2.- HEMOSTASIA
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VISIÓN MODERNA DE LA<br />
<strong>HEMOSTASIA</strong>: NUEVO MODELO<br />
DE COAGULACIÓN<br />
CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A<br />
DISTANCIA 2011-2012<br />
TALLER DEL LABORATORIO CLÍNICO<br />
Nº 2
I.S.S.N.- 1988-7469<br />
Título: Taller del Laboratorio Clínico<br />
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica<br />
Maquetación: AEBM<br />
Fecha de Distribución: diciembre de 2011
Visión moderna de la hemostasia: nuevo<br />
modelo de coagulación<br />
Eva Menéndez Alonso.- Residente de Bioquímica Clínica, Shaila<br />
Rubio Arias.- Residente de Análisis Clínicos, Mª Teresa Sánchez<br />
Calvin.- FEA de Análisis Clínicos. Hospital Universitario 12 de<br />
Octubre. Madrid.<br />
1. INTRODUCCIÓN<br />
La hemostasia permite que la sangre circule libremente por los vasos sanguíneos<br />
y cuando existe una lesión, inicia una serie de mecanismos fisiológicos que conducen<br />
a la formación del trombo hemostático, a reparar el daño y finalmente disolver el<br />
coágulo representando el cese fisiológico de la hemorragia.<br />
El sistema de coagulación junto a los mecanismos de retroalimentación asegura la<br />
eficacia hemostática, mientras que el sistema fibrinolítico actúa como regulador del<br />
sistema de la coagulación, eliminando la fibrina no necesaria para la hemostasia.<br />
La hemostasia siempre depende del equilibrio entre ambos sistemas, este<br />
equilibrio es perfecto en las personas sanas. Si hay un déficit de los factores de<br />
coagulación o si el potencial fibrinolítico sobrepasa el de coagulación, se producirá<br />
una hemorragia. Al contrario, si el potencial de coagulación sobrepasa al fibrinolítico<br />
o se produce una disminución de los factores de inhibición de la coagulación se<br />
producirá una trombosis.<br />
Las superficies celulares, plaquetas, células endoteliales, fibroblastos y monocitos<br />
principalmente, juegan un papel muy importante dentro de la coagulación sanguínea.<br />
Desempeñan dos acciones básicas en la hemostasia. Por una parte proporcionan los<br />
factores esenciales que normalmente no están presentes en el plasma y por otra<br />
584
proveen una superficie para el ensamblaje de los complejos enzima-cofactor y su<br />
interacción con los sustratos para formar el coágulo de fibrina.<br />
El sistema de la hemostasia se divide en dos mecanismos de respuesta<br />
principales: la hemostasia primaria, donde se lleva a cabo fundamentalmente la<br />
interacción entre el endotelio y la plaqueta; y la hemostasia secundaria o coagulación<br />
donde participan los factores de coagulación que interaccionan sobre una superficie<br />
catalítica para formar una red de fibrina y posteriormente formar el coágulo<br />
sanguíneo (1).<br />
<strong>2.</strong> <strong>HEMOSTASIA</strong> PRIMARIA<br />
Tiene lugar a los pocos segundos de producirse una lesión vascular. La<br />
interacción de las plaquetas y la pared vascular juegan un papel esencial para<br />
detener la salida de la sangre en capilares, arteriolas pequeñas y vénulas.<br />
Las plaquetas son participantes esenciales en el proceso de la hemostasia<br />
primaria. Son pequeñas células discoides anucleadas, procedentes de la<br />
fragmentación del megacariocito. A pesar de carecer de núcleo, estas células<br />
contienen muchos componentes estructurales, metabólicos y de señalización propios<br />
de las células nucleadas. Incluso debido a su participación en diversos procesos<br />
fisiológicos y su accesibilidad, han servido como modelo de estudio en biología<br />
molecular.<br />
Las plaquetas, que normalmente circulan en forma inactiva, se adhieren a la<br />
pared del vaso dañado, segregando el contenido de sus gránulos e interaccionando<br />
con otras plaquetas, formando la base del tapón hemostático. Por otro lado, las<br />
plaquetas participan en la activación del sistema de la coagulación proporcionando la<br />
superficie sobre la cual se van a ensamblar los complejos que intervienen en esta<br />
fase (2).<br />
585
La formación del tapón hemostático se produce por una serie de mecanismos:<br />
<br />
Adhesión de la plaqueta al subendotelio vascular dañado (interviene el factor<br />
Von Willebrand)<br />
<br />
Agregación plaquetaria primaria al activarse el receptor glucoproteico IIb/IIIa<br />
y permitir así la unión de las plaquetas<br />
<br />
Liberación de compuestos intraplaquetarios que provocan agregación<br />
secundaria de nuevas plaquetas al tapón hemostático<br />
<br />
<br />
Consolidación y retracción del coágulo<br />
Formación del tapón hemostático definitivo con la formación del polímero de<br />
fibrina<br />
Detención de la hemorragia (1)<br />
3. COAGULACIÓN O <strong>HEMOSTASIA</strong> SECUNDARIA<br />
En esta fase se produce la interacción entre sí de las proteínas plasmáticas o<br />
factores de coagulación que se activan en una serie compleja de reacciones que<br />
culminarán con la formación del coágulo de fibrina.<br />
La fibrina formará una malla definitiva que reforzará al tapón hemostático inicial,<br />
formándose un coágulo o trombo definitivo.<br />
Intervienen en el proceso varias proteínas procoagulantes (factores de<br />
coagulación) y proteínas anticoagulantes (las más importantes son antitrombina III,<br />
proteína C y proteína S) que regulan y controlan el proceso de coagulación evitando<br />
una coagulación generalizada.<br />
Aunque la descripción del mecanismo de la coagulación se divide en diferentes<br />
fases, todas ellas guardan relación entre si. Las plaquetas activadas van a acelerar<br />
el proceso de la coagulación y a su vez los productos de la coagulación van a inducir<br />
