Caracterización Molecular de Razas Patogénicas de Fusarium ...

Universidad de Córdoba
Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC
Caracterización Molecular de Razas
Patogénicas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
y Análisis de su Diversidad Genética
Doctorando: María del Mar Jiménez Gasco
Directores: Prof. Rafael M. Jiménez Díaz
Dra. Encarnación Pérez Artés
Córdoba, Diciembre de 2001

Universidad de Córdoba
Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC
Caracterización Molecular de Razas
Patogénicas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
y Análisis de su Diversidad Genética
Memoria presentada para optar al Grado de Doctor por la
Universidad de Córdoba, por la Ingeniero Agrónomo:
María del Mar Jiménez Gasco
V. B:
Los Directores de la Tesis
Prof. Rafael M. Jiménez Díaz Dra. Encarnación Pérez Artés
Catedrático de Patología Vegetal Científico Titular
Universidad de Córdoba IAS-CSIC
Córdoba, 2001

D. Rafael M. Jiménez Díaz, Catedrático de Patología Vegetal de la
Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes de la
Universidad de Córdoba, y Dña. Encarnación Pérez Artés, Científico
Titular del Instituto de Agricultura Sostenible del CSIC;
Co-directores de la Tesis Doctoral titulada ‘Caracterización molecular
de razas patogénicas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y análisis
de su diversidad genética’, realizada por al Ingeniero Agrónomo Dña.
María del Mar Jiménez Gasco,
Certifican: Que la mencionada Tesis Doctoral ha sido realizada bajo
nuestra dirección en los laboratorios e instalaciones del
Instituto de Agricultura Sostenible, y se encuentra finalizada
para ser presentada y defendida públicamente en la
Universidad de Córdoba.
Córdoba, 16 de Octubre de 2001
Prof. Rafael M. Jiménez Díaz Dra. Encarnación Pérez Artés
Catedrático de Patología Vegetal Científico Titular, IAS-CSIC

D. Luis López Bellido, Catedrático de Producción Vegetal y Director del
Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales de la
Universidad de Córdoba,
Informa: Que el Consejo de Departamento, en su reunión del 17 de
Octubre de 2001 ha acordado que la Tesis Doctoral presentada
por Dña. María del Mar Jiménez Gasco, con el título
‘Caracterización molecular de razas patogénicas de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y análisis de su
diversidad genética’ y realizada bajo la dirección de D. Rafael
M. Jiménez Díaz y Dña. Encarnación Pérez Artés, reúne las
características necesarias para su lectura y defensa.
Córdoba, 17 de Octubre de 2001
D. Luis López Bellido
Catedrático de Producción Vegetal

Este Trabajo ha sido realizado en el Instituto de Agricultura Sostenible,
Córdoba, gracias a la concesión de una Beca de Formación de Personal
Investigador (FPI-MEC), y ha sido financiado por los Proyectos de
Investigación AGRE-CT91-0051, CICYT OLI96-2131 y CICYT AGF98-
0872.

Biografía
María del Mar Jiménez Gasco nació en Logroño, La Rioja, en 1972.
En Septiembre de 1990 inició sus estudios de Ingeniero Agrónomo en
la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes de la
Universidad de Córdoba, obteniendo su Título en Mayo de 1997 al
presentar el Trabajo Profesional Fin de Carrera titulado ‘Caracterización de
razas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris mediante RAPD-PCR’, con la
calificación máxima de Sobresaliente.
En al Curso Académico 1993/94 realizó una estancia de seis meses
como estudiante ERASMUS en la Universidad de Wageningen, Holanda,
durante la cual participó en Investigaciones en el Departamento de
Nematología. Durante 1996 disfrutó de una Beca de ‘Introducción a la
Investigación’ concedida por el Consejo Superior de Investigaciones
Científicas, a desarrollar en el Instituto de Agricultura Sostenible en
Córdoba.
Desde Septiembre de 1997 a Septiembre de 2001 ha disfrutado de una
Beca de Formación de Personal Investigador (FPI-MEC) en el
Departamento de Protección de Cultivos del Instituto de Agricultura
Sostenible. Las Investigaciones realizadas durante estos años han dado
lugar a participación en Congresos nacionales e internacionales, así como a
dos publicaciones en revistas incluidas en SCI (‘European Journal of Plant
Pathology’, y ‘Plant Pathology’). Además, durante estos años ha realizado
varias estancias en Centros de Investigación extranjeros (1997, King’s
College of London, Universidad de Londres; 1998, 1999, y 2000,
Departamento de Patología Vegetal de la Universidad de Cornell, NY,
EEUU).

A mi Madre, a mi Familia, a Vagelis

Agradecimientos
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a los Directores de esta
Tesis Doctoral por su inestimable ayuda en el desarrollo experimental de la
Investigación, así como durante la realización de este documento.
Gracias a mis compañeros del Departamento de Protección de Cultivos
del IAS, en especial a Susana Carrasco, Pablo Castillo, Juan Antonio
Navas, y Blanca B. Landa, por estar siempre dispuestos a ayudarme, por
sus consejos en todo momento, por las charlas del café.
Gracias al Prof. Michael G. Milgroom por acogerme en su laboratorio
del Departamento de Patología Vegetal de la Universidad de Cornell, por
haber sido como un Director más, por las charlas científicas de los viernes
por la tarde que tanto me han servido, por su entusiasmo y por
escucharme. Gracias a tantos amigos de allí, en especial a Isabel Cristina
McGuire, por mostrarme la preciosa Ithaca y por tantos consejos.
Gracias a mis compañeros de laboratorio, en especial a Susana
Carrasco, Gema Contreras y Antonio Valverde, por las risas, por su apoyo
técnico y por haberme prestado esa tercera mano en tantos momentos.
Gracias a todos mis amigos, en especial a Naty y a Carmen, por intentar
sacarme del laboratorio a una hora razonable.
Gracias a Rocío, mi hermana, por mostrarme siempre tanto amor, y
ayudarme tanto con la bibliografía...., a Rafa, a Rodrigo, y a toda mi familia,
en especial a mi madre.
Gracias a la persona que más confía en mí, que más me ha guiado, me
ha enseñado, más entusiasmo me ha transmitido, mi Director, mi
maestro....mi padre.
And last but not least, thank you Vagelis, for helping me out with my
poor self-confidence, and for always telling me that I am ‘the best’.

Resumen
Resumen
La Fusariosis Vascular del garbanzo (Cicer arietinum L.), una de las
enfermedades más importantes y limitantes de este cultivo en el mundo, es
causada por Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr. f. sp. ciceris (Padwick)
Matuo & K. Sato, un hongo anamórfico capaz de persistir
prolongadamente en el suelo. El método más práctico y económico de
lucha contra esta enfermedad es la utilización de cultivares de garbanzo
resistentes. Sin embargo, la eficiencia de éstos es amenazada por la
existencia de razas patogénicas del agente (razas 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y
6), que constituyen dos patotipos, denominados Amarillez (razas 0 y 1B/C)
y Marchitez (razas 1A a 6) en razón del síndrome que causan en la planta
huésped. La utilización eficiente de cultivares resistentes requiere
información previa y precisa sobre las razas del patógeno que prevalecen
en las distintas áreas de cultivo, cuya identificación y caracterización
mediante pruebas de patogenicidad es laboriosa y costosa en material,
espacio, y tiempo, y no es informativa sobre la relación y diversidad
genética existente entre y dentro de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris.
Todo ello hace necesario que se investiguen procedimientos nuevos y
alternativos basadas en las técnicas moleculares disponibles, para la
detección e identificación rápida, precisa, consistente y fiable del patógeno
y de sus razas patogénicas. Los objetivos de esta Tesis Doctoral han sido
desarrollar un método, basado en secuencias de ADN polimórfico, que
permita la identificación de F. oxysporum f. sp. ciceris y de sus razas
patogénicas mediante PCR específica, y el análisis de la variabilidad
genética y de la relación evolutiva existente entre las distintas razas del
patógeno.
La disponibilidad de marcadores moleculares de las razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris basados en ADN polimórfico se investigó mediante
análisis RAPD-PCR de 99 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
representativos de las diferentes razas y orígenes geográficos del patógeno.
i

Resumen
De un total de 40 iniciadores de secuencia arbitraria estudiados, cinco
(OPI-09, OPI-18, OPF-06, OPF-10, y OPF-12) amplificaron fragmentos
RAPD asociados a F. oxysporum f. sp. ciceris, así como a las razas 0, 1B/C, 5,
y 6 del patógeno. La aplicabilidad, reproducibilidad, consistencia y
fiabilidad diagnóstica de dichos fragmentos de ADN fue confirmada
mediante ‘experimentos ciegos’ de naturaleza biológica y molecular. El
análisis UPGMA de los perfiles RAPD mostró que existe una alta
similaridad genética entre los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris, y agrupó
a éstos en ‘clusters’ que estuvieron correlacionados con el patotipo de
Amarillez o de Marchitez a la que pertenecen. Los aislados del patotipo de
Amarillez constituyeron un grupo distintivo que incluye a los aislados de
las razas 0 y 1B/C; mientras que los aislados de Marchitez se ubicaron en
otro gran ‘cluster’ que agrupa a los aislados de las razas 1A, 2, 3, 4, 5, y 6.
Posteriormente, a partir de secuencias SCAR (‘Sequence Characterized
Amplified Region’) procedentes de los fragmentos RAPD marcadores
raciales inicialmente identificados, se diseñaron iniciadores para PCR
específica. Para ello, dichos fragmentos RAPD se clonaron y secuenciaron,
y de las secuencias extremas de los fragmentos clonados se diseñaron los
iniciadores de forma que contuviesen parte del iniciador aleatorio RAPD
que los originó. Estos iniciadores se utilizaron para amplificar ADN de
aislados representativos de todas las razas patogénicas de F. oxysporum f. sp.
ciceris y de un amplio rango geográfico del patógeno. De esta manera, se
han diseñado cinco parejas de iniciadores para reacciones PCR específicas
que permiten discriminar inequívocamente a aislados de F. oxysporum f. sp.
ciceris de: (a) aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo; (b)
aislados pertenecientes a otras formae speciales de F. oxysporum; y (c) otras
especies de Fusarium. Además, mediante análisis PCR específica utilizando
los iniciadores ‘ad hoc’ ha sido posible diferenciar entre sí a los aislados de
cada una de las razas 0, 1A, 5, y 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris, así como a
éstos de otros aislados pertenecientes a otras razas del patógeno.
La diversidad fenotípica y geográfica observada en el patógeno condujo
a plantear la hipótesis nula de un origen monofilético en F. oxysporum f. sp.
ciceris. Dicha hipótesis se contrastó mediante la extensión y naturaleza de la
variación existente en las secuencias de intrones de varios genes
ii

Resumen
conservados [factor de traducción y elongación 1α (EF1α), β-tubulina,
histona 3, actina, y calmodulina] en aislados representativos de seis, 0, 1A,
1B/C, 4, 5, y 6, de las ocho razas patogénicas descritas. Los resultados
mostraron que a pesar de la diversidad entre los aislados de este patógeno
en cuanto su distribución geográfica, síndrome que inducen en la planta
susceptible, y la patogenicidad cultivar-específica, todos poseen secuencias
idénticas en los intrones de los cinco genes analizados. Adicionalmente, se
desarrollaron secuencias del gen EF1α de un total de 17 aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris, y de tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo. El análisis PAUP (‘Phylogenetic Analysis Using Parsimony’) de
dichas secuencias y de las de 24 aislados representativos de otras 11 formae
speciales de F. oxysporum obtenidas de GenBank, agrupó a los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris de forma distintiva respecto al resto de los aislados,
demostrando así su origen monofilético.
La variabilidad genética entre aislados de una misma raza, y entre
distintas razas de F. oxysporum f. sp. ciceris, así como la posible relación
evolutiva entre ellas, se investigó mediante análisis de ‘fingerprints’ de
ADN generados con sondas de hibridación (FocB10, FocO2 y FocP18).
Estas sondas se componen de ADN repetitivo identificado en el genoma
de F. oxysporum f. sp. ciceris en el curso de esta Tesis, y sus secuencias de
ADN presentan similaridad con elementos transponibles citados en la
literatura fitopatológica. En particular, la secuencia de FocB10 presentó un
80% de similaridad con el transposón Fot1 identificado en F. oxysporum f.
sp. melonis. El análisis de ‘fingerprints’ de ADN ha puesto de manifiesto
que los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris presentan perfiles altamente
correlacionados tanto con el síndrome que inducen en la planta huésped (i.
e., patotipos de Amarillez y de Marchitez), como con su patogenicidad
diferencial sobre líneas diferenciadoras de garbanzo (i. e., razas
patogénicas). Tanto el análisis fenético de la similaridad (UPGMA) entre
‘fingerprints’ de ADN, como su análisis cladístico (PAUP), distribuyeron a
los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris en dos grupos que corresponden,
respectivamente, a los patotipos de Amarillez y de Marchitez. Además, el
grupo correspondiente al patotipo de Amarillez se compone de dos
subgrupos en los que se incluyen los aislados de las razas 0 y 1B/C,
iii

Resumen
respectivamente. De igual manera, los aislados del patotipo de Marchitez
se distribuyeron en varios grupos que corresponden, respectivamente, a las
razas 1A/6, raza 5, y al grupo de razas 2, 3, y 4, estas últimas descritas
únicamente en la India. El análisis filogenético de los ‘fingerprints’ de
ADN mostró que los aislados de la raza 5 se encuentran más cercanos
evolutivamente a las razas 2, 3, y 4 que al resto de las razas presentes en la
Cuenca Mediterránea (razas 1A y 6). Aunque la raza 5 y las razas 2, 3, y 4
se encuentran geográficamente separadas entre sí, son las más similares en
cuanto a su virulencia sobre líneas diferenciadores.
Se ha desarrollado un método del análisis del ADN genómico de F.
oxysporum f. sp. ciceris, basado en rep-PCR, alternativo a las hibridaciones
tipo ‘Southern’ para generar ‘fingerprints’ de ADN. Para ello, hemos
diseñado una pareja de iniciadores que amplifican las regiones de ADN
existentes entre las copias del elemento repetitivo FocB10 dispersas en el
genoma de F. oxysporum f. sp. ciceris. Mediante el análisis rep-PCR se
generaron patrones de amplificación que resultaron válidos para
discriminar entre las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris. Además, el análisis
UPGMA de los datos generados mediante este análisis puso de manifiesto
que la información generada es equivalente a la proporcionada por
hibridaciones ‘Southern’ obtenidas con el propio elemento repetitivo. En
consecuencia, la metodología rep-PCR desarrollada supone una
herramienta muy adecuada para el estudio de diversidad genética en las
poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris.
Finalmente, nuestra hipótesis evolutiva en F. oxysporum f. sp. ciceris es
que sus aislados derivan de una población inicial fundadora pequeña
(posiblemente un único individuo) que adquirió patogenicidad sobre Cicer
spp. Además, la subsiguiente diversificación del patógeno en patotipos y
razas patogénicas ha podido ser el resultado de la acumulación de
pequeños cambios genéticos, que refleja una larga historia de asociación
con su planta huésped, el garbanzo, como especie cultivada. También
postulamos que en F. oxysporum f. sp. ciceris unas razas se han originado a
partir de otras, y que el avance evolutivo de las razas patogénicas va unido
a una mayor virulencia de éstas sobre un conjunto de líneas
diferenciadoras raciales. Así, la raza 0 es la menos virulenta de todas las
iv

Resumen
razas, y la más antigua de ellas en razón de la mayor diversidad genética
que presenta. Por el contrario, la raza 5 es la más virulenta de las razas
identificadas hasta ahora en la Cuenca Mediterránea, la que menor
diversidad genética posee, y a la que por tanto correspondería un origen
evolutivo más reciente.
v

Summary
Summary
Fusarium wilt of chickpea (Cicer arietinum L.), caused by Fusarium oxysporum
Schlechtend.: Fr. f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato, is one of the
most important diseases and limiting factors of chickpea production
worldwide. The pathogen is an anamorphic fungus which can survive in
soil for long time. The most practical and cost-efficient method for
control of the disease is the use of resistant cultivars, which efficiency is
curtailed by the occurrence of pathogenic races. Eight pathogenic races
designated races 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, and 6 have been identified, which
can be classified into two pathotypes, yellowing (races 0 and 1B/C) and
wilting (races 1A through 6), according to the disease syndrome that they
induce in the plant. Characterization of pathogenic races and pathotypes in
F. oxysporum f. sp. ciceris prevailing within a region is a key factor for the
efficient use of resistant cultivars in the management of the disease.
Characterization of pathogenic strains by means of biological pathotyping
is costly in time, space, and resources and it is not informative of the
genetic diversity and relationship existing among and within races and
pathotypes. Therefore, there is a need of new, more informative methods
for the rapid, consistent and reproducible identification of the pathogen
races. These new methods can be based on recently developed molecular
biology techniques. The objectives of this Doctoral Dissertation were to
develop a method based on sequences of polymorphic DNA of use for
the identification of F. oxysporum f. sp. ciceris and characterization of its
pathogenic races by means of specific PCR, and to analyze the genetic
variability and evolutionary relationship that might exist among races of
the pathogen.
Molecular markers of F. oxysporum f. sp. ciceris races were first
investigated by RAPD-PCR analysis using 40 arbitrary primers and 99
isolates of the pathogen representatives of the eight races and of disease
geographical range. Five (OPI-09, OPI-18, OPF-06, OPF-10, and OPF-
12) out of the 40 primers produced RAPD amplicons associated with F.
vii

Summary
oxysporum f. sp. ciceris and with races 0, 1B/C, 5, and 6. Practicability,
reproducibility, and fiability of these markers for diagnosis of the pathogen
were confirmed by biological and molecular ‘blind trials’. UPGMA analysis
of RAPD profiles showed a high genetic similarity among F. oxysporum f.
sp. ciceris isolates, and grouped them in clusters that were correlated to
Yellowing or Wilting pathotypes. Isolates belonging to the Yellowing
pathotype formed a distinct cluster that included races 0 and 1B/C; while
isolates belonging to the Wilting pathotype formed another cluster that
included races 1A through 6. Sequence characterized amplified regions
(SCARs) from the RAPD-race markers identified served for the design of
primers for specific PCR. To this aim, the amplified RAPD fragments
were cloned and sequenced, and primers were designed from both ends of
the fragment sequence that contained part of the RAPD primer which
originated the marker. The new primers designed were used for specific
PCR analyses using F. oxysporum f. sp. ciceris isolates representatives of all
pathogenic races and of diverse geographical origin. Five primer pairs for
specific PCR were designed that allow consistent and reproducible
discrimination of F. oxysporum f. sp. ciceris isolates from: a) F. oxysporum
isolates nonpathogenic to chickpea; b) isolates of other F. oxysporum formae
speciales; and c) isolates of other Fusarium spp. In addition, these specific
PCR analyses using primers ‘ad hoc’ made it possible to differentiate
among isolates o races 0, 1A, 5, and 6 of F. oxysporum f. sp. ciceris.
The observed phenotypic and geographical diversity in F. oxysporum f.
sp. ciceris suggested the null hypothesis that this pathogen is of
monophyletic origin. This hypothesis was addressed by analyzing the
extent and nature of intron sequence variation existing in the following
conserved genes: elongation translation factor 1α (EF1α), β-tubulin,
histone 3, actin and calmodulin, among isolates representative of races 0,
1A, 1B/C, 4, 5, and 6 ad of diverse geographic origin. In spite of the wide
diversity of pathogen isolates in the study, in terms of their geographic
distribution, disease syndrome induced in the plant, and cultivar specific
pathogenicity, all of them showed identical sequences for each of the five
genes of study.
viii

Summary
In addition, we generated the EF1α sequences of 17 F. oxysporum f. sp.
ciceris isolates and three isolates of F. oxysporum nonpathogenic to chickpea.
These sequences, together with those of 24 isolates representative of 11
formae speciales of F. oxysporum obtained from GenBank were analyzed by
means of PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony). All F. oxysporum
f. sp. ciceris isolates were grouped together and distinctively from all other
F. oxysporum isolates, demonstrating a monophyletic origin.
The genetic variability among isolates of a race, and of different races,
as well as the evolutionary relationship among the races, were investigated
by means of analysis of DNA fingerprint. These fingerprints were
generated with probes FocB10, FocO2, and FocP18 which contain
repetitive DNA identified within the F. oxysporum f. sp. ciceris genome and
show DNA similarity with transposable elements referred in the literature.
In particular, the FocB10 sequence showed 80% similarity with Fot1
transposon from F. oxysporum f. sp. melonis. Analyses indicated that DNA
fingerprinting was highly correlated with their nature in term of pathotype
and race belonging. Both the phenetic analysis of similarity (UPGMA) and
the cladistic analysis (PAUP) of fingerprints grouped F. oxysporum f. sp.
ciceris isolates in two clusters which correlate with the Yellowing and
Wilting pathotypes. Also, the cluster comprised of Yellowing isolates was
formed by two subclusters which included race 0 and race 1B/C isolates,
respectively. Similarly, the cluster including Wilting isolates comprised
several subclusters which corresponded with races 1A/6, race 5, and races
2, 3, and 4. This latter group of races have been reported from India only.
Phylogenetic analysis of DNA fingerprints showed that race 5 isolates are
evolutionarily closer to races 2, 3, and 4 than to races 1A and 6 also
present in the Mediterranean Basin. Although races 5 and races 2, 3, and 4
are widely separated apart, they are the most similar among F. oxysporum f.
sp. ciceris races in terms of virulence to differential chickpea lines.
In this research, we have also developed a rep-PCR-based method for
analysis of genomic F. oxysporum f. sp. ciceris DNA, which is an alternative
to DNA fingerprinting generated by Southern hybridization. To this aim,
we designed a primer pair that amplify DNA regions between copies of
the repetitive element FocB10 dispersed within the F. oxysporum f. sp. ciceris
ix

Summary
genome. Rep-PCR analyses generated amplification profiles that
discriminated among races of the pathogen. In addition, UPGMA analysis
of data thus generated showed that the information provided by rep-PCR
analysis is equivalent to that obtained by means of Southern hybridization
using the same repetitive element. Therefore, the rep-PCR-based method
developed is a useful and adequate tool for studying genetic diversity
within F. oxysporum f. sp. ciceris populations.
Finally, our evolutionary hypothesis for F. oxysporum f. sp. ciceris is that
isolates of this pathogen derive from an initial, small founder population
(possibly a single isolate) that acquired pathogenicity to Cicer spp. In
addition, diversification of the pathogen in pathotypes and races may have
resulted from accumulation of small genetic changes, which reflect a
prolonged history of association with its cultivated host, the chickpea crop.
We also postulate that races originate one from another, and that the
evolutionary development of new races implies higher virulence of them
to chickpea differential lines. Thus, race 0 is the least virulent of all races
and the oldest among them because of the highest genetic diversity shown
among isolates belonging to them. On the contrary, race 5, the most
virulent of all races identified in the Mediterranean Basin so far, is the race
showing the least genetic diversity and would be the most recently
evolved.
x

ÍNDICE DE CONTENIDO
Índice de Contenido
INTRODUCCIÓN 1
La Fusariosis Vascular del garbanzo.......................................................... .1
Importancia y distribución geográfica de la
enfermedad..........................................................................................1
Sintomatología.......................................................................................2
Biología del agente y patogénesis.......................................................3
Variabilidad patogénica de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris .............4
Identificación de razas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris:
Pruebas de Patogenicidad..................................................................7
Control de la Fusariosis Vascular del garbanzo mediante
cultivares resistentes ..........................................................................8
Objetivos......................................................................................................15
CAPÍTULO I 19
Identificación de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
y de las razas patogénicas 0, 1B/C, 5 y 6 mediante
RAPD-PCR 19
Introducción.................................................................................................19
Materiales y Métodos..................................................................................22
Aislados fúngicos................................................................................22
Pruebas de Patogenicidad..................................................................26
Extracción de ADN...........................................................................27
Análisis RAPD....................................................................................28
Análisis de datos .................................................................................29
Resultados.....................................................................................................30
Análisis RAPD de mezclas de ADN de aislados de
F. oxysporum f. sp. ciceris pertenecientes a una misma raza..........30
xi

Índice de Contenido
xii
Análisis RAPD de ADN de aislados individuales de
cada raza............................................................................................31
Confirmación de la caracterización racial mediante
análisis RAPD...................................................................................32
Análisis de los datos RAPD..............................................................34
Discusión......................................................................................................38
CAPÍTULO II 45
Desarrollo de un método basado en el análisis
PCR específica para la identificación molecular
de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y de las
razas patogénicas 0, 1A, 5, y 6 45
Introducción................................................................................................ 45
Materiales y Métodos..................................................................................49
Aislados fúngicos................................................................................49
Extracción de ADN...........................................................................50
Reacciones de amplificación RAPD................................................50
Clonación de fragmentos RAPD .....................................................56
Purificación de plásmido bacteriano................................................57
Hibridación de las bandas clonadas con los perfiles de
amplificación RAPD y PCR específica.........................................58
Hibridaciones ‘Southern’...................................................................60
Secuenciación de los fragmentos RAPD clonados........................60
Diseño de iniciadores específicos.....................................................61
Reacciones de amplificación PCR....................................................61
Resultados.....................................................................................................63
Clonación de los fragmentos RAPD.. .............................................63
Hibridaciones con el perfil RAPD...................................................64
Hibridaciones ‘Southern’...................................................................68

Índice de Contenido
Secuenciación de los fragmentos RAPD ........................................70
Reacciones de amplificación PCR....................................................70
Discusión.. ...................................................................................................79
CAPÍTULO III 83
Genealogías génicas definen a Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
como un grupo monofilético 83
Introducción .................................................................................................83
Materiales y Métodos.................................................................................. 86
Aislados fúngicos................................................................................86
Amplificación de ADN y secuenciación.........................................88
Análisis filogenético ...........................................................................89
Resultados....................................................................................................90
Discusión......................................................................................................92
CAPÍTULO IV 99
Caracterización de aislados de Fusarium oxysporum
f. sp. ciceris mediante ‘fingerprinting’ genómico
con secuencias de ADN repetitivo 99
Introducción .................................................................................................99
Materiales y Métodos................................................................................102
Aislados fúngicos..............................................................................102
Extracción de ADN.........................................................................103
Hibridaciones ‘Southern’.................................................................103
Análisis de datos ...............................................................................106
Resultados..................................................................................................107
Variabilidad genética entre razas de F. oxysporum
f. sp. ciceris........................................................................................110
xiii

Índice de Contenido
xiv
Variabilidad genética entre aislados de F. oxysporum
f. sp. ciceris pertenecientes a la misma raza..................................112
Discusión....................................................................................................116
CAPÍTULO V 123
Mejora de la metodología de análisis de poblaciones
de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris mediante
PCR entre elementos de ADN repetitivo (rep-PCR) 123
Introducción..............................................................................................123
Materiales y Métodos................................................................................126
Aislados fúngicos..............................................................................126
Extracción de ADN.........................................................................126
Diseño de iniciadores.......................................................................127
Condiciones de amplificación rep-PCR ........................................127
Análisis de datos ...............................................................................130
Resultados..................................................................................................131
Variabilidad en F. oxysporum f. sp. ciceris
determinada mediante análisis rep-PCR.....................................131
Análisis de los datos rep-PCR ........................................................132
Análisis comparativo entre los resultados de las
hibridaciones ‘Southern’ y el análisis rep-PCR ..........................134
Discusión....................................................................................................137
DISCUSIÓN GENERAL 141
CONCLUSIONES 149
BIBLIOGRAFÍA CITADA 153

ÍNDICE DE FIGURAS
Índice de Figuras
Figura 1. Amplificaciones RAPD generadas mediante el
iniciador aleatorio OPF-16 utilizando mezclas de ADN
de aislados pertenecientes a la misma raza (A), y ADN
de aislados individuales (B) representativos de cada raza
de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris………………………………………..33
Figura 2. Amplificaciones RAPD generadas mediante el
iniciador aleatorio OPF-10 utilizando mezclas de ADN
de aislados pertenecientes a la misma raza (A), y ADN
de aislados individuales (B) representativos de cada raza
de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris………………………………………..35
Figura 3. Dendrograma obtenido mediante el análisis
UPGMA de los datos que generó el análisis RAPD de57
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y cuatro
aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo,
con los iniciadores OPI-01, OPI-09, OPI-18, OPF-06,
OPF-10, OPF-12, y OPF-16 ............................................................................39
Figura 4. Amplificación RAPD utilizando ADN de
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris con el
iniciador aleatorio OPF-10 (A), e hibridación del mismo
perfil de amplificación con el fragmento RAPD clonado
de 1,1 kb marcador de la raza 1B/C (clon FocD33)(B)................................65
Figura 5. Hibridación ‘Southern’ del ADN genómico
de aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris digerido
con la enzima EcoRI, con la sonda FocL10 (0,9 kb –
raza 5– OPF10)....................................................................................................69
Figura 6. Amplificaciones PCR específicas de las razas
0 (A), 5 (B), 6 (C), y 1A-6 (D) de Fusarium oxysporum f.
sp. ciceris realizadas con los iniciadores basados en
secuencias SCAR obtenidas a partir de fragmentos
RAPD marcadores..............................................................................................73
xv

Índice de Figuras
Figura 7. Amplificación PCR específica utilizando
ADN de de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris, de F.
oxysporum no patogénicos de garbanzo, de otras formae
speciales, y de diferentes Fusarium spp., y los iniciadores
Foc0-12fwd y rev (A); e hibridación de los productos de
amplificación con el fragmento RAPD clonado de 1,5
kb marcador de la forma specialis ciceris (clon Foc0-12) (B).............................75
Figura 8. Cantidad de ADN del aislado Foc-Tonini
(raza 6) detectada mediante la amplificación PCR
específica utilizando los iniciadores Foc0-12fwd y rev,
específicos de forma specialis ciceris .....................................................................77
Figura 9. Uno de los tres árboles filogenéticos de igual
máxima parsimonia inferidos a partir de la genealogía
génica del factor de traducción y elongación EF1α
(EF1α), que demuestra la monofilia en Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris ...........................................................................................93
Figura 10. ‘Fingerprint’ de ADN genómico de aislados
de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris representativos de
todas las razas patogénicas descritas (razas 0, 1A, 1B/C,
2, 3, 4, 5, y 6), y de un amplio origen geográfico del
patógeno.............................................................................................................109
Figura 11. Dendrograma UPGMA generado a partir de
la información obtenida mediante ‘fingerprints’ de ADN
genómico de aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
(razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6) y F. oxysporum no patogénicos
(NP) de garbanzo con las sondas de ADN repetitivo
FocB10, FocO2, y FocP18..................... ..............................................111
Figura 12. Uno de dos árboles filogenéticos de igual
máxima parsimonia generados mediante PAUP en base
a la información generada mediante ‘fingerprints’ de
ADN genómico de aislados de Fusarium oxysporum f. sp.
ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6) y F. oxysporum no
patogénicos de garbanzo (NP) generados con las sondas
de ADN repetitivo FocB10, FocO2, y FocP18......................................115
xvi

Índice de Figuras
Figura 13. Amplificación rep-PCR de aislados de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6)
y F. oxysporum no patogénicos (NP) de garbanzo....................................133
Figura 14. Dendrograma UPGMA generado a partir de
la información obtenida mediante la amplificación rep-
PCR de ADN de aislados de Fusarium oxysporum f. sp.
ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6) y F. oxysporum no
patogénicos (NP) de garbanzo..............................................................135
Figura 15. Dendrograma UPGMA generado a partir de
la información de ‘fingerprints’ obtenidos mediante
hibridaciones ‘Southern’ de ADN genómico de aislados
de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a
6) y F. oxysporum no patogénicos (NP) con el elemento
repetitivo FocB10.........................................................................................137
xvii

ÍNDICE DE TABLAS
Índice de Tablas
Tabla 1. Reacción de las líneas de garbanzo
diferenciadoras a la inoculación con las distintas razas de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris..............................................................................9
Tabla 2. Información geográfica y racial sobre los
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F.
oxysporum (Fo) no patogénicos de garbanzo, utilizados en
el análisis RAPD-PCR........................................................................................23
Tabla 3. Nombre y secuencia de los siete iniciadores
seleccionados por su capacidad de producir
polimorfismos de ADN informativos para la
identificación de F. oxysporum f. sp. ciceris y de sus razas
patogénicas mediante el análisis RAPD...........................................................36
Tabla 4. Análisis de la varianza molecular, AMOVA, de
los datos RAPDs obtenidos a partir de 57 aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris agrupados según su patotipo
(Amarillez, Marchitez), raza patogénica (razas 0, 1A,
1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6), y origen geográfico) .....................................................40
Tabla 5. Información geográfica y racial sobre los
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F.
oxysporum (Fo) no patogénicos de garbanzo, utilizados en
el análisis PCR específica ..................................................................................51
Tabla 6. Aislados de otras formae speciales de Fusarium
oxysporum, así como de otras Fusarium spp. utilizados en
el análisis PCR específica con aislados de F. oxysporum f.
sp. ciceris.................................................................................................................54
Tabla 7. Designación y características de los plásmidos
bacterianos de ADN recombinante generados mediante
la clonación de fragmentos RAPD marcadores de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y de sus razas patogénicas.............................67
xix

Índice de Tablas
Tabla 8. Secuencias de los iniciadores, y condiciones de
amplificación para su utilización en análisis PCR
específica para la identificación de Fusarium oxysporum f.
sp. ciceris y sus razas patogénicas 0, 1A, 1B/C, 5, y 6.....................................72
Tabla 9. Información sobre la raza y origen geográfico
de los aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc) y
Fusarium oxysporum (Fo) no patogénicos de garbanzo
utilizados en el análisis de genealogías génicas ..............................................87
Tabla 10. Secuencia de los iniciadores que amplifican
intrones de los genes altamante conservados factor de
traducción y elongación 1α, β-tubulina, histona 3,
actina, y calmodulina, utilizados en el análisis de
genealogías génicas en Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris......................................................................................….89
Tabla 11. Información geográfica y racial sobre los
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de
Fusarium oxysporum (Fo) no patogénicos de garbanzo
utilizados en el análisis de ‘fingerprints’ de ADN........................................104
Tabla 12. Información geográfica y racial sobre los
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de
Fusarium oxysporum (Fo) no patogénicos de garbanzo
utilizados en el análisis de ‘fingerprints’ de ADN........................................128
xx

INTRODUCCIÓN
La Fusariosis Vascular del garbanzo
Importancia y distribución geográfica de la enfermedad
Introducción
La Fusariosis Vascular del garbanzo (Cicer arietinum L.) causada por
Fusarium oxysporum Schlechtend: Fr. f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato
es, junto con la Rabia causada por Didymella rabiei Kovachevski [anamorfo
Ascochyta rabiei (Pass.) Labrousse], la enfermedad más importante de las que
afectan a la producción de garbanzo en España (Navas Cortés et al., 1998;
2000; Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985).
La enfermedad ha sido diagnosticada además en la mayoría de los países
donde se cultiva el garbanzo, entre los que se encuentran Bangladesh,
Etiopía, India, Méjico, Pakistán, Siria y Túnez (Halila y Strange, 1996;
Nene et al., 1984); Chile, Irán, Sudán (Haware et al., 1986a); Perú (Echandi,
1970); Unión Soviética (Stepanova, 1971); Malavi (Kannaiyan, 1981);
EEUU (California) (Buddenhagen y Workneh, 1988; Phillips, 1988); Italia
(Frisullo et al., 1989); Israel (Y. Katan, comunicación personal); y Líbano y
Turquía (C. Akem, comunicación personal).
La Fusariosis Vascular es uno de los principales factores limitantes del
cultivo de garbanzo en la región Mediterránea y el subcontinente Indio
(Haware, 1990; Jiménez Díaz et al., 1989c; Nene y Reddy, 1987), pudiendo
originar pérdidas anuales de rendimiento de 10-15% en la India (Singh y
Dahiya, 1973) y España (Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985), y la
devastación completa del cultivo en condiciones determinadas (Halila y
Strange, 1996).
1

Introducción
Sintomatología
La Fusariosis Vascular del garbanzo se caracteriza por dos síndromes,
denominados Amarillez y Marchitez, distinguibles entre sí tanto por los
síntomas que los componen como por la cronología con que éstos se
desarrollan. Ambos síndromes son consecuencia de infecciones vasculares
de la planta, y llevan asociada una coloración castaño oscura del xilema y
médula de la raíz, cuello y tallo de las plantas infectadas.
El síndrome de Amarillez se caracteriza por el desarrollo progresivo de
clorosis, amarillez y necrosis de foliolos, que progresan de forma acrópeta
en la planta dando lugar a la defoliación de ésta. Generalmente, en
inoculaciones artificiales las plantas no mueren antes de los 40 días después
de la siembra en suelo infestado (Trapero Casas, 1983; Trapero Casas y
Jiménez Díaz, 1985).
El síndrome de Marchitez se caracteriza por un desarrollo rápido de
flaccidez y clorosis verde mate en las hojas, en ausencia de amarillez, que
se extiende poco después al resto de la planta. La flaccidez es seguida por
la desecación de hojas y tallos, los foliolos permanecen adheridos al raquis,
y posteriormente la planta muere. En inoculaciones artificiales mediante
siembra en suelo infestado por el patógeno, la muerte de plantas
susceptibles ocurre generalmente antes de transcurridos los 20 días desde
la siembra (Trapero Casas, 1983; Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985).
Ambos síndromes han sido descritos en la literatura fitopatológica
asociados con la Fusariosis Vascular del garbanzo, aunque el de Marchitez
ha sido el más común y tradicionalmente reconocido en diversos países
(Narasimhan, 1929; Nene, 1980; Raheja y Das, 1957). Por el contrario, el
síndrome de Amarillez es el predominante en Andalucía, Castilla y León, y
Extremadura (Alcalá Jiménez, 1995; Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1986a,
b).
2

Biología del agente y patogénesis
Introducción
F. oxysporum f. sp. ciceris es un hongo de suelo, necrotrofo obligado,
patogénicamente especializado de especies de Cicer, a las que infecta
vascularmente, y transmisible en semillas infectadas de C. arietinum, su
huésped cultivado (Haware et al., 1978; 1986a; Nene y Haware, 1980). No
obstante, F. oxysporum f. sp. ciceris puede invadir asintomáticamente raíces
de otras plantas, tanto leguminosas como no leguminosas, tales como:
guisante (Pisum sativum L.), lenteja (Lens esculenta Moench), Cajanus cajan (L.)
Millsp. (Haware y Nene, 1982a), altramuz blanco (Lupinus albus L.), habas
(Vicia faba L.), judía (Phaseolus vulgaris L.), melón (Cucumis melo L.), patata
(Solanum tuberosum L.), remolacha azucarera (Beta vulgaris L.), Chenopodium
album L., y veza (Vicia sativa L.) (Cabrera de la Colina et al., 1987; Trapero
Casas y Jiménez Díaz, 1985), que proporcionan al patógeno un medio de
sobrevivir parasíticamente durante periodos de tiempo en que el suelo
permanece libre de su huésped cultivado. Además, F. oxysporum f. sp. ciceris,
al igual que los agentes causantes de otras Fusariosis Vasculares, posee la
capacidad de sobrevivir inactivo en el suelo en forma de clamidosporas
durante varios años en ausencia de plantas huésped (Allen, 1983); hasta 6
años, según indican investigaciones realizadas en la India (Haware et al.,
1986b).
F. oxysporum f. sp. ciceris puede invadir las plántulas de garbanzo de
cultivares tanto susceptibles como resistentes durante la germinación y
emergencia, en los primeros días después de la siembra, sin necesidad de
heridas en los tejidos subterráneos de la joven planta. La penetración de la
planta por el patógeno tiene lugar principalmente a través de los
cotiledones, y en las zonas del hipocotilo y epicotilo próximas a los
cotiledones; y en menor proporción por zonas de la raíz principal, a
excepción del ápice radical (Jiménez Díaz et al., 1989a). Posteriormente, y
tras el crecimiento del hongo a través del córtex radical, tiene lugar la
colonización vascular de la planta debido al crecimiento de las hifas a lo
largo del eje vegetal y al transporte de microconidias en los vasos del
xilema, seguido de la colonización de los vasos adyacentes debido al
crecimiento lateral del micelio a través de los poros laterales de aquéllos.
Inicialmente, la colonización vascular se produce mediante el crecimiento
3

