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SECRETARIA DE COMERCIOYFOMENTO INDUSTRIALNORMA MEXICANANMX-AA-42-1987CALIDAD DEL AGUA DETERMINACION DEL NUMERO MASPROBABLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMESFECALES (TERMOTOLERANTES) Y Escherichia coli PRESUNTIVA.WATER QUALITY-DETERMINATION OF THE MOST PROBABLENUMBER (NMP) OF TOTAL COLIFORMS, FECAL COLIFORMS(THERMAL TOLERANTS), AND Escherichia coli PRESUMPTIVE.DIRECCION GENERAL DE NORMAS

NMX MX-AA-42-1987PREFACIOEn la elaboración de la presente norma participaron las siguientes instituciones:SECRETARIA DE DESARROLLO URBANO Y ECOLOGIA Instituto SEDUE.SECRETARIA DE SALUDSECRETARIA DE AGRICULTURA Y RECURSOS HIDRAULICOSSECRETARIA DE MARINA. Dirección General de Oceanografía Naval.DEPARTAMENTO DEL DISTRITO FEDERAL Dirección General de ReordenaciónUrbana y Protección Ecológica. Laboratorio Central de Control.UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO. Facultad de Química.PETROLEOS MEXICANOSCAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DEL HIERRO Y EL ACERO.ASOCIACION MEXICANA CONTRA LA CONTAMINACION DEL AGUA Y ELAMBIENTECELANESE MEXICANA, S.A.MERCK MEXICO, S.A.

NMX MX-AA-42-1987CALIDAD DEL AGUA-DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)DE COLIFORMES TOTALES, COLIFORMES FECALES (TERMOTOLERANTES) YEscherichia coli PRESUNTIVA.WATER QUALITY-DETERMINATION OF THE MOST PROBABLE NUMBER (NMP)OF TOTAL COLIFORMS, FECAL COLIFORMS (THERMAL TOLERANTS), ANDEscherichia coli PRESUMPTIVE.0 INTRODUCCIONLa presencia y extensión de contaminación fecal es un factor importante en ladeterminación de la calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad demicroorganismos y formas de resistencia de los mismos, involucrando organismospatógenos, los cuales son un riesgo para la salud publica al estar en contacto con el serhumano. El examen de muestras de agua para determinar la presencia de microorganismosdel grupo coliforme que habitan normalmente en le intestino humano y de otros animalesde sangre caliente, da una indicación. Dada la limitada capacidad de algunos miembros delgrupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus números también puedenemplearse para estimar el grado de contaminación fecal.1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIONEsta Norma Mexicana establece un método para la detección y enumeración en agua deorganismos coliformes totales, organismos coliformes fecales (termotolerantes) yEscherichia coli presuntiva (E. coli) mediante el cultivo en un medio liquido en tubosmúltiples y él cálculo de sus números más probables (NMP) en la muestra.Este método es aplicable para todo tipo de agua, incluyendo aquellos que contienen unacantidad apreciable de materia en suspención.La selección de las pruebas usadas en la detección y confirmación del grupo de organismoscoliformes, incluyendo E. coli, puede verse como parte de una secuencia continua. Elgrado de confirmación con una muestra en particular depende parcialmente de lanaturaleza del agua y parcialmente de las razones para realizar el examen.En la practica, la detección de E. coli presuntiva, como se define en el punto 3.3 de estanorma, da usualmente una indicación satisfactoria de contaminación fecal.

NMX MX-AA-42-19872 REFERENCIASEsta norma se competa con las siguientes Normas Mexicanas vigentes:NMX-Z-1NMX-BB-14Sistema Internacional De Unidades (SI)Clasificación y tamaños nominales para utensilios de vidrio usados enlaboratorios.3 DEFINICIONESPara propósitos de esta Norma Mexicana, se aplican las siguientes definiciones:3.1 Organismos coliformes.- Organismos capaces de crecimiento aeróbico ya sea 308 ± 1k(35 ± 1°C) ó 310 ± 1k (37 ± 1°C) en un medio de cultivo líquido lactosado con producciónde aciso y gas dentro de un periodo de 48 h.3.2 Organismos coliformes fecales (termotolerantes). Organismos coliformes como sedescribe en 3.1 que tienen las mismas propiedades fermentativas a 317 ± 0.5k (44 ±0.5°C).3.3 Escherichia coli presuntiva (E. coli).- Organismos coliformes termotolerantes como sedescribe en 3.2 que también producen Indol a partir de tripofano a 317k (44°C).4 PRINCIPIOEl método se basa en la inoculación de alicuotas de la muestra, diluida o sin diluir, en unaserie de tubos de un medio de cultivo liquido conteniendo lactosa.Los tubos se examinan a las 24 y 48 horas de incubación ya sea a 308 o 310k (35 o 37°C).Cada uno de los que muestran turbidez con producción de gas se resiembra en un medioconfirmativo más selectivo y, cuando se busca E. coli presuntiva, en un medio en el que sepueda demostrar la producción de indel.Se lleva acabo la incubación de estos medios confirmativos basta por 48 horas ya sea 308 ó310k (35 o 37°C) para la detección de organismos coliformes y a 317k (44°C) paraorganismos termotolerantes y E. coli.Mediante tablas estadísticas se lleva acabo él calculo del numero más probable (NMP) deorganismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. coli que pueda estarpresente en 100 cm 3 de muestra, a partir de los números de los tubos que dan resultadosconfirmativos positivos.

NMX MX-AA-42-19875 APARATOS Y EQUIPOAparte de los equipos que se suministran estériles, el material de vidrio y el resto delequipo deben esterilizarse.5.1 Incubadora capaz de mantener una temperatura de 308 ± 1k (35 + 1°C) ó 310 ± 1k(37 ± 1°C) y 317 ± 0.5k (44 ± 0.5°C).5.2 Estufa capaz de mantener una temperatura de 453 a 473k (180 a 200°C).5.3 Autoclave u olla de presión o con manómetro.5.4 Potenciometro.5.5 Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001 g.5.6 Pipetas serológicas.5.7 Pipeteros de aluminio o acero inoxidable; se pueden sustituir con papel aluminio opapel Kraft.5.8 Tubos de ensaye de cristal refractario de 15mm x 150 mm con tapón de baquelita,aluminio o algodón.5.9 Frascos muestreadores, de vidrio resistente o cristal refractario de 125 cm 3 , contapón de cristal esmerilado.5.10 Tubos de fermentación (Durham).5.11 Asas de inoculación.5.12 Material común de laboratorio.6 REACTIVOS.Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico a menos que seindique otra cosa. Cuando se especifique el uso de agua se debe entender agua destilada invitro o agua desionizada libre de sustancias que pueden inhibir el crecimiento bacteriano enlas condiciones de prueba.

NMX MX-AA-42-1987Para la preparación de los reactivos, las condiciones de esterilización deben ser 349k(121°C) y 0.098066 Mpa (1 kg/cm 2 ) de presión manométrica durante 15 minutos. Los tubosde fermentación (Durham) no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.En caso de utilizar medios deshidratados, seguir las recomendaciones del fabricante para supreparación.6.1. Utilizar uno de los siguientes medios de cultivo:6.1.1. Caldo lauril triptosa (CLT).Medio de doble concentración:Triptosa 40.0gLactosa 10.0gCloruro de sodio (NaCl) 10.0gFosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 ) 5.5gFosfato dibásico de potasio (K 2 HPO 4 ) 5.5gLauril sulfato de sodio 0.2gAgua para llevar a 1000cm 3Añadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y añadir el laurilsulfato de sodio. Disolver el resto de los componentes por separado y agregarlos a losanteriores mezclando suavemente para evitar la formación de espuma. Ajustar a pH 6.8.Preparar medio de simple concentración diluyendo el medio de doble concentración con unvolumen igual de agua.Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 53cm 3 y el medio de dobleconcentración en volúmenes de 10 y 50 cm 3Cada tubo o matraz deben contener un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocaren autoclave a 388k (115°C) durante 10 min.6.1.2.Caldo Mc Conkey.Medio doble de concentración:Sales biliares 10.0gPeptona 40.0gLactosa 20.0gCloruro de sodio (NaCl) 10.0gPúrpura de brmocresol (1% v/v en soluciónEtanolica) 2cm 3Agua para llevar a 1000cm 3

NMX MX-AA-42-1987Disolver, calentando, la peptona, el cloruro de sodio y las sales biliares en agua yalmacenarlo a 277k (4°C) durante todo la noche. Filtrar mientras esta aun frío añadir lalactosa y disolver. Ajustar a pH 7.4 y añadir la púrpura de bromocresol.Preparar el medio de simple concentración disolviendo el de doble concentración con unvolumen igual de agua o prepararlo usando la mitad de concentración de los ingredientes.Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 5 cm 3 y la dobleconcentración en volúmenes de 10 y 50 cm 3 en tubos o matraces conteniendo un tubo defermentación invertido (Durham).Colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min.6.1.3.Caldo lactosa.Medio de doble concentración:Peptona 10.0gLactosa 10.0gExtracto de carne 6.0gAgua para llevar a 1000cm 3Disolver los componentes en agua hirviendo. Si es necesario ajustar el pH de modo que alterminar la esterilización sea de 6.7. Preparar el medio de simple concentración diluyendoel medio de doble concentración con un volumen igual de agua.Distribuir el medio de simple concentración en volúmenes de 5cm 3 y la dobleconcentración en volúmenes de 10 y 50 cm 3 , Cada tubo o matraz debe contener un tubo defermentación invertido (Durham). Esterilizar en autoclave a 394 ± 1k (121 ± 1°C) durante15 min.Estos tres medios son de uso común en numerosos países la selectividad del Mc Conkey ydel CLT depende respectivamente de la presencia de salas biliares y del agente desuperficie activo, el laurilsulfato. El caldo lactosa no es un medio selectivo.6.2 Utilizar uno o más de los siguientes medios confirmativos:6.2.1 Medios para la producción de gas:6.2.1.1 caldo bilis lactosa verde brillante:Peptona 10.0gLactosa 10.0gBilis de buey (deshidratada) 20.0gVerde brillante (1% m/m en solución acuosa) 13cm 3Agua para llevar a 1000cm 3

NMX MX-AA-42-1987Disolver la peptona en 500 cm 3 de agua. Añadir los 20g de bilis de buey deshidratadadisueltos en 200cm 3 de agua; La solución debe tener un pH entre 7.0 y 7.5 Disolver conagua hasta un volumen aproximado de 975 cm 3 . Añadir la lactosa y ajustar el pH a 7.4.Añadir la solución verde brillante y aforar a 1000 cm 3 con agua.Distribuir volúmenes de 5cm 3 en tubos de ensaye conteniendo tubos de fermentacióninvertidos (Durham) y colocar en autoclave a 388k (115°C) durante 10 min.Nota 1. - Este medio no da resultados reproducibles en todos los casos y se recomiendacomprobar sus propiedades inhibitorias antes de usarlo.6.2.1.2 Medio EC:Triptosa o tripticasa 20.0gLactosa 5.0gMezcla de sales biliares 1.5gFosfato dibásico de potasio (K 2 HPO 4 ) 4.0gFosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 ) 1.5gCloruro de sodio (NaCl) 5.0gAgua para llevar a 1000cm 3Disolver los componentes por separado y agregarles agitando suavemente. El pH debe serde 6.9 después de la esterilización. Antes de esterilizar, distribuir en tubos de fermentacióncon suficiente medio para que el tubo invertido quede cubierto cuando menos parcialmenteDespués de la esterilización.Como medio confirmativo para coliformes totales, el más generalizado es el caldo de bilislactosa verde brillante (BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes fecales seutilizan tanto el BLVB como el caldo EC.6.2.2. Medio para la producción de indol:6.2.2.1. Agua de triptona:Triptona 20.0gCloruro de sodio (NaCl) 5.0gAgua para llevar a 1000cm 3Disolver los componentes en agua y ajustar a pH. 7.5 distribuir en volúmenes de 5cm 3 ycolocar en autoclave a 308K (115°C) durante 10 min.NOTA 2. - La adición de 0.1% (m/m) de L ó DL- triptofano puede mejorar elfuncionamiento del medio.6.3.Reactivo de Kovacs para indol:1,4 dimetilaminobenzaldehído

NMX MX-AA-42-1987(C 6 H 4 [H(CH 3 ) 2 ]CHO) 5.0gAlcohol amílico (CH 3 (CH 2 ) 4 CH) librede bases orgánicas 75cm 3Acido clorhídrico concentrado(HCL) 85cm 3Disolver el aldehido en el alcohol. Añadir el ácido concentrado con cuidado. Proteger de laluz y almacenar a 277K (4°C)NOTA 3. - El reactivo debe tener la coloración entre amarillo claro; algunas muestras dealcohol amilico son insatisfactorias y dan una coloración oscura con el aldehido.6.4 Reactivo de oxidasa para la prueba de oxidasa:Clorihidrato de tetrametil-p-fenilendiamina 0.1g10cm 3Este reactivo no es estable y debe prepararse para usarse en pequeñas cantidades cada vezque sea necesario.6.5.1 Diluyentes:6.5.1 Diluyente de peptona (0.1%)PeptonaAgua para llevar aDisolver la peptona en aproximadamente 950cm 3 de agua. Ajustar el pH con solución dehidróxido de sodio 1mol/L ó ácido clorhídrico 1 mol/L de modo que después de laesterilización sea de 7.0±0.1. Llevar a 1000cm 3 con agua, distribuir en volúmenesconvenientes y esterilizar en autoclave a 394± 1K (121±1°C)6.5.2 Solución salina de peptona:Peptona 1.0gCloruro de sodio (NaCL) 8.5gAgua para llevar a 1000 cm 3Disolver los componentes hirviéndolos en aproximadamente 950cm 3 de agua. Ajustar el pHcon solución de hidróxido de sodio 1mol/L o ácido clorhídrico 1 mol/L de modo quedespués de la esterilización sea de 7.0±0.1. Llevar a 1000cm 3 con agua, distribuir envolúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 394±1K (121±1°C) durante 15 min.6.5.3 Solución de Ringer:Cloruro de sodio (NaCL) 2.25gCloruro de potasio (KCL) 0.105g

NMX MX-AA-42-1987Cloruro de calcio anhidro (CaCl 2 ) 0.12gBicarbonato de sodio (NaHCO 3 ) 0.05gAgua para llevar a 1000 cm 3Disolver los componentes y dividirlos en volúmenes convenientes.Esterilizar en autoclave a 394K (181°C) durante 15min.6.5.4 Solución amortiguadora de fosfato:Fosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 )42.5mgCloruro de magnesio(MgCL 2 )190.0mgAgua para llevar a 1000 cm 36.5.4.1 Solución de fosfato.Disolver 34g de fosfato en 500cm 3 de agua. Ajustar a PH 7.2±0.5 con solución dehidróxido de sodio 1mol/L y aforar a 1000 cm 3 con agua.6.5.4.2 Solución de cloruro de magnesio.Disolver 38g de cloruro de magnesio en 1000cm 3 de agua.Para usarla, añadir 1.25cm 3 de solución de fosfato (6.5.4.1) y 5.0cm 3 de solución decloruro de magnesio (6.5.4.2) a 1000cm 3 de agua. Distribuir en volúmenes convenientes yesterilizar en autoclave a 394±1K (121±1°C) durante 15 min.7 MUESTREOEl procedimiento para la recolección de las muestras de agua para el análisis bacteriológico,depende del tipo de agua que se desee muestrear.Las muestras para el análisis bacteorológico, se deben tomar en frascos muostreadores quese hayan lavado con extremo cuidado y esterilizado. En su interior colocar previo a laesterilización, 0.1cm 3 de solución de tiosulfato de sodio al 1% con el propósito de inhibirlaacción del cloro que puede contener la muestra, cubriendo además el tapón del frasco hastael cuello con papel aluminio.7.1.1 Muestreo en cuerpos receptores7.1.1 Siempre que sea posible, llenar el frasco a 2/3 partes de su capacidad; una cantidadmenor sería insuficiente, si fuera mayor, disminuiría el espacio de aire disponible, necesariopara homogeneizar la muestra. Las muestras deben ser representativas del agua en elestudio y asimismo no deben contaminarse en forma alguna.

NMX MX-AA-42-19877.1.2 El frasco donde se colecta la muestra no se debe destapar sino hasta el momento enel que se efectúe el muestreo.Al muestrear, se debe evitar que el cuello del frasco se ponga en contacto con los dedos ocualquier otro material contaminante.7.1.3 El examen de la muestra colectada debe realizarse lo más pronto posible, para evitarproliferación o muerte de las bacterias.Cuando el examen se practica dos horas después de tomar la muestra, los resultadosempiezan a ser inciertos.7.1.4 El volumen de muestra suficiente para efectuar el análisis bacteriológico, depreferencia debe ser de aproximadamente 100cm 3 . Es importante que todas las muestraestén acompañadas de datos completos y exactos de identificación y descripción.7.1.5 El mecanismo de muestreo superficial es el siguiente:7.1.5.1 Quitar el papel aluminio del cuello del frasco; Introducir el frasco aproximadamente30 cm 3 bajo la superficie del agua.7.1.5.2 Destapar el frasco dentro del agua. La boca del envase debe quedar en sentidocontrario al flujo de la corriente. Si no existe corriente, como en los embalses, crearlaempujando el frasco horizontalmente, en dirección opuesta al movimiento de la mano.7.1.5.3 Una vez que la muestra ocupe el volumen correspondiente del frasco (2/3 partes);tapar sin sacarlo del agua teniendo cuidado de que el papel aluminio vuelva a cubrir elcuello de la botella.7.1.5.4 Si no es posible la recolección de muestras en las condiciones antes anunciadas;fijar un lastre al frasco, al que se hace descender en el agua.7.1.6 Para tomar muestras profundas en lagos o embalses; usar aparatos especiales quepermitan destapar y tapar mecánicamente el frasco debajo de la superficie.7.2 Muestreo en pozos y grifos.7.2.1 Si el pozo está provisto de bomba de mano, bombear durante 5 min. , Para que elagua fluya libremente, antes de tomar la muestra.7.2.2 Si el pozo esta dotado de bomba mecánica, tomar la muestra en una llavepreviamente flameada de la descarga, dejando que fluya el agua libremente 5min. antes detomar la muestra.7.2.3 A efectuar este muestreo, se deben flamear los bordes del frasco y tapón durante eltiempo que dura el muestreo. Esto se hace con objeto de mantener el máximo lascondiciones de asepsia.

NMX MX-AA-42-1987volumen de diluyente a la porción de prueba. Inocular los tubos conteniendo medios deaislamiento de doble concentración con porciones de prueba de un volumen mínimo de5cm 3 .9.1.2 Incubación de los tubos.Incubar los tubos inoculados ya sea a 308± 1K (35± 1°C) o 340± 1K(37±1°C) durante 48horas.9.1.3 Examen de los tubosExaminar los cultivos de los tubos después de un período de incubación de 18 a 24 horas yconsiderar como resultados positivos a aquellos que muestren turbidez debida alcrecimiento bacteriano y formación de gas en los tubos internos invertidos (Durham) juntocon producción de ácido si el medio de aislamiento contiene un indicador de pH. Reincubaraquellos tubos que no muestran alguno o todos estos cambios y examinarlos nuevamentepara detectar reaccionan positivas a las 48 horas.9.2 Pruebas confirmativas.9.2.1 Inoculación del medio.Resembrar a partir de cada tubo de medio de aislamiento que muestro un resultado positivoen uno o más tubos de medio confirmativo (6.2) para detectar la producción de gas e indol.NOTA 4: - Si se usa el medio más inhibitorio de caldo lactosa para aislar, resembrar enalguno de los dos medios confirmativos más selectivos, Caldo de Bilis Lactosa VerdeBrillante o Caldo EC para efectuar la confirmación.9.2.2 Incubación y examen.Para confirmar la presencia de organismos coliformes, incubar un tubo de 9.2.1 de CaldoLactosa Verde Brillante o Caldo EC a 310K(37°C) y examinarlo para ver si hay producciónde gas dentro de un período de 48 horas.Para confirmar la presencia de organismos coliformes termotolerantes, incubar otro tubode 9.2.1 de Caldo Bilis Lactosa Verde Brillante o Caldo EC a 317K (44°C) durante 24horas para ver si hay producción de gas.Para confirmar la presencia de E. coli. Presuntiva, incubar un tubo de 9.2.1 de agua detriptona para detectar la formación de indol a 317L(44°C) durante 24 horas. Después añadirde 0.2 a0.3 cm 3 de reactivo de Kovacs (6.3) el tubo de agua de triptona; El desarrollo de unanillo de color rojo después de agitar suavemente de note la presencia de indol.

NMX MX-AA-42-1987NOTA 5.- La detección de E. coli presuntiva se considera una evidencia satisfactoria decontaminación fecal. Sin embargo, pueden efectuarse mayores pruebas para laconfirmación de E. coli si se considera necesario.9.3 Prueba de oxidasaAlgunas bacterias existentes en el agua pueden conformarse a la definición de organismoscoliformes en muchos aspectos, pero son capaces de producir gas a partir de lactosasolamente a temperaturas inferiores a 310K (37°C). Por consiguientes dan resultadosnegativos a las pruebas confirmativas estándar para organismos coliformes y su presenciaen agua usualmente no se considera significativa. Las especies de Aeromonas, que seencuentran naturalmente en el agua, tienen una temperatura óptima de crecimiento en elrango 303 a 308K (30 a 35°C), pero a pesar de ello son capaces de producir ácido y gas apartir de lactosa a 310K(37°C). Tienen poco significado para efectos sanitarios y sedistinguen del grupo de los coliformes por una reacción de oxidasa positiva.9.3.1 Llevar a cabo la prueba con subcultivos puros de los organismos fermentadores delactosa, crecidos en medio nutriente de agar, como sigue:-Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa recientemente preparado (6.4) en un papelfiltro en una caja de Petri.-Con una barra de vidrio o un asa de alambre de platino (no de nicromel), colocar parte delcultivo en el papel filtro preparado.-Considerar la aparición de u color azul marino purpúreo en un lapso de 10 segundos comouna reacción positiva.NOTA 6. - En cada ocasión que se use el reactivo de oxidasa, llevar a cabo pruebas decontrol con cultivos de organismos que se sepa dan una reacción positiva (pseudomonasaeruginosa) y uno que de una reacción negativa (E, coli) en 100 cm 3 de la muestra.10 CALCULOSA partir del número de tubos que dan reacciones positivas en los medios de aislamiento yconfirmativo, calcular por referencia a las tablas estadísticas (ver tabla) el número másprobable de organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y E. colipresuntiva en 100 cm 3 de la muestra. Cuando se emplean de dilución para hacerloequivalente.En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear para loscálculos la siguiente ecuación:

NMX MX-AA-42-1987No. de tubos positivos x 100Nmp/100cm 3 =_____________________________Cm 3 de muestracm 3 de muestraEn tubos negativos x en todos los tubos.TABLA 1Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultadospositivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm 3 en cada uno, 5 conporciones de 1cm 3 y con 5 porciones de 0.1 cm 3 .No. de tubos conreacciones positivas5tubos con10cm5tubos con1cm 35tuboscon0.1cm 3Indice delNMPpor100cm 3Límiteconfiable de95%InteriorSupe-riorNo. de tubos conreacciones positivas5tubos con10cm35tubos con1cm 35tubos con0.1cm 3Indice delNMPPOR100cm 3Límiteconfiable de95%InteriorSuperior0 0 0

NMX MX-AA-42-19875 4 4 350 120 1,0004 0 0 13 3 31 5 5 0 240 68 7504 0 1 17 5 46 5 5 1 350 120 1,0004 1 0 17 5 46 5 5 2 540 180 1,4004 1 1 21 7 63 5 5 3 920 300 3,2004 1 2 26 9 78 5 5 4 1600 640 5,8004 0 0 22 7 67 5 5 5 =

NMX MX-AA-42-19871 1 7 7 1 17 1 5 3 92 27 2201 1 9 9 2 21 1 5 4 160 39 4501 2 5 5 240TABLA 3 Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones deresultados positivos y negativos cuando se usan: 5 tubos con porciones de 50 cm 3 , 5 tuboscon porciones de 10 cm 3 y 5 tubos con porciones de 1 cm 3 .No. de tubos conreacciones positivas5tuboscon50cm5tuboscon10cm5tuboscon1cm 3IndicedelNMPPor100cm3Límiteconfiable de95%InferiorSuperiorNo. de tubos conreacciones positivas5tuboscon50cm 35tuboscon10cm 35tuboscon1cm 3IndicedelNMPpor100cm3Límiteconfiable de95%Inferior0 0 0

NMX MX-AA-42-19873 2 0 3 1 7 5 4 0 13 6 313 2 1 3 1 7 5 4 1 17 6 473 2 2 4 1 9 5 4 2 22 7 703 3 0 3 1 7 5 4 3 28 9 853 3 1 4 1 9 5 4 4 35 11 1003 4 0 4 1 9 5 5 0 24 8 753 4 1 4 1 95 5 1 35 11 1004 0 0 2 240TABLA 4Indice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultadospositivos y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 1 cm 3 y 3 con porciones de0.1 cm 3.0.1 cm cm 3 1cm 3Por cm 3 Interior SuperiorIndice Límite Confiable de 95%No. de tubos con reacciones positivasDel3 tubos con 3 tubos con 3 tubos conNMP.

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NMX MX-AA-42-1987e. Cualquier suceso particular observado en el curso del análisis y cualquier operaciónno especificada en el método o considerada opcional que pueda haber influído en losresultados.11 CONFIABILIDADEl procedimiento de fermentación en tubos múltiples es el método más usado por sufacilidad y economía. El resultado de esta prueba se expresa por el “número más probable”(NMP), pero debe entenderse que este método no es exacto ya que sólo nos da la probabledensidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada.La confiabilidad está dada por los niveles superiores o inferiores del límite de confianza al95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 cm 3 , no obstante, es una indicaciónimportante para evaluar la calidad sanitaria del agua.12 BIBLIOGRAFIASTANDARD METHODS FOR THE EXAMINATION OF WATER ANDWASTEWATER.15 th edition.Paginas 794-805.1980.14 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALESEsta norma concuerda parcialmente con el anteproyecto de norma ISO/DP 9308/2. Waterquality- Detection and enumeration of coliform organisms, thermotolerant coliformorganisms and presumtiveEscherichia coli by the multiple tube (most probable number) method.México, D.F. a 3 Junio de 1987LA DIRECTORA GENERAL DE NORMASLIC. CONSUELO SAEZ PUEYO

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SECRETARIA DE COMERCIOYFOMENTO INDUSTRIALNORMA MEXICANANMX-AA-112-1995-SCFIANALISIS DE AGUA Y SEDIMENTOS – EVALUACION DETOXICIDAD AGUDA CON PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM –METODO DE PRUEBA.WATER AND SEDIMENT ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATIONWITH PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – TEST METHOD.DIRECCION GENERAL DE NORMAS

NMX-AA-112-1995-SCFIPREFACIOEn la elaboración de la presente Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas einstituciones:- ASESORIA Y CONSULTORIA ECOLOGICA-REMMSA- ASOCIACION NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUIMICA- BECTOR DICKINSON DE MEXICO- CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE CELULOSA Y PAPEL- CONTROL DE CONTAMINACION DEL AGUA, S.A. DE C.V.- COMITÉ TECNICO DE NORMALIZACION NACIONAL DE PROTECCIÓN ALAMBIENTE- DISEÑO HIDRAULICO Y TECNOLOGIA AMBIENTAL, S.A. DE C.V.- EMPRESA PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION DEL AGUA ENLA ZONA E CIVAC- F.J. SALCEDO Y COMPAÑÍA- INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO- INSTITUTO POLITECNICO NACIONALCentro de investigación y de Estudios Avanzados.- INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC- JUNTA MUNICPAL DE AGUA Y SANAMIENTO DE CIUDAD JUAREZCHICHUAHUA- SECRETARIA DE MARINADirección general de Oceanografía Naval.- SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA.Comisión Nacional de Agua.Dirección general de Acuacultura.Instituto mexicano de Tecnología del agua.Instituto Nacional de Ecología.

NMX-AA-112-1995-SCFIINDICE DEL CONTENIDONúm. del Capítulo1. Objetivo2. Campo de aplicación3. Referencias4. Definiciones5. Muestreo6. Principio7. Reactivos y materiales8. Aparatos9. Preparación y acondicionamiento de la muestra10. Procedimiento11. Expresión de los resultados.12. Informe de los resultados13. Informe de la prueba14. Bibliografía15. Concordancia con normas internacionales.Apéndice A (informativo)Apéndice B (informativo)

NMX-AA-112-1995-SCFIANALISIS DE AGUA Y SEDIMENTOS – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDACON PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – METODO DE PRUEBA.WATER AND SEDIMENT ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITHPHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM – TEST METHOD.1 OBJETIVO.Esta Norma Mexicana establece el método para determinar la calidad del agua. Lixiviadosy sedimentos mediante pruebas de toxicidad aguda utilizando a la bacteria bioluminiscentemarina Photobacterium phosphoreum.2 CAMPO DE APLICACIÓNEsta Norma Mexicana es aplicable para la evaluación de toxicidad aguda en cuerpos deagua dulce, salubre y/o marina, así como aguas residuales industriales, agrícolas omunicipales, sustancias puras o combinadas, lixiviados y sedimentos.3 REFERENCIASEsta norma se complementa con las siguientes Normas Mexicanas y Norma OficialMexicana vigentes:NMX-AA-033NMX-AA-007NMX-AA-008NMX-AA-014Aguas residuales – Muestreo.Aguas – Determinación de temperatura.Aguas – Determinación de pH.Cuerpos receptores – Muestreo.NMZ-AA-087-SCFI Análisis de agua – Evaluación de toxicidad aguda con Daphniamangna Straus (Crustacea – Cladocera) – Método de prueba.NOM-053-ECOLQue establece el procedimiento para llevar a cabo la prueba deextracción para determinar los constituyentes que hacen a un residuopeligroso por su toxicidad al ambiente.

