Anotación funcional - Bioinformatics and Genomics Department at ...

Anotación Funcional de 

Secuencias en especies p no modelo 

Ana Conesa 

Bioinformatics Department 

Centro de Investigación Príncipe Felipe 

htt http://bioinfo.cipf.es/aconesa 

//bi i f i f /

Créditos 

Blast2GO Development: 

Bioinformatics Department 

Centro de Genómica 

CIPF, Valencia 

IVIA, Valencia 

Ana Conesa 

Javier Terol 

Stefan Goetz Manuel Talón 

Blast2GO special thanks to: 

ANNEX :Simen Myhre, Henrik Tveit (MTNU) 

GOSSIP: Nils Blüthgen (MicroDiscovery GmbH) 

ZVTM: Emmanuel Pietriga (INRIA) 

goslim goslim.tair.obo: tair obo: Suparna Mundodi (TAIR) 

Biomedical Informatics 

UPV, Valencia 

Juan Miguel Gómez 

Montserrat Robles 

Curso Bioinformática, 19 Diciembre 2007, Universida de Alicante

Contenido 

1. Conceptos p y 

necesidad de anotación 

2. Anotación funcional mediante B2G 

• Estrategia 

• Aplicación informática 

33. Uso del B2G por la comunidad 

científica 

44. Ejercicio práctico 


Anotación funcional, ¿por qué? 

Secuenciación a gran escala “for everybody” 

Proyectos de genoma proteoma 

Proyectos de ESTs 

A N O T A C I ON D E S E C U E N C I A S 

transcriptoma 


Aclaraciones sobre “anotación” 

Función de proteína: se refiere 

al funcionamiento 

molecular de la proteina 

e.g. tyrosine kinase 

Anotación funcional: sentido 

más amplio amplio, caracterización 

biológica de la proteína 

e.g. g stress‐related protein p 

Sí 

¿Función localizable 

en la molécula? 

No 

necesariamente 


Anotación: una posible ontología 

Referencia 

bibliográfica 

Interacción 

Expresión 

Anotación 

Empírica Transferencia 

Ensayo 

bioquímico 

Análisis de 

de secuencia 

Comparación de 

estructura 

Homología de 

sequencia Identificación 

motivos 

Filogenia 

Identificación 

de pliegues 


Sistemas terminológicos 

Motivos Funcionales 

Función Molecular 

Proceso Biológico 

Componente Celular 

Mapas Metabólicos 

KEGG ortólogos 


Anotación automática: trampas y dificultades 

1. Fuentes de anotaciones erróneas (falta, sobra, incorrecto) 

‐> Anotación automática como “ “propuesta” ” 

2. Transferencia excesiva de funciones: transferencia de 

anotaciones en “cis” cis (proteínas “multi‐domain”) multi domain ) y “trans” trans 

(procesos biológicos) 

‐> Diferente impacto ORFs/Contigs, métodos homología/estructura 

3. ¿Genes G parálogos ál comparten t ffunción? ió ? 

‐> Contexto celular 

44. Especificidad y sensibilidad de métodos (top‐blast) (top blast) bajas 

‐> Los dos extremos de la balanza 

5. Umbral de alineamiento relativo (BBDD, Secuencias, 

métodos) é d ) 


Servidores y Software 

PFP 

Protein Analyst y 

GOPEP 

ProKnow 

PFPS 

ProFunc 

ProtFun 

PropSearch 

RIO 

FIGENIX 

GGoBlet Bl t 

Gotcha 

OntoBlast 

Basado en Homología 

Usa técnicas de ML 

Alta recuperación 

Poca interacción 

No-intensivo 

AAnaliza li estructuras t t 3D Recupera Funciones 

Predicción desde estructura No-intensivo 

Predicción desde motivos 

Recupera Funciones 

No-intensivo 

Predicción desde filogenia Secuencias protéicas 

No-intensvo 

Basado en Homología 

Asigna GOs del BlastHit 

Recupera anotaciones 


Nuestra propuesta 

�Anotación �Anotación de secuencias noveles 

� Herramienta de data mining en genómica funcional 

�� Si Sistema IIntensivo i 

�Orientado a laboratorios biológicos: fácil, visual, intuitivo 


Conceptos de anotación funcional en B2G 

� Blast 

o High‐throuput High throuput Blast 

o Tratar todos los hit vs. top‐blast 

o Usar BBDD grandes (NR) 

�� Mapeo 

o Recuperar lo más posible 

o No importa la calidad 

� Anotación 

o (Semi)automática (human supervised) 

o Combinación de conceptos p 

o Filtrado de datos (ajustable, recall vs. precisión) 

� Visualización 

o Comprobar y validar anotación de manera rápida y sencilla 

� Análisis 

o Enriquecimiento, Charts, GO‐Slim, “Combined Graphs” 


Anotación Funcional con Gene Ontology 

� La Gene Ontology (GO) es un 

vocabuario controlado para anotar 

funcionalmente genes por su 

proceso biologico, funcion 

molecular y localización 

� El GO es un Direct Acyclic Graph 

� Genes están normalmente 

anotados td al l nivel i l más á específico ífi 

dentro del conocimiento actual. 