Introducción
de hifas delgadas en la raíz y base del tallo de la plántula. Posteriormente,
se desarrollan hifas gruesas irregulares y ramificadas cuyo crecimiento
profuso da lugar a la oclusión del lumen de los vasos infectados (Jiménez
Díaz, 1994; Jiménez Díaz et al., 1989a).
La colonización vascular de la planta ocurre de forma similar por los
aislados del patógeno que causan el síndrome de Amarillez y por los que
causan Marchitez. Sin embargo, los aislados causantes de Amarillez, menos
virulentos que los de Marchitez, invaden la planta más lentamente y con
menor extensión. Para ambos tipos de aislados, los síntomas severos
característicos se desarrollan después de la colonización intensa y extensa
de los haces xilemáticos de la raíz y base del tallo por el hongo, y la
distribución de éste a lo largo del eje de la planta (Jiménez Díaz, 1994;
Jiménez Díaz et al., 1989a).
Variabilidad patogénica de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
Las poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris contienen una variabilidad
apreciable en lo concerniente a la capacidad patogénica de los aislados que
las componen (Alcalá Jiménez, 1995; Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz
et al., 1989a, b). Por una parte, los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
pueden ser caracterizados en dos patotipos por el síndrome de Amarillez
(patotipo de Amarillez) o de Marchitez (patotipo de Marchitez) que
inducen en cultivares de garbanzo susceptibles. Además, superimpuesto
sobre la caracterización patotípica, los aislados pertenecientes a un
patotipo pueden ser clasificados en razas patogénicas en base al patrón de
reacciones que originan en un conjunto de cultivares o líneas denominados
diferenciadores raciales. La primera descripción de razas patogénicas en F.
oxysporum f. sp. ciceris es debida a Haware y Nene (1982b), quienes
identificaron las razas 1, 2, 3 y 4, según la interacción diferencial que
obtuvieron al inocular 10 cultivares de garbanzo (‘Annigeri’, ‘BG-212’,
‘Chafa’, ‘C-104’, ‘CPS-1’, ‘JG-62’, ‘JG-74’, ‘K-850 3/27’, ‘L-550’ y ‘WR-
315’) con aislados del patógeno procedentes de la India.
4

Introducción
La raza 1 se caracteriza por ser no patogénica sobre ‘JG-74’, ‘CPS-1’,
‘BG-212’ y ‘WR-315’; mientras que la raza 2 es no patogénica únicamente
sobre ‘WR-315’, la raza 3 es no patogénica únicamente sobre ‘JG-74’ y la
raza 4 lo es sobre ‘JG-74’ y ‘WR-315’ (Haware y Nene, 1982b).
Trabajos posteriores pusieron de manifiesto que determinados aislados
de F. oxysporum f. sp. ciceris procedentes de Andalucía son no patogénicos
sobre el cv. JG-62 (Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985). Estos aislados
inducen el síndrome de Amarillez en cultivares tipo ‘kabuli’ (semilla grande
de color beige y forma de cabeza de carnero) locales; mientras que otros
aislados procedentes de la misma región inducen el síndrome de Marchitez
y resultaron ser altamente virulentos sobre la mayoría de los cultivares de
garbanzo (Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985).
La inoculación artificial de seis (‘BG-212’, ‘C-104’, ‘CPS-1’, ‘JG-62’,
‘JG-74’ y ‘WR-315’) de los 10 cultivares diferenciadores utilizados por
Haware y Nene (1982b) y de ‘12-071/10054’, ‘ICCV-2’, ‘ICCV-4’, ‘PV-24’
y ‘P-2245’, con 11 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris de Andalucía y con
aislados representativos de las razas descritas en la India, dio lugar a
asignar dichos aislados a tres nuevas razas, denominadas 0, 5 y 6 (Cabrera
de la Colina et al., 1986; Jiménez Díaz et al., 1989b).
La raza 0 es la menos virulenta de las razas descritas y se caracteriza por
ser no patogénica sobre el cultivar ‘desi’ (semilla pequeña, de color oscuro
y perfil anguloso) JG-62, que es susceptible a todas las demás razas
descritas. La raza 0 es patogénica sobre ‘C-104’ y ‘12071/10054’. Hasta el
momento, todos los aislados de la raza 0 estudiados inducen el síndrome
de Amarillez, que se desarrolla a los 30-40 días después de la inoculación
por el método de siembra en suelo infestado contenido en macetas (Nene
y Haware, 1980; Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985).
La raza 5 induce el síndrome de Marchitez rápida en cultivares
susceptibles, y se caracteriza por no ser patogénica en la línea ‘desi’ 12-
071/10054, que es susceptible a la raza 0, pero patogénica en el resto de
los cultivares diferenciadores inoculados excepto ‘BG-212’ y ‘WR-315’.
Los cvs. CPS-1 y JG-74 son moderadamente susceptibles a la raza 5, por
cuya infección desarrollan un amarilleamiento foliar lento y progresivo que
5

Introducción
es distinguible de la amarillez causada por la raza 0 en cultivares
susceptibles (Jiménez Díaz et al., 1989b).
La raza 6, que induce una marchitez vascular similar a la originada por
la raza 5 y las razas descritas en la India, se caracteriza por ser patogénica
sobre ‘C-104’, ‘ICCV-2’, ‘ICCV-4’ y ‘JG-62’, y no patogénica sobre ’12-
071/10054’ (que es susceptible a la raza 1), ‘BG-212’, ‘CPS-1’ y ‘JG-74’
(Jiménez Díaz et al., 1989b).
Estudios posteriores han indicado que ninguna de las razas 0, 5 y 6 son
patogénicas sobre ‘Annigeri’, ‘Chafa’, y ‘K-850 3/27’, que son susceptibles
a las razas 1-4 (Jiménez Díaz, no publicado; Halila y Strange, 1996)
La estructura de virulencia en poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris
fue reevaluada con una muestra de aislados del patógeno más amplia que la
estudiada en el periodo 1983-86 (Cabrera de la Colina et al., 1985; Jiménez
Díaz et al., 1989b), incluyendo aislados de Andalucía, Extremadura y
Castilla y León en España, California, Marruecos y Túnez. Los resultados
confirmaron que los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris pueden ser
clasificados en uno de los patotipos de Amarillez o Marchitez de acuerdo
con el síndrome que causan en cultivares susceptibles de garbanzo; y
además indicaron que ambos patotipos existen en el sur y noroeste de
España, así como en California y posiblemente Marruecos (Alcalá Jiménez,
1995; Jiménez Díaz et al., 1993a). Por el contrario, los aislados procedentes
de Túnez pertenecen al patotipo de Amarillez, característica que ha sido
recientemente confirmada por Halila y Strange (1996).
Los estudios referidos permitieron identificar las razas 0, 1, 5 y 6 entre
los aislados investigados, y a su vez constatar que existen ligeras diferencias
fenotípicas entre aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris de una misma raza.
Así, en dichos estudios se distinguieron a aislados procedentes de
California y caracterizados patogénicamente como raza 1, pero que
inducen el síndrome de Amarillez (raza 1B/C), en contraposición con el
resto de aislados de esta raza procedentes de California, España, India y
Marruecos, los cuales inducen el síndrome de Marchitez (raza 1A)
(Jiménez Díaz et al., 1993a).
6

Introducción
En consecuencia, en cultivares susceptibles de garbanzo los aislados
pertenecientes a las razas 0, 1B/C inducen el síndrome de Amarillez
descrito anteriormente, mientras que aislados pertenecientes a las razas 1A,
2, 3, 4, 5 y 6 causan el síndrome de Marchitez. Además, la información
más reciente indica que las razas 0, 1 (1A, y 1B/C), 5 y 6 de F. oxysporum f.
sp. ciceris existen en España y California, mientras que las razas 0 y 1B/C
existen en Siria, Túnez y Turquía; las razas 0, 1A y 6 en Israel; las razas 1A
y 6 en Marruecos, y la raza 0 en el Líbano (Halila y Strange, 1996; Jiménez
Díaz et al., 1993a; Jiménez Díaz, no publicado). Por el contrario, las razas 2, 3
y 4 han sido descritas únicamente en la India hasta el momento, donde
también existe la raza 1A (Jiménez Díaz, 1994).
Identificación de razas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris: Pruebas de
Patogenicidad
La correcta identificación de las variantes patogénicas de F. oxysporum f. sp.
ciceris presentes en una determinada zona de cultivo es un aspecto crucial
con vistas a la utilización y desarrollo mediante mejora genética de
cultivares con resistencia estable. De forma tradicional, la identificación de
razas patogénicas en hongos fitopatógenos se ha llevado a cabo por el
fenotipo de las interacciones planta-patógeno, en pruebas de patogenicidad
basadas en la inoculación de líneas diferenciadoras de la planta huésped
con aislados del patógeno.
Para la identificación de razas de F. oxysporum f. sp. ciceris, en nuestro
laboratorio se ha venido utilizando una modificación del método descrito
por Haware y Nene (1982b), utilizando 10 líneas de garbanzo, que incluyen
las empleadas por dichos autores a excepción de ‘Annigeri’, ‘Chafa’, ‘K-850
3/27’ y ‘L-550’; y añadiendo las ‘P-2245’, ‘12-071/10054’, ‘ICCV-2’ e
‘ICCV-4’ (Jiménez Díaz et al., 1989b) (Tabla 1).
Para la realización de las pruebas de patogenicidad, la inoculación de las
líneas diferenciadoras de garbanzo se lleva a cabo mediante la siembra de
semillas germinadas en suelo infestado artificialmente contenido en
7

Introducción
macetas. Con este propósito, los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris no
deben ser mantenidos repetidamente en medios de crecimiento sintéticos
debido a mutaciones que ocurren con frecuencia y que están asociadas con
pérdida de virulencia. Por ello, los aislados son conservados en suelo
estéril. El inóculo se incrementa en una mezcla de arena y harina de maíz
(AMA) (9:1, p/p) durante 15 días a 25ºC. Posteriormente el AMA
infestado se mezcla con suelo esterilizado en una proporción de 1:12
(p/p). Una vez que el hongo está establecido en esta mezcla de suelo
infestado, se siembran las semillas pregerminadas de garbanzo en macetas
que contienen dicha mezcla. Este nivel de inóculo es suficiente para causar
el 100% de mortalidad en ‘JG-62’, una línea de garbanzo altamente
susceptible. La reacción de la planta a la infección se determina mediante la
severidad de los síntomas en una escala de 1 a 4 (1=no síntomas; 4=planta
muerta), según el porcentaje de área foliar afectada a los 20 y 40 días
después de la inoculación.
Control de la Fusariosis Vascular del garbanzo mediante cultivares resistentes
La ecología del patógeno y la epidemiología de la enfermedad indican que
las epidemias de Fusariosis Vascular del garbanzo son de naturaleza
monocíclica. En consecuencia, las estrategias más adecuadas para su
control son aquéllas que contribuyen a reducir la cantidad del inóculo
inicial en el suelo, a reducir su eficacia, o a ambas.
La rotación de garbanzo con cultivos no huéspedes puede contribuir a
reducir el inóculo de sus patógenos que residen en el suelo. Sin embargo,
el control de la Fusariosis Vascular mediante la rotación de cultivos no es
efectivo debido a la capacidad del patógeno de sobrevivir
prolongadamente en el suelo mediante clamidosporas, así como de
infectarasintomáticamente otros cultivos de plantas leguminosas y no
leguminosas (Cabrera de la Colina, 1986; Trapero Casas y Jiménez Díaz,
1985). De forma similar, investigaciones sobre la utilización combinada de
tratamientos fungicidas de la semilla de cultivares de garbanzo de diferente
susceptibilidad, indicaron que algunos fungicidas incrementan
8

Introducción
Tabla 1. Reacción de las líneas de garbanzo diferenciadoras a la inoculación con las
distintas razas de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris a
Línea
Raza
diferenciadora 0 1A 1B/C 2 3 4 5 6
12-071/10054 S M S R R R R M
JG-62 R S S S S S S S
C-104 M M R/M S S S S M
JG-74 R R R S R R M R
CPS-1 R R R S M M M R
BG-212 R R R S M M R R
WR-315 R R R R S R R R
ICCV-2 R R R S S S S M
ICCV-4 R R R S S S S M
P-2245 S S S S S S S S
a Evaluada en una escala de severidad de 0-4 según el porcentaje de tejido
foliar afectado (0=0%, 1=1-33%, 2=24-66, 3=67-100, 4=planta muerta) a
los 40 días de la siembra en una mezcla de suelo infestado con AMA
colonizado por el hongo. Las reacciones con severidad media 3 se
consideran resistentes (R) y susceptibles (S), respectivamente. Las reacciones
de severidad intermedia entre dichos valores se consideran moderadamente
susceptibles (M) (Halila y Strange, 1996; Haware y Nene, 1982b; Jiménez
Díaz et al., 1989b).
9

Introducción
significativamente la emergencia de las plántulas y retrasan el comienzo de
las epidemias en cultivares moderadamente resistentes, pero no en
cultivares altamente susceptibles como es el caso de ‘P-2245’. Sin embargo,
ningún tratamiento fungicida proporcionó un nivel de control satisfactorio
de la enfermedad (Jiménez Díaz y Trapero Casas, 1985).
El método más práctico y económicamente eficiente para el control de
la Fusariosis Vascular es la utilización de cultivares resistentes (Nene y
Reddy, 1987). Sin embargo, la efectividad de este método de control puede
ser disminuida por la existencia de razas patogénicas de F. oxysporum f. sp.
ciceris (Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a). Como en
otros patosistemas, el desarrollo de genotipos de garbanzo resistentes a
esta enfermedad puede ser influido por factores como la genética de la
resistencia en la planta y la variabilidad patogénica en el agente. Aún así, se
han conseguido importantes avances en el desarrollo de genotipos de
garbanzo resistentes o tolerantes a enfermedades individuales (Singh,
1988). Sin embargo, en muchos casos, el germoplasma resistente a una
enfermedad se ha mostrado altamente susceptible a otras enfermedades
importantes del cultivo.
Estudios realizados en condiciones de campo indicaron que la
resistencia a la Fusariosis Vascular en diferentes cultivares de garbanzo era
monogénica con dominancia incompleta (Ayyar e Iyer, 1936), o
monogénica y recesiva (López, 1974; Sidhu et al., 1983). Investigaciones
más cuidadosas mostraron que la resistencia a la raza 1 de F. oxysporum f.
sp. ciceris en los cvs. CPS-1 y WR-315 es conferida por un único alelo
recesivo, que se encuentra en el mismo locus en ambos genotipos de
garbanzo (Kumar y Haware, 1982). Asimismo, Kumar y Haware (1982)
sugirieron que en la resistencia a la raza 1A del patógeno pudieran estar
implicados otros genes mayores o complejos poligénicos, ya que los
cruzamientos realizados entre líneas susceptibles y resistentes de garbanzo
no mostraban la relación fenotípica esperada de 3 (susceptible): 1
(resistente).
Trabajos posteriores indicaron que el tiempo que transcurre hasta el
desarrollo de los síntomas en la planta es un componente fenotípico de
10

Introducción
interés en el análisis de la reacción de genotipos de garbanzo a la
inoculación con razas del patógeno. Así, mientras en la marchitez de ‘JG-
62’ (‘marchitez temprana’) los síntomas iniciales aparecen antes de
transcurridos los 20 días desde la inoculación, en ‘C-104’ (‘marchitez
tardía’) los síntomas iniciales son visibles pasados los 21 días después de la
inoculación. Además, esta diferencia es controlada por un único gen,
siendo la marchitez temprana parcialmente dominante sobre la marchitez
tardía (Upadhyaya et al., 1983a).
Estudios de las segregaciones de cruzamientos entre los cvs. JG-62 y C-
104 y las líneas completamente resistentes BG-212, CPS-1, P-436-2 y WR-
315, así como de cruzamientos entre cultivares que mostraban marchitez
tardía, ‘C-104’, ‘K-850 3/27’ y ‘H-208’, indicaron que la resistencia a la raza
1A de F. oxysporum f. sp. ciceris parece ser controlada por al menos tres loci
independientes, designados H1, H2 y H3 (Singh et al., 1987a, b; Upadhyaya
et al., 1983b). Un alelo recesivo en homocigosis en cualquiera de los dos
primeros loci, o el alelo dominante en el tercer locus, determina un retraso
en el desarrollo de la marchitez; pero la existencia de dos de cualesquiera
de los tres alelos descritos operativos confiere resistencia completa a la
raza 1A del patógeno.
Investigaciones posteriores por el mismo grupo de trabajo indicaron
que la resistencia a la raza 2 de F. oxysporum f. sp. ciceris es regulada por un
sistema genético similar al descrito para la raza 1A. El estudio incluyó las
segregaciones F 2 y F 3 del cruzamiento ‘P-165’ (resistente) x ‘C-104’
(susceptible) y las líneas CPS-1 y K-850, controles, respectivamente de
marchitez temprana y tardía (Gumber et al., 1995). Los resultados
mostraron que la resistencia a la raza 2 del patógeno es regulada por dos
genes, uno de los cuales, A, debe estar en homocigosis recesiva y el otro,
B, en homocigosis dominante o heterocigosis. Así, la reacción de
marchitez temprana ocurre en genotipos bb, independientemente de A; y la
de marchitez tardía ocurre en genotipos AB. Estos resultados tienen
importantes implicaciones con respecto a la mejora del garbanzo en cuanto
a la resistencia a las razas 1A y 2 de F. oxysporum f. sp. ciceris, ya que puede
obtenerse resistencia completa al patógeno mediante cruzamientos
utilizando sólo parentales con resistencia del tipo de marchitez tardía,
11

Introducción
aunque sean susceptibles (Singh et al., 1987a; van Rheenen et al., 1992).
Dichos cultivares tienen generalmente buenas características agronómicas
y pueden producir rendimiento aún con ataques de la enfermedad,
mientras que la muerte temprana de los cultivares de marchitez temprana
excluye la producción de semilla por cultivos afectados (Gumber et al.,
1995).
Este tipo de estudios sobre la genética de la resistencia en la planta debe
ser realizado para otras razas del patógeno con fines comparativos, ya que
es posible que algunos de los genes implicados en la resistencia a las razas
1A y 2 de F. oxysporum f. sp. ciceris puedan ser efectivos también contra
otras razas del patógeno.
Los progresos en la identificación de fuentes de resistencia y en el
desarrollo de cultivares de alto rendimiento y resistentes a la Fusariosis
Vascular han sido significativos (Singh, 1987; Singh y Reddy, 1991). En el
ICRISAT (‘International Crop Research Institute for the Semiarid
Tropics’) hay disponibles más de 150 líneas tanto del tipo ‘desi’ como del
tipo ‘kabuli’, resistentes a la Fusariosis Vascular (Haware et al., 1989), así
como otras fuentes de resistencia a la Fusariosis Vascular y a la
Podredumbre de Raíz (Reddy et al., 1990). Dicha resistencia a la Fusariosis
Vascular ha sido incorporada con éxito a cultivares de garbanzo ‘desi’ y
‘kabuli’ de alto rendimiento, incluyendo ‘ICCV-2’, ‘ICCV-3’, ‘ICCV-4’ e
‘ICCV-5’ (Kumar et al., 1985), e ‘ICCV-6’ (Ghanekar et al., 1990)
procedentes de ICRISAT; ‘Surutato 77’, ‘Sonora 80’, ‘Gavilan’, ‘Kino’ y
‘Tubutama’ de Méjico (Morales, 1986); ‘UC-15’ y ‘UC-27’ de California
(Buddenhagen et al., 1988; Helms et al., 1992) y ‘Andoum 1’ (Halila y
Harrabi, 1990) de Túnez.
En colaboración con el Programa de Mejora Genética del Garbanzo de
ICARDA (‘International Center for Agricultural Research in the Dry
Areas’) durante los años 1987-1990 se evaluó la resistencia a la Fusariosis
Vascular de 2702 líneas de garbanzo ‘kabuli’ (el más frecuente en el Área
Mediterránea y Oriente Próximo) en una parcela naturalmente infestada
por las razas 0, 1A y 5 de F. oxysporum f. sp. ciceris en Santaella (Córdoba).
Las líneas consideradas más prometedoras un año fueron reevaluadas en
años sucesivos, y las finalmente seleccionadas fueron inoculadas con las
12

Introducción
razas 0, 1A y 5 del patógeno en condiciones controladas para confirmar la
naturaleza de la reacción. Un total de 14 líneas fueron seleccionadas por su
resistencia en campo. Cuando dichas líneas y 35 líneas adicionales se
inocularon artificialmente con cada una de las tres razas del patógeno,
ocho de ellas fueron resistentes a las tres razas; 10 fueron resistentes a las
razas 0 y 1A, y 16 líneas fueron resistentes sólo a la raza 0 (Jiménez Díaz et
al., 1991; 1993a).
Excepto en contados casos, las líneas de garbanzo ‘kabuli’ con
resistencia a la Fusariosis Vascular generalmente son susceptibles a la
Rabia causada por D. rabiei, lo cual limita considerablemente su utilidad en
áreas geográficas donde ambas enfermedades son prevalentes. Por ello, se
desarrolló un programa de mejora genética en colaboración con el
Departamento de Genética y Mejora Vegetal de la ETSIAM de la
Universidad de Córdoba, el Departamento de Agronomía y Mejora del
CIFA-Córdoba y Koipesol S. A., que incluyó entre sus principales
objetivos desarrollar germoplasma de garbanzo ‘kabuli’ con resistencia
combinada a las dos enfermedades. De dicho programa ha resultado la
identificación de cuatro líneas con semilla de interés comercial resistentes a
la raza 5 de F. oxysporum f. sp. ciceris y moderadamente resistentes a un
aislado altamente virulento de D. rabiei; cuatro líneas resistentes a D. rabiei y
moderadamente resistentes a la raza 5; y una línea resistente tanto a la raza
5 de F. oxysporum f. sp. ciceris como a D. rabiei (Navas et al., 1994).
Asimismo, en colaboración con la Estación de Introducción de
Germoplasma Vegetal del USDA en Washington, se evaluaron 52 entradas
de 11 especies silvestres de Cicer por su resistencia a las razas 0 y 5 de F.
oxysporum f. sp. ciceris en condiciones controladas, 47 de las cuales fueron
también evaluadas por su resistencia a la raza 5 del patógeno en
condiciones de campo, en microparcelas artificialmente infestadas con
aquélla. Mientras que frente a la raza 0, menos virulenta, se identificó
resistencia en C. bijugum K. H. Rech, C. canariense Santos Guerra & G. P.
Lewis, C. chorassanicum (Bge) M. Popov., C. cuneatum Hochst. ex Rich., C.
judaicum Boiss, y C. pinnatifidum Juab. & Spach; sólo C. bijugum, C. cuneatum y
C. judaicum contienen resistencia a la raza 5. Además, algunas entradas de
C. bijugum (PI 458550, PI 458552) y C. judaicum (PI 458559), resistentes a
13

Introducción
las razas 0 y 5 de F. oxysporum f. sp. ciceris, también son resistentes a D.
rabiei (Kaiser et al., 1994).
14

Objetivos
Introducción
Como se ha mencionado anteriormente, la estrategia de lucha contra la
Fusariosis Vascular del garbanzo más práctica y económicamente eficiente
es la utilización de cultivares de garbanzo resistentes. La utilización
eficiente de los cultivares de garbanzo disponibles con resistencia a la
Fusariosis Vascular, requiere información previa y precisa sobre las razas
del patógeno que prevalecen en las distintas áreas de cultivo, ya que esta
resistencia es generalmente operativa contra una o algunas de las razas de
F. oxysporum f. sp. ciceris descritas (Jiménez Díaz et al., 1993b; Kaiser et al.,
1994). La identificación de razas del patógeno mediante pruebas de
patogenicidad es costosa en espacio, tiempo, y recursos, y puede ser
influida por la variabilidad inherente al sistema experimental. Además,
dicho procedimiento de caracterización racial no proporciona información
sobre las relaciones genéticas y la variabilidad existente entre, y dentro de,
las diferentes razas. Como consecuencia, tanto en éste, como en otros
patosistemas similares en los que el agente sólo se reproduce asexualmente,
se conoce muy poco sobre el origen de nuevas razas, o sobre si la
extensión con que una raza ya conocida, identificada en un nuevo lugar, es
el resultado de una introducción o representa un origen independiente de
dicha raza (Jiménez Díaz, 1994).
Por estos motivos, además de la correcta identificación del agente
causal de la enfermedad, es de suma importancia un mejor conocimiento
de las relaciones genéticas existentes entre aislados del patógeno (Kistler,
1997). Todo ello hace que se hayan investigado vías alternativas, basadas
en las técnicas moleculares disponibles, para la detección e identificación
rápida, precisa y fiable de los patógenos, y de sus razas patogénicas, en
particular de hongos mitospóricos.
El gran desarrollo de las técnicas de biología molecular que ha tenido
lugar en la última década ha hecho posible que su aplicación alcance
disciplinas como la Patología Vegetal (Bridge et al., 1998a, b). La aplicación
de herramientas experimentales basadas en técnicas de biología molecular,
tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, ‘Polymerase
Chain Reaction’) (Henson y French, 1993; Mullis y Faloona, 1987; Ward,
15

Introducción
1994) o la hibridación de ADN genómico con sondas de ADN específicas
de una determinada raza (Michelmore y Hulbert, 1987), puede facilitar el
desarrollo de una metodología que permita la detección e identificación
rápida y precisa de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris presentes en una
zona de cultivo determinada.
De igual manera, este tipo de nuevas herramientas experimentales
puede facilitar el análisis de la diversidad genética existente en las
poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris, el nivel de similaridad entre
aislados de una misma raza, y la posible relación evolutiva entre razas
(Gordon y Martyn, 1997, Kistler, 1997). Este conocimiento representaría
un avance significativo en la comprensión de la naturaleza genética e
interrelaciones de variantes patogénicas de hongos que carecen de
reproducción sexual, y cuyas poblaciones deben tener por tanto una
estructura clonal determinada (Taylor et al., 1999a, b). Con dicho
conocimiento podría ser posible predecir los cambios que puedan ocurrir
en la estructura racial existente en un suelo al someterlo al uso continuado
de cultivares de garbanzo que presenten resistencia a una o alguna de las
razas de F. oxysporum f. sp. ciceris.
16
Para ello, los objetivos de la presente Tesis Doctoral han sido:
1. Identificar marcadores moleculares basados en ADN polimórfico
asociados a las variantes patogénicas de F. oxysporum f. sp. ciceris, y el
estudio de su utilidad diagnóstica para la caracterización racial de
aislados del patógeno de diverso origen geográfico.
2. Desarrollar una metodología basada en secuencias de ADN polimórfico
amplificadas, para la identificación de F. oxysporum f. sp. ciceris y de sus
razas patogénicas mediante PCR específica.
3. Analizar la variabilidad genética existente entre aislados pertenecientes a
las distintas razas de F. oxysporum f. sp. ciceris, y de la relación genética
entre ellas.
4. Analizar las relaciones filogenéticas entre los aislados de F. oxysporum f.
sp. ciceris.

Introducción
En consecuencia, esta Tesis Doctoral se centra en dos temas
principales: (1) la identificación molecular específica de F. oxysporum f. sp.
ciceris y de sus razas patogénicas; y (2) el estudio de su diversidad genética y
de las relaciones inter e intra raciales. Los Capítulos I y II se centrarán en el
desarrollo de marcadores moleculares mediante la utilización de la PCR
(Mullis y Faloona, 1987), que permitan la diferenciación específica de las
razas de F. oxysporum f. sp. ciceris prevalentes en la Región Mediterránea. La
estrategia seguida para la consecución de los dos primeros objetivos ha
sido una búsqueda inicial de marcadores RAPD (‘Random Amplified
Polymorphic DNA’) (Williams et al., 1990) asociados a una raza, mediante
el análisis de una colección compuesta por aislados del patógeno
representativos de todas las razas, y de diverso origen geográfico (Capítulo
I); y la posterior caracterización genética de los marcadores RAPD
identificados, su secuenciación, y la puesta a punto de la identificación de
F. oxysporum f. sp. ciceris y sus razas mediante PCR (Capítulo II).
Los Capítulos III, IV, y V se centrarán en el estudio de la variabilidad
genética existente en F. oxysporum f. sp. ciceris, y a la relación genética entre
sus razas patogénicas. El Capítulo III demostrará un origen monofilético
para la forma specialis ciceris. Los Capítulos IV y V exploran la variabilidad de
‘fingerprints’ de ADN generados, bien mediante sondas de ADN
repetitivo (Capítulo IV), o mediante métodos basados en rep-PCR
(Capítulo V).
17

CAPÍTULO I
Capítulo I
Identificación de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
y de las razas patogénicas 0, 1B/C, 5 y 6 mediante
RAPD-PCR
Introducción
El conocimiento de la naturaleza de la variación y distribución de las razas
patogénicas de un agente fitopatógeno es un requisito crucial para el
manejo eficiente de una enfermedad mediante cultivares resistentes, así
como para identificar cambios en la estructura racial o poblacional que
puedan producirse en dicho agente (McDonald, 1997). En ciertos
patosistemas, la identificación de razas mediante pruebas de patogenicidad
requiere de un coste y esfuerzo considerables, y proporciona una
información mucho más limitada que aquélla que puede ser generada
mediante el uso de marcadores genéticos neutrales. Los marcadores
genéticos selectivamente neutrales son especialmente útiles para la
identificación de razas en patógenos con reproducción estrictamente
asexual, ya que el genoma del patógeno se encuentra fijado al no
producirse recombinación genética de origen sexual (Milgroom y Fry,
1997).
19

Capítulo I
Las poblaciones naturales de Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr.
contienen componentes fitopatógenos que causan enfermedades
vasculares en una amplia gama de plantas cultivadas y no cultivadas.
Mientras que la identificación de la especie se basa en caracteres
morfológicos del hongo, los componentes patogénicos se clasifican en
formae speciales en base a su gama de plantas susceptibles (Snyder y Hansen,
1940). A su vez, las formae speciales se dividen en razas patogénicas según la
patogenicidad específica de sus componentes sobre un grupo de líneas o
cultivares diferenciadores de la planta huésped.
F. oxysporum f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato, causante de la
Fusariosis Vascular del garbanzo (Cicer arietinum L.), ha sido clasificada en
dos patotipos, denominados de Amarillez (clorosis progresiva, coloración
vascular, y muerte de la planta a los 40 días de la inoculación) y de
Marchitez (clorosis severa, flacidez, coloración vascular, y muerte de la
planta antes de los 20 días de la inoculación), según el síndrome que
causan en cultivares susceptibles en inoculaciones artificiales mediante
siembra en suelo infestado por el patógeno (Trapero Casas, 1983; Trapero
Casas y Jiménez Díaz, 1985). Además, se han descrito ocho razas
patogénicas (0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6) cuya identificación se realiza
tradicionalmente mediante pruebas de patogenicidad; de las cuales las razas
0 y 1B/C pertenecen al patotipo de Amarillez y las 1A a 6 pertenecen al
patotipo de Marchitez (Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b;
1993a). Las pruebas de patogenicidad son laboriosas, costosas en tiempo
(50-60 días), requieren infraestructuras importantes y pueden ser influidas
por la variabilidad inherente al sistema experimental. Además, los datos
sobre patogenicidad por si mismos no proporcionan información sobre la
diversidad o relación genética existente entre y dentro de las razas del
patógeno. Consecuentemente, se necesitan métodos nuevos y alternativos
a las pruebas de patogenicidad que permitan la caracterización rápida e
informativa de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris.
La amplificación arbitraria de fragmentos de ADN polimórficos
(RAPD, ‘Random Amplified Polymorphic DNA’) (Williams et al., 1990) ha
sido aplicada extensamente para la detección y caracterización genética de
hongos fitopatógenos (Brown, 1998; Miller, 1996), incluyendo la
20

Capítulo I
diferenciación de razas de varias formae speciales de F. oxysporum, i. e., formae
speciales cubense (E. F. Smith) W. C. Snyder & H. N. Hansen (Bentley et al.,
1994), dianthi (Prill. & Delacr.) W. C. Snyder & H. N. Hansen (Manulis et
al., 1994; Migheli et al., 1998), pisi (Linf.) W. C. Snyder & H. N. Hansen
(Grajal Martín et al., 1993), y vasinfectum (Atk.) W. C. Snyder & H. N.
Hansen (Assigbetse et al., 1994). Esta técnica, basada en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR, ‘Polymerase Chain Reaction’) (Mullis y
Faloona, 1987), utiliza iniciadores cortos (10 nucleótidos) de secuencia
aleatoria. El análisis RAPD no requiere el conocimiento previo de
secuencias del organismo en estudio, y presenta numerosas ventajas como
su rapidez y los escasos requerimientos en cantidad y calidad de ADN.
Además, los polimorfismos en nucleótidos individuales son más fácilmente
identificables mediante el análisis RAPD que mediante otro tipo de
análisis, por ejemplo el análisis de RFLPs (‘Restriction Fragment Length
Polymorphism’). Ésto hace que los marcadores RAPD sean muy
adecuados para detectar variabilidad intraespecífica (Keim et al., 1989), en
especial en hongos tales como F. oxysporum que carecen de reproducción
sexual, y cuyas poblaciones tienen estructura clonal (Taylor et al., 1999b).
En trabajos anteriores, se utilizó el análisis RAPD mediante iniciadores
de secuenciación o basados en secuencias conocidas de ADN ribosómico
para caracterizar y diferenciar los patotipos de Amarillez y Marchitez en F.
oxysporum f. sp. ciceris; sin embargo, dichos iniciadores no proporcionaron
resultados satisfactorios en cuanto a la identificación de razas patogénicas
(Kelly et al., 1994). No obstante, los resultados de dicho estudio han
mostrado ser de utilidad para la detección del patotipo de Marchitez en
planta y en suelo (García Pedrajas et al., 1999; Kelly et al., 1998).
Los objetivos de las investigaciones contenidas en este Capítulo han
sido: (1) demostrar si las diferentes razas patogénicas de F. oxysporum f. sp.
ciceris pueden ser distinguidas mediante el análisis RAPD utilizando otros
iniciadores distintos de los informativos sobre patotipo; y (2) analizar las
relaciones genéticas y variabilidad existente entre aislados representativos
de estas razas.
21

Capítulo I
Materiales y Métodos
Aislados fúngicos
Se han utilizado 99 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris representativos de
las ocho razas patogénicas descritas y de un amplio origen geográfico del
patógeno, así como tres aislados no patogénicos de F. oxysporum obtenidos
de raíces de plantas sanas de garbanzo (Tabla 2). Todos los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris, a excepción de los procedentes de Israel, Líbano,
Siria, Túnez, y Turquía (Grupo D en Tabla 2), fueron caracterizados
racialmente mediante pruebas de patogenicidad en trabajos anteriores
(Jiménez Díaz et al., 1993a; Kelly et al., 1994).
Los 99 aislados fúngicos proceden de la micoteca del Departamento de
Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC,
Córdoba, España. Los aislados Foc–9601 a –9606 proceden de Túnez y
fueron proporcionados por el Dr. M. H. Halila (‘Institute Nationale de la
Recherche Agronomique’, Ariana, Túnez). Los aislados Foc–9620 a –9632,
–cc21C, –cc22D, –cc62R, y –cc63K, procedentes de Israel, fueron cedidos
por el Prof. J. Katan (‘Department of Plant Pathology and Microbiology,
The Hebrew University of Jerusalem’, Israel). Los aislados etiquetados
como L, Sy, y T, proceden de Líbano, Siria y Turquía, respectivamente, y
fueron proporcionados por el Dr. C. Akem (ICARDA, Aleppo, Siria).
Todos los aislados se han mantenido como cultivos monoconídicos en
suelo estéril, en tubos de ensayo, a 4ºC, en oscuridad. Los cultivos activos
de los aislados se obtuvieron a partir del subcultivo de los aislados
almacenados a 4ºC, en agar patata-dextrosa (PDA) a 25ºC y un
fotoperiodo de 12 h de luz fluorescente y cercana a ultravioleta (NUV) a
36 µEm -2 s -1 .
Para la extracción de ADN fúngico se utilizó micelio liofilizado de los
aislados. A tal fin, se transfirió 1 ml de suspensión de conidias (5 x 10 6
conidias/ml) a un matraz con 100 ml de caldo de patata-dextrosa (PDB).
Los cultivos fueron incubados durante 4 días en un agitador orbital
22

Capítulo I
Tabla 2. Información geográfica y racial sobre los aislados de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F. oxysporum (Fo) no patogénicos de
garbanzo, utilizados en el análisis RAPD-PCR
Raza
Aislado(s) a Origen b Patogenicidad Análisis RAPD c
GRUPO A
Foc-7932, -82115, -8317, -8601,
-8602, -8604, -8733, -8901, -8911,
-8912, -8913, -8914, -90111,
-9198, -91100, -91114
España 0 NT
Foc-1987-B EEUU 0 NT
Foc-USA 1633-2RIJ EEUU 1A NT
Foc-1992 R1N India 1A NT
Foc-8905, -8924 España 6 NT
Foc-1987 T EEUU 6 NT
GRUPO B
Foc-7802, -7952, -7982, -8207,
-82108, -82113, -8310, -8413,
-8415, -8717, -9018 JG62,
-9018 PV1, -91105, -91108
España 0 0
Foc-8250 d España NP NP
Foc-1987-W17, -USA 3-1 JG62 EEUU 1B/C 1B/C
Foc-7989 India 1A *
Foc-9166 e, -9168 Marruecos 1A *
Foc-8605, -1992 R2N India 2 2
Foc-8606, -1992 R3N India 3 3
Foc-8607, -1992 R4N India 4 4
Foc-8012, -8257, -8408, -8508, -9035 España 5 5
Foc-USA 1-1 JG62, -1987-W6-1 EEUU 5 5
Foc-9164 Marruecos 6 6
Foc-8272, -8720, -9023, -9093 PV1 España 6 6
GRUPO C
Foc-8503f, -9032 España 0 0 (W)
Foc-9165
Marruecos 1A * (W)
23

