Mitocondria

Proteoma mitocondrial de
Saccharomyces cerevisiae

PNAS, 23: 13207-13212 (2003)

Mitocondria
• Orgánulos celulares presentes en casi todas las células
eucariotas.
• La mitocondria desempeña un papel principal en múltiples
funciones celulares:
• Bioenergética
• Apoptosis
• Metabolismo de ácidos grasos, lípidos, hierro
• Muchas enfermedades se atribuyen a defectos mitocondriales.
• El conocimiento de las funciones fisiológicas de la mitocondria
es limitado, y muchas enfermedades mitocondriales no pueden
ser analizadas a nivel molecular.

Mitocondria
IM - membrana interna
IMS- espacio intermembrana
OM- membrana externa

Saccharomyces cerevisiae
• Hongo ascomiceto unicelular que se utiliza ampliamente en la
elaboración de vino, cerveza, pan y otros alimentos.
• Muchos genes humanos implicados en enfermedades tienen
homólogos en levaduras.
• Excelente accesibilidad de las levaduras al análisis genético y
bioquímico.
• Principal organismo modelo para la identificación y
caracterización de funciones proteicas y rutas celulares en
eucariotas.
• Primer genoma eucariota completamente secuenciado: 12 Mb,
organizado en 16 cromosomas.

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae
• Foury F et al., "The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.", FEBS Lett, 1998 Dec 4;440(3):325-31
• Bussey H et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XVI.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):103-5
• Jacq C et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome IV.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):75-8
• Dietrich FS et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome V.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):78-81
• Tettelin H et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):81-4
• Dujon B et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XV.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):98-102
• Churcher C et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome IX.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):84-7
• Philippsen P et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIV and its evolutionary implications.", Nature, 1997
May 29;387(6632 Suppl):93-8
• Johnston M et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):87-90
• Bowman S et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):90-3
• Goffeau A et al., "Life with 6000 genes.", Science, 1996 Oct 25;274(5287):546, 563-7
• Galibert F et al., "Complete nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome X.", EMBO J, 1996 May 1;15(9):2031-49
• Vassarotti A et al., "Structure and organization of the European Yeast Genome Sequencing Network.", J Biotechnol, 1995 Jul 31;41(2-3):131-7
• Murakami Y et al., "Analysis of the nucleotide sequence of chromosome VI from Saccharomyces cerevisiae.", Nat Genet, 1995 Jul;10(3):261-8
• Bussey H et al., "The nucleotide sequence of chromosome I from Saccharomyces cerevisiae.", Proc Natl Acad Sci U S A, 1995 Apr
25;92(9):3809-13
• Feldmann H et al., "Complete DNA sequence of yeast chromosome II.", EMBO J, 1994 Dec 15;13(24):5795-809
• Johnston M et al., "Complete nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VIII.", Science, 1994 Sep 30;265(5181):2077-82
• Dujon B et al., "Complete DNA sequence of yeast chromosome XI.", Nature, 1994 Jun 2;369(6479):371-8
• Oliver SG et al., "The complete DNA sequence of yeast chromosome III.", Nature, 1992 May 7;357(6373):38-46
• Hartley JL, Donelson JE, "Nucleotide sequence of the yeast plasmid.", Nature, 1980 Aug 28;286(5776):860-5

Objetivo
Identificación de proteínas mitocondriales
de S. cerevisiae
El análisis del proteoma mitocondrial proporcionará una
importante base de datos para:
• Análisis de funciones asociadas a la mitocondria
• Análisis de nuevas funciones mitocondriales
• Caracterización de enfermedades mitocondriales

Purificación de mitocondrias
• Aislamiento de mitocondrias a partir de lisados celulares de
S. cerevisiae mediante:
• Centrifugación diferencial
• Dos gradientes de sacarosa consecutivos
• Utilización de cuatro métodos de separación de proteínas en
paralelo, para minimizar el problema de que una fracción
significativa de proteínas pueda escapar a la detección:
• 1D-PAGE
• 2D-PAGE
• Digestión con 4 proteasas seguida de
cromatografía líquida multidimensional
(MDLC, multidimensional liquid cromatography)
• Generación de fracciones asociadas a mitocondrias
mediante tratamiento con sales o tripsina.