la activación de las plaquetas.<br />
586
3.1 FACTORES DE COAGULACIÓN<br />
Los factores plasmáticos de la coagulación son proteínas procoagulantes (su<br />
nomenclatura es internacional). Se denominan utilizando números romanos,<br />
asignados en el orden en el que fueron descubiertos (no existe factor VI).<br />
A algunos factores plasmáticos no se les ha asignado un número romano, como<br />
son la precalicreína, calicreína, y el quininógeno de alto peso molecular (CAPM). Los<br />
fosfolípidos plaquetarios no están incluidos en esta clasificación.<br />
Todas las proteínas y componentes celulares involucrados en el proceso de<br />
coagulación circulan en plasma de forma inactiva en condiciones fisiológicas<br />
normales. Durante el proceso de la coagulación serán activados y entonces se<br />
representan con el sufijo “a” después del número romano. Se pueden englobar en<br />
dos grandes grupos:<br />
Factores dependientes de vitamina K<br />
La síntesis de los factores de la coagulación se realiza, principalmente, en el<br />
hígado y en el endotelio vascular. Requieren vitamina K para su correcta<br />
funcionalidad, aquí se incluyen los factores II, VII, IX y X, así como las dos<br />
principales proteínas reguladoras de la coagulación proteína C y proteína S. Todos<br />
ellos contienen de 10 a 12 residuos de glutamina, que son carboxilados a ácido<br />
carboxiglutámico por una carboxilasa que precisa como cofactor a la vitamina K.<br />
Este paso es importante para la unión del ión calcio y necesarios para la<br />
interacción de estas proteínas con las membranas plaquetarias (fosfolípidos<br />
plaquetarios).<br />
Los factores no carboxilados se conocen como P.I.V.K.A. (Protein Induced by<br />
Vitamin K Absence) que no son funcionales y poseen actividad anticoagulantes<br />
por un mecanismo competitivo sobre los factores carboxilados.<br />
587
Cofactores<br />
Se dividen en dos grupos:<br />
<br />
Procofactores plasmáticos: incluyen a los factores V, VIII y quininógeno. El FV<br />
circula en plasma como una proteína monomérica y el FVIII circula junto con<br />
el factor de von Willebrand (FvW) que al activarse, se disociarán por<br />
proteólisis.<br />
<br />
Procofactores celulares: incluyen al factor tisular (FT) y la trombomodulina<br />
(TM). El FT es el único factor que no se encuentra normalmente en la<br />
circulación sanguínea, es una proteína específica presente sobre la membrana<br />
plasmática de células como monocitos o células endoteliales. El FT se activa<br />
únicamente al entrar en contacto con el FVII, momento en el que se inicia la<br />
coagulación plasmática. La TM se expresa sobre las células del endotelio<br />
vascular, participa como anticoagulante activando a la proteína C (1)<br />
4. FIBRINOLISIS<br />
El sistema fibrinolítico consiste en la conversión de una proenzima, el<br />
plasminógeno, en su forma activa, la plasmina, la cual es capaz de degradar la<br />
fibrina y, así, eliminar el coágulo previamente formado. La transformación del<br />
plasminógeno en plasmina se produce mediante la acción proteolítica de dos<br />
enzimas: activador tisular del plasminógeno (tPA) y activador del plasminógeno tipo<br />
urocinasa (uPA).<br />
La plasmina degrada la fibrina del coágulo y la transforma en productos de<br />
degradación del fibrinógeno (PDF) que contienen residuos de lisina y arginina en<br />
posición carboxiterminal. Estos residuos constituyen los sitios de unión para el tPA y<br />
el plasminógeno, y son por tanto responsables de amplificar enormemente la<br />
cascada de la fibrinolisis. A esta tendencia profibrinolítica se opone una actividad<br />
588
antifibrinolítica, de tal modo que sólo un adecuado equilibrio entre ambas fuerzas<br />
dará lugar a un correcto funcionamiento del sistema fibrinolítico.<br />
La inhibición de la fibrinolisis se produce a diferentes niveles. Por una parte, están<br />
los inhibidores de los activadores del plasminógeno: el principal inhibidor de la<br />
fibrinolisis in vivo es el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 o PAI-1, que<br />
se sintetiza en el endotelio vascular y también en el hígado. Otros inhibidores son el<br />
PAI-2, fundamentalmente de origen placentario y el PAI-3, con una menor actividad<br />
antifibrinolítica.<br />
Se ha descrito también otro mecanismo que regula negativamente la activación<br />
del plasminógeno, se trata de la vía del inhibidor de la fibrinolisis activable por<br />
trombina (TAFI). Los residuos de los aminoácidos básicos exhibidos en la superficie<br />
de la fibrina parcialmente degradada sirven de anclaje al plasminógeno y al tPA.<br />
Cuando el plasminógeno y el tPA coinciden en la superficie del coágulo de fibrina, se<br />
produce la conversión del plasminógeno a plasmina. A este nivel el TAFI, una vez<br />
activado por la trombina (TAFIa), es capaz de eliminar los residuos de lisina y<br />
arginina de la superficie de la fibrina, impidiendo la formación de plasmina y, por lo<br />
tanto, limitando la cascada de la fibrinolisis.<br />
A otro nivel se puede regular la actividad proteolítica de la plasmina por la acción<br />
de la α2-antiplasmina, su principal inhibidor fisiológico, y, en menor medida, por la<br />
α2-macroglobulina y el TAFIa.<br />
Éstos son, básicamente, los factores implicados en la fibrinolisis, de tal modo que<br />
una correcta hemostasia depende del balance de fuerzas entre todas estas<br />
tendencias opuestas. Hay que resaltar que<br />
se trata de un equilibrio dinámico y<br />
adaptable a diferentes situaciones tanto fisiológicas como patológicas. (3)<br />
589
5. MODELOS DE COAGULACIÓN<br />
Distintos modelos de la coagulación in vivo se han descrito desde finales del siglo<br />
