Mejoramiento del diagnóstico molecular de la distrofia miotónica ...

Mejoramiento del diagnóstico molecular de la distrofia miotónica
tipo 1 mediante el estudio del mosaicismo somático
Investigadora principal desde julio 2007 hasta marzo del 2009
Patricia Eugenia Cuenca Berger.
Magíster Scienteae en Biología de la Universidad de Costa Rica.
Doctora en Ciencias Naturales de la Universidad de Hamburgo, Alemania
Profesora de la Escuela de Medicina.
Investigador principal marzo 2009-2010
Fernando Alberto Morales Montero.
Magíster Scienteae en Biología de la Universidad de Costa Rica.
Doctor en Genética Molecular Humana de la Universidad de Glasgow,
Escocia, Reino Unido.
Profesor de la Escuela de Medicina.
Investigadores asociados:
Roberto Brian Gago, Médico, Neurólogo Infantil, Hospital Nacional de Niños. Profesor de la
Escuela de Medicina, UCR.
Mauricio Sittenfeld Appel, Neurólogo, Hospital San Juan de Dios. Profesor de la Escuela de
Medicina, UCR.
Huberth Fernández Morales, Neurólogo, Hospital Calderón Guardia.
Melissa Vásquez Cerdas, Magíster Scienteae en Biología con énfasis en Genética y Biología
Molecular.
Unidad de Investigación
Instituto de Investigaciones en Salud (INISA), Universidad de Costa Rica.
La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es considerada la enfermedad muscular hereditaria más
común en adultos jóvenes, sin embargo afecta también otros sistemas en grado variable a los
diferentes pacientes, de tal manera que algunos individuos afectados pueden presentar diabetes
tipo 2, atrofia de los testículos, cataratas, calvicie frontal, problemas de aprendizaje o abortos a
repetición en el caso de las mujeres. Se caracteriza por ser degenerativa y tener un patrón de
herencia autosómico dominante, lo cual significa que las personas afectadas por la enfermedad
tienen un 50% de riesgo de heredarla a cada uno de sus hijos. La edad en que se empiezan a
manifestar los primeros síntomas también es muy variable, la forma leve puede iniciar su
manifestación en los adultos mayores, la forma clásica en adultos jóvenes, la forma pediátrica en

niños y adolescentes y la forma congénita desde el nacimiento.
La mutación o alteración a nivel de la molécula de ADN consiste en una expansión
anormal de la repetición de un trinucleótido CTG: Citosina, Timina, Guanina; localizada en uno de
los extremos del gen que codifica para la proteína-quinasa de la distrofia miotónica (DMPK). Los
pacientes afectados presentan entre 50 y más de 2000 repeticiones CTG. El diagnóstico molecular
de la DM1 se realiza por medio de un método bioquímico (hibridación de Southern) que mide el
tamaño de los fragmentos de ADN donde se localiza la expansión. Estos fragmentos provienen de
miles de células obtenidas de la sangre periférica de los pacientes. La expansión de la repetición
CTG ocurre a diferente ritmo y puede ser de diferente tamaño en las diferentes células de un
mismo paciente, por lo cual se dice que esta enfermedad presenta mosaicismo somático. Esto
provoca que cuando se lee el resultado de las pruebas de laboratorio, aparezca una banda difusa
(mancha) en lugar de una banda definida, como ocurre normalmente cuando se analizan
muestras de personas normales (Ver figura 1). Debido a esto, la costumbre ha sido medir el
punto medio de la mancha y reportar este tamaño como el resultado del análisis del laboratorio
Figura 1: Autorradiografía de una hibridación de Southern para el gen DMPK en pacientes afectados con
distrofia miotónica tipo 1 y una persona normal. De izquierda a derecha: en el primer carril se observan dos bandas
de ADN pertenecientes a una persona sana, una de 9.800 pares de bases (pb) y otra de 8.600. El segundo carril muestra
el gen de un paciente afectado, con una banda normal de 9.800 pb y una banda con expansión de 12.000 pb. En el tercer
carril la banda normal es de 8.600 pb y las expansiones de diferente tamaño provocan una mancha en lugar de una banda
definida, por lo que se reporta el tamaño promedio, en este caso 14.000 pares de bases. Lo mismo ocurre con el paciente