Capítulo I
Tabla 2. (Continuación) Información geográfica y racial sobre los aislados
de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F. oxysporum (Fo) no
patogénicos de garbanzo, utilizados en el análisis RAPD-PCR
Aislado(s) a
24
Raza
Origen b Patogenicidad Análisis RAPD c
Foc-9027 PV1e España 1A * (W)
Foc-USA SD-8415 EEUU 1A * (W)
Foc-9094 JG62 España 5 5 (W)
Foc-USA 6-1 JG62, -USA 14201 EEUU 5 5 (W)
Foc-9170 Marruecos 6 6 (W)
Foc-Tonini
GRUPO D
EEUU 6 6 (W)
Foc-cc21C, -cc62R, -cc63K Israel 0 0 (U)
Foc-L96-5 a -L96-7, -L96-9 a -L96-11 Líbano 0 0 (U)
Foc-Sy96-14-1, -Sy96-18-3, -Sy96-19-1 Siria 0 0 (U)
Foc-9601, -9603 a -9606 Túnez 0 0 (U)
Foc-T96-1-3 Turquía 0 0 (U)
Foc-cc22D Israel 1B/C 1B/C (U)
Foc-9602 Túnez 1B/C 1B/C (U)
Foc-Sy96-10-1 Siria 1B/C 1B/C (U)
Foc-T96-1-1, -T96-1-2, -T96-2-1,
-T96-2-2
Turquía 1B/C 1B/C (U)
Foc-9620, -9622, -9628, -9632 Israel 6 6 (U)
GRUPO E
Fo-9009, -9081, -90105 España NP NP
a Los aislados en los grupos A a D fueron caracterizados racialmente
mediante: A, análisis RAPD utilizando mezclas de ADN (ver Materiales y
Métodos: estrategia 1); B, análisis RAPD usando mezclas de ADN y ADN
individualizado (ver Materiales y Métodos: estrategia 2); C, análisis RAPD
en un ‘ensayo ciego’; D, pruebas de patogenicidad y análisis RAPD en
‘ensayos ciegos’ dobles. Grupo E: aislados de F. oxysporum no patogénicos
de garbanzo.
b Los aislados de EEUU (California), España, y Marruecos proceden de la
micoteca del Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de
Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba. Los aislados de la India fueron
proporcionados por el Dr. M. P. Haware, ICRISAT, Hyderabad, India. Los

Capítulo I
aislados procedentes de Túnez fueron proporcionados por el Dr. M. H.
Halila, Institute Nacionale de la Recherche Agronomique, Ariana, Túnez.
Los aislados de Israel fueron cedidos por el Profesor J. Katan,
Departamento de Patología Vegetal y Microbiología, The Hebrew
University of Jerusalem, Israel. Los aislados originarios de Líbano, Siria y
Turquía fueron proporcionados por el Dr. C. Akem, ICARDA, Aleppo,
Siria.
c NT = no estudiado; NP = no patogénico de garbanzo; U, W = la identidad
racial de estos aislados era desconocida (U), o conocida con anterioridad a
los análisis RAPD pero no fue revelada al operador hasta la terminación de
los análisis (W). El asterisco indica que no se encontraron marcadores
RAPD para la raza 1A.
d Aislado clasificado originalmente como raza 0 (Cabrera de la Colina, 1986)
pero confirmado posteriormente como aislado de F. oxysporum no
patogénico de garbanzo (Kelly et al., 1994).
e Aislados clasificados originalmente como pertenecientes a la raza 1A de F.
oxysporum f. sp. ciceris, pero caracterizados como raza 6 en pruebas de
patogenicidad duplicadas (Alcalá Jiménez, 1995).
f Aislado clasificado originalmente como raza 5 (Cabrera de la Colina, 1986)
pero confirmado en el presente trabajo como aislado perteneciente a la raza
0 de F. oxysporum f. sp. ciceris.
25

Capítulo I
a 125 rpm, 25ºC y 12 h de luz. El micelio se recolectó mediante filtrado a
través de gasa estéril, se lavó con abundante agua estéril, y después fue
liofilizado, y almacenado a –20ºC.
Pruebas de Patogenicidad
Los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris no caracterizados con anterioridad
a este estudio (Grupo D, en Tabla 2) se caracterizaron racialmente
mediante pruebas de patogenicidad, en la realización de ‘ensayos ciegos’ de
este trabajo. Para ello, se utilizaron las líneas de garbanzo diferenciadoras
raciales P-2245, JG-62, BG-212, C-104, JG-74, CPS-1, WR-315, Annigeri,
Chafa, K850 12-071/10054, y ICCV-4 (Haware y Nene, 1982b; Jiménez
Díaz et al., 1993a).
El inóculo se incrementó en una mezcla de arena y harina de maíz
(AMA) (Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985) durante 2 semanas a 25ºC, y
un fotoperiodo de 12 h de luz fluorescente y NUV a 36 µEm -2 s -1 . El AMA
infestado se mezcló con suelo esterilizado en autoclave (arena: limo: turba,
1:1:1, v/v) en una proporción de 1:12 (p/p).
Las semillas se desinfestaron superficialmente, se germinaron, y se
sembraron en macetas de arcilla de 15 cm de diámetro (cuatro plantas por
maceta) rellenas de la mezcla de suelo infestada. Las plantas testigo se
cultivaron en una mezcla de AMA no infestado y suelo esterilizado en
autoclave. Las plantas se incubaron en una cámara de cultivo ajustada a 24
± 1ºC, 60-90 % humedad relativa, y un fotoperiodo de 14 h de luz
fluorescente a 36 µEm -2 s -1 . Además, las plantas se fertilizaron
semanalmente con 100 ml de una solución nutritiva (Hoagland y Arnon,
1950).
Las plantas se observaron diariamente respecto del desarrollo de la
sintomatología de la enfermedad. La reacción de las plantas a la infección
se evaluó en base a la severidad de los síntomas en una escala de 0-4 según
el porcentaje foliar afectado (0=0%, 1=1-33%, 2=34-66%, 3=67-100%,
4=planta muerta), a intervalos de 7 días, durante 2 meses. Valores
26

Capítulo I
inferiores a 1 se consideraron propios de reacción de resistencia, y valores
superiores a 3 se consideraron reacciones susceptibles. Los valores de
enfermedad intermedios fueron considerados reacciones moderadamente
susceptibles. Una vez terminados los experimentos, se comprobó la
existencia de infección vascular en plantas sintomáticas y asintomáticas
mediante el aislamiento de Fusarium a partir de segmentos de tallos. Para
ello, los trozos de tejido se colocaron sobre agar-jugoV8-oxgall-PCNB
(VOPA), medio selectivo de Fusarium (Bouhot y Rouxel, 1971), y el
crecimiento polar del hongo desde la superficie de corte del tallo indicó la
infección vascular del tallo. Se realizaron dos experimentos, cada uno de
los cuales tuvo un diseño en bloques completos al azar, con tres
repeticiones (maceta con cuatro plantas) para cada combinación aisladolínea
diferenciadora.
Extracción de ADN
Para cada aislado fúngico se extrajo ADN genómico a partir de 50 mg de
micelio liofilizado y molido. El ADN se purificó mediante el método
descrito por Raeder y Broda (1985), con ligeras modificaciones. El micelio
molido fue resuspendido en una solución tampón de extracción (200 mM
Tris HCl [pH 8,5]; 25 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0,5% SDS). La mezcla se
homogenizó cuidadosamente con fenol equilibrado y una mezcla de
cloroformo : alcohol isoamílico (24:1), y se centrifugó durante 1 h a 13.000
rpm (4ºC). La fase acuosa se transfirió a un nuevo tubo y se sometió a un
tratamiento con ARNasa. Posteriormente, se añadió un volumen de
cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), y se centrifugó de nuevo durante 15
min a 13.000 rpm y 4ºC. La fase superior se transfirió a un nuevo tubo, el
ADN se precipitó con isopropanol frío, y a continuación se centrifugó
durante 30 min a 13.000 rpm. El ADN se resuspendió en 100 µl de agua
químicamente ultrapura (UHQ), y se almacenó a –20ºC. Con el fin de
estimar la calidad y concentración de las muestras de ADN, se analizaron
alícuotas de éstas en geles al 0,7% de agarosa y tampón Tris-acetato-
EDTA (TAE; 40 mM Tris-acetato y 1mM EDTA, pH 8,0). Las muestras
27

Capítulo I
de ADN se diluyeron a una concentración de 50-100 ng/µl en agua estéril
para las reacciones de PCR.
Análisis RAPD
Las reacciones RAPD (Williams et al., 1990) se realizaron utilizando 40
iniciadores de 10 nucleótidos correspondientes a los ‘kits’ OPF y OPI
(Operon Technology, Alameda, CA, EEUU). Las mezclas de reacción (25
µl) estuvieron compuestas por 0,5 µM de iniciador, 200 µM de cada dNTP,
2,5 µl de 10 x tampón de reacción (50 µM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0
[25 ºC], 1% v/v triton X-100), 2 U de Taq ADN Polimerasa (Promega,
Madison, WI, EEUU), 1,5 mM MgCl 2, y 50-100 ng de ADN fúngico.
Las amplificaciones se realizaron en varios termocicladores diferentes:
Perkin-Elmer 2400, Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT,
EEUU) y PTC 100 (MJ Research Inc., Watertown, MA, EEUU). El ciclo
de temperaturas consistió en 4 min de desnaturalización inicial a 94ºC, 30
ciclos de 1 min de desnaturalización a 94ºC, 1 min de complementación
entre el ADN molde y el iniciador a 37ºC, y 3 min de polimerización a
72ºC; el ciclo final fue de 6 min de extensión a 72ºC para producir
fragmentos completos de ADN de doble cadena. La temperatura entre la
complementación y la polimerización aumentó a 0,6ºC/s.
Los productos de amplificación fueron separados mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y 1,5 V·cm -1 , teñidos con
bromuro de etidio, y visualizados bajo luz ultravioleta. Como marcador de
peso molecular se utilizó el ‘0,1-kb DNA ladder XIV’ (Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemania). Todas las reacciones de amplificación fueron
repetidas al menos dos veces y siempre incluyeron controles negativos (sin
ADN molde).
La realización del análisis RAPD estuvo compuesta por dos estrategias
(1 y 2) con el objeto de facilitar la selección de los iniciadores que
produjesen los perfiles de amplificación más informativos. La estrategia 1
consistió en el análisis de mezclas de ADN de aislados pertenecientes a
28

Capítulo I
una misma raza. Para ello, se mezclaron cantidades iguales de ADN de
aislados pertenecientes a una misma raza de F. oxysporum f. sp. ciceris. De
esta manera se analizaron un total de 60 aislados del patógeno distribuidos
en ocho mezclas de ADN. Dichas mezclas de ADN estuvieron
compuestas por 32 aislados de la raza 0, cinco de la raza 1A, dos de cada
una de las razas 1B/C, 2, 3, y 4, siete de la raza 5 y ocho de la raza 6 (Tabla
2). Cada mezcla de ADN se amplificó utilizando 40 iniciadores Operon.
Todos los iniciadores que generaron fragmentos RAPD asociados a
alguna de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris fueron seleccionados para el
posterior análisis individualizado de los aislados componentes de las
mezclas de ADN (estrategia 2). El objetivo de la estrategia 2 fue confirmar
que los marcadores RAPD identificados en las mezclas de ADN de cada
raza eran igualmente amplificados en cada uno de los aislados
componentes de dichas mezclas. En esta segunda estrategia de estudio se
analizaron un total de 38 aislados F. oxysporum f. sp. ciceris (Tabla 2).
Análisis de datos
Un total de siete iniciadores, cuatro pertenecientes al grupo OPF (OPF-06,
-10, -12, -16) y tres al grupo OPI (OPI-01, -09, -18), amplificaron
polimorfismos consistentes e informativos en los análisis RAPD. Con el
objeto de estudiar la relación genética entre aislados pertenecientes a una
misma raza, así como entre razas, se analizó la información RAPD
generada a partir de ADN individual de aislados F. oxysporum f. sp. ciceris
presentes en las mezclas de ADN de cada raza, así como un grupo de
aislados del ‘ensayo ciego’. A tal fin, se construyó una matriz binaria
resultante de combinar los datos generados por el análisis RAPD de 57
aislados F. oxysporum f. sp. ciceris y cuatro aislados F. oxysporum no
patogénicos con los siete iniciadores. En la matriz se representó la
presencia o ausencia de los fragmentos amplificados como ‘1’ ó ‘0’,
respectivamente. Las bandas de ADN de igual movilidad en el gel (i. e., de
igual peso molecular) fueron consideradas idénticas. El análisis de
similaridad entre aislados se realizó mediante el programa NTSYSpc2.0
29

Capítulo I
(Rohlf, 1988) utilizando el ‘unweighted paired group method with
arithmetic averages’ (UPGMA), que se basó en el coeficiente de
similaridad de Jaccard (Sneath and Sokal, 1973). Este coeficiente considera
únicamente la coincidencia en la presencia de bandas, y no en su ausencia,
con lo cual muestra una imagen más precisa de la similaridad entre
aislados.
Los datos RAPD se utilizaron también para realizar el análisis de
Varianza Molecular (AMOVA, ‘Analysis of Molecular Variance’)
(Excoffier et al., 1992), a fin de identificar y analizar la variación genética
entre aislados. Esta metodología convierte la matriz de distancias
fenotípicas en el equivalente análisis de varianza, permitiendo así la
estimación de los componentes de la varianza de los haplotipos RAPD,
mediante la partición de la varianza total entre la que corresponde a la
variación entre poblaciones y la correspondiente a la variación
intrapoblacional. El nivel de significación de los valores AMOVA se
calculó mediante procedimientos permutacionales no paramétricos.
Resultados
Análisis RAPD de mezclas de ADN de aislados de F. oxysporum f. sp.
ciceris pertenecientes a una misma raza
El análisis RAPD inicial utilizando mezclas de ADN de aislados
pertenecientes a una misma raza del patógeno ha resultado una estrategia
muy eficiente en este trabajo ya que ha permitido estudiar de un gran
número de combinaciones aislado-iniciador. En ningún caso hubo
amplificación en las reacciones que sirvieron de control. Para la mayor
parte de los iniciadores, los perfiles de amplificación RAPD fueron
reproducibles entre experimentos tanto cuando se utilizó ADN extraído
del mismo micelio liofilizado, como cuando se utilizó ADN de micelio
obtenido de cultivos nuevos de los aislados F. oxysporum f. sp. ciceris.
Aquellos iniciadores para los que los perfiles de amplificación RAPD no
30

Capítulo I
fueron reproducibles fueron descartados. Los perfiles RAPD fueron
igualmente reproducibles cuando las amplificaciones fueron realizadas con
distintos termocicladores, y por distintos operadores del mismo
laboratorio y de diferente laboratorio, i. e., ‘Microbial Physiology Group’,
‘King’s College’, Universidad de Londres.
De los 40 iniciadores utilizados para amplificar las mezclas de ADN, 12
(OPF-05, -06, -08, -10, -12, -16, -18, -19; y OPI-01, -09, -18, -19)
produjeron 31 bandas de ADN polimórficas. En los perfiles de
amplificación realizados con dichos iniciadores se identificaron marcadores
RAPD putativos para todas las razas F. oxysporum f. sp. ciceris de este
trabajo, a excepción de la raza 1A. Para esta raza 1A, el análisis de las
mezclas de ADN produjo bandas de 1,2 y 2,7 kb que también fueron
amplificadas en la mezcla de ADN de aislados de la raza 6 del patógeno.
De igual manera, la banda de 1,5 kb generada por OPF-12 a partir de
ADN de cualquiera de las razas fue considerada marcadora de la forma
specialis ciceris.
Análisis RAPD de ADN de aislados individuales de cada raza
Con el objeto de confirmar la especificidad de las bandas RAPD
marcadoras de raza seleccionadas inicialmente del análisis de mezclas de
ADN, se realizaron análisis RAPD utilizando ADN individual de los
aislados componentes de dichas mezclas, y los 12 iniciadores que
generaron los marcadores inicialmente.
Siete de los 12 iniciadores amplificaron un total de 17 bandas de ADN,
generando perfiles de amplificación RAPD iguales para todos los aislados
de cada raza (Fig. 1 y 2). Esta consistencia confirmó la especificidad de las
bandas de ADN marcadoras de las razas 0, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6 (Tabla 3).
El aislado Foc–8250, representante de la raza 0, fue una excepción ya que
produjo un perfil RAPD completamente diferente a los obtenidos de los
otros 31 aislados de dicha raza, independientemente del iniciador o el
ADN utilizados (ADN mezcla o ADN individual) (Fig. 1 y 2). Esta
discrepancia fue confirmada mediante la realización de nuevos ensayos de
31

Capítulo I
patogenicidad, que indicaron que Foc–8250 es un aislado de F. oxysporum
no patogénico de garbanzo (Kelly et al., 1994).
Confirmación de la caracterización racial mediante análisis RAPD
La utilidad del análisis RAPD para la identificación de razas de F. oxysporum
f. sp. ciceris fue validada mediante ‘ensayos ciegos’, en los que se utilizaron
10 nuevos aislados del patógeno seleccionados de forma arbitraria de entre
los disponibles en nuestra colección de cultivos. Estos aislados (designados
‘W’ en la Tabla 2) habían sido caracterizados racialmente con anterioridad
mediante pruebas de patogenicidad. Asimismo, se incluyeron en los
análisis tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo. Todos
estos aislados fueron caracterizados racialmente mediante análisis RAPD, y
posteriormente se comparó dicha caracterización con su identidad racial
determinada con bioensayos.
Los análisis RAPD identificaron correctamente la raza a la cual
pertenecían los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris estudiados. Las bandas
RAPD que se señalan a continuación son diagnósticas para las siguientes
razas del patógeno: raza 0, 0,9 kb (OPI-09); raza 1B/C, 0,53 kb (OPI-09),
0,53 kb (OPI-18), 1,9 kb (OPF-06), 0,51 kb y 1,1 kb (OPF-10); raza 2, 0,9
kb (OPF-12); raza 3, 2,0 kb (OPF-06); raza 4, 0,95 kb (OPF-10); raza 5, 0,9
kb (OPF-10); y raza 6, 1,3 kb (OPI-09) (Fig. 1 y 2). La banda RAPD 1,5 kb
(OPF-12) fue confirmada como diagnóstica de la forma specialis ciceris (Tabla
3).
El aislado Foc–8503 había sido identificado como raza 5, previamente,
mediante bioensayos pero los análisis RAPD dieron como resultado un
perfil de amplificación RAPD característico de la raza 0. Posteriores
ensayos de patogenicidad con este aislado indicaron que causa el típico
síndrome de Amarillez (datos no mostrados) e identificaron a este aislado
como perteneciente a la raza 0.
32
El análisis RAPD de los tres aislados de F. oxysporum no patogénicos

2,6
1,
1,
0,
A B
M 1 2 3 4 5 6 7 8
M 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Capítulo I
0,65
kb
Figura 1. Amplificaciones RAPD generadas mediante el iniciador aleatorio OPF-
16 utilizando mezclas de ADN de aislados pertenecientes a la misma raza (A), y
ADN de aislados individuales (B) representativos de cada raza de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris. Los números a la izquierda son los pesos moleculares (kb)
del ‘0,1kb DNA ladder’ (Roche Diagnostics) (carril M). El número situado a la
derecha corresponde al peso molecular de la banda marcadora de la raza 0. A,
carriles 1-8, mezclas de ADN de las razas 0, 1B/C, 1A, 2, 3, 4, 5, y 6. B, carriles:
9-19, aislados de la raza 0 Foc–7802, –9018 JG62, –82108, –8717, –7952, –8207,
–9032, –9601, –91108, –9604, –82113; 20-22, aislados de la raza 1B/C Foc–USA
3-1JG62, –1987 W17; 23-26, aislados de la raza 1A Foc–7989, raza 5 Foc–8012,
raza 6 Foc–9093 PV1, y aislado de F. oxysporum no patogénico de garbanzo Fo–
9009, respectivamente.
33

Capítulo I
indicó que éstos presentaron ciertas similaridades con los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris de la raza 0. Los fragmentos RAPD de 0,39 kb
(iniciador OPF-12) y 0,65 kb (iniciador OPF-16) (Fig. 1) que habían
identificado a la raza 0 en análisis previos, fueron también amplificados
con estos iniciadores a partir de ADN de algunos de los aislados no
patogénicos de F. oxysporum.
Con objeto de reconfirmar la validez del análisis RAPD para la
identificación racial de los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris, se llevaron a
cabo ‘ensayos ciegos dobles’ de 29 aislados no caracterizados racialmente
procedentes de Israel, Líbano, Siria, Túnez y Turquía (Grupo D en Tabla
2). Cada aislado fue caracterizado racialmente mediante el análisis RAPD
utilizando los iniciadores OPI-01, OPI-09, OPI-18, OPF-06, OPF-10,
OPF-12, y OPF-16; y mediante pruebas de patogenicidad sobre líneas
diferenciadoras.
Los resultados de ambos análisis indicaron un 100% de coincidencia en
la identificación racial de cada aislado. Los 21 aislados de Líbano, Siria,
Túnez, y Turquía pertenecen al patotipo de Amarillez, de los cuales 16
fueron de la raza 0 y cinco de la raza 1B/C (Tabla 2). De igual manera, de
los ocho aislados procedentes de Israel, cuatro pertenecen al patotipo de
Amarillez (tres de la raza 0 y uno de la raza 1B/C) y cuatro fueron
clasificados como patotipo de Marchitez y fueron caracterizados como
raza 6 (Tabla 2).
Análisis de los datos RAPD
Los análisis RAPD generaron un total de 160 fragmentos de ADN. El
análisis UPGMA de los datos RAPD distribuyó los aislados F. oxysporum f.
sp. ciceris en tres grupos principales (‘clusters’) (I, II, III) cada una de los
cuales compartió aproximadamente un 72% de similaridad. Además, estos
‘clusters’ estuvieron altamente correlacionados con la capacidad de los
aislados de inducir el síndrome de Amarillez o de Marchitez (Fig. 3). Por el
34

2,6
1,
1,
0,
A
M 1 2 3 4 5 6 7 8
B
M 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
Capítulo I
0,9 kb
Raza
Figura 2. Amplificaciones RAPD generadas mediante el iniciador aleatorio OPF-
10 utilizando mezclas de ADN de aislados pertenecientes a la misma raza (A), y
ADN de aislados individuales (B) representativos de cada raza de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris. Los números a la izquierda son los pesos moleculares (kb)
del ‘0,1kb DNA ladder’ (Roche Diagnostics) (carril M). El número situado a la
derecha corresponde al peso molecular de la banda marcadora de la raza 5. A,
carriles 1-8, mezclas de ADN de las razas 0, 1B/C, 1A, 2, 3, 4, 5, y 6. B, carriles:
9-12, aislados de la raza 0 Foc–7802, –91108, –9018 JG62, –9601; 13-16, aislados
de la raza 1A Foc–9027 PV1, –9165, –9166, –7989; 17-23, aislados de la raza 5
Foc–8012, –8508, –9035, –USA 1-1 JG62, –USA 14201, –9094 JG62, –1987 W6-
1; 24-27, aislados de la raza 6 Foc–Tonini, –9023, –9164, –9093 PV1; y 28-29,
aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo Fo–8250 y –9009,
respectivamente.
35

Capítulo I
Tabla 3. Nombre y secuencia de los siete iniciadores seleccionados por su
capacidad de producir polimorfismos de ADN informativos para la
identificación de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y de sus razas patogénicas
mediante el análisis RAPD a
36
Nombre Secuencia (5’–3’)
Bandas de ADN (kb)
polimórfico amplificadas Raza patogénica
OPI-01 ACCTGGACAC 1,0 1A
1,2 0, 1A, 1B/C, 6
2,7 1A, 6
OPI-09 TGGAGAGCAG 0,53 1B/C
0,9 0
1,0 6
1,4 6
OPI-18 TGCCCAGCCT 0,53 1B/C
1,0 2, 3, 4
OPF-06 GGGAATTCGG 1,9 1B/C
2,0 3
OPF-10 GGAAGCTTGG 0,51 1B/C
0,95 4
0,9 5
1,1 1B/C
OPF-12 ACGGTACCAG 0,39 b 0
0,9 2
1,5 F. o. ciceris c
OPF-16 GGAGTACTGG 0,65 b 0
a Los análisis RAPD se realizaron utilizando ADN individualizado de aislados
presentes en el ADN mezcla de una raza.
b También amplificada en los análisis RAPD utilizando ADN de algunos
aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo.
c Banda RAPD identificada como marcadora de la forma specialis ciceris por ser
amplificada a partir de ADN de aislados pertenecientes a todas las razas de
F. oxysporum f. sp. ciceris, pero no de aislados de F. oxysporum no patogénicos
de garbanzo.

Capítulo I
contrario, los aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo no se
agruparon con los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris. Todos los aislados
de la raza 0, que causan el síndrome de Amarillez, constituyeron un
‘cluster’ (I) con una similaridad media aproximada entre aislados del 82%.
Los aislados de la raza 1B/C, que también inducen el síndrome de
Amarillez, se agruparon juntos formando otro ‘cluster’ (II). Todos los
aislados pertenecientes al patotipo de Amarillez, que incluye a los aislados
de las razas 0 y 1B/C, compartieron un 73% de similaridad media.
Todos los aislados causantes de síndrome de Marchitez, que comprende
a los aislados de las razas 1A, 2, 3, 4, 5, y 6, formaron un tercer ‘cluster’
(III) que compartió aproximadamente un 82% de similaridad media. Estos
aislados de marchitez estuvieron distribuidos en varios subgrupos con una
similaridad del 80% al 100%. Los aislados de las razas 2, 3, 4, procedentes
de la India constituyeron grupos distinguibles entre sí y separados de las
razas 1A, 5, y 6, dentro del ‘cluster’ de aislados de Marchitez (Fig. 3). No
existió asociación alguna entre la distribución de los aislados en el
dendrograma generado a partir de los datos RAPD y el origen geográfico
de los aislados, a excepción de la indicada para los aislados de la India.
La variación genética de F. oxysporum f. sp. ciceris según la asignación de
los aislados a un patotipo (Amarillez, Marchitez) y su origen geográfico se
estudió mediante el análisis AMOVA (Tabla 4). Los resultados del
AMOVA mostraron que las diferencias entre aislados pertenecientes a
cada uno de los dos patotipos fueron altamente significativas (P < 0,001).
Dentro del grupo de aislados del patotipo de Amarillez, las diferencias
genéticas entre las razas 0 y 1B/C fueron también altamente significativas,
siendo un 54% de la variación total atribuible a las diferencias entre razas.
El AMOVA también indicó que no hubo diferencias significativas entre
aislados que inducen el síndrome de Marchitez (razas 1A, 5 y 6)
procedentes de la región Mediterránea y de EEUU. Sin embargo, si hubo
diferencias altamente significativas (P < 0,001) entre el grupo de aislados
del patotipo de Marchitez procedentes de la India (razas 1A, 2, 3 y 4) y los
procedentes de la región Mediterránea y EEUU conjuntamente (razas 1A,
5 y 6). Asimismo, el AMOVA indicó que un 36% de la variación genética
total era debida a diferencias entre los aislados pertenecientes al patotipo
37

Capítulo I
de Marchitez (Tabla 4), y esta proporción aumentó cuando se excluyó del
análisis la raza 1A de la India (datos no mostrados).
Discusión
La identificación rápida y precisa de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris es
de crucial importancia para el desarrollo y utilización eficiente de cultivares
de garbanzo resistentes a la Fusariosis Vascular. Nuestro objetivo principal
en el trabajo contenido en este Capítulo fue determinar si las diferentes
razas de este patógeno podían ser distinguidas entre sí mediante el análisis
RAPD. Los resultados alcanzados respaldan dicha hipótesis, ya que se han
identificado fragmentos de ADN amplificados por iniciadores arbitrarios
en análisis RAPD que son diagnósticos de F. oxysporum f. sp. ciceris, así
como de las razas 0, 1B/C, 5, y 6 del patógeno.
La aplicabilidad general y fiabilidad del método han sido confirmadas al
identificar correctamente, mediante ‘ensayos ciegos’, la raza patogénica a la
que pertenecían aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris caracterizados
patogénicamente con anterioridad a este trabajo, así como aislados no
caracterizados previamente. El bajo número de aislados representativos de
las razas 2, 3, y 4 disponible para el estudio ha impuesto limitaciones en la
confirmación de la capacidad diagnóstica de los marcadores asociados a
dichas razas. En cambio, el mayor número de aislados de las razas 0,
1B/C, 5, y 6 que se han analizado, apoyan la consistencia y utilidad de los
marcadores RAPD identificados para la caracterización de estas razas.
En los últimos años, alguno trabajos realizados en otras formae speciales
de F. oxysporum, similares al aquí presentado, no han tenido éxito al tratar
de relacionar marcadores RAPD y razas patogénicas del agente (Woo et al.,
1996). En cambio, existen otros trabajos que han demostrado la utilidad de
la técnica RAPD para este propósito (Assigbetse et al., 1994; Grajal-Martín
38

0.00 0.25 0.50 0.75
7802
7952
8207
8413
9032
9605
9606
9603
8503
7982
82108
8310
8415
82113
91105
9018 PV1
9018 JG62
9601
8717
91108
9604
9602
1987-W17
USA3-1 JG62
9027 PV1
Tonini
9165
9093PV1
9164
9170
9166
7989
9168
8720
9620
9023
9622
9628
9632
8257
8408
8508
USA1-1 JG62
1987-W6-1
USA14201
9035
9094 JG62
8272
USA6-1 JG62
8012
USA-SD-8415
8605
1992R2N
8606
1992R3N
8607
1992R4N
9081
90105
8250
9009
1.00
Raza
patogénica Origen
Raza
patogénica geográfico
Origen
geográfico
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1B/C
1B/C
1B/C
1A
6
1A
6
6
6
1A
1A
1A
6
6
6
6
6
6
5
5
5
5
5
5
5
5
6
5
5
1A
2
2
3
3
4
4
NP
NP
NP
NP
España
España
España
España
España
Túnez
Túnez
Túnez
España
España
España
España
España
España
España
España
España
Túnez
España
España
Túnez
Túnez
EEUU
EEUU
España
EEUU
Marruecos
España
Marruecos
Marruecos
Marruecos
India
Marruecos
España
Israel
Israel
Israel
Israel
Israel
España
España
España
EEUU
EEUU
EEUU
España
España
España
EEUU
España
EEUU
India
India
India
India
India
India
España
España
España
España
Capítulo I
Amarillez Marchitez
Cluster I CII Cluster III
Figura 3. Dendrograma obtenido mediante el análisis UPGMA de los datos que
generó el análisis RAPD de 57 aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y cuatro
aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, con los iniciadores OPI-01,
OPI-09, OPI-18, OPF-06, OPF-10, OPF-12, y OPF-16. La escala inferior
corresponde a la similaridad entre aislados basada en el coeficiente de Jaccard.
NP=no patogénico de garbanzo.
39

Capítulo I
Tabla 4. Análisis de la varianza molecular, AMOVA, de los datos RAPDs
obtenidos a partir de 57 aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
agrupados según su patotipo (Amarillez, Marchitez), raza patogénica (razas
0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6), y origen geográfico
Fuente de Variación a
Grados de Cuadrado Componente de
libertad medio la varianzab Valor P c
Amarillez vs Marchitez 1 2,043 0,0712 (52,2)

Capítulo I
et al., 1993; Manulis et al., 1994; Migheli et al., 1998). Nuestro trabajo indica
una clara correlación entre los perfiles RAPD identificados y la
caracterización patogénica de las razas 0, 1B/C, 5, y 6 de F. oxysporum f. sp.
ciceris mediante bioensayos.
La falta de éxito en encontrar un marcador RAPD de los aislados de la
raza 1A, así como la identificación de ciertas bandas RAPD presentes en
las razas 1A y 6, puede ser explicado por la existencia de una gran
similaridad genética entre dichas razas. Un caso similar fue descrito por
Woo et al. (1996), quienes identificaron aislados de F. oxysporum f. sp.
phaseoli Kendr. & Zinder de diversa patogenicidad que presentaban
patrones RAPD similares. Las razas 1A y 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris
presentan patrones de virulencia similares en cultivares de garbanzo
diferenciadores (Halila y Strange, 1996; Jiménez Díaz et al., 1993a), por lo
que existe la posibilidad de una caracterización racial errónea de estos
aislados, debida a algún fallo durante la realización de las pruebas de
patogenicidad. Análisis RAPD adicionales, utilizando un mayor número de
aislados de la raza 1A del patógeno, así como nuevos iniciadores RAPD,
podrían resolver esta cuestión. Asimismo, también es posible que estas dos
razas patogénicas aún no se encuentren lo suficientemente separadas entre
sí desde un punto de vista evolutivo, para haber desarrollado marcadores
diagnósticos y patogénicos independientes.
Los marcadores RAPD identificados en este trabajo ofrecen
aplicaciones importantes para la epidemiología y manejo de la Fusariosis
Vascular del garbanzo. Esta utilidad ha sido probada mediante la
identificación correcta de dos aislados (Foc–8250 y –8503) cuyos perfiles
RAPD no correspondieron con la caracterización racial esperada. El
aislado Foc–8250 fue el menos virulento de los aislados de la raza 0
estudiados por Cabrera de la Colina (1986). Posteriormente, repetidas
pruebas de patogenicidad sobre líneas de garbanzo susceptibles, en
condiciones estandarizadas, revelaron tanto la ausencia de síntomas de
Amarillez como la ausencia de infección en la planta (Kelly et al., 1994).
Por lo tanto, tanto las pruebas de patogenicidad como la ausencia de los
marcadores RAPD de la raza 0 indicaron que Fo–8250 es un aislado no
patogénico de garbanzo. De forma similar, Foc–8503 fue caracterizado
41

Capítulo I
originalmente mediante bioensayos como un aislado de la raza 5, pero los
análisis RAPD, así como pruebas de patogenicidad repetidas,
reidentificaron a este aislado como perteneciente a la raza 0.
Un beneficio neto adicional de este estudio ha sido la posibilidad de
discriminar las razas 0 y 1B/C mediante el análisis RAPD, ya que dichas
razas inducen el síndrome de Amarillez en las pruebas de patogenicidad.
En trabajos anteriores, los análisis RAPD utilizando los iniciadores KS, P2,
y P6, no pudieron diferenciar entre esta dos razas, aunque si las asignaron
al patotipo de Amarillez (Kelly et al., 1994). Los casos reflejados son
ejemplos que resaltan los problemas que pueden presentarse en las pruebas
de patogenicidad, y que pueden ser eliminados mediante el uso de
marcadores RAPD diagnósticos.
El análisis de ‘clusters’ de los datos RAPD mostró una alta similaridad
genética entre los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris. Todos los aislados
que inducen el síndrome de Amarillez constituyen un grupo distintivo, que
corresponde a los aislados de las razas 0 y 1B/C. Por el contrario, los
aislados de Marchitez se ubicaron en otro gran ‘cluster’, agrupando a los
aislados de las razas 1A, 2, 3, 4, 5, y 6. Esta división en diferentes grupos
de los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris es consistente con la descrita por
Kelly et al. (1994), quienes utilizaron sólo tres iniciadores RAPD y una
parte del mismo grupo de aislados del patógeno que se ha utilizado en este
trabajo. Además, los resultados del análisis de ‘clusters’ son también
consistentes con los del análisis AMOVA. Por lo tanto, podemos concluir
que F. oxysporum f. sp. ciceris es un grupo clonal de aislados patógenos con
una fuerte estructura racial, en el cual la correlación entre los marcadores
genéticos neutrales y la patogenicidad puede ser utilizada para inferir
conclusiones sobre la relación genética entre razas.
Estudios anteriores demostraron que todas las razas de F. oxysporum f.
sp. ciceris presentan el mismo patrón RFLP del ADN mitocondrial (Pérez
Artés et al., 1995), pertenecen al mismo grupo de compatibilidad vegetativa
(VCG) (Nogales Moncada, 1997), y poseen el mismo elemento repetitivo
(Kelly, 1996). Además, el aislado Foc–USA 3-1 JG62 de la raza 1B/C
procedente de California puede formar heterocariontes estables (i. e.,
vegetativamente compatible) con aislados de F. oxysporum no patogénicos
42

Capítulo I
obtenidos de raíces de plantas sanas de garbanzo (Nogales Moncada,
1997). Este hecho sugiere que puede producirse el intercambio genético
asexual entre aislados de diferentes razas, y también entre aislados
patogénicos y no patogénicos.
Correll (1991) propuso varios modelos para explicar la relación entre
formae speciales, razas, y VCGs en F. oxysporum, con la asunción de que, en su
origen, la especie estuvo constituida por una población parasítica, no
patogénica, y diversa en VCGs, de la cual pudieron producirse mutaciones
en aislados que dieron lugar a la adquisición de la patogenicidad específica.
Nuestros resultados apoyan dicha hipótesis, y parecen corresponder al
patrón de diversidad entre razas y VCGs del modelo III de Correll (1991),
i. e., diferentes razas de una forma specialis originadas a partir del mismo
VCG. En nuestro trabajo hemos observado que los aislados de la raza 0 de
F. oxysporum f. sp. ciceris y algunos aislados de F. oxysporum no patogénicos
de garbanzo comparten bandas de ADN que son amplificadas por varios
iniciadores de Operon, en coincidencia con Pérez Artés et al. (1996)
quienes utilizaron diferentes aislados de F. oxysporum y los iniciadores KS,
P2, y P6 (Kelly et al., 1994). Hibridaciones ‘Southern’ utilizando como
sonda el fragmento RAPD específico de Amarillez clonado, demostraron
la existencia de cierta similitud en la secuencia de fragmentos de ADN
amplificados de aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo y
aislados del patotipo de Amarillez de F. oxysporum f. sp. ciceris (Pérez Artés
et al., 1996). El hecho de que los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
pertenecientes a un mismo VCG compartan una alta similaridad genética,
pero pertenezcan a razas diferentes, sugiere que estos aislados fueron
clones, o se originaron de un parental común, aunque en el presente se
encuentren separados geográficamente y sean patogénicamente diversos
(Leslie, 1993).
La raza 0 de F. oxysporum f. sp. ciceris no ha sido identificada en el
subcontinente Indio, pero es la más común de las identificadas en la región
Mediterránea (Halila y Strange, 1996; Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a;
Jiménez Díaz, no publicado). La raza 0 es no patogénica sobre el cv. JG-62,
susceptible universal de las razas causantes de Marchitez, y es patogénica
principalmente en cultivares de garbanzo ‘kabuli’ (Jiménez Díaz et al.,
43

Capítulo I
1989b; 1993a). Los garbanzos ‘kabuli’ se cultivan de forma tradicional y
generalizada en la región Mediterránea, mientras que los cultivares ‘desi’
son cultivados principalmente en el subcontinente Indio, y la mayoría son
resistentes a la raza 0 del patógeno. Las razas 2, 3, y 4, identificadas hasta
ahora sólo en la India, son las más virulentas de las ocho razas descritas
(Halila y Strange, 1996; Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b;
1993a), y las que más distan genéticamente del resto de las razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris (Fig. 3, Tabla 4). Esta aparente correlación entre las
razas patogénicas del agente y los cultivares del huésped, podría explicarse
si las razas fuesen grupos de aislados geográficamente separados adaptados
al germoplasma local.
En conclusión, la metodología RAPD constituye una herramienta
diagnóstica poderosa para la identificación de las principales razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris presentes en la región Mediterránea. Los marcadores
moleculares que hemos identificados podrán ser utilizados para estudiar la
distribución de dichas razas, y facilitar así el empleo eficiente de los
cultivares resistentes disponibles. Estos marcadores ayudarán a la
detección temprana de la posible introducción de razas, así como a la
detección de los cambios que puedan ocurrir en la frecuencia relativa de las
distintas razas en una población, como repuesta a la utilización de
cultivares de garbanzo resistentes. Finalmente, las bandas de ADN
marcadoras con probada capacidad diagnóstica podrán ser clonadas y
secuenciadas, con el objeto de desarrollar sondas e iniciadores específicos
de raza, para uso en hibridaciones ‘dot-blot’ o PCR específica,
respectivamente.
44