XIX. Las primeras descripciones estuvieron relacionadas con individuos que<br />
desarrollaban trombosis, se demostró que la formación del coágulo de fibrina se<br />
genera a partir de su precursor el fibrinógeno mediante una conversión enzimática<br />
mediada por la enzima trombina que a su vez provenía de la protrombina.<br />
En los siguientes años se realizaron múltiples investigaciones hasta conocer el<br />
factor responsable del inicio del proceso de coagulación.<br />
En el año 1904 Morawitz describió por primera vez un esquema de la coagulación<br />
sanguínea. Afirmó que los tejidos vasculares liberaban una tromboplastina tisular tras<br />
la lesión vascular, necesaria para el inicio del proceso de coagulación y propuso<br />
cuatro componentes esenciales para la coagulación: protrombina, fibrinógeno, calcio<br />
y tromboplastina. Descubrió también la presencia de antitrombinas en la circulación<br />
que modulan la trombocinasa, mejor conocida como factor tisular (FT). En el<br />
trascurso de los años se fueron descubriendo los factores de la coagulación.<br />
Ya en los años 60 dos grupos de investigación por separado, propusieron un<br />
modelo de coagulación que incorporaba una complejas reacciones, donde la<br />
activación secuencial de los factores de coagulación, daban como resultado la<br />
generación de una enzima llamada trombina. En este modelo las vías de coagulación<br />
se dividieron en dos sistemas: sistema extrínseco y sistema intrínseco. Le dieron una<br />
mayor importancia a la vía intrínseca como iniciadora de la coagulación a través del<br />
factor XII. Ambas vías convergían en una vía común y eran capaces de activar al<br />
factor X, el cual uniéndose con el cofactor V activado, generaban la trombina.<br />
Este modelo denominado Cascada de<br />
Coagulación, es razonablemente bueno<br />
y de gran utilidad en el laboratorio, para<br />
explicar la activación in vitro de la<br />
590
coagulación a través del tiempo de<br />
protrombina (TP) y tiempo de<br />
que corresponden a las vías extrínsecas<br />
e intrínsecas respectivamente.<br />
tromboplastina parcial activado (TTPa)<br />
Figura 1. Cascada de la coagulación<br />
Sin embargo en base a los descubrimientos de los últimos años este modelo es<br />
inadecuado para explicar las vías fisiológicas de la hemostasis in vivo al no considerar<br />
la interacción del sistema con las células que participan en la coagulación.<br />
Es evidente que la hemostasia no es posible sin la participación de las plaquetas, y<br />
por otra parte el FT es una proteína que está presente en la membrana de diversas<br />
células esenciales en la coagulación. Además diferentes células expresan proteínas<br />
procoagulantes, anticoagulantes y receptores para diversos componentes de la<br />
hemostasia, lo que ha supuesto un paradigma para explicar las reacciones que<br />
tienen lugar durante el proceso hemostático. (4)<br />
El modelo clásico de la cascada de la coagulación es por tanto inconsistente con<br />
el comportamiento clínico de la disfunción de la hemostasia. Se comprobó que<br />
ambas vías no operan de forma independiente y que los déficit de factores de la vía<br />
intrínseca que prolongan el TTPA no conllevan el mismo riesgo hemorrágico:<br />
591
deficiencias de factor XII no cursan con hemorragia y las de XI puede cursar con<br />
hemorragia leve, mientras que las deficiencias de factores VIII y IX (hemofilia A y B<br />
respectivamente) conllevan hemorragias graves. Otra observación clave fue el hecho<br />
de que el complejo FT/VII no sólo activa el factor X, sino también el factor IX (4).<br />
Varios grupos han explicado procesos fundamentales que rompen la estructura<br />
del modelo clásico de la coagulación:<br />
- La interacción FT/VIIa activa no solamente al factor X sino también al IX,<br />
llegándose a la conclusión de que la vía extrínseca sería la de mayor relevancia<br />
fisiopatológica in vivo.<br />
- El evento disparador de la hemostasia in vivo es la formación del complejo<br />
FT/FVIIa.<br />
- La trombina activa directamente al factor XI en una superficie cargada.<br />
De todo ello se ha concluido que es poco probable que el modelo tradicional<br />
funcione en condiciones fisiológicas, por lo que Hoffman y otros investigadores han<br />
propuesto una alternativa denominada Modelo Celular de la Coagulación (5).<br />
6. MODELO CELULAR DE LA COAGULACIÓN<br />
El modelo celular de la coagulación se explica en 3 diferentes etapas.<br />
6.1. INICIACIÓN<br />
El FT es el principal iniciador de la coagulación in vivo que actúa como receptor<br />
para el factor VII. Se expresa en numerosos tipos de células y está presente en<br />
monocitos circulantes y células endoteliales en respuesta a procesos inflamatorios.<br />
Las células están localizadas fuera del endotelio, lo que previene la iniciación de la<br />
coagulación cuando el flujo es normal y el endotelio está intacto. Es necesario que se<br />
produzca una lesión que rompa la barrera que separa al FT y al factor VII.<br />
592
Cuando se produce una lesión en la pared vascular, las células subendoteliales<br />
que contienen FT entran en contacto con el plasma y se inicia el proceso de<br />
generación de trombina al unirse al factor VII creando el complejo FT/VIIa. Éste<br />
complejo a su vez activa más VII, y también actúa sobre el factor IX y X.<br />
El factor Xa se combina en la superficie celular con el Va para producir pequeñas<br />
cantidades de trombina, que jugarán un papel importante en la activación de las<br />
plaquetas y del factor VIII en la siguiente fase (4).<br />
6.<strong>2.</strong> AMPLIFICACIÓN<br />
En esta fase la célula fundamental es la plaqueta. Éstas se adhieren a la matriz<br />
