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Biotecnología de Plantas
Desafíos<br />
para la expresión de genes introducidos<br />
1. Importancia del promotor y elementos enhancers<br />
2. Hay dos factores principales que determina si los<br />
genes se expresan en el momento y cantidad<br />
adecuadas<br />
a) Un gen debe ser introducido en todas las células<br />
y<br />
ser estabble para la transferencia a su<br />
descendencia:<br />
i. El promotor debe ser reconocido y bien<br />
regulado o siempre activo. . Un promotor fuerte<br />
que se usa de manera rutinario es el promotor<br />
del virus del mosaico de la colifor (CaMV 35S) y<br />
el promotor de la Rubisco, regulada por luz
ii.<br />
Se debe suministrar terminación y señal de<br />
poliadenilación<br />
iii. Se pueden necesitar secuencias que dirija la<br />
proteína a un orgánulo determinado<br />
b) Uso de codones:<br />
i. Los genes necesitan especificar aminoácidos que<br />
coincida con los tRNA y grupos de aminoácidos de<br />
la planta<br />
ii.<br />
Los genes se pueden modificar para que contenga<br />
los codones adecuados (ingeniería de codones)
Dinero que mueve la Ingeniería Genética<br />
• Inversión global estimada alrededor de<br />
20.000 millones de euros<br />
• 2/3 consiste en inversión privada<br />
• Un estudio industrial estimó el mercado<br />
potencial para productos biotecnológicos en<br />
278.000 millones de euros en 2005<br />
Hindmarsh et al. 1998
DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE<br />
DNA RECOMBINANTE<br />
• Aislar genes<br />
• Manipular el diseño<br />
• Integrar el DNA recombinante en las células<br />
de la planta<br />
• regenerar un planta completa
PARA LA MEJORA POR INGENIERÍA GENÉTICA<br />
SE NECESITA.....<br />
1. Conocer los procesos que controlan la característica a<br />
mejorar<br />
2. Identificar especies o variedades que contienen los genes<br />
de interés (cualquier especie)<br />
3. Aislar el gen<br />
4. Organizar el gen para que se exprese en el lugar y modo<br />
adecuado<br />
5. Que la proteína (si la hay) sea funcional<br />
6. Transformar plantas y seleccionar transformantes que<br />
expresen la proteína a niveles suficientes<br />
7. Rezar......
DESARROLLO DE TECNOLOGÍA DE<br />
DNA RECOMBINANTE<br />
• CONFERIR CARACTERÍSTICAS DESEADAS DE MANERA<br />
PRECISA<br />
• CRUZAR BARRERAS DE ESPECIES<br />
• CREAR NUEVAS COMBINACIONES DNA<br />
• INTRODUCIR SÓLO EL GEN DE INTERÉS
Expresar un gen..<br />
PROMOTOR<br />
GEN<br />
TRANSFORMAR PLANTAS
Promotores: regulación<br />
PROMOTOR<br />
RNA polimerasa<br />
PROMOTOR<br />
GEN<br />
transcripción<br />
GEN
Promotores<br />
•Promotores fuertes<br />
GEN<br />
•Promotores débilesd<br />
GEN<br />
•Promotores específicos<br />
de tejidos<br />
GEN
DesarrollosBiotecnológicos<br />
GMOs - Organismos Geneticamente modificados<br />
• GMO - Un organismo que expresa caracteres que resultan<br />
de la introducción de DNA extraño<br />
• También llamado organismo transgénico
Términos importantes<br />
Source: USDA<br />
• Mejora<br />
Gen beneficioso añadido de misma especie<br />
Gen añadido por cruces dentro de especies<br />
• Transformación<br />
Gene beneficioso de otra especie<br />
Gen añadido por ingeniería genetica<br />
Source: USDA
Aclaremos conceptos<br />
• Mejora clásica ≠ Biotecnología<br />
Mejora sólo intercambia genes dentro de especies<br />
Sólo en especies afines<br />
PERO no es lo mismo que biotecnología<br />
• Biotecnología añade características que no son disponibles en<br />
estas especies<br />
Soja no tiene un gen que degrada Roundup<br />
El gen viene de Bacteria
Cruce interespecífico<br />
