Los hongos como factorías celulares: biodiversidad de metabolitos ...

S54 Rev Iberoam Micol 2000; 17: S54-S60 

Revisión 

Resumen 

Summary 

Key words 

Dirección para correspondencia: 

Dr. Santiago Gutiérrez 

Dpto de Ecología, Genética y Microbiología, ESTIA, 

Universidad de Léon, Campus de Ponferrada, 

24400 Ponferrada, España 

Tel.: +34 987 291509; Fax.: +34 987 291506; 

E-mail: degsgm@unileon.es 

©1999 Revista Iberoamericana de Micología 

Apdo. 699, E-48080 Bilbao (Spain). 

1130-1406/99/5.00 Euros 

Los hongos como factorías celulares: 

biodiversidad de metabolitos 

secundarios 

Santiago Gutiérrez 2,3 , Javier Casqueiro 2 y Juan Francisco Martín 1,2 

1 Dpto. de Ecología, Genética y Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de León, León, España, 

2 Instituto de Biotecnología (INBIOTEC), León, España y 3 Dpto de Ecología, Genética y Microbiología, ESTIA, 

Universidad de Léon, Ponferrada, España 

La superproducción de antibióticos β-lactámicos ha sido abordada tradicionalmente 

por técnicas de mutagénesis clásica, método que se ha mostrado muy 

efectivo y que ha sido el responsable de los mayores incrementos en la producción. 

El desarrollo de las técnicas de ADN recombinante aplicables a hongos 

filamentosos ha permitido la actuación directa sobre los genes implicados en la 

biosíntesis. En primer lugar el incremento en el número de copias de algunos 

genes particulares ha permitido alcanzar aumentos moderados en la producción, 

pero sólo en algunos casos. Por otro lado el cambio de la región promotora de 

algunos genes con bajo nivel de transcripción (Ej. El gen cefG de A. chrysogenum) 

ha llevado a mayores incrementos y finalmente la modificación del flujo de 

precursores de la biosíntesis de antibióticos β-lactámicos (Ej. Incremento del 

"pool" de ácido α-aminoadípico) han permitido obtener notables incrementos en 

la producción de penicilina. La manipulación genética de los hongos filamentosos 

ha llevado por tanto a obtener mejoras en la producción, aunque estas de 

momento no han superado a las mejoras obtenidas por mutagénesis clásica, 

debido fundamentalmente a que la mejora de uno de los pasos limitantes en la 

producción lleva a la aparición de una nueva limitación impidiendo así incrementos 

importantes de la misma. 

β-lactamas, Dosis génica, Sobreexpresión, Precursores 

Filamentous fungi as cellular factories: Biodiversity 

of secondary metabolites 

The increase in the production of β-lactam antibiotics has been carried out traditionally 

by classical mutagenic techniques, this method has been shown to be 

very effective and it has been the responsible for high increases in production. 

The development of DNA recombinant techniques in filamentous fungi has allowed 

the direct use of the genes involved in β-lactam biosynthesis. First the increase 

in the gene copy number of some particular genes has allowed slight 

increases of β-lactam antibiotics production, thought in only some cases. In addition, 

the exchange of the promoter region of some genes with low level of transcription 

(e.g. the promoter region of the cefG gene of A. chrysogenum) has given 

rise to higher increases. Finally the modification of the flux of the β-lactam antibiotics 

biosynthesis precursors (e.g. Increase of the α-aminoadipic acid pool) 

has yielded the highest increase in the penicillin production. Thus the genetic 

manipulation of the filamentous fungi has resulted in improvements in the production, 

though until now they have not exceeded the increases achieved by 

classical mutation. When one limiting step is improved, other new, limitations of 

the production appear to prevent important increases in the β- lactam production. 

β-lactams, Genetic dosage, Overexpression, Precursors

Los hongos producen gran variedad de metabolitos 

secundarios de interés para el hombre como son: antibióticos, 

ciclosporinas, ácidos mevínicos, alcaloides, compuestos 

antifúngicos, etc. 

De todos ellos, la biosíntesis de antibióticos β-lactámicos 

ha sido la más estudiada a nivel bioquímico y 

genético, así como en la que se han producido los incrementos 

de producción más significativos. Aspergillus, 

Penicillium y Acremonium, son importantes productores 

de antibióticos β-lactámicos. Estructuralmente, dichos 

antibióticos son esencialmente péptidos modificados que 

tienen rutas biosintéticas muy similares. El primero de sus 

intermediarios es formado por complejos multienzimáticos 

que integran múltiples funciones catalíticas. Aunque 

dichas multienzimas han sido caracterizadas bioquímica y 

genéticamente, las actividades obtenidas in vitro han sido 

muy bajas, y son reconocidos como "cuellos de botella" 

en las fermentaciones para la producción de antibióticos. 

La mayoría de los genes estructurales y algunos de 

los elementos de control de la ruta de biosíntesis de β-lactamas 

han sido ya identificados en hongos filamentosos. 

Sin embargo, el conocimiento limitado acerca de los 

mecanismos de regulación no ha permitido abordar una 

manipulación más directa. 

La superproducción de este tipo de compuestos ha 

sido abordada habitualmente por mutagénesis clásica de 

las cepas de producción, un método que aunque tedioso, 

ha sido generalmente muy efectivo, y que ha sido además 

el responsable de los mayores incrementos obtenidos en la 

producción de dichos antibióticos. Una vía más racional 

para incrementar la eficiencia de los programas de mejora 

de cepas implicaría el uso de la tecnología de ADN 

recombinante. Sin embargo, la mayoría de los experimentos 

de incremento de dosis génica no han conducido al 

incremento esperado en la producción, habiéndose conseguido 

por esta vía incrementos modestos. Estrategias más 

innovadoras, estarían basadas por un lado en la eliminación 

de los "cuellos de botella" ya conocidos y por otro en 

el estudio de las redes regulatorias que controlan la eficiencia 

de las enzimas in vitro, lo cual conduciría a indicar 

dianas para la manipulación eficiente de las cepas. 

Experimentos cuyo objetivo será el incremento en la producción 

industrial de metabolitos secundarios. Éstos 

incluyen productos ya existentes, así como nuevos productos, 

originados de fermentaciones de diferentes organismos 

y de diferentes cepas que expresen las enzimas 

modificadas genéticamente. 

De la gran cantidad de metabolitos secundarios 

producidos por hongos filamentosos, los antibióticos βlactámicos 

tienen una especial importancia tanto económica 

como social en diversos países europeos, entre ellos 

España, con una producción histórica que data de casi 50 

años. Como resultado, las industrias europeas ocupan 

posiciones de liderazgo en el mercado mundial. Liderazgo 

que se ha traducido en un gran esfuerzo investigador, 

especialmente notorio en los últimos diez años. 

Las tendencias de investigación más recientes, en 

el campo de los hongos filamentosos, tienden a considerar 

a dichos organismos como unidades biológicas en las que 

para mejorar la producción de un determinado compuesto 

hay que actuar, no sólo sobre la ruta de biosíntesis de ese 

compuesto, sino adicionalmente sobre otras rutas que 

indirectamente pudieran afectar a la primera. Como serían 

por ejemplo: rutas de secreción, transporte, regulación 

genética, etc. Convirtiéndose los hongos filamentosos en 

factorías celulares que con las modificaciones adecuadas 

pueden producir en cantidades económicamente significativas 

cualquier compuesto para el que exista o se pueda 

generar una ruta biosintética en dicho hongo filamentoso. 

Metabolitos secundarios en hongos filamentosos 

Gutiérrez S, et al. 

S55 

En el presente artículo se pretende dar una visión 

general de los distintos abordajes llevados a cabo hasta el 

momento, mediante el uso de técnicas de manipulación de 

ADN, para intentar incrementar la producción de antibióticos 

β-lactámicos en hongos filamentosos. 

BIOSÍNTESIS DE PENICILINAS Y CEFALOSPO- 

RINAS 

La ruta para la biosíntesis de penicilinas y cefalosporinas 

ha sido estudiada en profundidad durante los últimos 

años. En ambos casos la biosíntesis comienza con la 

condensación no ribosomal de los tres aminoácidos precursores, 

ácido L-α-aminoadípico, L-cisteína y L-valina 

para dar lugar al tripéptido ACV, en el segundo paso el 

tripéptido anterior es ciclado para formar la isopenicilina 

N, que es el primer intermediario de la ruta con actividad 

antibiótica. Desde la isopenicilina N la ruta diverge para 

formar la penicilina G por diferentes especies de 

Penicillium y Aspergillus, en este caso la cadena lateral 

del α-aminoadípico es intercambiada por una cadena lateral 

hidrófoba (Ej. ácido fenilacético para dar la penicilina 

G) activada como derivado de Coenzima A. En la biosíntesis 

de cefalosporina la cadena lateral de α-aminoadípico 

de la isopenicilina N es isomerizada a la forma D dando 

lugar a la penicilina N. Este intermediario es primero 

expandido para formar la desacetoxicefalosporina C, que 

contiene el anillo dihidrotiazínico de nueva formación, e 

hidroxilado dando lugar a la desacetilcefalosporina C, que 

es finalmente acetilada resultando en la formación de 

cefalosporina C por Acremonium chrysogenum (syn. 

Cephalosporium acremonium) (Figura 1) [1-3]. 

ESTRATEGIAS UTILIZADAS PARA INCREMEN- 

TAR LA PRODUCCIÓN DE ANTIBIÓTICOS 

β-LACTÁMICOS EN HONGOS FILAMENTOSOS 

UTILIZANDO LA TECNOLOGÍA DEL ADN 

RECOMBINANTE 

Incremento del número de copias de los genes 

a) Incremento del número de copias de los genes 

pcbC y penDE de Penicillium chrysogenum. Mediante 

transformación con un fragmento SalI de 5,1kb que contiene 

los genes pcbC y penDE de P. chrysogenum [4] en 

la cepa Wisconsin 54-1255 de este hongo y usando la 

resistencia a fleomicina como marcador de selección, se 

consiguieron aislar varios transformantes con una capacidad 

incrementada para producir penicilina V en comparación 

con la cepa control. Sin embargo la producción en los 

clones individuales fue muy variable, encontrándose también 

transformantes con capacidad reducida para producir 

antibióticos. Sin embargo, la producción media de penicilina 

V de 26 transformantes fue mayor en un 18% que la 

producción en las cepas control. Los dos mejores transformantes 

producían alrededor de un 40% más de penicilina 

V que el valor medio de los transformantes control. Las 

diferencias en la concentración de penicilina V entre 

transformantes individuales pueden ser explicadas por la 

integración del plásmido en diferentes localizaciones cromosomales 

y por diferencias en el número de copias entre 

ellos [5]. 