� La “true path p rule” asegura g que q 

para un gen todos los terminos 

desde su anotacion a la raiz son 

ciertos 

más general 

más á especifico 

ifi 


Anotación en Blast2GO 

� Términos de Gene Ontology gy (GO). ( ) 

� Enzimas (Kegg) 

� Motivos (InterPro) 


Conceptos p de anotación funcional del B2G 

Similitud 

EEspecificidad ifi id d Precisión 

CCalidad lid d 

Selección 

Regla de anotación 


Conceptos de anotación funcional del B2G 

término más bajo 

cumpliendo los requisitos 

requerimiento de similitud 

sim 

= 

∑ positives 

hsp 

∑ hsp 

calidad de la 

anotación t ió “source” “ ” 

EC weight 

IC 1 

TAS 1 

IDA 1 

IMP 0.9 

IGI 0.9 

IPI 0.9 

ISS 08 0.8 

IEP 0.8 

NAS 0.7 

IEA 0.7 

cóódigos 

de eevidenciaa 

posibilidad de abstracción 

Recall 

alignmentl ength engthhsp 

ND 05 0.5 

vs vs. 

NR 0.5 

RCA 0.5 

Precision 

lowest. node[(max. sim× ECw) + (# GO× GOw)] ≤threshold 

Regla de anotación 


Evaluación 

� � … ¿Y Y eso funciona? f i ? 

� Método transparente (vs. un/supervised learning) 

�� PPrecisión i ió d de anotación t ió con parámetros á t por ddefecto f t alcanza l 6 65‐70%. % 

(que son valores típicos obtenidos por método automáticos de 

anotación) 

� … y Blast2GO ofrece una plataforma amigable, amplia y variada 


Evaluación 


Software Blast2GO 

� Plataforma universal para: 

1. Anotación basado en Gene Ontology 

2. Análisis estadístico 

3. Vi Visualización li ió (DAG) iinteractiva t ti y coloreada l d 

� Ideal para la investigación en especies no‐modelo 

�� AAplicación li ió ddesktop k iintuitiva i i e interactiva i i 

Secuencias 

blast análisis funcional 

mapeo 

Anotación 

GO GO,EC, EC 

… 

generación de grafos 

Visualización 


Arquitectura 


Arquitectura 


Buscar de secuencias similares con BLAST 

Parámetros: 

•URL del Servidor 

• BBDD de secuencias 

•Blast‐Tipo 

(blastx, blastp,...) 

•Formato de 

Resultados 

Mas parámetros: 

•E‐Value l Cutoff ff 

•Number of Hits 

• Mi Minimum i HSP 

length 


Buscar secuencias similares con BLAST 


Mapeo de términos GO con secuencias 

Fuentes del mapeo: 

� Gene Ontology BBDD: contiene mas de ~2 

milliones de “productos geneticos” anotado en GO, de 

Arabidopsis hasta Zebrafish. 

� NCBI Flat Files: gene2accession (4 079 414 entries) 

gene_info (1 635 614 entries) 

� PIR ‐ Non‐Redundant Reference Protein Database: 

incluye PSD, UniProt, Swiss‐Prot, TrEMBL, RefSeq, 

GenPept y PDB 

Hit 

ACC/GI 

Mapping 

RResources 

EC 

GO-Terms GO Terms 

sim % 


Mapeo detallado 

Blast2GO ast GO sigue sgue3 3 diferentes d e e tes caminos ca os durante du a te el e mapeo apeo para pa a obtener obte e 

la máxima información GO posible para los hits: 

1. BlastResult Accessions BlastResult.accs are used to retrieve GeneNames (Symbols) y making g 

use of two mapping ncbi.gene2accession.protein_accession 

files provided by NCBI (gene_info, gene2accession). 

