EXTRACTO DE ALCACHOFA (CYNARA SCOLYMUS, L)

3 ES 2 167 277 A1 4procede dicho extracto.Por tanto, un objeto de esta invención lo constituyeun extracto de alcachofa que comprendePODs y PPOs.Un objeto adicional de esta invención lo constituyeun procedimiento para la obtención de dichoextracto de alcachofa que comprende PODsy PPOs.Otro objeto adicional de esta invención loconstituye el empleo de dicho extracto de alcachofaque comprende PODs y PPOs para oxidaruna sustancia tóxica seleccionada entre un fenol,una amina aromática, un haluro orgánico, un metalpesado, y sus mezclas, por reacción con unperóxido en presencia de dicho extracto de alcachofahasta convertir a dicha sustancia tóxica enun material no contaminante o menos contaminante.Otro objeto adicional de esta invención loconstituye un procedimiento para la descontaminacióntotal o parcial de medios, líquidos, sólidosysemisólidos, contaminados con fenoles, aminasaromáticas, haluros orgánicos y/o metales pesadosque comprende la adición opcional de unperóxido al medio a tratar en presencia de dichoextracto de alcachofa que comprende PODsy PPOs.Una ventaja de esta invención radica en quepermite extraer un extracto rico en PPOs y PODsa partir de un desecho agrícola e industrial, útil enaplicaciones medioambientales, y, por otra parte,el residuo sólidoobtenidotraslaextracción dedichas actividades enzimáticas se puede utilizarcomo material enriquecido en fibra para el consumoanimal y humano, o bien como fuente parala obtención de otros bioproductos con aplicacionessanitarias, agroalimentarias o industriales.Breve descripción de las figurasLa Figura 1 es una gráfica que muestra la evoluciónde la concentración de 4-clorofenol con eltiempo en las fracciones descritas en el Ejemplo2.La Figura 2 es una gráfica que muestra laevolución de la concentración de L-dopa con eltiempo en las fracciones descritas en el Ejemplo3.La Figura 3 es una gráfica que muestra elefecto de la concentración de extracto de alcachofasobre la oxidación de paracetamol y muestralaevoluciónde la concentración de paracetamolcon el tiempo en las fracciones descritas en elEjemplo 4.La Figura 4 es una gráfica que muestra elefecto de la concentración de peróxido de hidrógenosobre la oxidación de paracetamol y muestra laevolución de la concentración de paracetamol conel tiempo en las fracciones descritas en el Ejemplo4.Descripción detallada de la invenciónLa invención proporciona un extracto de alcachofa,en adelante extracto de la invención,que comprende enzimas con actividad peroxidasa(PODs) de alcachofa y enzimas con actividad polifenoloxidasa (PPOs) de alcachofa.El extracto de la invención puede obtenersea partir de tejidos de alcachofa, en particular,tallos, hojas y brácteas de alcachofa, mediante unprocedimiento que comprende la extracción de la5101520253035404550556065fracción soluble en un medio acuoso, rica en dichasactividades enzimáticas, mediante un procedimientoque se describirá detalladamente másadelante.En una realización particular, dichos tallos,hojas y brácteas de alcachofa forman parte de losdesechos de alcachofa generados por la industriaconservera, por lo que esta invención supone elaprovechamiento de un producto de interés (extractoque comprende PODs y PPOs de alcachofa)a partir de un desecho industrial que constituyeuna fuente nueva y económica de dichasactividades enzimáticas.De forma más concreta, el extracto de la invenciónpuede obtenerse mediante un procedimientoen el que material vegetal de alcachofa,incluyendo hoja, tallo y la parte externa de la flor(brácteas) se somete a trituración y homogeneizaciónen un medio acuoso constituido por agua opor una disolución acuosa salina, opcionalmentetamponado en un intervalo de pH comprendidoentre 3 y 10. Adicional y opcionalmente, dichomedio acuoso puede contener uno o más secuestradoresde fenoles, por ejemplo polivinilpirrolidonasoluble o carbón activo.Tras la homogeneización, la parte soluble sesepara del residuo sólido por medio de cualquiertécnica convencional de separación sólidolíquido,por ejemplo, por centrifugación o filtración,para obtener una primera fracción soluble(que contiene ambas actividades enzimáticasPOD y PPO) y un primer residuo sólido (quecontiene retenido algo de dichas actividades). Dichoprimer residuo sólido se somete a uno o más(generalmente dos) ciclos adicionales de lavado,homogeneización en el medio acuoso previamentemencionado y separación