b) Incremento del número de copias del gen cefEF 

de A. chrysogenum. La observación de que los genes 

implicados en la biosíntesis de cefalosporina C estaban en 

una sola copia y que la penicilina N se acumulaba en los 

caldos de fermentación sugería que el nivel de biosíntesis 

de cefalosporina C estaba limitado por la cantidad de 

expandasa/hidroxilasa presente en A. chrysogenum. Se 

realizaron experimentos de transformación con un vector

S56 

Rev Iberoam Micol 2000; 17: S54-S60 

c 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc c 

dd�cddc�cddd�dd 

cyPdTˆcddc�dd cddc dd ddcd c 

dd�cddc�cdddvcdd 

dd�cddc�cdddAˆdd dddddIcddc�dd cddc dd ddcd c 

dd�cddc�cddd�dd 

dddddddc�cddddddd ddc‡ddcddc�dd cddc dd�cddccddddddcddcdcdddTˆcdddTˆ c 

dd�cddc�cdddvcdd 

dd�cddc�cddcddddcdTˆ Qddd‰ccddddddd cddc dd�cddctddddddcddcdcddddIcddddI c 

dd�cddc�cdddAˆdd 

dd�cddc�cddcQdddcQdAˆc ‡Pd@�cddddTˆddddddd cddc dd�gdd‡8dddcddcddcdcddcddcdcddd c 

dddddddc�cddddddd 

cyPddTuc yPddTu dd�cddc�cddc†9ddc†9dAˆ c‡8d@‰�Ud�dddddc�dd cddc dd�cdddH‰dddddddddcddcdcddcddcddddd c 

dddddddc�cdd†9ddd�9dTu 

dd�cdda�cddcc†Rd�†9dAˆc ‡8d@‰c�dd�dddddc�dd cddc dd�Qdddddcddcddcdcddcdddd�dd c 

dd�cddc�cddcxddd�†RddTu��cyPddddddTuc��yPddddddTu 

fddc��c†9dAˆ c‡8d@‰�ddddd@‰ddc�dd tddv dddddd�xdd†9ddddcddcdcddcdddddddd c 

dd�cddc�cddccQdd�sRddTu�cyPddHwccsRddTˆc�yPddHw�sRddTˆ 

cddc��†9dAˆc ‡8d@‰c�csRdH‰cddc�dd cdTu cy8ddAuc��dddddd�cddc†RHcRdddcdcddcdHcRdddd c 

dd�cddc�cddcc†Rd�sRddTˆ�cyPddHwc�cs9dAu�yPddHw�s9dAuc 

cddc��c†9dAˆ c‡8d@‰ cdddTu��cyPddddddTuc c 

s9dAuccyPddHwc�†RddTu�yPddHw�c†RddTuc 

c†Rdddddd@wc��sRdddddd@w��csRddTˆc‡PddTˆ�yPddTˆ�‡PddTˆcddc�dd †RdAˆc��y8d@‰c sRddTu�c‡PddHwccsRddTuc c 

cddc 

csRdddH‰ sRdddH‰c csRdA„8ddddIcddddddIc‡8ddddAˆddc�dd s9Au��yPddH‰ sRddTu�y8d@wc�csRddTuc c 

dc 

dc fdd@wsRdcddccs9d‡8dccs9ddddc�dd cxddddddddddddddHw sRddTu�yPddH‰�csRddTuc c 

cddc 

cddr�cdSc�xddddc�xddddddddd dd@w cddc��cddc�cddc�dc sRddddddHw��cs9ddd c 

dc 

cddc�cd�tddddc�cddddddddd ddrc cddc�c‡PTuc�‡PTucddc‡PdTˆc�cyPTˆc‡PdTˆc s9dd@w †Rdd c 

dc 

cQdvc‡PdcdAˆc‡8ddddv�cddddc�dd dd cddc�‡8dddddcUddddddcUdddIcdcddddIcUdddIc cxddrc c 

dc 

cxdAc8ddcQdAc8d@c9dAcPddcddc�dd dd cddc�cy8dcs9ddcddcdcddcddcddcdcddcddcddcddc dd c 

dc 

ddddddc†RdddH‰c†Rdddddcddc�dd dd cddc�dddddd�cddcddddcddcdddddcdcddcddcdddddc dd c 

dc 

dd cddc�ddddddcy8ddcdcdddddcddcddcdcddcddcddcddc dd c 

dc 

dd cddddddccs9dddddddddddddd‡ddddScdcddcddcdddddc dd c 

dc 

dc cdc‡Pd�dd dc dd cddddddc�†RddddHcRddHcRdH‚RdH‰cdcddcddcdddddc dd c 

dd 

dc cdcUdr�dd dc dd dd c 

dd 

c‡PdddcddddddddcdcdddddcdddTˆcdddTuyPdddcddcdddddcdd‡PddTcPddd dc dd dd c 

dd 

dc dd c 

dd�yPddddTu�y8ddddcddddddddcdcdddddcd@‰dIcddddddd†9dcddcdddddcddddddddddddvc 

dc dd c 

dd�cddddd�dd†dddd‰ddddcddcdd�dcdcddcddcdrcddcdddddddcxdcddcdd�dddddd�dddccdIc 

c‡PddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcdd�cddc dd c 

dd�cddddd�dd‡dddddddddcddcdd�dcdcddcddcdvcddddddddddctdcddcddctddddddctdddctddc 

‡8ddddIcUdddddAc8dddddAˆdd�cddc dd c 

dd�cd�ddd`�cddcddcddcdd�dcdcddcddcdAˆddddcddddd‡8dcddcdd‡8dcdddd‡8ddd‡8dSc 

Ud@wsRdcdd�dddd�dddd�cddc dd c 

dddddc�cddddddc�cddddddddcdd�dcdcddcddcddddHcRdddddddddcddcdddddcddddddHcRddH‰c 

ddrc�dd�dddd�dddddddddc c 

dd 

c‡PdddTˆc‡PdddTˆc‡Pdddddcddc�dd Qdvc�dd�dddd�dddddddddc c 

dd 

xdAucyPddd�dddd�dddd�cddc c 

cUd@c9dIcUd@c9dAc8d@cRddcddc�dd 

dddc�‡Pdccddc cddrc†Rdcd@‰c†9ddddr�cddddc�dd cQddddd†9ddddd@c9ddddd@‰dd�cddc c 

cddddc 

dddv�Uddvcxdv cddc�cd�xddddc�cddddddddd c†Rddddc†RdddH‰c†RdddH‰cdd�cddc ddddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcddc�dd c 

tdcddc 

cddv�‡8cdIc�tddddc�tddddc�dd ctdddddIcUdddddIcUdddddAˆddc�dd c 

Udcddc�c‡Pddddc�ctdcdIctdddI�dI 

cQdAuy8dcddccy8d†9dccy8ddddc�dd cUdccsRdcd@wcs9dcddc�cddddc�dd c 

ddcddc�y8dcddda�cUdcddcUdcddvcdd 

c†9ddddScddddddSc†9dddd@‰ddc�dd cddc�cdrc�xddddc�cddddddddd c 

ddcddc�dddddcddƒddTˆdddddcdddddIcdd 

†RddH‰�sRddH‰�†RddH‰cddc�dd cddc�cdvc�tddddc�cddddddddd c 

ddcddc�s9dcddd`cfdd�cddd@ws9dcdd 

cQdccyPdcdAucy8dcddc�cddddc�dd c 

Qd‡ddddd�c†Rddddc�dd�cddH‰cc†9ˆdS 

xddr cddc cxdddddScQdddddScQddddd@‰ddc�dd c 

xdd` 

cddc cddc ddddH‰c†RdddH‰c†RdddH‰cddc�dd c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc c 

cddc�ddTˆ�cdddddTˆ 

cddc c 

cddc�dddI�cddddddI 

cddc c 

cddddddc‡PddTucdddddctdddd�cddc�dd 

cddc c 

cdddddd‡8dddddddddddcUddddvccddddddd 

cddc c 

cddccddddd†Rdddd@‰ddcddcddIccddddddd 

cddc c 

tddccddddd�dd‰cddcddddddvcddcc‡dd 

cddc c 

UdddddddddddTˆdddddddddddddIcddcy8dd 

cddc c 

ddddd@ws9ddddddddddddd�s9ddcddddddS 

cddc c 

dd†RH‰�†RHwsRdddHwsRd�c†RdcdddddH‰ 

cddc c 

dd 

cddc��cddd�yPdTˆcdd�‡Pdc�dd c 

dd 

c 

cddc��cdddvccdddddAˆddvcUddc�dd�cddTˆc�‡PTˆ 

c 

cddc��tdddIccdd@c9ddddIcddSc�‡PddTˆddcddddTˆdddAcPdTc8ddAcPdddcdddTuyPddTˆc 

c 

cddc��Uddddccddrc†Cc9ddcddrc�UdddddddcddddddddddddddddddddddddcddddddddddIc 

c 

cddc��ctddcddvcddc�xddcdd�dddddcddcddcddddddddddddcddcdddddcdddd�dddddc 

c 

tddc��cUdddddIcddvc‡PdcddddS�dddddcddcddcddddddddddddcddcdddddcdddddddddddc 

c 

Uddddc�cdddddddcddAc8dScQdddr�ddcdddddcddcdddddddddcddcddcddcddddddddddcdddc 

c 

ddddSc�cddc�dd‡ddddd@‰cxdddc�Qddd@‰ddcddcdddddddddddScdddddddd‡dddddddddddc 

c 

ddddrc�cddc�ddHwsRdH‰c�dddc�†RdH‰cddcddcddHcRHwsRdH‰cddHcRdddH‚RdHwsRddddc 

c 

Qddd 

c 

xddS 

c 

cddr 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

cddc�dd 

c 

cddc�dd 

c 

cddc�dd 

c 

cddddddd 

c 

cddc�dd 

c 

cddc�dd 

c 

cddc�dd 

cddc�dd c 

cddc 

c 

cddc 

c 

dd�cddc�cddd�dd�cddc 

cddddddcdd�cddc c 

dd�cddc�cdddvcdd�cddc 

cddc�dd cdd†9ddcdd�cddc c 

dd�cddc�cdddAˆdd�cddc 

cddv�dd cddc†ddcdd�cddc c 

dddddddc�cddddddd�cddc 

cddAˆcdd cddddddcdddddddc c 

dd�cddc�cddcdddd�cddddd 

yPddTu cyPddTuc cyPdddddIcdd cyPd@ccdˆs9ddcdd�cddc cddc�cddc�cddddTuc�dddc�cyPdTˆcddcc‡Pd c 

dd�cddc�cddcQddddTuc 

cyPddH‰ccdAu†ddcdd�cddc cddc�cddc�cddddddd�dddv�dddddAˆddvcUdd c 

dd�cddc�cddc†9dddddTuc��yPddddddTu��cyPddddddTuc��cyPddH‰ddddcddddTu 

c‡Pdd@wc�cQddddScdd�cddc cddc�cddc�cddd†9dd�ctdddI�dd@c9ddddIcddS c 

dd�cdda�cddcc†RHwsRddTuc�yPddHw�sRddTu�cyPddHwccsRddTuc�cyPddHwccddcdddd†RddTˆ 

y8ddH‰�c†RddH‰cdd�cddc cddc�cddc�cdddcxdd�cUdddd�ddrc†Cc9ddcddr c 

fddc��csRddTuc�yPddHw�sRddTu�cyPddHwc�csRddTuc�cyPdd@wc�cddcQddd�sRdAuc 

yPddHw cddc�cddc�cddd�dd�cddcddvcdd�cxddcddc c 

cddc��csRddTucyPdd@w��sRddTucyPddHwc�csRddTuyPdddH‰�cddc†9dd�s9dTuc 

cs9ddddddH‰c��s9ddddd@wc��cs9dddddHw�cddcc†Rd�c†RdddddddddddddddddddHw cddc�cddc�cdddctddcdddddddddIcddvc‡PdcddddSc c 

cddc 

c†RdddH‰ †9dddc cs9dddddddddddddddHw cddc�cddc�cddd‡8ddcddddddddddcddAc8dScQdddrc c 