Wheat<br />
Rye<br />
X<br />
Triticale<br />
Nueva especie, pero NO<br />
un producto<br />
biotecnológico
Biotecnología Vegetal<br />
•Tradicional<br />
Mejora clásica<br />
Recombinante<br />
Técnicas de DNA<br />
http://www.insp.mx/xcongreso/ponencias/5
Los resultados de mejora clásica son<br />
buenos per muy lentos…<br />
cob<br />
corn<br />
teosinte<br />
John Doebley photo<br />
Tomate silvestre<br />
(Lycopersicon pimpinellifolium )<br />
D= 1 cm
www.quirkyworks.com/design/ Samples/plant-breeding.jpg
híbridos<br />
(heterosis)
Mutagénesis: Nuevo caracter sin un nuevo Gen<br />
Mutagénesis cambian la secuencia de un gen<br />
Nuevas, características interesantes se pueden obtener<br />
Gen Normal<br />
susceptible<br />
Tratemiento de Mutagénesis<br />
ATTCGA<br />
Gen resistente<br />
mutante<br />
ATTGGA
El mercado de cosechas biotecnológica está<br />
dominado por cinco Países<br />
63%<br />
43 mha<br />
6%<br />
4 mha 3%<br />
3 mha<br />
21%<br />
14 mha<br />
3%<br />
3 mha<br />
Estos países suponen el 98% del mercado<br />
15 % de incremento en cultivo biotec en 2003<br />
a<br />
2003 growing season data. http://www.isaaa.org/Press_release/Briefs30-2003/press/b30_english.htm
Productos de Biotecnología bacteriano y animal<br />
Source: Chr. Hansen<br />
Biotecnología chymosin<br />
enzyma usado en productos lácteos<br />
gen de levaduras<br />
obtenidos de bacterias GE<br />
reemplaza el enzima del hígado<br />
Source: Rent Mother Nature<br />
bST (aomatotropina bovina)<br />
incrementa la producción de la leche<br />
gen de la vaca<br />
protein harvested from GE bacteria<br />
replaces cow protein originally<br />
harvested from pituitary glands<br />
of slaughtered cows
Cultivo de tejidos de plantas y<br />
aplicaciones<br />
Cultivo de tejido de plantas<br />
Se define como el cultivo de partes de plantas en<br />
condiciones estériles<br />
tales como órganos,<br />
embriones, semillas, , y células<br />
en medio líquido l<br />
o<br />
solidificado<br />
Células diferenciadas se pueden cultivar in vitro para<br />
generar plantas enteras, , con el uso de una<br />
pequeña a cantidad de material<br />
Tejido meristemático<br />
tico (células<br />
en crecimiento) ) se usa<br />
para crecer plantas con flores, y es libre de virus,<br />
aspecto importante en la propagación de plantas
Los pasos básicos b<br />
de cultivo de plantas son:<br />
a) Remover una pieza de tejido de una planta,<br />
denominado un explanto.<br />
b) Coloca un explanto en un medio nutritivo para forzar a<br />
las células<br />
del explando convertirse en indiferenciadas<br />
y formas un callo: Desdiferenciación.<br />
c) El tejido que forma el callo se transfiere a otro medio<br />
nutritivo que permite si diferenciación en un tejido:<br />
Rediferenciación.<br />
d) La planta se transfiere a sustrato.<br />
La capacidad de una célula c<br />
vegetal a producir una planta<br />
completa se llama Totipotencia.
Hay 6 tipos de cultivo in vitro que pueden crear una planta completa:<br />
a) Cutivo de callo – cultivo de un tejido desdiferenciado de un<br />
explanto que se desdiferencia<br />
b) Cultivo celular – cultivo de células<br />
o agregado de células<br />
(pequeño o grupo de células) ) en cultivo líquidol<br />
c) Cultivo de protoplasto – cultivo de células vegetales que<br />
tienen sus paredes celulares quitadas<br />
d) Cultivo de embriones – cultivo de embriones aislados<br />
e) Cultivo de semillas – cultivo de semillas para generar plantas<br />
completas<br />
f) Cultivo de órganos<br />
– Cultivo de órganos<br />
de plantas aislados<br />
como anteras, raíces<br />
ces, tallos, yemas etc.