sólido-líquido para obtenerun segundo residuo sólido y unas segundasfracciones solubles (que contienen ambas actividadesenzimáticas POD y PPO) que, si se desea,se mezclan con la primera fracción soluble. Dichaprimera fracción soluble junto con, opcionalmente,dichas segundas fracciones solubles, constituyenel extracto crudo. Una vez finalizado elproceso de extracción, una cantidad igual o superioral 90 % de las unidades de POD, e igual osuperior al 60 % de las unidades de PPO se encuentraen dicho extracto crudo. Si se desearaaumentar la concentración de POD y PPO endicho extracto crudo se podría efectuar una extracciónasistida con detergentes: entre ellos, detergentesno iónicos, tales como Triton X-100 oTriton X-114, que se adicionarían, por ejemplo, enuna relación del 1 % (p/v) a las disoluciones previamentedescritas. El extracto crudo, así comoelextracto crudo enriquecido en POD y PPO, presentanactividades POD y PPO de alcachofa yconstituyen el extracto de la invención.El extracto de la invención, si se desea, sepuede desecar o liofilizar por métodos convencionales,o bien se puede someter a precipitaciónsalina, por ejemplo, precipitación con sulfatoamónico en una concentración comprendida entre50 % y 90 %. En este último caso, el precipitadose puede someter posteriormente, si se desea, a unproceso de desalado por cualquier técnica convencional.En general, se obtienen, aproximadamente3

7 ES 2 167 277 A1 8nol, 3,4-dimetoxifenol, p-hidroxialcohol bencílico,p-hidroxibenzaldehído, ácido p-hidroxibenzoico,anilina, p-toluidina, o-toluidina, m-toluidina, 4-amino-N,N’-dimetilanilina, catecol, 4-metilcatecol,4-terc-butilcatecol, dopamina, dopa, ácido3,4-dihidroxibenzoico, cadmio, mercurio o plomo.En otro aspecto, la invención proporciona unmétodo para la descontaminación total o parcialde un medio contaminado con fenoles, aminasaromáticas, haluros orgánicos, metales pesados ysus mezclas, en adelante, método de descontaminaciónde la invención, que comprende poner encontacto dicho medio contaminado a tratar conun peróxido y con un material de alcachofa quecomprende PODs y PPOs, en una cantidad adecuaday bajo unas condiciones apropiadas paradescontaminar total o parcialmente el medio contaminado.En el sentido utilizado en esta descripción, laexpresión “descontaminación total o parcial deun medio contaminado” significa que medianteel tratamiento aplicado desaparece totalmente elcontaminante o que éste se mantiene a unos nivelesprácticamente indetectables o bien que éstese mantiene a una concentración inferior a la quese puede considerar tóxica o nociva para el medioambiente.En una realización particular del método dedescontaminación de la invención, dicho mediocontaminado es un medio líquido seleccionado entreefluentes o vertidos industriales, aguas residualesy sus mezclas, y puede contener sólidostanto en disolución como en suspensión. En otrasrealizaciones particulares, dicho medio contaminadoes un medio semisólido, por ejemplo, unlodo, o un medio sólido, por ejemplo, un suelo.El material de alcachofa que comprende PODsy PPOs se selecciona entre tejidos de alcachofa,en particular, tallo, hojas y brácteas de alcachofas,desechos de alcachofas y el extracto de la invención,preferentemente este último. Aunque lainvención contempla la posibilidad de tratar losmedios contaminados directamente con los desechosde alcachofa, los cuales también comprendenPODs y PPOs, en general se prefiere el empleo delextracto de la invención ya que parte del materialpresente en los desechos de alcachofa se puedeutilizar como suplemento de fibra en alimentaciónanimal y humana, con lo que se podría obtenerun mayor rendimiento económico si se extrajerala parte soluble rica en PODs y PPOs de acuerdocon el procedimiento proporcionado por esta invención.La cantidad de extracto de alcachofa necesariopara realizar el método de descontaminaciónde la invención viene determinada por la actividadenzimática del extracto utilizado y por la naturalezadel material contaminante. Aunque lasenzimas (PODs y PPOs) no son consumidas en lareacción, ya que actúan como catalizadores, siemprees posible una pérdida de actividad por inactivación.En una realización particular, la cantidadde POD está comprendida entre 0,2 y 10 unidadesde POD por litro de medio líquido contaminado.Encasodequeseañadiera directamente el tejidovegetal (tallo, hojas y/o brácteas) de alcachofa,bien como tal o bien