CAPÍTULO II
Capítulo II
Desarrollo de un método basado en el análisis PCR
específica para la identificación molecular de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y de las razas
patogénicas 0, 1A, 5, y 6
Introducción
Tradicionalmente, la identificación de hongos fitopatógenos se ha basado
en la observación y comparación de caracteres morfológicos de los
especímenes; sin embargo, en cada uno de los niveles taxonómicos, i. e.,
especie, subespecie, variedad, forma specialis y raza, cada vez es menos
numeroso el tipo de caracteres morfológicos que se consideran válidos
para la diferenciación entre dichos grupos. Además, mientras que
subespecies y variedades suelen diferir en algunos aspectos morfológicos,
formae speciales y razas difieren generalmente en la gama de especies y de
cultivares de éstas, respectivamente, sobre las que son patogénicas, pero no
pueden ser distinguidas entre si por su morfología (Coddington y Gould,
1992).
La taxonomía de Fusarium es un tema complejo que se encuentra en
constante proceso de revisión y actualización (Nelson et al., 1981; 1983). F.
oxysporum Schlechtend.:Fr. es un hongo anamórfico que incluye tanto
45

Capítulo II
aislados fitopatogénicos como no patogénicos. Las formas patogénicas
causan enfermedades vasculares y podredumbres corticales, y se agrupan
en formae speciales en base a su gama de plantas susceptibles. Además,
dentro de una forma specialis puede existir variación en la virulencia que sus
miembros manifiestan sobre cultivares de su especie, dando lugar a la
designación de patotipos y razas patogénicas (Kistler, 1997).
F. oxysporum f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato es paradigmática
entre las formae speciales de F. oxysporum en términos de diversidad
patogénica. Así, los componentes de las poblaciones naturales de este
patógeno de suelo pueden ser diferenciados en los patotipos de Amarillez
y Marchitez, por las características del síndrome patológico que determinan
en cultivares de garbanzo susceptibles en inoculaciones artificiales por
siembra en suelo infestado; i. e., Amarillez: clorosis foliar progresiva,
coloración vascular y muerte de la planta a los 40 días de la inoculación;
Marchitez: clorosis severa, flacidez, coloración vascular y muerte antes de
los 20 días de la inoculación (Trapero Casas, 1983; Trapero Casas y
Jiménez Díaz, 1985). Superpuesta sobre la diferenciación en patotipos, los
componentes de F. oxysporum f. sp. ciceris pueden ser asignados a una de
ocho razas patogénicas (razas 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6) según la reacción
diferencial de líneas diferenciadoras en inoculaciones estandarizadas, en
ambiente controlado (Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b;
1993a).
En consecuencia y en ausencia de métodos alternativos, la
caracterización de aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris, como los de otras
formae speciales de F. oxysporum, requiere de la realización de bioensayos que
conllevan la inoculación del huésped para reproducir la sintomatología
característica de la enfermedad. Los procedimientos experimentales para
llevar a cabo dichos bioensayos son relativamente simples y
económicamente practicables, pero requieren tiempo, disponibilidad de
recursos e instalaciones experimentales, y operarios especializados.
Asimismo, el resultado de este tipo de metodologías depende en cierta
manera del juicio subjetivo del investigador y, consecuentemente, de su
experiencia en la realización de diagnósticos visuales. Además, en nuestra
experiencia en la Fusariosis Vascular del garbanzo, aislados no patogénicos
46

Capítulo II
de F. oxysporum obtenidos de plantas de garbanzo sintomáticas pueden ser
identificados erróneamente como F. oxysporum f. sp. ciceris debido a fallos
inherentes al sistema experimental (i. e., incubación de plantas inoculadas
en ambiente inadecuado, inóculo insuficiente, senescencia prematura de las
plantas, etc.). Morfológicamente, los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
son indistinguibles de aquellos aislados no patogénicos de F. oxysporum que
se encuentran infectando el córtex radical de garbanzo, pero que no son
capaces de invadir el sistema vascular, y por tanto no causan enfermedad.
La identificación consistente, rápida y precisa de las variantes
patogénicas del agente es clave para el desarrollo y utilización eficiente de
cultivares resistentes del huésped, que en muchos casos es el medio de
lucha más eficiente contra enfermedades de plantas. Por ello, existe una
gran demanda de métodos simples, fiables, y rápidos para la detección y
diferenciación de formas patogénicas especializadas de F. oxysporum, que
no estén basados en caracteres morfológicos ni patogénicos.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, ‘Polymerase Chain
Reaction’) ha sido utilizada ampliamente y con éxito para la identificación
de hongos fitopatógenos de importancia, como Verticillium dahliae Kleb. y
V. albo-atrum Reinke & Berthold (Carder y Barbara, 1994; Nazar et al.,
1991; Pérez-Artés et al., 2000), Phytophthora spp., etc. (Henson y French,
1993; Martin et al., 2000; Miller, 1996), así como para diferenciar F.
culmorum (W. G. Sm.) Sacc., F. graminearum Schwäbe, y F. avenaceum (Fr.)
Sacc. (Schilling et al., 1996).
Las estrategias utilizadas convencionalmente, para desarrollar un
método de identificación de especies de hongos fitopatógenos basado en la
PCR, ha sido el diseño de iniciadores basados en secuencias polimórficas
de regiones de ADN altamente conservadas entre aquéllas, tales como las
regiones ITS (‘Internal Transcribed Spacer’) e IGS (‘Intergenic Spacer’) del
ADN ribosómico (Henson y French, 1993; Ward, 1994). Aunque estas
estrategias han tenido éxito para la identificación de especies (Bunting et al.,
1996; Lee et al., 1993; Lévesque et al., 1994; Nazar et al., 1991), no ocurre
así en cuanto a su uso para la diferenciación de grupos o variantes
subespecíficos, tales como formae speciales o razas patogénicas (White et al.,
1990). En cambio, otra de las estrategias utilizadas para desarrollar
47

Capítulo II
marcadores específicos, basada en el aislamiento y secuenciación de
fragmentos de ADN polimórfico amplificados mediante RAPD (‘Random
Amplified Polymorphic DNA’), sí permite detectar y utilizar
polimorfismos asociados a dichos grupos subespecíficos. La utilización de
fragmentos RAPD secuenciados (SCARs, ‘Sequence Characterized
Amplified Regions’) fue aplicada por primera vez por Paran y Michelmore
(1993) para identificar resistencia a Mildiu (Bremia lactucae Regel) en lechuga
(Lactucae sativa L.).
El objetivo de las investigaciones contenidas en este Capítulo fue
desarrollar un método diagnóstico rápido, eficaz, sensible y fiable que
posibilite la detección selectiva de la forma specialis ciceris, patogénica en
garbanzo, así como la identificación y diferenciación de las razas
patogénicas de F. oxysporum f. sp. ciceris presentes en la Cuenca
Mediterránea.
En investigaciones anteriores (Capítulo I), estudiamos la diversidad
genética de una colección mundial de aislados del patógeno representativos
de todas las razas patogénicas, mediante el análisis RAPD-PCR. Dichas
investigaciones dieron lugar a la identificación de iniciadores arbitrarios
que generan marcadores RAPD diagnósticos de F. oxysporum f. sp. ciceris,
así como de las razas 0, 1B/C, 5, y 6 del patógeno. La amplificación que
generan dichos iniciadores ha demostrado ser sumamente útil para la
diferenciación del patógeno y de sus razas; sin embargo, debido a la
naturaleza aleatoria de los marcadores RAPD, la reproducibilidad de la
técnica podría ser influida por determinados factores, incluyendo la fuente
y procedimiento de extracción del ADN fúngico, la existencia de
contaminantes, la amplificación de secuencias de ADN diferentes pero del
mismo tamaño que el fragmento marcador, etc.
Para obviar la posibilidad de las dificultades referidas anteriormente,
hemos desarrollado un método de análisis PCR específica que ha requerido
el diseño de iniciadores basados en las secuencias de ADN de dichas
bandas marcadoras RAPD. El desarrollo de tales iniciadores y la tecnología
de PCR específica facilitaría eventualmente la detección de F. oxysporum f.
sp. ciceris y sus razas patogénicas en tejido vegetal infectado y en suelo. En
el presente Capítulo de esta Tesis Doctoral estudiamos la posibilidad de
48

Capítulo II
utilizar SCARs para desarrollar marcadores basados en PCR específicas, a
partir de marcadores RAPD informativos. Para la consecución de dicho
objetivo fue necesario: (i) clonar los fragmentos RAPD asociados a cada
raza de F. oxysporum f. sp. ciceris; (ii) caracterizar las secuencias de ADN
contenidas en los fragmentos clonados, para lo cual es necesario asegurar
la especificidad de éstos mediante hibridaciones con el perfil RAPD y con
ADN genómico de las razas digerido con enzimas de restricción; (iii)
secuenciar dichos fragmentos; y (iv) diseñar iniciadores a partir de las
regiones extremas y demostrar su validez mediante la realización de análisis
de PCR específica.
Materiales y Métodos
Aislados fúngicos
Se han utilizado 76 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris representativos de
las ocho razas patogénicas (0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6) descritas y de un
amplio origen geográfico del patógeno (Tabla 5). De igual manera, se han
incluido en el estudio 20 aislados de F. oxysporum obtenidos de raíces sanas
de garbanzo y no patogénicos de éste (Tabla 5), seis aislados pertenecientes
a otras formae speciales de F. oxysporum (Tabla 6), y 58 aislados de 47 especies
de Fusarium diferentes a F. oxysporum (Tabla 6). Todos los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris habían sido caracterizados racialmente en trabajos
anteriores (Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a; Kelly et al., 1994; Capítulo I).
Los 96 aislados de F. oxysporum patogénicos y no patogénicos de
garbanzo, así como los seis pertenecientes a otras formae speciales, proceden
de la colección del Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de
Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba, y los restantes aislados fueron
amablemente cedidos por el Dr. J. F. Leslie, Departamento de Patología
Vegetal, Universidad de Kansas, Manhattan, KS, EEUU. Todos los
aislados se han mantenido almacenados como cultivos monoconídicos en
suelo estéril en tubos de ensayo, a 4ºC, en oscuridad. De dichos cultivos se
49

Capítulo II
obtuvieron cultivos en crecimiento activo mediante métodos descritos
anteriormente (Pág. 22, Capítulo I).
Para la extracción de ADN fúngico se utilizó micelio liofilizado de los
aislados. A tal fin, el micelio se obtuvo por dos métodos: (1) mediante
cultivo en caldo de patata-dextrosa (PDB) y posterior filtrado, lavado y
liofilización del micelio recogido (Pág. 26, Capítulo I); o (2) mediante
cultivo del hongo sobre una lámina de celofán estéril (121 ºC, 20 min, en
autoclave) colocada sobre agar patata-dextrosa (PDA). La lámina de
celofán permite el tránsito de nutrientes hacia el micelio fúngico en
crecimiento, mientras que el tamaño de sus poros es demasiado pequeño
para permitir el crecimiento de las hifas fúngicas a su través. De esta
manera, se pudo recolectar gran cantidad de micelio puro de los aislados
fúngicos mediante el raspado de la colonia. Posteriormente, este micelio
fue sometido a los procesos de liofilización, y molienda, quedando listo
para proceder a la extracción de su ADN.
Extracción de ADN
El ADN genómico de cada aislado se purificó a partir de micelio
liofilizado y molido, según el método de Raeder y Broda (1985) con ligeras
modificaciones (Pág. 27-28, Capítulo I). Las muestras de ADN se
diluyeron hasta una concentración de 5-10 ng/µl para realizar los análisis
PCR posteriores.
Reacciones de amplificación RAPD
Las reacciones de amplificación RAPD se realizaron de forma idéntica a la
descrita anteriormente (Pág. 28, Capítulo I) utilizando los iniciadores de 10
oligonucleótidos OPF-10, OPF-12 y OPI-09 (Operon Technology,
Alameda, CA, EEUU) (Tabla 3, Pág. 36, Capítulo I). Las condiciones de
50

Capítulo II
Tabla 5. Información geográfica y racial sobre los aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F. oxysporum (Fo)
no patogénicos de garbanzo, utilizados en el análisis PCR específica
Aislado Origen geográfico a Raza patogénica b Aislado Origen geográfico a Raza patogénica b
Foc-7802 España 0 Foc-9606 Túnez 0
Foc-7952 España 0 Foc-T3 Túnez 0
Foc-8207 España 0 Foc-cc21C Israel 0
Foc-82108 España 0 Foc-cc62R Israel 0
Foc-82113 España 0 Foc-cc63K Israel 0
Foc-8503 España 0 Foc-L96-5 Líbano 0
Foc-8733 España 0 Foc-L96-6 Líbano 0
Foc-8912 España 0 Foc-L96-7 Líbano 0
Foc-9018 PV1 España 0 Foc-L96-9 Líbano 0
Foc-9018 JG62 España 0 Foc-L96-10 Líbano 0
Foc-9032 España
0 Foc-L96-11 Líbano 0
Foc-90111 España 0 Foc-Sy 96-14-1 Siria 0
Foc-91100 España 0 Foc-Sy 96-18-3 Siria 0
Foc-91015 España 0 Foc-Sy 96-19-1 Siria 0
Foc-91108 España 0 Foc-T 96-1-3 Turquía 0
Foc-91114 España 0 Foc-USA 3-1JG62 EEUU 1B/C
Foc-9601 Túnez 0 Foc-1987-W17 EEUU 1B/C
Foc-9603 Túnez 0 Foc-9602 Túnez 1B/C
Foc-9604 Túnez 0 Foc-Sy 96-10-1 Siria 1B/C
Foc-9605 Túnez 0 Foc-T 96-1-1 Turquía 1B/C
51

Capítulo II
Tabla 5. (Continuación) Información geográfica y racial sobre los aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F.
oxysporum (Fo) no patogénicos de garbanzo, utilizados en el análisis PCR específica
52
Aislado Origen gepgráfico a Raza patogénica b Aislado Origen geográfico a Raza patogénica b
Foc-T 96-1-2 Turquía 1B/C Foc-9094 PV1 España 5
Foc-T 96-2-1 Turquía 1B/C Foc-9094 JG62 España 5
Foc-T 96-2-2 Turquía 1B/C Foc-USA1-1JG62 EEUU
5
Foc-cc22D Israel 1B/C Foc-USA W6-1 EEUU 5
Foc-7989 India 1A Foc-USA14201 EEUU 5
Foc-9027 PV1c España
1A Foc-8272 España 6
Foc-9166 c Marruecos
1A Foc-8905 España 6
Foc-9168 Marruecos 1A Foc-8924 España 6
Foc-8605 India 2 Foc-9023 España 6
Foc-1992 R2N India 2 Foc-9093 PV1 España 6
Foc-8606 India
3 Foc-9164 Marruecos 6
Foc-1992 R3N India 3 Foc-9170 Marruecos 6
Foc-8607 India
4 Foc-Tonini EEUU 6
Foc-1992 R4N India 4 Foc-9620 Israel 6
Foc-8012 España
5 Foc-9622 Israel 6
Foc-8257 España 5 Foc-9628 Israel 6
Foc-8408 España 5 Foc-9632 Israel 6
Foc-8508 España 5 Fo-8250 España NP
Foc-9035 España 5 Fo-9009 España NP

Capítulo II
Tabla 5. (Continuación) Información geográfica y racial sobre los aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F.
oxysporum (Fo) no patogénicos de garbanzo, utilizados en el análisis PCR específica
Aislado Origen geográfico a Raza patogénica b Aislado Origen geográfico a Raza patogénica b
Fo-9081
Fo-90101
Fo-90105
Fo-9169
Fo-91117
Fo-Fsp4
Fo-Fsp7
Fo-Fsp8
Fo-Fsp9
España NP Fo-420 Italia NP
España NP Fo-422 Italia NP
España NP Fo-425 Italia NP
Marruecos NP Fo-442 Italia NP
España NP Fo-448 Italia NP
Argelia NP Fo-457 Italia NP
Argelia NP Fo-506 Italia NP
Argelia NP Fo-526 Italia NP
Argelia NP Fo-C4P Italia NP
a
Los aislados de Argelia, EEUU (California), España, Italia y Marruecos proceden de la micoteca del Departamento de Protección
de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba. Los aislados de la India fueron proporcionados por el Dr. M. P.
Haware, ICRISAT, Hyderabad, India. Los aislados procedentes de Túnez fueron proporcionados por el Dr. M. H. Halila, Institute
Nacionale de la Recherche Agronomique, Ariana, Túnez; los aislados de Israel fueron cedidos por el Profesor J. Katan,
Departamento de Patología Vegetal y Microbiología, The Hebrew University of Jerusalem, Israel; los aislados originarios de
Líbano, Siria y Turquía fueron proporcionados por el Dr. C. Akem, ICARDA, Aleppo, Siria.
b Raza determinada mediante pruebas de patogenicidad en líneas de garbanzo diferenciadoras (Alcalá-Jiménez, 1995; Jiménez-Gasco
et al., 2001). NP = no patogénicos de garbanzo.
c
Aislados caracterizados por Alcalá Jiménez (1995) como pertenecientes a la raza 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris en pruebas de
patogenicidad duplicadas.
53

Capítulo II
Tabla 6. Aislados de diferentes formae speciales de Fusarium oxysporum, así
como de otras Fusarium spp. utilizados en el análisis PCR específica de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y de las razas patogénicas 0, 1A, 5, y 6
Fusarium spp. a Aislado
F. oxysporum Schlechtend.:Fr.
f. sp. lycopersici (Sacc.) Snyder & Hansen
f. sp. melonis (Leach & Currence) Snyder &
Hansen Fom-8701, -9016
f. sp. niveum (E. F. Sm.) Snyder & Hansen Fon-8805, Fon-8822
f. sp. phaseoli Kendr. & Snyder DR85
F. acuminatum Ellis & Kelerm. 11442
F. acutatum Nirenberg & O’Donnell 10769
F. armeniacum (Forbes et al.) Burgess & Summerell 11623
F. andiyazi 4647
F. anthophilum (A. Braun) Wollenw. 11560
F. avenaceum (Fr.) Sacc. 11440
F. babinda Summerell, Rugg & Burgess 11478
F. begoniae Nirenberg & O’Donnell 10767
F. brevicatenulatum Nirenberg & O’Donnell 10756
F. bulbicola Nirenberg & O’Donnell 10759
F. chlamydosporum Wollenw. & Reiking 11397
F. circinatum Nirenberg & O’Donnell 10766, H-10847, H-10850
F. compactum (Wollenw.) Gordon 11624
F. concentricum Nirenberg & O’Donnell 10765
F. crookwellense Burgess, Nelson, & Tousson 11451
F. culmorum (W. G. Smith) Sacc. 11427
F. decemcellulare Brick 11411
F. denticulatum Nirenberg & O’Donnell 10763
F. dimerum Penzig 11425
F. equiseti (Corda) Sacc. 11439
F. globosum Rheeder et al. 11554
F. guttiforme Nirenberg & O’Donnell 10764
F. lactis Pirotta & Riboni 10757
F. lateritium Nees 11403
F. longipes Wollenw. & Reiking 11428
54

Capítulo II
Tabla 6. (Continuación) Aislados de diferentes formae speciales de Fusarium
oxysporum, así como de otras Fusarium spp. utilizados en el análisis PCR
específica de F. oxysporum f. sp. ciceris y de las razas patogénicas 0, 1A, 5, y 6
Fusarium spp. a Aislado
F nelsonii Marasas & Logrieco
11564
F. nisikadoi Nirenberg & Aoki 10758
F. nygamai Burgess & Trimboli 5111
F. phyllophilum Nirenberg & O’Donnell 10768
F. poae (Peck) Wollenw. 11470
F. polyphialidicum Marasas, Nelson, Tousson & van Wijk 11414
F. proliferatum (Matsushima) Nirenberg 11558, D-4853, D-4854
F. pseudoanthophilum Nirenberg et al. 10755
F. pseudocircinatum O’Donnell & Nirenberg 10761
F. pseudograminearum O´Donnel & Aoki 11435
F. pseudonygamai O’Donnell & Nirenberg 10762
F. ramigenum O’Donnell & Nirenberg 10670
F. sacchari (Butler) W. Gams 278, B-3852, B-3853
F. scirpi Lambotte & Fautr. 11409
F. semisectum Berk. & Rav. 11432
F. solani (Martius) Sacc. 11420
F. sporotrichioides Sherb. 11552
F. subglutinans (Wollenw. & Reinking) Nelson et al. 11544, E-990, E-2192
F. thapsinum Klittich et al. F-4093, F-4094
F. torulosum (Berk. & Curt.) Nirenberg 11419
F. tricinctum (Corda) Sacc. 11566
F. verticillioides (Sacc.) Nirenberg 11556, A-149, A-999
a Los aislados de F. oxysporum proceden de la micoteca del Departamento de
Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba.
Los aislados de las diferentes especies de Fusarium fueron proporcionados por
el Dr. J. F. Leslie, Department of Plant Pathology, Kansas State University,
Manhattan, KS, EEUU.
55

Capítulo II
reacción fueron iguales a las descritas anteriormente, salvo porque se
utilizó 0,6 U de EcoTaq ADN Polimerasa (EcoGen, Madrid, España) por
reacción. Las amplificaciones se realizaron en los termocicladores Perkin-
Elmer 2400 y Perkin-Elmer 9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, EEUU).
Posteriormente, los fragmentos RAPD fueron separados mediante
electroforesis en geles de agarosa y visualizados bajo luz ultravioleta, como
se ha descrito anteriormente (Pág. 28, Capítulo I)
Clonación de fragmentos RAPD
Los fragmentos RAPD asociados a alguna de las razas de F. oxysporum f.
sp. ciceris se retiraron del gel de agarosa y se purificaron mediante el ‘kit’
Qiaex II (Qiagen, Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del
fabricante. La estrategia seguida fue la clonación T/A, que se basa en que
la gran mayoría de las enzimas ADN polimerasas generan fragmentos de
ADN con extremo 3’-A; con lo cual el método más eficaz de clonación es
unir dichos fragmentos amplificados a vectores bacterianos linearizados
que presentan extremos 3’-T. Para ello se utilizaron los plásmidos
bacterianos pGem-T (Promega, Madison, WI, EEUU) o pCR2.1-TOPO
vector (‘TOPO TA Cloning kit’, Invitrogen, Groningen, Holanda), y
posteriormente se transformaron células supercompetentes DH5α
(Sambrook et al., 1989) o TOP 10F’ (‘TOPO TA Cloning Kit’, Invitrogen,
Groningen, Holanda) de Escherichia coli.
Las colonias bacterianas que albergaban plásmido recombinante fueron
identificadas por la tonalidad blanca que adquirieron en el medio Luria-
Bertani (LB) ampicilina/X-gal/IPTG, en contraste con la coloración azul
que presentan las colonias bacterianas con plásmido sin inserto, debido a la
α complementación (Sambrook et al., 1989). Para obtener los clones
bacterianos que albergaban los plásmidos con el inserto correcto se realizó
el siguiente proceso: (1) se seleccionaron entre 30 y 50 colonias blancas
por cada transformación; (2) se purificó ADN plasmídico a partir de 1,5
56

Capítulo II
ml de cada cultivo bacteriano incubado durante la noche a 37 ºC en medio
LB líquido, mediante el método de lisis por ebullición (Sambrook et al.,
1989); (3) se seleccionaron un conjunto de clones potencialmente
adecuados en base a su migración en gel de agarosa; (4) de ese primer
conjunto seleccionado se eligieron entre cuatro y seis clones según su
perfil de restricción con las enzimas EcoRI, BamHI, XbaI, ApaI, PstI, y SacI
(Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania; Pharmacia KLB, Upsala,
Suecia); y (5) cada uno de los clones seleccionados fue utilizado como
sonda en experimentos de hibridación con el perfil RAPD generado por el
iniciador que amplificó el fragmento original.
Purificación de plásmido bacteriano
El plásmido bacteriano se purificó por tres métodos diferentes, i. e.,
mediante lisis por ebullición, lisis alcalina, y ‘Qiagen Plasmid Minikit’
(Qiagen, Hilden, Alemania). En el método de lisis por ebullición se
centrifugaron (5 min, 6.000 rpm) 1,5 ml de cultivo bacteriano en medio LB
líquido con ampicilina (incubado en agitación durante la noche a 37 ºC), y
el precipitado se resuspendió en 350 µl de solución STET (8% sacarosa,
0,5% Triton-X, 50 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,0). Posteriormente, se
añadieron a la mezcla 25 µl de lisozima fresca (10 mg/ml, en 10 mM
Tris·HCl [pH 8,0]), y ésta se incubó a 100 ºC durante 40 s exactos.
Después, la mezcla se centrifugó (10 min, 13.000 rpm) para eliminar los
restos de células bacterianas, al sobrenadante acuoso se añadieron 40 µl de
2,5 M acetato sódico (pH 5,2) y 420 µl de isopropanol puro, y
seguidamente se centrifugó (5 min, 13.000 rpm) para precipitar el ADN. El
ADN precipitado se resuspendió en 40 µl de H 2O UHQ.
Para la purificación de ADN plasmídico mediante lisis alcalina, el
precipitado obtenido por centrifugación de 3 ml de cultivo bacteriano en
medio LB líquido con ampicilina (incubado en agitación durante la noche,
a 37 ºC) se resuspendió en 200 µl de solución tampón GTE (50 mM
Glucosa, 25 mM Tris [pH 8,0], 10 mM EDTA). Después, a la suspensión
se añadieron secuencialmente 300 µl de una solución fresca de 0,2 M
57

Capítulo II
NaOH :1% SDS, y 300 µl de 3 M acetato sódico, con 5 min de incubación
a 0 ºC después de cada adición. Seguidamente, la mezcla se centrifugó (10
min, 13.000 rpm), y se trató el sobrenadante con ARNasa. El sobrenadante
tratado se extrajo con cloroformo : alcohol isoamílico (24:1), se precipitó
el ADN plasmídico con isopropanol, y se centrifugó 30 min a 13.000 rpm.
El ADN se resuspendió en 30 µl de H 2O UHQ.
Por último, el ADN plasmídico destinado a la secuenciación fue
purificado mediante el ‘Qiagen Plasmid Minikit’ siguiendo las instrucciones
del fabricante.
Hibridación de las bandas clonadas con los perfiles de amplificación
RAPD y PCR específica
Los fragmentos RAPD clonados en vectores bacterianos se utilizaron
como sondas de ADN en hibridaciones con el perfil RAPD generado por
el iniciador que originó cada fragmento transferido a membranas de nylon.
Estas hibridaciones se llevaron a cabo con cuatro fines: (1) confirmar que
el clon bacteriano seleccionado albergaba el inserto de estudio, y no otro
diferente, como resultado de la escisión incorrecta de ADN del perfil
RAPD; (2) confirmar que existe homología entre las bandas del mismo
peso molecular amplificadas en aislados pertenecientes a la misma raza; (3)
confirmar que esa misma banda RAPD no está siendo amplificada en
aislados de otras razas a intensidad no detectable en gel de agarosa; y (4)
desestimar la posibilidad de que exista homología entre el fragmento
RAPD en proceso de estudio, y otros fragmentos de diferente peso
molecular originados por el mismo iniciador aleatorio. Para ello, los
perfiles de amplificación RAPD de un grupo de aislados representativos de
todas las razas patogénicas y orígenes geográficos del patógeno, separados
en geles de agarosa tales como los descritos con anterioridad, fueron
transferidas por capilaridad en condiciones alcalinas (Sambrook et al.,
1989) a membranas Zeta-Probe Blotting Membranes (Bio-Rad Lab. S.A.,
Madrid).
58

Capítulo II
Para la producción de las sondas de ADN, se obtuvo primero el inserto
correspondiente mediante digestión del plásmido bacteriano con las
enzimas de restricción que tenían su secuencia de corte en la región
‘polylinker’ del vector. Seguidamente, el inserto y el vector se separaron
electroforéticamente, y el inserto se escindió del gel de agarosa mediante el
‘kit’ Quiaex II, y se marcó. El marcaje se realizó por métodos no
radiactivos, mediante la incorporación de DIG-11-dUTP [digoxigenina-3-
O– metilcarbonil – amino– caproil– 5-(3-aminoalil)-ridina5’trifosfato]con
iniciadores aleatorios utilizando el ‘DNA labelling kit’ (Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemania).
Los tratamientos de prehibridación e hibridación se realizaron en
condiciones altamente astringentes (68 ºC) según lo descrito por
Sambrook et al. (1989). El revelado de las membranas de hibridación se
realizó mediante métodos quimioluminiscentes utilizando el ‘kit’ de
revelado ‘DIG Luminescent Detection Kit’ (Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemania) con CSPD (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las membranas
reveladas se expusieron a películas BioMax Light (Eastman Kodak
Company, Rochester, NY, EEUU) durante un tiempo de 15 a 30 min, a
temperatura ambiente, procediendo seguidamente al revelado de las
películas siguiendo las instrucciones del fabricante.
De igual manera, se realizaron hibridaciones de las mismas sondas de
ADN descritas anteriormente con los productos de análisis PCR
específica. Estos productos fueron generados por los iniciadores para PCR
diseñados en esta investigación para la identificación específica de F.
oxysporum f. sp. ciceris y de las razas patogénicas 0, 1A, 1B/C, 5, y 6. El
proceso se realizó de forma idéntica al descrito anteriormente para la
hibridación de los perfiles de amplificación RAPD.
59

Capítulo II
Hibridaciones ‘Southern’
Las sondas de ADN generadas como se ha descrito anteriormente también
se utilizaron para realizar hibridaciones con ADN total de aislados de una
raza digerido con la enzima de restricción EcoRI. Para ello, se digirieron
entre 3 y 5 µg de ADN con 15 a 25 U de EcoRI incubando a 37ºC durante
12-14 h. Los fragmentos generados por la digestión se separaron
electroforéticamente en geles de agarosa al 0,8 % de 15 x 25 cm, en
tampón TAE, a 1 V·cm -1 durante 12-14 h, y posteriormente se
transfirieron a membranas de nylon Zeta-Probe Blotting Membranes
mediante vacío (VacuGene XL y VacuGene Pump, Pharmacia LKB,
Upsala, Suecia). Los tratamientos de prehibridación e hibridación se
realizaron en condiciones de alta astringencia (68 ºC) (Sambrook et al.,
1989). El revelado de las membranas de hibridación se realizó como se ha
indicado anteriormente. Una vez reveladas, las membranas se expusieron a
películas BioMax Light durante un tiempo variable, desde 2 a 12 h. El
revelado de las películas se realizó como ha sido descrito en el apartado
anterior.
Secuenciación de los fragmentos RAPD clonados
Los insertos de cada uno de los plásmidos seleccionados, correspondientes
a cada una de las bandas RAPD asociadas a las razas de F. oxysporum f. sp.
ciceris, fueron secuenciados por los servicios de secuenciación de la
Universidad de Cornell, Ithaca, NY, EEUU, y de NBT (Newbiotechnic,
S.A., Sevilla, España). Las dos cadenas de ADN de las bandas marcadoras
se secuenciaron utilizando un secuenciador ABI 377 de Applied
Biosystems, con los iniciadores universales M13 forward (-21) y reverse,
así como con iniciadores internos a la secuencia, y posterior solapamiento
hasta completar la totalidad del inserto. Los cromatogramas fueron
visualizados y alineados con el programa informático Sequencher 3.1.1.
(GenCodes, Ann Arbor, MI, EEUU). Se realizó una búsqueda de
homología de las secuencias mediante el programa BLASTN 2.1.1
60

Capítulo II
(Altschul et al., 1997) del servicio NCBI (‘National Center for
Biotechnology Information’; www.ncbi.nlm.nih.gov).
Diseño de iniciadores específicos
Los iniciadores para PCR específica se diseñaron mediante el programa de
PrimerSelect 3.11 del paquete de ‘software DNA Star’ (Madison, WI,
EEUU). Las secuencias seleccionadas para construir los iniciadores
estuvieron basadas en las regiones más externas de los fragmentos RAPD
clonados, incluyendo parte del iniciador aleatorio RAPD que las originó.
Los iniciadores para PCR específica fueron sintetizados comercialmente
por GENSET S. A. (Paris, Francia). Las secuencias de cada uno de estos
iniciadores se presentan en la Tabla 8.
Reacciones de amplificación PCR
Las reacciones de amplificación PCR se pusieron a punto
independientemente para cada par de iniciadores. Las condiciones de
amplificación PCR específica para la identificación de F. oxysporum f. sp.
ciceris, así como de cada una de la raza 0, 1B/C, 6, y 1A-6 fueron las que
siguen a continuación. Las mezclas de reacción (25 µl) estuvieron
compuestas por 0,2 µM de cada iniciador, 200 µM de cada dNTP, 2,5 µl de
10 x tampón de reacción [166 mM (NH 4) 2SO 4; 670 mM Tris-HCl (pH 8,0,
25ºC); 0,1% Tween-20], 0,6 U de EcoTaq ADN Polimerasa (EcoGen,
Madrid, España), 1,0 mM MgCl 2, y 10-25 ng de ADN fúngico. Las
amplificaciones se realizaron en los termocicladores Perkin-Elmer 2400 y
Perkin-Elmer 9600. Los ciclos de temperaturas consistieron en 2 min de
desnaturalización inicial a 94ºC, 25 a 28 ciclos de 30 s de desnaturalización
a 94ºC, 1 min de complementación a 58ºC para los iniciadores específicos
de F. oxysporum f. sp. ciceris y de 61ºC para los de las razas 0, 1B/C, 6, y 1A-
6, y 30 s de polimerización a 72ºC; y un último paso de 4 min de extensión
61

Capítulo II
a 72ºC para producir fragmentos completos de ADN de doble cadena
(Tabla 8).
Para la amplificación PCR específica utilizando ADN genómico de
aislados de la raza 5 se utilizó la modalidad ‘touch-down’ de la PCR (Don
et al., 1991). Dicho método consistió en un aumento de la temperatura de
complementación de 10ºC en el primer ciclo de PCR (71ºC), y la
disminución consecutiva de 1ºC en cada ciclo de amplificación, durante los
10 primeros ciclos, hasta conseguir la temperatura de especificidad óptima
(61ºC), seguido de 15 ciclos normales de PCR a dicha temperatura óptima
como se ha descrito anteriormente. Esta estrategia tiene por objeto
aumentar tanto la especificidad de la reacción como el rendimiento de la
amplificación. La composición de las mezclas de reacción fue la misma que
la descrita para el resto de los pares de iniciadores, excepto por la
utilización de 1 U de EcoTaq ADN polimerasa.
Los productos de amplificación fueron separados mediante
electroforesis en geles al 1% de agarosa, como se ha descrito
anteriormente. Como marcador de peso molecular se utilizó el 0,1-kb
DNA ladder XIV (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).
Todas las reacciones de amplificación se repitieron al menos dos veces,
y siempre incluyeron controles negativos (sin ADN molde). Además, para
establecer la cantidad mínima de ADN detectable por los iniciadores y
visible en gel de agarosa, se realizaron amplificaciones utilizando ADN a
concentraciones de 200, 150, 100, 50, 25, 10, 5, 1, 0,1, 0,01, 10 –3 , 10 –4 y 10 -
5 ng en la mezcla de reacción. Las condiciones específicas para la
amplificación selectiva del ADN de los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
pertenecientes a cada una de las razas 0, 1B/C, 5, 6, y 1A-6, así como de la
forma specialis ciceris, se presentan recogidas en la Tabla 8.
62

Resultados
Capítulo II
La estrategia seguida para diseñar iniciadores útiles para la identificación
específica de F. oxysporum f. sp. ciceris, así como para diferenciar entre sus
razas patogénicas 0, 1A, 1B/C, 5, y 6, se ha basado en la utilización de
secuencias polimórficas SCAR generadas mediante análisis RAPD con
iniciadores arbitrarios. Para ello, los fragmentos RAPD asociados a la forma
specialis ciceris y a cada una de sus razas (Capítulo I) se clonaron y
secuenciaron, y de las secuencias se diseñaron nuevos iniciadores. A partir
de los fragmentos de ADN clonados se desarrollaron sondas marcadas
con digoxigenina, con las cuales se realizaron hibridaciones con el perfil
RAPD original y con el ADN genómico digerido mediante enzimas de
restricción. Posteriormente, se diseñaron iniciadores para PCR específica y
se comprobó la capacidad diagnóstica de los productos de reacción.
Clonación de los fragmentos RAPD
Para la obtención de los fragmentos RAPD marcadores raciales, y de
interés en este estudio, se utilizaron los siguientes aislados de F. oxysporum
f. sp. ciceris: raza 0, Foc-9018 JG62; raza 1B/C, Foc-USA3-1JG62; raza 2,
Foc-8605; raza5, Foc-9035; y raza 6, Foc-9093 PV1 (Tabla 7). Los
fragmentos clonados fueron los siguientes: raza 0, 0,39 kb (OPF-12), y 0,9
kb (OPI-09); raza 1B/C, 0,53 kb (OPI-09), y 1,1 kb (OPF-10); raza 2, 1,0
kb (OPF-12); raza 5, 0,9 kb (OPF-10); raza 6, 1,0 kb, y 1,4 kb (OPI-09).
Además, se realizaron clonaciones de la banda de 1,5 kb amplificada por
OPF-12 y marcadora de F. oxysporum f. sp. ciceris, que se obtuvo de un
aislado de la raza 0 (Foc-7802). Los fragmentos referidos fueron separados
y purificados del gel de agarosa, y clonados en un vector bacteriano (Tabla
7).
En todos los casos se obtuvo una variedad considerable de insertos
(entre tres y seis tipos), cuyas diferencias fueron advertidas debido a ligeras
variaciones en el peso molecular del inserto, o a los distintos patrones de
63

Capítulo II
restricción que se generaron en las digestiones con las enzimas EcoRI,
BamHI, XbaI, ApaI, PstI, y SacI. Estas diferencias en los patrones de
restricción puso de manifiesto la existencia de diversos insertos formados
por distintas secuencias de ADN, como resultado de la clonación de un
fragmento RAPD purificado del gel de agarosa. La hibridación de cada
uno de estos insertos con el perfil generado por el iniciador que originó
cada fragmento RAPD permitió seleccionar el clon adecuado. Los
experimentos de hibridación confirmaron la existencia de secuencias
diferentes, ya que se identificaron clones que generaron señal de
hibridación con bandas de igual peso molecular, no visibles en el gel de
agarosa. Se seleccionaron un total de nueve clones bacterianos, cuya
nomenclatura, vector bacteriano, y características del inserto están
recogidos en la Tabla 7.
Hibridaciones con el perfil RAPD
Se realizaron experimentos de hibridación con los perfiles de amplificación
RAPD generados con cada uno de los iniciadores OPF-10, OPF-12 y
OPI-09, utilizando como sonda de ADN cada una de las bandas RAPD
clonadas. Esto se realizó con los siguientes objetivos: (1) confirmar que el
clon bacteriano seleccionado albergaba el inserto de estudio, y no otro
diferente, como resultado de la escisión incorrecta de ADN del perfil
RAPD; (2) confirmar que existe homología entre las bandas del mismo
peso molecular amplificadas en aislados pertenecientes a la misma raza; (3)
confirmar que esa misma banda RAPD no está siendo amplificada en
aislados de otras razas a intensidad no detectable en gel de agarosa; y (4)
desestimar la posibilidad de que exista homología entre el fragmento
RAPD en proceso de estudio, y otros fragmentos de diferente peso
molecular originados por el mismo iniciador aleatorio.
64