†RdddHwc 

cxdddc xddc cddddddddddddddddddd�dd�cdd‡ddddd@‰cxddd c 

cd 

dddc cddc cd cddddddddddddddddHwc�dd�cddHwsRdH‰�cddd c 

cd 

dddc cddc cd c 

cd 

dddc cddc cd c 

cd 

cddc cd c 

cd 

c‡PdddTˆ cddc cd c 

cd 

cUdddddAˆc cddc cd c 

cd 

cddc�cdIc cddc cd c 

cd 

cddc�cddc cddc�cddd�ddcddc�dd cd c 

cd 

cddc�cddc cddc�cdddvcddcddc�dd cd c 

cd 

cddc�cdSc cddc�cdddAˆddcddc�dd cd c 

cd 

cQddddd@‰c cddc�cdddddddcddddddd cd c 

cd 

c†RdddH‰ ‡Pddddddddddddddd†9dddcdddddddvc td c 

cd 

c‡8d c 

Uddd@w�cddcxdddcddc�ddAu 

Qdd@‰c�cddccQddcddc�ddddTˆ��y8dddTuc c 

ddddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcddc�dd 

†RH‰��cddcc†Rdcddc�dddddAˆc�yPddHcRddTuc c 

ctdddddIcUdddddIcUdddddAˆddc�dd 

c‡PddTuc cs9dAˆ�yPddHw�csRddTuc c 

cUdccsRdcd@wcs9dcddc�cddddc�dd 

cUdddddd †9dAuc�‡PddHw�csRddTuc c 

cddc�cdrc�xddddc�cddddddddd 

td@w�dd c†RddTuy8d@w��csRddTuc c 

cddc�cdvc�tddddc�cddddddddd 

Udrc�Qd cs9ddddH‰c��cs9ddTuc c 

cQdccyPdcdAucy8dcddc�cddddc�dd 

ddvc�cd †9d@wc †Rdddd c 

cxdddddScQdddddScQddddd@‰ddc�dd 

QdAˆc‡8d dr sRdd c 

ddddH‰c†RdddH‰c†RdddH‰cddc�dd 

cUdc c 

†9dAc8dS 

cddc c 

c†RdddH‰ 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddv 

c 

cddI 

c 

cddd 

c 

cddd 

c 

cdcd 

c 

cddd 

c 

cddd 

c 

c 

c‡PddTˆc‡PddTu�‡PddTu�dd�cddc 

c 

‡8ddddIcUddddddcUddddddcdd�cddc 

Ud�sRdˆd@wccddcd@wccddcdd�cddc c 

cddc 

dd�fddr�cQdddr�cQdcdddddddc c 

cddc 

dd�cddv�dddv�dcdddddddc c 

cddc 

ddvc‡PdddAˆc‡8dddAˆc‡8dcdd�cddc c 

cddc 

QdAc8d@c9dAc8d@c9dAc8dScdd�cddc c 

cddc 

†RdddH‰c†RdddH‰c†RdddH‰cdd�cddc c 

cddc 

c 

cddc c 

dddc�‡PdddTˆc 

cddc c 

dd‰c�UdddddIc 

cddc c 

‡Pddddc‡PddTˆcddddTˆdd�sRdc 

cddc c 

UdddddcUddddAˆdddddddd 

cddc c 

dd@‰ddcddcsRddddcddddd 

cddc c 

dd‰cddcddc�cdddcdddddvc‡Pdc 

cddc�dd dd�dddddddddc dddccddc�dddc c 

ctddddddcdddddcddddddcddAc8ddc 

cddc�dd dd�dddddddddc dddvcddc�dddc�c‡PTˆc c 

cUddddddcQdddScdddddScdddddddc 

cddc�ddc‡Pdddc‡PddTcPdddTuyPddTcPdddTˆcddcdddTˆdddddddddddddTuyPddTˆc�dddIcddc�‡PddTˆdddddddTc8ddAcPdddcdddTuyPddTˆ c 

cddddHwcc†RdH‰cddddH‰ccsRdHw 

cddc�ddcUddddcUddddddddddddddddddddddIcddcdddddddddddddddddddddddddIc�ddddcddc�UdddddddddddddddddddddddcddddddddddI c 

cddc 

cddc�ddcdddddcdd†9dddddcdddddddddddcddcddddd†d‰ddddddddddd@‰ddcdddddc�dddddddc�Qddddcddddddcddcddcdddddcddddccddddd c 

cddc 

c 

cddc�ddcdddddcddccdddddcdddddddddddcddcdddddc�dddddddddddrcddddddddc�ddcddddc�cdddddddddddcddcddcdddddcddddddddddd 

c 

cddc�ddcdddddcdd‡8dddddcdddddddddddcddcdddddddddddddddddddccddddcdddc�ddcQdddc�Udddddddddddcddcddcddcddddddddddcddd 

c 

cddc�ddcQdddScdddd@‰ddddd@c9dddddddcddcdd†9dddddddddddddddccddddddddc�ddcxdddc�ddddddddddddcddcdddddddd‡ddddddddddd 

c 

cddc�ddc†RdH‰�sRH‰cddddH‰c†RHwsRddcddcddc†RHwsRddddddddddccdHcRddddc�dd�dddc�csRHwsRdddddcddcddHcRdddH‚RdHwsRdddd 

cddd c 

tddc 

cddd c 

Uddddc 

c 

ddddSc 

c 

ddddrc 

c 

Qddd 

c 

xddS 

c 

cddr 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

dd�cddc 

c 

dd�cddc 

c 

dd�cddc 

c 

dddddddc 

dd�cddc c 

cddc 

dd�cddc c 

cddc 

dd�cddc c 

cddc 

dd�cddc c 

cddc 

c 

cddc 

‡Pdddd c 

cddc�dd�dddccddc�cddc 

Udd†9d c 

cddc�dd�dddvcddc�cddddddc 

dTˆccddc Qddc†d c 

cddc�dd�dddAˆddc 

ddAˆcddc yAˆccdddddvc c 

cddddddd�dddddddv 

‡PddTˆ c‡PddTˆc c‡PddddIcddv ‡PddIcUd†RddAˆ c 

cddc�dd�dd†9dddAˆc 

cy8ddddAuc y8ddddAu y8ddddddcddAˆc cy8dddScdd�cddAˆc c 

cddc�dd�ddcxddddAu 

c‡PddddH‰cQdddddddIc c 

cddc�dd�dd�Qdd†9dTu��cyPd@w�s9dTuc��yPd@wccs9dTu��yPddH‰ddddddddAu 

y8dddHwc�†RddHws9dv c 

cddc�dd�dd�†Rdc†RddTu�cyPddH‰c�c†RddTuc�yPddH‰�†RddTu�yPddHw�dd†9ddddddTˆ 

‡PdddHwc��cxdAˆc c 

cAˆc��sRddTu�cyPddHwc�csRddTuc�yPddHw�sRddTu�yPddHw�ddcxdddcs9dAuc 

QdIc��cyAˆ c 

cdIc��sRddTcPddHwc��csRddTcPddHw��sRddddddHw�dd�dddcc†RddTuc��cy8dHw 

sRdddHwc csRdddHw s9dddc cs9ddddddddddddddd@w †9dv�c‡PddI c 

cddc 

csdw cxdddc xdddddddddddddddrc cxdAˆc�‡8dddS c 

cd 

dddc cddc��cd QdIc�cy8dddH‰ c 

cd 

dddc cddc��cd †9dv�c‡PdddHw c 

cd 

dddc cddc��td cxdI�y8ddHw c 

cd 

dw cddc��Ud Qd‡PddHw cddc dddc�cdddddcddc cdTˆcddc c 

cd cddc��dd xddd@w cdd‡PdTˆ�yPTu�cyPTˆc‡PdTˆccyPTˆcddd„PdTˆcddcddcddccyPTˆc‡PdTˆc�tddIcddc c 

c‡PTˆc 

cd c‡PdTu cddc��dd tddd tddddddIcdddddddddddAc8dddAcPdddIcdd†ddddIcddcddcdddddddAc8dddIc�Udddcddc c 

‡8ddAc 

cd ‡8dddddc cddc��dd c‡8@c9Au Udddddddcdd†9dddd@‰dddddcdddddcddcddddd†Rdˆdddddddddddˆddddddddc�dddddddc c 

cy8d@w 

cd Ud@ws9dv cddc ‡8@‰c†9dTˆ dddddddddddccddddrcdddddddddddˆddcdddddWc†ddddddddddd†ddddddddSc�ddddddSc c 

c‡Pdd@‰c 

cd d@‰ccxdI cddc�cdTˆ�dd c‡8drc�†9dAˆc ddddddddddd‡8ddddccdddddddddd†dddddddd†ddddddddcddcddcddddddddrc�ddcdddrc c 

y8ddH‰ 

cd dc�dd cddc�cddAˆcdd ‡8dS�c†9dAu ddddddd@‰dddddˆddddddddddddddcdddddddddd@‰ddcddcdddddcddcddddd�ctddcddd c 

‡Pdd@w 

cd dAˆcctdS tddc�cdddIcdd c‡8d@‰�†9ddTˆ dHcRddH‰cdddH‚dddddHwsRddHcRdcdHcRHwsRdH‰cddcddcdddddcddcddddd�cdddcddd c 

c‡8ddH‰c 

y8d@wc cd QdAuy8dr c‡8dddddddddddcddddcdd ‡8d@‰c�c†9ddAˆc dd@w c 

dddddddTˆc 

‡Pdd@‰ †9dddddc ‡8ddddddHw�cddddddddTˆc�c‡8d@‰��xdddIc dH‰c c 

ddddddddAˆ 

c‡8ddH‰c c†RdHw Bddd@w�cdd†9dddddAu�‡8d@‰c��cQddSc c 

cyPdTˆc‡PdTcPddddd�cddI 

y8d@wc ddddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcddc�dd †dd@‰c�cddcxddd†RddTu�c‡8d@‰��c†RH‰c c 

dddddAc8dddddddddd�cQdd 

‡PddH‰ ctdddddIcUdddddIcUdddddAˆddc�dd ‡Pdddddr��cddccddd�sRddTˆ�‡8d@‰c c 

dd@cRddddcddcddcdd�dd 

cy8d@w cUdccsRdcd@wcs9dcddc�cddddc�dd Uddddddv s9dAuy8d@‰ c 

ddrc�ddddddcddcdd�cUdd 

c‡Pdd@‰c cddc�cdrc�xddddc�cddddddddd dd�dI c†Rdddd@‰c c 

dd‡Pdddddcdddddcdd�cddS 

‡8ddH‰ cddc�cdvc�tddddc�cddddddddd dd�dd cs9d@‰ c 

Qddd@c9dddddddScdddddd@‰ 

cy8d@w cQdccyPdcdAucy8dcddc�cddddc�dd dd�dd xdrc c 

†RdH‰c†RddHcRH‰cdddddH‰c 

cxdddddScQdddddScQddddd@‰ddc�dd dd�dS cd c 

c‡Pdd@‰c 

ddddH‰c†RdddH‰c†RdddH‰cddc�dd Qddddd@‰ cd c 

‡8ddH‰ 

†RdddH‰c cd c 

cy8d@w 

cdvc c 

c‡PddH‰c 

tdIc c 

y8d@wc 

Uddc c 

‡Pdd@‰ 

dddc c 

c‡8ddH‰c 

dddc c 

y8d@wc 

dcdc c 

‡Pdd@‰ 

dddc c 

cy8ddH‰c 

dddc c 

c‡Pdd@wc 

dd�ddcddcdd dTˆccddc dddc c 

‡8ddH‰�dd 

dd�ddcddcdd ddIccddc c 

cy8d@w�dd 

c‡PddTˆc‡PdddTˆcc‡PdddTcPd�cddc c 

c‡Pdd@‰c�ddcdddTˆc‡PdTˆcddddTuyPdTˆcddddTˆcdd‡PddTˆddcddcddcddddTuyPddd�dddvcddc 

‡8ddddIcUdddddAuy8dddddddd�cddc c 

‡8ddH‰�ddcddddA„8dddAˆddddddddddAˆdddddIcddddddddddcddcddcddddddddddd�dddIcddc 

Ud@wsRdcdd�dddd�dddd�cddc c 

cy8d@w�ddcdddd†dddcddddd@‰dddddddddd@‰ddcddddddH‰ddcddcddcddcdddcdddd�ddddcddc 

ddrc�dd�dddd�dddddddddc c 

c‡PddH‰c�ddcddddddddcdddddccddddddddddrcddcdddd�ddcddcddcddcdddddddd�dddddddc 

Qdvc�dd�dddd�dddddddddc c 

y8d@wc��dddddddddddcdddddAˆddddcdddddccddcddddddddddcddcddcddcdddddcddvc�ddcddddc 

xdAucyPddd�dddd�dddd�cddc c 

‡Pdd@‰��dd†9ddd@c9ddd@‰dddddddddd@‰ddccddcdd†9dd@‰ddcddcddcddcddddddddIc�ddcQdddc 

cQddddd†9ddddd@ws9dddddddd�cddc c 

c‡8ddH‰c��ddc†RdH‰c†RdH‰cddddHwcsRH‰cddccddcddc†RH‰cddcddcddcddcddHcRHcRdc�ddc†Rddc 

cddc c†Rddddc†RdddH‰cc†RdddHcRd�cddc c 

y8d@wc 

cddc c 

‡Pdd@‰ 

c 

c‡8c8ddH‰c 

cddc c 

‡8ddd@wc 

cddc c 

c‡8ddddc 

dddddcddddddcddddddddddTcPddTˆcdddddddTcPdddTcPddddc c 

‡8dddddd 

dddddcddddddcddddddddddddddddIcdddddddddddddddddcddc c 

UddddHwc 

ddddddddˆcddcddddcdddcddddddddcddc‡ddddddddddcdddddc dd c 

ctddHw 

ddddddddAˆddcddddcdddcddddddddcddcUdddddcddddddddddc ddvc c 

cdHw 

QdIc dddddd��cddcdd ‡8cddddd�c‡Pddddc�ddTˆ��c 

QddddddddddScddddcdddcdddddddScddcdddddddddddddddddv 

†9dv yPdddddd�ddddddac��cddcdd cy8dcddddd�‡8dddddv�ctdddI��c 

†RddH‰ddddH‰cddddcdddcdHcRddH‰cddcddddddddddHcRddddd 

cxdAˆc yPdddddddddddd�dd�c†dddddcddddddcddcdddddddcdddddcdddddddddddddd�UddcsRdA„PddTˆcUdddd��c 

dd 

QdIc cyPddddddddddHwc dddddddddddcddddddcddcddddcddcdddddcddcddddddddddd�dddc�cfdddddIcddcddvc�c 

dd 

xddv yPddddddddHw dddddddddddddddcddcddcdddddddcdd�dddddcddcdddddcddddddc�dd�ddcdddddIc�c 