subendotelial, siendo activadas en lugares donde se ha expuesto el FT. Las pequeñas<br />
cantidades de trombina generadas en la fase anterior junto con el calcio sanguíneo y<br />
los fosfolípidos plaquetarios, amplifican la señal procoagulante inicial activando a los<br />
factores V, VIII y XI que se ensamblan en la superficie plaquetar para promover<br />
posteriores reacciones en la siguiente fase.<br />
Esta fase se acaba cuando el factor Va y el VIIIa se unen a la membrana celular<br />
de una plaqueta activada para poder formar dos complejos que iniciarán la fase<br />
siguiente (6).<br />
6.3. PROPAGACIÓN<br />
Los complejos iniciadores de la propagación son la tenasa (VIIIa/IXa, Ca 2+<br />
y<br />
fosfolípidos) y el complejo protrombinasa (Va/Xa, Ca 2+ y fosfolípidos). El complejo<br />
tenasa cataliza la conversión del factor Xa, mientras que el complejo protrombinasa<br />
cataliza, a nivel de la superficie plaquetar, la conversión de protrombina en grandes<br />
cantidades de trombina, lo que se conoce como “explosión de trombina” necesaria<br />
para la formación de un coágulo estable de fibrina.<br />
593
La trombina generada, activará al factor XIII o factor estabilizador de fibrina y a<br />
un inhibidor fibrinolítico (TAFI) necesarios para la formación de un coágulo de fibrina<br />
resistente a la lisis (4).<br />
La trombina es la enzima principal de la coagulación, la velocidad y el pico<br />
máximo de producción de trombina son factores muy importantes para que todas<br />
sus funciones se lleven a cabo.<br />
Las principales funciones de la trombina son: activación de las plaquetas, del<br />
cofactor V y VIII, del factor XI y XIII, activación de la vía del inhibidor de la<br />
fibrinolisis por trombina (TAFI), es la enzima responsable de la transformación del<br />
fibrinógeno a fibrina, interviene en la unión al receptor PAR-4 en la superficie de las<br />
plaquetas y participa en los procesos de inflamación y cicatrización de heridas (7).<br />
Figura <strong>2.</strong> Nuevo Modelo celular de la hemostasia (3)<br />
En resumen, según el modelo celular de la hemostasia, la coagulación fisiológica<br />
depende del contacto del FT subendotelial en el lugar de la lesión con el factor VIIa y<br />
del ensamblaje de las reacciones de coagulación a nivel de superficie celular<br />
plaquetar, lo que favorece la formación de trombina a nivel local y la generación de<br />
594
un coágulo estable de fibrina. Este modelo contempla una vía única y la focalización<br />
del proceso en las superficies celulares (4).<br />
7. CONTROL DE LA COAGULACIÓN<br />
Existen varios mecanismos que regulan la coagulación para prevenir un exceso de<br />
formación de trombina y la posible oclusión del flujo sanguíneo. Existe una expresión<br />
de antitrombina III y del inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) que inhiben al<br />
factor Xa que no está unido a las células que liberan TF o las plaquetas activadas.<br />
Por otra parte la trombina se autorregula al unirse a la trombomodulina y así activar<br />
a la proteína C que va a impedir la generación de nuevas moléculas de trombina al<br />
escindir irreversiblemente el factor Va y el VIIIa. Esta proteína requiere de un<br />
cofactor la proteína S que va a actuar aumentando su afinidad por la membrana<br />
celular unas 10 veces. La proteína C inhibirá al factor Va en un endotelio no dañado,<br />
pero no lo bloqueará si se encuentra sobre una plaqueta activada. El complejo<br />
proteína C-proteína S también inactiva a un importante inhibidor de la fibrinolisis, el<br />
inhibidor del activador del plasminógeno. La fibrinolisis es esencial para disolver el<br />
coágulo formado por los mecanismos hemostáticos (6).<br />
8. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO (8)<br />
8.1. CONDICIONES PREANALÍTICAS<br />
Para la determinación del estudio hemostático lo primero que necesitamos es una<br />
correcta obtención de la muestra. Son necesarios tubos con citrato sódico como<br />
anticoagulante. Estos tubos contienen una concentración de citrato sódico de 130<br />
mM, que con la sangre se quedará en una concentración final de 13mM, para ello se<br />
deben extraer 9 partes de sangre y una de citrato sódico. Para la hematológica<br />
básica se debe utilizar un tubo con ácido etilen diamino tetracético (EDTA) como<br />
595
anticoagulante.<br />
8.<strong>2.</strong> EXPLORACIÓN DE LA <strong>HEMOSTASIA</strong> PRIMARIA<br />
Tiempo de sangría: es el periodo de tiempo desde que se realiza una pequeña<br />
incisión en la piel y el momento en que finaliza el sangrado. Es la única prueba que<br />
permite medir in vivo la reacción plaqueta-endotelio y demuestra la capacidad<br />
hemostática de las plaquetas. Se usa la técnica de Ivy que consiste en practicar una<br />
incisión en la cara anterior de antebrazo mediante una hoja especial de 1 cm de<br />
longitud y 1 mm de profundidad.<br />
El tiempo de hemorragia normal es entre 3 minutos y 30 segundos, y 8 minutos y<br />
30 segundos. Las causas de prolongación del tiempo de sangría son las alteraciones<br />
en la pared vascular, trombocitopenias, defectos en la agregación o adhesión<br />
plaquetar.<br />
Función plaquetaria: para su evaluación estudiaremos el PFA-100, agregometría y el<br />
estudio de las glucoproteínas de membrana.<br />
Para evaluar el PFA-100 (9) se utiliza sangre total citratada. No es tan específica<br />
como el Ivy pero es más rápida y menos dolorosa para el paciente además de evitar<br />
los posibles errores producidos por problemas cutáneos del paciente.<br />
Se realiza una simulación in vitro del tiempo de hemorragia. Reproduce un flujo<br />
constante de sangre que atraviesa una membrana porosa de colágeno y epinefrina o<br />