1,1
2,6
1,
1,
0,
A
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
B
Capítulo II
Figura 4. Amplificación RAPD utilizando ADN de aislados de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris con el iniciador aleatorio OPF-10 (A), e hibridación del
mismo perfil de amplificación con el fragmento RAPD clonado de 1,1 kb
marcador de la raza 1B/C (clon FocD33) (B). Los números a la izquierda
corresponden a los pesos moleculares (kb) del ‘0,1 kb ladder XIV’ (Roche
Diagnostic). Carriles: 1-3, aislados de la raza 0 Foc–8207, –9018 JG62, –7952; 4,
5, aislados de la raza 1B/C Foc–USA 3-1JG62, –1987-W17; 6, 7, aislados de la
raza 1A Foc–7989, –9166; 8, 9, aislados de la raza 2 Foc–8605, –1992R2N; 10,
11, aislados de la raza 3 Foc–8606, –1992R3N; 12, 13, aislados de la raza 4 Foc–
8607, –1992R4N; 14-16, aislados de la raza 5 Foc–8012, –9035, –USA1-1 JG62;
17, 18, aislados de la raza 6 Foc–9023, –Tonini; 19, 20, aislados de F. oxysporum
no patogénicos de garbanzo, Fo–9009 y –90105, respectivamente.
65

Capítulo II
Los resultados mostraron que en todos los casos hubo 100% de
homología, indicada por la alta intensidad de la señal de hibridación entre
las bandas RAPD amplificadas en aislados de la misma raza, incluso en
aquéllos que son de distinto origen geográfico. Dicha homología no se
observó en aislados pertenecientes a otras razas, excepto por el clon
FocC19. El clon FocC19 (0,39 kb–raza 0–OPF12) produjo señal de
hibridación en la misma posición en el gel (y por tanto, con un fragmento
amplificado del mismo peso molecular) en las amplificaciones de aislados
de otras razas de F. oxysporum f. sp. ciceris distintas a raza 0, así como con el
aislado de F. oxysporum Fo-90105 no patogénico de garbanzo. Aunque
dicha banda no fue detectada visualmente en el perfil de amplificación
RAPD generado por OPF-12 en otras razas, este resultado demuestra que
la misma secuencia no sólo está presente en los genomas de dichas razas,
sino que está siendo amplificada a niveles no detectables visualmente en
gel, en aislados de otras razas.
Los clones FocD33 (1,0 kb–raza 1B/C–OPF10), FocL10 (0,9 kb–raza
5–OPF10), y FocO2 (1,0 kb–raza 6–OPI09) hibridaron únicamente con la
banda RAPD marcadora racial correspondiente, i. e., las amplificadas
únicamente en los aislados de las razas 1B/C, 5, y 6, respectivamente (Fig.
4). En cambio, para el resto de los clones se detectó señal de hibridación
con otras bandas de diferente peso molecular amplificadas en aislados de
otras razas, pero en ningún caso con bandas del mismo peso molecular.
Otro resultado destacable en estos experimentos fue la hibridación cruzada
entre los clones FocM15 (0,9 kb–raza 0–OPI-09) y FocP18 (1,4 kb–raza
6–OPI-09), aunque existió gran diferencia en la intensidad de la señal con
respecto a las hibridaciones homólogas (datos no mostrados). Resultados
posteriores en este estudio confirmaron que una parte de las secuencias de
dichos clones es idéntica.
66

Capítulo II
Tabla 7. Designación y características de los plásmidos bacterianos de
ADN recombinante generados mediante la clonación de fragmentos
RAPD marcadores de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y de sus razas
patogénicas
Clon
bacteriano Vector a
Aislado utilizado
Fragmento
RAPD clonado b
FocB10 pGem-T Foc-8605 1,0 kb–R2–OPF12
FocC19 pGem-T Foc-9018 JG62 0,39 kb–R0–OPF-12
FocD33 pGem-T Foc-USA 3-1 JG62 1,1 kb–R1B/C–OPF-10
FocL10 pCR2.1 Foc-9035 0,9 kb–R5–OPF-10
FocM15 pCR2.1 Foc-9018 JG62 0,9 kb–R0–OPI-09
FocN5 pCR2.1 Foc-USA 3-1 JG62 0,53 kb–R1B/C–OPI-09
FocO2 pCR2.1 Foc-9093 PV1 1,0 kb–R6–OPI-09
FocP18 pCR2.1 Foc-9093 PV1 1,4 kb–R6–OPI-09
Foc0-12 pCR2.1 Foc-9018 JG62 1,5 kb–Foc–OPF-12
a Vectores bacterianos comerciales pGem-T (Promega, Madison, WI, EEUU), y
pCR2.1 (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Holanda).
b Peso molecular aproximado del fragmento RAPD clonado, raza de F.
oxyspmorum f. sp. ciceris a la que identifica, e iniciador aleatorio que lo generó,
respectivamente.
67

Capítulo II
Hibridaciones ‘Southern’
La naturaleza del ADN contenido en los fragmentos RAPD clonados se
estudió por el patrón que éstos generaron al utilizarlos como sondas en
hibridaciones con ADN genómico digerido con EcoRI. Generalmente, los
patrones de hibridación se clasifican en tres clases (Goodwin et al., 1992):
(1) altamente repetitivos, i. e., que presentan un fondo (‘smear’) de
hibridación indistinguible, o más de 20 bandas distintivas; (2)
moderadamente repetitivos, i. e., que presentan entre 5 y 20 bandas de
hibridación; y (3) de copia única o bajo número de copias, i. e., aquéllos
cuyos patrones de hibridación presentan sólo una a cuatro bandas.
La mayoría de las sondas utilizadas en nuestro estudio pueden ser
consideradas como sondas altamente repetitivas, ya que generaron
patrones de hibridación que contenían de 20 a 30 bandas claramente
distinguibles. La única excepción a este hecho fue el clon FocL10 (0,9 kb–
R5–OPF-10), que hibridó con una o dos de las bandas de digestión
generadas, según la enzima de restricción y según el aislado fúngico
utilizados. Así, Foc10L hibridó sólo con dos de las bandas en el ADN de
aislados de la raza 5 de F. oxysporum f. sp. ciceris digerido con EcoRI;
mientras que en el resto de los aislados sólo se observó señal de
hibridación con una banda de diferente tamaño (Figura 5). Aún así, puesto
que este clon presentó polimorfismos bien en los lugares de corte de la
enzima o bien en la secuencia homóloga a FocL10, no se desestimó su
posible utilidad para posteriores análisis.
De igual manera, se detectaron numerosos polimorfismos en los
patrones de hibridación generados por las secuencias de ADN repetitivo.
En general, se observó variabilidad en dichos patrones entre aislados
pertenecientes a las distintas razas de F. oxysporum f. sp. ciceris, y entre
aislados de la misma raza del patógeno. Las sondas producidas a partir de
FocM15 y FocP18, que habían originado señal de hibridación cruzada con
los perfiles de amplificación RAPD, generaron patrones de hibridación
con el ADN genómico digerido con EcoRI completamente diferentes. A
continuación, se secuenciaron todos los fragmentos RAPD clonados.
68

8,
7,
4,
2,
1,
M C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Capítulo II
Figura 5. Hibridación ‘Southern’ del ADN genómico de aislados de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris digerido con la enzima EcoRI, con la sonda FocL10 (0,9 kb–
raza5–OPF-10). Los números a la izquierda corresponden al peso molecular (kb)
aproximado de las bandas de ADN. Carriles: M, marcador de peso molecular; C,
control de hibridación; 1, 2, aislados de la raza 0 Foc–8207, –82108; 3, aislado de
la raza 1B/C Foc–1987-W17; 4, aislado de la raza 2 Foc–1992R2N; 5, aislados de
la raza 4 Foc–1992R4N; 6-8, aislados de la raza 1A Foc–7989, –9166, –9027 PV1;
9-13, aislados de la raza 5 Foc–8012, –USA1-1 JG62, –USAW6-1, –9035, –9094
JG62; 14, 16, aislados de la raza 6 Foc–Tonini, –9093 PV1; 15, 17, y 18, aislados
de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, Fo–8250, –9009 y –90105,
respectivamente.
69

Capítulo II
Secuenciación de los fragmentos RAPD
Se secuenciaron un total de nueve clones (Tabla 7). No se detectó
homología significativa alguna con secuencias presentes en GenBank para
los fragmentos representados en los clones FocN5 y Foc0-12. Sin
embargo, la secuencia insertada en el clon FocL10 presentó homologías
con varias proteínas transportadoras de urea, permeasas, y otras proteínas
de transporte identificadas en hongos.
Las secuencias de los clones FocB10, FocM15, FocO2, y FocP18
presentaron similitudes con secuencias relacionadas con transposones. En
particular, la secuencia de FocB10 presentó un 80% de similaridad con el
transposón Fot1 identificado en F. oxysporum f. sp. melonis (Leach &
Currence) W. C. Snyder & H. N. Hans. (Daboussi et al., 1992).
La secuencia de FocO2 presentó un 52% de similaridad con una
proteína similar a una transposasa identificada en F. oxysporum (Okuda et
al., 1998); y las de FocP18 y FocM15 con transposasas putativas de otros
organismos.
Las secuencias de FocM15 y FocP18, que habían originado señal de
hibridación cruzada con los productos de amplificación RAPD,
presentaron 247 bp idénticas entre si, de un total de 0,9 kb y 1,4 kb,
respectivamente. Sin embargo, el resto de las secuencias de ambos clones
fueron completamente diferentes. Ésto explica la obtención de señal de
hibridación cruzada con la amplificación RAPD generada por OPI-09.
Debido a que al menos uno de los extremos de ambos clones eran
diferentes, la utilidad potencial de estas secuencias para diseñar iniciadores
que amplifiquen SCARs no fue desestimada.
Reacciones de amplificación PCR
Para el diseño de los iniciadores específicos se seleccionaron los clones
FocD33, FocL10, FocM15, FocN5, FocO2, FocP18, y Foc0-12 (Tabla 7).
En total se diseñaron siete pares de iniciadores para reacciones PCR
70

Capítulo II
específica (Tabla 8). Todos los iniciadores fueron diseñados a partir de las
secuencias extremas de los fragmentos clonados, de forma que
contuviesen parte del iniciador aleatorio RAPD que los originó. Estos
iniciadores se utilizaron para amplificar ADN de aislados representativos
de todas las razas patogénicas de F. oxysporum f. sp. ciceris y de un amplio
rango geográfico del patógeno.
Todos los pares de iniciadores amplificaron los fragmentos del tamaño
esperado. Los pares de iniciadores FocR1B/C-D33fwd y FocR1B/C-
D33rev; y FocR6-P18fwd y FocR6-P18rev, que se diseñaron para
identificar a las razas 1B/C y 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris,
respectivamente, amplificaron fragmentos de ADN de la misma intensidad
con el ADN de aislados de cada una de las razas del patógeno (datos no
mostrados), por lo cual fueron desestimados.
En cambio, los iniciadores FocR0-M15fwd y FocR0-M15rev
amplificaron un fragmento de 900 bp únicamente en los aislados de la raza
0 de F. oxysporum f. sp. ciceris y con igual intensidad en todos ellos, pero no
se produjeron amplicones en el resto de las razas, ni en aislados de F.
oxysporum no patogénicos de garbanzo (Fig. 6A). Hibridaciones del
fragmento de 900 bp con los productos de amplificación PCR utilizando
dichos iniciadores y ADN de aislados representativos de cada raza del
patógeno, generaron señal únicamente en los aislados de la raza 0 (datos
no mostrados). Ello significa que esta secuencia de 900 bp no es
amplificada en ninguna otra raza distinta de la 0, ni siquiera a niveles no
visuales en gel de agarosa.
De igual manera, los iniciadores FocR6-O2fwd y FocR6-O2rev
amplificaron un fragmento de 1000 bp únicamente en los aislados de la
raza 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris, pero no en el resto de las razas del
patógeno ni en aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo (Fig.
6C); y dicha amplificación fue asimismo corroborada mediante ensayos de
hibridación (datos no mostrados). Los iniciadores FocR1B/C-N5fwd y
FocR1B/C-N5rev, diseñados a partir de la secuencia de FocN5 (0,53 kb–
R1B/C–OPI09), amplificaron un único fragmento de 553 bp en los
71

Capítulo II
Tabla 8. Secuencias de los iniciadores, y condiciones de amplificación para su utilización en análisis PCR específica para la identificación de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y sus razas patogénicas 0, 1A, 1B/C, 5, y 6
72
Iniciador a Secuencia (5’-3’) b Raza
Tamaño del
fragmento
Condiciones de
amplificación c
Foc-0-12fwd GGCGTTTCGCAGCCTTACAATGAAG F. o. ciceris 1,5 kb Tª complementación 58 ºC
Foc-0-12rev GACTCCTTTTTCCCGAGGTAGGTCAGAT
28 ciclos de PCR
FocR0-M15fwd GGAGAGCAGGACAGCAAAGACTA R0 0,9 kb Tª complementación 61 ºC
FocR0-M15rev GGAGAGCAGCTACCCTAGATACACC
28 ciclos de PCR
FocR1B/C-N5fwd GAGAGCAGGGTCAGCGTAGATAG R1B/C 0,5 kb Tª complementación 61 ºC
FocR1B/C-N5rev GCAGCAGAAGAGGAAGAAAATGTA
25 ciclos de PCR
FocR5-L10fwd GGAAGCTTGGCATGACATAC R5 0,9 kb PCR ‘touch-down’
FocR5-L10rev AAGCTTGGGCACCCTCTT
Tª complementación 71-61ºC
FocR6-O2fwd GAGCAGTCAATGGCAATGG R6 1,0 kb Tª complementación 61 ºC
FocR6-O2rev AGAGCAGGGTCAGCGTAGATA
28 ciclos de PCR
FocR6-P18fwd GGAGAGCAGTAGAGTTACAGCAGTATT R1A, R6 1,5 kb Tª complementación 61 ºC
FocR0-M15rev GGAGAGCAGCTACCCTAGATACACC
25 ciclos de PCR
a La nomenclatura de los iniciadores: raza de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris a la que identifican y clon bacteriano en el que se basó su
secuencia, a excepción de los iniciadores Foc0-12fwd y rev que amplifican específicamente ADN de la forma specialis ciceris, y los
iniciadores FocR6-P18fwd y FocM15rev que amplifican ADN de las razas 1A y 6 cuando son utilizados conjuntamente.
b En el diseño de los iniciadores para PCR específica se utilizaron las secuencias de los fragmentos RAPD clonados, de manera que
contuvieron parte o la totalidad del iniciador aleatorio que los generó (secuencia subrayada), a excepción de los iniciadores Foc0-12
fwd y rev cuyas secuencias fueron algo más internas.
c Los ciclos de PCR normales consistieron en: 2 min-94ºC + 25 ó 28 ciclos [30s-94ºC + 1 min-Tª complementación + 30s-72ºC] +
4 min-72ºC. El ciclo de PCR ‘touch-down’ (Don et al., 1991) estuvo compuesto por: 2 min-94ºC + 10 [30s-94ºC + 1 min- 71ºC-
61ºC + 30s-72ºC] + 15 [30s-94ºC + 1 min- 61ºC + 30s-72ºC] + 4 min-72ºC.

2,6
1,
1,
0,
2,6
1,
1,
0,
Capítulo II
A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
C D
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Figura 6. Amplificaciones PCR específica de las razas 0 (A), 5 (B), 6 (C), y 1A-6
(D) de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris realizadas con los inciadores basados en
secuencias SCAR obtenidas a partir de los fragmentos RAPD marcadores. Los
números a la izquierda corresponden a los pesos moleculares (kb) del ‘0,1 kb
ladder XIV’ (Roche Diagnostic). A, y C, carriles: 1-3, aislados de la raza 0 Foc–
7802, 82113, –91108; 4, 5, aislados de la raza 1B/C Foc–USA 3-1JG62, –1987-
W17; 6-8, aislados de las razas 2, 3, y 4 Foc Foc–8605, –8606, –8607; 9-11,
aislados de la raza 1A Foc–7989, –9166, –9164; 12-14, aislados de la raza 6 Foc–
Tonini, –9093 JG62, –9023; 15-16, aislados de la raza 5 Foc–8012, –USA 14201;
y 17-18, aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, Fo–90101 y –
90105, respectivamente. B, carriles: 1-3, aislados de la raza 0 Foc–7802, 82113, –
91108; 4, 5, aislados de la raza 1B/C Foc–USA 3-1JG62, –1987-W17; 6-8,
aislados de las razas 2, 3, y 4 Foc Foc–8605, –8606, –8607; 9-10, aislados de la
raza 1A Foc–7989, –9166; 11-12, aislados de la raza 6 Foc–Tonini, –9023; 13-17,
aislados de la raza 5 Foc–8012, –9035, –USA W6-1, –USA 1-1 JG62, –USA
14201; 18, 19, aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, Fo–90101 y –
9081, respectivamente. D, carriles: 1-5, aislados de la raza 1A Foc–7989, –9164, –
9166, –9168, 9027 PV1; 6-12, aislados de la raza 6 Foc–Tonini, –9093 JG62, –
9023, –9170, –8272, – 8905, –8924; 13-18, aislados de cada una de las razas 0,
1B/C, 2, 3, 4, y 5, Foc–7802, –USA 3-1JG62, –8605, –8606, –8607, –8012; 19,
aislado de F. oxysporum no patogénico de garbanzo Fo–90105, respectivamente.
73

Capítulo II
aislados de la raza 1B/C procedentes de California. Sin embargo, dichos
iniciadores no amplificaron dicha banda cuando se utilizaron aislados de la
raza 1B/C de otras zonas geográficas (i. e., Turquía).
Los iniciadores FocR5-L10fwd y FocR5-L10rev amplificaron un
fragmento de 938 bp visible únicamente en los aislados de la raza 5 de F.
oxysporum f. sp. ciceris; sin embargo, los ensayos de hibridación revelaron
que dicha secuencia es amplificada a muy baja intensidad en el resto de las
razas del patógeno (datos no mostrados). A fin de aumentar la
especificidad e intensidad de la amplificación con ADN de los aislados de
la raza 5 como molde, se utilizó la modalidad de ciclo denominado ‘touchdown’
PCR descrita anteriormente. Esta modalidad de PCR mejoró
significativamente el rendimiento de la amplificación, generando un
producto de mayor intensidad sin que se produjera amplificación alguna en
el resto de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris (Fig. 6B).
Para la identificación específica de aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris, y
su diferenciación de aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo,
se diseñaron los iniciadores Foc0-12fwd y Foc0-12rev. Estos iniciadores
amplificaron un único fragmento de ADN de 1,5 kb solamente en aislados
de F. oxysporum f. sp. ciceris, independientemente de la raza a la que
pertenecían o de su origen geográfico, y sin presentar diferencias en la
intensidad de la amplificación (Fig. 7). Sin embargo, no se produjo
amplificación alguna, ni señal de hibridación, cuando dichos iniciadores se
utilizaron en análisis PCR específica de ADN de aislados de F. oxysporum
no patogénicos de garbanzo obtenidos de raíces de plantas sanas de éste,
de aislados de otras formae speciales de F. oxysporum (i. e., melonis, niveum,
lycopersici, phaseoli), ni de aislados pertenecientes a otras 47 especies de
Fusarium ( i. e., F. proliferatum, F. solani) (Tabla 6, Fig. 7).
74

A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
2,6
1,
1,
0,
B
1,
Capítulo II
Figura 7. Amplificación PCR específica utilizando ADN de aislados de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris, de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, de otras formae
speciales, y de diferentes Fusarium spp., y los iniciadores Foc0-12fwd y rev (A); e
hibridación de los productos de amplificación con el fragmento RAPD clonado
de 1,5 kb, marcador de la forma specielis ciceris (clon Foc0-12) (B). Los números a la
izquierda corresponden a los pesos moleculares (kb) del ‘0,1 kb ladder XIV’
(Roche Diagnostics) (Carril M). Carriles: 1-8, aislados de cada una de las raza 0,
1B/C, 1A, 2 a 6, Foc–7802, –USA 3-1JG62, –7989, –8605, –8606, –8607, –8012,
–9023; 9-12, aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, Fo–8250, –
9081, –90105, –506. 13, 14, aislados de F. oxysporum f. sp. melonis 9016, y F.
oxysporum f. sp. niveum 8805; 15-19, aislados de F. acuminatum, F. avenaceum, F. lactis,
F. proliferatum, y F. solani, respectivamente.
75

Capítulo II
Con objeto de determinar la cantidad mínima de ADN detectable en el
análisis PCR con cada par de iniciadores, se realizó la amplificación PCR
específica utilizando un intervalo de concentraciones de ADN y las
condiciones descritas con anterioridad. Todos los pares de iniciadores
utilizados detectaron hasta 0,1 ng de ADN fúngico (Fig. 8). También se
exploró la posibilidad de utilizar PCR ‘multiplex’, en la que los diferentes
pares de iniciadores se combinan en la misma mezcla de reacción para
realizar la amplificación conjunta de varias bandas marcadoras. Sin
embargo, debido a la similitud en cuanto a los pesos moleculares de las
bandas amplificadas, este proceso no produjo una amplificación que
distinguiese con facilidad a las distintas razas de F. oxysporum f. sp. ciceris,
por lo que fue desestimado.
También se exploró la posibilidad de que la combinación de distintos
iniciadores pudiese generar bandas marcadoras para otras razas. Así, la
utilización conjunta de los iniciadores FocR6-P18fwd y FocR0-M15rev,
que fueron diseñados para identificar a los aislados de las razas 6 y 0
respectivamente, amplificó una única banda de 1,4 kb en las razas 1A y 6,
sin que se apreciase amplificación alguna en el resto de las razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris o en aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo (Fig. 6D). Esta pareja de iniciadores permitió la identificación
indirecta de los aislados de la raza 1A debido a la posibilidad de
discriminar a éstos de los aislados de la raza 6 mediante PCR específica
utilizando los iniciadores FocR6-O2fwd y rev.
La utilización ‘ad hoc’ de los iniciadores desarrollados en el análisis
PCR específica permitió analizar 76 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
representativos de cada una de las ocho razas patogénicas descritas, y de
un amplio origen geográfico del patógeno. Los resultados indicaron una
correlación casi absoluta en la identificación racial de los aislados mediante
PCR específica, y la previa caracterización mediante pruebas biológicas.
Los análisis PCR específica utilizando los iniciadores FocR0-M15fwd
y rev identificaron correctamente a todos los aislados de la raza 0
procedentes de España, Israel, Líbano, Túnez, Turquía, y Siria. Sin
76

2,64
1,5
1,0
0,5
Foc-7802
Fo-90101
200
150 150
100
50
25
10
5
1
10-1 10-1 M 10-2
10-3 10-4 10-5 10-3 10-4 10-5 C
Capítulo II
Figura 8. Cantidad de ADN del aislado Foc–Tonini (raza 6) detectada mediante
la amplificación PCR utilizando los iniciadores Foc0-12fwd y Foc0-12rev,
específicos de la forma specialis ciceris. Los números a la izquierda corresponden a
los pesos moleculares del ‘0,1 kb ladder XIV’ (Roche Diagnostics) (Carril M).
Carriles 1 y 2, controles de amplificación de ADN del aislado de la raza 0 de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris Foc-7802, y del aislados de F. oxysporum no
patogénico de garbanzo Fo-90101. Carriles 3-15, ng de ADN en la reacción PCR
específica. Carril C, control sin ADN molde.
77

Capítulo II
embargo, dichos análisis amplificaron el mismo fragmento de ADN en los
aislados de la raza 1B/C Foc–9602 procedente de Túnez, y en los aislados
Foc–T96 1-1, –T96 1-2, y –T96 2-1 procedentes de Turquía; pero ni en el
resto de aislados de la raza 1B/C. El aislado Foc–9602 fue caracterizado
como perteneciente a la raza 1B/C mediante pruebas de patogenicidad y
mediante análisis RAPD; sin embargo, de las cinco bandas RAPD
marcadoras de R1B/C, sólo se identificaron dos de ellas en los perfiles
RAPD generados por los distintos iniciadores. Además, las interacciones
cultivar-aislado identificadas en las pruebas de biológicas sugirieron
características patogénicas intermedias entre la raza 0 y la raza 1B/C.
Igualmente, los análisis PCR específica utilizando los iniciadores
FocR6-O2fwd y rev identificaron correctamente a todos los aislados de la
raza 6, pero además, amplificaron el mismo fragmento en el ADN de
algunos aislados de la raza 1A, como Foc–9027 PV1, y –9166. Estos
aislados, aunque originalmente identificados como pertenecientes a la raza
1A, mostraron características patogénicas de la raza 6 en pruebas de
patogenicidad duplicadas (Alcalá Jiménez, 1995).
78

Discusión
Capítulo II
En investigaciones anteriores (Capítulo I) identificamos fragmentos RAPD
marcadores de F. oxysporum f. sp. ciceris y sus razas 0, 1B/C, 5, y 6; sin
embargo, la influencia de diversos factores (i. e., fuente del ADN de
análisis, procedimiento de extracción de éste, presencia de contaminantes
en la mezcla de reacción, etc.) sobre la reproducibilidad del análisis RAPD,
puede cuestionar o disminuir su aplicabilidad diagnóstica. Por ello, resulta
necesario desarrollar metodologías mejoradas que obvien tales influencias
y dificultades. Una de tales mejoras consiste en reemplazar la naturaleza
aleatoria del marcador de interés, propia de la tecnología RAPD, por
secuencias contenidas en el genoma del organismo diana. El objetivo de la
investigación realizada en este Capítulo ha sido desarrollar un método
basado en la PCR específica que permita la identificación consistente,
rápida, y precisa de F. oxysporum f. sp. ciceris y diferenciar sus razas
patogénicas.
La estrategia que hemos seguido en nuestro estudio ha sido diseñar
iniciadores específicos a partir de secuencias SCAR (‘Sequence
Characterized Amplified Region’) procedentes de marcadores RAPD
asociados a las razas del patógeno. De esta manera, se han diseñado
iniciadores para PCR específica que permiten distinguir inequívocamente a
aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris de: (a) aislados de F. oxysporum no
patogénicos de garbanzo; (b) aislados pertenecientes a otras formae speciales
de F. oxysporum; y (c) otras especies de Fusarium. Además, mediante análisis
PCR específica utilizando iniciadores ‘ad hoc’ ha sido posible diferenciar
entre si a aislados de las razas 0, 1A, 5, y 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris, así
como a éstos de aislados pertenecientes a otras razas del patógeno.
En investigaciones anteriores identificamos marcadores RAPD
asociados a las razas 2, 3, y 4 de F. oxysporum f. sp. ciceris procedentes de la
India; sin embargo, puesto que no disponíamos de un número
suficientemente adecuado de aislados representativos de estas razas,
consideramos improcedente continuar con el proceso experimental para
desarrollar iniciadores para PCR específica que permitan la identificación
de dichas razas.
79

Capítulo II
La estrategia que hemos seguido para el desarrollo de iniciadores ha
resultado muy útil, lo cual ha ayudado al éxito de nuestra investigación.
Los avances metodológicos que se están produciendo en la última década,
respecto de las técnicas relacionadas con el manejo del ADN
recombinante, pueden hacer parecer a los no familiarizados con dicha
tecnología que la clonación de ADN es un método meramente rutinario.
En esta investigación, se han extremado las precauciones para asegurar la
selección eficiente de clones que contuvieran los insertos correctos,
mediante la realización de numerosos experimentos de hibridación. Así, en
el curso de las hibridaciones realizadas se localizaron fragmentos RAPD de
igual peso molecular, pero cuyo posterior análisis con enzimas de
restricción mostró que contenían distintas secuencias de ADN. De no
haber practicado las precauciones suficientes, la utilización de tales
fragmentos podría haber concluido en el diseño de iniciadores inadecuados
para nuestros fines.
Generalmente, se asume inadecuadamente que fragmentos de ADN de
igual peso molecular que resultan amplificados en análisis RAPD de
aislados de una misma población/especie fúngica presentan homología en
sus secuencias. Sin embargo, esta asunción no tiene por qué ser
necesariamente cierta, a menos que se demuestre mediante análisis de
hibridación (Rieseberg, 1996; Thormann et al., 1994). Las precauciones
adoptadas en nuestro trabajo, antes referidos, son concluyentes en cuanto
a mostrar que los marcadores RAPD amplificados en todos los aislados de
una misma raza presentan una gran homología en sus secuencias.
Las hibridaciones ‘Southern’ del ADN genómico digerido con EcoRI,
han puesto de manifiesto la naturaleza repetitiva de las secuencias de ADN
contenidas en los fragmentos RAPD asociados a las razas de F. oxysporum
f. sp. ciceris. La utilidad de las secuencias repetitivas para la generación de
SCARs ya ha sido puesta de manifiesto por otros autores (Wiglesworth et
al., 1994), para la detección específica de Peronospora tabacina D. B. Adams
mediante análisis PCR. Aún así, en nuestra investigación, la capacidad del
análisis PCR específica de discriminar entre diferentes razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris, i. e., las razas 0 y 6, utilizando iniciadores que
identifican específicamente a los aislados de dichas razas, ha sido
80

Capítulo II
comprobada mediante la realización de hibridaciones de dicha
amplificación con el fragmento amplificado. Esto demostró que aunque
una secuencia puede encontrarse presente en el genoma de todas las razas
de F. oxysporum f. sp. ciceris, dicha secuencia sólo es amplificada cuando se
utiliza como molde el ADN de los aislados de una raza en concreto.
En cambio, el fragmento de ADN amplificado en los aislados de raza 5
fue detectado mediante hibridación también en el resto de las razas
estudiadas, si bien la intensidad de la señal de hibridación fue mucho
menor. Puesto que la amplificación en el análisis PCR visualizada en geles
de agarosa fue detectada únicamente cuando se utilizó ADN de los
aislados de la raza 5, consideramos que el método desarrollado es
suficientemente preciso para su utilización en actividades diagnosticas con
vistas a la identificación racial.
La detección de secuencias comunes en las distintas razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris no es necesariamente un hecho extraño. Puesto que
F. oxysporum es de reproducción estrictamente asexual, las poblaciones del
hongo en la naturaleza están constituidas por individuos clonales (Leslie,
1993; Kistler, 1997) que pueden acumular información genética similar.
F. oxysporum carece de un estado sexual conocido y la ocurrencia de
recombinación parasexual en condiciones naturales no ha sido
documentada y puede ser poco probable. Por tanto, la mutación parece ser
la principal fuente de variación que proporcione y mantenga la variabilidad
genética en este organismo. Para explicar gran parte de la variabilidad
genética observada en F. oxysporum se ha postulado la actividad de
transposones (Daboussi y Langin, 1994; Daboussi et al., 1992). F. oxysporum
contiene varias familias de este tipo de elementos, entre los que se
encuentran los transposones ‘Fot1-like’. La mayor parte de las secuencias
estudiadas en nuestra investigación han presentado similaridades
significativas con elementos transponibles, entre ellos el clon FocB10 (1,0
kb–R2–OPF-12) cuya secuencia posee un 80% de similaridad con el
transposón Fot1 identificado en F. oxysporum f. sp. melonis (Daboussi et al.,
1992). Los transposones pueden constituir hasta el 5% del genoma de F.
oxysporum, y por tanto pueden tener un gran impacto en la estructura y
función de algunos genes, así como en la organización cromosómica
81

Capítulo II
general de esta especie (Daboussi y Langin, 1994). Por tanto, parece lógico
pensar que los polimorfismos asociados a marcadores RAPD hayan tenido
como origen el movimiento pasado o actual de este tipo de elementos en
el genoma fúngico.
Todos los pares de iniciadores para PCR específica diseñados en esta
investigación han detectado hasta 0,1 ng de ADN fúngico, en las
condiciones de amplificación aquí descritas. Esta cantidad de ADN
fúngico puede ser extraído con facilidad de diversos substratos naturales
que pudieran contener al patógeno. Ello, junto con la robustez del análisis
PCR específica anima a estudiar la posible aplicación de la metodología
que hemos desarrollado en la detección de F. oxysporum f. sp. ciceris y de sus
razas patogénicas 0, 1A, 5, y 6, en suelo y en planta. Trabajos anteriores
permitieron detectar al patotipo de Marchitez de F. oxysporum f. sp. ciceris
en el suelo (García Pedrajas et al., 1999) y en plantas de garbanzo
infectadas (Kelly et al., 1998). Disponer de un método que permita la
detección rápida y temprana del patógeno en semillas de garbanzo, puede
ser de utilidad para evitar la dispersión de F. oxysporum f. sp. ciceris y de sus
razas patogénicas a zonas de cultivo libres de ella. Similarmente, la
aplicación de dicha metodología diagnóstica al suelo antes de la siembra
permitiría tomar decisiones respecto de la adecuación de cultivares de
garbanzo de interés agronómico y comercial, en razón de la prevalencia de
razas del patógeno virulentas sobre ellos. Finalmente, la utilización de la
metodología diagnóstica en ambos escenarios puede ayudar a determinar
los cambios en la estructura racial que puedan tener lugar en las
poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris, como consecuencia del uso de
cultivares resistentes o de modificaciones ambientales en el cultivo.
82

CAPÍTULO III
Capítulo III
Genealogías génicas definen a Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris como un grupo
monofilético
Introducción
En los hongos que carecen de estado reproductivo sexual, y que por tanto
se reproducen obligada y estrictamente por mecanismos asexuales, no se
produce una recombinación regular y la variación genética que se pueda
generar en ellos resulta principalmente de la acumulación de mutaciones.
En consecuencia, en este tipo de hongos todo el genoma se encuentra
ligado, es transmitido como una sola unidad de una generación a la
siguiente, y las diferentes regiones del genoma deben poseer la misma
historia evolutiva (Taylor et al., 1999b). Por lo tanto, la evolución de
caracteres fenotípicos en los hongos fitopatógenos de reproducción
asexual, tales como la especificidad de huésped o cultivar, o la relación
entre razas patogénicas, puede ser estudiada mediante el análisis de
genealogías de genes que no tienen que mantener necesariamente una
relación funcional directa con el fenotipo de interés, i. e., neutrales (ej.,
O’Donnell et al., 1998; Steenkamp et al., 2000; Taylor et al., 1999a).
Fusarium oxysporum Schlechtend: Fr. es una especie fúngica de
reproducción estrictamente asexual ubicua en los ambientes edáficos en el
mundo. Los aislados de F. oxysporum pueden causar Marchitez vascular o
83

Capítulo III
Podredumbre radical en numerosos cultivos agrícolas, y han sido
clasificados en formae speciales en base a la patogenicidad huésped- específica
que manifiestan (Nelson et al., 1981). Generalmente, los aislados de F.
oxysporum pertenecientes a una forma specialis son genéticamente más
similares entre sí que a los aislados de la especie patogénicamente
especializados sobre otros huéspedes, y por lo tanto, se suele asumir que
los aislados dentro de una forma specialis son evolutivamente de origen
monofilético (Kistler, 1997; Tantaoui et al., 1996).
Además, en F. oxysporum la clonalidad ha sido asociada a la
compatibilidad vegetativa (Gordon y Martyn, 1997; Kistler, 1997), ya que
aislados del hongo que pertenecen a un mismo grupo de compatibilidad
vegetativa (VCG) muestran una alta similaridad genética determinada
mediante haplotipos de ADN mitocondrial (ADNmt) o de IGS
(‘Intergenic Spacers’) (Gordon y Martyn, 1997).
Sin embargo, algunos estudios basados en genealogías génicas han
demostrado que ciertas formae speciales de F. oxysporum pueden tener
orígenes múltiples e independientes (i. e., son de origen polifilético),
indicando que patogenicidad y virulencia han evolucionado más de una
vez en el curso de su historia adaptativa (Baayen et al., 2000; O’Donnell et
al., 1998).
De forma similar, también se han encontrado excepciones notables en
la correlación entre VCG y los haplotipos de ADNmt y de IGS. Así, por
ejemplo, un aislado de F. oxysporum f. sp. melonis (Leach & Currence) W. C.
Snyder & H. N. Hansen perteneciente al VCG 0131 compartió los
haplotipos de ADNmt e IGS de aislados patogénicos del VCG 0134, en
lugar de compartirlos con aislados representativos del VCG 0131 (Appel y
Gordon, 1995). Además, aislados de F. oxysporum no patogénicos de
melón, pero vegetativamente compatibles con aislados de F. oxysporum f.
sp. melonis de los VCGs 0131 y 0134, presentaron secuencias de
nucleótidos de la región IGS del ADN ribosómico que fueron diferentes a
las de los aislados patogénicos (Appel y Gordon, 1996). Este último
ejemplo demuestra que, en algunos casos, la compatibilidad vegetativa
puede ser una coincidencia que haya resultado como consecuencia de la
convergencia de caracteres en lugar de poseer un antepasado común.
84

Capítulo III
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato, el agente
causante de la Fusariosis Vascular del garbanzo (Cicer arietinum L.), es
patogénico de especies de Cicer (Kaiser et al., 1994), y ha sido descrita en
todas las zonas geográficas del mundo cultivadoras de esta leguminosa
(Jalali y Chand, 1992). La variación en los tipos de síndromes que el
patógeno induce en la planta (patotipos) y en razas patogénicas según la
reacción de cultivares de garbanzo a la infección, ha sido correlacionada
con las distintas regiones geográficas donde existe el patógeno, y con
polimorfismos en marcadores moleculares.
En F. oxysporum f. sp. ciceris se han descrito dos patotipos, designados
Amarillez y Marchitez, que se identifican mediante pruebas de
patogenicidad en cultivares susceptibles de garbanzo (Trapero Casas y
Jiménez Díaz, 1985). Estos dos patotipos también pueden ser
diferenciados mediante marcadores RAPD (‘Random Amplified
Polymorphic DNA’), y se distribuyen en dos grupos diferentes mediante el
análisis de ‘cluster’ de los productos de amplificación de su ADN con
iniciadores arbitrarios (Kelly et al., 1994; Jiménez Gasco et al., 2001;
Capítulo I); lo que sugiere que podrían no encontrarse muy relacionados
genéticamente.
Además de la variación en patotipos, en F. oxysporum f. sp. ciceris existen
ocho razas patogénicas (razas 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6) que son
identificadas mediante la reacción diferencial de una serie de líneas o
cultivares de garbanzo (Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b;
1993a). Al igual que ocurre con los patotipos, algunas de estas razas
pueden ser diferenciadas mediante marcadores RAPD (Jiménez Gasco et
al., 2001; Capítulo I).
En cultivares de garbanzo susceptibles, las razas 0 y 1B/C inducen el
síndrome de Amarillez, mientras que las razas 1A, 2, 3, 4, 5 y 6 inducen el
síndrome de Marchitez (Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a; Trapero Casas y
Jiménez Díaz, 1985). Además, estas razas también presentan distintas
distribuciones geográficas: las razas 2, 3, y 4 han sido descritas únicamente
en la India (Haware y Nene, 1982b), mientras que las razas 0, 1B/C, 5, y 6
se encuentran principalmente en la región Mediterránea y en EEUU
(California) (Halila y Strange, 1996; Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a). La
85