‡Eˆc 

cQdAˆc yPdddddddHwc dd�dddddddddcddcddcdddddddcdd‡PdcdddddcddcdddddcddddddcyPdddd�dddddddddc�c 

BdIc 

c†9dIc cyPdddddHw dd�Qddddddddcddcddcddddddd‡dddddcdddddcdddddddd�s9ddddd†9ddddddd�cddv�c 

xddv 

xddv cyPdddddHw dd�†RddHcRddcddcddcdddddddH‚Rdddcdddddcdddddddd�c†Rddddc†RddHcRd�cddd�c 

cQdI 

cQdI yPddddHw c 

cxddvc 

cxddvc��yPdddHwc c 

QdAˆ 

QdAˆ��yPdddHwc c 

†9dI 

†9dI�‡PddHw c 

cxddvc 

cxddvc�cy8dHw c 

QdIc 

xddv QdIc�c‡Pd@w c 

cddc�dd 

cQdI xddv�‡8d@‰c c 

cddc�dd 

cxddvc cQdAˆcUd@‰ c 

cddc�dd 

QdAˆ c†9dAˆd@‰c c 

cddddddd 

†9dI xddddr c 

cddddddd 

cxddvc cQdddc c 

cddc�dd 

cddc�dd QdIc cxdddc c 

cddddTˆc 

cddc�dd xddv Qddv c 

cdddddIc 

cddc�dd c‡PdddTˆ cQdI †9dAˆc c 

cddccddc 

cUdd†9dI cxddvc cxddAˆ c 

dd�cddc�cdTˆ�dd��cddccddc 

cQddc†dS yPdddddddddddddddTuc��QdAˆ QddAuc c 

dd�cddc�cddAˆcdd��cddccddc 

dddddc cyPdddddddddddddddddddddddddddddddddddddTu�†9dI †9dddTuc c 

dd�cddc�cdddIcdd��cddccddc 

cdTˆ�dd c‡PdcUd†RddI cddccddd�‡Pdddddc�cddddddddddddddHwc csRddddddddddTu†ddvc cxdddddTuc c 

dddddddc�cddddcdd��cddddddc 

cyPdTu ydcddI�dd ‡8ddcddc�dd cddccddd�Uddddddv�cdddHw csRdddddddIc QdddddddTu c 

dddddddc�cddcddddcdTu�cdddHw�cyPTuc 

cyPddddTuc��c‡PdddddTu yPdScdddvcddvc cy8ddddddddddddTˆc cddccddd�dd�cddI csRddddv xdd‡dddddddTuc c‡PdddTˆ�‡Pdd c 

dd�cddc�cddcQdddcdddTu 

c‡PddddHwcsRddHwcdAˆ cddddddd�dd�cddd cs9ddI cQdd‚RddcddddddTuc cUdddddIc‡PdTˆ�Uddd c 

dd�cddc�cddc†9dd�sRddTˆ��cyPddHwsRddTˆc��y8ddHws9ddTˆ��yPddH‰cdddAˆddAu 

y8dddHwc�cQdI cddddddd�ddvctddS †9ddvc c†9dvcs9dd�sRdddddddTuc cddcsRdd„8dddIctddddvc c 

dd�cddc�cddcc†Rd�s9dAuc�cyPddHwc�csRdAu�yPddHw�c†RddAuc�yPddHw�cdddddddddTˆ 

‡PdddHwc��cxddvc cddccddd�ddAc8ddr cxddAˆ xdAˆc†RddTˆc�sRddddddddddddTu ddTu�cddc�cYdd@‰ddcUddddIc c 

c†RddTuc�cyPddHwc�cs9dTu�yPddHw�csRddTuc�‡PddHw�cdd†9ddd†9dAˆc 

csRddTuyPddHwc��†RddTuyPddHw��csRddTuy8d@w�cddcxdddc†9dAu��cy8ddHwc QdIc��cydc cddccddd�QdddddSc ctdddI cQdI�cs9dAu�sRdddddddddddddddddddTuc��†ddddTuc�cddvc‡8ˆdd�ddcddddddv c 

cddc 

csRddddHwc sRddddHw cs9dddd@‰c�cddccddd�†RdddddddddddddddddHwc †9dv�c‡Pddv cddccdddac�†RdddH‰c ‡8dcddvc cxddvc�†RddTu csRddddddddddddddddddddddddddddddddc�cddAc8ddddAˆddcddddddI c 

dc 

dd sRHw xddddr cddddddddddddddd cxdI�‡8dddD cfdd cy8ddcQdIc QdIc�sRddTu ‡dddddHw�cQdddddddddddddddcs9dd c 

cddc 

cddddc cddc��dd Qdvc�cy8dddH‰ dd c‡Pd@w�xddv †9dv�s9ddTˆ dddHwc�c†RddHwcsRddHcRddcc†Rd c 

dd 

cddddc cddc��dd xdAˆ�c‡PdddHw dd y8d@‰c�cQdI cxdAˆc�c†RddAuc c 

dd 

cddddc cddc��dd cQdI�‡8ddHw yPddH‰�cxddvc QdIc�csRdddTu c 

dd 

cddddc cddc��dd c†9dcy8dHw yPddHw�QdAu xddv�csRdddTu c 

dd 

cddc��dd xddd@w yPddHw��xdddTˆ cQdI��csRdddTu c 

dd 

c‡PdddTˆ cddc��dd tddd cyPdddHw��cddddI c†9dvc��csRddddTuc c 

dd 

‡8dddddI cddc�ctdS c‡8@‰dAˆ cyPdddHw cddddd xdAˆ sRdddTuc c 

dd 

Ud�dd cddc�cUdr�dc ‡8@‰cQdAˆc cyPdddHw cQdddd cQdI sRddddTu c 

dd 

dd�dd cddc�cddv�dc c‡8@‰cc†9dAu yPdddHwc c†9dddvc cxddvc csRddddTuc c 

dd 

dd�dd cddc�cddAˆcdc ‡8@‰�†9ddTˆ cyPdddHw †9ddIc QdAˆ sRddddTu c 

dd 

Qd�dd cddc�cdddIcdc c‡8@‰c�c†9ddAˆc cyFc�yPddddHw c†9ddc †9dI csRdddddTu c 

dd 

†9dddddS cddddddddddccdcddcdc ‡8@‰�†9ddAu dd cddTˆc�ddTˆ�cyPd‰yPddddHwc †9dc cxddvc sRddddddTu dd cddd�dddc c 

dd 

c†RdddH‰ ‡PdddddddddddccdcQddddTu��c‡8@‰c�c†9ddddc dd cdddIcctdddI�c‡PdddddddHw c†9c QdIc sRddddddTu�cdTu��dd cdddvcctdddc c 

dd 

dd�‡Pdddd�tddddvcUdddd�y8dddddd xddv sRdddddddTˆdddTu��dd tdddIccUdddv c 

Uddd@w�cdc†9dddddTˆ�‡8@‰��†9ddSc 

dd�cy8dcdddaccy8dcddIcddcddvc�cddddddddd cQdAˆc sRddddddddddTu�dd�yPdddTuccy8ddddccddddI c 

Qdd@‰c�cd�xdd†RddAuc�c‡8@‰c��c†RH‰c 

ƒdH‰��cd�cddccsRddTuc�‡8dr dd�yPddddcddƒddddddddddcdddddIc dddd�‡Pdd�cddddddcdddd�c†9dIc cs9ddddddddc�dd�cdddddcdd†ddddddcddccddcddvc c 

ddddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcddc�dd 

c‡Pdd‰ cs9ddTuy8dSc ddddd`cs9dcddd`ccddddddddddddddc ctdddd�Uddd�tddddddcdddd�xddv †Rdddddddc�dd�gdddddcdd‡ddddddddddddddddIc c 

ctdddddIcUdddddAc8dddddAˆddc�dd 

‡8ddddTˆ †Rddddd@‰c dddddc�†Rdddd�cdHwcsRddHwcsRdc cUdddd�ctdddd�Uddccddddddd�cQdI ddddd`cs9dcddd`ccddc�dddd�cddc c 

cUdccsRdcddc�cddddc�cddddc�dd 

Ud@ws9dI sRdd@‰ cddddd�y8dddd�dddddddddddd�cxddvc dddddc�†Rdddd�cddc�dddd�cddc c 

cddc�cddc�cddddc�cddddddddd 

ddrccxdd cdrc cddcdd‡Pddddddddvcdddddddddddd�QdAˆ c 


dd�dd td cddcddddddddddddIcdd�c‡ddddddvc�†9dI c 

cQdccyPdcddc�cddddc�cddddc�dd 

ddvcctdd Ud cdddd@wccdddcs9ddcdd�cUd@wcddIc�cxddvc c 

cxdddddScQddddd@c9ddddd@‰ddc�dd 

QdAuy8dS dd cdddH‰�cddd�†Rdddd�cdH‰�dddc�QdIc c 

ddddH‰c†RdddH‰c†RdddH‰cddc�dd 

dd xddv c 

†9ddddH‰ 

dd cdddddTˆcddddddd cQdAˆc c 

c†RdHw 

cddddddAˆddddddd c†9dIc c 

ddvc 

ddddTuyPddTˆcddddTˆddc�dddddc xddv c 

ddIc 

dddddddddddIcddddddddc�Qddddddddd cQdI c 

dddc 

ctddcddddddcddcddddddddc�cddddddddd cddc cxddvc c 

dddc 

cUddcddddddddddddcdddddc�Uddddc cQdv QdAˆ c 

dcdc 

cdddcddddd�ddddScddcddc�dddddc cxdAˆc †9dI c 

dddc 

cddddd@c9dddddddrcddcdddddd@‰ddddddd QdIc cxddvc c 

dddc 

xddv QdIc c 

cddddH‰c†RddHcRd�ddcdddddH‰cddddddd 

cQdAˆc †9dv c 

tddc 

c†9dIc cxdAˆc c 

dddc 

QdIc c 

xddv 

cQdI xddv c 

c‡Pddddcc‡PdddTˆc‡PdddTˆcd�dc 

c†9dvc cQdI c 

cUdddddcy8dddddIcUdddddIcd�dc 

xdAˆ c†9dvc c 

cd@wcsRddd�ddcd@wcs9dcd�dc 

dddcdddc cdrc�dd�ddddrc�xdcddddddc cQdI xdAˆ c 

c‡Pd�dddddcdd 

dddcddSc cdvc�dd�ddddvc�tdcddddddc cxddvc cQdI��dddc dd�cddcdddddc dddccddc c 

cUdS�ddcddcdd 

cdAucyPddd�ddcdAucy8dcd�dc QdAˆ cxddvc��dddc dd�cddcdddddc dddvcddc c 

‡Pddddcdddddcdddddcddr‡Pdddcddcddcdd‡PdddTcPdddd�ctdddcddrc 

cQddddd@c9dddddScQdddddScd�dc †9dI QdIc��ddd‡PddTuyPddTcPdddTˆc‡PdTˆcdddddcddc‡PdTˆcddcdddddddddTuyPddTˆc�dddIcddc c 