NMX-AA-112-1995-SCFI4 DEFINICIONES.Para fines de esta Norma Mexicana, se entiende por:4.1. Agua desionizada.Es el agua que ha sido tratada para remover los iones en solución que presenta unaconductividad menor o igual a 2µmhos/cm.4.2. Agua destilada.Es el agua que ha sido evaporada y condensada en un aparato de destilación de vidrioborosilicato u otro material, para remover impurezas.4.3. Agua intersticial.Es el agua que se encuentra ocupando un espacio entre las partículas del sediento. Lacantidad de agua interstical se expresa como un porcentaje del sedimento húmedo enrelación a su masa seca.4.4. Agua marina.Es el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares alagua marina natural.4.5. Agua de mar artificial.Es el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares alagua marina natural.4.6. Aguas residuales.Son las aguas de composición variada provenientes de las descargas municipales,industriales, comerciales, agrícolas, pecuarias, domésticas y en general de cualquiera otra.4.7. Bioluminiscencia.Es el fenómeno por el cual, ciertos organismos vivos emiten luz como resultado de suactividad bioquímica.4.8. Contaminante.Es toda materia o energía en cualesquiera de sus estados físicos y formas que alincorporarse o actuar en la atmósfera, agua suelo, flora, fauna o cualquier otro elementonatural, altere o modifique su composición o condición natural.

NMX-AA-112-1995-SCFI4.9. Concentración efectiva media (CE 50 )Es la concentración de sustancias puras, combinadas, cuerpos receptores, afluentes,lixiviados y sedimentos que reducen la intensidad de luz emitida por la bacteriaphotobecterium phosphoreum a un 50%4.10. Cuerpos de agua.Son los mares, lagos, lagunas, estuarios, acuíferos, redes colectoras con excepción de lossistemas de drenaje y alcantarillado urbano o municipal, ríos y sus efluentes directos oindirectos, permanentes o intermitentes, presas. Cuencas. Cauces, canales, embalses,cenotes, manantiales, y demás depósitos o corrientes de agua.4.11. Descarga.Son las aguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua osistema de drenaje y alcantarillado urbana o municipal, incluyéndose los procesos deinfiltración e inyección.4.12. Efecto agudo.Es aquél que se manifiesta como una respuesta inmediata de un organismo al tóxico otóxicos a los que se ha sido expuesto. Usualmente produce inhibición de alguna funciónmetabólica, inmovilidad o muerte.4.13. Efluente.Es el agua u otro líquido que procede de un embalse, cuenca, procesos o planta detratamiento.4.14. Falso positivo.Es la reducción de luz detectada, causada por un factor o factores diferentes de la presenciade algún tóxico.4.15. Liofilizado.Es el producto sometido a deshidración en condiciones de baja temperatura y alto vacío conel fin de conservarlo.4.16. Lixiviado.Es el líquido proveniente de los residuos, el cual se forma por reacción, arrastre opercolación y que contienen, disueltos o en suspensión, componentes que se encuentran enlos mismos residuos.

NMX-AA-112-1995-SCFI4.17. Muestra simple o instantánea.Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar unvolumen que resulte representativo de la descarga de aguas residuales, en el sitio y en elmomento del muestreo.4.18. Muestra compuesta.Es aquélla que se forma con la mezcla de muestras simples o instantáneas tomadas en unefluente industrial, agrícola o municipal. El número de muestras simples depende de lashoras por día que opere el proceso generado de la descarga.4.19. Photobacterium phosphoreum.Es la bacteria marina bioluminiscente, con forma bacilar, Gramm-negativa, anaerobiafacultativa, halofílica, la cual posee un flagelo en uno de los polos.4.20 Prueba de toxicidad (bioensayo de toxicidad).Es la exposición controlada de organismos a sustancias puras o combinadas y aguasprovenientes de cuerpos de agua, para evaluar su efecto.4.21. Reconstitución.Es la reactivación de la bacteria liofilizada por la adición de agua destilada. (rehidratación).4.22. SalinidadEs el contenido de sales disueltas por litro.4.23. Sedimento.Es el material particulado o granular que se deposita en el fondo de un cuerpo de agua,sistema de drenaje o alcantarillado urbano o municipal.4.24. Sustancia pura.Es el elemento o conjunto de dos o más elementos combinados químicamente, que danlugar a un compuesto con pureza no menor al 98%, por ejemplo: dicromato de potasio(K 2 Cr 2 O 7 ), fenol (C 6 H 5 -OH), sulfato de zinc (ZnSO 4 ).4.25. Sustancia combinada.Es aquélla que se forma por la integración de dos o más compuestos en una proporción nomayor al 98% de cualquiera de ellos. Para fines de esta norma: aguas residuales,industriales, efluentes agrícolas, municipales, lixiviados y sedientos.

NMX-AA-112-1995-SCFI4.26. Tiempo de exposición.Es el período en el que se someten los organismos a las soluciones de prueba, en unbioensayo de toxicidad.4.27. Tiempo de reconstitución bacteriano.Es el período en el que se lleva a cabo la rehidratación bacteriana y que comprende desde elmomento en que la solución de reconstitución es vertida al liofilizado, hasta el instante enque es colocada en incubación a 5,5ºC y que no debe exceder de 10 s.4.28. Toxicidad.Es el efecto que produce un tóxico.4.29. Toxicidad aguda.Es el efecto medido por la reducción de luz de Photobacterium phosphoreum. Después deser expuesta a un tóxico una sola vez durante un período corto no mayor a 30min.4.30. Tóxico.Es cualquier sustancia pura o combinada que al entrar en contacto con un organismo,produce daños estructurales o alteraciones bioquímicas o fisiológicas e incluso la muerte;dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición.4.31. Tóxico de referencia.Es una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad cuyo efecto en losorganismos a determinadas concentraciones es conocido y por lo tanto, permite establecerel estado de respuesta de los mismos; así como, comparara los resultados intra e interlaboratorios. El uso de estos tóxicos, proporciona también una evaluación general de laprecisión (estabilidad y reprocibilidad) del método a través del tiempo.5. MUESTREO.El muestro tanto de cuerpos de agua como de efluentes industriales, agrícolas, municipaleso urbanos, lixiviados y sedimentos, constituyen una parte integral y fundamental decualquier programa de evaluación de la calidad del ambiente acuático.5.1. Muestreo en efluentes industriales, agrícolas, municipales y urbanos.

NMX-AA-112-1995-SCFISe efectúan muestreos instantáneos de acuerdo a la tabla 1.TABLA 1.- Muestras instantáneas requeridas para formar una muestra compuesta.Horas pro día que operael proceso generador dela descarga.Hasta 8hMás de 9h y hasta 12hMás de 12h y hasta 18hMás de 18h y hasta 24hNúmero demuestras.4466Intervalo para la obtención demuestras simples.Mínimo MáximoHh1,022,032,033,04La integración de la muestra compuesta se efectúa de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-003 (ver 2 Referencias), tomándose las precauciones necesarias en cuanto a lapreservación de las muestras simples, para la cual, cada una de éstas se debe mantener a4ºC ± 2ºC hasta que sea integrada la muestra compuesta. Una vez concluido esto,dependiendo de cuando se realice el análisis, la muestra compuesta se debe almacenar ypreservar de acuerdo al capítulo 9 de esta norma.5.2. Muestreo en cuerpos de agua.El muestro se debe realizar de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-014 (VER 2Referencias). Además de los parámetros fisicoquímicos básicos, considerados sólo parafines del reporte (pH, oxígeno disuelto, conductividad, temperatura de agua y aire), sedeben registrar las siguientes características aparentes:- Olor- Color- Turbiedad- Presencia o ausencia de burbujas y espumaLas muestras simples o instantáneas se integran de acuerdo al inciso 4.17 de esta norma,siguiendo los ejemplos indicados en el inciso 13.1 de la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 2 Referencias).5.3. Muestreo en sedimentos.El muestreo de sedimentos se lleva a cabo utilizando una draga tipo Ekman o similar, obien un nucleador, siempre que se realice en cuerpos de agua cuya profundidad sea igual omayor a 50 cm. Si el muestreo se efectúa a profundidades menores a la anterior, se utilizauna pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte, o bien, puede realizarse muestreodirecto, utilizando el recipiente de almacenamiento.

NMX-AA-112-1995-SCFIEn cualquiera de los dos casos mencionados, la muestra que se considera para el análisiscorresponde a la lámina superior de sedimento con un espesor de 3cm y mas húmedaaproximada de 200g.Al efectuar el muestreo, se recomienda considerar lo siguiente:- Cuando se realiza el muestreo en sedimentos limosos, se sugiere introducirlentamente la draga o el nucleador para evitar remolinos y corrientes que suspendanel sedimento.- Si el muestreo se realiza en un sedimento rocoso arenoso, pueden quedar atrapadasrocas pequeñas entre las mandíbulas de la draga, impidiendo el cierre total de ésta,ocasionado pérdida de sedimento cuando se recupera; por lo cual. Se debe lanzar ladraga tantas veces como sea necesario hasta obtener la cantidad de sedimentosuficiente. De igual forma, si se utiliza un nucleador, quizá se requiera efectuarvarios muestreos hasta obtener el sedimento necesario.- Cuando el muestreo de sedimentos se realice en zonas de aguas someras (menor a50 cm de profundidad), al utilizar la pala pequeña, se debe procurar sumergirla endirección del flujo, y al llegar al fondo introducirla lentamente inclinando la pala enun ángulo aproximado de 45º, posteriormente arrastrar ésta, paralelamente al fondohasta obtener una cantidad suficiente. En seguida, se debe elevar la pala en formacasi horizontal (paralela al fondo) muy lentamente, para evitar pérdida desedimento.Para todos los casos anteriores, la muestra colectada para el análisis se coloca en recipienteslimpios de boca ancha de volumen mínimo de 250ml, de polietileno de alta densidad, contapa o contratapa del mismo material.5.3. Muestreo de lixiviadosEl muestreo de lixiviados se debe efectuar en los pozos de monitoreo de los sistemas decaptación de los mismos, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-053-ECOL, (ver 2Referencias).Para la colecta de la muestra, se deben tomar las preocupaciones necesarias utilizando elequipo de seguridad adecuado. Las muestras se deben colocar en recipientes limpios de 50ml de polietileno e alta densidad con contratapa.6. PRINCIPIOEste método se basa en la evolución del efecto que sustancias puras, combinadas, cuerposreceptores, efluentes, lixiviados y sedimentos pueden tener sobre la intensidad e la luzemitida por la bacteria Photobacterium phosphoreum en condiciones controladas deexposición.

NMX-AA-112-1995-SCFI7.- REACTIVOS Y MATERIALES.7.1. Reactivos y soluciones.7.1.1. Reactivos.7.1.1.1. Fenol (C 6 H 5 -OH)Compuesto con una pureza superior o igual a 99%.7.1.1.2. Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O)Compuesto con una pureza superior o igual a 99%7.1.1.3. Metanol (CH 3 OH)Grado plaguicida, para efectuar la extracción Soxhlet en la muestra testigo.7.1.1.4. Acetona (C 3 H 6 O)7.1.1.5. Acido nítico concentrado (HNO 3 )7.1.1.6. Agua destilada, o en su defecto, agua con pureza equivalente.7.1.1.7. Agua desionizada.7.1.1.8. Cloruro de sodio (NaCL)7.1.1.9. Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCL 2 .6H 2 O)7.1.1.10. Cloruro de estrocio hexahidratado (SrCL 2 .6H 2 O)7.1.1.11. Cloruro de potasio (KCL)7.1.1.12. Bromuro de potasio (KBr)7.1.1.13. Cloruro de calcio (CaCL 2 ) anhidro7.1.1.14. Sulfato de sodio decahidratado (NaSO 4 .10H 2 O)7.1.1.15. Bicarbonato de sodio (NaHCO 3 )7.1.1.16. Floruro de sodio (NaF)7.1.1.17. Acido borico (H 3 BO 3 )

NMX-AA-112-1995-SCFI7.1.2. Soluciones7.1.2.1. Medio de reconstitución.Reactivo de agua destilada o similar no tóxica a la bacteria Photobacterium phosphoreum.7.1.2.2. Medio de dilución para muestras de agua dulce.El mismo medio señalado en el inciso anterior agregado en una relación mas volumen(M/V) 2% de cloruro de sodio (NaCL).7.1.2.3. Medio de dilución para muestras de agua salina o salobre.El medio de dilución debe ser agua de mar artificial preparada según el inciso 7.1.2.6.7.1.2.4. Medio de dilución para fase sólida.Medio señalado en el inciso 7.1.2.1. con la adición de NaCL en una relación masa volumen(M/V) de 3,5%. En caso de muestras salinas o salobres, el medio de dilución es agua demar artificial preparada como se indica en el inciso 7.1.2.6.7.1.2.5. Solución de ajuste osmótico.Medio utilizado para el inciso 7.1.2.1. con la adición de NaCL en una relación masavolumen (M/V) de 22%.7.1.2.6. Agua de mar artificialSe prepara con agua destilada o desionizada de acuerdo con la tabla 2, con una salinidadaproximada de 35, (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.16).TABLA 2.- Reactivos utilizados en la preparación de agua de mar artificialSolución ASolución BSalesCantidad(g)SalesCantidad(g)NaCL 23,90 NaSO 4 .10H 2 O 9,06MgCL 2 .6H 2 O 10,83 NaHCO 3 0.02CaCL2 anhidro 1,15 NaF 0,003SrCL2.6H2O 0,004 H2BO3 0,0003KCL 0,682 Agua destilada 100 mlKBr 0,099Agua destilada 856

NMX-AA-112-1995-SCFILa solución B se adiciona lentamente a la solución A, agitando constantemente para lograruna mezcla homogénea. Después de 24h, filtrar la mezcla utilizando un filtro de membranade 0,45 µm.7.1.2.7. Agua marina.Libre de tóxicos, puede emplearse en sustitución de 7.1.2.6.7.2. Materiales.7.2.1. Material biológico.7.2.1.1. Photobacterium phosphoreumla suspensión bacteriana debe ser utilizada a una concentración aproximada de 1 X 10 8células/ml. Dado que los cultivos frescos son inherentemente variables, se debe utilizar uncultivo liofilizado con 2,0% de NaCL, 94% de sólidos de leche descremado y 4% debacterias. Estas se deben preservar en forma liofilizada en un congelador a una temperaturaentre –18ºC y –20ºC (bajo estas condiciones, el tiempo de caducidad de la bacteria es de unaño). Cuando se hidratan, las bacterias comienzan inmediatamente a emitir luz, y puedenser usadas en pruebas sin ningún tratamiento posterior. La cepa liofilizada aporta valoresconstantes de CE 50 para tóxicos de referencia (ver inciso 10.3.3.). si la cepa se preserva porotros métodos o se utilizan cultivos frescos, su respuesta a tóxicos de referencia puede serno reproducible (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.2).7.2.2. Otros materiales.7.2.2.1. Celdillas.Las celdillas de lectura deben ser compatibles con el luminómetro utilizado; tenercapacidad para un volumen total de 3000µL-5000µL; de vidrio borosilicato y descabales.7.2.2.2. Columnas filtradoras.Provista con un filtro de fibra de vidrio de 45µm. Utilizadas para extraer el sobrenadante delas muestras de sedimentos.7.2.2.3. Micropipetas.Deben tener doble fase de aire, y capacidad para extraer volúmenes de 1000µL, 500µL,250µL y 10µL.7.2.2.4. Puntas para micropipetas.Deben ser estériles, de polipropileno y desechables.

NMX-AA-112-1995-SCFI7.2.2.5 Soporte de celdillas.Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, treinta celdillas en baño derecirculación o sistema de control de temperatura. El soporte debe prevenir que las celdillasse sumerjan en agua (el exceso de agua en la parte externa de las celdillas puede interferircon la lectura de luz de cada celdilla), así como tener buena transferencia de calor yresistencia a la corrosión; éste es necesario cuando se utilice un luminómetro sin pozos deceldilla con temperatura controlada.7.2.2.6.Soporte de celdilla RDispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, una celdilla en baño derecirculación o sistema de control de temperatura a 5,5ºC. Este soporte puede sumergir a laceldilla en agua y debe ser resistente a la corrosión. Si la celdilla no está inmersa en agua,éste debe cumplir con las especificaciones del material del soporte de celdillas, descrito enel inciso anterior. El soporte de celdillas es necesario cuando se utiliza un luminómetro sinbloque de incubación con temperatura controlada.7.2.2.7.Soporte de tubos de ensaye.Dispositivo capaz de sostener en forma estable y vertical, al menos 30 tubos de ensayedescritos en el inciso 7.2.2.8., dentro del baño de recirculación o sistema de control detemperatura mencionado en el inciso 8.2. El material de construcción debe tener buenatransferencia de calor y resistencia a la corrosión dentro del sistema de recirculación ossistema de control de temperatura. Este soporte es necesario para realización de la pruebaen fase sólida.7.2.2.8. Tubos de ensayedesechables, de vidrio borosilicato o policarbonato, con capacidad de 15 ml y 20mm dediámetro. Limpios. Se utilizan para la prueba en fase sólida7.2.2.9. Equipo de seguridadGuantes, mascarillas, lentes de seguridad, botas de hule, etc.7.2.2.10. Recipientes de muestreode polietileno de alta densidad, de 50 ml y de 250mL (boca ancha), tapa o contratapa delmismo material.7.2.2.11 Sistema de extracción (de acuerdo a lo indicado en el apéndice B)De capacidad mínima de 250 mL.

NMX-AA-112-1995-SCFI7.2.2.12. Paraflim7.2.3. Lavado de materialTodo el material que se utilice en el muestro y análisis (excepto celdillas y puntas demicropipeta) debe llevarse según el método descrito a continuación:- Lavar con detergente y enjuagar dos veces con agua de la llave.- Enjuagar con acetona (C 3 H 6 O). Dejar secar completamente.- Enjuagar con ácido nítico (HNO 3 ) concentrado, eliminar el excedente. Enjuagarabundantemente con agua desionizada, escurrir y dejar secar.Una vez lavado, proteger el material de polvo y otros factores.8.- APARATOS.8.1. Luminómetro.Debe ser capaz de detectar la luz emitida por photobacterium phosphoreum, a una longitudde onda de 490nm.8.2. Baños de recirculación o sistemas de control de temperatura.Debe ser capaces de mantener una temperatura de 15º ± o,5ºC y 5,5ºC ± 0,5ºC.Los 3 equipos descritos pueden ser individuales o estar integrados en un sistemaautomatizado.8.3. CongeladorDebe ser capaz de mantener una temperatura de –20ºC ± 2ºC.8.4. RefrigeradorDebe ser capaz de mantener una temperatura de 4ºC ± 2ºC.8.5 Parrilla magnética.Debe ser capaz de tener agitación continua durante 48h.

NMX-AA-112-1995-SCFI8.6. Parrilla de calentamiento para el sistema de extracción (ver Apéndice B)Debe ser capaz de mantener una temperatura entre 70ºC y 80ºC.8.7. Centrífuga clínica o equivalente.Debe ser capaz de separar la fase sólida de la líquida.8.8. Medidor de pH.El pH de las muestras se determina de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-008, (ver 2Referencias).8.9. TernómetroLa temperatura se determina de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-AA-007, (ver 2Referencias).8.10. Salinómetro.Utilizado para determinar la salinidad de las muestras marinas y salobres.8.11. Oxímetro.Para determinar el oxígeno disuelto de las muestras en campo.8.12. Horno de secado o equivalenteDebe ser capaz de mantener una temperatura de 100ºC.8.13. Balanza analítica.Con sensibilidad mínima de 1mg.9 PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS.9.1. Preparación.En general, el contenido de salas de la muestra y del medio de dilución durante el análisis,debe ser de 2,0% (M/V) como cloruro de sodio (NaCL) para muestras de agua dulce y de3,5% (M/V) para muestras de agua salobre y marina.

NMX-AA-112-1995-SCFI9.1.1. Preparación de muestras de agua dulceel contenido de sales de las muestras debe ajustarse a 2,0% de cloruro de sodio (NaCL)previo al análisis, lo cual es necesario par evitar la pérdida de bioluminiscencia de labacteria debida al choque osmótico. Este ajuste se logra adicionando la cantidad adecuadade solución de ajuste osmótico descrita en el inciso 7.1.2.5. (1 parte de solución por 10partes de muestra). Por ejemplo, supóngase que se tienen una muestra e agua dulce (0% deNaCL), se debe agregar 2,5ml de muestra y 0,25ml de solución de ajuste osmótico; o bien,adicionar NaCL sólido a la muestra (0,2g en 9,8ml de muestra).9.1.2. Preparación de muestras de agua salubre.La salinidad de las muestras debe determinarse antes de ser analizadas, Si el contenido desales está por debajo del 2,0%, debe ajustarse a este valor adicionado NaCL. Si elcontenido de sales es mayor a 2,0%, se debe adicionar NaCL al medio de dilución hastaigualar la salinidad de la muestra.9.1.3. Preparación de muestras de agua marina.El contenido de sales de las muestras es aproximadamente de 3,5%, por lo tanto, no serequiere ajuste osmótico. El diluyente de prueba debe ser agua de mar artificial o agua demar carente de contaminación (ver incisos 7.1.2.6. y 7.1.2.7).9.1.4. Preparación de muestras de agua interstical de sedimentos.Centrifugar el sedimento de cada muestra par separar la fase sólida de la fase líquida.Decantar cuidadosamente la fase líquida y emplearla par su preparación de acuerdo a losincisos 9.1.1., 9.1.2. y 9.1.3, según su procedencia.- En muestras de sedimento de sistemas de agua dulce, se debe hacer la preparacióndescrita en el inciso 9.1.1.- En muestras de sedimento de sistemas de agua dulce salubre, se debe hacer lapreparación descrita en el inciso 9.1.2.- En muestras de sedimento de sistemas de agua marina, se debe realizar lapreparación descrita en el inciso 9.1.3.

NMX-AA-112-1995-SCFI9.1.5. Preparación de extractos acuosos de sedimentos.Homogeneizar la muestra de sedimento colectada, mezclar con el tipo de agua quecorresponda al origen de la muestra en una relación 1:4 (M/V) utilizando un matrazErlenmeyer. Agitar vigorosamente durante 60min en una parrilla magnética. Centrifugar lamezcla de 10 00r/min hasta obtener una separación completa de las dos fases. Utilizar elsobrenadante para el análisis.9.1.6. Preparación muestra de sedimento para la prueba de fase sólida.9.1.6.1. Muestra problema.Proceder a mezclar la muestra hasta homogeneizarla. Si es necesario, centrifugar a unavelocidad adecuada para separar la fase sólida de la líquida. Psoteriormente eliminar elsobrenadante.9.1.6.2. Muestra testigo.Efectuar una extracción (ver Apéndice B) exhaustiva (de 4h a 5h) empleando metanol,grado, grado plaguicidad. Recuperar el sedimento y evaporar el metanol remanente atemperatura ambiente, o utilizando un horno de secado a 40ºC.Para la muestra problema y testigo (ver incisos 9.1.6.1. y 9.1.6.2.), determinar la masa de0,3g de sedimento o fase sólida en tubo de ensaye, agregar 3,000µl de medio de diluciónpara fase sólida, preparado según el inciso 7.1.2.4. para efectos de cálculo, considerarúnicamente la masa seca de la muestra.9.1.7. Preparación de la bacteria y desarrollo de la prueba.(ver figura 1, número 3)Sacar un frasco de bacteria liofilizada del congelador; de inmediato, vaciar en él, el mediode reconstitución contenida en la celdilla R (mantenida a 5,5ºC) y suspender. Estasacciones deben efectuarse rápidamente para evitar un efecto de choque osmótico a lasbacterias. Transferir la mezcla nuevamente a la celdilla R (ahora RB), y continuar suincubación a 5,5ºC. Mezclar el contenido de dicha celdilla con una micropipeta. Estoimplica la aspiración y eyección de la mezcla en la celdilla; repetir el mismo proceso 20veces.9.2. Acondicionamiento.Las muestras de agua, lixiviados y sedimentos se almacenan dependiendo del tiempo entrela toma y el inicio del análisis, es decir:

NMX-AA-112-1995-SCFISi el análisis de la muestras se realiza dentro de las primeras 48h, se deben almacenar a 4ºC± 2ºC, en los recipientes indicados en 7.2.2.10; deben ser llenados completamente, evitandodejar espacio entre la muestra y el tapón. Si el análisis se realiza después de 48h y hasta 12días posteriores a la fecha de colecta, la temperatura de conservación debe ser de –10ºCLas muestras deben ser preservadas sin la adición de producto químico alguno.Antes de iniciar el análisis, las muestras deben ser descongeladas a temperatura ambiente;posteriormente, agitar para lograr la homogeneización, sin abrir el recipiente y dejar reposar30min para alcanzar el equilibrio.Si el análisis se realiza después de 48h, se debe reportar el tiempo transcurrido entre lacolecta y el análisis.Las muestras preservadas pro más de 12 días no son válidas para realizar pruebas detoxicidad.El tiempo cero, en una muestra compuesta, es el momento de la toma de la última colectasimple o instantánea.El tiempo final, es el momento en el que las bacterias reconstituidas entran en contacto conla muestra.10.- PROCEDIMIENTO.La prueba de toxicidad aguda con photobacterium phosphoreum se realiza por duplicadoutilizando cuatro diluciones (90%, 45%, 22,5 %, 11,25%), y un control por réplica.10.1. Procedimiento para efectuar el análisis en muestras de agua dulce, salobre, marina,lixiviados, agua interstical y extractos acuosas de sedimento, (ver figura 1)10.1.1. Estabilizar el baño de recirculación o sistema automatizado a 15ºC ± 0,5ºC duranteel análisis.10.2.2. Colocar 5 celdillas (de la A1 a la A5) en los pozos de incubación del luminómetro oen el soporte de celdillas en el baño de recirculación o sistema de control de temperatura a15ºC ± 0,5ºC.10.1.3. Colocar 5 celdillas ® en el pozo de incubación del luminómetro o en el soporte deceldillas en un baño de recirculación o sistemas de control de temperatura a 5,5ºC.10.1.4. Agregar a la celdilla R, la cantidad apropiada de medio de reconstitución paraalcanzar una densidad bacteriana de 1 X 10 8 células/ml.

NMX-AA-112-1995-SCFI1.-Preparación de la muestra.FIGURA1. Procedimiento para efectuar el análisis en muestras de agua dulce, salobre,marina, agua interstical, lixiviados y extracto acuoso de sedimentos

NMX-AA-112-1995-SCFI10.1.5. Para muestras líquidas, intersticiales y extractos acuoso de sedimentos provenientesde sistemas de agua dulce y lixiviados. Agregar 1 000µl del medio de dilución (ver inciso9.1.1) a las celdillas A1, A2, A3 Y A4 indicadas en 10.1.2.10.1.6. Para muestras líquidas, intersticiales y extractos acuosos de sedimentos,provenientes de sistemas de agua salobre o marinos y lixiviados. En caso de muestrassalobres, adicionar 1 00µl a la celdillas A1, A2, A3 y A4 del medio de dilución quecorresponda de acuerdo al inciso 9.1.2. en caso de muestras de agua marina, utilizar comodiluyente agua de mar artificial o marina.10.1.7. Agregar 2 750 µl de la muestra preparada según los incisos 9.1.1, 9.1.2. y 9.1.3.para muestras de agua dulce, salobre y marina respectivamente, a la celdilla A5.10.1.7.1. Efectuar una serie de 3 diluciones partiendo de la celdilla A5 y finalizandoen A2, en un patrón de dilución 1:2, obteniéndose las concentraciones al 90%, 45%, 22,5%y 11,25%, que se preparan transfiriendo volúmenes de 1 000µL a cada celdilla.Posteriormente desechar de A2 1 000µL y 750 µL de A5 para uniformizar volúmenes. Laceldilla A1 contienen sólo medio de dilución y es considerada control (ver figura 1 número2).10.1.8. En el caso de que los límites de confianza se localicen fuera de ± 15% del valor deCE 50 obtenido (considerando un 95% de confiabilidad estadística), se debe repetir la pruebapara obtener mayor precisión. Con la misma finalidad, también se puede elaborar una seriecon un mayor número de diluciones utilizando factores como: 1:1,2 ó 1:1,25 ó 1:1,33.Para su elaboración se debe emplear un factor de dilución menor a 2, como puede ser: 1:1,2ó 1:1,25 ó 1:1,33.10.1.9. Adicionar con una micropipeta 10 µL de suspensión bacteriana (celdilla RB) a cadauna de las celdillas de prueba (de la A1 a la A5) y agitar ligeramente para asegurar sucorrecta distribución en la solución.Inmediatamente poner en funcionamiento el cronómetro ajustado para indicar el tiempo alos 5min y 15min.10.1.10. Calibración del luminómetro.Al sonar la primera alarma (5min), colocar la celdilla A1 (control) en el luminómetro ycalibrar la lectura al 90% de la escala; posteriormente, registrar las lecturas de las celdillasA1 a la A5.10.1.11. Realizar el procedimiento por duplicado de los incisos: 10.1.2. 10.1.5,10.1.6., 10.1.7, 10.1.7.1, 10.1.9 y 10.1.1.10.

