1 FISIOLOGÍA BACTERIANA GUIA DE PROBLEMAS 1. El cloruro de ...

FISIOLOGÍA BACTERIANA
GUIA DE PROBLEMAS
1. El cloruro de sodio en concentración mayor de 6 g/l inhibe la mayoría de los
gérmenes permitiendo el crecimiento de Estafilococos. Dado el siguiente medio
de cultivo:
Extracto de carne 1 g/l
Peptona
10 g/l
NaCl
75 g/l
D-Manitol 10 g/l
Agar
10 g/l
Rojo de fenol 25 mg/l
pH 7,4
A- ¿Cómo clasificaría este medio
B- ¿Si hubiera fermentación de azúcar, se produciría algún cambio en el medio
2. Dados los siguientes medios cuya composición se detallan a continuación:
Medio 1 Medio 2
Lactosa 5 g/l Triptona 5 g/l
Sacarosa 5 g/l Extracto de levadura 25 g/l
K 2 HPO 4 2 g/l Glucosa 10 g/l
Eosina 0,4 g/l Agar 15 g/l
Azul de metileno 0,065 g/l pH 7
Agar 15 g/l
pH 7,4
A- ¿Cuál medio usaría para realizar un recuento de microorganismos totales de un
lote de pastillas
B- ¿Qué razones tiene para haber hecho esa elección
3. Sabiendo que el citrato de sodio y el desoxicolato de sodio inhiben el crecimiento
de Gram(-) y algunos otros microorganismos y permite el crecimiento de
Salmonella y Shigellas. Dado el siguiente medio de cultivo:
Peptona
20 g/l
Glucosa
1 g/l
D-Manitol
2 g/l
Citrato de sodio 5 g/l
Desoxicolato de sodio 0,5 g/l
K 2 HPO 4
4 g/l
KH 2 PO 4
1,5 g/l
NaCl
5 g/l
pH 7,4
¿Cómo clasificaría a este medio de cultivo Fundamente su respuesta.
4. Confeccione un medio de cultivo e identifique las condiciones de crecimiento para
cada uno de los siguientes microorganismos:
a- Quimiolitoheterótrofo
b- Quimiorganoautótrofo
1

c- Quimiorganoheterótrofo
d- Quimiolitoautótrofo fijador libre de N2
e- Quimiorganoheterótrofo anaerobio estricto
5. Se desean estudiar los microorganismos presentes en una muestra polimicrobiana.
Para ello se necesitan obtener cultivos puros de cada uno de ellos, para lo cual:
a- Aisla colonias en un medio sólido complejo y a partir de éstas siembra en un
medio líquido complejo.
b- Aisla colonias en un medio sólido complejo y a partir de éstas siembra por
depósito y posterior quemado en medio sólido complejo.
c- Aisla colonias en medio sólido sintético y a partir de éstas siembra por
agotamiento de ansa en medio sólido complejo.
d- Aisla colonias en un medio sólido complejo y a partir de éstas siembra en un
medio líquido sintético.
e- Todo lo anterior es cierto
f- Nada de lo anterior es cierto
6. Se toma un inóculo de uno de los cultivos puros y se siembra por punción en un
tubo que contiene medio SIM, cuya composición es:
Peptona de caseína 20,0 g/l
Peptona de carne 6,6 g/l
Citrato de amonio y Fe(III) 0,2 g/l
Tiosulfato de sodio 0,2 g/l
Agar
3,0 g/l
El medio SIM es:
a- Sólido y complejo
b- Líquido y sintético
c- Semisólido y complejo
d- Semisólido y sintético
e- Todo lo anterior es cierto
f- Nada de lo anterior es cierto
Luego de incubar a 37°C durante 12 horas se observa que el crecimiento se
extiende sobre toda la superficie del medio, pero no hay crecimiento en la
punción.
De los resultados obtenidos usted puede deducir que se trata de un
microorganismo:
a- Anaerobio estricto (movilidad +)
b- Anaerobio facultativo (movilidad -)
c- Aerobio (movilidad +)
d- Todo lo anterior es cierto
e- Nada de lo anterior es cierto
f-
7. Ud recibe una mezcla polimicrobiana y le solicitan aislamiento e identificación de
gérmenes. ¿Cómo procedería a partir de la muestra para obtener los
microorganismos aislados Utilizaría:
a. Un medio sólido selectivo para Gram (+)
b. Un medio sólido selectivo para Gram (-)
c. Un medio líquido diferencial
2

d. Un medio sólido complejo
e. Un medio sólido sintético
f. Todo lo anterior es cierto
g. Nada de lo anterior es cierto
Posteriormente Ud. está interesado en identificar un determinado
microorganismo basándose en las características que presenta su colonia en la
tinción de Gram del mismo. Para ello Ud. debe obtener un cultivo puro de ese
organismo a fin de identificarlo mediante distintas pruebas metabólicas.
¿Cómo procedería para lograrlo:
a. A partir de una colonia aislada sembraría una placa con medio sólido
complejo
b. A partir de una colonia aislada sembraría un medio líquido complejo
c. A partir de una colonia aislada sembraría una placa con medio sólido
sintético
d. Todo lo anterior es cierto
e. Nada de lo anterior es cierto
8. Señale con una cruz qué tipo de medio de cultivo, de acuerdo a su consistencia
utilizaría para los siguientes ensayos:
Líquido Semisólido Sólido
a. Movilidad determinada macroscópicamente: ........... .............. ...........
b. Obtener cultivos puros: ............ ............... ...........
c. Movilidad determinada microscópicamente: ............ ................. ...........
d. Contaje de células viables: ............ ................. ...........
e. Realizar una curva de crecimiento por D.O: ............ ................. ...........
9. El agar TCBS (agar-tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa) se utiliza para el
aislamiento de Vibrio cholerae. Las elevadas concentraciones de tiosulfato y
citrato inhiben el crecimiento de enterobacterias, mientras que la bilis y el colato
inhiben a enterococos.
a- Dada la composición del medio, indique como lo clasificaría de una manera
más completa, y justifique.
Peptona de caseína 5 g/l
Peptona de carne 5 g/l
Extracto de levadura 5 g/l
Citrato de sodio 10 g/l
Tiosulfato de sodio 10 g/l
Bilis desecada 5 g/l
Colato de sodio 3 g/l
Sacarosa
20 g/l
Cloruro de sodio 10 g/l
Hierro (III) citrato 1 g/l
Azul de bromotimol 0,04 g/l
Azul de timol 0,04 g/l
Agar-agar
14 g/l
3