contenido en desechos de5101520253035404550556065alcachofa, sobre el medio líquido contaminado atratar, la cantidad de tejido vegetal o desecho estaríacomprendida entre 2,5 y 25 gramos de tejidode alcachofa o desecho por litro de medio líquidocontaminado.Para el tratamiento de medios líquidos contaminados,mediante el método de descontaminaciónde la invención,elextractodealcachofasedebe de adicionar en presencia de un peróxido.En el sentido utilizado en esta descripción,el término “peróxido” incluye a cualquier compuestoquímico que contiene el agrupamiento bivalente-O-O-, tal como un alquil-peróxido, porejemplo, metil-peróxido, etil-peróxido, terc-butilperóxido,etc., peróxido de hidrógeno y sus mezclas,preferentemente peróxido de hidrógeno.En general, es aconsejable añadir el peróxidogradualmente con el tiempo para, por una parte,impedir la inactivación de POD y PPO, y, porotra, suministrar al sistema uno de los sustratosnecesarios para la catálisis. La concentración deperóxido puede estar comprendida entre 0,1 y 10mmoles de peróxido por litro de medio líquidocontaminado, preferiblemente entre 0,2 y 2 mmolespor litro de medio líquido contaminado. Sila contaminación es debida a un compuesto o-difenólico, el método proporcionado por esta invenciónpodría realizarse sin necesidad de adicionarel peróxido. Sin embargo, se ha visto que laadición de peróxido, incluso en estos casos, facilitala polimerización de los productos de oxidación,probablemente por reacción de POD conintermedios de la ruta de oxidación de estos o-difenoles.Otro aspecto no necesario, pero que aumentala eficacia del método de descontaminación de lainvención es la agitación y/o aireación continuadel medio líquido contaminado a tratar. Esto produceun mejor contacto del material de alcachofaque comprende PODs y PPOs, en particular, delextracto enzimáticodelainvención, con las sustanciastóxicas o contaminantes presentes en elmedio a tratar y, además, proporciona un suministrode oxígeno al sistema, importante para laactuación de la PPO.Se ha comprobado que la POD de alcachofaes estable a temperaturas de 65 ◦ C aproximadamentedurante más de 24 horas, mientras que laPPO solo pierde un 40 % de su actividad en esetiempo y a esa temperatura, por lo que el métodode descontaminación de la invención se puede realizara una temperatura comprendida entre 10 ◦ Cy70 ◦ C, aunque, en general, estará condicionadopor la temperatura del medio líquido a descontaminarya que en la mayoría de casos ésta es difícilde controlar.La actividad de PPO y POD de los extractosde alcachofa es dependiente del pH aunquedichas enzimas presentan una elevada estabilidaden un amplio intervalo de pH. Aunque estas enzimaspueden actuar a un pH comprendido entre3 y 9, el método de descontaminación de lainvención es más efectivo en un intervalo de pHcomprendido entre 3,5 y 7. Por tanto, en general,antes de iniciar el método de descontaminaciónde la invención, se contempla la posibilidad demedir el pH del medio líquido a tratar y efectuarlas correcciones apropiadas, mediante la adición5

9 ES 2 167 277 A1 10de los ácidos o bases necesarios, para mantenerel medio líquido a tratar en un intervalo de pHapropiado para la realización del método de descontaminaciónde la invención.En una realización particular del método dedescontaminación de la invención, especialmenteaplicable en el tratamiento de medios líquidos,consiste en la inmovilización de las PODs y/oPPOs en soportes sólidos para la fabricación debiorreactores. Aunque, en principio, ésto puedesuponer un encarecimiento del método de descontaminaciónde la invención, la inmovilizaciónpresenta una serie de ventajas, tales como mayoraprovechamiento de las enzimas y mejor controldel proceso catalítico, que podrían justificaresta realización. En este caso, el extractode la invención se puede utilizar como fuente dePPOs y PODs para su inmovilización por distintosmétodos, como el enlace a soportes sólidos,el atrapamiento en geles, la encapsulación envesículas, el entrecruzamiento de moléculas deenzimas y el confinamiento en biorreactores demembranas. Entre ellos, estaría el enlace a soportescomo magnetita o concanavalina-A. A modode ejemplo, se ha observado que más del 65 %de la actividad peroxidasa de un extracto de lainvención se retiene en concanavalina-A, lo queindica que una alta fracción de esta enzima estáglicosilada. La inmovilización del extracto de lainvención también