NMX-AA-112-1995-SCFI10.2. Prueba de fase sólida o sedimentos.La técnica para fase sólida o sedimentos.La técnica para fase sólida permita la medición del efecto de tóxicos fuertemente adheridosa partículas sólidas en suelos y sedimentos. Este procedimiento permite el contacto de labacteria con el complejo tóxico-partícula sólida.Este procedimiento debe utilizarse en esta norma como una forma preliminar de evaluaciónde sedimentos, ya que el contacto de la partícula sólida con la bacteria siempre ocasionareducción en la luminiscencia detectada aún cuando el sedimento no contenga tóxicos(respuesta falso positiva).Algunos de los factores que pueden producir este efecto son:- Adsorción de las bacterias a las partículas sólidas.- Efectos de sombra de las partículas en suspensión sobre la detección debioluminiscencia.- Floculación bacteriana.Por lo anterior, es necesario preparar una muestra testigo para cada muestra problema, deacuerdo al inciso 9.1.6.10.2.1. Procedimiento10.2.1.1. Preparación de la celdilla Rproceder conforme a los incisos 10.1.3. y 10.1.4.10.2.1.2. Desarrollo de la prueba (ver figura 2)este procedimiento debe realizarse tanto para la muestra problema como para la muestratestigo.Introducir 15 tubos de ensaye (denominados a1, b1 a b5 y c1 a c5) para fase sólida en elsoporte de tubos de ensaye y colocarlos en la incubadora con baño de recirculación a 15ºC;agregar 1 500µL de medio de dilución para fase sólida (ver inciso 7.1.2.4.) en cada uno delos tubos, excepto en el tubo c5.Colocar en el tubo c5 la muestra preparada de acuerdo al inciso 9.1.6. cubrir con parafilm yagitar hasta obtener una suspensión homogénea (ver figura 2, paso 1).

NMX-AA-112-1995-SCFIUtilizar una pipeta de 1000µL a 5 000µL para mezclar y resuspender el contenido del tuboc5 llenando y vaciando la pipeta de 5 a 6 veces; mientras los sólidos están en suspensióntransferir 1 500µL de éste al tubo c44; mezclar éste último. Transferir 1 500 µL del tubo c4al c3, mezclar éste y repetir la operación hasta llegar al tubo a4.Posteriormente, descartar 1 500µL del tubo a4 para igualar volúmenes. Los tubos a1, a2 ya3 son controles. Esperar 10 min para alcanzar la uniformidad térmica (ver figura 2, Paso 2)Proceder conforme a lo indicado en el inciso 10.1.9.Poner en marcha un cronómetro de cuenta regresiva ajustado a 20 min, inmediatamenteagregar 20µL de la suspensión bacteriana a cada uno de los 15 tubos en dirección a1 a a5,b1 ab5 y c1 a c5. Mezclar la muestra de cada tubo con una pipeta de 1 000 µL a 5 ... µL,succionando y vaciando ésta de 5 a 6 veces. Tres minutos antes de que termine la cuentaregresiva, insertar las columnas filtradoras en cada uno de los tubos, cuidando de que éstasno toquen el sobrenadante.Una vez transcurridos los 20min, empujar suavemente las columnas en la muestra,debiéndose detener antes de llegar al nivel superior de los sólidos sedimentados;posteriormente, transferir 500µL del filtrado de la columna a la celdilla correspondiente enel sopor te de celdillas, en la misma dirección indicada en el inciso anterior, ajustar elcronómetro al tiempo de prueba (5min). Tiempo total de exposición: 25min (ver figura 2,paso 3)Proceder según el inciso 10.1.10 con la celdilla A1 del soporte de celdillas.

NMX-AA-112-1995-SCFIFIGURA 2.- Procedimiento para preparar muestras de fase sólida o sedimentos.

NMX-AA-112-1995-SCFIAl sonar la alarma, colocar la celdilla A1, referida como control, en el luminometro ycalibrar la lectura al 90%, posteriormente registrar las lecturas de las celdillas a1 a la c5.10.2.2. Para el caso de muestras extremadamente tóxicas, tanto de agua como de sedimento,en las cuales no sea factible detectar bioluminiscencia, es indispensable preparar todas lasdiluciones necesarias, de acuerdo al inciso 10.2.3, para obtener el valor de CE 50 consultar elcapítulo 11 de esta norma.10.2.3. Preparación de diluciones.Cualquier tren de diluciones puede funcionar; sin embargo, diluciones 1:10 son fáciles deefectuar. Par un volumen no mayor de las celdillas requeridas, se deben utilizar 250 µL demuestra y 2 250µL de medio de dilución para un volumen total de 2,5 µL. En caso derequerir diluciones mayores, preparar diluciones 1:1’’ y/ó 1:1 000.Para la obtención del resultado, se debe considerar el factor de dilución utilizado.10.3. Evaluación de sensibilidad.El laboratorio que realice pruebas de toxicidad como photobacterium phosphoreum debevalidar la sensibilidad del organismo utilizando cualquiera de los 2 tóxicos de referenciaseñalados en los incisos 10.3.3.1. y 10.3.3.2. de esta norma. Esto se debe llevar a cabo encuando se presente alguno de los siguientes casos:- Se observen anomalías en la respuesta.- Se inicie el uso de un lote de bacterias.- Se inicie el análisis de un lote de muestras.10.3.1. Los tóxicos de referencia deben tener como principales características la siguientes:- Amplio espectro tóxico.- Facilidad de obtención en forma pura- Alta solubilidad en agua- Persistencia y estabilidad en solución- Estabilidad en almacenamiento- Facilidad de cuantificación.10.3.2. La sensibilidad de Photobacterium phosphoreum se evalúa mediante ladeterminación de la CE 50 , empleando concentraciones establecidas de alguno de los tóxicosde referencia sugeridos: fenol (C 6 H 5 -0H) y sulfato de zinc (ZnSO 4 ). El método y lascondiciones de prueba, deben ser los descritos en la presente norma, de acuerdo al inciso10.1.

NMX-AA-112-1995-SCFI10.3.3. Tóxicos de referencia10.3.3.1. Fenol (C 6 H 5 -OH)La CE50 que presenta este compuesto para Photobacterium phosphoreum se encuentraentre 13mg/L y 26mg/L a un tiempo de exposición de 5 min. Este tóxico produce un efectoclaro y rápido.La solución patrón de fenol se prepara a una concentración de 100mg/L y se conserva en unfrasco ámbar a 4ºC ± 2ºC de 3 meses a 4 meses.Realizar el análisis con el estándar de fenol con lecturas a tiempos de 5min y 10min.10.3.3.2. Sulfato de zinc (ZNSO 4 )La CE 50 que presenta este compuesto para Photobacterium phosphoreum se encuentra entre5mg/L y 12mg/L, a un tiempo de exposición de 10min.La solución patrón de sulfato de zinc (ZNSO 4 ) se prepara a una concentración de 100mg/Ly se conserva en un frasco ámbar a 4ºC ± 2ºC de 3 meses a 4 meses.10.3. Los valores de CE 50 determinados experimentalmente para los tóxicos de referencia,deben quedar dentro de los intervalos mencionados, en caso contrario, se tienenelementos para suponer cualquiera de las siguientes posibilidades:- Condiciones inadecuadas de almacenamiento de la bacteria liofilizada, siendo lasprincipales, tiempo y temperatura.- Reconstitución inadecuada de la bacteria.- Uso de la bacteria después de 2h de haber sido reconstituida.- Posible contaminación de alguno de los reactivos o materiales utilizados en elensayo.- Falta de pericia del analista.10.5. Los tóxicos de referencia usados en esta norma pueden ser sustituidos por cualquierotro, siempre y cuando cumplan con las características señaladas en el inciso 10.3.1.

NMX-AA-112-1995-SCFI11.- EXPRESION DE RESULTADOS.Al término de la prueba, la CE 50 , debe obtenerse mediante los siguientes cálculos:11.1. Cálculo del valor de Gamma ( r ) para cada concentración.dondert=Itc/It) - 1rt es la Gamma al tiempo de incubación (t)Itc es el nivel de luz (I) al tiempo de incubación (t) del control (c)It es el nivel de luz (I) al tiempo de incubación (t) para cada concentración de lamuestra.11.2. Graficar las Gammas contra la concentración de la muestra en papel para gráficasLog-Log (ver figura 3); interpolar a valor de Gamma igual a 1 para obtener la CE 5011.3. El procedimiento de fase sólida, se expresa a partir de la siguiente relación:CE 50R = CE 50M – CE 50TSiempre que: CE 50M > CE 50TDonde:CE 50R es igual a la CE 50 real obtenida para análisis en sedimentos;CE 50M es igual a la CE 50 de la muestra problema;CE 50T es igual a la CE 50 de la muestra testigo.

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NMX-AA-112-1995-SCFI12. INFORME DE LA PRUEBA.El informe de la prueba incluye especificar los siguientes puntos:12.1. Localización de la cuenca hidrológica.12.2. Nombre del cuerpo de agua receptor.12.3. Datos de afluentes como sigue:a) Si es efluente industrial, indicar los siguientes datos de la empresa: razón socia,dirección, teléfono, que produce o fabrica, que materias primas utiliza, horario deoperación.b) Si es efluente urbano o municipal, indicar los siguientes datos: localización, nombrede la ciudad o municipio.c) Si es efluente agrícola, indicar lo siguiente datos: localización, tipo(s) de cultivo(s) yen su caso, que fertilizante(s) se utiliza (n).d) Si es efluente urbano o municipal, indicar los siguientes datos: localización, nombrede la ciudad o municipioPara los casos descritos en b), c) y d), además se debe especificar lo siguiente:- Caudal promedio (m3/día); caudal promedio durante el muestro (m3/s); en caso decontar con sistemas de tratamiento, breve descripción del mismo; localización de puntos (s)de muestreo seleccionado (s); método de colecta usado; fecha, período y horario de colecta;tiempo transcurrido entre la última toma de muestras(s) y el inicio del análisis; temperaturade la(s) muestra(s) al recibirse en el laboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones encampo; responsable(s) del muestreo.12.4. En el caso de pruebas en cuerpos receptores, se debe indicar lo siguiente:Localización de punto(s) de muestreo; método de colecta usado; fecha, período y horario decolecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) al recibirse en ellaboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo; responsables (s) del muestreo.12.5. En el caso de pruebas en sedimento, se debe indicar:Profundidad; método utilizado para muestrear; tipo de sedimento aparente (limoso, rocoso,arenoso y cualquier otro); observaciones de campo; responsables (s) del muestreo.12.6. En el caso de pruebas de lixiviados, se debe indicar:Razón social de la empresa; dirección; teléfono; que tipo(s) de residuo(s) se dispone(n);horario de colecta de las muestras.12.7.Datos a registrar durante la prueba de toxicidad:Forma de almacenamiento y preservación de la(s) muestra(s); fecha del análisis; tipo deprueba realizada (en efluentes, cuerpos de agua, lixiviados y/o sedientos); datos

NMX-AA-112-1995-SCFIfisicoquímicos, en caso de análisis de agua, al inicio del análisis (pH, oxígeno disuelto ysalinidad) y características aparentes (olor, color, turbiedad, presencia o ausencia deburbujas y espuma); registro de lectura al ajustar el luminómetro con celdilla control,Lectura al ajustar el luminómetro con celdilla control; lectura de emisión de luz de labacteria en datos las celdillas de prueba a los tiempos de lectura establecidos; lectura deemisión de luz en las celdillas a los 5 min y 15min; cálculo del valor de Gamma ( r ) paracada concentración; cálculo de la CE 50 ; responsable(s) prueba(s) de toxicidad.Si los análisis son par fase sólida, indicar:12.7.1. Registro de lectura al ajustar el luminómetro con celdilla A1Lectura de emisión en las celdillas restantes y valores de EE 50M y CE 50T12.8.Análisis de resultados.Se deben dar las tablas y gráficas derivadas de la prueba de toxicidad, proveer los valoresde CE 50 de las pruebas de toxicidad con sus respectivos límites de confianza al 95%, asícomo las unidades de toxicidad obtenidas y método estadístico utilizado; discusión deresultados.12.9.Datos adicionales:Indicar lo tóxico de referencia utilizado en la prueba de sensibilidad, CE 50 obtenida y fechade realización; responsables(s) de la realización de la prueba.12.10. Conclusiones y recomendaciones.12.11. Si se contrata a una empresa consultora, laboratorio o cualquier otro, que lleve acabo los análisis, indicar razón social, representante lega, dirección y teléfono.13.- BIBLIOGRAFIA.13.1. APHA, AWWA, WPCF, 1989. Standard Methods for the examination of water andWastewater. (Métodos para el análisis de agua y de aguas residuales) AmericanPublic health Association, Port City Press, Baltimore, Maryland, E.U.A. 10-200 p.±láminas.13.2. Bulich, A.A. 1979. Use of luminescent Bacteria for Determining Toxicity inAquatic Evironments. (Utilización de la bacteria luminiscente para la determinaciónde la toxicidad en ambientes acuáticos) aquatic toxicology. ASTM STP 667, L.L.Marking and R.A. Kimerle, Eds., American Society for Testing and Materials. 98-106 pp.

NMX-AA-112-1995-SCFI13.3. Bulinc, A.A. 1990. The Luminescent Bacteria Toxicity Test: its Potential as an inVitro Alternative. (Prueba de toxicidad de la bacteria Luminiscente: su potencialcomo una alternativa in Vitro) Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence5: 71-71.13.4. Burton, S.a. and R. Dabbah. 1989 The Bacterial Bioluminescence Test: AnAlternative Test to Compendial In Vitro Biological Reactivity Tests and a PotentialTest for Comparative Biological Reactivity of Bulk Pharmaceutucal Chemicals.(Prueba de toxicdad de la bacteria bioluminiscente; una alternativa para lacompresión de las pruebas de reactividad biológica in Vitro, así como para lacomparación de la reactividad biológica de la mayor parte de los químicosfarmacéuticos) Pharmacop. Forum, 15(1): 4812-4814.13.5. CETESB, 1991. Bioensaio de Toxicidade Aguda comPhotobacterium phosphoreum.Sistema Microtox. Método de ensayo. (Bioensayo de toxicidad aguda conPhotobacterium phosphoreum. Sistema Microtox. Método de ensayo) Sao Paulo,SP. Brasil s.p.13.6. CETESB, 1991. Procedimientos para utulizacao de testes de toxicidade no controlede efluentes líquidos. (Procedimientos para la utilización de pruebas de toxicidad enel control de efluentes, líquidos) Serie Manuais. Sao Paulo, SP. Brasil, 17p.13.7. CETESB, 1991. Implementacao de testes de toxicidade no controle de efluenteslíquidos. (Implementación de pruebas de toxicidad en el control de efluenteslíquidos) Serie Manuais. Sao Paulo, SP. Brasil, 7p13.8. Environment Canadá, 1992. Biological Test Method: Toxicity Test UsingLuminescent Bacteria Photobacterium phosphoreum. (Método de prueba biológica:Prueba de toxicidad utulizando la bacteria Luminiscente PhotobacteriumPhosporeum) EPS 1/RM/24. 61p.13.9. Danilov, V.S., A. D. Ismailov and N. A. Baranova. 1985. The inhibition of bacterialbioluminescence by xenobiotics. (Inhibición de la bioluminiscencia bacteriana porxenobióticos). Xenobiotica. Vol. 15 (4):271-276.13.10. Dezwart, D. And W. Slooff. 1983 The Microtox as an Alternative Assay in theAcute Tocity Assessment of Water Pollutants. (el Micotox como un ensayoalternativo del análisi de toxicidad aguda de contmainantes de agua). Aquatic.Toxicol. 4:129-138 pp.13.11. DIN 38 412 Parte 34: Determination of the inhibitory effect of waster water on thelight emission of Photobacterium phosphoreum. (Test using preserved luminiscentbacteria) (Determinación del efecto inhibitorio de las aguas residuales sobre laemisión de luz de Photobacterium phosphoreum.-Prueba que utiliza una bacteriaLuminiscente liofilizada)

NMX-AA-112-1995-SCFI13.12. Dutka, B. J., G. Bitton. 1986. Toxicity Testing Using Microorganisms. (Pruebas detoxicidad utilizando microorganismos) Vol. II. CRC Press, Inc. Florida . 202 p.13.13. EPA, 1991. Mhetods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and ReceivingWaters to Freshwater and Marine Organisms. (Método par medir la toxicidad agudade efluentes y aguas receptoras con organismos marinos y dulceacuícolos)EPA/600/4-90/027.13.14. EPS, 1990. Guidance Document on Control of Toxicity Tests Precision UsingReference Toxicants. (Guía para el control de la precisión en la prueba de toxicidadutilizando tóxicos de referencia) Report EPS 1/RM/12 Canadá.13.15. Greene, J.C., W.E. Miller, M.K. Debacon, M. A. Long and C. L. Bartels, 1985. AComparison of Three Microbial Assay Procedures for Measuring Toxicity ofChemical Residues. (una comparación de tres procedimientos de ensayosmicrobionos para la evaluación de la toxicidad de residuos químicos). Arch.Environ. Contam. Toxicol., 14:659-667.13.16. Kinne, o. 1971 Marine Ecology. (Ecología Marina). Volumen 1 EnvironmentalFactores Part. 2. Wiley Interscience. New Tork13.17. Mallak, F.P. and R. L. Brunker. 1983 Determination of the Toxicity of SelectedMetalworking Fluid Preservatives by Use of the Microtox System and an In-VitroEnzyme Assay. (Determinación de la toxicidad de preservativos selectos de fluidosde acabados metálicos) In B. J. Dutka and D. Liu (ed.), Toxicity screeningprocedures using bacterial systems. Toxicity Series, Vol. 1. Marcel Dekkar, NewYork. 65-76 pp.13.18. McFeters, G.A., P. J. Bond, S. B. Olson and y. T. Tchan, 1983. A Comparison ofMicrobial Bioassays for the Detection of Aquatic Toxicants. (comparación de losbioensayos microbianos para la detección de tóxicos en el agua) Water Res., 17(12): 1757-1762.13.19. O`Brien, T.A. and G.J. Bacher. 1990. Toxicity of Industrial and Domestic ComplexEffluents to three Australian Freshwater Orgamisms and the Microtox Bacteria.Aquatic Biology Sectio, Frescwater Fisheries Management Branch, Arthur RylahInstitute, Fisheries Division, department of Conservation Forests and Lands.13.20. Pielou, E.C. 1969. An Introduction to Mathematical ecology. (Introducción a laEcología matemática) wiley Intersciencies John Wiley and Sons, New Tork.13.21. SARH. 1992. Ley de Aguas Nacionales. Publicada en el Diario Oficial de laFederación del 1 de diciembre de 1992.13.22. SEDUE. 1988. Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente.Publicada en el Diario Oficial de la Federación del 28 de enero de 1988.

NMX-AA-112-1995-SCFI13.23. Stephan, C.E., 1977 Methods for calculation an LC 50. (Métodos para el cálculo de laCL 50 ) In: Mayer y J.L. Hamelind, (Eds.), Aquatic Toxicology and hazardEvaluation, ASTM STP 634, American Society for Testing and Materials,Philadelphia, Pennsylvania: 65-84 pp.14.- CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES.Esta norma no concuerda con ninguna norma internacional por no existir referencia algunaal momento de su elaboración. (ver Apéndice a).APENDICE A INFORMATIVO.Cabe señalar que para la elaboración de la presente Norma Mexicana, se llevó a cabotomando como base investigación realizada a nivel nacional y con información consultadade normas extranjeras.APENDICE B INFORMATIVOEl sistema de extracción utilizado puede ser el Soxhlet o equivalente.MÉXICO, D.F. A 6 marzo.1996LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS.LIC. MA. EUGENIA BRACHO GONZALEZ.

SECRETARIA DE COMERCIOYFOMENTO INDUSTRIALNORMA MEXICANANMX-AA-110-1995-SCFIANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CONArtemia franciscana Kellogg (CRUSTACEA – ANOSTRACA) –METODO DE PRUEBA.WATER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Artemiafranciscana Kellogg (CRUSTACEA-ANOSTRACA) – TEST METHOD.DIRECCION GENERAL DE NORMAS

NMX-AA-110-1995-SCFIPREFACIOEn la elaboración de la presente Norma Mexicana, participaron las siguientes empresas einstituciones:- ASESORIA Y CONSULTORIA ECOLOGICA – REMMSA- ASOCIACION NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUIMICA- BACTON DICKINSON DE MEXICO.- CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE CELULOSA Y PAPEL- EMPRESA PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION DEL AGUA ENLA ZONA DE CIVAC.- F.J. SALCEDO Y COMPAÑÍA- INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO- INSTITUTO POLITECNICO NACIONALCentro de Investigación y de Estudios Avanzados;Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.- INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC- JUNTA MUNICIPAL DE AGUA Y SANAMIENTO DE CIUDAD JUAREZCHIHUAHUA.- SECRETARIA DE MARINADirección General de Oceanografía Naval- SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA.Comisión Nacional de Agua;Dirección General de Acuacultura.Instituto Mexicano de Tecnología del Agua;Instituto Nacional de Ecología,Instituto Nacional de la Pesca.- UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO.

NMX-AA-110-1995-SCFIINDICE DEL CONTENIDONúm. del Capítulo1. Objetivo2. Campo de aplicación3. Referencias4. Definiciones5. Muestreo6. Principio7. Reactivos y materiales8. Aparatos y/o instrumentos9. Preparación y acondicionamiento de las muestras.10. Procedimiento11. Expresión de los resultados12. Informe de la prueba13. Bibliografía14. Concordancia con normas internacionales.Apéndice (informativo)

NMX-AA-110-1995-SCFIANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON Artemiafranciscana Kellogg (CRUSTACEA – ANOSTRACA) – METODO DE PRUEBA.WATER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Artemia franciscanaKellogg (CRUSTACEA-ANOSTRACA) – TEST METHOD.1 OBJETIVOEsta Norma Mexicana establece el método biológico para la evaluación d la calidad delagua mediante pruebas de toxicidad aguda utilizando Artemia franciscana.2 CAMPO DE APLICACIONEsta Norma Mexicana es aplicable para la evaluación de toxicidad aguda en cuerpos deagua salobres y marinos, así como aguas residuales industriales, municipales y agrícolas,lixiviados, sustancias puras o combinadas y extractos acuosos con salinidades mayores adiez.3. REFERENCIAS.NMX-AA-007NMX-AA-008Aguas – Determinación de la temperatura.Aguas – Determinación del pHNMX-AA-087-SCFI Análisis de agua – Evaluación de toxicidad aguda con Daphniamagna. Straus (Crustacea-Cladocera) – Método de prueba.NOM-053-ECOLQue establece el procedimiento para llevar a cabo la prueba deextracción para determinar los constituyentes que hacen de unresiduo peligroso por su toxicidad al ambiente.4 DEFINICIONESPara los propósitos de esta norma, se establecen las siguientes definiciones:4.1. Agua de mar artificialEs el agua preparada en laboratorio que presenta características fisicoquímicas similares alagua marina.

NMX-AA-110-1995-SCFI4.2. Artemia franciscana (Kellogg, 1906)Organismo planctónico que en promedio mide de 8 mm a 12 mm de longitud en etapaadulta y 35 µm en la etapa naupliar. Con 42 cromosomas, de 1 a 3 cromocentro, diploides,furca con dos lóbulos, con varias setes y constricción basal. Presenta dimorfismo sexual: elmacho tienen penes con espina; su segundo par de antenas bien desarrolladas, funcionacomo órgano présil para retener a la hembra; en cada antena lleva una protuberanciasemiesférica; la hembra tiene un saco ovígero en la parte ventral, el cual, visto lateralmente,es puntiagudo. Generalmente habita en aguas salobres e hipersalinas, cuya concentraciónvaría desde 5 g/L hasta 150 g/L. Es una especie originaria del continente americano, (verfigura 1).FIGURA 1.- Artemia franciscana.4.3. Clase crustáceaCategoría taxonómica que agrupa a los organismos mandibulados, los cuales presentanexoesqueleto quitinoso con sales calcáreas, por lo que el caparazón a veces es muy duro.Tiene dos pares de apéndices prebucales que constituyen el primero y segundo par deantenas; al primer par también se le conoce como aténulas. El segundo par, aunque seencuentra antes de la boca, en su origen es postoral. Después de la boca, los crustáceosposeen numerosos pares de apéndices. Con excepción del primer par de antenas, todos losapéndices derivan de apéndices birramios. Durante su desarrollo, en general, presentanmetamorfosis y un estado larval llamado “nauplio” (ver inciso 4.12) de tipo muy primitivo.

NMX-AA-110-1995-SCFI4.4. Concentración letal media (Cl 50 )Es la concentración de una sustancia (pura o combinada) o efluente, que en una prueba detoxicidad aguda, provoca un efecto letal en 50% de los organismos expuestos durante untiempo determinado.4.5. Cuerpos de agua.Son los mares, lagos, lagunas costeras, estuarios, acuíferos, ríos y sus efluentes directos oindirectos, permanentes o intermitentes, presas, cuencas, cauces, canales, embalses,cenotes, manantiales, y demás depósitos o corrientes de agua y redes colectoras, conexcepción de los sistemas de drenajes y alcantarillado urbano y municipal.4.6. Cuerpos receptores.Son todos los mencionados en el inciso 4.5. que reciban directa o indirectamente descargas.4.7. Descarga.Aguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua o sistemade drenaje y alcantarillado urbano o municipal, incluyéndose los procesos de infiltración einyección.4.8. Efluente.Es el agua u otro líquido que procede de un embolse, cuenca, proceso o planta detratamiento.4.9. Inmovilidad.Es la incapacidad de los nauplios (ver inciso 4.12) para presentar algún movimientoapendicular, después de 10s de observación mediante la utilización de un microscopioestereoscópico. Este criterio se emplea en esta norma como un indicador de mortalidad delos organismos.4.10. Lixiviado.Es el líquido proveniente de los residuos, el cual se forma por reacción, arrastre operculación y que contiene, disueltos o en suspensión, componentes que se encuentran enlos mismos residuos.4.11. Muestra simple o instantánea.Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar unvolumen proporcional al caudal, de manera que éste resulte representativo de la descarga deaguas residuales, medido en el sitio y en el momento del muestreo.

NMX-AA-110-1995-SCFI4.12. Nauplio.Es la primera etapa de desarrollo de un crustáceo y abarca desde que emerge del huevohasta la primera muda. El nauplio recién nacido tiene forma ovoide, mide en promedio 350µm de longitud; su cuerpo muestra tres segmentos cefálicos y una región post mandibularno segmentada, un ojo naupliar y labrum amplio, debajo del cual se encuentra la boca. Enel primer segmento cefálico lleva un par de antenas llamadas anténulas, colocadas una acada lado del ojo naupliar; en el segundo segmento cefálico se ubica el segundo par deantenas que son apéndices birramios y funcionan como las primeras estructuras delocomoción; el tercer segmento, lleva las mandíbulas que también son birramiadas, (verfigura 2)4.13. Orden anostraca.FIGURA 2. NauplioCategoría taxonómica que agrupa a organismos sin caparazón, ojos compuestospedunculados, antenas prensibles bien desarrolladas en los machos y reducidas en lashembras, poseen de 11 a 19 pares de apéndices en el tronco. Sin apéndices postgeneitales.Rama furcal unisegmentada. Con metamorfosis en su desarrollo. Tienen la capacidad detomar huevos resistentes llamados quistes. Las aberturas genitales de hembras y machos selocalizan en un segmento que resulta de la fusión de los segmentos 12 y 13 del tronco. Enla etapa de la reproducción, la hembra muestra una bolsa de la reproducción, la hembramuestra una bolsa de huevecillos (ovisaco), en la cara ventral de los primeros segmentospostgenitales.

NMX-AA-110-1995-SCFI4.14. Prueba de toxicidad (bioensayos de toxicidad)Es la exposición controlada de organismos a sustancias puras o combinadas, lixiviados,extractos acuosos, aguas residuales industriales, municipales, agrícolas y aguasprovenientes de cuerpos de agua, para evaluar su efecto tóxico.4.15. Quiste.Es un estado de desarrollo embrionario en etapa de gástrula, protegido por una cubiertaconstituida por tres estructuras; corión, membrana cuticular externa y cutícula embrionaria.Los quistes tienen una masa de 2,8µg a 4µg. Miden 200µm a 300µm y son de color marrónclaro. Cuando están deshidratados tienen la apariencia de balones desinflados y alhidratarse se tornan esféricos.4.16. SalinidadEs la cantidad total de materia sólida, en gramos, disuelta en 1 kg. de solución acuosadespués de que todos los carbonatos se han convertido en óxidos, todos los bromuros yyoduros reemplazados por cloruros y toda la metería orgánica se ha oxidado.4.17. SedimentoMaterial particulado o granular que se deposita en el fondo de un cuerpo de agua, sistemade drenaje y alcantarillado urbano o municipal.4.18. Sustancia combinada.Es aquella que se forma por la integración de dos o más compuestos en una proporción nomayor al 98% de cualquiera de ellos. Para fines de esta norma las sustancias combinadaspueden ser de aguas; residuales industriales, municipales y agrícolas, lixiviados y extractosacuosos con salinidades mayores a diez.4.19. Sustancia pura.Elemento o conjunto de dos o más elementos combinados químicamente, que dan lugar aun compuesto con pureza no menor al 98%, por ejemplo: dicromato de potasio (K 2 Cr 2 O 7 ),fenol (CH 6 -OH), sulfato de zinc (ZnSO 4 ).