- De acuerdo a los requerimientos de fuente de carbono y energía, señale que
clase de microorganismos podrían cultivarse en el medio TCBS.
1- Quimioorganoheterótrofo
2- Quimiolitoheterótrofo
3- Fotoautótrofo
4- Fotoheterótrofo
5- Todo lo anterior es cierto
6- Nada de lo anterior es cierto
10. Si una cepa de Escherichia coli posee un genotipo met - trp - , dicha cepa:
a- Es auxótrofa para metionina y triptofano
b- Puede cultivarse en un medio de cultivo mínimo al cual se le adicionó
metionina y triptofano.
c- Puede cultivarse en medio de cultivo complejo.
d- Es incapaz de sintetizar metionina y triptofano.
e- Todo lo anterior es cierto.
f- Nada de lo anterior es cierto.
11. Se desea obtener un cultivo puro de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis a
partir de una mezcla de microorganismos. ¿Cuál de los siguientes medios
utilizaría
Medio 1 Medio 2
Peptona 20 g/l extracto de levadura 5 g/l
NaCl 5 g/l triptona 10 g/l
Lactosa 10 g/l NaCl 5 g/l
Sales biliares 1,5 g/l agar 20 g/l
Rojo neutro 0,03 g/l
Violeta cristal 0,001 g/l
Agar
20 g/l
Justifique su respuesta. Clasifique ambos medios de cultivo.
12. Lactoccocus lactis es una bacteria que posee una pared constituida por una gruesa
capa de mureína y carece de membrana externa. Qué observaría al microscopio
óptico, al realizar un extendido de un cultivo de dicha bacteria, en los siguientes
casos:
a- Luego de realizar una coloración de Gram
b- Si en la tinción de Gram cambia el violeta de genciana por zafranina.
c- Si antes de la tinción de Gram resuspende el cultivo en sacarosa 50% y agrega
lisozima.
d- Si se olvida de agregar la mezcla alcohol-acetona de la coloración de Gram.
e- ¿Podrá detectar la presencia de una cepa contaminante de Escherichia coli
usando una coloración de Gram ¿ Y si se olvida de agregar el decolorante
Justifique.
13. Dado el siguiente medio de cultivo:
Hidrocloruro de cisteína
Citrato de sodio
Dextrosa
Fosfato diácido de potasio
0.1 g/l
0.3g/l
0.2 g/l
1 g/l
4

Extracto de levadura 0.5 g/l
Cloruro de sodio
5 g/l
Agar
15 g/l
Rojo fenol
0,012 g/l
NH 4 Cl
1 g/l
pH 6.9
a. Se trata de un medio sintético, sólido, que permite el crecimiento de
bacterias Gram (+) y Gram (-).
b. Se trata de un medio sólido, complejo, que permite el crecimiento de
bacterias Gram (+).
c. Es un medio complejo, semisólido, diferencial y selectivo para Gram (+).
d. Es un medio sólido, diferencial, complejo, que impide el crecimiento de
bacterias Gram (+).
14. Ud. crece una bacteria en caldo peptonado en el cual la relación con el oxígeno es
desconocida. Luego de 24 hs a 37 o C, saca el cultivo de la estufa sin agitación y
observa que el microorganismo creció a todo lo largo del tubo. Ud. concluye que
es:
a- un aerobio obligado
b- un microaerófilo
c- un aerobio facultativo
d- un anaerobio obligado.
15. Se estudia el mecanismo y lugar de acción de un antibiótico activo contra
bacterias Gram (+), de estructura péptido cíclico con un brazo de ácido graso.
Para ello se realizan los siguientes ensayos:
A) ensayos de biosíntesis de macromoléculas: se cultiva a la bacteria ( en este
caso Staphylococcus aureus) en presencia de distintos precursores de
macromoléculas marcadas radiactivamente, en presencia de distintos
antibióticos conocidos y del nuevo antibiótico LY. Luego se preparan los
extractos celulares según la macromolécula que se quiere estudiar y se
determina la cantidad de radiactividad en cada una según la siguiente tabla:
% de inhibición sobre la biosíntesis
PROTEÍNA DNA RNA MUREÍNA
LY 2 2 0 90
ERITROMICINA 70 0 0 0
ACTINOMICINA 0 90 0 0
RIFAMPICINA 0 0 94 0
VANCOMICINA 0 0 0 78
Posteriormente se realizaron los siguientes ensayos para aclarar el mecanismo de
acción:
B) Incorporación de radiactividad proveniente de precursores unidos a UDP en
presencia de distintos antibióticos: se realiza la incubación del cultivo
bacteriano con los distintos precursores en presencia de distintos antibióticos.
Posteriormente se separa el péptido glicano ácido insoluble y se determina su
radiactividad para cada condición de cultivo según se ve en la siguiente tabla:
5

Precursor radiactivo Antib. (g/ml) Radiactividad % inhibición
Sin agregado 22000 -
UDP-GlcNAc
LY (100) 7000 68
Fosfomicina (300) 4000 82
Vancomicina (100) 3500 85
Sin agregado 4000 -
UDP-MurNAc-pentap.
LY (100) 1200 70
Fosfomicina (300) 4000 0
Vancomicina (100) 600 85
C) al incubar las bacterias con 14 C D-Alanina en presencia de 1000 g/ml de
Vancomicina, se produce la acumulación in vivo de UDPMurNAcpentapéptido,
radiactivo, ya que la Vancomicina inhibe la transferencia del
precursor. Se agregan distintas cantidades de LY y a tiempos determinados de
determina la radiactividad en células (Fig. 1).
D) Por último se ensayó el efecto de la concentración de LY sobre la liberación de
K + intracelular en S. aureus. El K + liberado al medio extracelualr se midió en
un medio isoosmótico.
Figura 1
Figura 2
30
Radiactividad (cpm x 103)
25
20
15
10
5
0
0 20 40 60 80 100
concentración de LY (ug/ml)
K liberado (ug/DO590 nm)
0.1 1 10 100
concentración de LY (ug/ml)
En base a los datos suministrados :
1) interpretar cada uno de los resultados presentados.
2) Indicar los posibles lugares de acción del antibiótico.
16. Se quiere determinar el sitio de acción de un antibiótico, para lo cual se utiliza la
bacteria Gram (+) Bacillus subtilis. Alícuotas de esta bacteria son incubadas con
el agregado de precursores radioactivos en presencia o en ausencia del antibiótico.
Luego se van tomando muestras a distintos tiempos y se determina la
incorporación de radioactividad en cada caso, obteniéndose los siguientes
gráficos:
6

