МДС

ГранулоцитиCD45 средна / SSC средна/високаЕритробластиCD45 отрицателна / SSC нискаМоноцитиCD45 средна/висока / SSC среднаБластиCD45 ниска / SSC нискаЛимфоцитиCD45 висока / SSC ниска

КонтролМДСSSC Gran /SSC Lym6.5 4.9Control Average – 1x SD

отклонения от нормалния матурационенмоделлипса на експресия или промени винтензитета на експресирани антигениасинхронна експресияаберантна експресия

КонтролМДСControl Average – 1x SD

CD10- GrCD56+ Gr

Анализ на фенотипа и физическитехарактеристики на костномозъчните популациипри МДС (4-8 цветни комбинации антитела)WHO classification of tumors ofhematopoietic and lymphoid tissues, 2008г.

Флоуцитометрична скоринг-система (ФЦСС): По 1 точка за всеки абнормен параметърГранулоцити – абнормен модел на експресия на CD16/CD13 и CD16/CD11b,аберантна експресия на CD34 и CD36, хипогранулираност, олевяване.Моноцити - аберантна експресия на CD34, липса на експресия на CD13, CD11b,CD16 и CD36Бласти - (%), %CD 34+, аберантна експресия на CD11b или CD15Еритробласти – ниска или липса на експресия на CD71Флоуцитометричен скор (FCSS)РАЕБ6,29±1,11[5-8]IPSSInt-1Int-2HighМДС4,63±1,82РАРЦ±МД±РС3,33±1,0[2-4, 5(1)]IPSSInt-1 (1)LowF score=3F score=4Неясницитопении3,67±4,33Контролна група1±1,13[0-2]F score=1

Флоуцитометриятае бърз и надежден метод за количествена и качественаоценка на хемопоетичните клетки при МДСпозволява установяване на диспластични промени вотделните костномозъчни популации в допълнение къмконвенционалните морфологични изследванияможе да предостави съществена информация придиференциалната диагноза на част от неясните цитопеничнисъстоянияВ допълнение,FCSS би могъл да обособи подгрупи в рамките надефинираните IPSS рискови групи с вероятно различеневолютивен потенциал, което следва да бъде потвърдено сизследване на по-голям брой пациенти

Имунофенотип допълнително средство за точна диагноза(не в рутинната практика)Подлежащи молекулярнимеханизми биологичнохарактеризиране (?прогноза,клиничен ход) (в научниизследвания)АПОПТОЗА

Анулиран апоптозенконтролУдължена преживяемостАнти-апоптознифактори[ОМЛ]Про-апоптознифактори[МДС]Ексцесивна апоптоза –Неефективна хемопоезаCD34CD34CD34CD3CD 434Clonal evolution

МембраннаасиметрияАпоптозаФосфатидилсеринНеживиAnnexinVhighPIhighКъсни АпоAnnexinVhighPImidЖивиAnnexinVlowPIlowРанни АпоAnnexinVhighPIlow

Апоптоза – ядрена фрагментация – sub G1

Апоптоза - вътреклетъчни про- и анти-апоптознипротеиниFasLFasРЕЦЕПТОРЕН ПЪТМИТОХОНДРИАЛЕН ПЪТFADD (Адапторни протеини)Pro-caspase 8Active Caspase 8МитохондрииДНКувредаPro-caspase 9 + Apaf 1 + Cyt CBcl-2Active Caspase 9Pro-caspase 3Active Caspase 3Протеинова деградацияPoly (ADP-ribose) polymerase(PARP)Нуклеазна активацияКЛЕТЪЧНАСМЪРТ

Флоуцитометрично проучване на вътреклетъчни нива наaC-3, cPARP, bcl-2 чрез микросферов метод (CytometricBead Array, CBA)+ЗалавящоантитялоКлетъчен лизатАнализ+Залавящи сфериФлуоресциращидетекторниантителаРезултатBD CBA Human Apoptosis Kit – 3 популации сфери с различна флуоресцентна интензивност, покрити съсзалавящи антитела, специфични за ключови за апоптозата протеини cPARP, Bcl-2 and Caspase-3, РЕконюгиранидетекторни антитела и лизатни стандарти BD CBA Analysis Software