Udddddcdddddcdddddcdd‡8ddddˆdddddddddddddddddddd�cUdddddd 

c†RdddH‰c†RdddH‰c†RdddH‰cd�dc cxddvc †9dv��ddddddddddddddddddddAc8dddIcdddddcddcUddd@cddcddddddddddddddddIc�ddddcddc c 

dd@‰dddddddddddcddcddddd�fddddddddddd@‰ddcddddd�cddddddd 

QdAˆ cxdAˆc�ddddddddcddccdddddcddddddddcddcddcddcdd†@‰cddcddddddddcddcdddddc�dddddddc c 

dd‰cdddddddddddcddcddddd�cdddddcddcddrtdddddddS�cddcdddd 

†9dI QdIc�ddddddddcddccdddddcddddddddcddcddcddcddc�cddcddddddddcddddddddc�ddcddddc c 

dddddddddddddddˆddddddddddddddddcddcddcUdddddddr�cddcQddS 

cyPdddddddddddddddddTu�cxddvc xddv�dddddcddddddddddddcdddddcddcddcddcddcdd‡Pdcddcddddddddcddddcdddc�ddcQdddc c 

ctddddHwsRdddddH‚RddddHcRddHcRHcRdcddcddcddddddddc�cddc†RH‰ 

cyPddddddddddddddddddddddddddTucddIc cQdI�ddddddd@cRdddddddddd@c9dddScddcddcddcQdddScddcddddddddcddddddddc�ddcxdddc c 

cUdd 

yPddddddddHw csRddddddv c†9dvc�ddHcRdH‰�sRHwcddddH‰c†RdH‰cddcddcddc†RdH‰cddcddddddddcdHcRddddc�dd�dddc c 

cddd 

ddcddcdd�c‡PddTˆc�ddTˆ��yPddddddHw s9dddAˆc xdAˆ cddd c 

dddddd��cddddd 

ddcddcdd�‡8ddddIc�ctdddI�yPdddddHwc c†9dddIc cQdI cddd c 

ddddddac��cddddd 

†9dddv cxddvc c 

dd�c†dddddcddddddcddddddddddcddddTcPddddddddddcdd�Ud@wsRdcddddTˆcUdddd�c‡PddddHwc 

cxdddAˆc QdAˆ cdddddTcdc cddd c 

dddddddddddcddddddcdddddddcddcdddddddddddddddddcdd�ddrc�dddddIcddcddvc�c8dHwc 

QdddIc †9dI cddddddddv cddd c 

dddddddddddddd�ddcddddddddddcdd�cddddddcddcddcddcdddddvc�ddc‡ddcdddddIc 

cdcddv cxddvc�dddddcdddTˆddddddddIcdddddddddcdddddcddddddddddddddcdddddddddcddddTcPddTˆc c 

dd�dddddddd�ddcddddddddddcdd‡PdddddddcddcddcddcdddddAuyPdcdd‡8dddddddddc 

UdcQdI QdIc�dddddcdddddddddddddScdddddddddcdddddcddddddddddddddcdddddddddcddddddddddIc c 

dd�Qddddddd�ddcdddddddddd‡dddddcdddddcdddddcdd�cdddddScQddddddd�cddv 

dd�†RddHcRd�ddcddddddddddH‚Rdddcdddddcdddddcdd�cddddH‰c†RddHcRd�cddd ctdSc†9dvc xddv�ctdddddddd�cddddddddrcddc‡dddddcddcddcddddˆcddcdddddcdd�‡ddddcdddd�dddddc c 

cddc 

‡8dr�xdAˆ cQdAˆccUdddddddd�cddddddddvcddcUdddddcddcddcddddIcddcdddddcdd�Uddddcdddddddddddc c 

cddc 

c‡8dSc�cQdI c†9dIccQdddddddddddddddddddIcddcQdddddcddcdddddcddcddcdddddcdd�ddddddddcddddddddc c 

cddc 

‡8d@‰c�cxddvc xddvc†RdddHcRdddddddddddddcddc†RddddcddcdHcRddddcddcdddddcdd�dddddddddddddddddc c 

cddc 

c‡8d@‰�QdAˆ cQdI c 

cddc 

y8d@‰c�†9dI cxddvc c 

cddc 

‡PddH‰�cxddvc QdAˆ c 

cddc 

cy8d@w��QdIc †9dI c 

cddc 

cyPddH‰c��†9dv cxddvc c 

cddc 

cyPddHwc cxdAˆc QdIc c 

cddc�cyPTˆc 

yPdddHwc QdIc xddv c 

cddc�cyPdddAc 

yPddHw xddv cQdAˆc c 

cddc�dddddc 

yPddddHw cQdAˆc c†9dIc c 

cddc�dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cyPddddHwc c†9dIc xddv c 

cddc�dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cddc yPddddddHw xddv cQdI c 

cddc�cs9dddˆc 

cddc cyPTuc�cddd cyPdddddddHw cQdAˆc c†9d c 

cddc�†RddDc 

cddc c‡Pddddd�tddd�cyPTuc�cyPdddddddddHw c†9dIc xddddc c 

cddc�s@‰c 

cddc cUddddddc‡PddTˆcUdddvc�yPdddddddddddddddddddHwc xddv tddddc c 

cddc 

cddc cdd@wsRdcUddddIcddddIc�dddddddddddddddHwc cQdI 9ddddv c 

cddc 

cddc cddc�cdd†9ddcddcddv�dddddddd c†9dvc †9dddI c 

cddc 

cddc cddAuyPdcddccddddddddI�csRddd xdAˆ c†9ddd c 

cddc 

cddc cQddddddcdd‡8ddddddddd cQdI †9dd c 

cddc 

cddc c†Rdddddcdddddˆddc�dd cxddvc c†9dvc c 

cddc 

cddc csRHwc�sRH‚Rddc�dd QdAˆ †Rdc c 

cddc 

cddc †9dI c 

cddc 

cddc cxddvc c 

ddcdddTˆ 

cddc QdAcdc c 

ddcddddD 

cddc †9dddc c 

Qddddd@‰ 

cddc c†dddv c 

xdddddrc 

cddc 9ddddI c 

cQdddS 

cddc †9dddd c 

c†9ddr 

cddc c†Rddd c 

†Rdc 

cs9dvc c 

cddc 

†9Ic c 

cddc 

c†9c c 

cddc c 

dd�cddc 

cddc c 

dd�cddc 

cddc c 

dd�cddc 

cddc c 

dddddddc 

cyPdTu c 

dd�cddc 

cyPdddddTu c 

dd�cddc 

cyPddddd†RddTu c 

dd�cddc 

dd�cddc ‡PdTuc cyPddddddd�sRddTu c 

dddddd 

Uddddd c‡Pdddddd@wc�sRddTˆ c 

dd�cddc�cddc�dd��dd�ddvc 

ddˆsRd y8ddddddH‰�s9dAuc c 

dd�cddc�cddv�dd��dd�QdIc 

ddAu cdddddddHw��cxdddd cd�dc c 

dd�cddc�cddAˆcdd��dd�cddc 

dTˆccddc ctdddddd cdddddHw dddd cd�dc c 

dddddddc�cdddIcdd��ddcy8dSc 

ddIccddc c‡PTc8dˆ�ddvc cdddHw dddd cd�dc c 

dddddddc�cddddcdd��ddddddrc 

cyPdTu cyPddddvcddv y8dddddAucddAˆ cddc dddd cddddddc c 

dd�cddc�cddcddddcdTu�dddddd�yPdTuc 

yPdddddTuc��cyPdddddTu��c‡PddddddAˆddAuc ‡PddddHc9ddddddAˆc cdddddddddcddddddc cddc dddd cddddddc c 

dd�cddc�cddcQdddcdddTu 

cy8dddHw�†RdHwsRdAˆ tdddddddddcddddddc cddc dddd cd�dc c 

dd�cddc�cddc†9dd�sRddTu��yPddHwcsRddTuc�cyPddHwcsRddTu��y8d@wcdddddddddTˆc 

c‡PdddHw��cs9Auc ddddTuyPddTc8ddddd�cddc cddc dddd cd�dc c 

dd�cdda�cddcc†Rd�sRddTu�yPddHw�csRddTuc�cyPddHwc�sRddTu�yPddH‰�dd†9ddd†9dAˆ 

sRddTu�yPdd@w�csRddTuccyPdd@wc�sRddTu�yPddHw�ddcxdddc†RdAuc y8ddHw †9dTˆc ctddddddddddddddddddddddcddddddc cddc dddd cd�dc c 

s9dc 

sRdddddddH‰c��csRdddddddH‰��sRddddddHw�dd�Qddc�s9dTuc��yPddHw c†9dIc cUddcd@‰dddddddddcddddddcddddddc cddc dddd cyPdTˆ c 

dc 

s9dddHwc csRdddHw cddddc�dd�†Rdc�c†9ddddddddddddddd@w xddc cdddcd�ddddddddScdd�cddc cddc dddd dddddI c 

cddc 

csdw cddddc xddc��ddrc cddc cQdddd@cddddddddrcdddddddddc cddc dddd ddc‡dd c 

cxdd 

cddddc cddc��dd cddc c†RddH‰cddddHcRd�dddddddddc cddc dddd Qddd‰c c 

dd 

cddddc cddc��dd cddc cdddTu dddd cdTˆ�dc ‡PdccddddTˆc c 

dd 

cddddv cddc��dd cddc cdddddTu ddddddddddddddddTu cddI�dc c‡8dd‡8d�ddIc c 

dd 

cddAˆc cddc��dd cddc cdddddddTˆ��ddddddddddddddddddTu cyAˆcdddvcdc y8dddddd�dddc c 

dd 

cdddddAˆ cddc��dd cddc sRdddddAuc�c‡PddHwc��sRddTu��cyPddAcdddAˆdddTˆc ‡PddddHcRddddddv c 

dd 

td@ws9dI cddc��dd cddc s9dddddTuc�y8d@wc sRddTu�cyPddHwccd†9ddd†9dAu cy8dddHw�csRdH‰dAˆc c 

dd 

Udrcc†9d cddc��dd cddc c†Rddddddd�yPddH‰ sRddTu�cyPddHwc�cdcxdddc†RddTˆ c‡PdddHw��QdAˆ c 

dd 

dd�cd cddc��dd cddc csRddddd„PddHw sRddTcPddHwc�cd�Qddc�s9dAuc��y8dHwc��†9dAˆc��c‡Pd c 

dd 

Qdvcc‡8d cddc�ctdS cddc cs9dd†dd@w s9dddd�cd�†Rdc�c†Rdddddddddddddddd@wc c†9dAˆ��‡8ddvc c 

dd 

xdAuy8dS cddc�cUdc�dc ‡8ˆddc †RdddH‰c cxdddd dddddddddddddddr †9dI�cy8dddDc c 

dd 

cddddd@‰ tddc�cddI�dc cy8ddddv cddddddc dd sdwc dddd dd��cddc c†9dvc�c‡PddddH‰c c 

dd 

sRdH‰c c‡8ddddddddddccddd�dc��cyPddddddAˆc cddddddc dd dddd dd��cddc †9Aˆ�‡8dddHwc c 

dd 

cddc�dTcPdcddddTcPddddcddddTcPddddd‡PddTcPdddTcPddddc dddd dd��cddc cxdAˆccy8ddHwc c 

‡8ddˆc�cdddddddTu�c‡PdddcdddddAu 

8dˆdDc�cd†9ddddddTˆ�y8ddcdd@wccs9dTˆ cddddddcQdddScddddddddcddcddddddddddddddddddddddddddcddc dddS dd��cddc QdAcPddHwc c 

cddddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcdd�cddc 

c†d@‰c�cdcxdddcs9dAuc�‡PddddddH‰�†RdAuc cddddddcxdddrcddcddddddddcddcddddd�ddcddddddddddcdddddc ctddd‰ dd��cddc xdddd@wc c 

tdddddIcUdddddIcUdddddIcdd�cddc 

‡Pdddddr��cd�Qddcc†RddTuy8ddddd@w�s9dTuc cddc�tdddvcddcddddddddcddcddddd�ddddddddcddddddddddc ‡8ddddTˆ dd��cddc tddddc c 