a- Incubación realizada en presencia de UDP ( 14 C) Glc-Nac
% de radioactividad
en la pared celular
Sin antibiótico
Con antibiótico
1 2 3
Tiempo (Hs.)
b- Incubación realizada en presencia de ( 14 C) D-alanina.
% de radioactividad
en la pared celular
Sin antibiótico
Con antibiótico
1 2 3
Tiempo (Hs.)
4
c- Incubación realizada en presencia de ( 14 C) D-alanina.
% de radioactividad
en la fracción de
membrana
Sin antibiótico
Con antibiótico
1 2 3 4
Tiempo (Hs.)
Indique los posibles sitios de acción de este antibiótico. Grafique D.O. en función
del tiempo para un cultivo al que se le agrega este antibiótico. Justifique sus
respuestas.
7

17. Se realizaron investigaciones acerca del mecanismo de resistencia a Tetraciclina,
desarrollado por una cepa mutante de Staphylococcus faecalis. Se emplearon para
este fin tres cepas de este microorganismo: Una sensible al antibiótico (A), una
cepa resistente ya conocida (B), y la mutante en estudio (C). Para detectar el
origen de la resistencia adquirida por esta cepa, se realizaron los siguientes
ensayos:
a- Efecto de la tetraciclina sobre el crecimiento de las cepas (A), (B) y (C). La
flecha indica el momento de agregado del antibiótico (100 µg/ml).
Log DO (590 nm)
S. faecalis (A)
S. faecalis (B)
S. faecalis (C)
2 4 6 8
Tiempo (Hs.)
b- Actividad biológica de la Tetraciclina recuperada del sobrenadante
(esterilizado por filtración) donde se desarrollaron las cepas (B) y (C). El
sobrenadante de un cultivo de S. faecalis (B) y (C), de 15 Hs., al que se cultivó en
presencia de Tetraciclina (100 µg/ml), fue recuperado y utilizado para ensayar su
capacidad inhibitoria remanente a distintas concentraciones, sobre una suspensión
de bacterias (A). El crecimiento fue observado y medido a las 15 Hs. De este
nuevo inóculo adicionado con sobrenadante. El control se realizó incorporando en
un tubo cantidades variables de Tetraciclina fresca.
Log DO (590 nm)
2 4 6 8 Tetraciclina (µg/ml)
1
/
1
/
1
16 8
/
1
4
/ 2 1
Diluciones del
sobrenadante
Cepa (A) + distintas diluciones del sobrenadante de (B)
Cepa (A) + distintas diluciones del sobrenadante de (C)
Cepa (A) + cantidades variables de Tetraciclina
8

c- Efecto de la Tetraciclina en la síntesis in vitro de proteína, medida como
porcentaje de Actividad ( incorporación de 14 C aminoácidos)
Los extractos de las cepas (A), (B) y (C) fueron preparados y se enfrentaron con
distintas concentraciones de Tetraciclina.
100
% actividad
síntesis proteica
50
S. faecalis (A)
S. faecalis (B)
S. faecalis (C)
5 10 15 20 25 Tetraciclina (µg/ml)
d- Incorporación de 3 H-Tetraciclina por la cepas (A), (B) y (C).
Se analiza la capacidad de acumularla intracelularmente en presencia o ausencia
de glucosa (fuente de energía).
Cepa A
Cepa B
Cepa C
100
100
100
75
75
75
50
50
50
25
25
25
5 10 15
20
5 10 15 20
5 10 15 20
Tiempo (min)
S. faecalis (A) en presencia de glucosa
S. faecalis (A) en ausencia de glucosa
S. faecalis (B) en presencia de glucosa
S. faecalis (B) en ausencia de glucosa
S. faecalis (C) en presencia de glucosa
S. faecalis (C) en ausencia de glucosa
Establezca qué tipo de mecanismo sería el que impide que estos mutantes no sean
afectados por la Tetraciclina.
9

18. Las tetraciclinas representan una familia de antibióticos introducidos a fines de la
década del 40, a partir de su aislamiento de diferentes cepas de Streptomyces.
Cuando una de estas cepas es cultivada en un medio de cultivo adecuado se
obtienen los resultados observados en la siguiente tabla.
TIEMPO (hs) PESO SECO (g/l) Ln PESO SECO
1 4.5 1.50
3 5.0 1.61
6 6.3 1.84
10 12.5 2.53
14 25.0 3.22
18 40 3.70
Por encima de las 20 hs. no se observa aumento apreciable del peso seco.
Paralelamente se determina la concentración de tetraciclina (Tc) producida por
esta especie bacteriana en el sobrenadante del medio de cultivo.
Cc de Tc
producida
5 10 15
20 25 30
Calcular la velocidad de crecimiento específica máxima y el tiempo de
generación.
a- Se podrían utilizar los datos numéricos de producción de Tc (en caso de contar
con ellos) para calcular la velocidad pedida Justificar.
19. Se estudió el mecanismo y lugar de acción de un antibiótico activo contra
bacterias Gram (+), para ello se realizaron los siguientes ensayos:
Ensayos de biosíntesis de macromoléculas: se cultivó la bacteria (Staphylococcus
aureus) en presencia de distintos precursores de macromoléculas marcadas
radioactivamente, en presencia de distintos antibióticos conocidos y del nuevo
antibiótico X. Luego se prepararon los extractos celulares según la macromolécula
que se quería estudiar y se determinó la cantidad de radioactividad de cada una
según la siguiente tabla:
% de inhibición sobre la biosíntesis
Proteína DNA RNA Mureína
X 2 1 1 92
Cloranfenicol 85 0 2 2
Actinomicina 1 91 15 0
Tiempo (hs)
10