Клиничен материалМДС ІРефрактерна анемия (РА)Рефрактерна анемия с ринг-сидеробласти (РАРС)МДС ІІРефрактерна цитопения с мулти-линейнадисплазия (РЦ/МЛД)Рефрактерна анемия с ексес на бласти (РАЕБ)ОМЛ (Остра миелоидна левкемия)WHO classification of tumors of hematopoieticand lymphoid tissues, 2008 год.

Вътреклетъчни нива на aCaspase-3, bcl-2 и cPARP приболни с МДС и ОМЛU/ml300025002000150010005000МДС І МДС ІІ ОМЛActive Caspase-3 Bcl-2 Cleaved PARP

Корелация с % бласти в костния мозък приболни с МДС и ОМЛR=-0.43, p=0.009 R=0.49, p=0.002 R=0.07, p=0.68% бласти в к.мозъкаCaspase-3 Bcl-2 cPARP

Вътреклетъчни нива на aCaspase-3, bcl-2 и cPARPпри болни с МДС взависимост от рискаМДС І МДС ІІ рActiveCaspase-3[U/ml]Bcl-2[U/ml]Cleaved PARP[U/ml]144,98±275,12 345,58±683,47 Ns682,55±252,17 1350,12±1018,76 Ns21,45±17,57 47,91±31,18 Ns

ОМЛ/МЛДс нисък % бласти в костния мозък1 2 3 4 5 6 7 8ОМЛmean -72% бластиЕкспресия на MLF-1 гена,определена чрез RT-PCR[Matsumoto et al. Leukemia(2000)].[1]. Отрицателна контрола; [2-8]. Болни с ОМЛ: (2) M6; (3).M4; (4). M5b; (5). ОМЛ смултилинейна дисплазия; (6).M3; (7). М4; (8). М2.ОМЛ/МЛДРАЕБmean – 33% бластиmean – 12% бласти0 500 1000 1500 2000 2500 3000 U/ml3500Bcl-2aCaspase-3

ЗаключенияФлоуцитометричните данни показват хетерогенност на изследванитепротеини (участие на каспаза-независими механизми)Установяват се значими разлики в нивата на ключови маркери запрограмирана клетъчна смърт – активна каспаза-3 и Bcl-2 при пациенти с МДСи ОМЛ.Установява се обратна корелация между нивата на аКаспаза-3 и Bcl-2.Данните показват активация на ранните стадии на апоптоза при МДС,характеризираща се с повишени нива на аКаспаза-3.С нарастване на процента бласти и степента на дисплазия при МДС,паралелно с повишаване на каспазната активност, се наблюдава активиране ина антиапоптозни механизми (по-високи нива на Bcl-2), което вероятно е частот процесите на трансформацията в ОМЛ.

ФЦМ при МДС е предстоящ стандарт – цялостен консенсус все още нее достигнат.Целта е да усъвършенства съществуващите диагностични ипрогностични скоринг-системи.Необходимо е:Точни дефиниции за нормална и аберантна находка.Определяне на степента на отклонение от нормалната находка -% или MFI, разлики > ? log, отклонения > ? SDОпределяне на информативната стойност на находките –надеждни за диагноза или прогнозаФормиране на флоуцитометричен скор, който да има реалнадиагностична стойност - уточняване на броя аберации иопределяне на тежестта на всеки параметър.Software – позволяват обединяване на многобройни модели нанормална експресия сравняване на МДС находките с тях иизчисляване на отклоненията от нормата.

Комплексен диагностичен подходЦялостнахарактеристика назаболяванетоМорфологияИмунофенотипКлетъчен цикъл& АпоптозаЦитогенетика &Молекуляренанализ

Изследванията са финансирани от:ФОНД “НАУЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ”МИНИСТЕРСТВО НА ОБРАЗОВАНИЕТО И НАУКАТА