facilitaría la separación continuade los productos finales de la reacción, ya queel biorreactor podría estar acoplado a sistemas defiltración, afinidad, interacción hidrofóbica, intercambioiónico, quelatación o reparto.Algunas sustancias contaminantes que puedenser eliminadas de un medio liquido contaminadomediante el método de descontaminación de lainvención son: paracetamol, 4-fluorofenol, 3-fluorofenol,2-fluorofenol, 4-clorofenol, 3-clorofenol,2-clorofenol, 2,4,6-triclorofenol, 4-bromofenol, 3-bromofenol, 2-bromofenol, 4-iodofenol, 3-iodofenol,2-iodofenol, fenol, p-cresol, 4-etilfenol, 4-isopropilfenol,4-terc-butilfenol, guayacol, p-hidroxianisol,m-hidroxianisol, dimetoxifenol, 2-cloro-4-metoxifenol, 3,5-dimetoxifenol, 3,4-dimetoxifenol,p-hidroxialcohol bencílico, p-hidroxibenzaldehído,ácido p-hidroxibenzoico, anilina, p-toluidina,o-toluidina, m-toluidina, 4-amino-N,N’-dimetilanilina,catecol, 4-metilcatecol, 4-terc-butilcatecol,dopamina, dopa, ácido 3,4-dihidroxibenzoico,cadmio, mercurio o plomo. Asimismo,otras sustancias contaminantes que no sean sustratosde las PODs o PPOs de alcachofa tambiénpodrían ser oxidadas secundariamente por los radicaleslibres generados en la actuación de PODsobre sus sustratos primarios.En una realización particular del método dedescontaminación de la invención,elmediocontaminadoa tratar es un medio semisólido, tal comoun lodo, o un medio sólido, por ejemplo, un suelo.Para el tratamiento de lodos y suelos contaminadospor el método de descontaminación dela invención es más recomendable la adición dedesechos de alcachofas (tallos, hojas y brácteas)directamente sobre el lodo o el suelo a tratar. Enestos casos el peróxido podría ser añadido simplementepor pulverización. Una vez descompuesto5101520253035404550556065el material vegetal, las PODs y PPOs contenidasen los tejidos se liberarían y actuarían sobrelos contaminantes, convirtiéndolos en compuestosmenos tóxicos, los cuales no tendrían que ser, necesariamente,extraídos del suelo.Los siguientes ejemplos ilustran la invencióny no deben ser considerados como limitativos delalcance de la misma. El Ejemplo 1 describe la obtenciónde un extracto de alcachofa rico en PODy PPO, el Ejemplo 2 describe el tratamiento deagua contaminada por un clorofenol, el Ejemplo 3describe el tratamiento de agua contaminada porun difenol, y el Ejemplo 4 muestra el efecto de laconcentración de extracto de alcachofa y peróxidode hidrógeno en el tratamiento de agua contaminadapor paracetamol.Ejemplo 1Extracción y valoración económicaEn este ejemplo se describe un método parala extracción de un extracto de alcachofa rico enPOD y PPO. Además, se realiza una comparacióneconómica entre este método y los descritos parael tratamiento de sustancias tóxicas con peroxidasade rábano y con peroxidasa de soja.Para la obtención de un extracto de alcachofarico en POD y PPO, 150 gramos de brácteas dealcachofa se congelaron en nitrógeno líquido parafavorecer la trituración y homogeneización de estematerial rico en fibra. La homogeneización se realizóen 300 ml de tampón fosfato 50 mM pH 7,0conteniendo cloruro sádico 1M y 1 % (p/v) de polivinilpirrolidonasoluble. Después de homogeneizar,la parte soluble se separa del residuo sólidopor centrifugación (9.000 r.p.m. durante 30 minutos).El residuo sólido se somete a dos ciclosmás de lavado, homogeneización y centrifugaciónen las disoluciones anteriores. Los sobrenadantesde estas fracciones se juntaron constituyendo elextracto crudo rico en actividad POD y PPO.Se realizó una extracción igual a la anteriorpero utilizando 150 gramos de raíz de rábanopicante. Hasta la fecha, y de acuerdo con lasúltimas publicaciones, la raíz del rábano picantees la materia vegetal que posee mayor contenidode peroxidasa. Los inventores han determinadoy comparado la cantidad de peroxidasa extraídade la raíz del rábano y de las brácteas de la alcachofa.Sorprendentemente, este último tejidosólo tiene la mitad de unidades (21.000 unidadespor kilogramo) que la raíz del rábano picante(43.000 unidades por kilogramo). Por lo tanto,los desechos de alcachofa presentan una cantidadde POD comparable a la raíz del rábano picante.Pero lo que no es comparable es el precio de estosdos productos. El precio del rábano picante,utilizado para el consumo humano, oscila entrelas 300 y 700 pesetas/kg, mientras que los desechosde alcachofa, usados para la alimentaciónanimal, tienen un precio medio de 0,5 pesetas/kg.Esto significa que el tratamiento de vertidos industriales,aguas residuales y suelos contaminadosmediante extractos de alcachofa resulta unas 500veces más económico que el tratamiento con peroxidasade rábano picante. Otra peroxidasa máseconómica usada con este fin es la extraída de losbrotes de soja. Según una valoración económicaanterior (patente norteamericana US 5.178.762)usar esta proteína es aproximadamente 100 veces6