Rifampicina 0 1 92 1
Vancomicina 1 0 0 84
Posteriormente se realizó el siguiente ensayo para aclarar el mecanismo de acción:
Precursor radioactivo Antibiótico (µ/ml) Radiactivad
(incorporada en
mureína)
UDP-GlcNac Sin agregado
20000
X
200
D-cicloserina
250
UDP-MurNac-pentapéptido
Ristocetina
Sin agregado
X
D-cicloserina
Ristocetina
400
5000
4500
4250
500
% Inhibición
-
99
98.5
98
-
5
7.5
90
En base a los datos suministrados:
a. Interpretar cada uno de los resultados presentados.
b. Indicar los posibles lugares de acción del antibiótico.
20. Indique cómo se comportará un cultivo de la bacteria Gram (-) E. coli K12, ante el
agregado de los siguientes antibióticos, por separado, en los momentos indicados
por las flechas, ya sea en un medio isotónico (caldo peptonado + sacarosa) o
hipotónico (caldo peptonado)-
1- Penicilina G
2- Estreptomicina
3- Polimixina
4- Ácido Nalidíxico
D.O.
D.O.
1, 3, 4
3, 4
1, 2, 3
MEDIO ISOTÓNICO
Tiempo
3, 2
MEDIO HIPOTÓNICO
Tiempo
21. Hasta el presente se han descripto distintos mecanismos de resistencia bacteriana a
tetraciclinas. Para estudiar uno de estos mecanismos de resistencia mediado por la
proteína Tet (0) en una cepa de E. coli denominada JM107 productora de esta
proteína, se realizaron los siguientes ensayos:
11

a- Captación de 3 H-tetraciclina: se crecieron las cepas JM107 y HB101 (cepa de
E. coli resistente a tetraciclina mediante un proceso de expulsión activo de la
droga) hasta la fase log, se lavaron y resuspendieron en medio de cultivo fresco
con el agregado de 3 H-tetraciclina. A distintos tiempos se tomaron alícuotas y se
determinó la radioactividad presente en las bacterias.
Captación
3
de ( H)-Tc
8
JM107
6
4
2
HB101
15 30 45
60 75 90
Tiempo (min)
b- Efecto de Tet(0) sobre la actividad de la tetraciclina: se utilizó un sistema de
traducción in vitro a partir de ARNm sintético (poliU) cuya traducción da
polifenilalanina. Dicho sistema de traducción utiliza fracciones ribosomales
provenientes de E. coli HB101 o JM107 Tc r en presencia de 14 C-fenilalanina y
distintas concentraciones de tetraciclina en un medio por lo demás completo. A
los 60 minutos se precipita la polifenilalanina con ácido tricloroacético al 10% y
se mide la radioactividad incorporada en el precipitado. En la figura se grafica el
porcentaje de inhibición alcanzado.
% de 100
Inhibición
80
HB101
60
40
20
JM107
25 50 75
100 125 150
[Tc] µM
c- Por último se midió la unión de 3H-tetraciclina a una fracción de ribosomas
provenientes de la cepa HB101 o de la cepa JM107. Para ello se incubó una
alícuota conteniendo ribosomas en un buffer adecuado en presencia de distintas
concentraciones de 3H-tetraciclina durante 15 minutos a 37°C. Posteriormente se
colectaron los ribosomas, se lavaron, y se determinó la radioactividad unida en
cada caso. Se obtuvieron los siguientes resultados:
3
(H)-Tc
unida
2.0
1.5
HB101
1.0
0.5
JM107
20 40 60
80 100 125
150
[Tc] µM
12

En base a los datos mostrados, indique el posible mecanismo de resistencia de la
cepa JM107. Justifique su respuesta analizando en cada caso los datos mostrados.
22. Se desea estudiar el transporte de Cd ++ en dos cepas de la bacteria Gram (+)
Bacillus subtilis. B. subtilis 100 y B. subtilis 200. Para ello se realizaron los
siguientes experimentos:
a- Se crecen ambas cepas en presencia de distintas concentraciones de Cd ++ y se
determina la densidad óptica final alcanzada a las 12 horas de cultivo.
D.O.
B. subtilis 100
B. subtilis 200
++
1 10 100 [Cd ] µM
f. En la bacteria Gram (-) E. coli el transporte de Cd ++ es mediado por el mismo
transportados que introduzca Mn ++ . Con el objeto de determinar si sucede lo
mismo en bacterias Gram(+) se crecen ambas cepas de B. subtilis hasta la fase
exponencial tardía en presencia de distintas concentraciones de Cd++ y en
presencia o ausencia de Mn ++ . Luego se determina la densidad óptica final
alcanzada.
D.O.
B. subtilis 100
B. subtilis 200
o B. subtilis 200 + 50µM Mn
o B. subtilis 100 + 50µM Mn
++
++
++
1 10 100 [Cd ] µM
g. Se analizan los transportes de Cd ++ y Mn ++ en ambas cepas de B. subtilis
creciéndose las mismas hasta la fase exponencial tardía, centrifugando,
resuspendiéndolas en medio fresco con el agregado de 5 µM de Cd ++ o 5 µM
de Mn ++ radioactivos. Se determinó a continuación la radioactividad
transportada en cada cepa:
Cd ++ Mn ++
1 1
2.5
5
Tiempo (min)
2.5
5
Tiempo (min)
B. subtilis 100
B. subtilis 200
13