Capítulo III
raza 1A ha sido identificada en la India (Haware y Nene, 1982b), California
y la región Mediterránea (Jiménez Díaz et al., 1993a). Sin embargo, a pesar
de existir una variación notable en relación a sintomatología, razas
patogénicas, y distribución geográfica, todos los aislados de F. oxysporum f.
sp. ciceris estudiados hasta el momento pertenecen a un mismo VCG
(Nogales Monada, 1997).
La diversidad fenotípica y geográfica que hemos observado en F.
oxysporum f. sp. ciceris plantea la posibilidad de que este taxón sea de origen
polifilético, al igual que se ha demostrado en F. oxysporum f. sp. cubense (E.
F. Smith) W. C. Snyder & H. N. Hans. y F. oxysporum f. sp. melonis. Por
tanto, el objetivo de las investigaciones contenidas en este Capítulo fue
demostrar la hipótesis nula de un origen monofilético para F. oxysporum f.
sp. ciceris. Para alcanzar dicho objetivo, hemos estudiado la extensión y
naturaleza de la variación existente en las secuencias de intrones de varios
genes conservados. Estas secuencias fueron comparadas a las de otras
formae speciales de F. oxysporum con el objeto de comprobar si la forma specialis
ciceris es monofilética dentro de este complejo de especies. Un objetivo
adicional en nuestro estudio fue comparar la variación en dichas
secuencias en relación con la variación de patotipos, razas patogénicas y
distribución geográfica existente en el patógeno.
Materiales y Métodos
Aislados fúngicos
En este estudio se han utilizado un total de 17 aislados de F. oxysporum f.
sp. ciceris, representativos de las ocho razas patogénicas descritas, y de un
amplio rango geográfico del patógeno (Tabla 9). Además, se han incluido
tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, obtenidos de
raíces sanas de garbanzo (Tabla 9). Todos los aislados se habían
caracterizados en cuanto a patotipo y a raza patogénica en trabajos
anteriores (Jiménez Díaz et al., 1993a; Jiménez Gasco et al., 2001; Kelly et
86

Capítulo III
Tabla 9. Información sobre la raza y origen geográfico de los aislados de
Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc) y Fusarium oxysporum (Fo) no
patogénicos de garbanzo utilizados en el análisis de genealogías génicas
Aislado a Origen geográfico b Raza patogénica c
GRUPO A
Foc-7802 España 0
Foc-1987-W17 EEUU 1B/C
Foc-7989 India 1A
Foc-1992R4N India 4
Foc-9035 España 5
Foc-Tonini EEUU 6
GRUPO B
Foc-9601 Túnez 0
Foc-9602 Túnez 1B/C
Foc-USA 3-1 JG62 EEUU 1B/C
Foc-9168 Marruecos 1A
Foc-8605 India 2
Foc-1992R2N India 2
Foc-8606 India 3
Foc-1992R3N India 3
Foc-8607 India 4
Foc-9094 JG62 España 5
Foc-9093PV1 España 6
Fo-90101 España NP
Fo-90105 España NP
Fo-9169 Marruecos NP
a Los genes analizados en los aislados del Grupo A fueron factor de traducción y
elongación 1α (EF1α), β-tubulina, histona 3, actina, y calmodulina. El gen EF1α
fue el único analizado en los aislados del Grupo B.
b Los aislados de EEUU (California), España, y Marruecos proceden de la micoteca
del Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible,
CSIC, Córdoba, España. Los aislados de la India fueron proporcionados por el Dr.
M. P. Haware, ICRISAT, Hyderabad, India. Los aislados procedentes de Túnez
fueron cedidos por el Dr. M. H. Halila, Institute Nationale de la Recherche
Agronomique, Ariana, Túnez.
c Raza determinada mediante pruebas de patogenicidad sobre líneas de garbanzo
diferenciadoras (Alcalá Jiménez, 1995; Jiménez Gasco et al., 2001; Capítulo I). NP =
no patogénicos de garbanzo.
87

Capítulo III
al., 1994; Capítulo I). En el grupo de 17 aislados se incluyeron al menos
dos aislados representativos de cada raza, que fueron seleccionados para
maximizar la variación geográfica entre aislados de una misma raza,
siempre que fue posible (algunas de las razas presentan una distribución
geográfica limitada). Todos los aislados se conservaron como cultivos
monoconídicos, en suelo estéril a 4ºC, en oscuridad, y pertenecen a la
colección de cultivos del Departamento de Protección de Cultivos,
Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba. Los procedimientos
para la obtención de cultivos activos de los aislados, el manejo de éstos, y
la obtención de su micelio para extracciones de ADN, han sido descritos
con anterioridad (Pág. 22, 26, Capítulo I). El ADN genómico fue
purificado a partir de micelio liofilizado y molido, mediante el método de
Raeder y Broda (1985) (Pág. 22-28, Capítulo I).
Amplificación de ADN y secuenciación
Para este estudio se seleccionaron genes que contienen secuencias
conservadas entre ascomicetos, y que presentan al menos un intrón. Los
genes seleccionados fueron: factor de traducción y elongación 1α (EF1α),
β-tubulina (β-tub), histona 3 (H3), actina (Act), y calmodulina (Cal).
Los iniciadores y las condiciones de reacción para la amplificación PCR
(‘Polymerase Chain Reaction’) de estos genes fueron descritos
anteriormente (Carbone y Kohn, 1999; Glass y Donaldson, 1995;
O’Donnell et al., 1998) (Tabla 10). Los productos de PCR fueron
purificados del gel mediante los ‘kits’ ‘QIAquick PCR purification’ and
‘QIAquick gel extraction’ (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EEUU).
Todos los iniciadores fueron sintetizados por el Servicio de Síntesis de
Oligonucleótidos de la Universidad de Cornell, Ithaca, NY, EEUU. La
secuenciación de los productos de PCR fue realizada por Servicio de
Secuenciación de ADN de la Universidad de Cornell.
88

Capítulo III
Tabla 10. Secuencia de los iniciadores que amplifican intrones de los
genes altamente conservados: factor de traducción y elongación 1α
(EF1α), β-tubulina, histona 3, actina, y calmodulina, utilizados en el
análisis de genealogías génicas en Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
Gen amplificado Iniciadors Secuencia del iniciador (5’→3’)
EF1α a EF1 ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC
EF2 GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT
β-Tubulina b Bt1a TTCCCCCGTCTCCACTTCTTCATG
Bt1b GACGAGATCGTTCATGTTGAACTC
Histona 3 b H3-1a ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG
H3-1b GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT
Actina c ACT-512F ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC
ACT-783R TACGAGTCCTTCTGGCCCAT
Calmodulina c CAL-228F GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC
CAL-737R CATCTTTCTGGCCATCATGG
Iniciadores descritos en: a O’Donnell et al., 1998; b Glass & Donaldson, 1995; y c Carbone
& Kohn, 1999.
Análisis filogenético
Las secuencias génicas fueron editadas y alineadas con secuencias
homólogas de aislados de otras formae speciales de F. oxysporum obtenidas de
GenBank, mediante Sequencher 3.1.1 (Gen Codes, Ann Arbor, MI,
EEUU). El análisis filogenético se realizó mediante PAUP* 4.0b4a
(‘Phylogenetic Analysis Using Parsimony and Other Methods’) (Swofford,
2000). Las inserciones se consideraron como caracteres únicos. El análisis
de parsimonia se realizó mediante la opción de búsqueda Heurística, con la
adición aleatoria de 1.000 secuencias del algoritmo ‘tree-bisection-
89

Capítulo III
reconnection branch swapping’, y la opción MULPARS. El análisis de
‘bootstrap’ se realizó con 1.000 repeticiones.
Resultados
Inicialmente en este estudio se secuenciaron y analizaron los genes EF1α,
β-tub, H3, Act, y Cal. Estos genes se amplificaron a partir del ADN
genómico de un aislado de cada una de las razas 0, 1A, 1B/C, 4, 5, y 6 de
F. oxysporum f. sp. ciceris representativos de la mayor diversidad en patotipo,
raza, y origen geográfico del patógeno (Tabla 9, Grupo A), con objeto de
localizar polimorfismos en secuencias asociadas a dicho patotipos, razas
patogénicas y distribución geográfica. Los resultados indicaron que las
secuencias de los cinco genes son idénticas en los seis aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris analizados (números de acceso de GenBank:
AF346503, AF346505 a AF346508).
Diversos autores (ej., Baayen et al., 2000; O’Donnell et al., 1998) han
estudiado extensamente el gen EF1α en F. oxysporum para analizar la
filogenia de varias de sus formae speciales. Por ello, en este trabajo se
obtuvieron las secuencias EF1α de 11 aislados adicionales de F. oxysporum
f. sp. ciceris y de tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo
(Tabla 10, Grupo B). Todas las secuencias de EF1α de los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris fueron idénticas entre sí, independientemente de la
naturaleza racial o distribución geográfica de aquéllos. De forma similar,
las secuencias EF1α de los tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo (número de acceso de GenBank AF346504) resultaron idénticas
entre sí, y diferentes de las de los aislados F. oxysporum f. sp. ciceris. Las
diferencias entre las secuencias nucleotídicas fueron localizadas
únicamente dentro de los tres intrones existentes en el gen EF1α, tal
90

Capítulo III
como fue descrito por O’Donnell et al. (1998) para otras formae speciales de
F. oxysporum.
Para demostrar si la genealogía génica inferida a partir de las secuencias
de EF1α apoya la hipótesis de un origen monofilético para F. oxysporum f.
sp. ciceris, las secuencias del gen EF1α de 17 aislados del patógeno y de tres
aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo fueron comparadas
con 24 secuencias EF1α obtenidas de GenBank. Estas 24 secuencias
pertenecen a aislados de las siguientes 11 formae speciales de F. oxysporum:
asparagi Cohen, canariensis Mercier & Louvet, cubense, dianthi (Prill. &
Delacr.) W. C. Snyder & H. N. Hans., gladioli (Massey) W. C. Snyder & H.
N. Hans., lini (Bolley) W. C. Snyder & H. N. Hans., lycopersici (Sacc.) W. C.
Snyder & H. N. Hans., melonis, radicis-lycopersici W. R. Jarvis & R. A.
Shoemaker, spinaciae (Sherb.) W. C. Snyder & H. N. Hans., y tulipae Apt.,
así como a aislados de F. oxysporum referidos como no patogénicos en la
literatura fitopatológica. Las secuencias fueron seleccionadas como
representativas de las agrupaciones principales de F. oxysporum (Baayen et
al., 2000; O’Donnell et al., 1998).
El análisis de parsimonia se realizó a partir de 701 caracteres, de los
cuales 30 fueron filogenéticamente informativos. Se obtuvieron tres
árboles filogenéticos de igual máxima parsimonia, que fueron comparados
con la especie ‘fuera de grupo’ (especie ‘outgroup’) Fusarium spp. NRRL
22903 (O’Donnell et al., 1998).
Los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris formaron un grupo distintivo al
ser comparados con aislados de otras formae speciales (Fig. 9). Esta
agrupación, con un 62% de ‘bootstrap’, se resolvió dentro del grupo 1 sensu
O’Donnell et al. (1998). Los tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo, Fo–90101, –90105, y –9169, presentaron secuencias del gen
EF1α idénticas, independientemente de su origen geográfico (Fo–9169,
Marruecos; y Fo–90101 y –90105, España); además, estas secuencias
fueron iguales a la de otro aislado de F. oxysporum (NRRL 25356) referido
como no patogénico en la literatura fitopatológica, y a la de un aislado de
la forma specialis melonis (NRRL 26178). Las secuencias de estos aislados se
91

Capítulo III
resolvieron dentro del grupo 2 (O’Donnell et al., 1998), junto con la forma
specialis lini y una secuencia de la forma specialis cubense (NRRL 25609).
Discusión
El principal objetivo de este trabajo fue determinar si F. oxysporum f. sp.
ciceris presenta un origen evolutivo monofilético. A pesar de la diversidad
que presentan los aislados de este patógeno en cuanto a distribución
geográfica, tipos de sintomatología que inducen en la planta susceptible, y
la patogenicidad cultivar-específica, los aislados que hemos estudiado,
representativos de seis de las ocho razas patogénicas de agente descritas,
poseen secuencias idénticas en los intrones de los cinco genes analizados
(EF1α, β-tub, H3, Act, y Cal).
De forma similar, los 11 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris adicionales
estudiados no mostraron ningún polimorfismo en la secuencia de del gen
EF1α.
Cuando se compararon las secuencias de EF1α de los 17 aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris anteriores con las de tres aislados de F. oxysporum no
patogénicos de garbanzo, y con las de 11 otras formae speciales de F.
oxysporum, los aislados patogénicos de garbanzo formaron un grupo
distintivo del resto de los aislados (Fig. 9) demostrando así su origen
monofilético.
Trabajos anteriores en nuestro laboratorio mostraron que los aislados
de las diferentes razas de F. oxysporum f. sp. ciceris presentan el mismo
patrón RFLP (‘Restriction Fragment Length Polymorphism’) del ADNmt
(Pérez-Artés et al., 1995), pertenecen a un único VCG (Nogales Moncada,
92

86 F.o.lycopersici 26200
F.o.melonis 26046
57 F.o.lycopersici 26034
F.o.tulipae 28974
61 F.o.lycopersici 26383
GRUPO 3
58
F.o.lycopersici 26203
83 F.o.asparagi 28404
65 F.o.radicis-lycopersici 26379
F.o. cubense 26022
F.o.spinaciae 26876
F.oxysporum 25356
74 58 F.o.melonis 26178
F.oxysporum 90101 *
GRUPO 2
88 F.oxysporum 90105 *
F.oxysporum 9169 *
F.o.cubense 25609
F.o.lini 29094
57
F.o.dianthi 28401
76 F.o.gladioli 28918
F.oxysporum 28366
F.o.cubense 25607
F.o.ciceris 1992R2N *
F.o.ciceris 7802 *
F.o.ciceris 7989 *
F.o.ciceris 9035 *
F.o.ciceris 1992R3N *
F.o.ciceris 1992R4N *
F.o.ciceris Tonini *
62 F.o.ciceris USA-W17 *
F.o.ciceris 9601 *
F.o.ciceris 9602 *
F.o.ciceris USA3-1JG62 *
F.o.ciceris 8605 *
GRUPO 1
F.o.ciceris 8606 *
F.o.ciceris 8607 *
F.o.ciceris 9094 JG62 *
F.o.ciceris 9093 PV1 *
F.o.ciceris 9168 * 1 cambio
100 F.oxysporum 25357
F.o.cubense 25605
65 F.o.canariensis 26035
F.o.cubense 26029
F.oxysporum 28371
Fusarium sp. 22903
Capítulo III
Figura 9. Uno de tres árboles filogenéticos de igual máxima parsimonia inferidos
a partir de la genealogía génica del factor de traducción y elongación 1α (EF1α),
que demuestra la monofilia en Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. El asterisco indica
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris y Fusarium oxysporum, en comparación
con las secuencias de Fusarium oxysporum obtenidas de GenBank. Los números en
las líneas representan valores de ‘bootstrap’ >50% basados en 1.000 repeticiones.
93

Capítulo III
1997), y poseen el mismo elemento de ADN repetitivo en sus genomas
(Kelly, 1996). Además, dichos aislados presentan una alta similaridad
genética, indicada por el análisis de ‘cluster’ de datos RAPD (Jiménez
Gasco et al., 2001; Kelly et al., 1994; Capítulo I). Aunque toda esta
información sugiere un origen evolutivo monofilético para F. oxysporum f.
sp. ciceris, la evidencia directa para su demostración sólo puede obtenerse
mediante el análisis de genealogías génicas y su comparación con taxones
relacionados.
Las secuencias del gen EF1α de tres aislados de F. oxysporum obtenidos
de raíces de plantas sanas de garbanzo, pero no patogénicos de éste,
fueron idénticas a la de un aislado de F. oxysporum f. sp. melonis. En cambio,
otro aislado de F. oxysporum f. sp. melonis presentó una secuencia de EF1α
igual a la de un aislado de F. oxysporum f. sp. lycopersici. El hecho de que los
tres aislados de F. oxysporum estudiados no sean patogénicos de garbanzo
pero puedan serlo de otras plantas, como melón, no ha sido abordado en
nuestra investigación, por lo que esta posibilidad no puede ser descartada.
La secuencia del gen EF1α ha demostrado ser un marcador
filogenético excelente para estudiar la relación entre aislados de F.
oxysporum (Baayen et al., 2000; O’Donnell et al., 1998). Además, nuestro
análisis filogenético de las secuencias EF1α de aislados patogénicos de
garbanzo junto con las otras obtenidas de GenBank, confirma la
naturaleza polifilética de F. oxysporum f. sp. cubense y F. oxysporum f. sp.
melonis (Fig. 9) (O’Donnell et al., 1998). Sin embargo, los aislados de las 11
formae speciales a partir de los cuales se obtuvieron las secuencias de ADN
de GenBank no han sido analizados en este trabajo, por lo que no
podemos descartar la posibilidad de que estos aislados hayan sido
caracterizados de forma errónea en cuanto a forma specialis.
La interpretación más simple sobre el origen monofilético de F.
oxysporum f. sp. ciceris, y de la falta de variación en las secuencias del
patógeno estudiadas en este trabajo, es que sus aislados derivan de una
población inicial fundadora pequeña (posiblemente un único individuo)
que adquirió patogenicidad sobre Cicer spp. Como consecuencia de ello, la
posterior diversificación en patotipos y razas patogénicas en dicho agente
94

Capítulo III
ha podido ser el resultado de la acumulación de pequeños cambios
genéticos que hayan tenido lugar en fechas relativamente recientes
(Gordon y Martyn, 1997). Aunque estos pequeños cambios genéticos no
se han visto reflejados en las secuencias de los genes que hemos estudiado,
si han podido ser detectados mediante su asociación con marcadores
RAPD. De hecho, los análisis de ‘cluster’ y de la varianza molecular
(AMOVA, ‘Analysis of Molecular Variance’) de datos RAPD diferenciaron
de forma consistente a los patotipos de Amarillez y Marchitez (Jiménez
Gasco et al., 2001; Kelly et al., 1994; Capítulo I), y a las diferentes razas de
F. oxysporum f. sp. ciceris (Jiménez Gasco et al., 2001; Capítulo I). Ello
sugiere que los marcadores RAPD están evolucionando más rápidamente
que las secuencias de los genes utilizados para realizar análisis
genealógicos.
Basándonos en la conclusión de este trabajo sobre un origen evolutivo
de monofilético de F. oxysporum f. sp. ciceris, nuestra hipótesis es que los
polimorfismos tanto en fenotipos patogénicos como en marcadores
moleculares del patógeno, han debido surgir después de que F. oxysporum f.
sp. ciceris divergiese de otros taxones dentro de F. oxysporum. En particular,
nuestra hipótesis es que la variabilidad en patogenicidad que muestran los
varios patotipos y razas del agente sobre los diferentes tipos de
germoplasma de garbanzo, se desarrolló en subpoblaciones del hongo
aisladas geográficamente que se produjeron después de la divergencia de la
forma specialis ciceris del resto de poblaciones de F. oxysporum.
En Cicer spp. existen dos tipos de germoplasma, ‘kabuli’ y ‘desi’ (Singh,
1987). Los garbanzos ‘desi’ (de semilla pequeña, angular, y coloreada) se
cultivan principalmente en el subcontinente Indio, mientras que los
garbanzos ‘kabuli’ (de semilla grande, redondeada y de color claro) se
utilizan principalmente en la región Mediterránea y California.
Curiosamente, el patotipo de Amarillez (que comprende a las razas 0 y
1B/C) no ha sido descrito en el subcontinente Indio, pero se encuentra de
forma generalizada en la región Mediterránea y en California (Halila y
Strange, 1996; Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a; R. M. Jiménez Díaz, no
publicado). La raza 0 no es patogénica sobre ‘JG-62’, el cultivar de garbanzo
susceptible universal del patotipo de Marchitez (que comprende a las razas
95

Capítulo III
1A, 2, 3, 4, 5, y 6), y es principalmente patogénica sobre garbanzos ‘kabuli’
(Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a).
En cambio, las fuentes de resistencia a F. oxysporum f. sp. ciceris se
encuentran principalmente en el germoplasma tipo ‘desi’ (Haware et al.,
1980), y la mayor parte de los genotipos ‘desi’ son resistentes a la raza 0
(Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a). Además, las razas 2, 3, y 4, descritas
hasta ahora únicamente en la India, son las razas más virulentas de las
ocho razas patogénicas identificadas hasta el momento (Halila y Strange,
1996; Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a) y son las
razas que más distan genéticamente del resto de las razas de F. oxysporum f.
sp. ciceris (Jiménez Gasco et al., 2001; Kelly et al., 1994; Capítulo I).
Esta correlación aparente entre patotipos y razas del patógeno de una
parte y a los tipos de germoplasma de garbanzo de otra, podría ser
explicada si el patógeno está compuesto por poblaciones aisladas
geográficamente y adaptadas al germoplasma local de garbanzo, incluso
aunque todas parezcan haber evolucionado a partir del mismo antepasado
común. En cualquier caso, la demostración de un origen monofilético para
F. oxysporum f. sp. ciceris desestima claramente la posibilidad de que las
diferentes subpoblaciones hayan evolucionado a partir de orígenes
diferentes, sobre distintos tipos de huéspedes.
La utilización de genealogías génicas en este Capítulo de la investigación
ha permitido estudiar la evolución de F. oxysporum f. sp. ciceris como una
grupo derivado de una población fundadora pequeña o un individuo
único. Aunque existe la posibilidad de que puedan desarrollarse nuevas
variantes del patógeno con una mayor adaptación, que reemplacen a las
poblaciones existentes, i. e., un ‘barrido’ selectivo; no existe evidencia de
que esto haya ocurrido en F. oxysporum f. sp. ciceris, a menos que los nuevos
genotipos hayan tenido éxito en reemplazar a poblaciones existentes
anteriormente en las principales zonas cultivadoras de garbanzo del
mundo. La uniformidad en las secuencias genéticas estudiadas a lo largo de
todo el rango geográfico es una notable evidencia de un origen único.
Los resultados que hemos alcanzado en este estudio también resaltan la
necesidad de seleccionar marcadores genéticos apropiados para responder
96

Capítulo III
a las cuestiones que le han dado origen, esto es, las secuencias de genes
pueden no revelar suficientes polimorfismos para distinguir entre los
fenotipos de interés fitopatológico. Para esta aplicación, los marcadores
RAPD han demostrado ser de mayor utilidad (Assigbetse et al., 1994;
Grajal Martin et al., 1993; Jiménez Gasco et al., 2001; Kelly et al., 1994;
Capítulo I).
97

CAPÍTULO IV
Capítulo IV
Caracterización de aislados de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris mediante ‘fingerprinting’
genómico con secuencias de ADN repetitivo
Introducción
Las poblaciones de Fusarium oxysporum Schlechtend.:Fr. f. sp. ciceris
(Padwick) Matuo & K. Sato, el agente causante de la Fusariosis Vascular
del garbanzo (Cicer arietinum L.), presentan una gran variabilidad
patogénica. En F. oxysporum f. sp. ciceris se han identificado dos patotipos
(denominados Amarillez y Marchitez) en función de la sintomatología que
originan sus aislados en cultivares de garbanzo susceptibles; y ocho razas
patogénicas (denominadas 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6), según la reacción
que se desarrolla al inocular una serie de líneas de garbanzo diferenciadoras
(Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a; Trapero Casas y
Jiménez Díaz, 1985). Los mecanismos que han dado lugar a la aparición de
razas patogénicas en F. oxysporum f. sp. ciceris son desconocidos. Puesto que
F. oxysporum es un hongo anamórfico, la ausencia de un ciclo sexual
conocido imposibilita el estudio genético del patógeno mediante métodos
convencionales.
El conocimiento acerca de la extensión y distribución de la variabilidad
genética existente tanto en las razas patogénicas de F. oxysporum f. sp. ciceris,
como entre ellas como componentes poblacionales del patógeno, es un
99

Capítulo IV
requisito importante a la hora de estudiar la relación genética entre dichas
razas así como su posible origen evolutivo. Este conocimiento tiene
importantes implicaciones no sólo en el manejo adecuado de los cultivares
de garbanzo resistentes a F. oxysporum f. sp. ciceris ya disponibles, sino
también en el desarrollo de nuevos cultivares con resistencia más efectiva y
duradera a las diferentes razas del patógeno.
Los elementos de ADN repetitivo han mostrado ser herramientas muy
útiles para estudios taxonómicos y epidemiológicos de hongos
fitopatógenos (Goodwin et al., 1995; Levy et al., 1991; Roumen et al., 1997;
Shull y Hamer, 1996; Zeigler et al., 1995), incluido F. oxysporum (Kistler et
al., 1991; Mouyna et al., 1996; Namiki et al., 1994; 1998; Plyler et al., 2000;
Tantaoui et al., 1996). Las hibridaciones de ADN genómico con sondas de
ADN repetitivo generan patrones de fragmentos (‘fingerprints’) de ADN
que proporcionan información relativa a un gran número de loci de forma
simultánea.
Puesto que la probabilidad de que organismos no relacionados puedan
compartir un mismo genotipo ‘multilocus’ es muy baja, el análisis de
‘fingerprints’ de ADN permite estructurar las poblaciones fúngicas en
‘linajes clonales’; ésto es, grupos de aislados fúngicos que comparten una
alta similaridad en patrones de ‘fingerprints’ de ADN (Zeigler et al., 1995).
La interpretación evolutiva de esta aproximación fenética es que los
aislados que componen un linaje clonal están relacionados genéticamente y
descienden de un antepasado común. Una población fúngica con
estructura de linajes es consistente con el modo de reproducción asexual
del patógeno, y generalmente, los distintos linajes clónicos presentan
patrones de virulencia independientes.
Los estudios genéticos de poblaciones fúngicas mediante marcadores
moleculares indican que existen diferentes patrones de diversidad entre las
formae speciales de F. oxysporum (Kistler, 1997). Algunas formae speciales
presentan escasa diversidad en haplotipos ‘multilocus’ basados en datos de
RFLP (‘Restriction Fragment Length Polymorphism’) de copia única;
además, poseen similares haplotipos de ADN mitocondrial generados
mediante RFLPs, y/o pertenecen a un único grupo de compatibilidad
vegetativa (VCG). Este patrón de diversidad, tan simple, ha sido
100

Capítulo IV
identificado en F. oxysporum f. sp. albedinis (Killian & Maire) Gordon
(Fernández et al., 1997; Tantaoui et al., 1996), F. oxysporum f. sp. canariensis
Mercier & Louvet (Plyler et al., 2000), y F. oxysporum f. sp. conglutinans
(Wollenw.) W. C. Snyder & H. N. Hansen (Bosland y Williams, 1987;
Kistler et al., 1987). Dicho patrón de escasa similaridad es consistente con
la estructura de una población resultante de la expansión de un único
genotipo que ha tenido éxito en la adquisición de patogenicidad sobre un
huésped determinado (Kistler, 1997).
Otras formae speciales de F. oxysporum poseen patrones de mayor
diversidad que, aún siendo consistentes con la clonalidad consecuencia de
su sistema reproductivo asexual, se caracterizan por comprender dos o
más linajes dentro de una forma specialis, que se refleja mediante la existencia
de múltiples VCGs, y una diversidad alta de haplotipos mitocondriales y
haplotipos ‘multilocus’ identificados mediante RFLPs o RAPDs (‘Random
Amplified Polymorphic DNA’). Estos patrones de mayor diversidad han
sido identificados en F. oxysporum f. sp. cubense (E. F. Smith) W. C. Snyder
& H. N. Hansen (Bentley et al., 1995; Koenig et al., 1997; O’Donnell et al.,
1998), F. oxysporum f. sp. melonis (Leach & Currence) W. C. Snyder & H. N.
Hansen (Jacobson y Gordon, 1988; 1990), y F. oxysporum f. sp. lycopersici
(Sacc.) W. C. Snyder & H. N. Hansen (Elias y Schneider, 1991; Elias et al.,
1993).
Para explicar la relación entre formae speciales, razas, y VCGs en F.
oxysporum se han propuesto varios modelos evolutivos y se han identificado
numerosos ejemplos que reflejan cada uno de dichos modelos (Correll,
1991). En ciertas formae speciales (i. e., cubense, melonis) existe una compleja
relación entre razas patogénicas y VCGs, de manera que distintos aislados
del patógeno pertenecientes a una misma raza pueden ser adscritos a
diferentes VCGs, y un mismo VCG puede comprender aislados de
diferentes razas (Appel y Gordon, 1994; Bentley et al., 1998; Jacobson y
Gordon, 1990). Aunque numerosas investigaciones han demostrado que
puede existir correlación entre VCGs y linajes clonales (ej., Elias et al.,
1993; Koenig et al., 1997), existen muy pocos trabajos que hayan
profundizado en la relación evolutiva entre razas que pertenezcan a un
mismo VCG. Gordon y Martyn (1997) propusieron que una alta
101

Capítulo IV
similaridad genética entre razas patogénicas es indicativa de una posible
evolución de unas razas a partir de otras mediante pequeños cambios
genéticos (Gordon y Martyn, 1997). Aunque esta hipótesis es plausible,
por el momento, en la literatura fitopatológica no se encuentran datos que
la apoyen.
En las investigaciones que han dado lugar a este Capítulo hemos
utilizado sondas de ADN repetitivo para generar ‘fingerprints’ de ADN de
razas de F. oxysporum f. sp. ciceris, con el fin de: (1) examinar la variabilidad
genética entre aislados de una misma raza, y entre distintas razas de este
patógeno; (2) determinar si las diferentes razas de F. oxysporum f. sp. ciceris
están constituidas por linajes clonales genéticamente diferenciados, o en
cambio, se encuentran agrupadas dentro de un único linaje; y (3) estudiar la
posible relación evolutiva entre dichas razas patogénicas.
Materiales y Métodos
Aislados fúngicos
En este estudio se han utilizado 36 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
representativos de las ocho razas patogénicas descritas (i. e., razas 0, 1A,
1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6) y de un amplio origen geográfico del patógeno, así
como tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo obtenidos
de raíces de plantas sanas de garbanzo (Tabla 11). Todos los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris fueron caracterizados racialmente mediante pruebas
de patogenicidad en trabajos anteriores (Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a;
Jiménez Gasco et al., 2001; Kelly et al., 1994; Capítulo I), y proceden de la
colección de cultivos fúngicos del Departamento de Protección de
Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Córdoba.
Los aislados se han mantenido como cultivos monoconídicos, en suelo
estéril a 4ºC, en oscuridad. Los procedimientos para la obtención de
cultivos activos de los aislados fúngicos, el manejo de éstos, y la obtención
102

Capítulo IV
de su micelio para extracciones de ADN, han sido descritos con
anterioridad (Pág. 22, 26, Capítulo I; Pág. 52, Capítulo II).
Extracción de ADN
El ADN genómico de cada aislado se purificó a partir de micelio
liofilizado y molido, según el método de Raeder y Broda (1985) descrito
con anterioridad (Pág. 27-28, Capítulo I); la única excepción al método
descrito fue la utilización de 100 mg de micelio liofilizado y molido, con
objeto de obtener ADN de mayor concentración, y en mayor cantidad
para la realización de las digestiones con la enzima EcoRI.
Hibridaciones ‘Southern’
Se digirieron entre 3 y 5 µg de ADN de cada uno de los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris, y de los aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo, con 15 a 25 U de la enzima EcoRI. Los fragmentos generados en
la digestión enzimática se separaron mediante electroforesis en geles de
agarosa al 0,8 % de 15 x 25 cm, en tampón TAE (40 mM Tris-acetato; 1
mM EDTA, pH 8,0) a 1 V·cm -1 durante 12-14 h. Posteriormente, los
fragmentos separados electroforéticamente se transfirieron mediante vacío
103

Capítulo IV
Tabla 11. Información geográfica y racial sobre los aislados de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F. oxysporum (Fo) no patogénicos de
garbanzo, utilizados en el análisis de ‘fingerprints’ de ADN
104
Aislado Origen geográfico a
Raza
patogénica b
Foc-7802 España 0
Foc-7952 España 0
Foc-8207 España 0
Foc-82108 España 0
Foc-82113 España 0
Foc-9018 PV1 España 0
Foc-9018 JG62 España 0
Foc-9032 España 0
Foc-91108 España 0
Foc-91114 España 0
Foc-9605 Túnez 0
Foc-T3 Túnez 0
Foc-USA 3-1 JG62 EEUU 1B/C
Foc-1987-W17 EEUU 1B/C
Foc-9602 Túnez 1B/C
Foc-7989 India 1A
Foc-9027 PV1 c España 1A
Foc-9168 Marruecos 1A
Foc-9165 Marruecos 1A
Foc-9166 c Marruecos 1A
Foc-8272 España 6
Foc-9023 España 6
Foc-9164 Marruecos 6
Foc-9170 Marruecos 6
Foc-Tonini EEUU 6

Capítulo IV
Tabla 11. (Continuación) Información geográfica y racial sobre los
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), y de F. oxysporum (Fo) no
patogénicos de garbanzo, utilizados en el análisis de ‘fingerprints’ de ADN
Aislado Origen geográfico a
Raza
patogénica b
Foc-8012 España 5
Foc-9035 España 5
Foc-9094 JG62 España 5
Foc-USA 1-1 JG62 EEUU 5
Foc-USA W6-1 EEUU 5
Foc-8605 India 2
Foc-1992R2N India 2
Foc-8606 India 3
Foc-1992R3N India 3
Foc-8607 India 4
Foc-1992R4N India 4
Fo-8250 España NP
Fo-9009 España NP
Fo-90105 España NP
a Los aislados de EEUU (California), España, y Marruecos proceden de la
micoteca del Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura
Sostenible, CSIC, Córdoba, España. Los aislados de la India fueron
proporcionados por el Dr. M. P. Haware, ICRISAT, Hyderabad, India. Los
aislados procedentes de Túnez fueron cedidos por el Dr. M. H. Halila, Institute
Nationale de la Recherche Agronomique, Ariana, Túnez.
b Raza determinada mediante pruebas de patogenicidad sobre líneas de garbanzo
diferenciadoras (Alcalá Jiménez, 1995; Jiménez Gasco et al., 2001; Capítulo I).
NP = no patogénicos de garbanzo.
c Aislados caracterizados como pertenecientes a la raza 6 de F. oxysporum f. sp.
ciceris en pruebas de patogenicidad duplicadas (Alcalá Jiménez, 1995).
105

Capítulo IV
(VacuGene XL y VacuGene Pump, Pharmacia LKB, Upsala, Suecia) a una
membrana de nylon (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).
Como sondas de hibridación para generar ‘fingerprints’ de ADN se
utilizaron fragmentos de ADN de naturaleza repetitiva identificados con
anterioridad a este estudio. Estos fragmentos de ADN fueron
identificados en el transcurso de los procesos de clonación y secuenciación
de fragmentos RAPD marcadores de las razas 2 y 6 de F. oxysporum f. sp.
ciceris, que se llevaron a cabo con objeto de diseñar iniciadores para
reacciones de PCR específica (Ver Capítulos I y II). Los clones bacterianos
que albergaron dichos fragmentos RAPD clonados fueron los siguientes:
FocB10 (1,0 kb–raza 2–OPF12), FocO2 (1,0 kb–raza 6–OPI09), y FocP18
(1,4 kb–raza 6–OPI09).
La purificación de ADN plasmídico, así como la obtención de la sonda
de ADN y su marcaje con DIG-11-dUTP(digoxigenina-3-O-metilcarbonilamino-caproil-5-(3-aminoalil)-uridina-5’-tri-fosfato),
se realizaron por los
procedimientos descritos con anterioridad (Pág. 59-62 Capítulo II). Los
tratamientos de prehibridación e hibridación se realizaron en condiciones
de alta astringencia (68 ºC) (Sambrook et al., 1989). El revelado de las
membranas de hibridación se realizó mediante métodos
quimioluminiscentes descritos en el Capítulo II (Pág. 62-63). Las
hibridaciones se repitieron al menos dos veces.
Análisis de datos
Los datos obtenidos a partir de los ‘fingerprints’ de ADN generados
mediante la hibridación de las digestiones de ADN genómico con sondas
de ADN repetitivo, se han analizado mediante dos estrategias: (a) de tipo
fenético, en el que el criterio utilizado es la totalidad de similitud de
caracteres entre organismos; y (b) de aproximación cladística, que analiza la
relación entre los organismos teniendo en cuenta su historia evolutiva.
Se construyó una matriz binaria resultante de combinar los datos
generados por el análisis de hibridación de 36 aislados de F. oxysporum f. sp.
106

Capítulo IV
ciceris y tres aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo, con las
tres sondas de ADN repetitivo FocB10, FocO2, y FocP18. En la matriz, la
presencia o ausencia de los fragmentos identificados se codificó como ‘1’ y
‘0’, respectivamente.
El análisis de similaridad fenético entre los 39 aislados de estudio se
realizó mediante el programa NTSYSpc2.0 (Rohlf, 1988), utilizando el
‘unweighted paired group method with arithmetic averages’ (UPGMA),
que se basó en el coeficiente de similaridad de Jaccard (Sneath y Sokal,
1973).
El análisis cladístico se basó en un análisis de máxima parsimonia
mediante el programa PAUP* 4.0b4a (‘Phylogenetic Analysis Using
Parsimony and Other Methods’) (Swofford, 2000). El análisis de
parsimonia se realizó utilizando la búsqueda Heurística, y la significación
de cada una de las agrupaciones generadas se confirmó mediante el análisis
de ‘bootstrap’ con 1.000 repeticiones.
Resultados
En este estudio hemos utilizado sondas de ADN repetitivo de F. oxysporum
f. sp. ciceris para generar ‘fingerprints’ de ADN genómico de razas de dicho
agente. Este ADN repetitivo fue identificado durante los procesos de
clonación y secuenciación de marcadores RAPD de las razas 2 (FocB10) y
6 (FocO2 y FocP18) de F. oxysporum f. sp. ciceris, realizados para diseñar
iniciadores de PCR específica. El análisis de las secuencias de dichos
fragmentos de ADN indicó que éstos presentan similaridad con elementos
transponibles de otros hongos citados en la literatura fitopatológica. En
particular, la secuencia de FocB10 presentó un 80% de similaridad con el
transposón Fot1 identificado en F. oxysporum f. sp. melonis (Daboussi et al.,
1992). Similarmente, la secuencia de FocO2 presentó un 52% de
similaridad con la codificante de una proteína similar a una transposasa
identificada en aislados de F. oxysporum (Okuda et al., 1998); y la secuencia
107