Ud�sRdcd@wcs9dcd@wcs9dcdd�cddc 

c‡8ddddddc��cd�†Rdc�csRddddcdddH‰c�c†RddTˆc cdddddTc8dddIcdddddcdddddcddcddddddddddddddddddddddddddv Ud@ws9dI dd��cddc c‡8d@c9Aˆc c 

dd�dr�cxdddr�cxdddddddddc 

cUdc�cddc cs9ddddHwc��cs9dDc cddddddddHcRdcdddddcddddddddcddHcRddddddddddddddHcRddddd ddrccxdd dd��tdSc cUd@‰cxdAu c 

dd�dv�ctdddv�ctdddddddddc 

cddc�cddc †9d@wc †C‰c dd dd�dd dd��Ud�cddc td@‰�cQddTˆ c 

Qd�yPdcdAucy8dcdAucy8dcdd�cddc 

cddc�cddc cxdr dd ddvcctdd dd��ddIccddc c‡8@‰c�c†9ddAˆc c 

xdddddScQdddddScQdddddScdd�cddc 

cQdc�cddc dc QdAuy8dS ctdd��dddvcddc ‡8@‰�†9ddAˆ c 

cddddH‰c†RdddH‰c†RdddH‰cdd�cddc 

dc †9ddddH‰ ‡8dddddddddddddddAˆddv��c‡8@‰c�c†9ddAuc c 

c†9dddddSc 

dc cddccddddddc�yPdc ddcddc c†RdHw c‡8ddddddddddddddddddddAuc��‡8@‰��†9ddd@ c 

†RdddH‰c 

cddccddd�yPdddccyPTcPdTˆc�cddc‡PdTucyPdTuyPdTˆ cBddd@wc�dd†9dddddTuc�c‡8@‰c��c†9d@‰ c 

dc 

cddccddddddddddddcddddddddAcPddddcddcdd‡8ddddddddddddddI cxdd@‰��ddcxddd†9ddTˆc�‡8@‰ †C‰c c 

dc 

cdddddddddddd@‰ddcdd�dd†9ddddddScddcddddddddddddddddcdd d@‰c��dd�Qddc†RddAu�c‡8drc c 

dc 

cddddddddddddccddcdd�dd�ddcddd�ddcddddddddcdddddddddd ‡Pdddddr��dd�†Rdc�sRddTuy8dS c 

dc 

cddccddddddddAˆddcdd�dd‡8ddcdddIcddcddddddddcddddddddddvc Ud@cRddv s9dddd@‰ c 

dc 

cddccddddddddddddcdd�QddddddddddcddcdddddddddddddddddddIc ddrc�dI c†Rdd@‰c c 

dc 

dd�dd c‡dr c 

cddccdddddHcRddddcdd�†RddHcRHcRddddcdHcRdddHcRddHcRdddddc 

cUdc c 

dd�ctdd 

cddc c 

Qd�y8dS 

†9dddd@‰ cddc c 

c‡PddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcdd�cddc 

c†RddH‰c cddc c 

‡8ddddIcUdddddAc8dddddAˆdd�cddc 

cddc c 

Ud@wsRdcdd�dddd�dddd�cddc 

cddv c 

ddrc�dd�dddd�dddddddddc 

cddI c 

Qdvc�dd�dddd�dddddddddc 

cddd c 

xdAucyPddd�dddd�dddd�cddc 

cdcd c 

cQddddd†9ddddd@c9ddddd@‰dd�cddc 

cdcd c 

c†Rddddc†RdddH‰c†RdddH‰cdd�cddc 

‡8��c‡Pd��dddd�cddd cddc c‡PddTˆc cddd c 

dddc 

c‡8dvc��y8dS��ctdddd�cdddac cddc cUddddAˆ cddd c 

ddda 

cddd�dTcPdcdd dddddTˆc c 

‡Pdddd†dddTcPddddcdddddcdddTuyPddTc8ddAcPddTcPTuyPdddr‡PddTcPddTc8ddddddddcdd†ddddTcPddddcddddTuyPddTuyPddddd‡PdddTcPddddc�tdd@cRdA 

yPTˆc‡PdTˆ�yPTˆcddr‡PdTˆcdddddcdd�yPTucyPTuc�ctddddddIc c 

c‡8dddddddddddddddScdddddcddddddddddddddddddddddddddddd‡8dddddddddddddddddddcddddddddddddddˆdddddddddddddddddddddddddddddddc�Ud@‰ 

dddddAc8dddAcPdddIcdd‡8dddAˆdddddddddddddddddddd�cUddˆcdddc c 

cUddcddddddddddddd‰cddddddd@wccddddddddddddc‡ddcddd@‰ddddd�cdddddddddˆdddddddddd@‰ddddddd†dddcddddd�dddd@‰ddddd@‰ddcdddddc�dd 

cddc dd@‰dddddcdddddcddcddddd†RdddddddddddddˆddddcddS�cdd†dddddc c 

cdddcdddddddddddddddddddddd‰�cddddddddddddcUddcdddrtddddd�cdddddddd†ddddddddddd‰cdddddddddddcdddddctddddrcddcddrtdddddddSc�ddAuyPdc 

cddc ddrtdddddddddddˆddddddddWccdddddcddcdd†ddddddddr�cdd‡ddddSc c 

cQddddddddddddddddddddddddddddddddddddd‡dddcddddddd‡8ddddddddddddddddcdddddddddddddddddcdddddddddcdd‡8dddd�ddcddcUdddddddrc�QdddddSc 

cddc ctdd‡8dddddddddd†dddddddd†dddddcddcddcddcdddddcddc�cddd‰cddrc c 

c†RdddHcRdddddddddddddddHcRddHwsRddHcRdH‚RddddddddddddHcRddHwsRddHcRdcdddddddHwsRddddddddH‰ddddddcddddHcRd�ddcddcdddddddd�†RdddH‰c 