Identified GeneNames are ncbi.gene_info.symbol(tax_id) 

searched in the species specific entries of the 

GeneProduct Table of the GO‐Database. 

go.gene_product.symbol(ncbi_taxa_id) 

2. BlastResult GI identifier are used to retrieve UniPort Ids making use of a 

BlastResult.gis 

mapping file from PIR (Non‐redundant REFerence protein database) 

pir.nref.uniprot.id 

including PSD, UniProt, Swiss‐Prot, TrEMBL, RefSeq, GenPept and PDB. 

go.dbxref.xref_key 

g _ y 

Identified Uniprot Ids are searched in the DBXRef Table of the GO GO‐Database Database 

3. BlastResult Accessions are searched direcly in the DBXRef Table of the GO‐ 

Database. 

Database. BlastResult BlastResult.accs accs 

go.dbxref.xref_key 


Mapeo de términos GO con secuencias 


Anotación GO 


Gráficas Descriptivas Anotación 


Modulación de la anotación 

Cambiar la anotación manualmente 

GO‐Term ACC 

EC‐Codes 

Seq. Description 

Extender con el “Second Layer” 

Myhre et al, Bioinformatics 2006 

Resumir con el GOSlim” 

is involved in 

OBO GO‐Slim File 

MMolecular l l FFunction ti 

acts in 

Biological Process Cellular Component 


Anotación de KEGG pathways 

GO � Enzyme y Codes � KEGG maps p 


Anotación de Motivos de InterPro 

Utilizar el servicio web del EBI para buscar en InterProScan y parsear resultados 


Visualización (Una secuencia) 


Visualización (Varias Secuencias) 


Visualización (Varias Secuencias) 

Conceptos: 

� Herramienta para explorar y descubrir 

� Grafos interactivos y “zoomable” 

� Grafos coloreados “highlighting hot areas” 

Acumulación por nodo 

(Sequence Count) 

Información entrante 

(Node Score) 

∑ 

d 

score = # seq× α 

1 

4 

3 

1 3 

1 

2.4 

3 

1 3 

Curso Bioinformática, 19 Diciembre 2007, Universida de Alicante 

5 

2.5 

1 

1

Análisis estadístico (Fisher´s Exact Test) 

� El algoritmo comprueba para todos los 

términos GO si están enriquecidos en un 

grupo de prueba comparado con un grupo de 

referencia usando “Fisher’s Exact Test” y 

“Multiple testing correction” 

� Todos los niveles del grafo GO están 

considerados y el algoritmo suma para cada 

nodo en el DAG cuantos genes en el “test set” 

y “ “reference f set” ” están á anotados d di directa o 

notación 

indirectamente con este término. 

An 

Servidor B2G 

Cliente 

Ref.: 

Blüthgen,N., Brand,K., Cajavec,B., Swat,M., Herzel,H. and Beule,D., (2004) Biological Profiling of 

Gene Groups utilizing Gene Ontology –A Statistical Framework. arXiv:q‐bio.GN/0407034, 1, 1. 


Visuualización

Análisis estadístico (Fisher´s Exact Test) 


Estadísticas a partir de grafos 

•Sequence Distribution/GO 

as Bar‐Chart 

•Sequence Distribution/GO 

as Level‐Pie (level ( selection) ) 

•Sequence Distribution/GO as Multilevel‐Pie (#score or #seq cutoff) 


Blast2GO4Pipe 

Resultados Blast en 

formato XML 

Pipe Versión: 

B2G sin interfaz f grafico f 

para Win/Linux/Mac 

Integración de la anotación automática de GOs 

dentro de un “Pipeline” u otro aplicación 

http://www.blast2go.de/b2gdata/b2g4pipe.tar.gz 

configuración con un fichero 

de propiedades 

Anotaciones en un 

fichero .annot 


Elementos adicionales 

•Blast Import(xml)/Export(html/txt/xml) 

p ( ) p ( ) 

• Annotation import by ACC or Symbols 

•B2G Tutorial 

•Local Installation (B2G DB setup How‐To) 

•B2G Batch‐Mode 

•Anotación de Enzimas KEGG 

• Ejecución de InterProScan 

….. y en un futuro cercano: 

•Blasten Grid publico 

• Blast2GO en la web (Babelomics) 

•Fisher contra genoma entero 

•B2G como parte de BioMoby Web Service 


Uso mundial del Blast2GO 

Especies 

Citrus Citrus, nicotiana nicotiana, maize maize, soybean soybean, tomato, tomato grape… grape 

Streptococcus, Trichoderma, Schistosoma, Cyanobacteria… 

European Flounder,pig, flidder crab, rat, honneybee, human… 

Metagenome projects… 


Estadísticas del Uso 

800 

700 

600 

500 

400 

300 

200 

100 

0 

Monthly Avg. Visits: 

Total different visitors (ip) since June 2005: 6028 

Jul. 2005 

Sep. 2005 

Nov. 2005 

Jan. 2006 

March 2006 

May 2006 

Jul 06 

Sep 06 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

Jul. 20055 

Daily Avg. Vis its: 

Sept. 2006 - 25 Visitors (avg) a day 

Sep. 20055 

Nov. 20055 

Jan. 20066 

March 20066 

May 20066 


Jul 066 

Sep 066

Presesencia 

WWeb: b 

http://www.geneontology.org 

http://www.blast2go.de 

http://groups.google.com/group/Blast2GO 

Paper: p 

Ana Conesa, Stefan Götz, Juan Miguel García‐Gómez, Javier Terol, Manuel 

Talón and Montserrat Robles 

Blast2GO: A universal tool for annotation, visualization and analysis in 

functional genomics research. 