B. Micropropragación<br />
1. Plantas de interés se clonan a través de un proceso<br />
de cultivo in vitro denominado “propagación n clonal in<br />
vitro” o micropropagación<br />
2. Forma parte de una industria muy importante puesto<br />
que tiene el potencial de crear muchas más plantas a<br />
partir de un material inicial (por ejemplo olivos)
Hay 4 etapas en la micropropagación:<br />
Etapa 1 – Iniciación de un explanto estéril<br />
ril, esterilización de<br />
la superficie del tejido para prevenir contaminación, , y<br />
tranferencia de explantos a un medio nutritivo.<br />
Etapa 2 – Iniciación del tallo, que es la multiplicación del<br />
tejido del tallo a partir de explantos en un segundo tipo<br />
de medio nutritivo.<br />
Etapa 3 – Iniciación de raíz, que es la multiplicación de un<br />
tejido de raíz de explantos en medio nutritivo.<br />
Etapa 4 – Transferencia de las plantas a un medio estéril<br />
u<br />
otro sustrato bajo condiciones controlas para crecer<br />
plantas completas.
Nutrientes como vitaminas, sacarosa, , y hormonas vegetales pueden<br />
controlar el cultivo del tejido. Por ejemplo alterando las cantidades de<br />
las hormonas auxinas y citoquinicas induce multiples tallos para formar<br />
un cultivo.
Embriones somáticos<br />
(embriogénesis somática<br />
tica)<br />
a) Produce estructura embrion-like<br />
llamados embrioides de tejidos de<br />
plantas.<br />
b) Hormonas como auxinas afecta el desarrollo normal y forma embrioides<br />
de tejidos “normales”.<br />
c) Los callos también se pueden usar, cambiando las hormonas para inducir<br />
la formación de embriones, , y cada embrioide puede formar una nueva<br />
planta.<br />
d) También se pueden producir en cultivo líquidol<br />
quido, usando célulasc<br />
individuales o tejido de plantas:<br />
i. Las paredes celulares se degradan con enzimas para formar<br />
protoplastos.<br />
ii.<br />
Se regenera la pared celular, comienza la división celular, , y se forma<br />
agragaciones celulares.<br />
iii.<br />
Las agragaciones celulares se cultivan en un medio sólido s<br />
para formar<br />
tallos y raíces<br />
ces.<br />
e) Este es el método preferido para produccióna gran escala, usando<br />
bioreactores para producir millones de embrioides.<br />
f) Embrioides también se pueden empaquetar como semillas artificiales, que<br />
se encapsulan para la distribución y se protegen con un complejo de agar<br />
y otros geles.
Productos químicos<br />
de plantas<br />
a) Metabolitos primarios y secundarios son útiles<br />
para las<br />
plantas para funcionar como protección de mamíferos<br />
feros,<br />
insectos, , y patógenos<br />
genos. Muchos de estos compuestos son<br />
usados en medicina y alimentación.<br />
b) Más s del 25% de los productos farmacéuticos<br />
en Europa<br />
vienen de plantas y el 75% de la población mundial dependen<br />
de medicina obtenida de hierbas<br />
c) En muchos casos el desarrollo de una droga comienza con la<br />
identificación de una hierba medicinal ampliamente usada<br />
normalmente por indígenas<br />
genas. . Es compuesto químico<br />
(principio<br />
activo) ) es aislado, sintetizado químicamente<br />
y testado en<br />
ensayos clínicos<br />
nicos.
