que el criterio más determinante para la id<strong>en</strong>tificación de <strong>un</strong>a proteína es su secu<strong>en</strong>cia<br />
aminoacídica, y debido a que a veces las proteínas no están anotadas <strong>en</strong> las bases de datos, <strong>en</strong> muchas<br />
ocasiones se recurre a la obt<strong>en</strong>ción de espectros de fragm<strong>en</strong>tación (MS/MS). Consiste <strong>en</strong> seleccionar<br />
<strong>un</strong> ión peptídico <strong>en</strong> <strong>un</strong> primer analizador, se fragm<strong>en</strong>ta mediante colisión y <strong>en</strong> <strong>un</strong> seg<strong>un</strong>do analizador<br />
se separan las masas de los fragm<strong>en</strong>tos derivados del péptido. De la misma manera, que la huella<br />
peptídica, los espectros MS/MS son también característicos de cada <strong>un</strong>o de los péptidos, y permit<strong>en</strong> su<br />
id<strong>en</strong>tificación inequívoca, buscando y comparando <strong>en</strong> las bases de datos. Un estudio <strong>en</strong> detalle de los<br />
espectros MS/MS nos permit<strong>en</strong> determinar sitios de modificaciones post-traduccionales, e incluso<br />
id<strong>en</strong>tificar proteínas de organismos cuyo g<strong>en</strong>oma es aún desconocido, elucidando su secu<strong>en</strong>cia de<br />
aminoácidos (secu<strong>en</strong>ciación de novo).<br />
b) El flujo de trabajo, libre de gel, o proced<strong>en</strong>te de la escuela americana, se basa <strong>en</strong> el análisis<br />
de <strong>un</strong>a mezcla de proteínas más o m<strong>en</strong>os compleja, mediante la digestión con tripsina <strong>en</strong> solución del<br />
conj<strong>un</strong>to de proteínas. Los péptidos resultantes se separan mediante cromatografía de fase reversa<br />
según la hidrofobicidad y/o por cromatografía de intercambio iónico, según la carga de la molécula.<br />
Los péptidos así separados pued<strong>en</strong> ser analizados directam<strong>en</strong>te mediante espectrometría de masas <strong>en</strong><br />
tandem, <strong>en</strong> tiempo real.<br />
En los estudios de proteómica cuantitativa, se pued<strong>en</strong> comparar la expresión de proteínas de<br />
varias muestras de tejido, cultivo, etc., para detectar variaciones <strong>en</strong> el nivel de expresión de cada <strong>un</strong>a<br />
de las proteínas de las difer<strong>en</strong>tes condiciones y su posterior id<strong>en</strong>tificación.<br />
<strong>La</strong> aproximación de proteómica cuantitativa <strong>en</strong> gel se realiza mediante la tecnología DIGE<br />
(Differ<strong>en</strong>ce Gel Electrophoresis) que se basa <strong>en</strong> el marcaje de tres muestras a comparar con tres<br />
fluorocromos difer<strong>en</strong>tes y analizarlos <strong>en</strong> <strong>un</strong> mismo gel bidm<strong>en</strong>sional para disminuir las variaciones<br />
técnicas.<br />
En las aproximaciones de proteómica cuantitativa libre de gel, las muestras a comparar se<br />
pued<strong>en</strong> marcar difer<strong>en</strong>cialm<strong>en</strong>te con marcaje metabólico de los cultivos, SILAC (Stabe Isotpe <strong>La</strong>bel<br />
Aminoacids), o mediante marcaje isobárico difer<strong>en</strong>cial de los péptidos de la digestión de <strong>un</strong>a mezcla<br />
de proteínas con <strong>un</strong> reactivo químico (iTRAQ).<br />
El análisis y la interpretación de los datos obt<strong>en</strong>idos con las técnicas de proteómica descritas<br />
anteriorm<strong>en</strong>te, especialm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los experim<strong>en</strong>tos a gran escala, se necesitan herrami<strong>en</strong>tas<br />
bioinformáticas y han sido y son es<strong>en</strong>ciales para el desarrollo y auge de la proteómica.<br />
Como hemos com<strong>en</strong>tado, no existe <strong>un</strong> diagrama de flujo único para el análisis proteómico, por<br />
lo que queda a criterio del investigador la elección de la aproximación y el conj<strong>un</strong>to de técnicas más<br />