11 ES 2 167 277 A1 12más económico que hacerlo con la de rábano. Porlo tanto el método propuesto en esta invenciónes unas 5 veces más económico que el propuestousando la peroxidasa de soja.Ejemplo 2Tratamiento de agua contaminada por un clorofenolSe disolvieron 0,07 g de 4-clorofenol en 1 ml deacetona y la disolución resultante se añadió a0,4litros de agua corriente. La disolución fenólica sedividió en 4 fracciones de 100 ml y se mantuvierona temperatura ambiente y en agitación continua.A tiempo cero se les añadieron los siguientes componentes:- FRACCION CONTROL: 2,1 ml de aguadestilada- FRACCION 1: 2 ml de agua destilada + 0,1ml de peróxido de hidrógeno al 7,5 % (2 mM enla disolución)- FRACCION 2: 0,1 ml de agua destilada + 2ml de extracto crudo de alcachofa (0,2 unidadesde POD en la disolución)- FRACCION 3: 2 ml de extracto crudo dealcachofa (0,2 unidades de POD en la disolución)+0,1mldeperóxido de hidrógeno 7,5 % (2 mMen la disolución).Se recogieron alícuotas de 1 ml a distintostiempos. La reacción se paró por adición de0,01 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 20 %.Las muestras fueron filtradas y analizadas porcromatografia líquida de alta presión (HPLC).La concentración de 4-clorofenol se determinó deacuerdo a una recta patrón realizada con concentracionesconocidas de ese compuesto. Comose puede observar en la Figura 1, la mayor conversiónde 4-clorofenol correspondió a aquellasfracciones que contenían el extracto crudo de alcachofay el peróxido de hidrógeno, lo que significaque la POD es especialmente activa sobreeste monofenol clorado. La PPO oxida muchamás lentamente a este fenol como lo pone de manifiestosu desaparición lenta en aquella fraccióna la que se le adicionó extracto de alcachofa perono el peróxido de hidrógeno.Considerando largos tiempos de reacción, laTabla 1 muestra la concentración de 4-clorofenol(tanto por ciento respecto a la concentración inicial)a las 2 horas de reacción en las condicionesdescritas anteriormente. Después de 10 horaslas fracciones control y 1 no mostraron ningúncambio en su color. La fracción a la cual sele habla añadido únicamente extracto crudo dealcachofa (Fracción 2), presentó una coloraciónmarrón en ese tiempo, mientras que en la que seañadió conjuntamente el extracto crudo de alcachofay el peróxido de hidrógeno (Fracción 3) seformó un compuesto de color amarillo, insolubleyfácilmente separable de la disolución acuosa porcentrifugación o filtración.TABLA 1Porcentaje de 4-clorofenolFracción 4-clorofenol (%)Control 1001 992 643 135101520253035404550556065Ejemplo 3Tratamiento de agua contaminada por un difenolSe disolvieron 0,04 g del o-difenol, L-3,4-dihidroxifenilalanina(L-dopa), en 0,4 litros de aguacorriente y se repartieron en 4 fracciones de 100ml cada una, manteniéndose a temperatura ambientey en agitación continua. A tiempo cero seles añadieron los siguientes componentes:- FRACCION CONTROL: 1,1 ml de aguadestilada- FRACCION 1: 1 ml de agua destilada + 0,1ml de peróxido de hidrógeno al 7,5 % (2 mM enla disolución)- FRACCION 2: 0,1 ml de agua destilada + 1ml de extracto crudo de alcachofa (0,1 unidadesde POD en la disolución)- FRACCION 3: 1 ml de extracto crudo dealcachofa (0,1 unidades de POD en la disolución)+0,1mldeperóxido de hidrógeno al 7,5 % (2mM en la disolución).Se recogieron alícuotas de 1 ml a distintostiempos. La reacción se paró por adición de 0,01mL de TCA al 20 %. Las muestras se filtrarony analizaron por HPLC. La concentración de L-dopa se determinó de acuerdo a una recta patrónrealizada con concentraciones conocidas de esteo-difenol. La Figura 2 representa la desapariciónde L-dopa con el tiempo en todas las fracciones.En este caso la adición de peróxido de hidrógenono mostró diferencias significativas en catálisis deeste o-difenol por los extractos de alcachofa. Porlo tanto, en este caso, la PPO fue la que mayoritariamenteoxidó al compuesto fenólico. Esteejemplo muestra cómo la adición de peróxido dehidrógeno no es estrictamente