cddc cUddddddddddddddcddddd†9ddd@‰dddddddddddcddcdddddc�cQdddddS c 

tddc 

cddc cdddddHwsRddHcRdcdHcRdc†RdH‰cdddddddddddcddcdddddc�c†RdddH‰ c 

dddc 

cddc c 

cddc 

cddc c 

cddc c 

dddddddddc�dddd�‡Pdddddc‡PdddT„Pdd 

cddc c 

ctddcddddddvctdddd�UddddddcUdddddd‰dd 

cddc c 

cUdScddccddIcUddddctdd�cddcdd@wsRdcdd 

cddc c 

tddrtddccdddcddcddcUdd�cddcddrc�dd 

cddc c 

UddcUddctdddddddddcddd�tddcdd�dd 

cddc c 

dddcddd‡8ddcdddddd‡dddcy8dScddcyPddddd 

cddc c 

dddcddddddddd@wcddd‚9dddd@‰cQdddddˆddS 

cddc c 

QddcddddHwsRH‰�dddc†RddH‰�†RddH‚dddr 

ctddSc cddc c 

xddc 

cddH‰c cddc c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc 

c 

cddc 

c‡PddddTˆc dddc�cddddddcdddddd c 

cddc 

cUddddddIc dddc�tddcdddcddcddd c 

cddc 

cdddc‡ddd‡PddddcdddddTˆcddd„PddddcUddcddddddcddddddcdddcdddddddddd c 

cddc cddd‡8dddddddddcddddddIcdd†ddddddcdddcddcdddcddcdddcdddcdddddddddd c 

cddc 

cddc cdddddddˆddccddcdddcdddcddcdd@cRdcdddcddcdddcddcddScdddcddddddcddd c 

cddc 

cddc tdddddH‚dddddddcddScdddddddddr�ddddddcddddddcddrtddddddcdddcddS c 

cddc 

cddc Uddc�Qddddddcddrtddcdddddd‡PTucddcdddcddcdddddd‡8ddcdddcdddˆddr c 

cddc 

cddc dddc�xdddddddddcUddcdddddddddddddcddddddcddddddddddcdddˆdd†dddc c 

cddc 

cddc dddc�cddddHcRddcdddcdHwsRdddHcRddcdHcRddcdHwsRdddddcdH‚Rddcdddc c 

cddc 

cddc c 

cddc 

cddc c 

cddc 

cddc c 

cddc�cyPddc 

cddc c 

cddccyPddd‰c 

c 

cddcdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

c‡Pddc cddcddTcPd c 

cddcdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cUdddv tddcdddddd c 

cddcdddddc 

tddddI�ddddTˆcddddddc‡Pdddd�dddddddddddcUddcddcddd‡PdccddcddddTˆ c 

cddccsRddddc 

c‡8ddddd�dddddAcdddddd‡8ddddd�dddddddddddcdddˆddcddddddctddcdddddA c 

cddc�csRddc 

cUdddddd�dddddrtdd@‰ddddddcdddddddˆdd@‰dddcdd†dddcddcdddcUddcdddddr c 

cddc 

tddddddd�ddddd‡8ddrcddddddddddddd†dddrcdddcddcdddcddcddScdddcdddddv c 

cddc 

UdddddddctdddddddddccddddddddddddScddd�ddddddcddddddcdd‰cdddˆdddddI c 

cddc 

ctdd@w�dd‡8dddddddddddd@‰ddddddcddrcQddddddcdddcddcdddcdddddd†ddddddS c 

cddc 

cddH‰c�ddddddddH‰dddddH‰cdddddddddc�ddddddcddddddcdddcddddddcdddddH‰ c 

dTˆddddd 

ctdd cUdccddS c 

dddddddr 

cUdd cQdddddr c 

QdddddSc 

cddd c†Rddddc c 

†9ddddrc 

c 

cxdddS 

c 

ddH‰ 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

cddc�dd 

c 

cddc�dd 

c 

cddc�dd 

c 

cddddddd 

c 

cddddddd 

c 

cddc�dd 

cddc�dd c 

cddddTˆc 

cddc�dd c 

cdddddAˆ 

ddddTˆ c 

cddcs9dI 

dd†9dI c 

cddccxdd 

ddc†dS c 

cddc�dd�dTˆccddc��cddcctdS 

ctdddddc c 

cddc�dd�ddAˆcddc��cddcy8dr 

cdTˆ�dd y8dˆs9dI c 

cddc�dd�dddIcddc��cdddddSc 

cddAˆcdd c‡PddddAu†dd c 

cddddddd�ddddcddc��cddddH‰c 

yPdddTuc cyPdddTu c‡PdddddIcdd ‡8ddd‡ddddddddTˆ c 

cddddddd�ddcddddc�9dTu 

cy8ddddH‚RddHws9dAˆc c 

cddc�dd�ddcQdddc�†RddTu��yPddHc9ddTuc��cyPddHcRddTu��y8dddddddcdddTˆc 

c‡PddddHwc�c†9dAˆ c 

cddc�dd�ddc†9ddc�s9ddTˆ�‡Pdd@w�†RdddTˆc�c‡Pdd@wc�s9ddTˆ�yPddHwcddcddddddAˆ 

y8ddHw��†9dAˆc c 

cddc�dd�dd�†Rdc�c†RddAuc�cy8ddH‰c�sRddAu�y8ddH‰�c†RddAuc�yPddHw�cddcQddd†RdAuc 

c†9dAˆ c 

csRddTuccyPddHwc�sRddTu�yPddHw�csRddTucyPddHw�cddc†9dd�s9dTˆc��‡PddHw 

csRddddddHwc��sRddddddHw��csRddddd@w�cddcc†Rd�c†9dAu��cy8dHw †9dI c 

dd 

cs9dd@wc sRddHw ddddrc †9dddddddddddddddc cxdd c 

cd 

xddr dddd cxdd��cddc dd c 

dd 

dddd dd��cddc dd c 

cddc 


cddc 


cddc 

dd��cddc dd c 

cddc 

dd��cddc dd c 

cddc 

yPddTˆ dd��cddc dd c 

cddc 

cddddddI dd��cddc dd c 

cddc 

cddccs9dvc dd��gddc dd c 

cddc 

cdSc�xdIc dd�cdd…�dd dd c 

cddc 

cd�tddc dd�cddAˆcdd cydcdd c 

cddc 

cdAˆc‡8dSc dd�cdddIcdd cyPddcddvc c 

cddc 

cQdAc8d@‰c c‡Pddddddddddddddddcdd��c‡PdddddddAˆ c 

cddc 

cUdddˆ�cddcddddcdTˆ�y8ddcdd@cRdAuc c 

c†RdddH‰ 

c 

cddddD�cddcQdddcQdAuc�yPddddddH‰�s9dTˆc 

‡Pdddddd@‰�cddc†9ddc†RddTˆc‡Pdddddd@w�c†9dAu c 

ddddddc‡Pddddd�dddddTcPdc�dd 

Udddddddrc�cddccxdd�cs9dAc8ddcdddH‰c�†RddTˆ�ddddTˆcddc�dd�‡PdddTˆcdd�cddc c 

ctddHc9dcUd@cRdd�ddHc9ddddc�dd 

dd�dd��cddc�dd�†RdddddddHwc��s9dAˆcctdddddIcddc�dd�UdddddIcdd�cddc c 

cUdc�†9cddr�cddddc�xddddc�dd 

dd�dd s9ddd@wc��c†RdIccUdccsRdcddc�dd�d@wcs9dcdd�cddc c 


dd�dd c†9d@‰ csdccddc�cddddddd�dr�cxdddddddddc c 

cQdv�‡8ˆddc�tddddv�cddddc�dd 

dd�dS xdrc cddc�cddddddd�dv�ctdddddddddc c 

cxdAuy8ddddccy8ddddAuccddddc�dd 

Qddddd@‰ cd cQdccyPdcddc�dd�dAucy8dcdd�cddc c 

Qdddd@ws9dddd@ws9dddd@‰ddc�dd 

†RdddH‰c cd cxdddddScddc�dd�QdddddScdd�cddc c 

†RddH‰�†RddH‰�†RddH‰cddc�dd 

ddddH‰cddc�dd�†RdddH‰cdd�cddc c 

cd 

c 

cd 

dd c 

cd 

dd c 

cd 

dd c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

c 

c 

yPTu�c‡PdTu�yPdTˆcdd�cddc 

c 

cddddddc‡8ddddTuyPddddAˆdd�cddc 

c 

td@ws9dcUd@ws9dddd@ws9dddd�cddc 

c‡Pddddc��c‡PTˆc�dd dd cyPdTˆ�Udrcc†9cddrccxddddrccxdddddddddc c 

‡Pdc 

c‡PTc8ddddSc��‡8ddAu�dd dd c‡PddddI�dd�dd�dddd�dddddddddc c 

cy8ddc 

c 

‡PddddddddTuyPdddc‡Pdddc‡PdTˆc‡PdTc8dddddcddr‡PdTuyPddTc8ddddddTucdd‡PddTuyPddTuyPddddc‡PddTcPdddddddddddTcPddTˆ�cUdddddd�Qdvcc‡Pdddvcctddddvcctdddd�cddc 

c 

UdddddddddddddddSc8dddd‡8dddAc8ddddddddddcdd‡8dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd‡8dddddddddddddddddddddddI�cdd@wsRd�xdAuy8ddddAuy8ddddAuy8dddd�cddc 

c 

dd†9ddddcddddddd‰c†ddddddd†Rddddcdddddcddcdddd@cRdddcdddddc‡dddddddddd@‰ddddddˆcdd@‰dddddc‡dddd@‰ddddddˆddcddddd�cddr��cddddd@ws9ddddHwsRdddd@‰dd�cddc 

c 

dd�dddddddddddddddddddddd�cdddddddddˆddddddd‰c�ddddddddcUddddddddddrtddcdddIcdd‰cdddddcUddddrcddddd†ddddddddS�cddvc‡Eˆ�sRdH‰cc†RdHw�sRdH‰cdd�cddc 

c 

dd‡8ddddcddddcdddddcddddddddddddcdcdd†ddddddddddddddcddcddcddcddcddcdd‡8ddddcddcdddddddddcdddddccddcddcdddddcddr�cddAc8dD 

c 

Qdddddddddddddddddddddˆs9dddddddddddddddddd†9ddd@c9dddddddcQddddcddcdddddddddddˆdddddHc9dddddddccdddddcdd†9ddddc�cdddddH‰ 

c 

†RddHwsRdHwsRdHwcsRddddc†RHw�sRHwcsRddHcRdc†RdH‰c†RdHcRddc†RdddcddccsRHwcsRdH‚ddddHwcc†RdHcRddccdddddcddc†Rdddc�sRHw 

c 

cdd@wc 

c 

cdH‰ 

c 

c 

c‡PddddddTˆcc‡Pddc�‡PddTˆcddc 

c 

cUddˆdddddIccUdddcc‡8ddddIcddc 

c 

tdd†dddccddctddddvcUd@wsRdcddc 

c 

UdScddSccddcUddddIcddr�cddc 

c 

ddrcddrctddcddddddcddc�cddc 

c 

dd�ddcy8dddddddddcddcyPdTˆddc 

c 

ddctddddddˆddc�ddcQdddddddddc 

c 

ddcdddddH‚Rddc�ddc†RddddˆddSc 

ƒdd@‰c c 

ddvc 

8dH‰ c 

dddc 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

ddcddc�cyPTuc�cddd c 

c‡PTˆc 

c 

cUddIc��‡PTˆddcddc�c‡Pddddd�cdddvc 

c 

tddddcc‡Pdddc‡PdTc8dddddcddc�cUddddddc‡PddTˆctdddIc 

c 

UddddvcUdddd‡8ddddddddddcddc�cdd@wsRdcUddddIcUddddc 

dddddIcdd†Rdddddddcddcddcddc�cddc�cdd†9ddcddcddv c 

dd 

yPddddd@�ctddddddcddc�ddddddcddcddcddcdddddAuyPdcddccddddddddI c 

dd 

yPddddddddddddddH‰�cUddddddcdd‡Pddddcddcddcddcddcddddddddddcdd‡8ddddddddd c 

dd 

yPdddddddddddddHwc cdd@ws9dddddd@c9dddScdddddcddc�csRdddddcdddd@‰ddc�ddvc c 

dd 

yPdddddddddddHwc cdH‰�†RHcRdH‰c†RdH‰cdddddcddc�csRHwc�sRH‰cddc�dddc c 

dd 

yPdddddddddHwc c 

dd 

cyPddddddddHwc c 

dd 

yPddddddHw c 

dd 

cyPddddddHwc c 

‡PTuyPdTuc��dd 

yPddddddHw c 

UddddddddTˆc��dd 

yPddddddHw c 

yPTˆ�yPTu�ddcdd@c9ddAc��dd 

cyPdddddHw c 

cddddAcPdddddddddddrc†dd��dd 

cyPdddddHw c 

tddddddddddddddddddcddddIc��dd 

yPddddHw c 

Uddc�cddddddddddddcdddddc��dd 

c 

ddd‡Pdcdddddddd@‰ddc�dddc��dd��cyPddddHwc 

c 

QddddScddddddddrcQddddddSc��dd��yPddddHw 

c 

†RddH‰cddddHcRdcc†RddddH‰c��dd�cyPddddHwc 

c 

dd�cyPdddHw 

cddddTˆcc‡Pddc�‡Pdddd ddcddcddc‡8c dddd c 

dd�c‡PdddHw 

cdddddAˆcUdddvc‡8dddddvc ctddcddcdd‡8dc ddddac c 

dd�‡8ddHw 

cddccddIcddddIcUddcsRddc�dddddcddddTcPddTc8dddddcdddddddddddddddcddddddddddddddd†dddTˆcdddddddTcPdddTcPdddd c 

ddcy8d@w 

cddccdddcddcddcddd�ddcddcdd†RdddddddddddddcddddddddddddcddcddddddddddddddddddddIcdddddddddddddddddcdd c 

dddddH‰c 

cddccdddddddddcddd�dddddcdd�cddddddcddcddcddcddcdddcdddddcdd�dddddddcddcddddddcddc‡ddddddddddcddddd c 

ddd@wc 

cddccdddddddddddddcyPddc�dddddcdd‡dˆddddddcddcddcddcddcdddcdddddcdd�ddcdddddddcddddddcddcUdddddcdddddddddd c 

dddr 

cddddddˆdd�cdd†9dddddrc�dddddcddddddddddScdddddcddcddddddcdddddcdd�ddddddddddcQddddScddcdddddddddddddddddvc c 

dddc 

cddddH‚Rdd�cddc†Rdddd�ddddddddddHcRddH‰cdddddcddcddddddcdddddddd�ddddddHcRdc†RddH‰cddcddddddddddHcRdddddc c 

dddc 

c 

dddc 

c 

ddddTˆ 

c 

dd†9dAuc 

c 

ddc†RddTuc 

c 

dd�csRdddTu 

c 

dd�sRddddTu 

c 

dd�csRdddddTu 

c 

dd��sRddddddddTu 

sRddddddddddTu c 

cddddd‡Pdc 

csRddddddddddddddTuc c 

cQddddddSc 

csRddddddddddddddddddTuc ‡PdTuc�‡PTˆ c 

c†9dddddrc 

sRdddddddddddddddddddddddddTuc yPddTu�c‡8ddddd�UddI c 

xddddS 

sRdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddTˆc�cUd@c9dSc‡PdTˆ�ddddvc c 

cQdd@‰ 

csRdddddddddddddddddddddAc�cddrc†C‰‡8dddAucddddIc c 

c†RH‰c 

c 

cdddddHw�cddc�cy8ddcdddddddddc 

c 

cdHw��cddvc‡Pddddcdddddddddv 

c 

cQdAc8dddddcdddddddddI 

c 

c†9ddddHc9dddddddcs9dd 

c 

†RdHwcc†RdHcRddcc†Rd 

c 

c 

c 

c 

c 

dd�cddc 

c 

dd�cddc 

c 

dd�cddc 

c 

dddddddc 

c 

dd�cddc 

c 

dd�cddc 

dd�cddc c 

ddddTˆ 

dd�cddc c 

dddddI 

cddddddc c 

dd�dd 

cdd†9ddc c 

dd�dd 

cddc†ddc c 

cddc�dd�dTˆccddc��dd�dd 

dTˆccddc cddddddc c 

cddc�dd�ddIccddc��dd�dd 

ctddAˆcddc ydcdˆs9ddc c 

cddc�dd�dddvcddc��dddddd 

c‡PdTu y8dddIcddv ‡PddcdAu†ddc c 

cddddddd�dddAˆddccdTu�dddHwc�yPdTuc 

‡PdddddTuc y8ddddTu yPddddddcddAuc cy8dddddddddScdTˆc c 

cddddddd�dddddddccdddTu 

c‡PddddHwsRddH‰cQdAˆ c 

cddc�dd�dd†9dddc�sRddTˆ��cy8ddHws9ddTˆc��yPddHws9ddTˆ��yPddH‰ddcddddddTˆc 

‡8dddHwc�†9dAˆc c 

cddc�dd�ddcxdddc�sRdAuc�cyPddHwc�†RddAu�yPddHw�c†RddAuc�yPddHw�ddcQddd†9dAˆ 

cy8ddHwc��c†9dAˆ c 

cddc�dd�dd�dddc�s9dTuc�cyPddHwc�sRddTu�yPddHw�csRddTuc�‡Pdd@w�ddc†9ddc†9dAˆc 

†9dAˆc c 

c†RddTuyPddHwc��sRddTuyPddHw��csRddTuy8ddH‰c�dd�†Rdcc†9dAu��cyPddHwc 

csRddddHwc sRddddHw cs9dddd@wc †RdddddddddddddddddHwc c†9dIc c 

dd 

dd sRHw xddddr cddddddddddddddd xddc c 

dd 

dd cddddc cddc��dd cddc c 

dd 

cddddc cddc��dd cddc yPdTˆc c 

dd 

cddddc cddc��dd cddc ‡PddddAˆ c 

dd 

cddddc cddc��dd cddc Ud@ws9dI c 

dd 

cddc��dd cddc ddrccxdd c 

dd 

c‡Pddddd cddc��dd cddc dd�dd c 

dd 

cUd@cRddvc cddc��dd cddc ddvcctdd c 

dd 

cddr�cdIc cddc cddc QdAuy8dS c 

dd 

cddc�cddc cddc�cddd�dd cddc †Rdddd@‰ c 

dd 

cddc�tddc cddc�cdddvcdd cddc ‡dd@‰c c 

dd 

cQdccy8dSc cddc�cdddAˆdd cyPddddc U‰dr c 

dd 

c†9dddd@‰c cddddddddddddddddd c‡Pdddcddc dcdc c 

dd 

†RddH‰ ‡Pddddddddddddd†9dddddTˆ��y8ddˆdddddTˆ dcdc c 

Qd 

Uddd@w�cddcxddddddAuc�‡Pddd†dd@ws9dAuc dcdc c 

†ddTˆc�yPdTˆc�yPdTˆccd�dc 

Qdd@‰c�cddccQddcsRddTˆc�cy8ddcdddH‰cc†RddTˆc dcdv c 

cdddddAuyPddddAˆcdddddAˆcd�dc 

c‡PdddTˆ†RH‰�cddcc†Rd�cs9dAu�dddˆdddHwc�cs9dAˆ�‡PddTˆcddc�dd�c‡PddTˆcctdddAˆc‡PddTˆcddc�dd c 