Separación de proteínas y análisis MS
• Mitocondrias purificadas:
a. 2D-PAGE y MALDI-TOF-MS o n-LC-MS/MS (nano liquid
chromatography-MS/MS).
b. Cromatografía líquida multidimensional y ESI-MS.
c. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS.
• Fracciones asociadas a mitocondrias generadas mediante
tratamiento con sales o tripsina:
a. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS.
b. 1D-HPLC y n-LC-MS/MS.
• En total, se obtuvieron de más de 20 millones de espectros de
masas que se analizaron posteriormente en las bases de datos.

Separación de proteínas y análisis MS

Separación de proteínas y análisis MS
• Busqueda automática en la base de datos completa de S. cerevisiae
utilizando el algoritmo SEQUEST.
• Identificación de un total de 750 proteínas mitocondriales diferentes
en S. cerevisiae (aprox. 90% del total): indica la implicación de la
mitocondria en múltiples procesos celulares.
• Análisis con el programa MitoProt: predicción de una presecuencia
mitocondrial clásica en 320 proteínas (43%).
• Análisis con el programa TMHMM: predicción de al menos un
segmento α-hélice transmembrana en 255 proteínas (34%).

Separación de proteínas y análisis MS

Separación de proteínas y análisis MS
• Mediante 2D-PAGE se identificaron 209 spots, que permitieron la
identificación de 109 proteínas diferentes: 13 proteínas tenían
función desconocida.
• De las 750 proteinas mitocondriales identificadas:
• 436 proteínas (58%) mitocondriales conocidas
• 208 proteínas de función desconocida
• 106 proteínas previamente descritas como localizadas en
otros compartimentos celulares.
• Se ha descrito una localización doble (mitocondria y otro
compartimento celular) para al menos 30 proteínas mitocondriales
conocidas.

Cobertura del proteoma
• Identificación de todas las subunidades conocidas del complejo
piruvato deshidrogenasa.
• Identificación de los complejos de la membrana interna de la
maquinaria de fosforilación oxidativa.
• El estudio no está sesgado hacia proteínas de membrana.
• Tampoco está sesgado hacia proteínas pequeñas o grandes:
distribución de los MWs de las proteínas identificadas.
• Las proteínas mitocondriales identificadas representan aprox. el
92% de las proteinas mitocondriales conocidas de S. cerevisiae en
la base de datos MITOP.

Cobertura del proteoma
• Difícil identificar el 100% de las proteínas de un organulo celular
mediante un análisis proteómico.
• Algunas proteínas sólo se expresan en condiciones de crecimiento
particulares, por lo que no existe una única condición de
crecimiento en la que se expresen todas la proteínas
simultaneamente.
• Además, algunas proteínas escapan a la detección mediante los
métodos de separación e identificación disponibles.
• La identificación de proteínas mitocondriales en S. cerevisiae
mediante la combinación de múltiples aproximaciones está
próxima a la saturación.

Cobertura del proteoma
• Más de 650 proteínas mitocondriales identificadas con los
primeros 5 millones de espectros.
• La mayor parte de las proteínas restantes identificadas en los
siguientes 10 millones de espectros.

Clasificación funcional
• En base a las funciones conocidas o predichas de las proteinas
mitocondriales, diferentes clases funcionales:
• Sólo un 14% de las proteínas actuan directamente en el
metabolismo energético:
• Maquinaria de fosforilación oxidativa
• Ciclo del ácido tricarboxílico
• Piruvato deshidrogenasa
• Un 25% de las proteínas implicadas en el mantenimiento y
la expresión del genoma mitocondrial.
• El 25% de la proteínas identificadas tiene una función
desconocida.

Clasificación funcional

Perspectivas
• La base de datos del proteoma mitocondrial de S. cerevisiae
representa una fuente global para estudios de:
• Caracterización de nuevas funciones
mitocondriales.
• Caracterización de nuevas funciones asociadas a
la mitocondria.
• Rutas de señalización.
• Sistemas proteolíticos.
• Identificación molecular de las bases de las
enfermedades mitocondriales.