colágeno y ADP. El paso por la membrana produce la activación de las plaquetas y su<br />
agregación. El aparato registra el tiempo de obturación del flujo. El tiempo de<br />
obturación está aumentado en pacientes con trombocitopenia, enfermedad de Von<br />
Willebrand y en pacientes que toman medicación que altera la función plaquetar.<br />
596
Otro estudio es la agregometría que se realiza cuando el tiempo de oclusión en<br />
PFA-100 esta alterado. Utiliza el método turbidimétrico de Born, que consiste en<br />
medir la trasmitancia del plasma del paciente cuando se produce la agregación<br />
plaquetar. Obtenemos el porcentaje de agregación plaquetaria frente a un panel de<br />
agentes agregantes: ADP, colágeno, ristocetina, adrenalina, ácido araquidónico,<br />
trombina, endoperóxidos cíclicos y un ionóforo de calcio. La respuesta de las<br />
plaquetas a los diferentes agentes agregantes se divide en cuatro fases sucesivas: el<br />
cambio de forma, la agregación, la movilización y la liberación del contenido de los<br />
gránulos. Por ello, podemos estudiar donde se produce el fallo en el funcionamiento<br />
plaquetario.<br />
El último estudio para la determinación de la función plaquetar es la<br />
determinación de las glucoproteínas de membrana que se puede estudiar por dos<br />
técnicas diferentes:<br />
1- Técnica electroforética en gel de policrilamida donde se detecta y caracteriza la<br />
glucoproteína. Esta técnica no permite detectar las propiedades antigénicas de las<br />
proteínas ni su interacción con otras proteínas.<br />
2- Técnica inmunológica: citometría de flujo, permite medir diferentes subgrupos<br />
dentro de la población plaquetaria estudiada, es capaz de detectar cambios<br />
conformacionales en las glucoproteínas (ejemplo: complejo IIb-IIIa) y diferenciar las<br />
plaquetas activadas de las que están en reposo.<br />
Exploración de la cinética plaquetaria: se realiza un marcaje a las plaquetas con un<br />
radionúclido y se mide la radioactividad ligada a las plaquetas circulantes. Nos<br />
permite cuantificar la supervivencia plaquetar, la tasa de renovación plaquetaria y los<br />
lugares de destrucción periférica en el paciente (habitualmente el bazo).<br />
597
Exploración de la adhesividad: se realiza la técnica de Baumgartner que estudia la<br />
interacción entre las plaquetas y el subendotelio en condiciones de flujo definidas.<br />
Reproduce la circulación sanguínea y permite emular los parámetros reológicos de<br />
flujo y coeficiente de cizallamiento. Nos permite observar trastornos hemorrágicos<br />
congénitos (por defectos en la unión del Factor von Willebrand al subendotelio y al<br />
GPIb).<br />
Nuevos métodos de estudio de la función celular global de las plaquetas:<br />
transcriptómica y proteómica(10). Se sabe que las plaquetas poseen varios mRNA.<br />
Existen principalmente dos técnicas transcriptómicas para el estudio de los<br />
transcriptos, que son los microarrays y la SAGE (análisis seriado de expresión génica)<br />
(11). Las técnicas proteómicas nos proporcionaran conocimientos del contenido<br />
proteico plaquetar y de su importancia en las alteraciones de la función plaquetar o<br />
su respuesta a fármacos antitrombóticos.<br />
8.3. PRUEBAS DE ESTUDIO DE DIÁTESIS HEMORRÁGICA<br />
Tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa): el plasma citratado en presencia<br />
de tromboplastina parcial o cefalina y cloruro cálcico se coagula a una velocidad<br />
dependiente de la concentración de todos los factores (excepto VII y XIII). Se inicia<br />
la reacción añadiendo al plasma una sustancia cargada negativamente (sílice, caolín<br />
o ácido elágico). Esta prueba presenta un error sistemático cuando no se cumple la<br />
proporción 9:1 de sangre: citrato y nos da un valor de TTPa alargado. La relación<br />
(TTPa / TTPa control) > 1,5 se correlaciona con déficit de factores y el riesgo de<br />
hemorragia. Podemos detectar hemofilias tipo A y B e inhibidores de la coagulación<br />
(anticoagulante lúpico). Se usa para el control del tratamiento con heparina.<br />
598
Tiempo de protrombina o de Quick (TP): el plasma citratado en presencia de<br />
tromboplastina y cloruro cálcico se coagula a una velocidad dependiente de la<br />
actividad de protrombina, de los factores V, VII, X y el fibrinógeno. Evalúa la vía<br />
extrínseca. Se usa para el control del tratamiento crónico con cumarínicos. Detecta<br />
anomalías de factores y se correlaciona el riesgo de hemorragia junto con TTPa.<br />
Los resultados se expresan en la unidad: índice normalizado internacional (INR)<br />
es la razón del tiempo de coagulación del paciente respecto al control elevado a un<br />
valor llamado ISI (índice de sensibilidad internacional) que es propio de cada<br />
tromboplastina.<br />
Tiempo de trombina (TT): tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al<br />
añadir una baja concentración de trombina. Valora la capacidad de polimerizar del<br />
fibrinógeno. Se prolonga en niveles muy bajos de fibrinógeno o niveles altos de<br />
productos de degradación del fibrinógeno o de la fibrina.<br />
Tiempo de reptilasa: tiempo que tarda en coagular un plasma citratado al que se<br />
añade reptilasa (reptilasa es una enzima proteolítica extraída del veneno de la<br />
serpiente Bothrops atrox que actúa como el fibrinógeno). Se alarga en hepatopatías,<br />
disfibrinogenemias e hipofibrinogenemia. Es insensible a la heparina (se usa esta<br />
técnica cuando queremos comprobar si un plasma contiene heparina).<br />
Concentración de fibrinógeno: se usa el método Von Clauss (12) que utiliza plasma<br />
citratado diluido en el que se añade un exceso de trombina. Mide el tiempo de<br />