h. El DNP (dinitrofenol) es un compuesto que desacopla la fosforilación
oxidativa. El agregado de este compuesto a cultivos crecidos en presencia de
Mn ++ radioactivos da los siguientes resultados sobre la cepa de B. subtilis 100:
Transporte
de ( 54 Mn ++ )
1.5
0.8
B. subtilis 100 + 50µM 54 Mn ++
B. subtilis 100 + 50µM 54 Mn ++ + 0,5µM DNP
0.4
2.5 5
Tiempo (min)
En base a los resultados mostrados conteste justificando para cada caso:
a. Efecto del Cd ++ sobre cada cepa de B. subtilis
b. Relación entre el transportador de Cd ++ y Mn ++ en B. subtilis
c. Tipo/s de mecanismo/s de resistencia al Cd ++ en la cepa de B. subtilis 200.
d. Clasificación del mecanismo de transporte de Mn ++ .
e. Comente los distintos mecanismos de transporte de soluto indicando sus
características más importantes.
23. Durante una serie de estudios se logró aislar una especie bacteriana desde el
sedimento del fondo de una laguna. Este microorganismo denominado GS-15 fue
cultivado anaeróbicamente a 33 C en un medio de cultivo que contenía en
gramos por litro:
CaCl 2 .5 H 2 O 0.1
KCl 0.1
NH 4 Cl 1.5
NaH 2 PO 4 0.6
NaAcO 6.8
El medio contenía además vitaminas en cantidades adecuadas, como así también 200
mM de Fe(III) amorfo (hidróxido férrico) (medio I). Como resultado de estos
experimentos se obtuvieron las gráficas de la figura 1:
Nota: Fe (II) y Fe (III) se midieron en el sobrenadante.
40
35
30
25
20
15
FIGURA 1
x 107 cel. / ml
21
18
15
12
9
FIGURA 2
10
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
días
Fe (II) Nv x 107 cel/ml acetato Fe (III)
6
3
0
0 5 10 15 20 25
horas
Fe (III) Fe (II) Nv x 107 cel/ml
14

a. ¿Cómo interpreta cada una de estas curvas
b. Calcular máx. y el Tg . Tener en cuenta que los datos numéricos de las
gráficas no son logarítmicos.
c. ¿Cómo clasificaría el medio de cultivo
Luego GS-15 fue cultivada anaeróbicamente en una medio idéntico al I salvo que en
lugar de adicionar Fe(III) amorfo se agregó citrato férrico (medio II). Fig.2.
d. ¿Cómo interpreta las gráficas ¿Que conclusión obtiene de la
comparación de las velocidades de crecimiento entre las figuras 1 y 2
24. Se desean estudiar las características de crecimiento de dos especies bacterianas
Q.O.T. aisladas a partir de una muestra de suelo. Las especies en cuestión,
denominadas cepa A y cepa B, fueron caracterizadas nutricionalmente hallándose
que la cepa A posee una auxotrofía para el aminoácido (L)-leucina y que la cepa B
es protótrofa productora de al menos una sustancia con actividad antibiótica,
sintetizada desde el comienzo de la fase exponencial tardía de crecimiento.
Luego de crecerse, por separado, las cepas A y B en medio sintético mínimo se
obtuvieron los resultados dados a continuación.
Tiempo (h)
ln D.O.
Cepa A
Cepa B
0 0.095 0.182
1 0.139 0.182
2 0.530 0.405
3 0.910 0.693
4 1.609 1.029
5 2.300 1.386
6 2.990 1.568
7 3.400 1.609
8 3.690 1.705
9 3.800 1.705
10 3.850 1.723
11 3.850 1.740
12 3.850 1.723
Pregunta 1: Calcule la µ máxima de crecimiento y el tiempo de generación (tg)
para cada cepa bacteriana.
Pregunta 2: Confeccione un medio de cultivo sintético mínimo apto para el
crecimiento de cada cepa bacteriana por separado.
A continuación los microorganismos A y B son crecidos juntos en el mismo
medio de cultivo sintético mínimo obteniéndose los datos siguientes:
Tiempo (h)
ln (N° cél. viables / ml)
Cepa A
Cepa B
0 11.51 11.61
1 11.61 11.61
15

2 12.07 11.95
3 12.30 12.30
4 12.90 12.64
5 13.59 13.00
6 14.28 13.33
7 14.40 14.15
8 14.00 15.42
9 13.59 16.70
10 13.22 17.97
11 12.21 19.24
12 9.21 20.51
Pregunta 3: Confeccione un medio de cultivo sintético mínimo para el
crecimiento conjunto de las cepas A y B.
Pregunta 4: Calcule µ máxima de crecimiento de las cepas A y B así como µ
máxima de muerte (cuando corresponda). ¿Cómo explica Ud. los resultados obtenidos
al comparar estos datos con los de la respuesta a la pregunta 1, anterior situación en la
cual los microorganismos A y B fueron crecidos separadamente
25. Para estudiar el efecto y mecanismo de acción de un antibiótico se llevaron a cabo
los siguientes experimentos:
a. Recuento del número de células viables.
El ensayo del antibiótico (ATB) se realizó sobre una cepa de Bacillus subtilis
sensible (S) y una resistente (R); el antibiótico fue agregado en una
concentración de 100µg/ml, 150 minutos después de iniciado el cultivo.
Cuando el experimento se realizó en un medio isosmótico los valores de las
cepas R y S no difirieron significativamente del control realizado sin
antibiótico, no siendo así cuando el ensayo se realizó en un medio
hiposmótico. Los valores informados son unidades formadoras de colonias por
mililitro de cultivo.
TIEMPO (minutos) S y R con antibiótico. S sin antibiótico S con antibiótico
S sin antibiótico
0 1.0 x 10 3 1.1 x 10 3 1.1 x 10 3
30 1.0 x 10 3 1.2 x 10 3 1.2 x 10 3
60 1.5 x 10 3 1.3 x 10 3 1.2 x 10 3
90 4.0 x 10 4 4.2 x 10 4 4.1 x 10 4
120 4.0 x 10 5 4.1 x 10 5 4.0 x 10 5
150 4.0 x 10 6 3.9 x 10 6 3.8 x 10 6
180 4.2 x 10 7 4.1 x 10 7 4.0 x 10 6
210 3.7 x 10 8 3.6 x 10 8 9.0 x 10 5
240 4.3 x 10 8 4.2 x 10 8 2.0 x 10 5
270 5.0 x 10 8 4.9 x 10 8 8.0 x 10 4
300 5.1 x 10 8 5.0 x 10 8 4.0 x 10 4
330 5.2 x 10 8 5.1 x 10 8 2.1 x 10 4
360 5.2 x 10 8 5.2 x 10 8 1.0 x 10 4
390 5.2 x 10 8 5.2 x 10 8 5.0 x 10 3
Osmolaridad del ISOSMOTICO HIPOSMOTICO HIPOSMOTICO
medio
16