Capítulo IV
de FocP18 presentó cierta homología con transposasas putativas descritas
en numerosos organismos, aunque con niveles de similitud poco
significativos.
Los perfiles de hibridación generados con las tres sondas de ADN y el
ADN genómico de los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris manifestaron
una notable diferencia con respecto a los generados con ADN de aislados
de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo. Así, el clon FocB10 presentó
homología con 20 a 30 de los fragmentos generados en la digestión del
ADN de F. oxysporum f. sp. ciceris con EcoRI; mientras que el patrón de
hibridación que se generó utilizando ADN de los aislados de F. oxysporum
no patogénicos de garbanzo contuvo nueve ó 15 bandas de ADN (aislados
Fo–8250 y –90105, respectivamente), o ninguna (aislado Fo–9009). El
tamaño las bandas de hibridación observadas varió entre 1,5 y 12 kb,
aproximadamente.
Similarmente, la sonda de ADN FocO2 generó patrones de hibridación
que contenían entre 20 y 30 bandas homólogas en aislados de F. oxysporum
f. sp. ciceris, y sólo entre tres y 10 bandas en los aislados de F. oxysporum
Fo–8250 y –90105 no patogénicos de garbanzo, respectivamente (Fig. 10).
FocP18 fue probablemente la secuencia contenida más repetitivamente en
el ADN genómico de F. oxysporum f. sp. ciceris. Así, el patrón de hibridación
con la citada sonda fue tan profuso, que en el intervalo de peso molecular
entre 5 y 10 kb no hubo resolución suficiente para identificar bandas
individuales debido al ‘smear’ de fondo (rastro de hibridación continuo en
el que no se identifican bandas discretas). Aún así, en las hibridaciones se
identificaron ‘fingerprints’ de ADN formados por hasta 16 bandas
claramente distinguibles. Al igual que con las otras sondas utilizadas, en las
hibridaciones con esta secuencia de ADN repetitivo sólo se identificaron
tres o seis bandas de ADN homólogas en los aislados de F. oxysporum
Fo–8250 y –90105 no patogénicos de garbanzo, respectivamente. Por el
contrario, ninguna de las tres sondas de ADN repetitivo produjo señal de
hibridación alguna con el ADN genómico del aislado de F. oxysporum Fo–
9009.
108

1
5,
2,
1,
1,0
0,
0,
C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Capítulo IV
Figura 10. ‘Fingerprint’ de ADN genómico de aislados de Fusarium oxysporum
f. sp. ciceris representativos de todas las razas patogénicas descritas (razas 0,
1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6), y de un amplio origen geográfico del patógeno. La
sonda utilizada fue FocO2, que contiene un elemento de ADN repetitivo
identificado en el genoma de F. oxysporum f. sp. ciceris. Los números a la
izquierda indican el peso molecular aproximado (kb) de las bandas de
hibridación. Carriles: C, control de hibridación; 1-2, aislados de la raza 0 Foc–
9018 JG62, –7802; 3-4, aislados de la raza 1B/C Foc–USA 3-1 JG62, –1987
W17; 5, 6, aislados de cada una de las razas 2 y 4 Foc–8605, –1992R4N; 7-8,
aislados de la raza 5 Foc–8012, – 9035; 9-13, aislados de la raza 1A Foc–7989,
–9166, –9165, –9168, –9027 PV1; 14, 16, 17, aislados de la raza 6 Foc–Tonini,
–8272, –9170; 15, 18, 19, aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo
Fo–8250, –9009, y –90105, respectivamente.
109

Capítulo IV
Variabilidad genética entre razas de F. oxysporum f. sp. ciceris
Las hibridaciones realizadas utilizando ADN genómico de los 36 aislados
de F. oxysporum f. sp. ciceris y de tres aislados de F. oxysporum no patogénicos
de garbanzo, y las tres sondas de ADN repetitivo FocB10, FocO2, y
FocP18, produjeron 88 bandas claramente distinguibles y con la suficiente
resolución para ser contabilizadas. Los patrones de ‘fingerprints’ de ADN
fueron muy similares entre aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris, aunque la
presencia de ciertas bandas de hibridación permitió diferenciar visualmente
a cada una de las razas mediante su perfil de hibridación.
La similaridad entre los aislados fúngicos se determinó mediante análisis
de agregación (‘cluster’) de los datos de ‘fingerprinting’, en el que se
consideraron de forma conjunta las hibridaciones producidas por las tres
sondas de ADN repetitivo. El dendrograma así generado mostró que los
aislados pertenecientes a una raza de F. oxysporum f. sp. ciceris son
genéticamente más similares entre sí que lo son a los aislados
pertenecientes a otras razas del patógeno (Fig. 11).
Los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris compartieron aproximadamente un
32% de similaridad en ‘fingerprints’ de ADN genómico, y fueron
claramente distinguibles de los aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo incluidos en el análisis (Fig. 11). Dentro del grupo de aislados de
F. oxysporum f. sp. ciceris se distinguieron dos grupos claramente
correlacionados con la capacidad de los aislados de inducir el síndrome de
Amarillez (patotipo de Amarillez) o de Marchitez (patotipo de Marchitez),
que compartieron aproximadamente un 50% de similaridad cada uno. A su
vez, dentro de los grupos correspondientes a cada uno de dichos
patotipos, los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris se distribuyeron en
agrupaciones correlacionadas con la naturaleza racial de cada aislado.
110

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
Capítulo IV
Raza
patogénica
9018PV1 0
9018JG62 0
T3 0
82108 0
82113 0
91108 0
91114 0
7802 0
8207 0
7952 0
9032 0
9605 0
1987W17 1B/C
USA3-1JG62 1B/C
9602 1B/C
7989 1A
9168 1A
8272 6
9166 1A
9170 6
Tonini 6
9165 1A
9164 6
9023 6
9027PV1 1A
8605 2
1992R2N 2
8606 3
1992R3N 3
1992R4N 4
8607 4
8012 5
USA1-1JG62 5
9035 5
USAW6-1 5
9094JG62 5
8250 NP
90105 NP
9009 NP
Figura 11. Dendrograma UPGMA generado a partir de la información obtenida
mediante ‘fingerprints’ de ADN genómico de aislados de Fusarium oxysporum f. sp.
ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6) y F. oxysporum no patogénicos de garbanzo (NP)
con las sondas de ADN repetitivo FocB10, FocO2, y FocP18. La escala inferior
corresponde a la similaridad entre aislados basada en el coeficiente de Jaccard.
111
Amarillez Marchitez Marchitez

Capítulo IV
El ‘cluster’ que agrupó a los aislados del patotipo de Amarillez estuvo
constituido por dos ‘subclusters’ (63-65%), correspondientes
respectivamente a las razas 0 y 1B/C. De igual manera, dentro del ‘cluster’
correspondiente al patotipo de Marchitez se distinguieron tres
agrupaciones de aislados. De una parte, los aislados de las razas 1A y 6
constituyeron un grupo (64% de similaridad) claramente diferenciado del
resto de aislados causantes del síndrome de Marchitez. Este resto de
aislados estuvo comprendido por las razas 2, 3, 4, procedentes de la India,
que formaron un grupo distinguible del constituido por la raza 5, ambos
comprendidos en el ‘cluster’ de aislados causantes de Marchitez (Fig. 11).
Los aislados de la raza 5 se agruparon de forma distintiva al resto de
aislados de Marchitez, compartiendo un 90% de similaridad en los
‘fingerprints’ de ADN genómico. No existió asociación alguna entre la
distribución de los aislados en el dendrograma y el origen geográfico de los
aislados, a excepción de la indicada para los aislados de la India, que
constituyeron un ‘cluster’ distintivo.
Variabilidad genética entre aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
pertenecientes a la misma raza
En los ‘fingerprints’ de ADN genómico con sondas de ADN repetitivo, el
nivel de similaridad de los polimorfismos identificados entre aislados
pertenecientes a una misma raza de F. oxysporum f. sp. ciceris varió
notablemente según ésta. En particular, los aislados pertenecientes a la raza
0 de F. oxysporum f. sp. ciceris compartieron aproximadamente un 57% de
similaridad (Fig. 11). En cambio, los aislados de la raza 5, procedentes de
España y California (EEUU), fueron genéticamente los más similares entre
sí, con aproximadamente un 90% de similaridad en ‘fingerprints’ de ADN
genómico. Además, los aislados de la raza 0 se distribuyeron a su vez en
dos agrupaciones con un 63 y 65% de similaridad cada uno, que no
mostraron correlación geográfica alguna, ni asociación con los subgrupos
112

Capítulo IV
de virulencia descritos dentro de la raza 0 con anterioridad (Alcalá
Jiménez, 1995; Jiménez-Díaz et al., 1993a).
Los aislados pertenecientes a las razas 1A y 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris
se agruparon conjuntamente compartiendo aproximadamente un 64% de
similaridad en patrones de ‘fingerprints’ de ADN genómico. En la
agrupación de los aislados de dichas razas se observó que los aislados Foc
–9027 PV1, –9165, –9166, –9168, pertenecientes a la raza 1A, mostraron
ser genéticamente más similares a los aislados de la raza 6 que a otros
aislados de la raza 1A (i. e., Foc–7989). De igual manera, el aislado Foc–
8272 caracterizado como raza 6, se agrupó junto a los aislados de la raza
1A de F. oxysporum f. sp. ciceris (Fig. 11).
Análisis filogenético de aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
Con objeto de estudiar la posible relación evolutiva entre las razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris, se realizó un análisis filogenético basado en un
método de máxima parsimonia a partir de los datos obtenidos mediante
‘fingerprints’ de ADN genómico con las tres sondas de ADN repetitivo
descritos en el apartado anterior.
Esta aproximación cladística produjo dos árboles igualmente
parsimoniosos a partir de 67 caracteres filogenéticamente informativos
[longitud del árbol=202 pasos; índice de consistencia (CI)= 0,4158; índice
de consistencia recalculado (RC)= 0,3271; índice de homoplasia (HI)=
0,5842; índice de retención (RI)= 0,7866] (Fig. 12). La topografía general
del cladograma fue muy similar a la producida mediante el análisis fenético
UPGMA.
En dicho cladograma, el grupo de aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris se
diferenció claramente de los aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo. Además, los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris se distribuyeron
en dos grupos correlacionados con el patotipo al que pertenecen; i. e., su
capacidad de inducir el síndrome de Amarillez o de Marchitez.
113

Capítulo IV
A pesar de la similitud en la topografía de los análisis cladístico y
fenético, en el análisis de máxima parsimonia se identificaron varias
diferencias con respecto al análisis UPGMA. En el análisis cladístico, el
aislado Foc–9602, procedente de Túnez y caracterizado patogénicamente
como raza 1B/C, se agrupó junto con los aislados de la raza 0 analizados
(Fig. 12); mientras que el análisis UPGMA agrupó a dicho aislado junto a
los aislados de la raza 1B/C procedentes de California (Fig. 11). En este
contexto, es de resaltar que el análisis fenético analiza estrictamente la
similaridad total en el patrón de homologías producido en las
hibridaciones de ADN, mientras que la reconstrucción cladística refleja la
relación entre los aislados teniendo en cuenta sólo los caracteres derivados
compartidos (i. e., un antepasado común). El aislado Foc–9602 fue
caracterizado como perteneciente a la raza 1B/C mediante pruebas de
patogenicidad y mediante análisis RAPD; sin embargo, de las cinco bandas
RAPD marcadoras de R1B/C identificadas en los aislados de esta raza
procedentes de California (EEUU), sólo tres de ellas se identificaron en los
perfiles de amplificación RAPD del ADN genómico de Foc–9602
utilizando iniciadores aleatorios (Capítulo I). Además, el análisis del ADN
de este aislado mediante PCR (‘Polymerase Chain Reaction’) específica
generó la banda marcadora de la raza 0 (Capítulo II).
De igual forma, el análisis de máxima parsimonia mostró que los aislados
de la raza 1A son más cercanos evolutivamente a las razas 2, 3, 4, y 5, que
a los aislados de la raza 6. Similarmente, dicho análisis indicó que la raza 5
es la más distante genéticamente, con un mayor número de pasos
evolutivos (Fig. 12), y más cercana a las razas 2, 3, y 4, identificadas
únicamente en la India hasta ahora, que al resto de las razas causantes
del síndrome de Marchitez presentes en la Cuenca Mediterránea (razas 1A
y 6).
114

Capítulo IV
71
9018PV1 (R0)
9018JG62 (R0)
82108 (R0)
T3 (R0)
82113 (R0)
91108 (R0)
91114 (R0)
59
9602 (R1B/C)
55
7802 (R0)
8207 (R0)
53
9032 (R0)
7952 (R0)
89
9605 (R0)
USAW17 (R1B/C)
69
USA 3-1 JG62 (R1B/C)
83
7989 (R1A)
9168 (R1A)
8272 (R6)
90 8605 (R2)
86 1992R2N (R2)
8606 (R3)
55 1992R3N (R3)
1992R4N (R4)
8607 (R4)
87
100
95
9166 (R1A)
9165 (R1A)
9170 (R6)
59 8012 (R5)
USA1-1JG62 (R5)
9035 (R5)
9094 JG62 (R5)
70 USAW6-1 (R5)
52
Tonini (R6)
9164 (R6)
9023 (R6)
9027PV1 (R1A)
1 cambio
8250 (NP)
90105 (NP)
9009 (NP)
Figura 12. Uno de dos árboles filogenéticos de igual máxima parsimonia generados
mediante PAUP en base a la información generada mediante ‘fingerprints’ de ADN
genómico de aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6),
y de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo (NP), generados con las sondas de
ADN repetitivo FocB10, FocO2, y FocP18. Los números en las líneas representan
valores de ‘bootstrap’ >50% basados en 1.000 repeticiones.
115

Capítulo IV
Discusión
Los objetivos de la investigación incluida en este Capítulo han sido
determinar la variabilidad genética existente entre los aislados de una
misma raza, y entre las distintas razas patogénicas de F. oxysporum f. sp.
ciceris; así como estudiar la posible relación evolutiva entre dichas razas.
Para ello, hemos analizado los ‘fingerprints’ de ADN genómico de los
aislados generados mediante hibridaciones con tres sondas de ADN
repetitivo de F. oxysporum f. sp. ciceris, compuestas por secuencias que
presentan similitud con elementos transponibles de otros hongos descritos
en la literatura fitopatológica.; y la similaridad existente entre los
‘fingerprints’ de ADN de los distintos aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
se analizó mediante dos aproximaciones, una de tipo fenético y otra de
tipo cladístico.
El análisis de ‘fingerprints’ de ADN genómico ha puesto de manifiesto
que los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris presentan patrones de
hibridación altamente correlacionados tanto con su capacidad de inducir
un síndrome determinado en la planta huésped (i. e., patotipos de
Amarillez y de Marchitez), como con su patogenicidad diferencial sobre
líneas diferenciadoras de garbanzo (i. e., razas patogénicas),
independientemente del tipo de análisis realizado. El análisis fenético de la
similaridad entre ‘fingerprints’ de ADN mostró que, dentro del grupo del
patotipo de Amarillez, los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris se dividieron
en dos grupos que corresponden a la raza 0 y a la 1B/C. De igual manera,
los aislados pertenecientes al patotipos de Marchitez se distribuyeron en
varios grupos correspondientes a las razas 1A/6, raza 5, y al grupo de razas
2, 3, y 4, descritas únicamente en la India.
Esta agrupación por similaridad de ‘fingerprints’ de los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris es consistente con la obtenida por Kelly et al. (1994)
mediante el análisis RAPD con tres iniciadores aleatorios, y por Jiménez
Gasco et al. (2001) (Capítulo I) mediante RAPDs utilizando siete
iniciadores aleatorios diferentes a los anteriores. Es de resaltar que en los
dos estudios referidos se utilizó una parte del mismo grupo de aislados del
116

Capítulo IV
patógeno que se ha utilizado en el análisis de ‘fingerprints’. Ésto sugiere
que F. oxysporum f. sp. ciceris es un grupo clonal de aislados patógenos con
una fuerte estructura racial, en el cual la correlación entre los marcadores
genéticos neutrales, tales como los ‘fingerprints’ de ADN, y la
patogenicidad, puede ser utilizada para inferir conclusiones sobre la
relación genética entre razas.
En los últimos años se han realizado numerosos estudios de análisis de
‘fingerprints’ con ADN repetitivo en varias formae speciales de F. oxysporum,
con objeto de inferir los modelos de evolución entre razas patogénicas. La
mayor parte de dichos estudios no mostró una correlación entre razas y
evolución genética (Kim et al., 1992; Kistler et al., 1987; 1991; Manicom y
Baayen, 1993; Manicom et al., 1990), aunque si ha sido muy clara la
correlación entre ‘fingerprints’ de ADN y VCGs (Elias et al., 1993;
Whitehead et al., 1992). Así, por ejemplo, en F. oxysporum f. sp. vasinfectum
(Atk.) W. C. Snyder & H. N. Hansen, el análisis RFLP del ADN
ribosómico (ADNr) y mitocondrial (ADNmt) no estableció una clara
correlación entre razas pertenecientes a distintos VCGs y la variabilidad
genética entre ellas, aunque los aislados de cada raza pudieron ser
diferenciados al combinar la información del análisis RFLP del ADNr y
del ADNmt (Fernández et al., 1994). En la literatura fitopatológica no
existen trabajos que analicen a fondo la evolución de razas en formae
speciales monofiléticas, tal como F. oxysporum f. sp. ciceris.
El análisis de ‘fingerprints’ de ADN reveló que algunos aislados de la
raza 1A de F. oxysporum f. sp. ciceris (i. e., Foc–9027 PV1, –9166) son más
similares genéticamente a los aislados de la raza 6 que al resto de los
aislados de la raza 1A o al resto de las razas que inducen el síndrome de
Marchitez (Fig. 11). Esta agrupación ha sido identificada con anterioridad
(Jiménez Gasco et al., 2001; Capítulo I) y podría ser explicada bien por la
caracterización errónea de algunos de los aislados, o por una alta
similaridad genética entre dichas razas.
De hecho, existe documentación que apoya las dos posibilidades
señaladas. Así, cuando la caracterización racial de los aislados de la raza 1A
Foc–9027 JG62 y –9166 que realizó Alcalá Jiménez (1995) mediante
pruebas de patogenicidad fue repetida para confirmar la reproducibilidad
117

Capítulo IV
de asignación a una raza, dichos aislados fueron caracterizados como
pertenecientes a la raza 6 (Alcalá Jiménez, 1995). Además, las reacciones
de virulencia diferencial generadas por las razas 1A y 6 al inocular líneas
diferenciadoras de garbanzo en pruebas de patogenicidad son muy
similares entre sí, ya que las razas 1A y 6 se diferencian principalmente por
la reacción de los cvs. ‘ICCV-2’ e ‘ICCV-4’ (resistentes a la raza 1A,
susceptibles a la raza 6) (Halila y Strange, 1996; Jiménez Díaz et al., 1993a).
Tales diferencias en la asignación de un aislado a una u otra raza por el
fenotipo de la reacción de ‘ICCV-2’ a la inoculación, puede estar asociada
con el ciclo corto que caracteriza a este cultivar. En condiciones de cultivo
en maceta en ambiente controlado óptimo para el crecimiento de la planta
y el desarrollo de la infección, tiene lugar una senescencia precoz de la
planta que puede ser confundida con una reacción patogénica si no se
confirma la asociación entre sintomatología e infección mediante al
aislamiento positivo del agente en cultivo puro. Por todo ello, no es de
descartar la posibilidad de un error en la caracterización racial de los
aislados referidos, debida a algún fallo durante la realización de las pruebas
de patogenicidad. Asimismo, también es posible que estas dos razas
patogénicas aún no se encuentren suficientemente separadas entre sí en
términos evolutivos, para haber desarrollado patrones de ‘fingerprinting’
de ADN y patogénicos independientes. Finalmente, también existe la
posibilidad de que se haya producido una evolución convergente de
patogenicidad (i. e., raza 1A) a partir de antepasados genéticamente
diferentes, dando lugar a dos grupos de ‘fingerprints’ de ADN dentro de la
raza 1A, uno de ellos genéticamente más similar al que presenta la raza 6.
Independientemente de lo descrito anteriormente, el análisis fenético
(UPGMA) de los ‘fingerprints’ de ADN mostró que todos los aislados de
la raza 1A fueron más similares genéticamente a los aislados de la raza 6
que al resto de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris (Fig. 11). En cambio, el
análisis filogenético indicó que la raza 1A está más cercana evolutivamente
a las razas 2, 3, 4, y 5, que a la raza 6 (Fig. 12). Por lo tanto, es necesario un
análisis más profundo, tanto genético como patogénico, de las razas 1A y 6
de F. oxysporum f. sp. ciceris para aclarar su relación genética.
118

Capítulo IV
El aislado Foc–9602, procedente de Túnez, fue caracterizado como
perteneciente a la raza 1B/C de F. oxysporum f. sp. ciceris mediante pruebas
de patogenicidad (Capítulo I). En este estudio, el análisis de similaridad
fenética situó a este aislado junto a los aislados de la raza 1B/C
procedentes de California (EEUU) (Fig. 11); mientras que mediante el
análisis cladístico dicho aislado fue agrupado junto a los aislados de la raza
0 (Fig. 12). En pruebas de patogenicidad (Capítulo I), el aislado Foc–9602
mostró menor virulencia sobre el cultivar diferenciador C-104 que el resto
de los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris analizados y que el aislado tipo
de la raza 0 (Foc–7802); pero resultó más virulento que los aislados de raza
0 sobre ‘ICCV-4’ (Capítulo I). Estas interacciones cultivar-aislado sugieren
características patogénicas intermedias entre la raza 0 y la raza 1B/C.
El análisis filogenético de los ‘fingerprints’ de ADN mostró que los
aislados de la raza 5 (no descrito en la India) se encuentran más cercanos
evolutivamente a las razas 2, 3, y 4 (sólo descritas en la India) que al resto
de las razas presentes en la Cuenca Mediterránea (razas 1A y 6). Aunque la
raza 5 y las razas 2, 3, y 4 se encuentran geográficamente separadas entre
sí, dichas razas son las más similares en relación a la virulencia que
manifiestan sobre líneas y cultivares diferenciadores. Esta agrupación
puede ser explicada si dichas razas constituyen grupos relacionados
evolutivamente pero aislados geográficamente, y adaptados al
germoplasma local de garbanzo, incluso aunque todas parezcan haber
evolucionado a partir del mismo antepasado.
En Cicer spp. existen dos tipos de germoplasma, denominados ‘kabuli’ y
‘desi’ (Singh, 1987). Los garbanzos ‘desi’ (de semilla pequeña, angular, y
coloreada) se cultivan principalmente en el subcontinente Indio, mientras
que los garbanzos ‘kabuli’ (de semilla grande, redondeada y de color claro)
se utilizan principalmente en la región Mediterránea y California.
Si la patogenicidad sobre un huésped en particular constituyó un evento
único y aislado en el proceso evolutivo del patógeno, y el genotipo en
cuestión se distribuyó geográficamente de forma generalizada, cabe esperar
que el patógeno diferenciado sea genéticamente distinto a los aislados no
patogénicos con los que coexiste. En cambio, la relación genética cercana
entre aislados patogénicos y no patogénicos de una zona en particular
119

Capítulo IV
indica una derivación o selección reciente de dicho patógeno a partir de la
población de aislados no patogénicos (Gordon y Okamoto, 1992). La
notable diferencia entre los ‘fingerprints’ de ADN genómico observadas
entre los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris y los aislados de F. oxysporum
no patogénicos de garbanzo, es consistente con la hipótesis de que la
población actual de este patógeno debió estar constituida por un único
genotipo o un número limitado de ellos que adquirió la capacidad de
causar enfermedad en Cicer spp. Esta hipótesis está además apoyada por la
existencia de un único VCG en F. oxysporum f. sp. ciceris (Nogales Moncada,
1997), y de un único perfil de restricción del ADN mitocondrial (Pérez
Artés et al., 1995), así como por la ausencia de polimorfismos en las
secuencias de cinco genes conservados (Capítulo III).
Mientras que otras formae speciales compuestas por un único VCG han
mostrado una diversidad genética muy limitada (i. e., formae speciales
albedinis, y canariensis) (Plyler et al., 2000; Tantaoui et al., 1996), nuestros
resultados indican que F. oxysporum f. sp. ciceris es una forma specialis
altamente diversificada, patogénica y genéticamente. Esta diversidad puede
ser reflejo de una larga historia de asociación con su planta huésped, el
garbanzo, como especie cultivada. Aunque la presencia constatada más
antigua del garbanzo data del año 5.450 a de C., en Turquía; información
arqueológica reciente data el origen de esta planta hace 8.600 a 8.900 años
a de C. Además, dicha información indica que el garbanzo constituyó,
junto a otras seis especies de plantas, la cuna de la agricultura localizada en
el suroeste de la actual Turquía limitante con Siria (Lev-Yadun et al., 2000).
Este ha sido el único lugar donde se han identificado especímenes
silvestres de garbanzo (Singh, 1997).
Hipotéticamente, las razas patogénicas más antiguas han debido
acumular más diversidad genética que aquéllas originadas más
recientemente (Goodwin et al., 1995), especialmente si asumimos el origen
de una raza a partir de un único genotipo, seguido de su dispersión más o
menos generalizada. Además, se asume que la base primitiva de las formae
speciales fue una población parasítica, no patogénica, que evolucionó hacia
la adquisición de patogenicidad sobre un huésped determinado (Correll,
1991; Leslie, 1993). Por lo tanto, en un modelo de evolución en las que
120

Capítulo IV
unas razas patogénicas se originan a partir de otras a través de cambios
genéticos más o menos sencillos (Gordon y Martyn, 1997), las razas más
antiguas habrán de ser menos virulentas que las más recientemente
evolucionadas.
Nuestros resultados apoyan esta hipótesis evolutiva para F. oxysporum f.
sp. ciceris, en tanto las que la evolución más reciente de las razas
patogénicas va unida a una mayor virulencia de estas. Así, la raza 0 es la
menos virulenta de todas las razas, y es la que más diversidad genética
presenta (Fig. 11 y 12), por lo que corresponde a la más ancestral. Por el
contrario, la raza 5 es la más virulenta de las identificadas hasta ahora en la
Cuenca Mediterránea, la que menor diversidad genética posee, y a la que
por tanto correspondería un origen más reciente. Además, desde un punto
de vista evolutivo, a la raza 0 debería seguir la raza 1B/C, no sólo en
cuanto a su nivel de virulencia, sino también en cuanto a su capacidad de
causar el síndrome de Amarillez en cultivares de garbanzo susceptibles.
Esta hipótesis parece ser coherente con nuestros resultados, ya que estas
dos razas están genéticamente más relacionadas entre sí que con el resto de
las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris.
El tipo de elementos de ADN repetitivo que hemos utilizado para
generar ‘fingerprints’ de ADN genómico presentan secuencias
características de transposones. Ello indica que la ganancia o pérdida
paralela de fragmentos de ADN vía transposición o escisión genera un alto
nivel de homoplasia, que puede resultar en una falsa interpretación
filogenética y hacer que este tipo de datos no sean convenientes como
indicadores de descendencia común (O’Hanlon y Peakall, 2000), aunque
sean muy valiosos para el estudio de la similaridad entre aislados, en
especial entre organismos clonales (Carbone et al., 1999). Sin embargo,
tanto el análisis de similaridad fenética entre ‘fingerprints’ de ADN, como
el análisis filogenético de éstos, han mostrado ser congruentes entre sí, y se
correlacionan con las características fitopatógenas de los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris analizados.
Numerosos estudios señalan la posibilidad de que el movimiento de
transposones en el genoma de un organismo sea uno de los mecanismos
generadores de la gran variabilidad genética observada en F. oxysporum
121

Capítulo IV
(Daboussi, 1997; Daboussi y Langin, 1994), dando lugar a mutación de
genes o reorganizaciones genómicas mediante inserciones o escisiones
(Kistler y Miao, 1992). Nuestro trabajo ha demostrado que el genoma de F.
oxysporum f. sp. ciceris contiene numerosas secuencias homólogas a
secuencias similares a transposones descritos en otros hongos, entre ellos
Fot1 (Daboussi et al., 1992), cuya actividad en el sentido arriba indicado ha
sido demostrada. Este tipo de elementos constituyen una fuente potencial
de variación que puede dar lugar a la aparición eventual de nuevas razas a
partir de las ya existentes. El seguimiento de genotipos mediante la
generación de ‘fingerprints’ de ADN como los descritos en este trabajo,
será sumamente útil para detectar los cambios genéticos que se puedan
producir en las poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris.
122

CAPÍTULO V
Capítulo V
Mejora de la metodología de análisis de
poblaciones de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris
mediante PCR entre elementos de ADN repetitivo
(rep-PCR)
Introducción
La amplificación entre elementos repetitivos de ADN mediante análisis de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, ‘Polymerase Chain
Reaction’), o rep-PCR (‘repetitive element-based PCR’), genera
‘fingerprints’ (patrones de fragmentos) de ADN mediante la amplificación
entre las múltiples copias de los elementos repetitivos dispersos en el
genoma molde. Esta metodología combina la simplicidad de la técnica del
análisis PCR, con el nivel de polimorfismos que puede ser detectado
mediante la hibridación del ADN genómico utilizando sondas basadas en
secuencias repetitivas, y ha sido utilizada para el análisis de hongos,
bacterias del suelo, y bacterias fitopatógenas (Edel et al., 1995; George et
al., 1997).
En los análisis rep-PCR referidos, los iniciadores utilizados
corresponden a secuencias de regiones de ADN conservadas en bacterias,
como la secuencia REP (‘Repetitive Extragenic Palindromic Sequence’)
(Stern et al., 1984), las secuencias ERIC (‘Enterobacterial Repetitive
123

Capítulo V
Intergenic Consensus Sequences’) (Hulton et al., 1991), y el elemento BOX
(Martin et al., 1992). La naturaleza altamente conservada de estas
secuencias ha permitido su utilización para el análisis de numerosos
microorganismos, incluidos hongos fitopatógenos. Sin embargo,
posteriores estudios han demostrado que se puede alcanzar un mayor nivel
de polimorfismos y especificidad si la rep-PCR se basa en elementos
repetitivos endógenos, o propios del organismo de estudio (George et al.,
1997; 1998).
En trabajos anteriores en esta Tesis (Capítulos II y IV) hemos
identificado secuencias de ADN repetitivo en el genoma de Fusarium
oxysporum Schlechtend.:Fr. f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato, el
agente causante de la Fusariosis Vascular del garbanzo (Cicer arietinum L.).
Las poblaciones naturales de este patógeno presentan una gran variabilidad
patogénica y genética. Respecto de la diversidad patogénica, experimentos
de patogenicidad en condiciones controladas han llevado a identificar dos
patotipos, denominados Amarillez y Marchitez y ocho razas patogénicas,
denominadas razas 0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6 (Halila y Strange, 1996;
Haware y Nene, 1982b; Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a). Mientras que
los patotipos de Amarillez y Marchitez son determinados por las
características del síndrome patológico que inducen en cultivares de
garbanzo susceptibles (Trapero Casas, 1983; Trapero Casas y Jiménez
Díaz, 1985), la asignación de los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris a las
ocho razas patogénicas se basa en la reacción de líneas de garbanzo
diferenciadoras en inoculaciones estandarizadas (Haware y Nene, 1982b;
Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a).
Las secuencias identificadas en el genoma de F. oxysporum f. sp. ciceris
antes referidas (Capítulos II y IV) han mostrado similaridad con
transposones de genomas fúngicos descritos en la literatura (Daboussi et
al., 1992; Okuda et al., 1998). Cuando dichas secuencias de F. oxysporum f.
sp. ciceris se utilizan como sondas en hibridaciones del ADN genómico,
estas secuencias repetitivas presentan homología con un alto número de
fragmentos (20 a 30) de ADN, generando ‘fingerprints’ cuya utilidad para
determinar la variabilidad genética existente entre las razas patogénicas de
F. oxysporum f. sp. ciceris ha sido demostrada (Capítulo IV). De esta forma,
124

Capítulo V
hemos identificado numerosos polimorfismos asociados a la naturaleza
patotípica y racial de los aislados del patógeno analizados. Los
polimorfismos así identificados pueden ser debidos a diferencias en el
número de copias de estos elementos presentes en el genoma fúngico, o a
diferencias en los lugares de inserción de ellos en dicho genoma. Además,
la información generada por dichos ‘fingerprints’ de ADN genómico ha
permitido profundizar en la relación evolutiva entre las distintas razas
patogénicas, con lo cual, las secuencias de ADN repetitivo del patógeno
constituyen herramientas de gran utilidad para el estudio de la estructura
de las poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris.
La obtención de ‘fingerprints’ de ADN genómico para las
investigaciones que constituyen el Capítulo IV de esta Tesis, se ha basado
en la realización de hibridaciones tipo ‘Southern’ con sondas de ADN
repetitivo. Esta metodología requiere de la utilización de una gran cantidad
de ADN de alta calidad, así como de tiempo de análisis prolongado y
amplios recursos, lo cual dificulta significativamente el análisis de un
número elevado de aislados fúngicos. Por tanto, se necesita una
metodología de estudio que sea tan informativa como el ‘fingerprinting’ de
ADN genómico descrito anteriormente, pero cuya realización sea lo
suficientemente sencilla y no necesitada de recursos excesivos como para
poder ser utilizada de forma rutinaria en el laboratorio.
El objetivo de la investigación recogida en este Capítulo ha sido
demostrar la hipótesis de que los polimorfismos generados mediante la
hibridación del ADN genómico de F. oxysporum f. sp. ciceris con una sonda
constituida por un elemento repetitivo endógeno en dicho genoma, en
particular un transposón, pueden ser identificados mediante análisis rep-
PCR basado en la amplificación del ADN contenido entre las diferentes
copias de dicho elemento. Si dicha hipótesis se prueba cierta, la
información generada mediante hibridaciones ‘Southern’ será equivalente a
la generada mediante el análisis rep-PCR, y este último procedimiento
proporcionará un método alternativo más practicable para el análisis de
extensas poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris.
125

Capítulo V
Materiales y Métodos
Aislados fúngicos
En este estudio se han utilizado 32 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris
representativos de las ocho razas patogénicas descritas (0, 1A, 1B/C, 2, 3,
4, 5, y 6), y de un amplio origen geográfico del patógeno (Tabla 12).
Dichos aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris fueron caracterizados
racialmente en trabajos anteriores (Jiménez Díaz et al., 1989b; Jiménez
Díaz et al., 1993a; Kelly et al., 1994; Capítulo I). Asimismo, se han incluido
en el estudio cinco aislados de F. oxysporum obtenidos de raíces de plantas
sanas de garbanzo y no patogénicos de éste (Tabla 12). Todos los aislados
fúngicos utilizados proceden de la colección del Departamento de
Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC,
Córdoba, y se han mantenido almacenados como cultivos monoconídicos,
en suelo estéril en tubos de ensayo, a 4ºC, en oscuridad. Los
procedimientos para la obtención de cultivos activos de los aislados
fúngicos, el manejo de éstos, y la obtención de su micelio para la
extracción de ADN, han sido descritos con anterioridad (Pág. 22, 26,
Capítulo I; Pág. 52, Capítulo II).
Extracción de ADN
El ADN genómico de cada aislado se purificó a partir de micelio
liofilizado y molido, según el método de Raeder y Broda (1985) (Pág. 27-
28, Capítulo I). Las muestras de ADN se diluyeron hasta una
concentración de 25-50 ng/µl para la realización de las amplificaciones
rep-PCR.
126

Diseño de iniciadores
Capítulo V
Los iniciadores utilizados en la investigación se basaron en la secuencia del
clon bacteriano FocB10, que alberga el fragmento de 1,0 kb generado por
el iniciador aleatorio OPF12 en análisis RAPD. Esta banda RAPD
(‘Random Amplified Polymorphic DNA’) fue identificada como asociada a
la raza 2 de F. oxysporum f. sp. ciceris en trabajos anteriores en esta Tesis
(Capítulos I y II). El análisis de la secuencia correspondiente a este
fragmento mostró una alta similaridad con el transposón Fot1 identificado
en F. oxysporum f. sp. melonis (Leach & Currence) W. C. Snyder & H. N.
Hansen (Daboussi et al., 1992).
Los dos iniciadores: Foc-TnB10fwd 5’-GGCGTTGGATAAGG-
TTGCGATGGAGGTT-3’, y Foc-TnB10rev 5’-TCCGGGCATTTA-
TCGTTTTGACTGGTA-3’, se diseñaron a partir de cada uno de los
extremos de la secuencia del fragmento RAPD mencionado, en
orientación opuesta, de forma que los extremos 3’ estuvieran dirigidos
hacia el exterior de la secuencia repetitiva. Los iniciadores se diseñaron
mediante el programa PrimerSelect 3.11 del paquete de ‘software DNA
Star’ (Madison, WI, EEUU), y fueron sintetizados comercialmente por
GENSET S. A. (Paris, Francia).
Condiciones de amplificación rep-PCR
Para los análisis rep-PCR se utilizó el sistema ‘Expand Long Template
PCR System’ (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), optimizado para
realizar amplificaciones PCR de regiones genómicas largas. Las reacciones
de amplificación se realizaron en un volumen total de 25 µl, que contenía
0,4 µM de cada iniciador, 300 µM de cada dNTP, 2,5 µl de 10 x tampón S1
suministrado por el distribuidor, 2U de Taq ADN Polimerasa (Roche
Diagnostics, Mannheim, Alemania), 2,25 mM MgCl 2, y 50-100 ng de ADN
fúngico.
127

Capítulo V
Tabla 12. Información geográfica y racial sobre los aislados de Fusarium
oxysporum f. sp. ciceris (Foc), de F. oxysporum (Fo) no patogénicos de
garbanzo, utilizados en el análisis rep-PCR
128
Aislado Origen geográfico a
Raza
patogénica b
Foc-7802 España 0
Foc-7952 España 0
Foc-82108 España 0
Foc-82113 España 0
Foc-9018 PV1 España 0
Foc-9032 España 0
Foc-91108 I España 0
Foc-T3 Túnez 0
Foc-USA 3-1 JG62 EEUU 1B/C
Foc-1987-W17 EEUU 1B/C
Foc-9602 Túnez 1B/C
Foc-7989 India 1A
Foc-9027 PV1 c España 1A
Foc-9168 Marruecos 1A
Foc-9166 c Marruecos 1A
Foc-8272 España 6
Foc-9023 España 6
Foc-9093 PV1 España 6
Foc-9164 Marruecos 6
Foc-9170 Marruecos 6
Foc-Tonini EEUU 6

Capítulo V
Tabla 12. (Continuación) Información geográfica y racial sobre los
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (Foc), de F. oxysporum (Fo) no
patogénicos de garbanzo, utilizados en el análisis rep-PCR
Aislado Origen geográfico a
Raza
patogénica b
Foc-8012 España 5
Foc-9035 España 5
Foc-9094 JG62 España 5
Foc-USA 1-1 JG62 EEUU 5
Foc-USA W6-1 EEUU 5
Foc-8605 India 2
Foc-1992R2N India 2
Foc-8606 India 3
Foc-1992R3N India 3
Foc-8607 India 4
Foc-1992R4N India 4
Fo-8250 España NP
Fo-9081 España NP
Fo-90101 España NP
Fo-9169 Marruecos NP
Fo-90105 España NP
a Los aislados de EEUU (California), España, y Marruecos proceden de la
micoteca del Departamento de Protección de Cultivos, Instituto de Agricultura
Sostenible, CSIC, Córdoba, España. Los aislados de la India fueron
proporcionados por el Dr. M. P. Haware, ICRISAT, Hyderabad, India. Los
aislados procedentes de Túnez fueron cedidos por el Dr. M. H. Halila, Institute
Nationale de la Recherche Agronomique, Ariana, Túnez.
b Raza determinada mediante pruebas de patogenicidad en líneas de garbanzo
diferenciadoras (Alcalá-Jiménez, 1995; Jiménez-Gasco et al., 2001; Capítulo I).
NP=no patogénicos de garbanzo.
c Aislados caracterizados como pertenecientes a la raza 6 de F. oxysporum f. sp.
ciceris en pruebas de patogenicidad duplicadas (Alcalá Jiménez, 1995).
129