transformación del fibrinógeno a fibrina. Siendo la concentración de fibrinógeno<br />
proporcional al tiempo medido por el analizador, extrapolándose el resultado del<br />
paciente a la correspondiente curva de calibración realizada en el ensayo.<br />
599
Dosificación de la actividad de los factores:<br />
Factores II, V, VII y X: Dependiendo de qué factor quieras medir se usa plasma<br />
citratado con exceso de los otros factores y se inicia la coagulación con<br />
tromboplastina y calcio. El tiempo de coagulación es proporcional a la concentración<br />
del factor.<br />
Factores VIII, IX, XI y XII: igual que el anterior pero se inicia la coagulación con<br />
cefalina y calcio.<br />
Factor XIII: se debe activar el factor XIII con trombina y valorar la actividad<br />
trasglutaminasa sobre un sustrato o con un sustrato cromogénico.<br />
Factor von Willebrand (FvW): puede realizarse por medio de una determinación por<br />
aglutinación donde se añade ristocetina para inducir o mimetizar el cambio que se<br />
produce en el factor von Willebrand cuando se ha unido al colágeno. Se induce la<br />
agregación plaquetaria. Se determina por técnicas de ELISA, electroinmunoensayo.<br />
Determinación de dímero D: el dímero D es un producto de degradación de la fibrina.<br />
Su exceso nos indica estados de hiperactivación de la coagulación como coagulación<br />
intravascular diseminada (CID). También nos orienta a posible tromboembolismo e<br />
hiperfibrinolisis. Se detecta por métodos cuantitativos (ELISA o técnicas<br />
turbidimétricas) o semicuantitativos (aglutinación por partículas de látex o<br />
inmunofiltración).<br />
α 2 -antiplasmina: es el principal inhibidor de la plasmina (13). Es una glucoproteína.<br />
Se incuba el plasma citratado con exceso de plasmina. Luego se añade un sustrato<br />
cromogénico que mide la cantidad de plasmina residual, está será inversamente<br />
proporcional a la capacidad antiplasmínica del plasma, debida prácticamente en su<br />
totalidad a la α 2 -antiplasmina.<br />
600
8.4. DETECCIÓN DE INHIBIDORES<br />
El alargamiento de las pruebas básicas de coagulación o la detección de niveles<br />
bajos de un factor no siempre son debidas a un déficit o defecto, sino que puede ser<br />
consecuencia de la presencia de un inhibidor.<br />
Detección de anticoagulante lúpico (AL): son autoanticuerpos dirigidos contra<br />
complejos proteína-fosfolípidos que impiden la correcta unión de los factores de<br />
coagulación a las superficies fosfolipídicas. Se asocian a una tendencia trombótica.<br />
Resultados: se produce alargamiento de la TTPa, o el tiempo de protrombina.<br />
Para diagnosticar un paciente con AL deben cumplirse los siguientes criterios:<br />
prolongación de al menos una prueba de coagulación que necesite fosfolípidos,<br />
confirmación de que la alteración se debe a un inhibidor y no a un defecto de<br />
factores, evidencia de que la actividad inhibitoria depende de los fosfolípidos y<br />
evidencia de que el inhibidor no va dirigido contra factores de coagulación.<br />
Se determina por dos test: Test de Exner, mide el tiempo de coagulación de un<br />
plasma mezclado en diferentes proporciones con un plasma control, con caolín y<br />
cloruro cálcico. Es sensible a heparina y a los inhibidores específicos contra factores<br />
de coagulación. Al ser positivo descartaremos los inhibidores específicos contra<br />
factores de coagulación, y el Test de Russell, se coagula un plasma con veneno de la<br />
serpiente de Russell, que activa el factor X en presencia de pequeñas cantidades de<br />
fosfolípidos. También es sensible a la heparina.<br />
Detección de anticuerpos antifosfolípidos: son anticuerpos contra los fosfolípidos<br />
(14). Los pacientes presentan episodios trombóticos, abortos recurrentes o<br />
trombocitopenia. Se determinan con técnicas ELISA utilizando como antígeno la<br />
cardiolipina o la fosfatidilserina.<br />
601
Detección de inhibidores contra los factores de la coagulación: se detectan<br />
inhibidores contra los factores de la vía intrínseca, los más frecuentes son<br />
anticuerpos IgG anti-FcVIII. Se utiliza el test descrito por Ewing y Kasper, en el que<br />
se valora el TTPa de una mezcla del plasma normal y del paciente, incubados juntos<br />
durante dos horas a temperatura ambiente de 37ºC. En presencia de un inhibidor, el<br />
TTPa posterior a la incubación es prolongado en comparación con los controles sin<br />
inhibidor.<br />
8.5. PRUEBAS PARA VALORAR LA TENDENCIA TROMBÓTICA<br />
Cuando a un paciente se le relaciona con una patología trombótica se debe hacer<br />
un estudio básico de trombofilia, es decir, antitrombina, proteína C, proteína S,<br />
resistencia a la proteína C activada, anticoagulante lúpico, factor VIII, homocisteína,<br />
anticuerpos antifosfolípidos, la mutación factor V Leiden y la mutación G20210A del<br />
gen de la protrombina.<br />
Antitrombina: principal inhibidor fisiológico de las serínproteasas. Su cuantificación<br />
funcionalmente se basa en la inhibición de la antitrombina por trombina o factor Xa.<br />
Se incuba el plasma citratado problema con un exceso de trombina o de factor Xa en<br />
presencia de heparina que acelera la inhibición. A continuación se añade un sustrato<br />
cromogénico, con el que se valora la enzima residual, que es inversamente<br />
proporcional a la cantidad de antitrombina presente en el plasma.<br />
Si en la cuantificación funcional se obtiene niveles bajos de antitrombina se hace<br />
la determinación antigénica. Se realiza por métodos de inmunodifusión radial,<br />
electroinmunoensayo o ELISA. Si es un defecto de síntesis (los niveles detectados<br />
por la cuantificación funcional y la determinación antigénica son los mismos) y si es<br />