Cultivo celular:<br />
i. Produce compuestos químicos<br />
sin la necesidad de usar<br />
plantas tropicales y subtropicales para crecer plantas<br />
completas, que pueden dañar<br />
ar el medio ambiente<br />
ii.<br />
Puede producir mayoras cantidades de metabolitos que<br />
plantas completas en condiciones controladas como un<br />
bioreactor<br />
iii.<br />
Shikonina, , un producto químico que se usa en muchas<br />
cremas, cosmétidos<br />
y tintes se ha producido en grandes<br />
bioreactores que producen entre 1.5 y 4.0 gramos de<br />
shikonina por litro de cultivo<br />
iv.<br />
Muchos procesos de producción n requieren mucho tiempo<br />
(hasta<br />
10 años) ) y costa mucho desarrollar, por lo tanto las<br />
ventas deben amortizar los costes<br />
v. Los genes se pueden introducir en plantas de manera que<br />
permita a las células<br />
de plantas producir metabolitos qye no<br />
producen normalmente<br />
vi.<br />
Puede ser perjudicial para países<br />
en desarrollo, que se<br />
basa en la extracción de metabolitos de plantas en lugar<br />
que producirlos
Otros usos del cultivo de tejido<br />
1. Fusion de protoplastos<br />
a) Protoplastos se generan por digestión n de la<br />
pared celular<br />
b) Dos protoplastos de dos especies no<br />
relacionadas se fusionan por productos<br />
químicos<br />
o electroporación<br />
c) El material genético<br />
se mezcla junto, , y las<br />
células híbridas h<br />
se criban buscando<br />
caracteres de interés
Variación n somaclonal<br />
a) La variabilidad genética producida por cultivo de tejidos. Esta<br />
variabilidad puede ser explotada para mejora características<br />
de cosechas y plantas ornamentales, , tales como maíz, trigo,<br />
cebada, , y patata<br />
b) Caracteres tales como tolerancia a sal y metales pesados,<br />
resistencia a insectos, , y mejora de la calidad de semilla se<br />
puede generar por un proceso de selección<br />
c) La variabilidad genética<br />
se produce por cambios en el<br />
número cromosómico mico debido a reorganizaciones<br />
cromosómicas<br />
micas, amplificación n génicag<br />
nica, , y la activación de<br />
transposones. . Como resultado, , planta hijas difieren de<br />
parentales. . El manteniemiento de caracteres deseables es<br />
esencial
Colecciones de Germoplasma<br />
a) El material genético<br />
de una planta, que puede contener<br />
características importantes e incrementar el valor de una<br />
planta, como resultado de mayor tolerancia a sequía y plagas<br />
b) Germoplasma antiguo se usa para introducir nuevos<br />
caracteres tales como resistencia a enfermedades en plantas<br />
actuales<br />
c) El germoplasma va desapareciendo debido a la perdida de<br />
cultivo tradicional, eliminaciónd<br />
nd de viejos cultivos, , y el uso de<br />
plantas modernas en lugar de plantas antiguas<br />
d) Banco de genes
Introducir genes en plantas<br />
1) Infectar células de plntas con plásmidos como<br />
vectores que llevan el gen de interés<br />
2) Disparar balas microscópicas que contienen en su<br />
superficie el gen directamente a la célula
Ingeniería a genética<br />
de plantas<br />
Transformación de plantas y Agrobacterium tumefaciens.<br />
1. Una bactería común de suelo que causa tumor en<br />
agalla<br />
2. La bacteria entra por lugares donde la planta ha sido<br />
dañada<br />
ada<br />
3. La bacteria tiene un plásmido llamado “plasmido<br />
Ti”<br />
que contiene genes llamados “genes<br />
vir (virulencia)”<br />