adecuado para abordar sus estudios.<br />
4
APROXIMACIONES DE LA PROTEÓMICA<br />
<strong>La</strong> Proteómica, sin embargo, va más allá de la mera id<strong>en</strong>tificación de las proteínas. Con los<br />
experim<strong>en</strong>tos de Proteómica se pued<strong>en</strong> abordar difer<strong>en</strong>tes estudios proteómicas como se indican a<br />
continuación:<br />
A) Id<strong>en</strong>tificación de las proteínas que compon<strong>en</strong> <strong>un</strong> proteoma de forma masiva para obt<strong>en</strong>er<br />
<strong>un</strong>a visión global e integrada del proteoma, así como la realización de mapas de refer<strong>en</strong>cia.<br />
B) Realización de estudios de proteómica cuantitativa. Consist<strong>en</strong> <strong>en</strong> comparar la ab<strong>un</strong>dancia<br />
relativa de las proteínas <strong>en</strong>tre difer<strong>en</strong>tes muestras Por ejemplo, se pued<strong>en</strong> comparar<br />
proteomas expuestos a diversos ag<strong>en</strong>tes externos (tratado y sin tratar con <strong>un</strong>a determinada<br />
droga), <strong>en</strong> determinadas condiciones fisiológicas (ej. expuestos a difer<strong>en</strong>tes tipos de estrés),<br />
o patológicas (<strong>un</strong> tejido sano y <strong>un</strong>o <strong>en</strong>fermo), etc. De esta manera se pued<strong>en</strong> id<strong>en</strong>tificar<br />
proteínas de expresión difer<strong>en</strong>cial y elucidar qué procesos biológicos están implicados.<br />
C) Estudios de la interacción de proteínas con otras proteínas o moléculas con el fin de<br />
determinar su f<strong>un</strong>ción, ya que las proteínas no actúan de forma aislada sino formando<br />
complejos macromoleculares y redes f<strong>un</strong>cionales.<br />
D) Estudio de las modificaciones postraduccionales que sufr<strong>en</strong> las proteínas, como la<br />
fosforilación (fosfoproteómica), glicosilación (glicoproteómica), etc. Dichas<br />
modificaciones sirv<strong>en</strong> para modular la actividad y/o localización de <strong>un</strong>a proteína.<br />
E) Diseño de estudios de proteómica dirigida (“targeted proteomics”) para id<strong>en</strong>tificar y<br />
cuantificar <strong>un</strong>a proteína de interés <strong>en</strong> muestras biológicas complejas.<br />
APLICACIONES DE LA PROTEÓMICA<br />
El desarrollo de la Proteómica ha despertado grandes expectativas <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes áreas, como <strong>en</strong><br />
biotecnología, industria agroalim<strong>en</strong>taria y especialm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> biomedicina. <strong>La</strong> id<strong>en</strong>tificación de las<br />
proteínas que intervi<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> las difer<strong>en</strong>tes etapas de la <strong>en</strong>fermedad ayudará a compr<strong>en</strong>der las bases<br />
moleculares de dichas patologías, y así estas proteínas id<strong>en</strong>tificadas y cuantificadas se podrán utilizar<br />
como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico de la <strong>en</strong>fermedad y nuevas dianas terapéuticas.<br />
Los biomarcadores son moléculas que sirv<strong>en</strong> como indicadores del estado fisiológico o<br />
patológico de las células o tejidos objeto de estudio y cuyos requisitos f<strong>un</strong>dam<strong>en</strong>tales que deb<strong>en</strong><br />
cumplir son <strong>un</strong>a elevada especificidad y s<strong>en</strong>sibilidad.<br />
El desarrollo de la proteómica ha abierto grandes expectativas para la id<strong>en</strong>tificación de<br />
biomarcadores, ya que la espectrometría de masas permite id<strong>en</strong>tificar proteínas <strong>en</strong> muy baja<br />
conc<strong>en</strong>tración y puede realizarse <strong>un</strong> análisis sistemático de ci<strong>en</strong>tos o miles de proteínas <strong>en</strong> <strong>un</strong>a muestra<br />
clínica. Sin embargo, debido a la complejidad de estas muestras, que consist<strong>en</strong> <strong>en</strong> fluidos biológicos<br />