una proteína disfuncional (son mayores los niveles obtenidos por la determinación<br />
602
antigénica que por la cuantificación funcional).<br />
Proteína C: es una glucoproteína vitamina K dependiente con acción anticoagulante.<br />
Se puede hacer su determinación funcional midiendo la proteína C activada sobre un<br />
sustrato. Se puede utilizar el complejo trombina-trombomodulina o veneno de<br />
serpiente para activar a la proteína C. La detección se realiza añadiendo un sustrato<br />
cromogénico o su sustrato natural (factor Va y VIIIa). El primero es un método<br />
colorimétrico y el segundo una técnica coagulativa en la que se valora el<br />
alargamiento del tiempo de coagulación por la proteína C activa.<br />
Proteína S: es un cofactor no enzimático para la actividad de la proteína C activada<br />
sobre los factores Va y VIIIa. En el plasma va unida en un 60% a C4b binding<br />
protein (C4bBP) (15). El C4bBP es una glicoproteína de alto peso molecular del<br />
complemento, formada por 7 subunidades α idénticas y una subunidad β. Las<br />
subunidades α se unen a C4b y la unidad β se une a la proteína S (PS). Para evaluar<br />
su concentración hay que conocer la concentración total, la libre y su funcionalidad.<br />
La determinación de proteína S libre se realiza eliminando los complejos C4bBP-PS<br />
mediante precipitación con polietilenglicol. Luego se mide con una técnica ELISA. La<br />
determinación proteína S total se realiza por técnicas ELISA o de<br />
electroinmunoensayo. Por último, para la determinación funcional se mide el<br />
alargamiento del TTPa o de protrombina en el que el plasma citratado del enfermo<br />
se ha diluido en plasma deficiente en proteína S y al que se añade factor V y<br />
proteína C activada. El alargamiento del tiempo de coagulación es proporcional a la<br />
concentración de proteína S.<br />
Hay tres tipos de defectos: Tipo I (niveles bajos de PS total, libre y funcional),<br />
tipo II (niveles normales de PS total y libre y disminución de la PS funcional) este<br />
603
tipo es poco frecuente y posteriormente se ha comprobado que muchos de los<br />
pacientes de este grupo realmente tenían el factor V Leiden mutado, y el tipo III<br />
(niveles normales de PS total, bajos de PS libre y funcional).<br />
Mutación factor V Leiden: cuando existe una mutación en el nucleótido 1691G>A en<br />
el gen del factor V, se produce un cambio de una arginina por una glutamina. Lo que<br />
da lugar a una mayor resistencia a la degradación del factor V por la proteína C<br />
activada, lo que está asociado a trombofilia. Se analiza el ADN mediante<br />
amplificación por PCR del fragmento genómico que contiene el nucleótido y se hace<br />
una digestión con una enzima de restricción.<br />
Mutación 20210G>A del gen de la protrombina: La mutación se da en el fragmento<br />
genómico del gen de la protrombina. Se produce un cambio en la zona 3’ (no<br />
codificante), en el nucleótido 20210G>A. Se detecta por amplificación de la zona y<br />
posterior digestión con una enzima de restricción. La presencia de la mutación se<br />
asocia a niveles más elevados de factor II, y a un incremento del riesgo trombótico.<br />
Mutación Jak2: JAK2 (16) es una proteína con función tirosinquinasa implicada en la<br />
traducción de señal de los receptores de múltiples citoquinas. Se ha descrito una<br />
mutación en dominio pseudotirosinkinasa de esta proteína que confiere un estatus de<br />
activación permanente a esta proteína, lo que ocurre es que no puede ser inhibida<br />
por sus inhibidores. Esta mutación se sitúa en el aminoácido 617 y se produce un<br />
cambio de valina por fenilanina. La presencia de esta mutación se ha descrito en la<br />
trombocitosis esencial con una sensibilidad del 65% y una especificidad del 100%.<br />
Se analiza por High Resolution Melting (HRM), este método se basa en un análisis de<br />
PCR a tiempo real para identificar las variaciones en las secuencias de ácidos<br />
nucleicos, utilizando las curvas de la temperatura de melting (disociación del ADN).<br />
604
9. TRASTORNOS DE LA <strong>HEMOSTASIA</strong><br />
El diagnóstico de la hemostasia exige la realización de una historia clínica, una<br />
exploración física y un estudio complementario de laboratorio.<br />
9.1. TRASTORNOS DE LA <strong>HEMOSTASIA</strong> PRIMARIA (17)<br />
Trombocitopenia: se define como valores de plaquetas totales inferiores a<br />
150000/µl. Por debajo de 50000/µl se dan hemorragias espontáneas y por debajo de<br />
10000/µl pueden resultar mortales. La trombocitopenia es resultado de uno o varios<br />
de los siguientes procesos: disminución de su producción por la médula ósea,<br />
secuestro, por lo general en un bazo crecido, o mayor destrucción de las plaquetas.<br />
En primer lugar hay que descartar la posible presencia de una<br />
"Pseudotrombocitopenia", sobre todo en pacientes sin una causa manifiesta de<br />
trombocitopenia. Es un error in vitro causado por la aglutinación de las plaquetas<br />
mediada por los anticuerpos anti-EDTA. Se debe comprobar el resultado y observar<br />
si se ha producido un coágulo en la muestra por incorrecta homogeneización del<br />
anticoagulante con la sangre recién obtenida. Descartar la existencia de agregados<br />
plaquetarios con la observación de un frotis de sangre periférica al microscopio<br />
óptico. Y por último diagnosticar la psedotrombopenia con la realización del<br />
recuento plaquetario en sangre recogida en un tubo con citrato de sodio.<br />
Los síntomas de los pacientes con trombocitopenia son pequeños sangrados de<br />
vénulas pequeñas o capilares en lugar de vasos grandes. La piel de estas personas<br />
muestra muchas manchas purpúreas pequeñas, de las que deriva el nombre de<br />