que codifica una proteína que transfiere una región<br />
del plásmido llamado “T-DNA” a células donde se pa<br />
producido el daño<br />
4. Una vez que las células vegetales son infectadas,<br />
las hormonas vegetales estumula el crecimiento de<br />
las células tumorales
5. El T-DNA ha sido construido de manera que tiene los<br />
genes vir eliminados, , de manera que el DNA extraño<br />
puede ser insertado en genoma de plantas,<br />
transformando la misma<br />
6. Un método<br />
de transformación general:<br />
a) Células<br />
de un disco de hoja, plántulas<br />
ntulas, , o yemas, , y<br />
protoplastos reciben el DNA y las células crecen<br />
b) Se usa un medio de selección de aquellas célulasc<br />
con el nuevo caracter<br />
c) Las células transformadas se cultivan en un medio<br />
sólido<br />
para formar un callo<br />
d) Las hormonas son modificadas para promover la<br />
formación de tallos y raíces<br />
e) Se examinan las plantas modificadas para determinar<br />
si se expresa el gen introducido
5. El T-DNA ha sido construido de manera que tiene los<br />
genes vir eliminados, , de manera que el DNA extraño<br />
puede ser insertado en genoma de plantas,<br />
transformando la misma<br />
6. Un método<br />
de transformación general:<br />
a) Células<br />
de un disco de hoja, plántulas<br />
ntulas, , o yemas, , y<br />
protoplastos reciben el DNA y las células crecen<br />
b) Se usa un medio de selección de aquellas célulasc<br />
con el nuevo caracter<br />
c) Las células transformadas se cultivan en un medio<br />
sólido<br />
para formar un callo<br />
d) Las hormonas son modificadas para promover la<br />
formación de tallos y raíces<br />
e) Se examinan las plantas modificadas para determinar<br />
si se expresa el gen introducido
El ingeniero de la naturaleza:<br />
Agrobacterium tumefaciens
Ingenería genética de plantas con<br />
Agrobacterium tumefaciens<br />
• A. tumefaciens: usado<br />
rutinariamente.<br />
• Contiene T-DNA<br />
(plásmido bacteriano)<br />
• Los genes se integran en<br />
el DNA bacteriano<br />
cuando se transfiere el T-<br />
DNA<br />
Inducción del tumor<br />
por A. tumefaciens
El tumor de A.tumefaciens puede ser<br />
grandecito…
Biología de A. tumefaciens<br />
Bién conocido que produce el tumor de agalla<br />
A.tumefaciens es una<br />
bacteria que vive en el<br />
suelo (en la rizosfera)<br />
donde usa nutrientes que<br />
provienen de las raíces<br />
Infecta a través de heridas<br />
son atraídas<br />
quimiostáticamente a ellas<br />
www-genvagar.slu.se/teknik/ djup/plasm.htm<br />
T-plasmido bacteriano produce<br />
receptores para actosiringona<br />
Daño en plantas produce<br />
acetosiringone
Las bases de ingeniería genética<br />
mediada por Agrobacterium<br />
• T-DNA de A. tumefaciens se excinde e integra en el<br />
genoma de plantas como parte de una infección natura<br />
• Cualquier DNA insertado en el T-DNA será también<br />
integrado
Genes importantes condificados por<br />
1. Citoquininas<br />
(hormona vegetal esencial en división celular y crecimiento<br />
tumoral)<br />
2. Enzimas para la síntesis de ácido indolacético (auxina)<br />
Hormona vegetal (induce elongación de tallo y hoja, induce partenocarpia y previene<br />
envejecimiento)<br />
3. Enzimas implicadas en síntesis y liberación de metabolitos<br />
de plantas: las opinas<br />
(derivados de aminoácidos)<br />
las grocinopinas (derivados fosforilados de azúcares)<br />
Nopaline<br />
el plásmido Ti<br />
Opinas y agrocinopinas son NUTRIENTES de A.tumefacies.<br />