humanos (sangre, plasma y suero, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, cristalino, etc.) que son la<br />
principal fu<strong>en</strong>te de biomarcadores y a la baja conc<strong>en</strong>tración de proteínas que pued<strong>en</strong> actuar como<br />
biomarcadores (ng/ml), se deb<strong>en</strong> t<strong>en</strong>er <strong>en</strong> cu<strong>en</strong>ta alg<strong>un</strong>as consideraciones <strong>en</strong> la puesta a p<strong>un</strong>to de la<br />
preparación de la muestra.<br />
Desde el p<strong>un</strong>to de vista metodológico el problema a resolver consiste <strong>en</strong> que <strong>en</strong> los tejidos y<br />
especialm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> el suero, las proteínas poco ab<strong>un</strong>dantes, que son las más significativas, se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran<br />
<strong>en</strong>mascaradas por <strong>un</strong>as pocas (pocos ci<strong>en</strong>tos) proteínas muy ab<strong>un</strong>dantes, por lo que es necesario <strong>un</strong><br />
primer prefraccionami<strong>en</strong>to, depleción de las proteínas más ab<strong>un</strong>dantes, cuantificación de las proteínas,<br />
con la finalidad de que los resultados sean comparables y reproducibles. Además, este tipo de muestra<br />
<strong>en</strong> alg<strong>un</strong>os casos es de difícil recolección y son muestras escasas y muy valiosas ya que proced<strong>en</strong> de<br />
paci<strong>en</strong>tes o biobancos bi<strong>en</strong> caracterizados.<br />
5
En g<strong>en</strong>eral, las <strong>en</strong>fermedades no se deb<strong>en</strong> a alteraciones de <strong>un</strong>a única proteína, sino de muchas<br />
proteínas y a la variación <strong>en</strong> su ab<strong>un</strong>dancia. Por estos motivos la proteómica aplicada a la biomedicina<br />
no sólo consiste <strong>en</strong> la id<strong>en</strong>tificación del mayor número posible de proteínas <strong>en</strong> <strong>un</strong>a muestra, sino<br />
estudios de proteómica cuantitativa de las proteínas <strong>en</strong>tre muestras clínicas difer<strong>en</strong>tes. Estos estudios<br />
son complejos y necesitan de <strong>un</strong>a posterior validación, ya que las <strong>en</strong>fermedades suel<strong>en</strong> t<strong>en</strong>er <strong>un</strong>a<br />
naturaleza multifactorial, y por tanto no se trataría de <strong>un</strong> único biomarcador, sino de <strong>un</strong> conj<strong>un</strong>to de<br />
marcadores.<br />
Participación de la Unidad <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes Proyectos<br />
A continuación se <strong>en</strong>umeran alg<strong>un</strong>as áreas <strong>en</strong> las que la proteómica ti<strong>en</strong>e grandes impactos y <strong>en</strong><br />
los proyectos <strong>en</strong> los que participa la Unidad de Proteómica, dando apoyo tanto técnico como de<br />
asesoría ci<strong>en</strong>tífica a los investigadores:<br />
Estudio de nuevos biomarcadores de diagnóstico y pronóstico <strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes <strong>en</strong>fermedades:<br />
cardiovasculares, artritis reumatoide, cáncer y obesidad.<br />
Estudio de nuevos biomarcadores de diagnóstico y pronóstico <strong>en</strong> <strong>en</strong>fermedades metabólicas y<br />
autoinm<strong>un</strong>es.<br />
Id<strong>en</strong>tificación de nuevos alérg<strong>en</strong>os y proteínas candidatas para el desarrollo de vac<strong>un</strong>as.<br />
Id<strong>en</strong>tificación de antíg<strong>en</strong>os útiles para el diagnóstico y prev<strong>en</strong>ción de <strong>en</strong>fermedades<br />
infecciosas y búsqueda de dianas para el desarrollo de nuevos antifúngicos y otros fármacos.<br />
Estudios de proteómica aplicados a neurología y psiquiatría, autismo, y alzhéimer.<br />
Estudios difer<strong>en</strong>ciales de familias y especies de animales.<br />
Mejora de plantas y alim<strong>en</strong>tos.<br />
<strong>La</strong> Unidad de Proteómica ha prestado servicio a más de 250 investigadores, tanto del ámbito<br />