. Se ensayó también el efecto de distintas concentraciones del antibiótico sobre
el crecimiento de una cepa sensible en condiciones hiposmóticas, para lo cual
se adicionó el mismo a distintas alícuotas de un cultivo de DO=0,6 y se midió
la DO final alcanzada luego de 1 hora de adicionado el antibiótico.
CONCENTRACIÓN (µg/ml) DO final alcanzada
10 1.2
50 0.9
100 0.2
200 0.2
c. Para analizar cual era el metabolismo afectado se ensayó el antibiótico en
cuestión y otros de actividad conocida sobre una cepa sensible en presencia de
precursores marcados radiactivamente, y se midió su incorporación a distintas
biomoléculas. Los valores informados (en cuentas por minuto totales) fueron:
ANTIBIOTICO [ 35 S] metionina [ 3 H] timidina [ 3 H] uracilo [ 14 C] UDP
NAcGluc
ATB 14900 14000 14900 17000
Cloranfenicol 3100 16300 16100 111000
Actinomicina 14000 2500 15500 120000
Rifampicina 13900 16000 170 115000
Vancomicina 14800 16500 16000 20000
Sin antibiótico 15000 17000 16500 120000
d. Con el fin de localizar el sitio de acción del antibiótico se realizó un
experimento en el cual se utilizaron precursores radioactivos de la síntesis de
mureína, midiéndose la incorporación de los mismos a la pared celular en un
medio isosmótico, luego de 2 horas de cultivo, en presencia de 200 µg/ml del
antibiótico.
PRECURSOR S sin antibiótico S con antibiótico R con antibiótico
N-AcGlucosamina 20000 1500 18000
D-Alanina 23000 1300 17900
UDP NAc Mur pentapéptido 19000 1600 19000
e. Para estudiar el mecanismo de resistencia de la cepa R se realizó el siguiente
experimento:
Se cultivó la cepa R en presencia del antibiótico (200 µg/ml) hasta una DO de 0,5,
se separaron las células por centrifugación, y los sobrenadantes se usaron para
crecer la cepa sensible S partiendo de una DO inicial de 0,15 en 3ml volumen
final. Los resultados se informan como DO alcanzada luego de 3 horas.
MEDIO FRESCO : SOBRENADANTE
DO FINAL ALCANZADA
4 ml: 0 ml 0.80
3 ml : 1 ml 0.81
2 ml : 2 ml 0.72
1 ml : 3 ml 0.74
0 ml : 4 ml 0.71
17

i. Grafique ln(Nv) versus tiempo para las cepas en estudio.
ii. Represente los resultados esperados en el caso de medir Abs. en
lugar de Nv.
iii. Calcule la máx . para la cepa control sin antibiótico en medio
isosmótico.
iv. Indique el posible sitio de acción del antibiótico y mecanismo de
resistencia para la cepa R.
26. Para analizar el efecto de diferentes concentraciones de un antibiótico sobre el
crecimiento de una cepa de Streptococcus se determinó tanto la D.O. del cultivo,
como el recuento de células viables a diferentes tiempos. Los datos indicados en
la columna (cultivo I) fueron obtenidos en ausencia del antibiótico. Los cultivos 2
y 3 muestran los mismos datos, a los cuales se les adicionó a los 150 minutos el
antibiótico en estudio a una concentración final de 1 y 100 g/ml respectivamente.
Cultivo 1: ausencia de antibiótico
Cultivo 2: a los 150 minutos se agregó el antibiótico a una concentración final de 1
g/ml y se continuó midiendo la D.O. del cultivo.
Cultivo 3: se realizó el mismo procedimiento que para el cultivo 2 excepto que el
antibiótico se agregó a una concentración final de 100 g/ml.
Tabla 1. Medida de D.O.
Tiempo Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3
(min) D.O. ln D.O D.O. ln D.O D.O. ln D.O
0 148 5 148 5 148 5
60 149 5 149 5 149 5
90 181 5.2 181 5.2 181 5.2
120 330 5.8 330 5.8 330 5.8
150 600 6.4 600 6.4 600 6.4
180 1097 7 600 6.4 600 6.4
210 2000 7.6 600 6.4 600 6.4
240 3640 8.2 600 6.4 600 6.4
300 5400 8.6 600 6.4 600 6.4
360 5430 8.6 600 6.4 600 6.4
Tabla 2. Recuento de células viables (x 10 8 ).
Tiempo
Cultivo 2 Cultivo 3
(min) Nº cél. ln Nv Nº cél. ln Nv
viables (Nv)
viables (Nv)
0 2.7 19.4 2.7 19.4
60 2.7 19.4 2.7 19.4
90 3.3 19.6 3.3 19.6
120 6.0 20.2 6.0 20.2
150 11 20.8 11 20.8
180 11 20.8 11 20.8
210 11 20.8 11 20.8
240 11 20.8 11 20.8
300 11 20.8 11 20.8
360 11 20.8 11 20.8
18

A. Calcule máx . y tg e indique durante que lapso el cultivo se encontraba en la fase
exponencial.
B. Fundamente cual es el efecto del antibiótico para cada concentración
(bacteriostático, bactericida o bacteriolítico).
C. Calcule, si corresponde, la velocidad específica de muerte (), sabiendo que la
muerte celular sigue una cinética exponencial similar a la de crecimiento celular.
27. Con el fin de analizar el efecto de los antibióticos X e Y sobre el crecimiento de
E. coli se determinó el número de células viables por mililitro (Nv/ml) a diferentes
tiempos, en ausencia (Tabla 1) y en presencia de dichos antibióticos (Tabla
2:antibiótico x; Tabla 3: antibiótico Y). Se indican las diluciones realizadas a cada
tiempo para el contaje de células viables, el volumen sembrado para cada dilución
y el número de unidades formadoras de colonias (UFC) contadas en cada dilución.
Tabla 1. Valores obtenidos en ausencia de antibióticos.
Tiempo (hs) Dilución Vol. de siembra (ml) UFC
0 10 -2 0.1 30
10 -3 0.1 1
1 10 -2 0.2 61
10 -3 0.2 3
2 10 -2 0.1 60
10 -3 0.1 8
4 10 -3 0.1 410
10 -4 0.1 38
6 10 -6 0.2 49
10 -7 0.2 4
7 10 -5 0.1 922
10 -6 0.1 145
8 10 -6 0.1 290
10 -7 0.1 25
9 10 -7 0.2 58
10 -8 0.2 1
Tabla 2. El antibiótico X fue agregado a T=4 hs.
Tiempo (hs) Dilución Vol. de siembra (ml) UFC
5 10 -4 0.1 54
10 -5 0.1 5
7 10 -3 0.1 630
10 -4 0.1 55
9 10 -3 0.2 1200
10 -4 0.2 108
Tabla 3. El antibiótico Y fue agregado a T=4 hs.
Tiempo (hs) Dilución Vol. de siembra (ml) UFC
5 10 -4 0.2 108
10 -5 0.2 9
7 10 -3 0.1 120
10 -4 0.1 24
9 10 -3 0.2 54
10 -4 0.2 2
19