necesaria cuandose quiere limpiar un agua contaminada por un o-difenol con extracto de alcachofa.Después de 10 horas de reacción las Fracciones2 y 3 evolucionaron a la formación de compuestosde color marrón -oscuro e insolubles en medioacuoso, características que definen a las melaninasformadas a partir de L-dopa.Ejemplo 4Efecto de la concentración de extracto de alcachofay peróxido de hidrógeno en el tratamientode un agua contaminada por un fármacoEn este ejemplo se describe el efecto de la concentraciónde extracto de alcachofa y de peróxidode hidrógeno en el tratamiento de un agua contaminadapor paracetamol (4-acetaminofenol).Se disolvieron 0,1 g de paracetamol en 0,6 litrosde agua corriente. La disolución conteniendoeste fármaco se dividió en 6 fracciones de 100 ml yse mantuvieron a temperatura ambiente y en agitacióncontinua. Tres de estas disoluciones se usaronpara determinar el efecto de la concentraciónde extracto de alcachofa y las otras tres para estudiarel efecto de la concentración de peróxidode hidrógeno.4.1 Efecto de la concentración de extracto dealcachofaLas unidades enzimáticas añadidas están referidasa las unidades de POD. A los 100 ml dedisolución se les añadieron:- FRACCION CONTROL: 2 ml de agua destilada+ 0,1 ml de peróxido de hidrógeno al 30 %(8 mM en la disolución)- FRACCION 1: 1 ml de agua destilada +7

13 ES 2 167 277 A1 141 ml de extracto crudo de alcachofa (0,1 unidadesde POD en la disolución) + 0,1 ml de peróxidode hidrógeno al 30 % (8 mM en la disolución)- FRACCION 2: 2 ml de extracto crudo dealcachofa (0,2 unidades de POD en la disolución)+0,1mldeperóxido de hidrógeno al 30 % (8 mMen la disolución).Se recogieron alícuotas de 1 ml a distintostiempos. La reacción se paró por adición de 0,01ml de TCA al 20 %. Estas muestras fueron filtradasy analizadas por HPLC. La concentraciónde paracetamol se determinó de acuerdo a unarecta patrón realizada con concentraciones conocidasdeestefármaco.Los resultados se muestranen la Figura 3. Se puede observar cómo la adiciónde 2 unidades de POD por litro de agua contaminadaelimina prácticamente el 90 % de paracetamolpresente en esta agua en aproximadamente 1hora de reacción.4.2 Efecto de la concentración de peróxido dehidrógenoLas tres fracciones restantes de 100 ml de aguacontaminada conteniendo ese fármaco se sometieronal siguiente tratamiento:- FRACCION CONTROL: 0,1 ml de aguadestilada + 1 ml de extracto crudo de alcachofa(0,1 unidades de POD en la disolución)- FRACCION 1: 0,075 ml de agua destilada +1 ml de extracto crudo de alcachofa (0,1 unidadesde POD en la disolución) + 0,025 ml de peróxido51015202530de hidrógeno al 30 % (2 mM en la disolución)- FRACCION 2: 1 ml de extracto crudo dealcachofa (0,1 unidades de POD en la disolución)+0,1mldeperóxido de hidrógeno al 30 % (8 mMen la disolución).La concentración de paracetamol se valorócomo en el caso anterior y los resultados se muestranen la Figura 4. Esta Figura muestra la necesidadde adicionar pequeñas concentraciones delperóxido para obtener mejores resultados. Estoes debido al bien conocido efecto de inactivaciónde las peroxidasas por el peróxido. Para evitareste fenómeno de inactivación, en algunos casos,es más conveniente añadir pequeñas concentracionesdel peróxido e ir adicionando éste gradualmentecon el tiempo.Bibliografía- Klibanov, A.M.; Tu, T. y Scott, K.P.(1983) “Peroxidase-catalyzed removal of phenolsfrom coal-conversion waste waters”, Science 221,259-261.- Tatsumi, K.; Wada, S. y lchikawa, H.(1996) “Removal of chlorophenols from wastewaterby immobilized horseradish peroxidase”, Biotechnology& Bioengineering 51, 126-130.- Wada, S.; chikawa, H. y Tatsumi, K.(1995) “Removal of phenols and aromatic aminesfrom wastewater by a combination treatmentwith tyrosinase and a coagulant”, Biotechnology& Byoengineering 45, 304-309.354045505560658