Bioinformatics 2005 21: 3674‐3676 


Ejemplos de usos en “papers” (I) 

Ref.: 

Anotación de ~16.000 Unigenes 

‐ Parámetros por defecto 

‐ Resultado general: 

‐1 a 4 anotaciones/Unigen 

‐Anotaciones en las 3 categorías g 

‐Fallos = sin homólogos 


Ejemplos de uso en “papers” (II) 

Ref.: 

Anotación de ~21 ~21.000 000 “chip chip features features” 

‐ Uso como herramienta de anotación 

‐ Uso como “data data mining tool tool” 


Ejemplos de uso en “papers” (III) 

Ref.: 

Generación de un chip de platija 

‐ Estudio de cambios en 

transriptoma como marcador de 

contaminación. 

‐ B2G como herramienta de 

anotación y análisis funcional 

‐ Identificación de categorías 

funcionales sobrerexpresentadas 

relacionadas con stress 


Software Demo (I) 

Objetivo 

Conocer el Blast2GO como herramienta de anotación y análisis funcional. 

Recursos: 

Software via Java Web Start: http://www.blast2go.de/ 

DDatos: t http://www.blast2go.de/b2gdata/murcia.zip 

htt // bl t2 d /b2 d t / i i 

Desarrollo (I): 

• Durante este ejercicio se va a ver cómo asignar semi-automáticamente semi automáticamente funciones biológicas 

definido por la "Gene Ontology" a secuencias de ADN no conocidas en base a búsquedas 

BLAST. 

• Desde la página web del B2G se puede ejecutar la aplicación vía Java Web Start. Se abre el 

fichero (10Seqs (10Seqs.fasta) fasta) adjunto con la aplicación B2G B2G. 

• Blast: Búsquedas de similitudes con el NCBI Qblast (parámetros estándar) y se generan las 

estadísticas correspondientes con el menú “Statistics“. Revisa los resultados Blast de algunas 

secuencias "blasteadas“ usando el botón derecho sobre la secuencia correspondiente en la 

ttabla bl dde secuencias. i GGuardar d y visualizar i li el l fi fichero h .xml l 

• Mapping: Menu -> Mapping -> Start Mapping - 

correspondientes con el menú “Statistics". 

y se generan las estadísticas 

• Anotation: Menu -> Annotation -> Start Annotation - y se generan g las estadísticas 

correspondientes con el menú “Statistics". 


Software Demo (II) 

Desarrollo (II): 

• Ampliar las anotaciones usando la herramienta “Annex” Annex en el menú “Annotation” Annotation y observa los 

resultados en “Application Messages”. 

• Complementar/cambiar la anotación de la secuencia no.3 manualmente usando enlaces al 

NCBI y Amigo, "The Gene Ontology Web Browser" (www.geneontology.org) 

• PPara conseguir i eso se abre b el l menú ú ddel l contexto t t dde esa secuencia i (b (botón tó dderecho) h ) y se abre b 

los resultados blast, las descripciones GO y el grafo de la anotación de las 3 categorías de 

esta secuencia. 

• Busca en el Amigo los términos biológicos más frecuentes del resultado blast (ubiquitin) y 

compara los resultados con las anotaciones hechas por el B2G. Con el menú ítem: "Change 

annotation and description" añade esa nueva anotación encontrado en el Amigo (protein 

ubiquitination). 

• Vuelve a generar g el ggrafo de esa anotación ppara 

ver el cambio. 

• Visualización: Visualizar la anotación de esta secuencia y generar un "Combined Graph" del 

conjunto de secuencias/anotaciones del grafo "molecular function". Repetir cambiando Node 

Score Filter a 1. 

• Fisher Fisher. Hacer un análisis de enriquecimiento y visualizar datos datos. Utilizar ficheros 

reference.annot y test.txt. 


Para terminar 

� … os invitamos a probarlo en www.blast2go.de 

�� Y nos alegramos siempre de recibir “feedback” feedback 

� ¿Más preguntas?

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