Capítulo V
Las amplificaciones se realizaron en el termociclador Perkin-Elmer
2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). El ciclo de temperaturas consistió en
2,5 min de desnaturalización inicial a 95ºC; cinco ciclos de 1 min de
desnaturalización a 94ºC, 1 min de complementación entre el ADN molde
y el iniciador a 65ºC, y 10 min de polimerización a 68ºC; 30 ciclos de 30 s a
94ºC, 1 min a 65ºC, y 10 min a 68ºC; y finalmente, 15 min de extensión a
72ºC.
Los productos de amplificación fueron separados mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1,5 % y 1,5 V·cm -1 , teñidos con
bromuro de etidio, y visualizados bajo luz ultravioleta. Como marcador de
peso molecular se utilizó el ‘0,1-kb DNA ladder XIV’ (Roche Diagnostics,
Mannheim, Alemania) y ADN de fago λ digerido con la enzima PstI.
Todas las reacciones de amplificación fueron repetidas al menos dos veces
y siempre incluyeron controles negativos (sin ADN molde).
Análisis de datos
Para determinar la variabilidad genética entre los aislados de F. oxysporum f.
sp. ciceris en el estudio se realizó una análisis de similaridad mediante el
programa NTSYSpc2.0 (Rohlf, 1988), utilizando el ‘unweighted paired
group method with arithmetic averages’ (UPGMA) que se basó en el
coeficiente de similaridad de Jaccard (Sneath y Sokal, 1973). Para ello, se
construyó una matriz binaria con la información obtenida de la
amplificación rep-PCR de ADN de 32 aislados F. oxysporum f. sp. ciceris,
representativos de las distintas razas patogénicas identificadas y de un
amplio origen geográfico del patógeno; así como de cinco aislados de F.
oxysporum no patogénicos de garbanzo. La presencia o ausencia de los
fragmentos de ADN amplificados se identificaron como ‘1’ y ‘0’,
respectivamente.
Además de lo anterior, también se analizó mediante UPGMA la
información generada por la hibridación de ADN genómico de F.
oxysporum f. sp. ciceris con la sonda de ADN FocB10 (a partir de cuya
130

Capítulo V
secuencia se diseñaron los iniciadores utilizados para realizar los análisis de
rep-PCR). Para ello, se contabilizó la presencia o ausencia de los
fragmentos homólogos en una matriz binaria, tal y como se ha descrito
para el análisis rep-PCR.
Resultados
Variabilidad en F. oxysporum f. sp. ciceris determinada mediante
análisis rep-PCR
En este trabajo hemos utilizado un método basado en la PCR, para la
generar patrones de amplificación tan informativos como los ‘fingerprints’
de ADN genómico que se producen mediante su hibridación con sondas
de ADN repetitivo. Para ello, nos hemos basado en un elemento de ADN
repetitivo (transposón) obtenido del propio genoma de F. oxysporum f. sp.
ciceris, que presentó gran similaridad con el transposón Fot1 (Daboussi et
al., 1992). Para la investigación se diseñaron dos iniciadores a partir de los
extremos de la secuencia de dicho elemento repetitivo dirigidos hacia el
exterior del elemento, de forma que permitieran la amplificación entre
copias del transposón mediante PCR. Para el análisis se utilizaron
condiciones de PCR que favorecieron la amplificación de fragmentos
largos de ADN.
El tamaño de los fragmentos de ADN amplificados varió entre 0,5 y
más de 12 kb, aunque las bandas más reproducibles fueron las de peso
molecular inferior a 12 kb. En los análisis, los perfiles de amplificación
fueron reproducibles utilizando diferentes enzimas Taq Polimerasa,
diferentes termocicladores, y cuando se realizaron en diferentes
laboratorios (IAS, Córdoba; ‘Department of Plant Pathology’, Cornell
University, Ithaca, NY, EEUU). Sin embargo, la amplificación de
fragmentos largos de ADN requiere condiciones de PCR muy eficientes, y
el método hubo de ser optimizado antes de contabilizar las bandas de
ADN para proceder a su análisis.
131

Capítulo V
Los análisis de ADN de aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris generaron
perfiles de amplificación que los diferenciaron de los de F. oxysporum no
patogénicos de garbanzo. Además, mediante el patrón de amplificación
rep-PCR también se pudo diferenciar a los aislados de F. oxysporum f. sp.
ciceris pertenecientes a una raza de los aislados pertenecientes a otras razas
(Fig. 13). Mientras que el número de bandas amplificadas en aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris varió entre 10 y 20, los aislados de F. oxysporum no
patogénicos de garbanzo estudiados produjeron un número de bandas
significativamente inferior (entre 2 y 5).
Análisis de los datos rep-PCR
La información generada mediante amplificaciones rep-PCR se utilizó para
realizar un análisis de agrupación (‘cluster’) de los aislados de F. oxysporum
f. sp. ciceris según la similaridad que presentaron en los perfiles producidos.
Se contabilizaron un total de 33 fragmentos de ADN. El análisis UPGMA
de las bandas amplificadas mediante rep-PCR distinguió a los aislados de
F. oxysporum f. sp. ciceris de los de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo
(Fig. 14). Además, los aislados F. oxysporum f. sp. ciceris se distribuyeron en
dos grupos principales, que estuvieron altamente correlacionados con la
capacidad de los aislados de inducir el síndrome de Amarillez (patotipo de
Amarillez) o de Marchitez (patotipo de Marchitez). Estos ‘clusters’
compartieron aproximadamente un 60 y un 50% de similaridad en sus
perfiles de amplificación rep-PCR, respectivamente.
A su vez, dentro del grupo correspondiente a cada patotipo de F.
oxysporum f. sp. ciceris se distinguieron varias agrupaciones de aislados que
se correlacionaron con su naturaleza racial. Así, dentro del grupo
correspondiente al patotipo de Amarillez se identificaron dos ‘subclusters’
de aislados que correspondieron respectivamente a las razas 0 y 1B/C.
132

1
5,
2,
1,
1,
1,
0,
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Capítulo V
Figura 13. Amplificación rep-PCR de aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris.
La amplificación del ADN existente entre copias del elemento repetitivo FocB10
genera patrones como el mostrado, que están altamente correlacionados con la
naturaleza patotípica y racial de los aislados del patógeno. Los números a la
izquierda indican el peso molecular aproximado (kb) de las bandas de
amplificación. Carriles: M, marcador de peso molecular; 1-3, 9, 11, aislados de
la raza 0 Foc–9032, –82113, –7952, –T3, –9018 PV1; 4, 6, aislados de la raza
1A Foc–9168, –9027 PV1; 5, 8, aislados de la raza 6 Foc–9170, –8272; 10,
aislado de la raza 1B/C Foc–9602; 12, 13, aislados de la raza 5 Foc–9035, –
USA W6-1; 14-16, aislados de cada una de las razas 2, 3 y 4 Foc–1992R2N, –
1992R3N, –1992R4N; 7, 17, 18, aislados de F. oxysporum no patogénicos de
garbanzo Fo–8250, –9081, y –9169, respectivamente.
133

Capítulo V
De igual manera, dentro del ‘cluster’ correspondiente al patotipo de
Marchitez se distinguieron tres agrupaciones de aislados. Los aislados de
las razas 1A y 6 constituyeron un grupo (65% de similaridad) claramente
diferenciado del resto de aislados causantes de dicho síndrome. Los
aislados pertenecientes a la raza 5 formaron un grupo (90% de similaridad)
distinguible del resto, dentro de los aislados del patotipo de Marchitez (Fig.
14). Finalmente, los aislados de las razas 2, 3, 4, procedentes de la India, se
agruparon en un tercer ‘cluster’.
Análisis comparativo entre los resultados de las hibridaciones ‘Southern’ y
el análisis rep-PCR
Para confirmar que la información generada mediante la amplificación rep-
PCR entre copias de elementos repetitivos, es equivalente a la generada
cuando utilizamos dicho elemento como sonda para hibridación de ADN
genómico, se compararon los análisis de similaridad UPGMA de los
resultados obtenidos mediante ambos métodos.
La distribución de los aislados fúngicos según su similaridad en el
análisis de los datos generados mediante rep-PCR, fue muy similar a la
obtenida de ‘fingerprints’ de ADN generados mediante la hibridación de
ADN genómico de F. oxysporum f. sp. ciceris con el elemento repetitivo
FocB10. Así, los ‘clusters’ formados en dichos análisis estuvieron
altamente correlacionados con las características patogénicas de los
aislados.
Los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris, que compartieron un 25% de
similaridad, se diferenciaron claramente de los aislados de F. oxysporum no
patogénicos de garbanzo. Dentro del grupo de aislados de F. oxysporum f.
sp. ciceris, los aislados se distribuyeron en dos ‘clusters’ principales según su
134

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
Capítulo V
Raza
patogénica
7802 0
91108I 0
82108 0
7952 0
82113 0
9032 0
T3
0
9018PV1 0
USA3-1JG62 1B/C
USAW17 1B/C
9602 1B/C
8605 2
1992R2N 2
8606 3
1992R3N 3
1992R4N 4
8607 4
8012 5
USA14201JG62 5
9094JG62 5
9035 5
USAW6-1 5
7989 1A
9168 1A
8272 6
9023 6
9093PV1 6
9027PV1 1A
9166 1A
Tonini 6
9164 6
9170 6
90101 NP
90105 NP
9081 NP
9169
NP
8250 NP
Figura 14. Dendrograma UPGMA generado a partir de la información obtenida
mediante la amplificación rep-PCR de ADN de aislados de Fusarium oxysporum f.
sp. ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6) y de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo
(NP). La amplificación rep-PCR se produce entre copias del elemento repetitivo
FocB10, lo cual genera ‘fingerprints’ de ADN. La escala inferior corresponde a la
similaridad entre aislados basada en el coeficiente de Jaccard.
135
Amarillez Marchitez

Capítulo V
asignación a patotipo (Amarillez y Marchitez). A su vez, los aislados de
cada patotipo se distribuyeron en grupos que correspondieron a las razas
patogénicas identificadas en F. oxysporum f. sp. ciceris (Fig. 15)
Dentro del ‘cluster’ que incluyó los aislados de Amarillez (45% se
similaridad) se distinguieron dos subgrupos que correspondieron a los
aislados de las razas 0 y 1B/C; mientras el grupo de aislados del patotipo
de Marchitez (50% de similaridad) se subdividió en tres agrupaciones que
correspondieron a los aislados de las razas 1A/6, la raza 5, y las razas 2, 3,
y 4.
Esta agrupación de aislados es notablemente similar a obtenida
mediante el análisis de resultados obtenidos en amplificaciones rep-PCR
(Fig. 14, 15). De igual manera, en ambos análisis se han detectado
aproximadamente los mismos porcentajes de similaridad entre grupos o
subgrupos (Fig. 14, 15).
La única diferencia resaltable entre los dendrogramas UPGMA
generados mediante los diferentes métodos de análisis concierne a la
agrupación de los aislados de la raza 5 de F. oxysporum f. sp. ciceris. Así,
mientras que el análisis de los datos generados mediante rep-PCR mostró
que los aislados de la raza 5 fueron más similares a las razas 2, 3, y 4,
descritas únicamente en la India (Fig. 14); el análisis de los datos generados
mediante la hibridación con el elemento FocB10 situó a los aislados de la
raza 5 igualmente distantes de los de las razas 2, 3, y 4, que de los aislados
de las razas 1A y 6 que junto con aquéllos constituyen el patotipo de
Marchitez (Fig. 15).
136

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
Capítulo V
Raza
patogénica
9018PV1 0
9018JG62 0
T3 0
82108 0
7802 0
8207 0
9032 0
7952 0
9605 0
82113 0
91108 0
91114 0
1978W17 1B/C
USA3-1JG62 1B/C
9602 1B/C
7989 1A
9168 1A
9166 1A
9165 1A
9170 6
Tonini 6
9164 6
9023 6
9027PV1 1A
8272 6
8605 2
1992R2N 2
8606 3
1992R3N 3
1992R4N 4
8607 4
8012 5
USA1-1JG62 5
9035 5
USAW6-1 5
9094JG62 5
90101 NP
8250 NP
9009 NP
Figura 15. Dendrograma UPGMA generado a partir de la información de
‘fingerprints’ obtenidos mediante hibridaciones ‘Southern’ de ADN genómico de
aislados de Fusarium oxysporum f. sp. ciceris (razas 0, 1A, 1B/C, 2 a 6) y de F.
oxysporum no patogénicos de garbanzo (NP), con el elemento repetitivo FocB10.
La escala inferior corresponde a la similaridad entre aislados basada en el
coeficiente de Jaccard.
137
Amarillez Marchitez

Capítulo V
Discusión
El estudio de ‘fingerprints’ de ADN genómico generados mediante
hibridaciones con elementos de ADN repetitivo, ha mostrado ser una
herramienta importante para analizar la estructura genética de las razas
patogénicas de F. oxysporum f. sp. ciceris, así como para comprender la
relación genética entre ellas (Capítulo IV). Sin embargo, el prolongado
tiempo de análisis y amplitud de recursos que lleva implícita la utilización
de dicha metodología de análisis, hacen que sea difícil su aplicación
rutinaria al estudio de un elevado número de aislados componentes de
poblaciones de este patógeno, que es necesario para realizar inferencias
sobre su diversidad genética.
Nuestro objetivo en este trabajo ha sido desarrollar un método que,
basado en el análisis PCR, posibilite la identificación del mismo nivel de
polimorfismos que proporciona la hibridación de ADN genómico con
elementos repetitivos contenidos en él. Para ello, hemos diseñado una
pareja de iniciadores que amplifican las regiones de ADN existentes entre
las diferentes copias de un elemento repetitivo, que se encuentran
dispersas en el genoma de F. oxysporum f. sp. ciceris. Este elemento
repetitivo fue identificado en dicho genoma, y presenta aproximadamente
un 80% de similaridad al transposón Fot1 identificado en F. oxysporum f. sp.
melonis (Daboussi et al., 1992).
Mediante el análisis PCR en condiciones que favorecen la amplificación
de regiones largas de ADN, utilizando los referidos iniciadores orientados
hacia el exterior del elemento repetitivo, se generaron patrones de
amplificación con 10 a 20 bandas, que resultaron válidos para discriminar
entre razas de F. oxysporum f. sp. ciceris. Aunque el potencial de
discriminación entre aislados del patógeno que ofrece la hibridación de
ADN genómico con el elemento repetitivo fue mayor que el que
proporciona el análisis rep-PCR, es conveniente considerar algunas
limitaciones técnicas en la valoración comparativa de las dos metodologías.
Así, mientras el primer método requiere mucho tiempo y gran cantidad de
ADN puro, la preparación tediosa de la sonda de hibridación, y la
138

Capítulo V
realización de las hibridaciones ‘Southern’; el método rep-PCR sólo
requiere minipreparaciones de ADN y la realización de los análisis PCR.
El análisis de similaridad de los patrones de amplificación
proporcionados por el análisis rep-PCR, y su comparación con los
obtenidos mediante hibridaciones ‘Southern’, ha puesto de manifiesto que
la información generada por ambos métodos es equivalente. Así, el análisis
UPGMA de los datos generados mediante el análisis rep-PCR distribuye a
los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris en agrupaciones altamente
correlacionadas tanto con el tipo de síndrome patogénico que inducen en
la planta huésped (i. e., patotipos de Amarillez y de Marchitez), como con
su patogenicidad diferencial sobre líneas diferenciadoras de garbanzo (i. e.,
razas patogénicas). Esta distribución de aislados en grupos de similaridad,
así como los valores de similaridad entre dichos grupos, son comparables a
los que se obtuvieron en el análisis UPGMA de los patrones generados
mediante las hibridaciones con la sonda FocB10.
La única diferencia digna de ser destacada entre el resultado del análisis
de ‘clusters’ de la información generada por el análisis rep-PCR respecto
del correspondiente al de la generada por la hibridaciones de ADN, fue la
agrupación de los aislados pertenecientes a la raza 5 de F. oxysporum f. sp.
ciceris. Mientras que el análisis UPGMA de los perfiles de amplificación
rep-PCR indicó que los aislados de la raza 5 son genéticamente más
similares a las razas 2, 3, y 4 descritas solamente en la India, que a las razas
1A y 6 descritas en varias áreas de cultivo; el análisis de los datos de
hibridación con FocB10 indicó que los aislados de dicha raza 5 presentan
la misma similaridad a todas las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris que
pertenecen al patotipo de Marchitez. Sin embargo, el análisis conjunto de
los resultados generados por la hibridación con la sonda FocB10 y con
otras dos secuencias de naturaleza repetitiva, mostró la misma agrupación
de razas que la obtenida mediante el análisis de los perfiles de
amplificación rep-PCR desarrollado en este Capítulo. De igual manera, el
análisis de máxima parsimonia de los mismos datos indicó un estrecha
relación filogenética entre el grupo de razas 2, 3, y 4, procedentes de la
India, y la raza 5 de F. oxysporum f. sp. ciceris.
139

Capítulo V
La metodología de análisis rep-PCR basada en la utilización como
iniciadores de elementos repetitivos endógenos al organismo en estudio,
ha sido aplicada por otros autores anteriormente con éxito. Los elementos
repetitivos, y en particular el elemento MGR586, han sido utilizados
extensamente para la caracterización de las poblaciones de Magnaporthe
grisea (T. T. Hebert) Yaegashi & Udegawa; de hecho, George et al. (1998)
utilizaron la amplificación entre copias de estos elementos para inferir la
relación genética entre los aislados de dicho patógeno.
En nuestra investigación, además de FocB10 hemos identificado en el
genoma de F. oxysporum f. sp. ciceris otras dos secuencias de ADN que
poseen homología con un alto número de fragmentos generados mediante
su digestión con EcoRI, y cuyas secuencias han mostrado similaridad con
elementos transponibles ya descritos en otros hongos. Es presumible que
la utilización de estas secuencias para diseñar nuevos iniciadores podrá
generar una mayor cantidad de ‘fingerprints’ de ADN mediante análisis
rep-PCR; y además, que los nuevos iniciadores así generados podrán ser
utilizados combinadamente para realizar amplificaciones entre los
diferentes elementos repetitivos.
En consecuencia, los resultados de las investigaciones incluidas en este
Capítulo han puesto de manifiesto la utilidad de la metodología rep-PCR
como herramienta de análisis para generar ‘fingerprints’ de ADN válidos
para la caracterización y estudio filogenético de razas de F. oxysporum f. sp.
ciceris, que además supone la disponibilidad de una estrategia de estudio
alternativa a la convencional basada en la realización de hibridaciones de
ADN genómico con sondas de interés. El método descrito en este trabajo
parece especialmente adecuado para el estudio de diversidad en las
poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris, para lo cual es necesaria la
caracterización de un elevado número de aislados del patógeno
representativos de la variabilidad de dichas poblaciones.
140

DISCUSIÓN GENERAL
Discusión General
F. oxysporum f. sp. ciceris (Padwick) Matuo & K. Sato es paradigmática entre
las formae speciales de F. oxysporum en términos de diversidad patogénica. Así,
los componentes de las poblaciones naturales de este hongo anamórfico
de suelo pueden ser diferenciados en los patotipos de Amarillez y
Marchitez, por el síndrome que inducen en cultivares de garbanzo
susceptibles (Trapero Casas, 1983; Trapero Casas y Jiménez Díaz, 1985), y
en razas patogénicas (0, 1A, 1B/C, 2, 3, 4, 5, y 6) según la reacción a la
infección de líneas de garbanzo diferenciadoras (Haware y Nene, 1982b;
Jiménez Díaz et al., 1989b; 1993a). Esta diversidad patogénica tiene
relevancia respecto del uso eficiente de cultivares de garbanzo resistentes a
la enfermedad y su desarrollo mediante mejora genética, que es la
estrategia de control de la Fusariosis Vascular del garbanzo más práctica y
económicamente eficiente.
Esta Tesis Doctoral se ha centrado en dos temas principales que
guardan relación directa con dicho uso eficiente y desarrollo de resistencia
huésped: (1) la identificación molecular específica de F. oxysporum f. sp.
ciceris y de sus razas patogénicas; y (2) el estudio de su variabilidad genética,
así como de la posible relación evolutiva entre dichas razas. La
disponibilidad de una metodología de diagnóstico que permita la
identificación consistente, rápida y precisa de las razas patogénicas de F.
oxysporum f. sp. ciceris, facilitaría la caracterización de la estructura de
virulencia del patógeno en áreas extensas de cultivo, que es requisito
imprescindible para la adecuada elección y disposición en tiempo y espacio
de la resistencia disponible.
Para ello, hemos utilizado herramientas experimentales basadas en
técnicas de biología molecular disponibles, que nos ha permitido
desarrollar una metodología eficiente para identificar de forma rápida,
141

Discusión General
precisa y consistente a los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris y de las razas
patogénicas 0, 1A, 5, y 6, que son prevalentes en la Cuenca Mediterránea.
De igual manera, este tipo de herramientas experimentales nos ha
permitido estudiar la diversidad genética existente en las poblaciones de F.
oxysporum f. sp. ciceris, y el nivel de similaridad entre aislados de una misma
raza; así como profundizar en el conocimiento de la posible evolución de
este patógeno.
Nuestra estrategia experimental para desarrollar un método de
identificación de F. oxysporum f. sp. ciceris y discriminación entre sus razas
patogénicas, se ha basado en la asociación inicial de polimorfismos de
ADN amplificados mediante RAPD-PCR (‘Random Amplified
Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction’) (Williams et al., 1990) a
cada una de las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris. En el desarrollo de dicha
estrategia hemos identificado marcadores RAPD que distinguen a F.
oxysporum f. sp. ciceris y a cada una de las razas 0, 1B/C, 5, y 6; cuya
fiabilidad y reproducibilidad han sido contrastadas en ‘ensayos ciegos’ de
naturaleza biológica y molecular.
Posteriormente, las secuencias de los fragmentos RAPD asociados a F.
oxysporum f. sp. ciceris y a las razas patogénicas referidas sirvió para diseñar
iniciadores basados en el genoma del patógeno para el análisis PCR
específica. Esta estrategia ha supuesto un gran éxito en nuestro trabajo, ya
que hemos diseñado iniciadores para análisis PCR específica que permiten
distinguir inequívocamente a aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris de: (a)
aislados de F. oxysporum no patogénicos de garbanzo; (b) aislados
pertenecientes a otras formae speciales de F. oxysporum; y (c) otras especies de
Fusarium. Además, mediante análisis PCR específica utilizando iniciadores
‘ad hoc’ ha sido posible diferenciar entre sí a aislados de las razas 0, 1A, 5,
y 6 de F. oxysporum f. sp. ciceris, así como a éstos de aislados pertenecientes
a otras razas del patógeno.
En los últimos años, numerosos trabajos han demostrado la utilidad de
la técnica RAPD para relacionar marcadores moleculares y razas
patogénicas de formae speciales de F. oxysporum (Assigbetse et al., 1994;
Grajal-Martín et al., 1993; Manulis et al., 1994; Migheli et al., 1998). Sin
embargo, son limitados los trabajos en que los marcadores RAPD
142

Discusión General
identificados han sido subsiguientemente desarrollados en SCARs
(‘Sequence Characterized Amplified Regions’), y utilizados para el
posterior desarrollo de iniciadores para análisis PCR específica. La
robustez inherente del análisis PCR específica comparado con la
sensibilidad de la técnica RAPD a factores experimentales, hace que la
metodología que hemos desarrollado en esta investigación suponga una
mejora para el análisis de la estructura de virulencia de F. oxysporum f. sp.
ciceris; alternativa a la identificación tradicional de razas del patógeno
mediante pruebas de patogenicidad, que es costosa en tiempo, espacio y
recursos, y puede ser influida por la variabilidad inherente al sistema
experimental.
Además, ligeras modificaciones en la técnica de análisis puede permitir
la aplicación de la metodología que hemos desarrollado, para la detección
del patógeno y sus razas patogénicas utilizando ADN total extraído de
otros substratos distintos del micelio puro del hongo, como tejido vegetal
infectado y suelo infestado. Anteriores trabajos en nuestro laboratorio
demostraron esta posibilidad, utilizando iniciadores para la detección del
patotipo de Marchitez de F. oxysporum f. sp. ciceris (García Pedrajas et al.,
1999; Kelly et al., 1998). Disponer de un método que permita la detección
rápida y temprana del patógeno en semillas de garbanzo puede ser de
utilidad para evitar la dispersión de F. oxysporum f. sp. ciceris y de sus razas
patogénicas a zonas de cultivo libres de ella. Similarmente, la aplicación de
la nueva metodología al diagnóstico en suelo antes de la siembra permitirá
tomar decisiones respecto de la adecuación de cultivares de garbanzo de
interés agronómico y comercial, en razón de las razas del patógeno
existentes ellos. Finalmente, la utilización de dicha metodología diagnóstica
puede ayudar a detectar cambios en la estructura racial que puedan tener
lugar en las poblaciones de F. oxysporum f. sp. ciceris, como consecuencia de
la utilización de cultivares resistentes o de modificaciones ambientales en
el cultivo.
La diversidad fenotípica que observamos en F. oxysporum f. sp. ciceris, y
su amplia distribución geográfica, planteó la posibilidad de que este taxón
fuese de origen polifilético. Estudios basados en genealogías génicas han
demostrado que ciertas formae speciales de F. oxysporum pueden tener
143

Discusión General
orígenes múltiples e independientes (i. e., son de origen polifilético),
indicando que patogenicidad y virulencia han evolucionado más de una
vez en el curso de su historia adaptativa (Baayen et al., 2000; O’Donnell et
al., 1998). Para contrastar la hipótesis nula de monofilia en F. oxysporum f.
sp. ciceris, hemos estudiado la extensión y naturaleza de la variación
existente en las secuencias de intrones de varios genes conservados; y
algunas de estas secuencias fueron comparadas a las de otras formae speciales
de F. oxysporum.
A pesar de la diversidad que presenta F. oxysporum f. sp. ciceris en lo
referente a su distribución geográfica, los tipos de sintomatología que
induce en la planta susceptible, y la patogenicidad cultivar-específica,
aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris representativos de diversas razas y
variada procedencia geográfica poseen idénticas secuencias en los intrones
de cinco genes altamente conservados en genomas fúngicos: factor de
traducción y elongación 1α (EF1α), β-tubulina, histona 3, actina, y
calmodulina. Además, el análisis de máxima parsimonia de las secuencias
del gen EF1α de aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris representativos de
todas las razas del patógeno, y de secuencias representativas de 11 formae
speciales de F. oxysporum, agrupó a los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris de
forma distintiva respecto del resto de los aislados, todo ello indicando el
origen monofilético de esta forma specialis.
La interpretación más simple y lógica sobre el origen monofilético de F.
oxysporum f. sp. ciceris, y la falta de variación en las secuencias del patógeno
estudiadas en este trabajo, es que sus aislados derivan de una población
inicial fundadora pequeña (posiblemente un único individuo) que adquirió
patogenicidad sobre Cicer spp. Como consecuencia de ello, la posterior
diversificación de dicho agente en patotipos y razas patogénicas ha podido
ser el resultado de la acumulación de pequeños cambios genéticos que
hayan tenido lugar en fechas posteriores (Gordon y Martyn, 1997). Esta
hipótesis está además apoyada por la existencia de un único grupo de
compatibilidad vegetativa (VCG) en F. oxysporum f. sp. ciceris (Nogales
Moncada, 1997), y de un único perfil de restricción del ADN mitocondrial
(Pérez Artés et al., 1995).
144

Discusión General
Aunque estos pequeños cambios genéticos no se han visto reflejados en
las secuencias de los genes que hemos estudiado, si han podido ser
detectados mediante su asociación con marcadores RAPD. De hecho, los
análisis de ‘cluster’ de datos RAPD diferenciaron de forma consistente a
los patotipos de Amarillez y Marchitez (Jiménez Gasco et al., 2001; Kelly et
al., 1994), y a las diferentes razas de F. oxysporum f. sp. ciceris (Jiménez
Gasco et al., 2001). Ello sugiere que los marcadores RAPD están
evolucionando más rápidamente que las secuencias de los genes utilizados
para realizar análisis genealógicos.
Una vez demostrado el origen monofilético de F. oxysporum f. sp. ciceris,
nos propusimos profundizar en el estudio de la variabilidad genética
existente en las razas de F. oxysporum f. sp. ciceris, bajo la asunción de que en
este hongo carente de reproducción sexual todo el genoma se encuentra
ligado, es transmitido como una sola unidad de una generación a la
siguiente, y las diferentes regiones del genoma deben poseer la misma
historia evolutiva (Taylor et al., 1999b). Por lo tanto, la evolución de
caracteres fenotípicos en este tipo de hongos fitopatógenos mitospóricos,
tales como la especificidad de huésped o cultivar, o la relación entre razas
patogénicas, puede ser estudiada mediante el análisis de regiones del ADN
que no tienen que mantener necesariamente una relación funcional directa
con el fenotipo de interés, i. e., neutrales.
Por ello, hemos analizado ‘fingerprints’ de ADN genómico de los
aislados de las diferentes razas de F. oxysporum f. sp. ciceris, generados
mediante hibridaciones de dicho ADN con tres sondas de ADN repetitivo
identificadas en el propio genoma del patógeno, y compuestas por
secuencias que presentan similitud con elementos transponibles de otros
hongos descritos en la literatura fitopatológica. La similaridad existente
entre los ‘fingerprints’ de ADN de los distintos aislados de F. oxysporum f.
sp. ciceris se analizó mediante dos aproximaciones, una de tipo fenético y
otra de tipo cladístico.
El análisis de ‘fingerprints’ de ADN genómico puso de manifiesto que
los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris presentan patrones de hibridación
altamente correlacionados tanto con su capacidad de inducir un síndrome
determinado en la planta huésped (i. e., patotipos de Amarillez y de
145

Discusión General
Marchitez), como con su patogenicidad diferencial sobre líneas
diferenciadoras de garbanzo (i. e., razas patogénicas), independientemente
del tipo de análisis fenético o cladístico realizado.
Mientras que otras formae speciales compuestas por un único VCG han
mostrado una diversidad genética muy limitada (Plyler et al., 2000;
Tantaoui et al., 1996), nuestros resultados indican que F. oxysporum f. sp.
ciceris es una forma specialis altamente diversificada, patogénica y
genéticamente. Esta diversidad puede ser reflejo de una larga historia de
asociación con su planta huésped, el garbanzo, una de las especies
cultivadas que constituyeron la cuna de la agricultura, hecho documentado
por información arqueológica reciente (Lev-Yadun et al., 2000; Singh,
1997).
Hipotéticamente, las razas patogénicas más antiguas han debido
acumular más diversidad genética que aquéllas originadas más
recientemente (Goodwin et al., 1995), especialmente si asumimos el origen
de una raza a partir de un único genotipo, seguido de su dispersión más o
menos generalizada. Por lo tanto, en un modelo de evolución en las que
unas razas patogénicas se originan a partir de otras a través de cambios
genéticos más o menos sencillos y su persistencia en la población del
agente es consecuencia de la selección impuesta por la resistencia en el
huésped (Gordon y Martyn, 1997), las razas más antiguas habrán de ser
más diversas genéticamente y menos virulentas, que las más recientemente
evolucionadas.
Nuestros resultados apoyan dicho modelo evolutivo para F. oxysporum f.
sp. ciceris, e indica que el avance en la evolución de las razas patogénicas va
unida a mayor virulencia de éstas. Así, la raza 0 es la menos virulenta de
todas las razas, y es la que más diversidad genética presenta (indicado por
el análisis de datos RAPD, y por el análisis de ‘fingerprints’ de ADN) por
lo que corresponde a la más ancestral. Por el contrario, la raza 5 es la más
virulenta de las identificadas hasta ahora en la Cuenca Mediterránea, la que
menor diversidad genética posee, y a la que por tanto correspondería un
origen más reciente. Además, desde un punto de vista evolutivo, a la raza 0
debería seguir la raza 1B/C, no sólo en cuanto a su nivel de virulencia, sino
también en cuanto a su capacidad de causar el síndrome de Amarillez en
146

Discusión General
cultivares de garbanzo susceptibles. Esta hipótesis parece ser coherente
con nuestros resultados, ya que estas dos razas están genéticamente más
relacionadas entre sí que con el resto de las razas de F. oxysporum f. sp.
ciceris. Además, los aislados de la raza 5 (no descrito en la India) se
encuentran más cercanos evolutivamente a las razas 2, 3, y 4 (sólo descritas
en la India) que al resto de las razas presentes en la Cuenca Mediterránea
(razas 1A y 6). Aunque la raza 5 y las razas 2, 3, y 4 se encuentran
geográficamente separadas entre sí, dichas razas son las más similares en
relación a la virulencia que manifiestan sobre líneas y cultivares
diferenciadores.
Toda la información generada en esta Tesis Doctoral anima a
profundizar en el conocimiento sobre la relación evolutiva entre razas de
F. oxysporum f. sp. ciceris. Un mejor entendimiento de dicha evolución
podría ayudar a predecir los cambios que puedan ocurrir en la estructura
racial existente en un suelo, al someterlo al uso continuado de cultivares de
garbanzo que presenten resistencia a una o alguna de las razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris.
Finalmente, aunque existen numerosas investigaciones que han
demostrado la correlación entre VCGs y linajes clonales en F. oxysporum
(ej., Elias et al., 1993; Koenig et al., 1997), existen muy pocos trabajos que
hayan profundizado en la relación evolutiva entre razas que pertenezcan a
un mismo VCG. Gordon y Martyn (1997) propusieron que una alta
similaridad genética entre razas patogénicas es indicativa de una posible
evolución de unas razas a partir de otras mediante pequeños cambios
genéticos (Gordon y Martyn, 1997). Aunque esta hipótesis es plausible,
por el momento no se encuentran en la literatura fitopatológica datos que
la apoyen. Este es el primer trabajo en que se realiza un análisis tan
profundo de una forma specialis de F. oxysporum de origen claramente
monofilético, en el que la información patogénica y genética indica la
posible evolución de unas razas a partir de otras.
147

CONCLUSIONES
Las conclusiones de esta Tesis Doctoral son las siguientes:
Conclusiones
1. El análisis RAPD ha permitido identificar fragmentos de ADN que
son diagnósticos de F. oxysporum f. sp. ciceris, así como de las razas 0,
1B/C, 5, y 6 del patógeno. La aplicabilidad, reproducibilidad, y
fiabilidad de este método diagnóstico han sido confirmadas mediante
‘ensayos ciegos’ de aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris cuya identidad
racial era desconocida para el operador.
2. El análisis UPGMA de los perfiles de amplificación RAPD indicó una
alta similaridad genética entre los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris, y
agrupó a éstos en ‘clusters’ que estuvieron correlacionados con el
patotipo a que pertenecen. Los aislados del patotipo de Amarillez
constituyeron un grupo distintivo que incluye a los aislados de las
razas 0 y 1B/C; mientras que los aislados del patotipo de Marchitez
constituyeron otro ‘cluster’ conteniendo a los aislados de las razas 1A,
2, 3, 4, 5, y 6. El análisis AMOVA de los mismos datos fue
consistente con estos resultados.
3. Se han diseñado iniciadores para PCR específica, basados en las
secuencias de los marcadores RAPD asociados a las razas de F.
oxysporum f. sp. ciceris identificados, que permiten distinguir
inequívocamente a aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris de aislados de
F. oxysporum no patogénicos de garbanzo; de aislados pertenecientes a
otras formae speciales de F. oxysporum; y de otras especies de Fusarium.
Asimismo, se han diseñado iniciadores para PCR específica que han
hecho posible diferenciar entre sí a aislados de las razas 0, 1A, 5, y 6
149

Conclusiones
150
de F. oxysporum f. sp. ciceris, así como a éstos de aislados pertenecientes
a otras razas del patógeno.
4. El análisis de ‘fingerprints’ de ADN genómico generados mediante
hibridación con sondas de ADN repetitivo, ha puesto de manifiesto
que los aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris presentan perfiles de
hibridación altamente correlacionados tanto con su capacidad de
inducir un síndrome determinado en la planta huésped (i. e., patotipos
de Amarillez y de Marchitez), como con su patogenicidad diferencial
sobre líneas diferenciadoras de garbanzo (i. e., razas patogénicas).
5. Hemos desarrollado un método de análisis de ADN genómico de F.
oxysporum f. sp. ciceris, basado en la amplificación entre copias de un
elemento repetitivo identificado en el genoma del patógeno (rep-
PCR). La información generada por ‘fingerprints’ de ADN obtenidos
con este método es equivalente a la obtenida mediante hibridaciones
con el elemento repetitivo, lo cual supone un método alternativo, pero
más simple, para investigar la diversidad en las poblaciones de F.
oxysporum f. sp. ciceris basado en el estudio de un elevado número de
aislados del patógeno.
6. A pesar de la diversidad de este patógeno en su distribución
geográfica, los tipos de sintomatología que induce en la planta
susceptible, y la patogenicidad cultivar-específica, los aislados de F.
oxysporum f. sp. ciceris poseen idénticas secuencias de los intrones de
cinco genes altamente conservados en genomas fúngicos: EF1α, βtub,
H3, Act, y Cal.
7. El análisis de máxima parsimonia de las secuencias del gen EF1α de
17 aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris y de otras 24 secuencias
representativas de 11 formae speciales de F. oxysporum, agrupó a los
aislados de F. oxysporum f. sp. ciceris de forma distintiva respecto del
resto de los aislados, que demuestra el origen monofilético de esta
forma specialis.
8. La interpretación lógica de la monofilia de F. oxysporum f. sp. ciceris
sugiere que éste deriva de una población inicial fundadora pequeña

Conclusiones
(posiblemente un único individuo) que adquirió patogenicidad sobre
Cicer spp., y cuya subsiguiente diversificación en patotipos y razas
patogénicas ha podido resultar de la acumulación de cambios
genéticos relativamente simples.
9. F. oxysporum f. sp. ciceris es un grupo clonal de aislados patogénicos
con una fuerte estructura racial, en el cual la correlación entre los
marcadores genéticos neutrales, tales como RAPDs y ‘fingerprints’ de
ADN, y la patogenicidad, puede ser utilizada para inferir conclusiones
sobre la relación genética entre razas.
10. Nuestra hipótesis evolutiva es que, en F. oxysporum f. sp. ciceris, unas
razas patogénicas se han originado a partir de otras, y que el avance
evolutivo de dichas razas patogénicas va unido a un incremento de
virulencia de éstas (i. e., número de líneas diferenciadoras raciales
susceptibles). Así, la raza 0 es la menos virulenta de todas las razas, y
la más antigua de ellas en razón de su mayor diversidad genética. Por
el contrario, la raza 5 es la más virulenta de las identificadas hasta
ahora en la Cuenca Mediterránea, la que menor diversidad genética
posee, y a la que por tanto correspondería un origen evolutivo más
reciente.
151

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