púrpura trombocitopénica. La púrpura trombocitopénica es un trastorno adquirido<br />
que desencadena la destrucción de plaquetas mediada por factores inmunitarios y<br />
también se produce la inhibición de la liberación de plaquetas a partir del<br />
605
megacariocito.<br />
Trombocitopenia hereditaria, puede darse de forma aislada o como parte de otro<br />
síndrome. Es una enfermedad hereditaria autosómica dominante, autosómica<br />
recesiva o ligada a X. En la actualidad se sabe que muchas formas de<br />
trombocitopenia autosómica dominante están relacionadas con mutaciones en el gen<br />
de la cadena pesada de miosina no muscular MYH9.<br />
Trombocitosis: casi siempre se debe a una deficiencia de hierro, inflamación,<br />
cáncer o infección (trombosis reactiva), o un proceso mieloproliferativo subyacente<br />
(trombocitemia idiopática o policitemia verdadera)<br />
Trombopatías: dentro del grupo de trombopatías vamos a comentar la enfermedad<br />
de Von Willebrand, enfermedad de Bernard-Soulier y la enfermedad de Glanzman.<br />
Enfermedad de Von Willebrand: es el trastorno hemorrágico hereditario más<br />
frecuente (18).<br />
El factor de von Willebrand desempeña dos funciones: como<br />
principal molécula de adhesión que fija la plaqueta al subendotelio expuesto y como<br />
proteína fijadora para el factor VIII, lo cual trae consigo una prolongación importante<br />
de la vida media del factor VIII en la circulación sanguínea. La enfermedad de von<br />
Willebrand se ha clasificado en tres tipos principales (1, 2 y 3) y cuatro subtipos del<br />
tipo 2 (2A, 2B, 2M y 2N).<br />
El tipo 1 es el más frecuente. Los pacientes presentan, sobre todo, hemorragias en<br />
mucosas, equimosis excesiva y epistaxis. A menudo, la enfermedad de von<br />
Willebrand leve tipo 1 se manifiesta inicialmente durante las extracciones dentales o<br />
con la amigdalectomía. Muchos factores influyen tanto en las concentraciones de<br />
FvW como en los síntomas de hemorragia, se sabe que influyen el grupo sanguíneo<br />
del paciente, su estado hormonal tiroideo, la raza, el estrés y el ejercicio.<br />
606
Los pacientes con enfermedad de von Willebrand tipo 2 tienen defectos<br />
funcionales en el FvW.<br />
La enfermedad de von Willebrand adquirida es un raro trastorno que se observa<br />
en pacientes con gammapatías monoclonales, mieloma múltiple y macroglobulinemia<br />
de Waldenström. Se sospecha en pacientes con síntomas recientes de hemorragia<br />
grave en mucosas, sobre todo en individuos de edad avanzada.<br />
Enfermedad de Bernard-Soulier: Enfermedad con herencia autosómica recesiva que<br />
se manifiesta por hemorragias desde la infancia. Existe un déficit del receptor<br />
plaquetario GpIb-IX-V.<br />
Enfermedad de Glanzman: Enfermedad hereditaria autosómica recesiva,<br />
caracterizada por un déficit del receptor de plaquetas GpIIb-IIIa.<br />
9.<strong>2.</strong> TRASTORNOS DE LA COAGULACIÓN<br />
Trombosis venosa: Es el resultado de la formación de un coágulo obstructivo en<br />
las venas. Ocurre principalmente en las venas profundas de la pierna, desde donde<br />
algunas fracciones del coágulo a menudo embolizan hacia los pulmones. Los<br />
síntomas de trombosis venosa no son específicos y requiere estudios por imágen. El<br />
tratamiento con anticoagulantes debe ser rápido y adecuado. Los factores de riesgo<br />
para la trombosis, están relacionados con la inmovilización o con la<br />
hipercoagulabilidad.<br />
Trombofilia hereditaria: Estos pacientes tienen una “tendencia genéticamente<br />
determinada al tromboembolismo venoso”. Su primer episodio de trombosis suele<br />
aparecer alrededor de los 25-30 años. No son recomendables los anticonceptivos<br />
orales que contienen estrógenos y se considerará la profilaxis anticoagulante<br />
después del parto en mujeres con trombofilia hereditaria.<br />
607
Hemofilias: La hemofilia es una enfermedad hemorrágica recesiva ligada a<br />
cromosoma X producida por mutaciones en el gen F8 (hemofilia A o hemofilia clásica<br />
-> déficit factor VIII) o el gen F9 (hemofilia B -> déficit factor IX). Afecta a 1:10.000<br />
varones, las mujeres son portadoras de la enfermedad. Clínicamente la hemofilia A y<br />
la hemofilia B son indistinguibles. El fenotipo de la enfermedad se correlaciona con la<br />
actividad residual del factor VIII o el IX y se clasifica como grave (
vasos en la microcirculación y puede derivar a un fallo multiorgánico. Las causas más<br />
frecuentes son la sepsis bacteriana, trastornos malignos como tumores sólidos,<br />
leucemia promielocítica aguda y causas obstétricas.<br />
La púrpura fulminante es una forma grave de coagulación intravascular<br />
diseminada debida a trombosis de zonas extensas de la piel.<br />
Los análisis de laboratorio deben incluir pruebas de coagulación (TTPa, TP y TT),<br />
marcadores de productos de la degradación de la fibrina (dímero D), recuentos<br />
plaquetarios y eritrocíticos y análisis del frotis sanguíneo al microscopio óptico, con la<br />
observación de esquistocitos (fragmentos de eritrocitos).<br />
Déficit de vitamina K: el déficit de la vitamina K se ha relacionado con las<br />
deficiencias combinadas de todas las proteínas dependientes de vitamina K, incluidas<br />
las proteínas procoagulantes protrombina, VII, IX y X, y los anticoagulantes proteína<br />
C y proteína S (19). La vitamina K es una vitamina liposoluble y es el cofactor para<br />
la carboxilación del carbono gamma de los residuos de ácido glutámico en los<br />
factores dependientes de vitamina K. El déficit de vitamina K en un paciente produce<br />
episodios hemorrágicos leves a graves.<br />
609
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