No puden ser usados por otras especies bacterianas<br />
Proporciona un nicho único para A .tumefaciens
Cytoquininas son hormonas vegetales<br />
derivadas de la purina adenina<br />
Expresión específica celular de citoquinica<br />
en célula infectada por A.tumefaciens<br />
Zeatina es una de de las citoquininas cuya<br />
síntesis puede ser codificada por el<br />
plásmido Ti<br />
Aislada del maíz
Opinas son nutrientes que se usan para<br />
detectarse entre bacterias<br />
Las células de plantas comienzan a secretar<br />
Las opinas<br />
del T-DNA bacteriano transferido<br />
opina difunde en células de alrededor y<br />
sirve como moléculas señal para la<br />
conjugación de Agrobacterium<br />
(Quorum sensing)
Plásmido Ti<br />
Región<br />
T-DNA<br />
Genes que<br />
producen<br />
tumor<br />
DNA entre bordes<br />
L y R es<br />
Transferido a una<br />
planta como<br />
ssDNA<br />
Region<br />
Vir (virulencia)<br />
Catabolismo de Opinas<br />
ORI<br />
Genes codificados<br />
por el T-DNA se<br />
pueden sustituir<br />
por otros genes
Vectores basados en plásmidos<br />
Ti<br />
Sistemas binarios<br />
Necesita 2 vectores:<br />
Vectores co-integrativos<br />
Necesita 3 vectores<br />
Plásmido Ti desarmado<br />
Con gen de interés<br />
(sin genes vir)<br />
Vector helper<br />
para infección<br />
(con genes vir)<br />
Forma<br />
plásmido co-integrado<br />
después de<br />
recombinación<br />
homóloga sobre T-DNA<br />
Plámido con el Ti desarmado<br />
capáz de infectar<br />
Vector intermedio<br />
Con región T-DNA y el gen<br />
de interés<br />
(trasferido por conjugación)<br />
Vector helper Para<br />
trasferencia del plásmido<br />
intermedio al Agro
Vectores co-integrativos<br />
(plásmido ti híbridos)<br />
Ráramente<br />
usados<br />
DESVENTAJAS:<br />
1) Se requiere mucha homología entre plásmido Ti y plásmido de E. coli (vectores<br />
intermedios basados en pBR322) lo que hace que sean dificil de construir y usar<br />
2) Transferencia ineficiente comparados con vectores binarios
Vectores binarios<br />
Gen de interés<br />
Región T DNA eliminada<br />
Marcador de selección<br />
en planta<br />
Marcador de selección<br />
en bacteria<br />
Disarmed<br />
Ti<br />
plasmid<br />
Región de<br />
Virulencia<br />
Plásmido<br />
HELPER<br />
ori para E.coli<br />
ori para A. tumefaciens<br />
ori para Agro<br />
DESVENTAJA: Según la orientación, los plásmidos con dos orígenes de replicación<br />
pueden ser inestables en E. coli<br />
VENTAJA: Se usan vectores pequeños, lo que incrementa la eficiencia de transferencia<br />
de E. coli a Agrobacterium.<br />
No se requiere recombinación intermolecular
Promotores usados para la expresión<br />
en plantas transgénicas<br />
35S, promotor del virus del mosaico de la coliflor CaMV<br />
CaMV es un genoma circular de doble<br />
cadena dsDNA<br />
CaMV 35S es un promotor muy fuerte<br />
(constitutivo o ectópico) que es activo en la<br />
mayoría de tejidos de dicotiledoneas
Pasos en la creación de una planta transgénica<br />
1. Los dos plásmidos se transfieren a Agrobacterium<br />
2. Un cultivo vegetal se infecta con el Agro<br />
3. Productos de los genes Vir escinden el T-DNA y lo transfieren<br />
al cromosoma de la planta<br />
L-Border<br />
Polilinker<br />
Gen de resistencia a Kan<br />
R-Border<br />
Gen de interés<br />
4. Selección de células transformadas en Kan<br />
5. Confirmar la presencia del transgen por PCR<br />
6. Una planta completa se puede crecer de células<br />
transformadas !!!