NMX-AA-110-1995-SCFI4.20. Tiempo de exposición.Es el período en el que se someten los organismos a las soluciones de prueba, en unbioensayo de toxicidad.4.21. Toxicidad aguda.Es el efecto letal que se produce después de exponer a los organismos prueba, a sustanciaspuras o combinadas una sola vez, durante un período corto.4.22. Tóxico.Es cualquier sustancia pura o combinada que al entrar en contacto con un organismo,produce daños estructurales, alteraciones bioquímicas o fisiológicas o incluso la muerte,dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición.4.23. Tóxico de referencia.Es una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad, cuyo efecto en losorganismos, a determinadas concentraciones, es conocido y por lo tanto permite establecerel estado de respuesta de los organismos de prueba empleados, así como comparar losresultados intra e inter laboratorios. El uso de estos tóxico, proporciona también unaevaluación general de la precisión (estabilidad y reproducibilidad del método a través deltiempo.5 MUESTREO.El muestreo tanto de cuerpos de agua como de efluentes industriales, municipales yagrícolas, constituyen una parte integral y fundamental de cualquier programa de monitoreode la calidad del agua, pues proporciona bases para la evaluación de propiedades y efectospotenciales del agua, sobre los organismos de ecosistema.5.1. Muestreo en efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractos acuosos ylixiviados.Se toman muestras compuestas de dos litros (volumen total), en recipientes de plásticoinerte o de vidrio borosilicato, los cuales deben ser llenados completamente y sellados.El número de muestras instantáneas o simples, necesarias para formar una muestracompuesta depende de las horas en que se opere el proceso generador de la descarga, comose especifica en la tabla 1.

NMX-AA-110-1995-SCFITABLA 1Muestras instantáneas requeridas para formar una muestra compuesta.Horas por día en que se opera elproceso generador de la descarga.Hasta 8 hMás de 8 h y hasta 12hMás de 12 y hasta 18hMás de 18h y hasta 24hNúmero demuestras4466Intervalo para la obtención demuestras simples.Mínimo Máximo1,02,02,03,02,03,04,03,0Para determinar el volumen de las muestras instantáneas o simples para la preparación deuna muestra compuesta, se debe seguir el ejemplo del apéndice n de la Norma MexicanaNMX-AA-087-SCFI, (ver 3 Referencias).5.2. Muestreo en cuerpos de agua.Se debe establecer una red de muestreo que represente las condiciones del cuerpo receptor,las muestras deben ser simples y las muestras compuestas de 2L, colectadas en la mismaforma que en el inciso 5.1.Deben registrarse los parámetros fisicoquímicos básicos (salinidad, pH, oxígeno disuelto ytemperatura), anotando las siguientes características aparentes:- Olor- Color- Turbiedad- Presencia o ausencia de burbujas y espuma.5.3. Muestreo de lixiviadosel muestreo de lixiviados se debe efectuar en los pozos de monitoreo de los sistemas decaptación de los mismos, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-053-ECOL, (ver 3Referencias). Toda muestra debe colectarse en recipientes de plástico inerte o de vidrioborosilicato; éstos deben ser llenados completamente y sellados. Se deben tomar lasmedidas precautorias necesarias utilizado el equipo de seguridad adecuado (guantes deLátex, mascarillas, lentes protectores y cualquier otro)

NMX-AA-110-1995-SCFI5.4. Muestreo de sedimentos.El muestreo de sedimentos se lleva a acabo utilizando una draga Ekman o similar, o bien unnucleador, siempre que se realice en cuerpos de agua cuya profundidad sea igual o mayor a50 cm. Si el muestreo se efectúa a profundidades menores a la anterior, se utiliza una palapequeña de acero inoxidable o de plástico inerte.En cualquiera de los dos casos mencionados, la muestra que se considera para el análisiscorresponde a la lámina superior de sedimento con un espesor de 3 cm y masa húmedaaproximada de 2 Kg.Al efectuar el muestreo, se recomienda considerar lo siguiente:- Cuando se realiza el muestreo en sedimentos limosos, se sugiere introducirlentamente la draga o el nucleador, para evitar remolinos y corrientes que suspendanel sedimento.- Si el muestreo se realiza en un sedimento rocoso – arenoso, pueden quedaratrapadas rocas pequeñas entre la mandíbulas de la draga, impidiendo el cierreadecuado de ésta, lo cual conduce a pérdidas de sedimento.La draga o el nucleador deben lanzarse tantas veces como sea necesario hasta obtener lacantidad suficiente de sedimento.- Cuando se utilice la pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte, se debeprocurar sumergirla en dirección del flujo y, al llegar al fondo, introducirlalentamente inclinando la pala en un ángulo aproximado de 45º.Posteriormente, arrastrar ésta paralelamente al fondo hasta obtener una cantidadsuficiente. En seguida, se debe elevar la pala en forma casi horizontal (paralela alfondo) muy lentamente, para evitar pérdida de sedimento.Para todos los casos anteriores, la muestra colectada para el análisis se coloca en bolsas depolietileno incoloras, las cuales deben quedar perfectamente cerradas, con objeto deproteger la acción de la luz solar.Este método se basa en la exposición controlada del crustáceo Artemia franciscana, acuerpos de agua salobre o marino, sustancias puras o combinadas, cuya salinidad sea mayora diez, para evaluar su efecto tóxico.

NMX-AA-110-1995-SCFI7 REACTIVOS Y MATERIALES.7.1. Reactivos (grado analítico)- Acetona (C 3 H 6 O)- Acido bórico (H 3 BO 3 )- Acido nítrico (HNO 3 )- Agua destilada- Bicarbonato de sodio (NaHCO 3 )- Bromuro de potasio (KBr)- Cloruro de calcio anhidro (CaCl 2 )- Cloruro de estroncio (SrCl 2 .6H 2 O)- Cloruro de magnesio (MgCl 2 .6H 2 O)- Cloruro de potasio (KCl)- Cloruro de sodio (NaCl )- Fluoruro de sodio (NaF)- Lauril sulfato de sodio (Dodecil sulfato de sodio) (CH 3 ) (CH 2 ) 10 CH 2 OSO 3 Na*- Sulfato de sodio (NaSO 4 .10H 2 O)NOTA 1.-*Reactivo empleado como tóxico de referencia.7.2. Materiales.7.2.1. De vidrio.- Caja de petri de 60 mm de diámetro y 12 mm de alto.- Embudo de separación de 125 ml.- Matraces aforados (diferentes capacidades)- Matraces Erlenmeyer (diferentes capacidades- Pipetas Pasteur con bulbo.- Pipetas volumétricas (diferentes capacidades)- Vaso de precipitado tipo Griffin de 30ml.7.2.2. Material biológico.7.2.2.1. Quistes de artemia franciscana.Se debe utilizar quistes como un máximo de 10% de humedad y garantizados por elproveedor. La condición de humedad debe mantenerse aún después de abierto el recipiente.

NMX-AA-110-1995-SCFI7.2.3. Otros materiales.- Bolsas de polietileno incoloras- Cubrebocas.- Detergente para uso en laboratorio.- Filtro de membrana de 0,45 µm.- Guantes de látex- Lentes protectores- Mascarillas- Pala pequeña de acero inoxidable o de plástico inerte.- Propipetas- Recipientes de plástico inerte o de vidrio borosilicato- Soporte universal- Tamiz de luz de malla de nylon de 100µm- Tubo o manguera de plástico.8 APARATOS Y/O INSTRUMENTOS.- Balanza analítica- Bomba de aire- Centrífuga refrigerada- Congelador- Droga tipo Ekman- Luxómetro- Microscopio estereoscópico.- Medidor de pH- Nucleador- Oxímetro- Parrilla magnética- Salinómetro, refractómetro o Densímetro.- Sistema de control de temperatura.- Termómetro.9 PREPARACION Y ACONDICIONAMIENTO DE LAS MUESTRAS.Las muestras de agua (simples o instantáneas y compuestas), de lixiviados y de sedimentos,deben ser almacenadas, cuando se requiera, en el mismo recipiente donde fueroncolectadas.Las muestras deben mantenerse a una temperatura de 4ºC ± 2ºC desde su colecta, y hasta36 h y hasta 60 días posteriores a la fecha de colecta, se deben congelar a no más de –10ºCpara evitar cambios debidos a la actividad microbiana, transformación química y/o pérdidade sustancias volátiles. Las pruebas de toxicidad realizadas fuera de estas condiciones, noson válidas.

NMX-AA-110-1995-SCFILas muestras deben ser preservadas sin producto químico alguno.El tiempo cero, en una muestra compuesta, es el tiempo de la toma de la última colectasimple o instantánea.10 PROCEDIMIENTOEl área para pruebas de toxicidad debe ser exclusiva, con dimensiones mínimas de 6m 2 ycontrol de fotoperíodo (16 h Luz/8 h oscuridad).10.1. Actividades previas en el laboratorio.Una vez que se conoce la fecha exacta en la que se debe llevar a cabo el bioensayo, sedeben realizar las siguientes actividades:10.1.1. Técnicas de eclosión de quistes de Artemia franciscana y obtención de nauplios.A un embudo de separación de 125 ml de capacidad, agregar 100ml de agua de marartificial diluida. Establecer las condiciones que se mencionan en la tabla 2. Posteriormente,adicionar 100mg de quistes.TABLA 2.- Condiciones para llevar a cabo la eclosión de los quistes.ParámetroCondicionesTemperaturaLuminosidadSalinidadOxígeno disueltoPh **27ºC ± 3ºC1 000 Luxes *10 a 12No menor al 80% de saturación8,5 ± 0,5NOTA 2.NOTA 3* Luxes se abrevia Lx** En caso necesario ajustar con bicarbonato de sodio.Aplicar aireación continua, mediante el uso de una manguera conectada a una bomba deaire la que, se introduce por la boca del embudo hasta el fondo para que los quistes semantengan en movimiento y su distribución en el agua sea homogénea (ver figura 3).Procurar que la aireación sea moderada para no dañar los quistes.Exponer el embudo de separación a una fuente luminosa (luxómetro) colocada a unadistancia tal que asegure que la iluminación incidente sea la requerida. Mantener lailuminación por lo menos durante 7h.

NMX-AA-110-1995-SCFISi los quistes se mantienen durante 24h en las condiciones descritas, se obtiene la eficienciade eclosión máxima. Posteriormente, suspender la aireación para que los nauplios seconcentren en el fondo del embudo de separación; colectarlos en un tamiz de malla denylon de 100 µm de abertura, abriendo la llave del embudo. Transferirlo a cajas de petri de60 mm de diámetro y 12 mm de alto, donde deben permanecer hasta el inicio de la prueba.Con la ayuda de una pipeta Pasteur con bulbo, seleccionar los nauplios que presentenmayor movimiento. Para facilitar esta operación colocar una fuente luminosa por un lado dela caja de petri; aquellos nauplios que respondan más rápidamente al estímulo, son losindicados para utilizares en las pruebas de toxicidad.FIGURA 3.-Equipo para eclosionar los quistes de Artemia franciscana.

NMX-AA-110-1995-SCFI10.2. Lavado de material.Todos los recipientes que entren en contacto con las muestras, deben lavarse perfectamentepara eliminar residuos potencialmente tóxicos a los organismos de prueba, utilizando elmétodo siguiente:10.2.1. Lavar el material con detergente para uso en laboratorio y enjuagar dos veces conagua de llave.10.2.2. Enjuagar el material con ácido nítrico (HNO 3 ) al 30% para eliminar residuosmetálicos. Enjuagar con agua desionizada y escurrir.10.2.3. Enjuagar con acetona (C 3 H 6 O) para eliminar residuos orgánicos. Enjuagar con aguadesionizada y dejar secar completamente.Esta serie de lavados tienen que llevarse a cabo de 24h a 48h antes del bioensayo,protegiendo el material del polvo y otros factores.10.2.4. Minutos antes de iniciar el bioensayo, enjuagar con agua de mar artificial losrecipientes que van a contener a los organismos.10.2.4.1. Preparación de agua de mar artificialEl uso del agua de mar artificial es necesario para la prueba, ya que, tienen unacomposición química conocida y permite resultados reproducibles, su preparación debeefectuarse al menos con 72h de anticipación, cuidando que se efectúe tal y como se indicaen la tabla 3, ya que de ello depende en gran parte la culminación exitosa de la prueba, (verCapítulo 13 Bibliografía inciso 13.13.TABLA 3.- Preparación de agua de mar artificial a una salinidad de 35Solución ASolución BSales Cantidad (g) Sales Cantidad (g)NaCl 23,90 NaSO 4 .10H 2 O 9,06MgCl 2 .6H 2 O 10,83 NaHCO 3 0,20CaCl 2 anhidro 1,15 NaF 0,000 3SrCl 2 .6H 2 O 0,004 H 3 BO 3 0,002 7KCl 0,682 Agua destilada 100mlKBr 0,099Agua destilada 856 mlLa solución B se adiciona lentamente a la solución a, agitando constantemente para lograruna mezcla homogénea. Después de 24h, filtrar la mezcla utilizando un filtro de membranade 0,45 µm.

NMX-AA-110-1995-SCFIPara comprobar la calidad óptima del agua de mar artificial, se deben colocar 10 naupliosen una muestra de 20ml, durante 24h; si al término del plazo no se registra mortalidad, elagua puede ser utilizada en la prueba.10.3. Calibración de aparatos.Antes de cada prueba, se debe efectuar una calibración de aparatos (medidores de pH,oxígeno disuelto y de salinidad).10.4. Preparación de extractos acuosos de sedimentos provenientes de ambientes salobresy marinos.Homogeneizar la muestra de sedimento colectada, mezclar con agua marina artificial enuna relación 1:4 (masa/volumen) utilizando un matraz Erlenmeyer. Agitar vigorosamentedurante 30 min utilizando una parrilla magnética. Centrifugar la mezcla a 10 000 r/minutilizando una centrífuga refrigerada hasta obtener una separación completa de las dosfases. Utilizar el sobrenadante para análisis.Repetir el procedimiento las veces necesarias hasta obtener el volumen de muestrasuficiente para el análisis.10.5. Período de prueba.Cuando la muestra llegue al laboratorio, se deben medir y anotar la salinidad, temperatura yel pH. Si el análisis no va a ser efectuado inmediatamente, mantener la muestra como seindica en el inciso 9 de esta norma, hasta que sea procesada. En caso de que la muestrallegue congelada al laboratorio, estos parámetros se determinan al inicio del bioensayo. Lamuestra debe descongelarse a temperatura ambiente.Las aguas provenientes de efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractos acuososy lixiviados, deben ser evaluadas a partir de una prueba exploratoria y una definitivasiempre que la salinidad sea igual o mayor que diez; en el análisis de sustancias purassolubles en agua se debe utilizar el mismo criterio. Para cuerpos de agua con salinidadesmayores o iguales a diez, se realiza únicamente una prueba definitiva.10.5.1. Prueba exploratoria en efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractosacuosos, lixiviados y sustancias puras.Esta prueba sirve para determinar si una muestra es tóxica o no, y en su caso, permitedefinir el intervalo de concentraciones que se deben aplicar en una prueba definitiva. Eneste bioensayo se prueban cinco concentraciones de la muestra: 100%, 50%, 25%, 12% y6%, más un testigo, siguiendo los lineamientos de la tabla 4 de esta norma.

NMX-AA-110-1995-SCFITABLA 4.-Condiciones de la prueba exploratoria con Artemia franciscana KelloggNOTA 4.- * Luxes se abrevia Lx.10.5.2. Prueba definitiva en efluentes industriales, municipales y agrícolas, extractosacuosos lixiviados y sustancias puras.

NMX-AA-110-1995-SCFIEl tiempo de exposición en la prueba definitiva es mayor que en la exploratorio; por lotanto, la mortalidad pude incrementarse al final de la prueba y entonces la Cl 50 nonecesariamente cae dentro del intervalo seleccionado. Debido a esto, al finalizar la pruebaexploratoria se debe observar a los organismos que continúan vivos para determinar, deacuerdo al estado de afectación, el intervalo de concentraciones que va a ser usado en laprueba definitiva.Para la determinación del intervalo que debe ser usado en la prueba definitiva de estasmuestras, se recomienda revisar los ejemplos de apéndice B de la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 3 Referencias). Para la preparación de las diferentes diluciones, se debecontar con medidas de seguridad para evitar entrar en contacto directo con la muestras deagua residuales. Se recomienda utilizar propipetas, guantes de látex desechables ycubrebocas.10.5.2.1. Condiciones para la prueba definitiva.En la tabla 5 de esta norma se agrupan las condiciones que deben observarse durante unaprueba definitiva en muestras provenientes de efluentes industriales, municipales yagrícolas, extractos acuosos y lixiviados, así como en cuerpos de agua.10.5.3. Prueba definitiva en cuerpos de agua.En esta prueba se deben preparar al menos, cinco concentraciones: 100%, 50%,25%, 12,5%y 6,25%, más el testigo, utilizando para ello pipetas volumétricas y matraces aforados dediferentes capacidades.NOTA 5.- Es las pruebas definitivas para efluentes y cuerpos de agua, se deben preparar almenos tres réplicas.

NMX-AA-110-1995-SCFITABLA 5.- Condiciones de la prueba definitiva con Artemia franciscana KelloggNOTA 6.-* Luxes se abrevia Lx.10.5.4. Evaluación de sensibilidadEl laboratorio que realice pruebas de toxicidad debe validar la sensibilidad de la cepa deArtemia franciscana, realizando para ello, pruebas periódicas (se recomienda cada 2meses), con el tóxico de referencia que se establece en el inciso 10.5.5.1. de esta norma.La sensibilidad del Artemia franciscana se evalúa mediante la determinación de la CL 50 enun bioensayo de 48h, aplicando concentraciones establecidas de tóxico de referencia. Elmétodo y las condiciones de prueba, deben ser los descritos en la presente norma.

NMX-AA-110-1995-SCFI10.5.5. Tóxicos de referencia.Los tóxicos de referencia deben cumplir con las siguientes características:- Amplio espectro tóxico.- Facilidad de obtención en forma pura- Alta solubilidad en agua- Persistencia y estabilidad en solución- Estabilidad en almacenamiento- Facilidad de cuantificación10.5.5.1. El tóxico de referencia que se sugiere emplear en esta prueba es el laurilsulfato de sodio (dodecil sulfato de sodio) [(CH 3 )(CH 2 )10CH 2 OSO 3 Na], en las siguientesconcentraciones: 2 mg/L, 4mg/L, 8mg/L, 16mg/L y 32mg/L. La Cl 50 de referencia para estetóxico es de 16,6 mg/L ± 3,3 mg/L; el valor obtenido experimentalmente debe quedardentro de este intervalo de confianza.En caso contrario, se recomienda no realizar más bioensayos con dicha cepa y sustituirlacon una nueva para la prueba, la cual, también debe ser evaluada.10.5.5.2. El tóxico de referencia descrito en esta norma puede ser sustituido porcualquier otro, siempre y cuando, cumpla con las características señaladas en el inciso10.5.5. de esta norma, debiendo registrar el valor de CL 50 y el intervalo de confianzacorrespondiente.10.6. Factores de variabilidad.Algunos de los factores de variabilidad pueden ser:- Manejo de los nauplios- Manejo del tóxico de referencia- Lavado de material- Pureza de los reactivos- Pericia y consistencia en las realización de las pruebas por parte de los analistas.11 EXPRESION DE RESULTADOS.Para la obtención de la CL 50 se recomienda utilizar el Método de Unidades Probabilísticas“Probit” (ver Capítulo 13 Bibliografía inciso 13.12), el cual evalúa la relaciónconcentración – respuesta de un contaminante sobre un organismo, medido en términos desu CL 50 y su precisión o intervalo de confianza de acuerdo a los lineamientos que seestablecen en la Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI, (ver 3 Referencias).

NMX-AA-110-1995-SCFI11.1. Conteo de naupliosEl conteo de nauplios inmóviles debe efectuarse a las 24h y 48h para el cálculo de CL 50 . Sise tiene duda sobre la inmovilidad de los organismos, auxiliares de un microscopioestereoscópico.11.2. Parámetros a evaluar.Durante la prueba, los parámetros fisicoquímicos (pH, temperatura, oxígeno disuelto ysalinidad), se determinan al inicio y al término de la misma.Para fines de esta norma, el oxígeno disuelto y la salinidad se determinan mediante elempleo de un oxímetro y un salinómetro, densímetro o refractómetro respectivamente.La temperatura y el pH se determinan de acuerdo a la Normas Mexicanas NMX-AA-007 yNMZ-AA-008, (ver 3 Referencias).12 INFORME DE LA PRUEBA.El informe de la prueba incluye especificar los siguientes puntos:12.1. Cuenca hidrológica.12.2. Nombre del cuerpo de agua receptor.12.3. Si se trata de pruebas en efluentes, indicar12.3.1. Responsable legal del efluente o descarga.12.3.2. Si es efluente industrial:- Razón social de la empresa; dirección, teléfono, que produce; que materias primasutiliza; horario de operación.12.3.3. Si es efluente agrícola:- localización, tipo(s) de cultivo(s) y, en su caso, que fertilizante(s) y/o plaguicida(s)se utiliza(n).12.3.4. Si es efluente urbano o municipal- Localización, nombre de la ciudad o municipio.Para los casos descritos en los incisos 12.3.2, 13.3.3. y13.3.4, especificar además:

NMX-AA-110-1995-SCFI- Caudal promedio (m 3 /día); caudal promedio durante el muestreo (m 3 /s); en caso decontar con sistema de tratamiento, breve descripción del mismo, localización depunto(s) de muestreo seleccionado(s); método de colecta usado; fecha período yhorario de colecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) y el iniciodel análisis; temperatura de la(s) muestra(s) al recibirse en el laboratorio; datosfisicoquímicos y observaciones en campo; responsable(s) del muestreo.12.4. Si se trata de pruebas en cuerpos receptores, indicar:- Localización de punto(s) de muestreo; método de colecta usado; fecha, período yhorario de colecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) alrecibirse en el laboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo;responsables (s) del muestreo.12.5 Datos a registrar durante la prueba de toxicidad;- Condiciones de almacenamiento y preservación de la(s) muestra(s); fecha de inicioy término del análisis; tipo de prueba realizada (exploratoria y/o definitiva); datosfisicoquímicos al inicio del análisis (pH, oxígeno disuelto, salinidad, temperaturadel agua) y características aparentes (color, olor, turbiedad, presencia o ausencia deburbujas y espuma); datos fisicoquímicos en las muestras al 100%, diluciones ytestigo a las 24h y 48h de exposición (pH, oxígeno disuelto, salinidad, temperaturadel agua) concentración(es) y/o definitiva(s) y la mortalidad o inmovilidad de losorganismos prueba; responsable(s) de la realización de la(s) prueba(s) de toxicidad.12.6. Análisis de resultados.- Tablas y gráfica(s) derivadas de la prueba de toxicidad, así como, anotaciones de lasobservaciones diarias efectuadas en los organismos en cada concentración,incluyendo los testigos; indicar los valores de toxicidad obtenidos expresados en CL50 (con su respectivos límites de confianza al 95%) y en unidades de toxicidad,método estadístico utilizado y discusión de resultados.12.7. Datos adicionales:- Tóxico de referencia utilizado en la prueba de sensibilidad, CL 50 obtenida y fechade realización; responsable(s) de la realización de la prueba.12.8. Conclusiones y recomendaciones.12.9. Si se contrata a una empresa consultora, laboratorio, etc., para llevar a cabo losanálisis, indicar razón social, representante legal, dirección y teléfono.

NMX-AA-110-1995-SCFI13. BIBLIOGRAFIA13.1. ABREU-GROBOIS, F.A. 1987. A review of the genetics of Artemia. (Una revisiónde la genética de Artemia) En: Artemia research and its Applications. Vol. 1.Morphology, Genetics, Strain Characterization, Toxicology. P. Sorgeloos; D.A.Bengston; W. Decleir and E. Jaspers (Eds.) Universal Press. Wetteren, Bélgica. Pp.61-9913.2. APHA, AEEA, WPCF, 1989. Standard Methods For the examination of water andWastewater. (Métodos estándar para el análisis del agua y de aguas residuales)American Public Health Association, Port City press, Baltimore, Maryland, E.U.A.10-200p. + láminas.13.3. BLISS, D.E. 1982. The biology of crustacean. (Biología de los Crustáceos). Vol. 1Lawrence G. (Editor) Acadamic press, USA. Pp. 67-261.13.4. BURTON Jr. G.A. Sediment Toxicity Assessment. (Evaluación de Toxicidad desedimentos). Ed. Lewis Publishers INC. EUA. 957.p.13.5. CASTRO, B.T. Gallardo, R.C. 1983. Artemia s.p. Cuadernos No. 31. CBS. UAM .México, d.f. pp. 14-1513.6. CASTRO, M.J., De Lara A.R. 1991. Manual de Técnicas para el manejo de Quistesde Artemia sp. UNAM. México. 47 pp.13.7. CETESB, 1991 a Métodos de Avaliacáo de Toxicidade de Poluenes a OrganismosAquaticos. (Métodos de evaluación de toxicidad de contaminantes en organismosacuáticos) Sao Paulo, SP. Brasil. S.p.13.8. CETESB, 1991 b. Procedimientos para utilizacáo de testes de toxicidade no controlede efluentes líquidos. (Procedimiento para la utilización de pruebas, de toxicidad enel control de efluentes líquidos) Serie Manuais. Sao Paulo, SP. Brasil, 17p.13.9. CETESB, 1991 c. Implementacáo de testes de toxicidade no controle de efluenteslíquidos. (Implementación de pruebas de toxicidad en el control de efluenteslíquidos) Serie Manuais. Sao Paulo, SP. Brasil, 7p.13.10. EPA, 1991 Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and ReceivingWaters to Freshwater and Marine Organisms. (Métodos para medir la toxicidadaguda de efluentes y aguas receptoras con organismos marinos y dulceacuicolas)EPA/600-4-90/OZ7.13.11. EPS, 1990.Guidance Document on Control of Toxicity Test Precision UsingReference Toxicants. (Guía para el control de precisión en la prueba de toxicidadutilizando tóxicos de referencia) Report EPS 1/RM/12 Canadá.

NMX-AA-110-1995-SCFI13.12. FINNEY, D.J., 1971. Probit analysis. (Análisis probit) 3ª. Ed. Cambridge UniversityPress, Londres. 333 pp.13.13. KINNE, O. 1971. Marine Ecology. (Ecología Marina) volume 1 EnvironmentalFactors Part. 2. Wiley – Interscience. New York.13.14. Ley de Aguas Nacionales. Publicada en el Diario Oficial de la Federación del 1 dediciembre de 1992.13.15. Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente. Publicada en elDiario Oficial de la Federación del 28 de enero de 1988.13.16. LITCHFIELD, J.T.Jr. y F. Wilcoxon, 1949. A simplified method of evaluating doseeffect experiments. (Método simplificado para evaluar los efectos de las dosis en losexperimentos) J. Pharm. Exp. Ther. 96:99-113.13.17. NEEDHAM, J.G., P.S. Galtssoff, F. E. Lutz y P.S. Welch, 1937. Culture Methodsfor Invertbrate Animals. (Métodos de cultivo en invertebreados) Comstock Publ.Co. Reprinted by Dover Publ,. Inc., Nueva York.13.18. PEREZ, Ch. A. 1986. Eficiencia de eclosión de quistes de Artemia salinaprocedentes de dos salinas de México. Tesis de Licenciatura, UNAM Iztacala.México.13.19. PERSOONE, G. SORGELOOS, P. 1980. The structure of the shell and outermembranes in encysted Artemia salina embryos during cryptobiosis anddevelopment. (Estructura del caparazón y membranas externas en el enquistamientode los embriones de Artemia salina durante la criptobiosis y desarrollo). J.Ultrastruct. Res. 20:244-259.13.20. PIELOU, E.C. 1969. An Introduction to Mathematical Ecology. (introducción a laEcología Matemática) Wiley Intersciencies John Wiley and Sons, Nueva York.13.21. SAMOILOFF, M. 1984. Toxicity Testing of Sediments: Problems Trends, andSolutions. (Pruebas de Toxicidad en Sedimentos: Problemas, Guías y Soluciones).Bioquest International, Inc., Winnipeg, Manitioba, Canadá. Pp. 143-159.13.22. SORGELOOS, P. 1980. Life history of the brine shrimp Artemia (Ciclo de vida delcamarón de salmuera de Artemia.). p. XXI-XXIII. En : the brine shrimp Artemia.Vol. 1. Morphology, Genetics, Strain Characterization, Toxicology. P. Sorgeloos;D.A. Bengston; W. Decleir and E. Jaspers (Eds.) Universa Press. Wetteren, Bélgica.13.23. STEPHAN, C.E. 1977. Methods for calculation an Lc 50 . (Métodos para el cálculo dela CL 50 ) In: Mayer y J.L. Hamelink, (Eds.), Aquatic Toxicology and HazardEvaluation, ASTM STP 634, American Society for Testing and Materials,Philadelphia, Pennsylvania: 65-84.