cuyo ADN se muestra en el último carril, la expansión forma una mancha cuyo tamaño promedio es de 12.000 pb.
que se envía al médico tratante. Este dato se ha usado por parte de los científicos para tratar de
entender las diferencias clínicas que presentan los pacientes con relación al tamaño de la
expansión que portan, así como para tratar de predecir a que edad los portadores podrían
empezar a manifestar los primeros síntomas de la enfermedad. En términos generales se ha
observado que mientras más repeticiones CTG posea el paciente, más temprano en la vida
manifestará la enfermedad y en forma más severa. Sin embargo, definir el tamaño de la mutación
como el promedio del tamaño de todas las células que aportaron el ADN a la muestra del paciente
no ha sido de ayuda para que los médicos puedan establecer la edad de inicio ni tampoco el
pronóstico de la enfermedad. El tamaño observado de la mutación con el método usado en la
actualidad depende de la edad; mientras más edad tenga el paciente más grande la mancha, con
tendencia a la desaparición de los fragmentos de ADN con tamaños más pequeños; el tipo de
tejido (sangre, piel o músculo por ejemplo) y la tendencia a la expansión del mosaicismo somático
presente en los pacientes. Con el fin de contribuir a determinar el tamaño real de la mutación que
cada paciente heredó de su progenitor afectado, con la mínima interferencia de los factores
asociados, en este proyecto se aplicó una metodología diagnóstica más precisa que podría brindar
más información al médico tratante, conocida como, la small-pool PCR (SP-PCR). Este
procedimiento permite resolver la mancha observada mediante la hibridación de Southern en
células individuales, permitiendo así, estudiar y cuantificar más detalladamente, el mosaicismo
somático (o los niveles de inestabilidad) en cada paciente. Además, mediante este procedimiento,
es factible estimar el tamaño que tenía la expansión CTG en la célula progenitora (óvulo o
espermatozoide), así como también estudiar en detalle como ocurren las expansiones en las
células de sangre periférica (ver Fig. 2 y Fig. 3).

Figura 2. La SP-PCR consiste en diluir el ADN purificado de cada paciente hasta alcanzar una concentración equivalente
al ADN de una o unas cuantas células, y luego someterlo a amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa
bajo condiciones especiales, de tal manera que en las autorradiografías se pueden observar bandas que corresponden al
tamaño de una única molécula de ADN. Este figura muestra los resultados de la SP-PCR en tres pacientes con DM1 que
manifestaron la enfermedad a edades diferentes, en donde aparecen tres tamaños medidos: S=tamaño medido por medio
de la hibridación de Southern; I=tamaño del alelo progenitor medido por medio de la SP-PCR; N=tamaño normal medido
por medio de la SP-PCR. El tamaño del alelo progenitor es el que estamos usando para establecer las correlaciones clínicas
en la DM1.
Los datos obtenidos mediante este método pueden mejorar mucho la información predictiva
que se le brinda a los pacientes sobre su enfermedad.
El objetivo principal de este proyecto fue implementar la SP-PCR con el fin de determinar el
tamaño de la mutación heredada del progenitor y su relación con la variación de tamaño de la
expansión en diferentes células (mosaicismo somático), así como analizar la relación que podría
tener el tamaño progenitor con la severidad y progresión de la enfermedad en los pacientes
estudiados.
RESULTADOS
El proyecto ha estudiado 210 pacientes pertenecientes a 65 familias no emparentadas. En
este grupo de pacientes están representados todos los grados de severidad de la enfermedad,

leve, clásica, pediátrica y congénita.
Utilizando el tamaño del gen heredado del progenitor afectado en lugar del tamaño obtenido
por medio de la hibridación de Southern, se mejora significativamente la capacidad de predecir la
edad de inicio (se explica un 65% de la variación en la edad de inicio) y se puede brindar una
mejor información pronóstica a cada paciente afectado.
Además, el tamaño del gen heredado del progenitor afectado y la edad del paciente,
contribuyen de manera importante al mosaicismo somático, o sea a los niveles de inestabilidad
de esta mutación (estos dos factores explican un 65% de la variación en los niveles de
inestabilidad).
Sin embargo, algunas veces la medida del tamaño del gen heredado del progenitor afectado
puede ser difícil, por lo cual estamos utilizando la SP-PCR para cuantificar los niveles de
inestabilidad en dos momentos diferentes del mismo paciente. En estos momentos tenemos
resultados de un subgrupo de muestras de 60 pacientes en donde hemos estimado el alelo
progenitor en una segunda toma de muestra de sangre, para algunos casos aún después de 10
años del análisis de la primera muestra. En 11 de esos pacientes el tamaño de la mutación
medido en los dos momentos fue diferente, lo que indica que en estos 11 pacientes la dinámica
mutacional es mucho mayor que en los otros 49 pacientes (es decir que la expansión aumenta
más rápidamente). Una tercera toma de muestra en los mismos pacientes, permitiría analizar
como el mosaicismo somático y la dinámica de la mutación DM1 influyen en la capacidad
experimental de medir el alelo progenitor. De igual manera, permitiría confirmar si los factores
que hasta ahora hemos identificado como importantes, son realmente los que están
determinando los niveles de inestabilidad de la mutación en esta enfermedad.

Figura. 3 Del análisis por SP-PCR del ADN de unas 100 células por cada paciente se logra cuantificar los niveles de
inestabilidad de la mutación, permitiendo usar esta información para encontrar la relación entre los niveles de
inestabilidad, la edad de manifestación de los primeros síntomas y progresión de la enfermedad.