15 ES 2 167 277 A1 16REIVINDICACIONES1. Un extracto de alcachofa (Cynara scolymus,L.) que comprende enzimas con actividadperoxidasa (PODs) de alcachofa y enzimas conactividad polifenol oxidasa (PPOs) de alcachofa.2. Un procedimiento para la obtención de unextracto de alcachofa según la reivindicación 1,que comprende la extracción de dicho extractomediante homogeneización de tejidos de alcachofaen un medio acuoso.3. Procedimiento según la reivindicación 2,en el que dichos tejidos de alcachofa comprendentallos, hojas y brácteas de alcachofa.4. Procedimiento según la reivindicación 3, enel que dichos tallos, hojas y brácteas de alcachofaforman parte de los desechos de alcachofa generadospor la industria conservera de alcachofas.5. Procedimiento según la reivindicación 2,en el que dicho medio acuoso está constituido poragua o por una disolución acuosa salina, opcionalmentetamponado en un intervalo de pH comprendidoentre 3 y 10.6. Procedimiento según la reivindicación 2, enel que dicho medio acuoso comprende, además,uno o más secuestradores de fenoles.7. Procedimiento según la reivindicación 2,que comprende la trituración de dichos tejidos dealcachofa previa a la homogeneización de los mismos.8. Procedimiento según la reivindicación 2,que comprende la separación, tras la homogeneización,de la parte soluble del residuo sólido,mediante un proceso de separación sólido-líquidoconvencional, para obtener una primera fracciónsoluble y un primer residuo sólido.9. Procedimiento según la reivindicación 8, enel que dicha separación sólido-líquido se realizapor centrifugación o por filtración.10. Procedimiento según la reivindicación 8,en el que dicho primer residuo sólido se someteaunoomás ciclos adicionales de lavado, homogeneizaciónen medio acuoso y separación sólidolíquido,para obtener un segundo residuo sólidoy unas segundas fracciones solubles que, opcionalmentese mezclan con dicha primera fracciónsoluble y constituyen un extracto crudo que comprendePODs y PPOs.11. Procedimiento según la reivindicación 10,que comprende, además, efectuar sobre dicho extractocrudo una extracción con detergentes.12. Procedimiento según la reivindicación 2,que comprende, además, desecar o liofilizar el extractoobtenido.13. Procedimiento según la reivindicación 2,que comprende, además, someter a precipitaciónsalina al extracto obtenido, seguido de, opcionalmente,desalado del producto resultante.14. Procedimiento según la reivindicación 10,en el que dicho segundo residuo sólido se somete aun lavado con agua para obtener un material ricoen fibra adecuado para la fabricación de piensoscompuestos para animales, como fuente de fibraen la alimentaciónhumanaocomofuenteparalaobtención de bioproductos con aplicaciones sanitarias,agroalimentarias o industriales.15. Un procedimiento para oxidar una sustanciatóxica seleccionada entre un fenol, una amina5101520253035404550556065aromática, un haluro orgánico, un metal pesado,y sus mezclas, que comprende hacer reaccionardicha sustancia tóxica con un peróxido en presenciade un extracto de alcachofa según la reivindicación1, u obtenible por un procedimiento segúncualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, hastaconvertir a dicha sustancia tóxicaenunmaterialno contaminante o menos contaminante.16. Un métodoparaladescontaminación totalo parcial de un medio contaminado con fenoles,aminas aromáticas, haluros orgánicos, metalespesados y sus mezclas, que comprende poneren contacto dicho medio contaminado a tratar conun peróxido y con un material de alcachofa quecomprende PODs y PPOs, seleccionado entre desechosde alcachofas y un extracto de alcachofasegún la reivindicación 1, u obtenible por un procedimientosegún cualquiera de las reivindicaciones2 a 14, en una cantidad adecuada y bajo unascondiciones apropiadas para descontaminar totalo parcialmente el medio contaminado.17. Método según la reivindicación 16, en elque dicho medio contaminado es un medio líquidoseleccionado entre efluentes o vertidos industriales,aguas residuales y sus mezclas.18. Método según la reivindicación 17, en elque dicho material de alcachofa que comprendePODs y PPOs es dicho extracto de alcachofa.19. Método según la reivindicación 18, en elque el extracto de alcachofa se añade sobre el mediolíquido a tratar en una cantidad tal que contieneentre 0,2 y 10 unidades de POD por litro demedio líquido contaminado.20. Método según la reivindicación 17, en elque dicho material de alcachofa que comprendePODs y PPOs es dicho desecho de alcachofa.21. Método según la reivindicación 20, en elque el desecho de alcachofa se añade sobre el mediolíquido a tratar en una cantidad comprendidaentre 2,5 y 25 gramos de desecho de alcachofa porlitro de medio líquido contaminado.22. Método según cualquiera de las reivindicaciones16 ó 17, en el que dicho peróxido seselecciona entre un alquil-peróxido, peróxido dehidrógeno y sus mezclas.23. Método según la reivindicación 22, en elque dicho peróxido se adiciona de forma gradualcon el tiempo.24. Método según