Callo<br />
Tejidos especializados de plantas<br />
que se forman en una herida; se<br />
forma un cambiun para sellar la<br />
herida de manera progresiva<br />
Células del Callo<br />
Son las má fáciles de transformar<br />
(sus paredes son muy delgadas)<br />
Protoplastos (sin paredes<br />
celulares son más fáciles de<br />
transformar, pero es más deficil de<br />
obtener una planta completa
Los callos se producen por manipulación de<br />
concentraciones externas de hormonas vegetales<br />
Hormonas vegetales fundamentales<br />
Auxinas<br />
Auxina natural es el ácido indolacético (IAA)<br />
Citoquininas<br />
Relacionadas estructuralmente a<br />
la adenina<br />
Meristemo apical es el sitio principal<br />
de síntesis de auxinas<br />
Producida por tejidos de crecimiento<br />
activo, especialmente raíces,<br />
embriones y frutos<br />
auxina < CITOQUININA TALLOS<br />
AUXINA > citoquinina RAÍCES<br />
auxinA = citoquinina callo indiferenciado
Producir callo transformar callo <br />
estimular tallo por adición de citoquinina<br />
+ citoquinina<br />
Procedimento fácil<br />
(según especie) para<br />
dicotiledóneas<br />
Biology of Plants, Raven et. al., Freeman Worth Publishing, 1999
Monocots no son fáciles de manejar –<br />
callo es difícil de iniciar, callus A.tumefaciens no es<br />
una bacteria patogénica para monocots<br />
1. Se elimina el pericarpo y se obtienen embriones<br />
inmaduros (0.5 - 1.0 mm)<br />
2. Los embriones inmaduros<br />
se colocan en un medio de<br />
inducción de callos<br />
La transfomación se<br />
realiza con una pistola<br />
de genes<br />
Medio muy osmótico<br />
prepara el callo para<br />
transformación
DNA con el gen de interés y resistencia a antibiótico<br />
cubre partículas de oro<br />
Los callos se<br />
colocan en una<br />
cámara de vacío, la<br />
presión de Helio<br />
dispara el DNA<br />
hacia las células<br />
Arma de genes<br />
Partículas de oro<br />
recubiertas con el<br />
DNA<br />
Los callos se dejan<br />
en medios con alto<br />
osmótico durante<br />
20 horas después<br />
del disparo<br />
Cámara de vacío<br />
plantsciences.montana.edu/ .../transform1.htm
3. Bombardeo de partículas usando una pistola de genes que usa Helio<br />
Gas de Helio<br />
Metodología<br />
Discos de<br />
ruptura<br />
macroprojectiles<br />
Célula vegetal<br />
Partículas recubiertas<br />
con el DNA<br />
1. Bombardeo de células con partículas de oro<br />
2. Detectar actividad con proteínas marcadoras<br />
- No requiere cultivos celulares o pretratamiento de cultivos<br />
- Es la que se emplea normalmente para la transformación de monocots
Después del disparo los callos se sitúan en un medio<br />
de selección por varias semanas<br />
Los callos se transfieren a medio para inducir la<br />
producción de tallos<br />
Despúes de inducir pequellos tallos se<br />
transfieren a a contenedores con medio que<br />
induce la foramación de raíces
Las pequeñas plantas se transplanta a suelo y<br />
se aclimatan bajo condiciones de alta humedad<br />
Con los procedimientos actuales solo entre un 10-20% de las plantas<br />
actuales son trangénicas,y por tanto se deben comprobar en la expresión<br />
del transgen
4. Electroporación<br />
metodología<br />
Optimización n de mutiples variables<br />
Desidad de protoplasto<br />
2 x 10 6 mL -1<br />
Concentración plásmido<br />
200µg/mL<br />
Eliminaciónd de<br />
paredes celulares no<br />
siempre necesario<br />
1.5 kV<br />
Tamaño plásmido<br />
3-6 Kb<br />
Concentración de iones<br />
KCl 125 mM<br />
Examinar células para la actividad de transgen<br />
(por ejemplo expresión GUS)
Gen reportador – gen cuya expresión es fácil de<br />
observar. Usada para “reportar” la expresión del gen<br />
- regulación y localización<br />
http://home.ust.hk/~rocklab/dc3gus/<br />
ABA-inducible expression<br />
• gen GUS (uidA)<br />
X-Glc<br />
Ácido 5-bromo-4-cloro-3-inolil<br />
-β-D-glucurónico<br />
β-glucuronidasa<br />
Precipitado azul<br />
Guard cells<br />
Roots<br />
•Proteína fluorescente verde (GFP)<br />
Proteína de la medusa Aequorea victoria.<br />
GFP se produce en muchos organismos heterólogos<br />
Muchas variantes disponibles comercialmente (proteína fluorescente<br />
roja)<br />
• Gen de la kuciferasa (luc)<br />
A. thaliana C24 wild type (left)<br />
35S-mgfp4-ER transformed (right)<br />
Aequorea victoria<br />
La mosca de fuego de norte américa libera luz verde durante la oxidación del sustrato luciferina<br />
Cámaras CCD pueden detectar bioluminiscencia en tiempo real