A. Calcule UFC/ml del cultivo para cada tiempo, en ausencia y presencia
de los antibióticos X e Y.
B. Grafique ln Nv/ml vs tiempo en ausencia y presencia de los
antibióticos.
C. Calcule máx . y tg.
D. ¿Puede, en base a los datos de Nv, indicar el efecto de los antibióticos
X e y sobre E. coli (bacteriostático, bactericida propiamente dicho o
bacteriolítico). En caso negativo, indique qué otros datos necesitaría
para determinarlo.
28. Se desea conocer el número de unidades formadoras de colonia por mililitro
(UFC/ml), de un cultivo de Escherichia coli LE392. A partir de dicho cultivo se
realizaron tres diluciones consecutivas de 1:100, y una cuarta dilución de 1:10. se
sembraron con espátula de Drigalski 0,1 ml de la tercera y cuarta dilución. En la
tercera se contaron 50 colonias y en la cuarta 3 colonias.
a- ¿Cuál de las dos diluciones se usa para calcular el número de UFC/ml
Justifique.
b- Calcule en número de UFC/ml del cultivo original.
c- ¿Qué significado tiene el término UFC/ml
d- Este método de cuantificación de microorganismos determina:
I. número total de microorganismos.
II. número de microorganismos viables.
III. número de microorganismos muertos.
IV. todo lo anterior es cierto.
V. nada de lo anterior es cierto.
29. El Fe(III) es un importante agente oxidante de compuestos orgánicos naturales
ubicados en las superficies y sedimentos acuáticos. En estas transformaciones
participan microorganismos. Uno de ellos es Alteromonas putrefaciens y fue
sometido a los siguientes experimentos:
a- A. putrefaciens fue cultivada en el siguiente medio de cultivo (en g/l):
NaHCO 3 2,5 L-glutamina 0,02
KCl 0,1 DL-serina 0,04
NH 4 Cl 0,1 L-arginina 0,02
NaH 2 PO 4 .H 2 O 0,6
El Fe(III) fue provisto bajo la forma de citrato férrico 50 mM o bien como óxido
férrico amorfo 200mM. Los distintos compuestos orgánicos fueron adicionados según
se indica en cada caso. Condiciones de crecimiento: anaerobiosis.
El crecimiento de A. putrefaciens en el medio indicado suplementado con lactato
y citrato férrico muestra el comportamiento de la Figura 1 siguiente:
FIGURA 1
100
20
II) / Lactato o Acetato
(mM)
80
60
40
16
12
8
las viables (x10 7 /ml)
20

La estequiometría del proceso es:
Lactato + 2 H 2 O + 4 Fe 3+ ------------ Acetato + HCO 3
-
+ 5 H + + 4 Fe 2+
Si en lugar de suplementar con lactato y citrato férrico se suplementa con lactato
y MnO 2 se obtiene el siguiente comportamiento: (Figura 2)
Lactato + H + + HCO 3
-
+ 2 MnO 2 -------- Acetato + 2 H 2 O + 2 MnCO 3
FIGURA 2
5
25
Fe(II) / Lactato o Acetato
(mM)
4
3
2
1
20
15
10
5
Mn(II) (mM)
0
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (días)
Lactato Acetato Mn(II)
0
Si el medio es suplementado con glucosa y citrato férrico (o MnO 2 ) se obtienen
los siguientes resultados: (Figura 3)
FIGURA 3
5
25
Glucosa (mM)
4
3
2
1
20
15
10
5
Fe(III) o MnO2 (mM)
0
0 3 6 9
Tiempo (días)
Glucosa D.O. (600 nm) Fe(III) o MnO2
En base a estos resultados descriptos conteste justificando en cada caso:
0
21

1- ¿Cómo clasifica el medio de cultivo utilizado en base a su composición
química
2- ¿Cuál es la función del lactato en estos experimentos ¿Qué representa el
acetato
3- ¿Cómo clasifica a este microorganismo en base a su fuente de energía:
i. Quimioautótrofo
ii. Quimioorganótrofo
iii. Quimioheterótrofo
iv. Quimiolitótrofo
v. Fotótrofo
vi. Alguna combinación
vii. Ninguna combinación
Justificar
4- ¿Por qué se obtiene aún desarrollo al reemplazar el citrato férrico por MnO 2
¿Cuál es la función de los mismos
5- ¿Cómo explica la falta de crecimiento en presencia de glucosa y citrato férrico
6- Desde el punto de vista energético A. putrefaciens desarrolla un proceso de:
i. Fermentación
ii. Respiración aerobia
iii. Respiración anaerobia
iv. Fotosíntesis
v. Fotosíntesis anaerobia
vi. Alguna combinación, ¿cuál
Justificar
30. En los últimos años se ha tomado conciencia de la importancia de los compuestos
orgánicos sulfurados volátiles en el reciclaje de azufre en la atmósfera. Uno de
tales compuestos es el dimetildisulfuro (DMDS) que es producido en grandes
cantidades en ambientes acuáticos.
Estos sulfuros metilados son, en parte, absorbidos por el suelo y metabolizados
por ciertos grupos bacterianos como Thiobacillus. En una de tales investigaciones
se trabajó con una cepa de Thiobacillus thioparus que fue cultivada en el siguiente
medio (Medio A, en g/l):
KH 2 PO 4 2
K 2 HPO 4 2
NH 4 Cl 0,4
MgCl 2 .6H 2 O 0,2
El Medio A fue suplementado con 3 ml de solución de vitaminas y 1 ml de
solución de trazas metálicas, pH=7. Condiciones de crecimiento: 30°C en
aerobiosis. El DMDS fue adicionado en todos los casos al medio en las
concentraciones que se indican en cada oportunidad.
a- ¿Cómo clasificaría al medio de cultivo en base a su composición Justificar.
Se midió el crecimiento de T. Thioparus en el medio A con distintas
concentraciones de DMDS obteniéndose las curvas de la Figura 1.
22