la reivindicación 22, en elque dicho peróxido se adiciona en una concentracióncomprendida entre 0,1 y 10 mmoles deperóxido por litro de medio líquido contaminado.25. Método según la reivindicación 24, enel que dicho peróxido se adiciona en una concentracióncomprendida entre 0,2 y 2 mmoles deperóxido por litro de medio líquido contaminado.26. Método según la reivindicación 17, quecomprende, además, la agitación y/o aireacióncontinua del medio líquido contaminado a tratar.27. Método según la reivindicación 17, en elque la temperatura está comprendida entre 10 ◦ Cy70 ◦ C.28. Método según la reivindicación 17, en elque el pH del medio líquido contaminado a tratarestá comprendido entre 3 y 9.29. Método según la reivindicación 28, en elque el pH del medio líquido contaminado a tratarestá comprendido entre 3,5 y 7.9

17 ES 2 167 277 A1 1830. Método según la revindicación 17, quecomprende, además, medir previamente el pH delmedio líquido a tratar y efectuar las correccionesapropiadas, mediante la adición de los ácidos obases necesarios, para mantener el medio líquidoa tratar en un intervalo de pH comprendido entre3y9.31. Método según la reivindicación 17, quecomprende la inmovilización de las PODs y/oPPOs presentes en dicho extracto de alcachofamediante enlace a un soporte sólido, atrapamientoen geles, encapsulación en vesículas, entrecruzamientode moléculas de enzimas y confinamientoen biorreactores de membranas.32. Método según la reivindicación 31, en elqueelenlaceaunsoportesólido se realiza sobremagnetita o concanavalina-A.33. Método según cualquiera de las reivindicaciones17, 31 ó 32, en el que el biorreactorque comprende la enzima soluble o inmovilizadaestá acoplado a un sistema de filtración, afinidad,interacción hidrofóbica, intercambio iónico, quelatacióno reparto.34. Método según la reivindicación 17, en el510152025queelcontaminantepresenteenelmediolíquidocontaminado se selecciona entre paracetamol, 4-fluorofenol, 3-fluorofenol, 2-fluorofenol, 4-clorofenol,3-clorofenol, 2-clorofenol, 2,4,6-triclorofenol,4-bromofenol, 3-bromofenol, 2-bromofenol, 4-iodofenol, 3-iodofenol, 2-iodofenol, fenol, p-cresol,4-etilfenol, 4-isopropilfenol, 4-terc-butilfenol, guayacol,p-hidroxianisol, m-hidroxianisol, dimetoxifenol,2-cloro-4-metoxifenol, 3,5-dimetoxifenol,3,4-dimetoxifenol, p-hidroxialcohol bencílico, p-hidroxibenzaldehído, ácido p-hidroxibenzoico,anilina, p-toluidina, o-toluidina, m-toluidina, 4-amino-N,N’-dimetilanilina, catecol, 4-metilcatecol,4-terc -butilcatecol, dopamina, dopa, ácido3,4-dihidroxibenzoico, cadmio, mercurio, plomo ysus mezclas.35. Método según la reivindicación 16, en elque dicho medio contaminado se selecciona entreun medio semisólido y un medio sólido.36. Método según la reivindicación 35, en elque el material de alcachofa que comprende PODsy PPOs es desecho de alcachofa y el peróxido seañade por pulverización.303540455055606510

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OFICINA ESPAÑOLADE PATENTES Y MARCASESPAÑAk 11 ES 2 167 277k 21 N. ◦ solicitud: 200002544k 22 Fecha de presentación de la solicitud: 23.10.2000k 32 Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICAk 51 Int. Cl. 7 : C12N 9/08, 9/02, C02F 3/32DOCUMENTOS RELEVANTESCategoría Documentos citados ReivindicacionesafectadasY KANEL, M.Y.; GHAZY, A.M. Peroxidases of Cynara scolymus (global 1-2,15-16artichoke) leaves. Purification and properties. 1973. Acta Biol.Med. Ger., 31 (1), 39-49.Y ESPIN, JUAN CARLOS et al. Monophenolase activity of polyphenol 1-2,15-16oxidase from artichoke heads (Cynara scolymus l.). 1997. FoodSci. Technol. (London), 30 (8), 819-825.Y EP 462082 A2 (ENTE POUR LA NUOVE TECNOLOGIE E L’ENERGIE E 15-16L’AMBIENTE. ENEA) 18.12.1991, página 6, líneas 15-18,37-40,53-54;reivindicación 8.A EP 547318 A1 (AUSIMONT S.P.A.) 23.06.1993 15-16A EP 126394 A1 (PHILLIPS PETROLEUM COMPANY) 28.11.1994 15-16Categoría de los documentos citadosX: de particular relevanciaY: de particular relevancia combinado con otro/s de lamisma categoríaA: refleja el estado de la técnicaO: referido a divulgación no escritaP: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaciónde la solicitudE: documento anterior, pero publicado después de la fechade presentación de la solicitudEl presente informe ha sido realizado× para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n ◦ :Fecha de realización del informe Examinador Página04.01.2002 M. Hernández Cuéllar 1/1