NMX-AA-110-1995-SCFI13.24. VANHAECKE,P., PERSOONE, G., CLAUS, C. AND P. SORGELOOS. 1980.Researcha on the development of a short term standard toxicity test with Artemianauplii. (Investigación sobre el desarrollo de una prueba de toxicidad estándar decorta duración con nauplios de Artemia). Pp. 263-285. En: G. Persoone; p.Sorgeloos; o. Roels y E. Jaspers. (Eds.) The Brine Shrimp. Artemia. Vol. 1.Morphology, Genetics, Radiobiology, Toxicology. Universa Press. Wetteren,Bélgica. 318 p.13.25. VAZQUEZ, G. L. 1987. Zoología del phylum Arthropoda. Bravo, A. (Editor)Editorial Interamericana. México, D.F. 174 pp.14 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES.Esta norma no concuerda con ninguna norma internacional por no existir referencia algunaal momento e su elaboración.APENDICE INFORMATIVO.La elaboración de la presente Norma Mexicana se efectuó, tomando como baseinvestigación realizada a nivel nacional y la información consultada de normas extranjeras.MÉXICO, D.F. A 6 marzo.1996LA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS.LIC. MA. EUGENIA BRACHO GONZALEZ.

NMX-AA-102-SCFI-2006CALIDAD DEL AGUA – DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DEORGANISMOS COLIFORMES, ORGANISMOS COLIFORMESTERMOTOLERANTES Y Escherichia coli PRESUNTIVA –MÉTODO DE FILTRACIÓN EN MEMBRANA (CANCELA A LANMX-AA-102-1987)WATER QUALITY – DETECTION AND ENUMERATION OFCOLIFORM ORGANISMS, THERMOTOLERANT COLIFORMORGANISMS AND PRESUMPTIVE Escherichia coli –MEMBRANE FILTRATION METHOD

NMX-AA-102-SCFI-2006PREFACIOEn la elaboración de esta norma mexicana participaron las siguientes asociaciones,cámaras, dependencias, laboratorios privados, instituciones de educación superior einstitutos de investigación:−−−−−−−−−−−−−−−−−CENTRO DE SERVICIOS QUIMICOS DE AGUASCALIENTES.CENTRO NACIONAL DE METROLOGIA.COMISION ESTATAL DE AGUA Y SANEAMIENTO.COMISION FEDERAL DE ELECTRICIDAD.COMISION NACIONAL DEL AGUA.COMITÉ TÉCNICO DE NORMALIZACIÓN NACIONAL DE MEDIOAMBIENTE Y RECURSOS NATURALESCORPORACION MEXICANA DE INVESTIGACION EN MATERIALES.DIRECCION GENERAL DE NORMATIVIDAD Y APOYO TECNICO.ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS I.P.N.FISHER SCIENTIFIC MEXICANA S.A. DE C.V. (CASA ROCAS, S.A.)GOBIERNO DEL DISTRITO FEDERALDirección General de Construcción y Operación Hidráulica.INSTITUTO MEXICANO DE TECNOLOGIA DEL AGUA.INSTITUTO MEXICANO DEL PETROLEO.INSTITUTO NACIONAL DE ECOLOGIA.INSTITUTO TECNOLOGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORESMONTERREY.LABORATORIO CONTROL QUIMICO/NOVAMANN, S.A. DE C.V.LABORATORIO DE ECOLOGIA INDUSTRIAL, S.A. DE C.V.

NMX-AA-102-SCFI-2006−−−−−−−−−−−−−−−−−−−LABORATORIO DE PEMEX PERFORACION Y MANTENIMIENTO DEPOZOS.LABORATORIO DE QUIMICA DEL MEDIO E INDUSTRIAL, S.A DE C.V.LABORATORIO IDECA, S.A. DE C.V.LABORATORIO QUIMICO INDUSTRIAL.LABORATORIOS ABC QUIMICA, INVESTIGACION Y ANALISIS, S.A DEC.VMERCK- MEXICO, S.A.PERKIN ELMER DE MEXICO, S.A.PETROQUIMICA CANGREJERA, S.A. DE C.V.PETROQUIMICA MORELOS, S.A DE C.V.PETROQUIMICA PAJARITOS, S.A. DE C.V.PROTECCION AMBIENTAL Y ECOLOGIA, S.A. DE C.V.SECRETARIA DE SALUD.SERVICIOS AMBIENTALES MULTIPLES E INGENIERIA, S.A. DE C.V.SERVICIOS DE INGENIERIA Y CONSULTORIA AMBIENTAL.SISTEMA INTERMUNICIPAL DE AGUA POTABLE Y ALCANTARILLADO.UAM AZCAPOTZALCO.UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MÉXICO.UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.Facultad de Química.Instituto de Geofísica.Instituto de Ingeniería.VARIAN, S.A. DE C.V.

NMX-AA-102-SCFI-2006PREFACIONúmero de capítuloPágina0 Introducción 11 Objetivo y campo de aplicación 12 Referencias 23 Principio del método 24 Definiciones 35 Reactivos y patrones 56 Equipo y materiales 107 Recolección, preservación y almacenamiento de muestras 118 Control de calidad 119 Calibración 1210 Procedimiento 1211 Cálculos 1512 Interferencias 1713 Seguridad 1714 Manejo de residuos 1715 Bibliografía 1816 Vigencia de esta norma 1917 Concordancia con normas internacionales 19

NMX-AA-102-SCFI-2006CDU: 628.163CANCELA A LANMX-AA-102-1987CALIDAD DEL AGUA – DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DEORGANISMOS COLIFORMES, ORGANISMOS COLIFORMESTERMOTOLERANTES Y Escherichia coli PRESUNTIVA –MÉTODO DE FILTRACIÓN EN MEMBRANA (CANCELA A LANMX-AA-102-1987)WATER QUALITY – DETECTION AND ENUMERATION OFCOLIFORM ORGANISMS, THERMOTOLERANT COLIFORMORGANISMS AND PRESUMPTIVE Escherichia coli –MEMBRANE FILTRATION METHOD0 INTRODUCCIÓNLa presencia y extensión de la contaminación fecal es un factor importante en ladeterminación de la calidad de un cuerpo de agua. El análisis de muestras de aguapara determinar la presencia de miembros del grupo coliforme, que habitannormalmente en el intestino del hombre y otros animales de sangre caliente, da unaindicación sensible de dicho tipo de contaminación. Dado que la capacidad de algunosmiembros del grupo coliforme para sobrevivir en agua es limitada, sus númerospueden emplearse también para estimar el grado de contaminación fecal.1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓNEsta norma mexicana describe un método para la detección y enumeración deorganismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y Escherichia colipresuntiva (E. coli) en agua, después de una filtración a través de una membranacelulósica, su subsecuente cultivo en un medio diferencial lactosado y el cálculo desus números en la muestra.

NMX-AA-102-SCFI-20062/19Este método es aplicable a todo tipo de agua, exceptuando aguas salinas con altoscontenidos de diatomeas o cuando números grandes de otros organismos puedaninterferir con el crecimiento.La selección de las pruebas empleadas en la detección y confirmación de los gruposde organismos coliformes, incluyendo E. coli puede verse como parte de unasecuencia continua. El grado de confirmación en una muestra en particular dependeparcialmente de la naturaleza del agua y de las razones para llevar a cabo el examen.En la práctica, la detección en agua de E. coli presuntiva como se define en el punto3.3 de esta norma da usualmente una indicación satisfactoria de contaminación fecal.2 REFERENCIASEsta norma mexicana se complementa con la siguiente norma oficial mexicana vigenteo la que la sustituya:NOM-008-SCFI-2002Sistema General de Unidades de Medida, publicadaen el Diario Oficial de la Federación el 27 denoviembre de 2002.3 PRINCIPIOEl método se basa en la filtración de una muestra directa o una alícuota de la muestraa través de una membrana de celulosa que retiene los organismos, colocando lamembrana ya sea en un medio de cultivo selectivo de agar lactosado o en un cojineteabsorbente saturado con un medio líquido lactosado.La membrana se incuba durante 24 h ya sea a 35°C – 37°C para la detección deorganismos coliformes, o alternativamente a 44,0°C ± 1°C para la presencia deorganismos coliformes termotolerantes.Se lleva a cabo la cuenta directa de las colonias características desarrolladas sobre lamembrana, y algunas de estas colonias se resiembran para pruebas confirmativaspara producción de gas e indol. Finalmente se hace el cálculo del número deorganismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y Escherichia colipresuntiva que pueden estar presentes en 100 mL de la muestra.El sistema de unidades utilizado en la presente norma debe cumplir con lo establecidoen la norma oficial mexicana NOM-008-SCFI (ver 2 Referencias).

NMX-AA-102-SCFI-20063/194 DEFINICIONESPara los propósitos de esta norma mexicana, se establecen las siguientesdefiniciones:4.1 Aguas naturalesAgua cruda, subterránea, de lluvia, de tormenta, de tormenta residual y superficial.4.2 Aguas residualesLas aguas de composición variada provenientes de las descargas de usosmunicipales, industriales, comerciales, agrícolas, pecuarias, domésticos y similares,así como la mezcla de ellas.4.3 BitácoraCuaderno de laboratorio debidamente foliado e identificado, en el cual los analistasanotan todos los datos de los procedimientos que siguen en el análisis de unamuestra, así como todas las informaciones pertinentes y relevantes a su trabajo en ellaboratorio. Es a partir de dichas bitácoras que los inspectores pueden reconstruir elproceso de análisis de una muestra tiempo después de que se llevó a cabo.4.4 Blanco analítico o de reactivosAgua reactivo o matriz equivalente que no contiene, por adición deliberada, lapresencia de ningún analíto o sustancia por determinar, pero que contiene los mismosdisolventes, reactivos y se somete al mismo procedimiento analítico que la muestraproblema.4.5 DescargaAcción de verter, infiltrar, depositar o inyectar aguas residuales a un cuerpo receptoren forma continua, intermitente o fortuita, cuando éste es un bien del dominio públicode la Nación.4.6 Escherichia coli: presuntiva (E. coli)Bacilo Gram negativo , aeróbio o anaerobio facultativo no esporulado que secaracteriza por poseer la enzima beta- galactosidasa , se desarrolla a 44°C ± 0,1°C ,fermenta la lactosa y el manitol produciendo ácido y gas , produce indol a partir deltriptofano, es oxidasa negativo y no hidroliza la urea.

NMX-AA-102-SCFI-20064/194.7 FermentaciónOxidación aeróbica- anaerobica de compuestos por la acción enzimática de losmicroorganismos.4.8 Filtro de membranaTécnica que se utiliza para determinar la cantidad de organismos presentes en unvolumen de muestra determinado.4.9 Medio selectivoMedio de cultivo sólido- líquido que contiene sustancias químicas específicas quepermite el desarrollo de un grupo de organismos específicos, inhibiendo al mismotiempo el desarrollo de otros.4.10 Medios diferencialesMedio de cultivo sólido- líquido que contiene sustancias químicas específicas quepermiten al observador diferenciar distintos tipos de organismos.4.11 MuestraLa que se tome en el punto de interés, de manera continua, en día normal deoperación que refleje cuantitativa y cualitativamente el o los procesos másrepresentativos de las actividades que generan la descarga, durante el tiemponecesario para completar cuando menos, un volumen suficiente para que se lleven acabo los análisis necesarios para conocer su composición, aforando el caudaldescargado en el sitio y en el momento de muestreo.4.12 Organismo aerobioOrganismo que requiere de oxígeno molecular para su desarrollo.4.13 Organismo anaerobioOrganismo que se desarrolla en ausencia de oxígeno molecular.4.14 Organismo Anaerobio facultativoOrganismo que se desarrolla tanto en condiciones aerobicas como anaerobicas.

NMX-AA-102-SCFI-20065/194.15 Organismos coliformesComprende todos los bacilos aerobios o anaerobios facultativos Gram negativos , noesporulados que fermentan la lactosa a 35°C a 37°C con producción de gas y ácidoen un periodo de 24 h a 48 h.4.16 Organismos coliformes fecales (termotolerantes)Comprende todos los bacilos aerobios o anaerobios facultativos , Gram negativos , noesporulados que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas a 44ºC ± 1ºC enun plazo de 24 h.4.17 ParámetroVariable que se utiliza como referencia para determinar la calidad del agua.5 REACTIVOS Y PATRONESLos reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a menosque se indique otra cosa.Agua: Debe entenderse agua que cumpla con las siguientes características:a) Resistividad: megohm-cm a 25ºC: 0,2 Min.;b) Conductividad: µS /cm a 25ºC: 5,0 Máx.;c) pH: 5,0 a 8,0.En caso de utilizar medios deshidratados, seguir las recomendaciones del fabricantepara su preparación y uso.5.1 Diluyente.5.1.1 Diluyente de peptona (0,1%):PeptonaAgua para llevar a1,0 g1 000 mLDisolver la peptona en aproximadamente 950 mL de agua.Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio 1 mol/L ó ácido clorhídrico 1 mol/L demodo que después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,1. Aforar a 1 000 mL con agua,distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante15 min a una presión manométrica de 0,098 066 MPa (1 Kg / cm 2 ).

NMX-AA-102-SCFI-20066/195.1.2 Solución salina de peptona:PeptonaCloruro de sodio (NaCl)Agua para llevar a1,0 g8,5 g1 000 mLDisolver los componentes hirviéndolos en aproximadamente 950 mL de agua. Ajustarel pH con solución de hidróxido de sodio 1 mol/L o ácido clorhídrico 1 mol/L de modoque después de la esterilización sea de 7,0 ± 0,1. LLevar a 1 000 mL con agua,distribuir en volúmenes convenientes y esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante15 min a una presión manométrica de 0,098 066 MPa (1 Kg/Lcm 2 ).5.1.3 Solución amortiguadora de fosfato:Fosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 )Cloruro de magnesio (MgCl2)Agua para llevar a42,5 mg190,0 mg1 000 mL5.1.3.1 Solución de fosfato:Disolver 34 g de fosfato en 500 mL de agua. Ajustar a pH 7,2 ± 0,5 con solución dehidróxido de sodio 1 mol/L y aforar a 1 000 mL con agua.5.1.3.2 Solución de cloruro de magnesio:Disolver 38 g de cloruro de magnesio en 1 000 mL de agua.Para usarla, añadir 1,25 mL de solución de fosfato (6.1.4.1) y 5,0 mL de solución decloruro de magnesio (6.1.4.2) a 1 000 mL de agua. Distribuir en volúmenesconvenientes y esterilizar en autoclave a 121°C ± 1°C durante 15 min a una presiónmanométrica de 0,098 066 MPa (1 Kg/cm 2 ).5.2 Medios de aislamientoUtilizar uno o más de los siguientes medios de cultivo ya sea en forma sólida comoagar o bien como caldo para saturar cojinetes absorbentes:5.2.1 Medio Endo para membranaTriptosaTiopeptonaTripticasa (casitona)Extracto de levaduraLactosaCloruro de sodio (NaCl)Fosfato dibásico de potasio (K 2 HPO 4 )10,0 g5,0 g5,0 g1,5 g12,5 g5,0 g4,375 g

NMX-AA-102-SCFI-20067/19Fosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 )Lauril sulfato de sodio (NaC 12 H 25 SO 4 )Desoxicolato de sodioSulfito de sodio (Na 2 SO 3 )Fucsina básicaAgua para llevar a1,375 g0,05 g0,1 g2,1 g1,05 g1 000 mLDisolver los componentes en agua conteniendo 20 mL de etanol 95% (v/v). Calentar aebullición, quitar inmediatamente y enfriar a 45°C. No colocar en autoclave. El pH finaldebe ser de 7.1 a 7.3. Almacenar el medio a 4°C en la oscuridad y desechar el medioque no se haya usado después de 4 días.NOTA.-Este medio puede solidificarse adicionando de 1,2 % a 1,5 % (m/m) deagar antes de hervirlo.5.2.2 Agar LES EndoExtracto de levaduraTripticasa (casitona)TiopeptonaTriptosaLactosaFosfato dibásico de potasio (K 2 HPO 4 )Fosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 )Cloruro de sodio (NaCl)Desoxicolato de sodioLauril sulfato de sodio (NaC 12 H 25 SO 4 )Fucsina básicaAgarAgua para llevar a1,2 g3,7 g3,7 g7,5 g9,4 g3,3 g1,0 g3,7 g0,1 g0,05 g0,8 g15,0 g1 000 mL.Disolver los componentes en agua conteniendo 20 mL de etanol 95 % (v/v). Calentar aebullición, enfriar y distribuir en volúmenes convenientes en cajas de Petri. No colocaren autoclave, almacenar el medio a 4°C en la oscuridad y desechar el medio que nose haya usado después de 2 semanas.5.2.3 Medio MFCTriptosaPeptona proteosa No. 3 o polipeptonaExtracto de levaduraCloruro de sodio (NaCl)LactosaSales biliares No. 3 ó mezcla de sales biliaresAzul anilinaAgua para llevar a10,0 g5,0 g3,0 g5,0 g12,5 g1,5 g0,1 g1 000 mL

NMX-AA-102-SCFI-20068/19Rehidratar en agua conteniendo 10 mL de ácido rosólico (aurina) (C 19H 14O 3) al 1 % enNaOH 0,2 N. Calentar el medio hasta su punto de ebullición, quitar inmediatamente delcalor enfriar y distribuir en volúmenes convenientes en cajas de Petri. No esterilizar enautoclave. El pH final debe ser 7.4El medio debe almacenarse entre 2°C y 10°C y cualquier porción no utilizada debedesecharse después de 96 h.NOTAS:1 Este medio puede solidificarse mediante la adición de 1,2 % al 5 % deagar (m/m) antes de la ebullición.2 El reactivo de ácido rosólico (C 19H 14O 3) se descompondrá si se esterilizaen autoclave. La solución patrón debe almacenarse en la oscuridadentre 2°C y 10°C y debe desecharse después de 2 semanas, o antes sisu color cambia de rojo oscuro o café oscuro.5.3 Medios confirmativos.Utilizar uno o más de los siguientes:5.3.1 Medio para la producción de gas.Agua de lactosa peptona.Peptona10,0 gCloruro de sodio (NaCl)5,0 gLactosa10,0 gRojo de fenol (0.4% m/m en solución acuosa) 2,5 mL(o indicador de Andrade) (10 mL)Agua para llevar a1 000 mLDisolver los componentes en agua y ajustar a pH 7,5. Añadir el indicador de rojo defenol y distribuir en volúmenes de 5 mL en tubos conteniendo tubos de fermentacióninvertidos (Durham). Alternativamente, ajustar el pH entre 6,8 y 7,0 y añadir elindicador de Andrade. Colocar en autoclave a 110°C durante 10 min o poner a vapordurante 20 min diarios por 3 días sucesivos. Probar la esterilidad por incubación a37°C durante 24 h.5.3.2 Medio para la producción de indolAgua de triptona.

NMX-AA-102-SCFI-20069/19Algunas peptonas que dan resultados satisfactorios a 37° no son satisfactorias para laprueba de indol a 44°C. Se ha encontrado que la triptona es satisfactoria y por lo tantose recomienda.TriptonaCloruro de sodio (NaCl)Agua para llevar a20,0 g5,0 g1 000 mLDisolver los componentes en agua y ajustar a pH 7,5. Distribuir en volúmenes de 5 mLy colocar en autoclave a 115°C durante 10 min.5.3.3 Medio del tubo único tanto para la producción de gas como de indolCaldo lauril triptosa manitol con triptofano.TriptosaManitolCloruro de sodio (NaCl)Fosfato dibásico de potasio (K2 HPO4)Fosfato monobásico de potasio (KH2 PO4)Lauril sulfato de sodio (NaC12 H25 SO4)L (-) triptofanoAgua20,0 g5,0 g5,0 g2,75 g2,75 g0,1 g0,2 g1 000 mLAñadir la triptosa, el cloruro de sodio, el manitol, los fosfatos y el triptofano al agua ycalentar para disolver. Añadir el lauril sulfato de sodio y mezclar suavemente paraevitar la formación de espuma. Ajustar a pH 6,8 ± 0,2. Distribuir en volúmenes de 5 mLen tubos conteniendo un tubo de fermentación invertido (Durham). Colocar enautoclave a 115°C durante 10 min (en caso de utilizar medio de cultivo comercial sigalas instrucciones del fabricante).5.4 Reactivos5.4.1 Reactivo de Kovacs para indolParadimetilaminobenzaldehído((CH 3) 2NC 6H 4CHO)Alcohol amílico (CH 3(CH 2) 4OH)(libre de bases orgánicas)Acido clorhídrico (HCl) (d = 1,18 g/mL)Acido clorhídrico (HCl) (d = 1,18 g/mL)5,0 g75 mL25 mL25 mLDisolver el aldehído en el alcohol. Añadir con cuidado el ácido concentrado. Protegerde la luz y almacenar a 4°C.

NMX-AA-102-SCFI-200610/19NOTAS:1. El reactivo debe tener un color de amarillo claro a café claro; algunasmuestras de alcohol amílico no son satisfactorias y dan un color oscurocon el aldehído.2. También se puede utilizar reactivo de Erlich comercial para ladeterminación de Indol5.4.2 Reactivo de oxidasa para la prueba de oxidasaClorhidratado de tetrametil-p-fenilendiaminaAgua para llevar a0,1 g1 000 mLEste reactivo no es estable y por consiguiente debe prepararse para utilizarlo enpequeñas cantidades cada vez que se necesite.6 EQUIPOS Y MATERALES6.1 EquiposAparte de los equipos que se suministran estériles, el material de vidrio y el resto delequipo deben esterilizarse.6.1.1. Horno de aire caliente para esterilización con calor seco.6.1.2. Autoclave.6.1.3. Incubador o baño de agua, controlado termostáticamente a 35°C –37°C.6.1.4. Incubador o baño de agua, controlado termostáticamente a 44°C ± 0.1°C.6.1.5. Medidor de pH.6.1.6. Campana de Flujo Laminar (Opcional).6.1.7. Equipo para filtración con membrana.6.1.8. Bomba o sistema de vacío.

NMX-AA-102-SCFI-200611/196.2 Materiales6.2.1 Membranas filtrantes estériles de aproximadamente 47 mm de diámetro,con características de filtración equivalentes a un tamaño de diámetronominal de poro de 0,45 µm.6.2.2 Pinzas de bordes lisos, para manejar las membranas.6.2.3 Frascos muestreadores , de vidrio resistente o cristal refractario de 125mL ó 250 mL., con tapón de cristal esmerilado o tapa de rosca debaquelita, frascos de plástico desechables con tapón de rosca estérilesó, o bolsa de recolección de plástico estériles.6.2.4 Material común de laboratorio.6.2.5 Tubos de fermentación (tipo Duham).6.2.6 Asas de inoculación.7 RECOLECCIÓN, PRESERVACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEMUESTRASEl análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después desu recolección, es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el análisis seincide dentro de las seis horas próximas a la recolección de la muestra y en ningúncaso, este lapso debe exceder de 24 h.Durante el periodo que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar lamuestra a 4°C. Con objeto de inhibir la reproducción bacteriana.8 CONTROL DE CALIDADCada laboratorio que utilice este método está obligado a operar un programa decontrol de calidad (CC) formal.8.1 Es obligatorio para el laboratorio mantener los siguientes registros:- Los nombres, títulos, direcciones y número de teléfono de los analistasque ejecutaron los análisis y el encargado de control de calidad queverificó los análisis.

NMX-AA-102-SCFI-200612/19- Las bitácoras manuscritas del analista y del equipo en los que secontengan los siguientes datos:a) Identificación de la muestrab) Fecha del análisisd) Cantidad de muestra utilizadae) Número de muestras de control de calidad analizadasf) Trazabilidad de las calibraciones de los instrumentos de medicióng) Evidencia de la aceptación o rechazo de los resultadosh) Además el laboratorio debe mantener la información originalreportada por los equipos en disquetes o en otros respaldos deinformación, de tal forma que permita a un evaluador externoreconstruir cada determinación mediante el seguimiento de lainformación desde la recepción de la muestra hasta el resultadofinal.9 CALIBRACIÓNSe debe contar con la calibración de los equipos y materiales siguientes9.1 Balanza granataria y/o analítica.10 PROCEDIMIENTO10.1 Selección del volumen de muestraSeleccionar un volumen de muestra tal o una dilución del mismo que dé menos deaproximadamente 100 colonias en una membrana de 47 mm ó 50 mm de diámetro.Para trabajo rutinario se recomienda una muestra de 100 mL. Cuando se espere uncontenido alto de bacterias, puede tomarse una muestra más pequeña (20 mL); perose recomienda poner en el embudo previamente 50 mL de agua de dilución estéril.10.2 FiltraciónColocar las bases en la unidad filtrante y en ambiente, colocar la membrana con ayudade las pinzas estériles. La cuadrícula de la membrana debe quedar visible.

NMX-AA-102-SCFI-200613/19Colocar el embudo con cuidado y sujetarlo.Agitar vigorosamente la muestra, verter en el embudo y filtrar con ayuda del vacío.Enjuagar con agua de dilución estéril.10.3 Transferencia de la membrana.Después del último enjuague y terminada la filtración, quitar el embudo y con ayuda dela pinza estéril, levantar la membrana y sobreponerla, ya sea en:a) Una caja de Petri con medio de agar.b) Un cojinete absorbente estéril saturado previamente con medio líquidoen una caja de Petri.Asegúrese que no hay burbujas de aires atrapado entre la membrana y el medio. Paradiferentes volúmenes de la misma muestra, puede reutilizarse el equipo de filtraciónsin desinfectarlo, siempre y cuando se filtren primero las diluciones más altas. Parafiltrar otra muestra, usar otro tipo equipo de filtración o bien desinfectar el equipo.10.4 IncubaciónInvertir las cajas de Petri y colocarlas en una incubadora o baño de agua según sea elcaso. Las cajas que contienen membranas en cojinetes absorbentes deben colocarsesiempre en recipientes herméticos para evitar la desecación del medio.Para aislar los organismos Coliformes Totales. Incubar una membrana ya sea 35°C -37°C o entre 18 h y 24 h; para aislar los organismos termotolerantes; incubar la otramembrana a 44°C ± 1°C entre 18 h y 24 h.El mismo tipo de medio generalmente puede usarse para ambas membranas, peroutilizar el medio MFC solamente a 44 ± 1°C y los medios Endo y LES Endo a 35°C ó37°C.10.5 Examen de las membranasDespués de la incubación, las cajas o membranas deben examinarse inmediatamente.Si esto no es posible, almacenarse entre 4°C y 5°C durante períodos cortos, siempre ycuando esto no afecte la apariencia de las colonias.10.5.1 Organismos coliformesExaminar las membranas y contar como organismos coliformes presuntivos todas lascolonias, independientemente del tamaño que muestren, que tengan las siguientescaracterísticas después de su incubación a 35°C ó 37°C:

NMX-AA-102-SCFI-200614/19- En caldo o agar Endo (6.2.1): Un color rojo obscuro con brillo metálicoverde - dorado.- En agar LES Endo (6.2.2): Un color rojo obscuro con brillo metálicoverde - dorado.10.5.2 Considerar como organismos coliformes termotolerantes presuntivostodas las colonias que muestren, después de incubación a 44°C ± 1°C,las mismas características coloniales que se describen anteriormente(10.5.1). Si se usa medio MFC (6.2.3), las colonias serán de color azul.10.6 Es importante hacer notar que las cuentas de colonias en membranas a36°C ± 1°C y a 44°C ± 1°C son solamente resultados de coliformespresuntivos. Dado que no se detecta la producción de gas, hay tambiénun supuesto adicional de que los organismos que forman las coloniaspueden producir gas. Para el análisis de agua cruda o parcialmentetratada, esto puede ser suficiente, pero para agua potable es importantellevar a cabo las pruebas confirmativas.10.6.1 Resembrado, incubación y examen.Para confirmar los resultados de la membrana, resembrar cada colonia (10.5.1) o unnúmero representativo de ellas (una por tubo de fermentación) en agua lactosaPeptona (6.3.1) e incubar a 36°C ±1°C durante 48 h: la producción de gas durante esteperíodo confirma la presencia de organismos coliformes.Para organismos coliformes termotolerantes y E. coli presuntiva en membranas, yasea que hayan sido incubadas a 44°C ±1°C ó 36°C ±1°C, resembrar cada colonia(10.5.1) o un número representativo de ellas (una por tubo), en agua lactosa peptona yagua triptona e incubarlos a 44°C ±1°C durante 24 h. La producción de gas en agualactona peptona confirma la presencia de organismos coliformes termotolerantes y eldesarrollo de un color rojo en la superficie del cultivo en agua de triptona después dela adición de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs (5.4.1) confirma la presencia de E.coli presuntiva.NOTAS:1 El uso de caldo de lauril triptosa manitol con triptofano permite analizartanto la producción de gas como de indol en un solo tubo.2 La detección de E. coli presuntiva se considera una evidenciasatisfactoria de contaminación fecal. Sin embargo, pueden llevarse acabo mayores pruebas para la confirmación de E. coli si se consideranecesario.