En otro experimento utilizando el medio A con DMDS 2 mM se midieron los
parámetros indicados en la Figura 2.
b- ¿Cómo interpreta ambas figuras
FIGURA 1
FIGURA 2
Abs
0.4
0.2
Abs
0.2
0.1
2
1.5
1
DMDS o SO4 2- (mM)
0.5
0
0 20 40 60 80
Tiempo (hs)
DMDS (0,5 mM) DMDS (5 mM)
0
0
0 20 40 60 80
Tiempo (hs)
Abs DMDS (mM) SO42- (mM)
Estudios más complejos permitieron llegar a una ecuación general de utilización
de DMDS por esta bacteria:
(CH 3 ) 2 S 2 + 6,5 O 2 ------------ 2 CO 2 + 2 H 2 SO 4 + H 2 O
El metabolismo del DMDS es el siguiente:
(CH ) S 3 2 2
NADH + H +
NAD +
8 H O 2
16 H +
2 H O 2
2 CH SH
3
2 HCHO
2 O 2
(CATALASA)
2 H 2
S
2 H 2
O 2
2 H2O + O2
[S 2
O 3
=]
[S 4
O 6
=]
HS 2
O 4
2 H 2
O
2 NAD +
2 HCOOH
2 NADH + H +
2 NAD +
2 NADH + H +
2 CO 2
23

c- De acuerdo a la fuente de energía utilizada por T. Thioparus, Ud. clasificaría a
esta bacteria como:
i. Quimiolitótrofa
ii. Quimioautótrofa
iii. Quimioorganótrofa
iv. Quimioheterótrofa
v. Todos los anteriores
vi. Ninguno de los anteriores
vii. Alguna combinación, ¿cuál
Tache las respuestas incorrectas y justifique su respuesta.
Si a un cultivo de T. Thioparus en crecimiento exponencial en presencia de
DMDS se le adiciona un inhibidor de la actividad de catalasa se observa una
disminución abrupta del crecimiento de la bacteria. Esto no sucede si el DMDS es
reemplazado por tiosulfato de sodio.
d- ¿Cómo explica estos resultados (Utilice como ayuda el diagrama del
metabolismo general del DMDS)
31. En el curso de la búsqueda de nuevos antibióticos producidos por
microorganismos se detectó que una cepa de Bacillus subtilis produce un
novedoso antibiótico macrocíclico llamado Dificidina. A los efectos de
caracterizar este compuesto se realizaron los siguientes experimentos:
a- Una cepa de E.coli fue cultivada en medio sintético hasta D.O. 0,1. En ese
momento se fraccionó el cultivo en 4 partes, y a los 60 minutos a cada fracción
se le adicionó un compuesto diferente (Fig. 1).
b- Células de E. coli fueron cultivadas en medio M9 hasta fase logarítmica y en
ese momento se adicionó Dificidina. Se tomaron alícuotas del cultivo desde el
agragado del antibiótico, con el objeto de detectar la viabilidad celular (Fig. 2).
FIGURA 1 FIGURA 2
Abs (590nm)
0,8
ln N° Células
20
Agregado
de droga
0,6
0,4
Agregado
de droga
15
10
0,2
5
50 100 150 200
Tiempo (min)
50 100 150 200
Tiempo (min)
Control sin droga
Cloranfenicol
Dificidina
Penicilina
Control sin droga
100µg Dificidina
200µg Dificidina
24

En base a estos dos experimentos, qué conclusiones extrae sobre el efecto de
Dificidina sobre el crecimiento de E. coli Fundamente su respuesta.
A continuación es realizada una serie de experimentos para determinar el proceso
metabólico primario inhibido por Dificidina (ejemplo: síntesis de mureína, de
proteínas, de ARN, de ADN). En todos los casos E. coli se cultivó en medio M9
en presencia de algún precursor radioactivo como se indica en cada caso, y se
determinó la radioactividad (cpm) incorporada por las células (Figuras 3-6).
Incorporación de
3
[ H] Aminoácidos
Incorporación de
3
[H] Uracilo
CPM
1
CPM
1
4
7
2
2 y 5
6
Tiempo
Tiempo
Figura 3 Figura 4
Incorporación de
3
[ H] Timidina
Incorporación de
3
[H] DAP
CPM
1
6
2
CPM
3 1 5
2
3
4
Tiempo
Tiempo
Figura 5 Figura 6
1) sin agregado 5)Estreptomicina
2) Dificidina 6)Rifampicina
3) Ac. Nalidíxico 7)Cloranfenicol
4) Cicloserina
25

¿Qué conclusión extrae de estos últimos experimentos acerca del o de los posibles
blancos de acción de la Dificidina Explique su respuesta.
32. Usted desea determinar el tipo de metabolismo fermentativo de una determinada
bacteria. Para ello procede a realizar un cultivo líquido en aerobiosis, y en un
momento determinado separa tres alícuotas iguales, a las que agrega por separado
glucosa marcada en el C1, C2, C3 o C4, respectivamente. En función del tiempo
mide la radiactividad remanente en el medio de cultivo, encontrando que al cabo
de 5 min se ha perdido casi la totalidad de la misma solamente en el tubo
conteniendo glucosa marcada en el C1. ¿Qué tipo de fermentación realiza la
bacteria Fundamente su respuesta explicando cómo clasificaría además a la
misma en base a su relación con el oxígeno.
26