público como privado, <strong>en</strong> las áreas anteriorm<strong>en</strong>te descritas.<br />
FUTURO DE LA PROTEÓMICA<br />
En la X Confer<strong>en</strong>cia Anual de la Organización del Proteoma Humano (HUPO, <strong>en</strong> sus siglas <strong>en</strong><br />
inglés), celebrada <strong>en</strong> Sydney <strong>en</strong> septiembre de 2010, se lanzó el Proyecto Proteoma Humano (HPP). El<br />
objetivo del proyecto es la caracterización de las proteínas codificadas por los 21.000 g<strong>en</strong>es que<br />
constituy<strong>en</strong> el g<strong>en</strong>oma humano. Este estudio g<strong>en</strong>erará <strong>un</strong> mapa de proteínas y ayudará a elucidar las<br />
f<strong>un</strong>ciones moleculares y biológicas y supondrá <strong>un</strong> avance <strong>en</strong> el diagnóstico y tratami<strong>en</strong>to de las<br />
<strong>en</strong>fermedades. Este avance ci<strong>en</strong>tífico, comparable <strong>en</strong> su mom<strong>en</strong>to a la investigación sobre el g<strong>en</strong>oma,<br />
permitirá a los ci<strong>en</strong>tíficos descubrir y analizar cualquier proteína humana <strong>en</strong> cualquier muestra<br />
biológica.<br />
Para llevar a cabo la organización del trabajo, la tarea se ha segm<strong>en</strong>tado por cromosomas, de<br />
forma que cada grupo de países se c<strong>en</strong>tra <strong>en</strong> las proteínas codificadas por todos los g<strong>en</strong>es agrupados <strong>en</strong><br />
difer<strong>en</strong>tes cromosomas. Los grupos españoles, incluida la Unidad de Proteómica UCM-PCM,<br />
estudiarán, j<strong>un</strong>to con equipos suecos y noruegos, las proteínas del cromosoma 19, al que están ligadas<br />
<strong>en</strong>fermedades como el Alzheimer, el cáncer de ovario, de páncreas, de mama, de pulmón, los gliomas<br />
o la leucemia, <strong>en</strong>tre otras múltiples patologías. Además todos los conocimi<strong>en</strong>tos adquiridos durante los<br />
últimos años se integrarán <strong>en</strong> el desarrollo del Proyecto HPP. El trabajo es de gran magnitud y será<br />
necesario <strong>un</strong> <strong>en</strong>orme desarrollo tecnológico para llevarlo a cabo.<br />
Respecto al futuro, <strong>un</strong>a vez que conozcamos todas las proteínas humanas, podremos definir<br />
cuáles de ellas se alteran y participan <strong>en</strong> el desarrollo de <strong>un</strong>a <strong>en</strong>fermedad. Esto significa que, <strong>en</strong> <strong>un</strong>os<br />
años, se podrán definir biomarcadores de utilidad para conocer quién padece <strong>un</strong>a <strong>en</strong>fermedad<br />
(diagnóstico precoz), cómo será su pronóstico y si responderá o no a <strong>un</strong> tratami<strong>en</strong>to determinado para<br />
elegir el tratami<strong>en</strong>to más adecuado <strong>en</strong> cada caso. En este s<strong>en</strong>tido, la proteómica repres<strong>en</strong>ta <strong>un</strong> paso más<br />
6
<strong>en</strong> los estudios dirigidos a la medicina individualizada o personalizada, <strong>en</strong> la que se ti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>en</strong> cu<strong>en</strong>ta<br />
las respuestas de cada paci<strong>en</strong>te ante distintas terapias.<br />
ENLACES DE INTERÉS<br />
Página de la F<strong>un</strong>dación Parque Ci<strong>en</strong>tífico de Madrid-Unidad de Proteómica:<br />
http://www.fpcm.es/srvAProteomica.htm<br />
Página de la Universidad Complut<strong>en</strong>se de Madrid-Unidad de Proteómica:<br />
http://www.ucm.es/info/gyp/proteomica/<br />
Página de la Sociedad Española de Proteómica: http://www.fpcm.es/srvAProteomica.htm<br />
Página de la Plataforma <strong>en</strong> Red de Proteómica (ProteoRed): http://www.proteored.org/<br />
Página de la Asociación Europea de Proteómica (EuPA): http://www.eupa.org/<br />
Página de acceso a la información del Proyecto del Proteoma Humano(HPP):<br />
http://www.hupo.org/research/hpp/<br />
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