NMX-AA-102-SCFI-200615/193 El uso de caldo EC (con tubo de fermentación) se puede utilizar comoprueba confirmaiva para E. Coli10.7 Prueba de oxidasaLas bacterias encontradas en el agua pueden cumplir con algunas característicasbioquímicas de organismos coliformes en muchos aspectos, pero pueden producir gasa partir de lactosa solamente a temperaturas inferiores a 37°C. Por consiguiente, darresultados negativos en las pruebas confirmativas estándar para organismoscoliformes y su presencia en agua usualmente no se considera significativa. Lasespecies de Aeromonas, que se encuentran naturalmente en el agua, tienen unatemperatura óptima de crecimiento en el rango de 30 a 35°C pero a pesar de ellopueden producir ácido y gas a partir de lactosa a 37°C. Tienen poco significado comoindicadores de contaminación fecal y se distinguen del grupo coliforme por unareacción de oxidasa positiva.10.7.1 Llevar a cabo la prueba de oxidasa con subcultivos puros deorganismos fermentadores de lactosa, crecidos en medio nutriente deagar, como sigue:- Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa (6.4.2), recientementepreparado, en un papel filtro en una caja de Petri. (o en su caso utilizarreactivo comercial)- Con una varilla de vidrio o una asa de inoculación de platino (no denicromel), transferir un poco del crecimiento al papel filtro preparado.- Considerar la aparición de un color azul obscuro purpúreo dentro de unperíodo de 10 s como una reacción positiva.NOTA.-En cada ocasión en la que se utilice el reactivo de oxidasa, llevar a cabopruebas de control con cultivos de organismos que se sepa dan unareacción positiva (Pseudomona aeruginosa) y uno que dé una reacciónnegativa (E. coli).11 CÁLCULOSA partir del número de colonias características contadas en las membranas y tomandoen cuenta los resultados de las pruebas confirmativas, calcular el número deorganismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y Escherichia colipresuntiva presentes en 1 100 mL de la muestra, expresando el resultado comounidades formadoras de colonias en un volumen de referencia especificado en lamuestra (generalmente 100 mL ó 1 mL) de acuerdo con la siguiente fórmula:

NMX-AA-102-SCFI-200616/19Colonias coliformes totales Colonias coliformes contadas × volumen de referencia=Volumen de referenciaVolumen filtrado de muestraque puede expresarse como:Cs∑ N=is( n V F ) + ( n V F ) + K + ( n V F )111222nnnVdonde:C ses el número de unidades formadoras de colonias en el volumen dereferencia V s de la muestra.∑N i es la suma de las colonias en todas las cajas o membranas contadasfiltradas/siembras de dilución F 1.n 1 es el número de cajas contadas para una dilución particular F 1 .V 1 es el volumen de dilución de la muestra F 1 en la placa i.F 1es la dilución usada para la porción de muestra V 1 (F = 1 una muestrano diluida,Fes 0,1 para una dilusión a 10 veces, etc.).V s es el volumen de referencia seleccionado para expresar laconcentración de los microorganismos en la muestra.NOTA.-La cuenta final así obtenida es el promedio ponderado de las cuentasde cada una de las placas.11.1 Reporte de la pruebaEl reporte de la prueba debe hacer referencia a esta norma y dar toda la informaciónrelevante, incluyendo:a) Todos los detalles necesarios para la identificación completa de lamuestra;b) La técnica y medios de cultivo empleados;c) El tiempo, temperatura y condiciones de incubación;d) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el punto10.

NMX-AA-102-SCFI-200617/19e) Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis ycualquier operación no especificada en el método o consideradaopcional que pueda haber influido en los resultados.12 NTERFERENCIASColocar en el material de muestreo, previo a la esterilización, 0.1 mL de solución detiosulfato de sodio al 10% en el caso de agua residual con el propósito de inhibir laacción del cloro que puede contener la muestra.13 SEGURIDAD13.1 Este método puede no mencionar todas las precauciones de seguridadasociadas con su uso. El laboratorio es responsable de mantener unambiente seguro y un archivo de las normas de seguridad respecto a laexposición y manejo seguro de las substancias químicas especificadasen éste método. Debe tenerse un archivo de referencia de las hojas deinformación de seguridad el cual debe estar disponible a todo elpersonal involucrado en estos análisis.13.2 Los ácidos y bases concentradas empleadas en este método puedencausar severas quemaduras e irritaciones en la piel, por lo que debeutilizarse ropa protectora tal como batas, guantes y lentes de seguridadcuando se manejan estos compuestos químicos, por lo que se debenprepararse en campana de extracción.14 MANEJO DE RESIDUOSEs la responsabilidad del laboratorio cumplir con todos los reglamentos federales,estatales y locales referente al manejo de residuos, particularmente las reglas deidentificación, almacenamiento y disposición de residuos peligrosos.14.1 Cada laboratorio debe contemplar dentro de su programa de Control deCalidad el destino final de los residuos generados durante ladeterminación14.2 Los desechos ácidos se deben neutralizar para su posterior desecho14.3 Todas las muestras que cumplan con la norma de descarga aalcantarillado pueden descargarse en mismo sistema

NMX-AA-102-SCFI-200618/1915 BIBLIOGRAFÍANOM-001-SEMARNAT-1996NOM-031-ECOL-1993Que establece los límites máximos permisibles decontaminantes en las descargas de aguasresiduales en aguas y bienes nacionales, publicadaen el Diario Oficial de la Federación el 6 de enerode 1997.Que establece los límites máximos permisibles decontaminantes en las descargas de aguasresiduales provenientes de la industria, actividadesagroindustriales de servicios y el tratamiento deaguas residuales a los sistemas de drenaje yalcantarillado urbano o municipal, publicada en elDiario Oficial de la Federación el 18 de octubre de1993.NMX-AA-003-1980 Aguas residuales muestreo. Declaratoria devigencia publicada en el Diario Oficial de laFederación el 25 de marzo de 1980.NMX-AA-008-SCFI-2000NMX-AA-014-1980Análisis de agua - Determinación del pH - Métodode prueba. Declaratoria de vigencia publicada en elDiario Oficial de la Federación el 18 de diciembrede 2000.Cuerpos receptores muestreo. Declaratoria devigencia publicada en el Diario Oficial de laFederación el 5 de septiembre de 1980.NMX-AA-089/01-1986 Protección al ambiente - Calidad del agua -Vocabulario - Parte 1. Declaratoria de vigenciapublicada en el Diario Oficial de la Federación el 15de julio de 1986.NMX-AA-102-1987NMX-AA-115-SCFI-2001Calidad del agua - Detección y enumeración deorganismos coliformes, termotolerantes yescherichia coli presuntiva - Método de filtración enmembrana. Declaratoria de vigencia publicada en elDiario Oficial de la Federación el 28 de agosto de1987.Análisis de agua - Criterios generales para elcontrol de la calidad de resultados analíticos.Declaratoria de vigencia publicada en el DiarioOficial de la Federación el 17 de abril de 2001.

NMX-AA-102-SCFI-200619/19NMX-AA-116-SCFI-2001NMX-BB-014-1973ISO 9308/1Análisis de agua - Guía de solicitud para lapresentación de métodos alternos. Declaratoria devigencia publicada en el Diario Oficial de laFederación el 17 de abril de 2001.Clasificación y tamaños nominales para utensiliosde vidrio, usados en laboratorio. Declaratoria devigencia publicada en el Diario Oficial de laFederación el 24 de agosto de 1973.Water quality - Detection and enumeration ofcoliform organisms, thermotolerant coliformorganisms and presumptive Escherichia coli by themembrane filtration methodProcedimiento Obligatorio para el Muestreo de Descargas.- Artículo 278-B de la LeyFederal de Derechos.- 1997.Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 20a edición, 1998.Criterios Ecológicos de Calidad del Agua, publicados en el Diario Oficial de laFederación el 13 de diciembre de 1989.16 VIGENCIA DE ESTA NORMALa presente norma entrará en vigor 60 días naturales después de la publicación deesta declaratoria de vigencia en el Diario Oficial de la Federación.17 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALESEsta norma mexicana es equivalente a la norma internacional ISO 9308/1.México D.F., aMIGUEL AGUILAR ROMODIRECTOR GENERALRCG/OMF/DLR.

SECRETARIA DE COMERCIOYFOMENTO INDUSTRIALNORMA MEXICANANMX-AA-087-1995-SCFIANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CONDaphnia magna Status (Crustacea – Cladecera) – METODO DEPRUEBAWATRER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Daphaniamagna Stratus (Crustacea – Cladocera) – TEST METHODDIRECCION GENERAL DE NORMAS

NMX-AA-087-1995-SCFIPREFACIOEn la elaboración de esta Norma Mexicana, participaron las siguientes instituciones yempresas:- ASOCIACION NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUIMICA- BECTON DICKSON DE MEXICO- CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE LA CELULOSA Y PAPEL- CAMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA HULERA- COMITÉ TECNICO DE NORMALIZACION NACIONAL DE PROTECCION ALAMBIENTE- CONFEDERACION NACIONAL GANADERA- EMPRESA PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION DEL AGUA ENLA ZONA DEL CIVAC- F . .J. SALCEDO Y COMPAÑÍA- INSTITUTO POLITECNICO NACIONALEscuela Nacional de Ciencias Biológicas- INSTITUTO TECNOLOGICO DE ZACATEPEC- JUNTA MUNICIPAL DE AGUA Y SANEAMIENTO DE CIUDAD JUAREZ,CHIHUAHUA- PETROLEOS MEXICANOSGerencia de Protección ambiental- SECRETARIA DE COMERCIO Y FOMENTO INDUSTRIALDirección General de Promoción y Operación Minera- SECRETARIA DE MARINAComisión Nacional de AguasDirección General de Acuacultura;Instituto Mexicano de Tecnología del Agua;Instituto Nacional de la Ecología;Instituto Nacional de la Pesca.- UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEONFacultad de Medicina

NMX-AA-087-1995-SCFI- UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANAUnidad Iztapalapa- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICOFacultad de Estudios Superiores - Cuatitlán

NMX-AA-087-1995-SCFIINDICE DEL CONTENIDOCapítulo1 Objetivo2 Campo de Aplicación3 Referencias4 Definiciones5 Muestreo6 Principio7 Reactivos y materiales8 Aparatos9 Preparación y acondicionamiento de la muestra10 Procedimiento11 Expresión de los resultados12 Informe de la prueba13 ApéndicesABCComo formar una muestra compuesta – EjemploDeterminación del intervalo de concentraciones – EjemplosDeterminación del intervalo de concentraciones – Ejemplos14 Bibliografía15 Concordancia con normas internacionalesApéndice (informativo)

NMX-AA-087-1995-SCFIANALISIS DE AGUA – EVALUACION DE TOXICIDAD AGUDA CON Daphniamagna Status (Crustacea – Cladecera) – METODO DE PRUEBAWATRER ANALYSIS – ACUTE TOXICITY EVALUATION WITH Daphania magnaStratus (Crustacea – Cladocera) – TEST METHOD1 OBJETIVOLa presente Norma Mexicana establece el método para el análisis biológico de calidad delagua mediante pruebas de toxicidad aguda utilizando al organismo dulceacuíola Daphniamagna Stratus 1820 (Crustacea – Cladocera).2 CAMPO DE APLICACIÓNEste método es aplicable para la evaluación de toxicidad aguda en cuerpos de agua dulce,así como aguas residuales industriales, efluentes agrícolas, municipales y sustancias purascombinadas o lixiviados.3 REFERENCIASEsta norma se complementa con las siguientes Normas Mexicanas vigentes:NMX-AA-003Aguas residuales – Muestreo.NMX-AA-007Aguas – Determinación de la temperatura.NMX-AA-008Aguas – Determinación del Ph.NMX-AA-014Cuerpos receptores – Muestreo.NMX-AA-072Análisis de agua - Determinación de la dureza – Método del E.D.T.A.(Acido etilen diamino tetra – acético).NMX-AA-093 Protección al ambiente – Contaminación del agua – Determinaciónde la conductividad eléctrica.

NMX-AA-087-1995-SCFI4 DEFINICIONESPara los propósitos de esta Norma Mexicana se establecen las siguientes definiciones:4.1 AclimataciónEs la adaptación fisiológica a un nivel particular de una o más variables ambientales. Eltérmino es generalmente referido al control en condiciones de laboratorio.4.2 Agua desionizadaEs el agua que ha sido tratado para remover los iones de la solución para obtener unaconductividad menor o igual a 2 µmhos/cm.4.3 Agua de diluciónEl agua natural o reconstituida que por las características óptimas que presenta para lasobrevivencia y reproducción y reproducción de los organismos usados en pruebas detoxicidad, es utilizada para preparar las diferentes diluciones o concentraciones efectuadasdurante una prueba, sea ésta exploratoria o definitiva.4.4 Agua reconstituidaEs el agua desionizada o destilada con reactivos químicos adicionales. El resultado es aguadulce sintética libre de contaminantes y con características deseables de Ph y dureza. Seprepara con sales inorgánicas que se adicionan en la cantidad requerida por el organismoprueba.4.5 Aguas residualesSon las aguas de composición variada provenientes de las descargas municipales,industriales, comerciales, agrícolas, pecuarias, domésticas y en general de cualquier otra.4.6 CladoceraEs el orden taxonómico al que pertenecen las comúnmente llamadas “pulgas de agua”. Lasvalvas del caparazón de los organismos cubren solamente el tronco y los apéndices.4.7 Concentración letal (Cl)Es la concentración de una sustancia (pura o combinada), o efluente que produce la muertedel organismo.

NMX-AA-087-1995-SCFI4.8 Concentración letal media (Cl 50 )Es la concentración de una sustancia (pura o combinada), o efluente que origina un efectoletal en el 50% de los organismos expuestos.4.9 ContaminanteEs toda materia o energía en cualesquiera de sus estados físicos y formas que alincorporarse o actuar en la atmósfera, agua, suelo, flora, fauna o cualquier elemento natural,altere o modifique su composición y condición natural.4.10 Cuerpos de aguaSon los lagos, lagunas costeras, estuarios, acuíferos, redes colectoras, con excepción de lossistemas de drenaje y alcantarillado urbano y municipal, ríos y sus afluentes directos oindirectos, permanentes o intermitentes, presas, cuencas, cauces, canales, embalses,cenotes, manantiales y demás depósitos o corrientes de agua.4.11 DáfnidoEs el nombre castellanizado que reciben los organismos del género Daphnia conocidoscomo ”pulga de agua”.4.12 Daphnia magnaEs un microcrustáceo del orden Cladocera de 1 mm a 1, 5 mm de longitud los neonatos, yde 4 mm a 6 mm los adultos (ambos, visibles a simple vista).Es un representante importante de las comunidades dulceacuícolas con gran sensibilidad auna amplia gama de compuestos tóxicos, siendo ésta una de las características principalespara que sea usado internacionalmente en pruebas de toxicidad. Asimismo, su ciclo de vidacorto y fácil cultivo en laboratorio, permite realizar pruebas rápidas y económicas (verfigura 1).4.13 DescargaAguas residuales que se vierten directa o indirectamente en algún cuerpo de agua o sistemade drenaje y alcantarillado urbano y municipal, incluyéndose los procesos de infiltración einyección.4.14 Ecosistema acuáticoEs la unidad funcional básica de interacción de los organismos vivos entre sí y de estos conel ambiente acuático en un espacio y tiempo determinado.

NMX-AA-087-1995-SCFI4.15 Efecto agudoEs aquel que se manifiesta en una respuesta inmediata (en invertebrados acuáticos se hablacomúnmente de 24 h a 48 h) del organismo al tóxico o tóxicos a los que ha sido expuesto.Usualmente produce inmovilidad o muerte.4.16 Efecto agudoEs la respuesta a un estímulo que se produce durante una gran parte del ciclo de vida delorganismo expuesto, generalmente se manifiesta en su crecimiento y reproducción.4.17 EfluenteEs el agua u otro líquido que procede de un embalse, cuenca, proceso o planta detratamiento.4.18 FotoperíodoEs la duración de iluminación y obscuridad en un lapso de 24 h.4.19 InmovilidadEs la incapacidad de los dáfoidos para mover sus antenas natatorias (ver figura 1). Despuésde 10 s de haberlos separado con una pipeta Pasteur de punta recortada y expuesto a la luzblanca de una lampara de 60 W a una distancia de 10 cm. Este criterio se emplea en estaNorma Mexicana en caso de que se tenga duda de la muerte de los organismos.4.20 LixiviadoEs el líquido provenientes de los residuos, el cual se forma por reacción, arrastre opercolación y que contiene disueltos o en suspensión, componentes que se encuentran enlos mismos residuos.Es la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar unvolumen proporcional al caudal, de manera que éste resulte representativo de la descarga deaguas residuales, medido en el sitio y en el momento del muestreo.

NMX-AA-087-1995-SCFI4.21 Muestra simple o instantáneaEs la que se toma ininterrumpidamente durante el período necesario para completar unvolumen proporcional al caudal, de manera que éste resulte representativo de la descarga deaguas residuales, medido en el sitio y en el momento del muestreo.4.22Muestra compuestaEs aquella que se forma con la mezcla de muestras simples o instantáneas tomadas en unefluente industrial, agrícola o municipal. El número de muestras simples depende de lashoras por día que opere el proceso generador de la descarga.4.23NeonatosSon los dáfnidos de 1 mm a 1.5 mm de longitud y edad menor a 24 h utilizados en pruebasde toxicidad.

NMX-AA-087-1995-SCFI4.24 Prueba de toxicidad (bioensayos de toxicidad)Es la exposición controlada de organismos a sustancias puras, combinadas y aguasprovenientes de cuerpos de agua, para evaluar su efecto.4.25 Tiempo de exposiciónEs el período al que se someten los organismos a las soluciones de prueba en un bioensayode toxicidad.4.26 ToxicidadEs el efecto adverso que procede un tóxico.4.27 Toxicidad agudaEs el efecto letal que se produce después de exponer a los organismos prueba a sustancias(puras o combinadas) o efluentes una sola vez, durante un período corto. Para Daphniamaga es de 48 h.4.28 TóxicoEs cualquier sustancia (pura do combinada) o efluente que al entrar en contacto con elorganismo produzca daños estructúrale, alteraciones bioquímicas o fisiológicas o incluso lamuerte, dependiendo de la concentración y del tiempo de exposición.4.29 Tóxico de referenciaEs una sustancia química utilizada en bioensayos de toxicidad, cuyo efecto en losorganismos a determinadas concentraciones es conocido, y por lo tanto, permite establecerel estado de respuesta de los organismos de prueba empleados, así como comparar losresultados intra e inter laboratorios . El uso de estos tóxicos, proporciona también unaevaluación general de la precisión (estabilidad y respetabilidad) del método a través deltiempo.4.30 Toxicología acuáticaEs el estudio cualitativo y cuantitativo de los efectos adversos producidos por productosquímicos y materiales antropogénicos sobre los organismos acuáticos.5 MuestreoEl muestreo tanto de cuerpos de aguas como de efluentes industriales, agrícolas,municipales y / o urbanos y lixiviados, constituye una parte integral y fundamental decualquier programa de monitoreo de la calidad del agua, pues proporciona bases para la

NMX-AA-087-1995-SCFIevaluación de propiedades y efectos potenciales del agua, sobre los organismos delecosistema.5.1 Muestreo en efluentes industriales, agrícolas municipales y urbanosSe toman muestras compuestas de dos litros, (volumen total) en recipientes depolipropileno o de vidrio borisilicato, de acuerdo como se especifica en la tabla1.TABLA 1.- Muestras instantáneas requeridas para formar un muestra compuestaHoras por día queOpera el procesoGenerador de ladescargaHasta 8 hMás de 8 h y hasta 12 hMás de 12 h y hasta 18 hMás de 18 h y hasta 24 hNúmero de muestras4466Intervalo para laObtención de muestrassimplesMínimo (h) Máximo (h)1,0 2,02,0 3,02,0 3,03,0 4,0Con el fin de hacer explícito qué volumen de las muestras simples provenientes deefluentes es necesario para la preparación de una muestra compuesta, se presenta unejemplo en el Apéndice A.5.2 Muestreo en cuerpos de aguaEl muestreo se debe llevar a cabo tomando una muestra compuesta, se presenta un e unejemplo en el Apéndice A.El muestreo se debe llevar a cabo tomando una muestra instantánea o simple de dos litros,siguiendo los lineamientos descritos en la NMX-AA-014 (ver 3 Referencias).Además deben tomarse en consideración los parámetros fisico-químicos básicos (pH,oxígeno disuelto, conductividad y temperatura de agua y aire), registrando las siguientescaracterísticas aparentes:- Olor- Color- Turbiedad- Presencia o ausencia de burbujas y espuma

NMX-AA-087-1995-SCFI6 PRINCIPIOEste método se basa en la exposición controlada del crustáceo del orden Cladocera(Daphnia magna) a cuerpos de agua, sustancias puras, combinadas o efluentes y lixiviadospara evaluar el efecto que producen en dicho organismo.7 REACTIVOS Y MATERIALES7.1 Reactivos (grado analítico)- Acido bórico (H 3 BO 3 )- Acido etilen diamino tetra-acético (EDTA) *- Acido nítrico (HNO 3 ) al 30%- Acido sulfúrico concentrado (H 2 SO 4 )- Acetona (C 3 H 6 O)- Agua destilada o desionizada (H 2 SO 4 )- Bicarbonato de sodio (NaHCO 3 )- Cloruro de calcio (CaCl 2 -2H 2 O)- Cloruro de manganeso (MnCl 2 4H 2 O)- Cloruro de potasio (KCl)- Cloruro de sodio (NaCl)- Dodecil sulfato de sodio (SDS) **- Fosfato monobásico de potasio (KH 2 PO 4 )- Fosfato dibásico de potasio (K 2 HPO 4 )- Hidróxido de potasio (KOH)- Nitrato de cobalto Co (NO 3 ) 2 -6H 2 O- Nitrato de sodio NaNO 3- Oxido de molibdeno (MoO 3 )- Selenito de sodio (Na 2 SeO 3 )- Sulfato de calcio (CaSO 4 -2H 2 O)- Sulfato de cobre (CuSO 4 -5H 2 O)- Sulfato ferroso (FeSO 4 -7H 2 O)- Sulfato de magnesio (MgSO 4 -7H 2 O)- Sulfato de zinc (ZnSO 4 -7H 2 O)7.2 Materiales- Cajas petri- Cubrebocas- Detergente- Frascos ámbar con tapón de plástico- Frascos de boca ancha de 1000 ml- Garrafón de vidrio de 20 L- Guantes de látex desechables- Matraces Erlenmeyer de 1000 ml

NMX-AA-087-1995-SCFI- Matraces volumétricos de diferentes capacidades- Pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml y 10 ml- Pipetas Pasteur con punta recortada- Pipetas volumétricas de diferentes capacidades- Probetas graduadas de 100 ml- Propipetas- Recipientes de polietileno, polipropileno o de vidrio borosilicato de 2 L- Vasos de precipitados tipo Griffin de 150 mlNOTA 1- * El E.D.T.A. debe ser valorado.NOTA 2- ** Reactivo utilizado como tóxico de referencias.8 APARATOS- Agitador magnético- Autoclave- Balanza analítica- Cámara de Neubauer- Centrífuga- Conductímetro- Congelador (-28ºC)- Controlador de fotoperíodo “Timer”- Luxómetro- Microscopio óptico- Oxímetro- Potenciómetro- Refrigerador (de 0ºC a 4ºC)- Termómetro9 PREPARACION Y ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRALas muestras, tanto simples o instantáneas como compuestas deben ser almacenadas enrecipientes limpios de polietileno, polipropileno o de vidrio borosilicato; éstos deben serllenados totalmente y sellados. Los envases no deben ser reutilizados.Las muestras deben mantenerse a una temperatura de 4ºC ± 2ºC hasta su llegada allaboratorio. A menos que las pruebas de toxicidad se efectúen 6 h posteriores a la colecta, yhasta 36 h, se deben mantener a 4 ºC ± 2ºC.Después de 36 h y hasta 60 días posteriores a la fecha de colecta, se deben congelar a –28ºC(utilizando un congelador) para evitar cambios debidos a la actividad microbiana,transformación química y/o perdida de sustancias volátiles.

NMX-AA-087-1995-SCFILas muestras que se considera válido para el inicio del bioensayo depende de la forma en laque se preserva con ningún producto químico.El tiempo que se considera válido para el inicio del bioensayo depende de la forma en laque la que se preserve la muestra, es decir:- Hasta 36 h, las muestras mantenidas a temperatura ambiente.- Hasta 36 h, las muestras mantenidas a 4ºC ± 2ºC.- Hasta 60 días, las muestras que sean congeladas a –28ºC.Las muestras preservadas por más de 60 días no deben ser usadas para realizar pruebas detoxicidad.El tiempo cero, en una muestra compuesta es el tiempo de la toma de la muestra compuesta,es el tiempo de la ultima colecta simple o instantánea.El tiempo final considerado para la validez de la prueba, es el momento en el que losrecipientes de prueba.10 PROCEDIMIENTO10.1 Actividades previas en el laboratorioUna vez que se conoce la fecha exacta en la que se debe llevar a cabo el bioensayo, sedeben llevar a cabo el bioensayo, se deben realizar las siguientes actividades, con lafinalidad de iniciar la prueba en el preciso momento en que la muestra arribe al laboratorio.10.2 Condiciones ambientales para el cultivo de Daphnia magnaPara la instalación de un cultivo de Daphnia magna, se debe contar con un área mínima de6 m², que debe estar libre de sustancias tóxicas (gases, vapores, cualquier otra.) que puedanentrar en contacto directo con los cultivos. Esta debe tener los aditamentos necesarios paramantener una temperatura entre 18ºC y 22ºC, y fotoperíodo de 16 h luz/8h obscuridad,utilizando un termómetro y un controlador de fotoperíodo “Timer” respectivamente.A continuación se establecen las condiciones que deben contemplarse para tener en últimoestado al cladócero Daphnia magna:

NMX-AA-087-1995-SCFI10.2.1 IluminaciónEs necesario mantener constante la intensidad de luz en el área donde se encuentren losorganismos, ya que los cambios en la intensidad provocan que naden hacia la superficie yqueden atrapadas al no poder romper la tensión superficial del agua.Para la iluminación del cultivo deben utilizarse lámparas fluorescentes “luz de día” queproporcionen una luminosidad a los cultivos de 600 luces * a 1000 luxes, medida con unluxómetro ; asimismo mantener un fotoperíodo de 16 h luz/8 h obscuridad.• luxes se abrevia lx.10.2.2 TemperaturaMantener la temperatura del agua de los cultivos a 20ºC ± 2ºC.10.2.3 Oxígeno disueltoLos niveles del oxígeno disuelto se deben mantener por arriba de 3 mg/L, esto se lograrenovando completamente el medio de cultivo una vez por semana.10.2.4 pHEs necesario que los valores de pH se mantengan en un intervalo de 7,5 a 8,5.10.2.5 ConductividadEs indispensable que sea mantenida entre 250 µmhos/cm y 600µmhos/cm.10.2.6 Dureza totalEs necesario que se encuentre entre 160 mg/L y 180 mg/L de carbonato de calcio (CaCO 3 ).10.3 Condiciones para el cultivo y mantenimiento de los organismosEl cuidado que se debe tener con los organismos en cultivo, es una de las tareas que van aconducir a que se tenga un lote controlado de dáfnidos cuya densidad no debe ser mayor de15 organismos/L de agua reconstituida. Cada lote debe ser iniciado con neonatos de menosde 24 h de nacidos en estado óptimo, colocándolos en recipientes de boca ancha de 1L. Unavez transcurridos loa 7 días, se ha alcanzado la madurez sexual; del séptimo al noveno día,se presenta la primera progenie o descendencia; una vez que se ha dado ésta, cada 2 días ó3 días se obtienen descendencias sucesivas a partir del mismo adulto.

NMX-AA-087-1995-SCFIEl cuidado del cultivo conlleva los siguientes aspectos:10.3.1 Recambio de aguaEl agua de cultivo, después de un tiempo determinado, va a perder su característicasiniciales debido a la materia orgánica acumulada, producto de los desechos de losorganismos y de residuos alimenticios; por ende, debe ser renovada completamente una vezpor semana .10.3.2 LimpiezaTodos los recipientes usados en los cultivos, deben ser limpiados al menos dos veces porsemana para evitar problemas de acumulación excesiva de microorganismos (los dáfnidos,dentro de su dieta toleran cierto número de bacterias, sin embargo una cantidad excesivapuede ocasionarles problemas serios).10.3.3 AlimentaciónLa calidad de la dieta alimenticia es uno de los aspectos considerados como importantesdentro del cultivo de los organismos, ya que de ello depende la sobrevivencia y tasareproductiva óptima de los dáfnidos.El alimento está constituido por cualquiera de las siguientes tres especies de microalgasverdes: Chlorella vulgaris, Ankistrodemus falcactus y Scenedesmus incrassatulus.La alimentación se realiza hasta 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes, porejemplo). La cantidad de alimento suministrada a la Daphnia cada tercer día debe ser de 0,4 células/ml, 1,3 células/ml de Ankistrodemus vulgaris, Scenedesmus incrassatulus yChlorella vulgaris, respectivamente, utilizando pipetas graduadas de 1ml, 5 ml ó 10ml. Elconteó de las células algales se efectúa con la ayuda de una cámara de Neubauer ohematócimetro (ver capítulo 14 inciso 14.2).Las microalgas se separan del medio del cultivo antes de ser suministradas como alimento.La separación se hace por configuración, filtración o sedimentación.Las microalgas concentradas se conservan en obscuridad y refrigeración a 4ºC ± 2ºC enfrascos ámbar, utilizándose como alimento inmediatamente y hasta por un período máximode 2 semanas, después del cual debe desecharse cualquier remanente y emplear un nuevoconcentrado.Para el cultivo de las microalgas verdes se emplea el medio de cultivo Bold Basal descritoen la tabla 2.

NMX-AA-087-1995-SCFITABLA 2.- Medio de cultivo Bold BasalReactivoNaNO3CaCl2.2H2OMgSO4.7H2OK2HPO4KH2PO4NaClFeSO4.7H2OH2SO4.conc.H3BO3E.D.T.A.KOHZnSO4.7H2OMnCl2.4H2OMoO3CuSO4.5H2OCo(NO3) 2.6H2OConcentración250257575175254, 980, 001**11, 4250318, 821, 440, 711, 570, 49NOTA 3 - * En agua destilada o desionizada.NOTA 4 - ** ml/L.Una vez preparado el medio se esteriliza en autoclave durante 15 min a 1, 01 kg/cm².10.4 Selección de organismos de pruebaVeinticuatro horas antes de iniciar la prueba deben ser seleccionadas las hembras grávidasque se esperan tengan sus neonatos en ese lapso; deben ser colocadas en agua reconstituidase elabora de acuerdo a la técnica descrita en el inciso 10.5.5.1. Aproximadamente 1 h antesde iniciar la prueba, se deben separar los neonatos de los recipientes que contienen a lasmadres, utilizando una pipeta Pasteur con la punta recortada. De esta manera se garantizaque los neonatos utilizados en las pruebas de toxicidad tengan menos de 24 h de edad.Los organismos capturados deben ser colocados en pequeñas cajas petri antes de serfinalmente transferidos a las diluciones correspondientes.Este criterio de selección es válido sólo para neonatos de la segunda a la octava progenie.10.5 Lavado de material y cristaleríaTodos los recipientes que entren en contacto con las muestras que van a ser usadas en elmuestreo, deben lavarse perfectamente para evitar que contengan residuos potencialmentetóxicos a los organismos de prueba, utilizando el método que se describe a continuación:

NMX-AA-087-1995-SCFI10.5.1 Lavar el material con detergente y enjuagar dos veces con agua de la llave.10.5.2 Enjuagar el material con ácido nítrico (HN3) al as30 % para eliminarresiduos metálicos. Enjuagar con agua desionizada escurrir.10.5.3 Enjuagar con acetona (C3 H6 O) para eliminar residuos orgánicos . Enjuagarcon agua desionizada. Dejar secar completamente.Esta serie de lavado tienen que llevarse a cabo de 24 h a 48 h antes del bioensayo,protegiendo el material de polvo y otros factores.10.5.4 Enjuagar perfectamente con agua reconstituida.10.5.5 Minutos antes de iniciar el bioensayo, enjuagar los recipientes que van acontener a los organismos con agua reconstituida.El uso del agua reconstituida es necesario porque:- Es de composición química conocida.- Permite resultados reproducibles.- Permite crecimiento y reproducción adecuada.Para Daphnia magna se utiliza agua reconstituida cuya dureza sea de 160 mg/L a 180 mg/Ly el pH entre 7,5 y 8,5 . Su preparación debe efectuarse al menos con 72 h de anticipación,cuidando que se efectúe tal y como se indica en el punto siguiente, ya que de ello dependeen gran parte tanto el cultivo óptimo de los organismos como la culminación exitosa de laprueba.10.5.5.1 PreparaciónColocar 19 L de agua destilada o desionizada en un garrafón de vidrio de 20 Lperfectamente limpio. Cualquiera que sea el tipo de agua seleccionado, debe utilizarsedurante todo el proceso y cada vez que se realice la prueba. Asimismo, es necesarioindicarlo en los resultados.Agregar 2,4 g de sulfato de magnesio (MgSO4) ; 3,48 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3)y 0,16 g de cloruro de potasio (KCl) al recipiente en el orden respectivo.Agregar 2,4 g de sulfato de calcio (CaSO4 – 2H2O) a 1000 ml de agua destilada odesionizada en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml. Colocar la solución sobre un agitadormagnético hasta que el sulfato de calcio (CaSO4 – 2H2O) esté completamente disuelto.Adicionar a los 19 L preparados con anterioridad y mezclar perfectamente. Adicionar 20 µgde selenito de sodio (Na2SeO3). Airar por lo menos 24 h.

NMX-AA-087-1995-SCFIPara detectar la calidad óptima del agua reconstituida, se debe colocar durante 24 h a 10neonatos en una muestra de 100 ml; sí al término del se registra mortalidad el agua puedeser utilizada en el cultivo y/o en la prueba.10.6 Calibración de aparatos, preparación y valoración de reactivos utilizados enanálisis químicosSe debe efectuar una calibración de aparatos (potenciómetro, oxímetro y conductímetro) yla preparación y valoración del E.D.T.A (Acido etilien diamino ultra-acético) 0,01 M enbase a la NMX-AA-072 (ver 3 Referencias).10.7 Período de pruebaCuando la muestra llegue al laboratorio, se debe medir y anotar la temperatura, el pH yconductividad. Sí el análisis no va a ser efectuado inmediatamente, mantener la muestra deacuerdo al inciso 9 de esta Norma Mexicana hasta que sea procesada. En caso de que lamuestra llegue congelada al laboratorio, estos parámetros se determinan al inciso delbioensayo. La muestra debe congelarse a temperatura ambiente.Las aguas provenientes de efluentes industriales, agrícolas, municipales y urbanos, debenser evaluados a partir de una prueba exploratoria y una definitiva. Para cuerpos de aguaúnicamente se realiza una prueba definitiva.10.7.1 Prueba exploratoria en efluentes industriales, agrícolas, municipales yurbanosEsta prueba sirve para determinar si un efluente es tóxico o no, y en su caso, permite definiral intervalo de concentraciones que se deben aplicar en una prueba definitiva. En estebioensayo se prueban cinco concentraciones del efluente: 100 %, 50 %, 25 %, 12 % y 6 %,más un testigo, siguiéndose los lineamientos de la tabla 3 de esta Norma Mexicana.TABLAS 3.- Condiciones de la prueba exploratoria con Daphnia magna.CondicionesTipo de pruebaEstática sin renovación de laSolución de pruebaDuración24 hLuminosidad600 luxes* - 1000 luxesFotoperíodo16 h luz/ 8 h oscuridadVolumen de los recipientes de prueba 150 ml(vasos de precipitado tipo Griffin)Volumen de agua reconstituida 50 mlEdad de los organismosMenos de 24 hNúmero de réplicas 2

NMX-AA-087-1995-SCFINúmero de organismos de réplica 10Aireación de los recipientes de prueba NoAgua de diluciónReconstituida duraTemperatura 20ºC ± 2ºCAlimentaciónNoVolumen total de muestra por prueba 100 mlRespuesta evaluadaInmovilidadCriterio de aceptación de la prueba Sobrevivencia mayor o igual a 90 %en testigosNOTA 5 – Para la presentación de las muestras al 100 % y de los testigos, se puedenutilizar probetas graduadas de 100 ml.* luxes se abrevia lx.10.7.2 Prueba definitiva en efluentes industriales, agrícolas, municipales y urbanosUna vez registradas las observaciones obtenidas en la prueba exploratoria, se determina elintervalo de concentraciones que debe ser usado en la prueba definitiva.El tiempo de exposición en la prueba definitiva es mayor que en la exploratoria; por lotanto, la mortalidad puede incrementarse al final de la aprueba y entonces la CL50 no caedentro del intervalo seleccionado.Al finalizar la prueba exploratoria, se deben efectuar observaciones a los organismos quecontinúan vivos para determinar de acuerdo al estado de afectación, si es adecuado o nomodificar el intervalo seleccionado en la prueba definitiva (ver Capitulo 13 inciso 13.2).10.7.3 Prueba definitiva en cuerpos de aguaEl número mínimo de diluciones que deba realizarse en esta prueba es de 4 y la muestra al100 %. Estas se efectúan considerando un factor de dilución de 0,5, utilizando para elloprobetas graduadas de 50 ml y 100 ml, y pipetas graduadas de 1 ml, 5 ml y 10 ml deacuerdo a las diluciones, de tal forma que se obtenga la siguiente serie de concentraciones:100 %, 50 %, 25 % y 6,25 % ; además por supuesto , el testigo.En las pruebas definitivas para efluentes y cuerpos de agua, se deben preparar al menos 3réplicas.El conteo de inmovilidad debe efectuarse cada 24 h para calcular la CL50 a 24 h y 48 h (vercapítulo 4 inciso 4.19).

NMX-AA-087-1995-SCFI10.8 Parámetros a evaluar durante la pruebaLos parámetros fisicoquímicos que comúnmente se evalúan en un bioensayo, estáncontenidos en las normas indicadas en el punto 3 de está Norma Mexicana. Durante laprueba, los parámetros fisicoquímicos se determinan al inicio y al término de la prueba enuna serie de las réplicas (diluciones y muestra al 100 %) y en un testigo.Para fin de esta Norma Mexicana, el oxígeno disuelto se determina mediante el empleo deun oxímetro.En la tabla 4 de esta Norma Mexicana se agrupan las condiciones que deben observarsedurante una prueba definitiva en muestras provenientes de efluentes industriales, agrícolas,municipales y urbanos, así como en cuerpos de agua .10.9 Evaluación de sensibilidadSe debe elaborar un programa de control de calidad en el laboratorio que realice pruebas detoxicidad , para garantizar que se puedan realizar comparaciones de resultados intra e interlaboratorios . Para evaluar la sensibilidad del organismo de prueba (Daphnia magna), seutiliza el tóxico de referencia que se establecen en el inciso 10.9.3 de esta NormaMexicana.10.9.1 Los tóxicos de referencia tienen como principales características lassiguientes:- Amplio espectro tóxico.- Facilidad de obtención en forma pura.- Alta solubilidad en agua.- Persistencia y estabilidad en solución.- Estabilidad en Almacenamiento.- Facilidad de cuantificación,10.9.2 La sensibilidad de Daphnia magna se evalúa mediante la determinación de laCL50 en un bioensayo de 48 h, aplicando concentraciones establecidas deltóxico de referencia. El método y las condiciones de prueba deben ser losdescritos en la presente Norma Mexicana.10.9.3 El tóxico de referencia que se debe emplear en esta prueba es el dodecilsulfato de sodio (SDS), en las siguientes concentraciones: 2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L, 16mg/L y 32 mg/L. La CL50 de referencia para este tóxico es de 14,5 mg/L + 4,5 mg/L. LaCL 50 sea mayor o menor que dicho intervalo. Siendo necesario revisar los posibles factoresde variabilidad, tales como:

NMX-AA-087-1995-SCFITABLA 4.- Condiciones de la prueba definitiva con Daphnia magnaCondicionesTipo de pruebaEstática sin renovación de la pruebaDuración48 hLuminosidad600 luxes * - 1000 luxesFotoperíodo16 h luz / 8 h oscuridadVolumen de los recipientes de prueba 150 ml(vasos de precipitado tipo Griffin)Volumen total (agua reconstituida más 100 mlMuestra)Edad de los organismosMenos de 24 hNúmero de réplicas por concentración 3Número de organismos por réplica 10Aireación de los recipientes de prueba NoAgua de diluciónReconstituida duraTemperatura 20ºC ± 2ºCAlimentaciónNoRespuesta evaluadaInmovilidad a 24 h y 48 hCriterio de aceptación de la prueba Sobrevivencia mayor o igual al 90 % en losTestigosNOTA 6 – Las diferentes concentraciones que se preparen en las pruebas exploratorias yformales deben realizarse utilizando pipetas y/o matraces volumétricos de diferentescapacidades, excluyendo sólo a las muestras al 100 % y a los testigos.* luxes se abrevia lx.10.9.3.1 Método de cultivo mantenimiento de los organismos de prueba.10.9.3.2 Edad y estado de salud de los organismos.10.9.3.3 Manejo de los neonatos.10.9.3.4 Pericia y consistencia en la realización de las pruebas por parte de losanalistas.10.9.4 Una vez que se han revisado minuciosamente los factores mencionados yque se han descartado a los dos últimos como los responsables de lamodificación de la sensibilidad del lote de Daphnia magna empleado, sedebe revisar el método de cultivo . En caso extremo, se recomienda norealizar más bioensayos con dicho lote y sustituirlo con uno nuevo para laprueba el cual también debe ser evaluado.

NMX-AA-087-1995-SCFI10.9.5 El tóxico de referencia descrito en esta Norma Mexicana puede ser sustituidopor cualquier otro, siempre y cuando cumpla con las característicasseñaladas en el inciso 10.9.1 de esta norma.11 EXPRESION DE RESULTADOSPara la obtención de la CL50 (concentración letal media) se recomienda utilizar el “Métodode Unidades Probabilisticas” “Probit” (ver Capítulo 14 inciso 14.12), el cual evalúa larelación concentración respuesta de un contaminante sobre un organismo, medido entérminos de su CL 50 y su precisión o intervalo de confianza de acuerdo a los lineamientosque se establecen a continuación:11.1 Método ProbitEl método Probit, también conocido como “Método de Unidades Probabilísticas” esutilizado para evaluar la relación dosis respuesta de un contaminante sobre un organismo,medida en términos de la concentración letal media (CL50) y su precisión o intervalo deconfianza.11.1.1 Determinación de la concentración letal media (CL50)La obtención de la CL50 se realiza por el Método Probil , cuya secuencia se explica acontinuación, y en el Apéndice C se desarrolla un ejemplo.11.2 Paso 1Preparar una tabla con los siguientes datos:11.2.1 Concentración del efluente usado en la prueba (%)11.2.2 Logro de la concentración de efluente (X)11.2.3 Número de organismos por concentración (N)11.2.4 Mortalidad observada por concentración (r)11.2.5 Porcentaje de mortalidad por concentración (P)11.2.6 Probit empírico (EP)11.2.7 Probit calculado (CP)11.3 Paso 2Los incisos 11.2.1 al 11.2.5 del paso 1, son abtenidos directamente de los resultados delbioensayo.11.4 Paso 3El valor de probit empírico se obtiene de tabla 5, a partir del 5 % de mortalidad porconcentración.

NMX-AA-087-1995-SCFI11.5 Paso 4Graficar en papel el Loy10 de las concentraciones en el eje “X” y los Probit empíricos en eleje “Y” (ver Capítulo 13 inciso 13.3).11.6 Paso 5Efectuarse el ajuste de la recta por el “método de mínimos cuadrados”, utilizando laecuación de la recta que se describe a continuación:Y=mX + bTABLA 5.- Relación de % de mortalidad / Probit empírico% 0 1 2 3 4 5 6 7 8 90 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,6610 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,1220 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,4530 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,7240 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,9750 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,2360 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,5070 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,8180 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,2390 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33% 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,999 a 7,33 7,373 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09NOTA 7 – a Valores entre 99 y 99.7Una vez finalizado esto, trazar una recta perpendicular al eje “Y” exactamente en el valorde Probit igual a 5 . En el punto de intersección con la recta ajustada, proyectar hacia el eje“X” para obtener el Log 10 de la CL50.Una vez obtenido el valor de Log10 de la CL50, determinar la CL50, mediante la siguienterelación:CL50 = Antilog 10 X (en Y = 5)11.7 Paso 6Pasos a seguir en la determinación del error patrón.11.7.1 Determinar “S”, que esta definido como el intervalo de incremento de Log10de la concentración (X) por unidad de incremento en el Probit Empírico (EP)y tiene la siguiente relación:

NMX-AA-087-1995-SCFIX2 - X1S =⎯⎯⎯CP2 - CP1Donde :X2 y X1CP1 y CP2son los valores más bajos y más altos respectivamente obtenidos apartir de la concentración en Log 10 (X):son los valores más bajos y más altos respectivamente obtenidos apartir del Probit calculado (CP).11.7.2 Paso 7Determinar el error patrón del Log 10 CL50, preparando una tabla con los siguientes datos:11.7.2.1 Logaritmo de la concentración (X)11.7.2.2 Número de organismos en cada concentración (Nn)11.7.2.3 Probit calculado (CP)11.7.2.4 Factor ponderado (w), obtenido a partir de la tabla 6 considerando losvalores de Probit calculado (CP)11.7.2.5 Productos : Nw, NwX y NwX 211.7.2.6 Sumatorias : Nw, NwX y NwX 2TABLA 6 .- Factor ponderado (w) para el cálculo de Probit (CP)0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,91 0,001 0,001 0,001 0,002 0,002 0,003 0,005 0,006 0,008 0,012 0,015 0,019 0,025 0,031 0,040 0,050 0,062 0,076 0,092 0,113 0,131 0,154 0,180 0,208 0,238 0,269 0,302 0,336 0,370 0,404 0,439 0,471 0,503 0,532 0,558 0,581 0,601 0,616 0,627 0,635 0,637 0,634 0,627 0,616 0,601 0,581 0,558 0,532 0,503 0,476 0,439 0,405 0,370 0,336 0,302 0,269 0,238 0, 208 0,180 0,157 0,131 0,110 0,092 0,076 0,062 0,050 0,040 0,031 0,025 0,018 0,015 0,011 0,008 0,008 0,005 0,003 0,002 0,002 0,001 0,00Una vez obtenido el factor ponderado (w) y calculados los productos: Nw, NwX, NwX 2 ysumatorias, obtener el error patrón (ESLog 10 ) de la CL50 utilizando la siguiente relación:1 ∑Nw(m-z) 2SLog 10 CL 50 = S 2 [(___________+ ___________________________)] 0,5∑Nw ∑Nw(∑NwX 2 ) – ((∑NwX) 2donde :

NMX-AA-087-1995-SCFIESLog 10Ses el error patrón de la CL50;es el intervalo de incremento;m es el pendinte obtenida por mínimos cuadrados :ZNwXes igual a __________Nw11.8 El intervalo de confianza de la CL50 esta dado por la siguiente relación :IC CL50 = (CL50) (ESLog 10 CL50) (Log 10 )11.9 Las unidades de tenacidad aguda se obtienen a partir de la siguiente relación1U.T.a = ------------- x 100CL 50Donde :U.T.aCL50es la unidad de toxicidad aguda;es la concentración teórica que origina el 50 % de mortalidad de organismosexpuestos con la muestra evaluada.12 INFORME DE LA PRUEBAEl informe de la prueba incluye especificar los siguientes puntos:- Cuenca hidrológica.- Nombre del cuerpo de agua receptor.- Sí se trata de pruebas en efluentes indicar:1) Responsable legal del efluente.2) Sí es efluente industrial:Razón social de la empresa; dirección teléfono; que produce; que materiasprimas utiliza; horario de operación.3) Sí es efluente agrícola:

NMX-AA-087-1995-SCFILocalización, tipo(s) de cultivo (s) y en su caso que fertilizante(s) seutiliza(n).4) Sí es efluente urbano o municipal:Localización, nombre de la ciudad o municipio.Para los caso descritos en 2), 3) y 4), especificar además:Caudal promedio (m 3 /día): caudal promedio durante el muestreo (m 3 /s) ; en caso de contarcon sistema de tratamiento. Breve descripción del mismo; localización de punto (s) demuestreo seleccionado(s); método de colecta usado; fecha, período y horario de colectausado; fecha, período y horario de colecta usado. tiempo transcurrido entre l a última tomade muestras (s) y el inicio del análisis; temperatura de la(s) muestras al recibirse en ellaboratorio; datos fisicoquímicos y observaciones en campo: responsable(s) del muestreo.- Si se trata de prueba de cuerpos receptores, indicar:Localización de punto(s) de muestreo; método de colecta usado, fecha, período y horario decolecta; tiempo transcurrido entre la última toma de muestra(s) al recibirse en el campo;responsable(s) del muestreo.- Datos a registrar durante la prueba de toxicidad;Forma de almacenamiento y preservación de lata(s) muestra(s), fecha de inicio y términodel análisis ; tipo de prueba realizada (exploratoria y o definitiva) ; datos fisicoquímicos alinicio del análisis (pH, oxígeno disuelto, conductividad, temperatura de agua y aire) ycaracterísticas aparentes (olor, color, turbiedad, presencia o ausencia de burbujas y espuma); datos fisicoquímicos en las muestras al 100%, diluciones y testigos a las 24 h y 48 h detiempo de exposición (pH, oxígeno disuelto, conductividad, dureza total y temperatura deagua y aire); concentración (es) utilizada(s) en la(s) prueba(s) exploratoria(s) y/odefinitiva(s) y la mortalidad o inmovilidad de los organismos prueba; responsable(s) de larealización de la(s) prueba(s) de toxicidad.- Análisis de resultadosTablas y gráficas derivadas de la prueba de toxicidad, así como las anotaciones de laobservaciones diarias efectuada en lo organismos en cada concentración, incluyendo lostestigos; proveer los valores de CL50 de las pruebas de toxicidad con sus respectivos límitesde confianza al 95 %, así como las unidades de toxicidad obtenidas y método estadísticoutilizado; discusión de resultados.- Datos adicionalesTóxico de referencia utilizado en la prueba de sensibilidad, CL50 obtenida y fecha derealización: responsable(s) de la realización de la prueba.- Conclusiones y recomendaciones

NMX-AA-087-1995-SCFI- Sí se contrata una empresa consultora, laboratorio o cualquier otro que lleve a caboel análisis, indicar razón social, representante legal, dirección y teléfono.13 APENDICES13.1Apéndice AComo formar una muestra compuesta – EjemploSí el proceso generador de la descarga “X” funciona por 15 h ; entonces, de acuerdo a latabla 1 se tienen que tomar cuatro muestras simples para formar una compuesta.Se deben tomar precauciones cuando se lleve a cabo el muestreo, utilizando cubrebocas yguantes de látex desechables.Suponer que la hora de toma de la muestra simple y el caudal correspondiente se lleva acabo de acuerdo a la tabla 7.TABLA 7.- Horario y caudal hipotético del muestreo simple o instantáneoNúmero de muestra simple o Hora de la toma de la Caudal de la descarga (m 3 )InstantáneaMuestra simple (h)1 9 322 12 133 15 84 18 3TOTAL 56La proporción de muestra que debe ser tomada del caudal para cada tiempo se obtiene apartir de la siguiente relación:(Ct x ) (100)%Mt x = _______________Donde:%Mt x es el por ciento (%) de muestra al tiempo “x”;Ct x es el caudal al tiempo “x” en metros cúbicos (m 3 ):C T es el caudal total en metros cúbicos (m 3 ).Sustituyendo:Si Ct1 = 32 m 3C1

NMX-AA-087-1995-SCFI(32m 3 ) (100)%Mt1 = _____________ = 57,14 %56 m 3Si Ct2 = 13 m 3(13m 3 ) (100)%Mt2 = ______________ = 23,21 %56 m 3Si Ct3 = 8 m 3%Mt3 = (8m 3 ) (100)____________ = 14,28 %56 m 3Si Ct4 = 3 m 3(3m 3 ) (100)%Mt 4 = _____________ = 5,35 %56 m 3Por lo tanto, el volumen que corresponde a cada muestra simple considerando que elvolumen total es de dos litros, se calcula a partir de la siguiente relación:Vtx = (20) (%Mt x )Donde:Vtxes el volumen de muestra al tiempo “x” en mililitros (ml).Sustituyendo:Si %Mt1 = 57,14 %Vt1 = 20(57,14 %) = 1143 mlSi %Mt2 = 23,21 %Vt2 = 20(23,21 %) = 464 mlSi Mt3 = 14,28 %Vt3 = 20(14,28 % ) = 286 mlSi %Mt4 = 5,35 %

NMX-AA-087-1995-SCFIVt4 = 20 (5,35 %) = 107 mlEntonces :∑Vt = 2000 ml13.2 Apéndice BDeterminación del intervalo de concentraciones – EjemplosEjemplo 1:Suponer que al final de la prueba exploratoria, se obtienen las siguientes mortalidades:TABLA 8 .- Relación hipotética de concentración/ % de mortalidadConcentración (%) Mortalidad (%)6,25 0,0012,50 5,0025,00 10,0050,00 30,00100,00 70,00NOTA 8 - % Mortalidad A0 inmovilidad ⎯⎯⎯ x 100BDonde :A es el número de organismos muertos por concentración :B es el número de organismos expuestos por concentración.En este caso, la CL50 teórica a 24 h (tiempo de exposición que dura la prueba exploratoria)está entre la concentración al 50% y al 100 % por lo cual es factible seleccionar para laprueba formal , cinco concentraciones entre 50% y 100% sin embargo, aquí es importanteconsiderar lo siguiente:- Estado que presentan los organismos al final de la prueba exploratoria en laconcentración al 50 % . esto es si los organismos, diferencia de los testigos (los cuales, encondiciones normales tienden a moverse activamente por toda la columna de agua ),mueven muy lentamente su segundo par de antenas y además permanecen en el fondo o enla superficie, seguramente a las 48 h van a estar completamente inmóviles.

NMX-AA-087-1995-SCFIEn este caso, es erróneo seleccionar para la prueba definitiva, al 50 % como laconcentración mínima, ya que es más adecuado utilizar valores todavía menores . porejemplo 40 % y 30 %.Por otro lado, en caso de que los organismos a la concentración 6,25 % de este ejemplo,presenten una movilidad similar a la del testigo, es adecuado utilizar ésta, comoconcentración mínima.Ejemplo 2:Suponer ahora, que al final de la prueba exploratoria se obtienen los siguientes valores demortalidad:TABLA 9 .- Relación hipotética de concentración/ % de mortalidad:Concentración (%) Mortalidad (%)6,25 0,0012,50 80,0025,00 100,0050,00 100,00100,00 100,00En este caso, como se puede apreciar se tiene un efluente extremadamente tóxico ya que12, 5 % del mismo ocasiona una mortalidad del 80 % en los organismos expuestos.En este sentido y al igual que el ejemplo1 de este apartado, teóricamente se tiene queseleccionar para la prueba definitiva a 6,25 % y 12, 5% como las concentraciones mínima ymáxima respectivamente (ya que la finalidad de la prueba es obtener la CL50, la cual estadefinida como la concentración en este caso de un efluente, que origina un efecto letal en el50 % de los organismos expuestos) sin embargo, y para el caso de este ejemplo, si losorganismos en la concentración al 6,25% presentan un movimiento similar al de lostestigos, es adecuado considerar a este como el valor mínimo durante la prueba definitiva,en caso contrario dos concentraciones menores a esta (tal vez 1,0 % y 0,5 %) pueden serutilizadas en la prueba definitiva.Del mismo modo, se tiene que observar detenidamente a los organismos que quedan vivosen la concentración al 12,5 %, ya que si se encuentran muy afectados esto es, en él fondo ycon movimientos apenas perceptibles, es adecuado que en la prueba definitiva seconsideraran concentraciones todavía menores a esta (por ejemplo 5,5 y 10 %).Ejemplo 3:Suponer que al final de la prueba exploratoria no se observa mortalidad en ninguna de lasconcentraciones como se muestra en la siguiente Tabla:

NMX-AA-087-1995-SCFITABLA 10 .- Relación hipotética de concentración / % de mortalidadConcentración (%) Mortalidad (%)6,25 0,0012,50 0,0025,00 0,0050,00 0,00100,00 0,00En este ejemplo, el efluente presenta un efecto agudo no detectado después de 24 h deexposición de los organismos de prueba.En este caso de que los organismos sea similar al del testigo, se debe extender la prueba aun tiempo de 48 h.En caso de que los organismos a pesar de no estar inmóviles, si presentan cierto grado deafectación (el cual, para fácil identificación debe ser comparado con los testigos ) encualquier concentración , excepto en la muestra al 100 %, debe observarse en cual de ellasse evidencia la afectación y a partir de esa, considerar el valor máximo que debe serpreparado para la prueba definitiva.NOTA 9 – Para la preparación de las diferentes diluciones, se debe contar con medidas deseguridad para evitar entrar en contacto directo con las muestras de aguas residuales . serecomienda utilizar propipetas, guantes de látex desechables y cubrebocas.13.3 Apéndice CDeterminación de la CL 50 por el método de Probit – EjemploSuponer que al finalizar una prueba de toxicidad, se obtienen los siguientes datos:TABLA 11.- Resultados de toxicidad% ConcentraciónenvolumenNo. OrganismosExpuestos porConcentraciónNo. OrganismosMuertos porConcentración100 30 24 8050 30 18 6025 30 12 4012,5 30 6 206,25 30 3 10% Mortalidad porconcentración

NMX-AA-087-1995-SCFINOTA 10 – En caso de que la muestra sea sustancia tóxica específica (por ejemplo,dicromato de potasio K2Cr2O7), en vez de anotar el por ciento (%) de la concentración de lasustancia en mg/L o ml/L, en caso de tóxicos sólidos o líquidos respectivamente.NOTA 11- Número total de organismos por dilución es igual a 30 (3 réplicas con 10organismos en cada uno).- Realizando los pasos 1, 2, 3 (ver Capítulo 11 inciso 11.2, 11.3 y 11.4), se construyela siguiente tabla.TABLA 12 .- Datos de toxicidad para el Método ProbitConc. % Log 10Conc.(X)No. DeOrg. (N)MortalidadObservada(r)% Mortalidad(P)Probitempírico(EP)Probitcalculado(Y)100 2, 0 30 24 80 5,84 5,8150 1,698 30 18 60 5,25 5,2725 1,397 30 12 40 4,75 4,7412,5 1,096 30 6 20 4,6 4,216,25 0,795 30 3 10 3,72 0,67- Paso 4Se construye la gráfica (ver figura 2 ).- Paso 5Se realiza el ajuste de la recta y se obtiene para el ejemplo, que, el Log de la CL50 es de 1,54, por medio del siguiente procedimiento:CL50 = Antilog10 X ( en Y =5 )Simplificando:Log CL50 = 1,54Por lo tanto:

NMX-AA-087-1995-SCFIFIGURA 2 .- Representación gráfica del Método ProbitCL50 = Antilog 1, 54CL50 = 34,67 %El valor de 34,67% presenta la concentración teórica a la cual se detecta el 50% demortalidad en los organismos expuestos.- Paso 6Intervalo de incremento2 - 0,795S = --------------------- = 0,563 05,81 - 3,67- Paso 7

NMX-AA-087-1995-SCFIDeterminación del error patrón.Se construye la siguiente tabla con los datos señalados en el inciso 11.7.2.TABLA 13 .- Error patrón del Log CL50Log10 No. Org . Probit calc. Fact. Pond Producto Producto ProductoConc. (X) (N) (CP) (w) (Nw) (NwX) (NwX 2 )2,0 30 5,81 0,503 15,09 30,18 60,361,698 30 5,27 0,616 18,48 31,37 53,281,397 30 4,74 0,616 18,48 25,82 36,061,096 30 4, 21 0,503 15,09 16,54 18,120,795 30 3,67 0,336 10,08 8,02 6,37SumatoriasEl error patrón se determina por la siguiente formula :SUM (Nw)= 77,2SUM(NwX)= 11,931 ∑Nw (m – z ) 2ESLog 10 CL50 = S 2 [ (_________ + _________________________) ] 0.5∑Nw ∑Nw (∑NwX 2 ) – (∑NwX) 2donde :S = 0, 563 0m = 1, 769Nw = 77, 22NwX = 111, 93NwX 2 = 174, 20Nwx 111,93Z = -------- = ------------ = 1,450Nw 77,22Sustituyendo:1 77,22 (1,769 – 1,450) 2ESLog 10 CL50 = 0,317 0[(--------------) + (---------------------------------------) ] 0.577,22 77,22 (174,20) – 15528,327, 857 984 42= 0,3170 [0,317 0 +---------------------------------] 0.5923, 404= 0,317 0 [(0,0214598 )] 0.5SUM(NwX 2= 174,20

NMX-AA-087-1995-SCFI= 0,3170(0,146 491 6 ) 0.5= 0,0464378Para determinar el intervalo de confianza se sustituyen los valores correspondientes en lasiguiente relación :IC CL50 = ( CL50) (ESLog10CL50 ) (log10)Sustituyendo :IC CL50 = (34,67%) (0,0464378 ) (2,302 5 ) = 3,707 0 %Por lo tanto la CL50 obtenida para el ejemplo, con el intervalo (95 % de confiabilidadestadística) correspondiente es:CL50 = 34,675% ± 3,7070%Las unidades de toxicidad son:Sustituyendo: (ver Capítulo 11 inciso 11.9)1U.T.a. =--------- x 100 = 2,8834,67Por lo tanto en este ejemplo se obtuvieron 2,88 unidades de toxicidad aguda.14 BIBLIOGRAFIA14.1 Anderson, B.G., 1944. The toxicity thresholds of various substances found inindustrial wastes as determined by the use of Daphnia magna . (La toxicidad de variassustancias encintradas en desechos industriales determinadas por el uso de Daphnia magna) Sewage Works J. 16 : 1140-1156.14.2 APHA, AWNA, WPCF, 1987 . Standard Methosds para el análisis del aguay de aguas residuales) . American Public Health Association, Port City Press,Baltimore, Maryland, E.U.A. 10 – 200 p . + láminas.14.3 Attar, E . N y E. J . Maly, 1982. Acute toxicity of cadium, zinc and cadmium– zinc mixtures to Daphnia magna. (Toxixcidad aguda provocada por cadmio, zinc y lamezcla de los mismos en Daphnia magna) Arch . Environ Contam . Toxicol. 11 (3) : 291 –296.14.3 Biensinger . K.E. y G . M. Christensen, 1972 . Effects of various metals onsurvival . growth, reproduction and metabolism of Daphnia magna . (Efectos

NMX-AA-087-1995-SCFIde varios metales en la sobvrevivencia , crecimiento , reproducción ymetabolismo de Daphnia magna) J . Fish . Res . Board Can 29 : 1691 - 1700.14.4 CETESB, 1991 . Métodos de Avalación de Toxicidades de Polopuentes aOrganismos Aqúaticos . (Métodos de evaluación de toxicidad decontaminantes en organismos acuáticos) Sao Paulo, SP . Brasil . s.p.14.5 CETESB, 1991 a . Procedimientos para utilizacao de testes de toxicidadesno controle de efluentes líquidos . (Procedimientos para la utilización de pruebas detoxicidad en el control de efluentes líquidos) Serie Manulas . Sao Paulo, SP . Brasil, 17 p .14.7 CETESB, 1991 b . Implementacao de testes de toxicidade no controle deefluentes líquidos . (Implementación de pruebas de toxicidad en el control de efluenteslíquidos) Serie Manuals . Sao Paulo, SP. Brasil, 7 p.14.8 Environment Canada, 1990 . Biological Test Method : Reference Methodfor Determining Acute Lethality of Effluentents to Daphnia magna . (Método de referenciapara determinar la letalidad aguda de efluentes con Daphnia magna ) EPS 1/RM/14. 18 pp.14.9 EPA, 1991 . Methods for Mesuaring the Acute Toxicity of efluentes andReceiving Waters to Freswater and Marine Organismo. (Métodos para medir la toxicidadaguda de efluentes y aguas receptoras con organismos marinos y deulceacuícolas)EPA/600/4-90/DZ7.14.10 EPS, 1990 . Guidance Document on control of Toxicity Test PrecisiónUsing Reference Toxicicants . (Guía para el control de la precisión en la prueba detoxicidad utilizando tóxicos de referencia )Report EPS 1/RM/15 Canada.14.11 Finney, D. J ., 1971 . Probit analysis . (Análisis Probit) 3ª. Ed. CambridgeUniversity Press, Londres. 333 pp.14.12 Goulden, C.E. Y L .L . Henry, 1987 . Instrucciones para el cultivo deDaphnia para pruebas de Toxicidad . Guía de Trabajo . Academy of Natural Sciencies .Filadelfia . Pensilavania E. U .A . 13 pp.14.13 ISO 6341, 1982 a Water quality – Determination of the inhibition of themobility of Daphnia magna Straus (Crustácea – Cladocera). (Calidad del agua -Determinación de la inhibición de la movilidad de Daphnia magan Straus) ISO/6341-1982(E).14.14 Lewis , P . A . y W. B. Horning, 1988 . “A Short – Term Chronic ToxicityTest Using Daphnia magna” (Pruebas de toxicidad crónica a corto plazo utilizando Daphniamagna). Aquatic Toxicology and Hazard Assessment : 10 th Volume, ASTM, STP 1971 –w .J .Adams, G . A. Chapman, and W . G. Landis, Eds ., American Society for Testing andMaterials, Filadelfia : 508 – 555.

NMX-AA-087-1995-SCFI14.15 Litchfield, J . T . Jr. Y F. Wilcoxon, 1949. A aimplified method ofevaluating dose effect experiments . (Método simplificado para evaluar los efectos de ladosis en los experimentos) J. Pharm . Exp . Ther . 96 : -113.14.16 Needham, J. G ., P . S .Galtssoff, F. E . Lutz y P. S. Welch, 1937. CulturaMethods for Invertebrate Animals . (Métodos de cultivo en invertebrados) Cumstock Publ .Co. Reprinted by Dover Publ ., Inc ., Nueva York.14.17 Pennak, R . W ., 1978. Fresh Water Invertebrates of the United States .(Invertebrados dulceacuícolas de los Estados Unidos de América) 2ª ed ., John Wiley andSons, Nueva York, 365 – 367 pp.14.18 Pielou, E . C . 1969 . An Introduction to Mathermatical Ecology .(Introducción a la Ecología Matemática) Wiley Interscies John Wiley and Sons , NuevaYork.14.19 Ley de Aguas Nacionales . Publucada en el Diario Oficial de la Federacióndel 1 de Diciembre de 1992.14.20 Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente .Publicada en el Diario Oficial de la Federación del 28 de enero de 1988.14.21 Stephan, C . E ., 1977. Methods for calculating an LC50 .(Métodos para elcálculo de la CL50) In : Mayer y J .L Hamelink, (Eds.), Acuatic Toxicology and HazardEvaluation, ASTM STP 634, American Society for Testing and Materials, Philadelphia,Pennsylvania: 65 – 84.14.22 NOM-008-SCFI-1998 Sistema General de Unidades de Medida.15 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALESEsta Norma concuerda parcialmente con la norma internacional ISO 6341, ver apéndiceinformativo.APENDICE INFORMATIVOCabe mencionar que la presente norma ha sido complementada con normas de otros paísese investigación realizada a nivel nacional.

NMX-AA-087-1995-SCFIMéxico, D . F ., a 14 de noviembre de 1995.LA DIRECTORA GENERAL DE NORMASLIC. MARIA EUGENIA BRACHO GONZALEZ.

NMX-AA-113-SCFI-1999ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACIÓN DE HUEVOS DEHELMINTO - MÉTODO DE PRUEBAANALYSIS OF WATER - DETERMINATION OF HELMINTH EGGS- TEST METHOD

NMX-AA-113-SCFI-1999DGNP R E F A C I OEn la elaboración de la presente norma mexicana, participaron las siguientesempresas e instituciones:- ASOCIACIÓN NACIONAL DE LA INDUSTRIA QUÍMICA, A.C.Dirección General.- ASOCIACIÓN NACIONAL DE PRODUCTORES DE REFRESCOS Y AGUASCARBONATADASDirección Técnica.- CÁMARA DE LA INDUSTRIA DE TRANSFORMACIÓN DE NUEVO LEÓNInstituto para la Protección Ambiental - Dirección General.- CÁMARA MINERA DE MÉXICOComisión de Ecología y Recursos Naturales.- CÁMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE ACEITES, GRASAS Y JABONESGerencia de Ecología, Normas y Salud.- CÁMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DEL HIERRO Y DEL ACEROInstituto Mexicano del Hierro y el Acero.- CÁMARA NACIONAL DEL CEMENTO- COLEGIO DE INGENIEROS MECÁNICOS Y ELECTRICISTASCoordinación del Comité Nacional Permanente de Peritos de Riesgo Ambiental.- COMISIÓN FEDERAL DE ELECTRICIDADGerencia de Protección Ambiental.- COMISIÓN NACIONAL DEL AGUAGerencia de Saneamiento y Calidad del Agua.- COMITÉ TÉCNICO DE NORMALIZACIÓN NACIONAL DE PROTECCIÓN ALAMBIENTE- CONFEDERACIÓN DE CÁMARAS INDUSTRIALESComisión de Ecología.

NMX-AA-113-SCFI-1999DGN- CONFEDERACIÓN PATRONAL DE LA REPÚBLICA MEXICANAComisión Nacional de Ecología.- DEPARTAMENTO DEL DISTRITO FEDERALSubdirección de Verificación y Control de la Contaminación.- INSTITUTO MEXICANO DEL PETRÓLEO- INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALAcadémia de Ingeniería Sanitaria;Centro de Investigación y Estudios Avanzados.- INSTITUTO TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREYDirección General.- PETRÓLEOS MEXICANOSExploración y Producción-Subgerencia de Normatividad y Promoción;Refinación-Gerencia de Protección Ambiental y Seguridad Industrial;Dirección de Gas y Petroquímica Básica;Dirección Corporativa de Administración.- PROCURADURÍA FEDERAL DE PROTECCIÓN AL AMBIENTEDirección General de Verificación al Ordenamiento Ecológico.- SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA Y DESARROLLO RURAL. Dirección General de Agricultura.- SECRETARÍA DE COMUNICACIONES Y TRANSPORTESDirección General de Transporte Terrestre Federal.- SECRETARÍA DE ECOLOGÍA DEL ESTADO DE MÉXICODirección General de Normatividad y Apoyo Técnico.- SECRETARÍA DE ENERGÍADirección de Seguridad y Protección al Ambiente.- SECRETARÍA DE GOBERNACIÓNDirección General de Protección Civil.- SECRETARÍA DE MARINADirección de Protección al Medio Ambiente.- SECRETARÍA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCASubsecretaría de Recursos Naturales.

NMX-AA-113-SCFI-1999DGN- SECRETARÍA DE SALUDDirección General de Salud Ambiental.- SECRETARÍA DEL TRABAJO Y PREVISIÓN SOCIALSubdirección de la Unidad de Estructuración de Normas.- UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO- UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANACoordinación de Investigación.- UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICOCentro de Ciencias de la Atmósfera;Coordinación de Investigación Científica;Facultad de Ingenieria-Laboratorio de Control de Emisiones.

NMX-AA-113-SCFI-1999DGNÍNDICE DEL CONTENIDONúmero de capítuloPágina0 Introducción 11 Objetivo y campo de aplicación 12 Referencias 23 Definiciones 24 Principio 35 Muestreo 46 Reactivos y materiales 47 Aparatos 58 Preparación y acondicionamiento de la muestra 59 Procedimiento 510 Expresión de resultados 911 Informe de la prueba 1112 Bibliografía 1113 Concordancia con normas internacionales 12

CDU543.3.062NMX-AA-113-SCFI-1999DGNANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACIÓN DE HUEVOS DEHELMINTO - MÉTODO DE PRUEBAANALYSIS OF WATER - DETERMINATION OF HELMINTH EGGS- TEST METHODOINTRODUCCIÓNAnte la escasez de recursos hídricos, la explosión demográfica y el desarrolloindustrial, la utilización de aguas residuales es una importante alternativa como fuenteadicional de suministro, particularmente para riego agrícola. Sin embargo, dichaactividad tiene implicaciones negativas desde el punto de vista sanitario, ya querepresenta un riesgo a la salud de los trabajadores agrícolas y de los consumidores delos productos, en especial cuando se trata de aquéllos que se consumen crudos comolas hortalizas.Los helmintos representan un elevado riesgo a la salud humana debido a que susdiversos estadíos infecciosos (huevos embrionados o larvas) son altamentepersistentes en el agua contaminada. Así, el agua constituye un vehículo directo oindirecto de diseminación de helmintos, aun cuando se encuentren en bajasconcentraciones, dando lugar a enfermedades gastrointestinales, sobre todo cuandoésta se emplea para el riego de cultivos.1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓNEsta norma mexicana establece el método para la detección y enumeración de huevosde helminto en aguas residuales y lodos, con el fin de evaluar la calidad del agua y laeficiencia de los sistemas de tratamiento de la misma.Esta norma mexicana es aplicable para la evaluación de la calidad del agua residualcruda y tratada.

NMX-AA-113-SCFI-19992/12DGN2 REFERENCIASPara la correcta aplicación de esta norma se deben consultar las siguientes normasoficiales mexicanas y normas mexicanas vigentes o las que las sustituyan:NOM-001-ECOL-1996 Que establece los límites máximos permisibles decontaminantes en las descargas de aguas residuales enaguas y bienes nacionales, publicada en el Diario Oficial dela Federación el 6 de enero de 1997.NOM-003-ECOL-1997 Que establece los límites máximos permisibles decontaminantes para las aguas residuales tratadas que sereusen en servicios al público, publicada en el Diario Oficialde la Federación el 21 de septiembre de 1998.NMX-AA-003-1980NMX-BB-014-1973NMX-CC-013-1992Aguas residuales - Muestreo. Declaratoria de vigenciapublicada en el Diario Oficial de la Federación el 25 demarzo de 1980.Clasificación y tamaños nominales para utensilios de vidriousados en laboratorio. Declaratoria de vigencia publicada enel Diario Oficial de la Federación el 24 de agosto de 1973.Criterios generales para la operación de los laboratorios depruebas. Declaratoria de vigencia publicada en el DiarioOficial de la Federación el 25 de junio de 1992.3 DEFINICIONESPara los propósitos de esta norma se establecen las siguientes definiciones:3.1 Aguas residualesSon las aguas de composición variada provenientes de las descargas de usosmunicipales, industriales, comerciales, de servicios, agrícolas, pecuarios, domésticos,incluyendo fraccionamientos y en general de cualquier otro uso, así como la mezcla deellas.3.2 CoagulaciónEs la adición de compuestos químicos para alterar el estado físico de los sólidoscoloidales o suspendidos, a fin de facilitar su remoción por sedimentación o filtración.3.3 FiltraciónEs la remoción de las partículas suspendidas de un líquido que fluye a través de unmedio de porosidad adecuada.

NMX-AA-113-SCFI-19993/12DGN3.4 FlotaciónEs la técnica de concentración donde las partículas de interés permanecen en lasuperficie de la solución cuya densidad es mayor. Por ejemplo, la densidad de huevosde helminto se encuentra entre 1,05 y 1,18, y la de los líquidos de flotación se sitúaentre 1,1 y 1,4.3.5 HelmintosTérmino designado a un amplio grupo de organismos que incluye a todos los gusanosparásitos (de humanos, animales y vegetales) y de vida libre, con forma y tamañosvariados. Poseen órganos diferenciados, y sus ciclos de vida comprenden laproducción de huevos o larvas, infecciosas o no y la alternancia compleja degeneraciones que incluye hasta tres huéspedes diferentes.3.6 Método bifásicoEs la técnica de concentración que utiliza la combinación de dos reactivos no misciblesentre sí, y donde las partículas (huevos y detritus) se orientan en función de subalance hidrofílico-lipofílico.3.7 SedimentaciónEs el proceso físico de separación entre dos fases debido a la diferencia de susdensidades.4 PRINCIPIOEste método de análisis se basa en la diferencia de densidades entre los huevos dehelminto, las demás sustancias presentes en las aguas residuales, y las que seagregan para permitir la separación. El método comprende los procesos decoagulación, sedimentación, flotación, decantación y la técnica bifásica para recuperarlos huevos de helminto y efectuar el conteo.

NMX-AA-113-SCFI-19994/12DGN5 MUESTREOEl muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa deevaluación de la calidad del agua, por lo cual, éste debe efectuarse como se mencionaa continuación y de acuerdo a lo establecido en las normas mexicanas NMX-AA-003 yNMX-BB-014 (ver 2 Referencias):5.1 Preparar garrafones de plástico inerte de 8 L, previamente desinfectadoscon hipoclorito de sodio al 10 % (NaClO).5.2 Lavarlos con agua potable a chorro y enjuagarlos varias veces con aguadestilada.5.3 Se toman muestras de 5 L (volumen total), en estos garrafones de plásticoinerte, los cuales deben ser cerrados y sellados.6 REACTIVOS Y MATERIALES6.1 Reactivos (grado analítico)- Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 );- Alcohol etílico (C 2 H 5 OH);- Agua destilada;- Cloruro de sodio (NaCl);- Éter etílico;- Formaldehído al 4 %;- Hipoclorito de sodio (NaClO) (no aplica grado analítico), y- Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO 4 .7H 2 O).6.2 Materiales- Aplicadores de madera;- Barras magnéticas;- Bulbo de goma;- Espátula;- Garrafones de plástico inerte con paredes lisas y transparentes de 8 L decapacidad;- Gradillas para tubos de centrífuga de 50 ml;- Guantes de látex;- Mascarilla contra gases y vapores;- Matraz Kitazato;- Pipetas de 10 ml de plástico;- Probetas graduadas de 50 ml y de 1 000 ml;- Recipientes de plástico inerte con paredes lisas y transparentes de 2 000 ml y4 000 ml de capacidad;

NMX-AA-113-SCFI-19995/12DGN- Tamiz de 160 µm (micras) de poro;- Tubos de centrífuga de 200 ml, 450 ml o de mayor volumen según sea lacapacidad máxima de la centrífuga;- Tubos de centrífuga cónicos de 50 ml, y- Vasos de precipitados de 1 000 ml.NOTA- Los materiales utilizados deben cumplir con lo establecido en la normamexicana NMX-BB-014 (ver 2 Referencias).7 APARATOS- Agitador de tubos, con control de velocidad y adaptable a diversos tubos;- Balanza granataria;- Balanza analítica;- Bomba de vacío con control de velocidad de succión;- Campana de extracción;- Celda de Sedgwich-Rafter o cámara de conteo de Doncaster o cámara deNeubauer;- Centrífuga. Capaz de mantener los intervalos de operación de 1 000 r/min a3 000 r/min o su equivalente en g;- Densímetro (Hidrómetro). Capaz de mantener el intervalo de medición de 1,0 g/mla 1,4 g/ml, y temperatura de operación de 0ºC a 4ºC;- Incubadora;- Microscopio óptico. Equipado para hacer iluminación campo claro (Köheler), conaumento de 10 a 100x y platina móvil (opcional);- Parrilla con agitación magnética, y- Refrigerador.8 PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE LA MUESTRA8.1 Las muestras deben mantenerse a una temperatura de 4ºC ± 2ºC hasta sullegada al laboratorio.8.2 La muestra debe procesarse dentro de las 48 h después de su toma, o encaso contrario, debe fijarse con 10 ml de formaldehído al 4 %, o bien,preservarse en refrigeración para realizar su análisis antes de 2 meses.9 PROCEDIMIENTOLos siguientes puntos describen la secuencia del método de prueba, el cual deberealizarse conforme a lo descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datosobtenidos.

NMX-AA-113-SCFI-19996/12DGN9.1 Preparación de soluciones9.1.1 Solución de sulfato de zinc (ZnSO 4 ) con gravedad específica de 1,3Disolver 800 g de sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO 4 .7H 2 O) en 1 000 ml de aguadestilada; mezclar en la parrilla magnética hasta homogeneizar totalmente. Medir ladensidad con el densímetro. Ajustar la densidad a 1,3 agregando sulfato de zinc oagua destilada, según sea el caso.9.1.2 Solución de alcohol-ácido.Homogeneizar 650 ml de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) 0,1 N, con 350 ml de alcohol etílico.Almacenar la solución en un recipiente hermético.9.2 Calibración de aparatosTodos los equipos utilizados deben ser calibrados con patrones certificados oajustados de acuerdo a las especificaciones del fabricante.9.3 SeguridadDurante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de látex y cubreboca paraevitar cualquier riesgo de infección.Se debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado por elanalista, antes y después del ensayo.Cuando se efectúe la agitación de las soluciones con éter, ésta se debe realizar ensitios ventilados o dentro de la campana de extracción, y considerar su inflamabilidad.Evitar el contacto con los ojos, piel o ropa, ya que es un reactivo sumamente tóxico.

NMX-AA-113-SCFI-19997/12DGN9.4 Manejo de residuosTodo material desechado debe ser previamente esterilizado o desinfectado conhipoclorito de sodio al 10%.9.5 Concentración y separación de los huevos de helmintoLa recuperación de los huevos de helminto de la muestra se debe realizar efectuandolos siguientes pasos:a) Dejar reposar la muestra al menos 3 h o toda la noche o centrifugar a 400g de 3 min a 5 min.b) Aspirar y desechar el sobrenadante por vacío y sin agitar, si lasedimentación (separación) se realizó por centrifugación, decantarlentamente. Filtrar el sedimento en el tamiz de 160 µm de poro. Lavar eltamiz con 5 L de agua (potable o destilada), y recuperar el agua de lavadojunto con el sedimento filtrado.c) Colocar el filtrado y el agua de enjuague en el garrafón de 8 L dondeoriginalmente se encontraba la muestra o en los recipientes utilizados en lacentrifugación.d) Dejar reposar la muestra al menos 3 h o toda la noche o centrifugar a 400g de 3 min a 5 min.e) Aspirar con cuidado el sobrenadante al máximo y desecharlo. Depositar elsedimento en los recipientes para la centrífuga. Enjuagar 3 veces elgarrafón perfectamente con poca agua destilada, y colocar en losrecipientes para centrifugación.f) Centrifugar a 400 g de 3 min a 5 min.g) Decantar nuevamente el sobrenadante por vacío. Asegurarse que en elfondo del recipiente exista la pastilla; en caso contrario, centrifugarnuevamente. Resuspender la pastilla en 150 ml de la solución de sulfatode zinc (ZnSO 4 ). Homogeneizar la pastilla con el agitador de tubos o conun aplicador de madera.

NMX-AA-113-SCFI-19998/12DGNh) Una vez más, centrifugar a 400 g de 3 min a 5 min, y recuperar elsobrenadante virtiéndolo en un recipìente de plástico de 2 000 ml.Diluir cuando menos en 1 000 ml de agua destilada, y dejar sedimentar almenos 3 h, o toda la noche o centrifugar a 400 g de 3 min a 5 min.i) Aspirar con cuidado y al máximo el sobrenadante por vacío, y resuspenderel sedimento por agitación, utilizando poca agua destilada. Vertir lasuspensión resultante en un tubo de centrífuga de 200 ml, incluyendo elagua de enjuague del recipiente y centrifugar a 480 g durante 3 min.j) Decantar nuevamente el sobrenadante y resuspender la pastilla con aguadestilada en un tubo de 50 ml y centrifugar a 480 g durante 3 min.k) Decantar nuevamente el sobrenadante por vacío y resuspender la pastillaen 15 ml de la solución de alcohol-ácido por medio de un agitador detubos, y agregar 10 ml de éter. Agitar suavemente y de vez en cuandodestapar cuidadosamente los tubos para dejar escapar el gas que sedesprenda. Por seguridad realizar en sitios ventilados utilizando lamascarilla o en la campana de extracciónl) Centrifugar una última vez a 660 g durante 3 min.m) Aspirar al máximo el sobrenadante, dejando menos de 1 ml del mismo yevitando la pérdida de la pastilla; homogeneizar la pastilla, y proceder a lacuantificación. Por seguridad realizar en sitios ventilados utilizando lamascarilla o en la campana de extracción.9.6 Cuantificación de los huevos de helmintoa) Para evitar la sobreposición de las estructuras y el detritus no eliminado,repartir la muestra en volúmenes de 0,5 ml a 1,0 ml, con el fin de facilitar lalectura.b) Distribuir cada uno en una celda de Sedgwich-Rafter, o bien, en unacámara de conteo de Doncaster o cámara Neubauer.

NMX-AA-113-SCFI-19999/12DGNc) Identificar visualmente una a una las estructuras, anotando los generosidentificadas con ayuda de la figura 1.10 EXPRESIÓN DE RESULTADOS10.1 CálculosPara determinar las revoluciones por minuto (rev/min) de la centrifuga, se utiliza lafórmula siguiente:donde:rev/min = √Kg/rgKres la fuerza relativa de la centrifugación;es la constante cuyo valor es 89,456, yes el radio de la centrifuga en centímetros (cm).La fórmula para calcular g es la siguiente:g = r(rev/min)/K10.2 Expresar el resultado en número de huevecillos por litro, tomando enconsideración la expresión en cálculos, o bien expresar el número dehuevos contados y el volumen analizado:HL =H 5donde:H es el número de huevos leídos en la muestra;HL es el número de huevos por litro, y5 es el volumen de la muestra.10.2 InterferenciasLa sobreposición de estructuras y/o detritus no eliminado en el sedimento, puededificultar su lectura. En tal caso, es importante dividir el volumen en las alícuotas quese consideren necesarias. La falta de experiencia en la identificación de especies estambién un elemento decisivo en el conteo y sobreconteo.

NMX-AA-113-SCFI-199910/12DGNFIGURA 1.-Especies de huevos de helminto

NMX-AA-113-SCFI-199911/12DGN11 INFORME DE LA PRUEBAEl informe de la prueba debe incluir lo siguiente:- Todos los detalles necesarios para la identificación completa de la muestra;- Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el punto 10, y- Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis, así comocualquier operación no especificada en el método, o considerada opcional, quepueda haber influido en los resultados.12 BIBLIOGRAFÍA12.1 NOM-008-SCFI-1993 Sistema General de Unidades de Medida, publicada enel Diario Oficial de la Federación el 14 de octubre de 1993.12.2 Ayres, R. M., A Practical Guide for the Enumeration of Intestinal Helmints inRaw Wastewater and Effluent from Waste Stabilization Ponds. (Guía prácticapara la enumeración de helmintos intestinales en aguas residuales y efluentesprovenientes de estanques residuales de estabilización). Leeds UniversityDepartament of Civil Engineering.1989, 19 pp.12.3 CETESB, Sâo Paulo, Helmintos e Protozoarios Patôgenicos Contagem deOvos e Cistos en Amostras Ambientais (Helmintos y protozoarios patógenospresentes en huevos y quistes en muestras ambientales). 1989, 33 pp.12.4 Cifuentes, E., U. Blumenthal, P. G. Ruiz y S. Bennett. Health ImpactEvaluation of Wastewater Use in Mexico. (Evaluación del impacto en la saludde las aguas residuales utilizadas en México) Public Healt Rev. 1991/9219:243-250.12.5 De León, R., P. Ch. Gerba y B. J. Rose, Manual de Vigilancia de Parásitos enel Agua. Universidad de Arizona EEUU. 1988, 48 pp.12.6 Instituto Nacional de Referencias Epidemiológicas (INDRE), DiagnósticoParasitológico. 1993, Capítulo IV-6, 1-43 p.

NMX-AA-113-SCFI-199912/12DGN12.7 Jiménez, B. y C. Maya, Evaluación de las diversas técnicas para la detecciónde los huevos de helminto, y selección de una para conformar la NMXcorrespondiente. Instituto de Ingeniería, UNAM, México, 1996.12.8 Lamothe, R. y P. L. García, Helmintos del Hombre en México-Tratamiento yProfilaxis. Edit. AGT, 1988, 25-98 pp.12.9 Martínez, B. M., Manual de Parasitología Médica. Edit. La Prensa MédicaMexicana, 1986, 183-316 p.12.10 Organización Mundial de la Salud, Guías para la calidad del agua potable.1995, Vol. 1, 2a. Edic., España.12.11 Satchwell, G. M., An Adaptation of Concentration Technique for theEnumeration of Parasitic Helminth Eggs from Sewage Sludge (Adaptación dela técnica de Concentración para la enumeración de huevos de helmintoparásitos provenientes de lodos residuales). Water Res. 1986, 20:813-816.12.12 Schwartzbrod, J., L. Stien, K. Bouhoum y B. Baleux., Impacto del Tratamientode Agua Residual sobre Huevos de Helminto. Water Sc. Techn. 1989,21:295-297.13 CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALESEsta norma mexicana no equivale a ninguna norma internacional por no existirreferencia alguna al momento de su elaboración.MÉXICO, D.F. ALA DIRECTORA GENERAL DE NORMAS.CARMEN QUINTANILLA MADERO.JADS/LFVO/DLR/mrg.