cddcs9dddd@ws9dAˆd@ws9dIcd�dc 

cUdddddAˆc †RddTˆdd†dd@wc�†RdAuc�UddddAˆddc�dd�‡8ddddAuy8ddddIcUddddAˆddc�dd c 

cdScc†C‰ddrccxddddrcc†9dcddddddc 

cddc�cdIc s9ddddddH‰��s9dd�ddcsRddddc�dd�Ud@w�dddd@wsRdcddcsRddddc�dd c 

cd�dd�dddd�cdcddddddc 

cddc�cddc c†Rddd@w c†Rd�dS�cddddddd�ddrc�ddddrc�dS�cddddddd c 

cdIcc‡Pdddvcctddddvcc‡8dcd�dc 

cddc�cddc ddrc dc�cddddddd�dd�dddd�dc�cddddddd c 

cddcy8ddddAuy8d@‰dAuy8dScd�dc 

cddc�cdSc dd dAˆc‡Pdddc�dd�Qd�ctddddvc‡PdcdAˆc‡Pdddc�dd c 

cddddd@wsRdddd@‰cddddd@‰cd�dc 

cQddddd@‰c dd QdAc8ddddc�dd�xddTc8d@‰dAc8ddcQdAc8ddddc�dd c 

sRdH‰c�sRdH‰c�sRdH‰ccd�dc 

dd †RdddHcRdc�dd�cdddddH‰cddddddc†RdddHcRdc�dd c 

c†RdddH‰ 

c 

dd 

dd dd c 

dd 

cd cd c 

dd 

dd dd c 

dd 

c 

dd 

c 

dd 

c 

dd 

c 

c 

c 

c‡PddTˆc‡PdddTˆc‡PdddTˆcdd�cddc 

c 

‡8ddddIcUdddddAc8dddddAˆdd�cddc 

c 

Ud@wsRdcdd�dddd�dddd�cddc 

c 

ddrc�dd�dddd�dddddddddc 

c 

Qdvc�dd�dddd�dddddddddc 

c 

xdAucyPddd�dddd�dddd�cddc 

yPdc c‡PdddTˆ cQddddd†9ddddd@c9ddddd@‰dd�cddc c 

cddddddc�dddTuc�cddd 

c†Rddddc†RdddH‰c†RdddH‰cdd�cddc c 

tddddddc‡PdTucddc†ddTˆcddr‡PdTˆc‡PdTˆccyPTˆccyPTuc�yPdddccyPTˆc‡PdTˆc�‡8dddddI 

c 

Ud@wsRd„8ddddddddddddIcdd‡8dddIcUdddAcPdddAcPddddTcPddddd‡PdddAc8dddIc�UddcsRdd 

c 

ddrc�fdddcdddddcdddddcdddd@‰ddcddddddddcddddd†9ddddddddddddcddddddddc�ddSc 

c 

ddvc�cddddddddddddddddddddrcddcddddcdddcddddd�dddd@‰ddddddˆdddddddSc�dd 

c 

ddAcPddddddddddcdddddddddddccdddddddddddcddddd‡8ddddrcddcdd†ddddddddrc�ddAcPddc 

c 

Qdddd@c9dddddddcQddddcdd†9dddddddddddddddd@‰dddd@‰dd�ddcddcdddddddd�Qddddddc 

c 

†RddH‰c†RddHcRdc†Rddddddc†RddHwsRdddˆddddH‰cdddH‰cdd�ddcddcdHcRdddd�†RddHw 

c 

cfdddc 

c 

dddc 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

dddc c 

dddc 

ddSc c 

ctdddv 

ctddrc c 

‡8dddI 

c 

Uddddd�ddddddcdddddddddTˆcddddddddddcddddddc‡PdddddcUddcdddcddddddddddddd 

c 

ctddddddctddddddcddddddddddAˆddddddddddcdddddd‡8ddddddcdddcddrtddcdddddddddd 

c 

cUddcdddcUddcsRdcdd@‰dddcddddddcdddcdddddd�ddddddcdddcddddddcUddcdddcdddddd 

c 

tdddddddcddd�cddrcddddddddddcddScddcdddctdddddScddScddcdddcdddcdddˆddcddd 

c 

Udddddddcddd‡Pdddddccdddcddcdddcddrtddcddd‡8ddcddrcddrtddcdddcdddcdd†dddcddd 

c 

ctdd@w�dddddddddcdddccQdddddddddˆddcUddcQddddddˆddctddcUddcddddddddddcdddcddS 

c 

cddH‰c�ddHcRddddcdddcc†RdddHcRH‚Rddcdddc†RdddH‚RddcdddcdddcdddddHcRddcdddcdH‰ 

c 

c 

c 

c 

c 

Figura 1. Ruta biosintética de antibióticos β-lactámicos en hongos filamentosos. 

que contenía el gen cefEF y también el gen de resistencia 

a higromicina B como marcador de selección (se prefirió a 

la resistencia a ampicilina, debido a que esta última es una 

β-lactamasa que podría degradar la cefalosporina C sintetizada). 

Aproximadamente el 25% de los transformantes 

mostraron una capacidad mejorada para producir cefalosporina 

C. En el mejor transformante, se demostró una producción 

mejorada en un 47% con respecto a la cepa 

control. Dicho transformante tiene sólo una copia adicional 

del gen cefEF, que es mitóticamente estable y además 

no se produce acumulación de penicilina N en el caldo de 

fermentación. En estos experimentos el ADN transformante 

incluido en el vector anteriormente mencionado 

consistía en un fragmento BamHI de 7,2 kb, el cual desde 

1992 es sabido que contiene el gen cefG además del cefEF 

[6,7], por tanto el incremento en la producción final de 

cefalosporina C sería debido no sólo al incremento del 

número de copias del gen cefEF, sino también al incremento 

en la dosis del gen cefG [8]. 

c) Incremento en el número de copias del gen pcbC 

de Acremonium chrysogenum. El análisis de varios cientos 

de transformantes con copias adicionales de dicho gen 

no demostró ningún incremento en los niveles de producción 

de cefalosporina C en comparación con la cepa sin 

transformar. De manera que se puede concluir que el paso 

biosintético codificado por el gen pcbC no es limitante 

para la producción de cefalosporina [9]. 

d) Incremento del número de copias del gen pcbC 

en una cepa industrial de P. chrysogenum. El análisis de 

transformantes con copias adicionales del gen pcbC no 

resultó en un incremento en la producción de penicilina 

incluso en aquellos transformantes con niveles de isopenicilina 

N sintasa incrementados [10]. Asimismo, en este 

estudio se descubrió que las cepas de alta producción de 

P. chrysogenum, incluyendo la usada en este estudio, 

mostraban amplificación de los tres genes biosintéticos 

[11,12]. Así, es muy probable que el incremento en el 

número de copias de uno de los genes no resulte en un 

incremento en la producción de penicilina. Sin embargo, 

el incremento de la concentración de los precursores 

requeridos para la biosíntesis (como el α-aminoadípico) 

podría tener un efecto estimulador tanto para las biosíntesis 

de penicilinas como de cefalosporinas. 

Incremento de la expresión de uno o más genes 

de la ruta, mediante el cambio de sus regiones promotoras. 

a) Sobreexpresión del gen cefG de A. chrysogenum 

bajo el promotor de distintos genes de alto nivel de 

expresión en hongos filamentosos. La conversión de desacetilcefalosporina 

C en cefalosporina C es poco eficiente 

en la mayoría de las cepas de A. chrysogenum. Dicha conversión 

la lleva a cabo la enzima DAC-acetiltransferasa, 

codificada por el gen cefG. Dicho gen se expresa muy 

pobremente en dicho hongo filamentoso en comparación 

con otros genes de la ruta de biosíntesis de cefalosporina. 

De manera que la introducción de copias adicionales del 

gen cefG con su promotor nativo no condujo a un incremento 

significativo del nivel de transcrito del gen cefG. 

Debido a los resultados comentados anteriormente, 

se abordó la expresión del gen cefG a partir de los siguientes 

promotores: (i) del gen (gpd) que codifica para la gliceraldehido-3-fosfato 

deshidrogenasa de Aspergillus 

nidulans, (ii) (gla) que codifica para la glucoamilasa de 

Aspergillus niger, (iii) (gdh) que codifica para la glutamato 

deshidrogenasa de P. chrysogenum y (iv) (pcbC) que 

codifica para la isopenicilina N sintasa también de 

P. chrysogenum. Dos transformantes obtenidos en la cepa 

A. chrysogenum C10 con cada uno de los plásmidos conteniendo 

los promotores mencionados, fueron analizados 

inicialmente por su nivel de transcripción del gen cefG, 

observándose que todos ellos habían incrementado muy 

significativamente el nivel de dicho transcrito con respecto 

a la cepa control transformada con un plásmido sin 

inserto. Posteriormente en esos mismos transformantes se 

determinó, mediante inmunodetección, el nivel de proteína 

DAC-acetiltransferasa, observándose que dicho nivel 

se había incrementado significativamente en los transformantes 

obtenidos con los plásmidos que contenían los 

promotores gpd(p) y gdh(p), lo cual se correlacionaba con 

el nivel de actividad DAC-acetiltransferasa que también 

se había incrementado notablemente en dichos transformantes. 

Y finalmente se determinó la producción de cefalosporina 

en medio definido de fermentación (Figura 2). 

Aquellos transformantes en los que el gen cefG se expresó 

a partir de los promotores gdh(p) y gpd(p) producen niveles 

muy superiores de cefalosporina C en comparación 

con la cepa control. El análisis por HPLC demostró que 

ese incremento en el nivel de producción de cefalosporina 

C era el reflejo de una conversión más eficiente de DAC 

en CPC [13]. 

b) Sobreexpresión del gen pcbAB de A.nidulans 

bajo el promotor del gen alcA. En este caso el promotor 

del gen acvA de A. nidulans se reemplazó por el promotor 

del gen que codifica para la etanol deshidrogenasa de 

A. nidulans (alcA). El nivel de expresión, como se demos

‡Pdddcdddddcdddddc‡PddTˆ 

Ud�dd†9dcdd†9d‡8d�dI 

dddddcddcxddddcxdddd�dd 

tró por fusiones con el gen lacZ, fue más de 100 veces 

superior que el demostrado por el promotor del gen acvA 

en condiciones de fermentación. El reemplazamiento del 

promotor fue hecho por integración homóloga en el locus 

acvA y la producción de penicilina en transformantes 

monocopia se incrementó más de 30 veces. Las fermentaciones 

que fueron llevadas a cabo con uno de los transformantes 

(JKEX6) y con la cepa no transformada (G191) 

con y sin adición del inductor (ciclopentanona 100 mM), 

demostraron que bajo condiciones de inducción, la cepa 

de sobreexpresión producía alrededor de 30 veces más 

penicilina que la cepa parental. Incluso sin inducción la 

cepa con el promotor del gen alcA todavía produjo más 

penicilina que la cepa parental (ocho veces), reflejando 

niveles de expresión elevados. Los niveles de crecimiento 

de ambas cepas no mostraron grandes diferencias. La 

expresión del promotor alcA bajo condiciones de represión 

fue probada por crecimiento de los transformantes 

monocopia llevando la fusión alcAp::lacZ en medio conteniendo 

o bien glucosa o bien lactosa. Cuando la glucosa 

está presente en el medio a elevadas concentraciones 

(condiciones represivas), la expresión de la proteína de 

fusión fue baja (

S58 


ción, así la KM de la isopenicilina N aciltransferasa de 

P. chrysogenum por la isopenicilina N es 23 mM [19], 

mientras que la KM de la epimerasa de A. chrysogenum por 

la isopenicilina N no ha sido determinada. 

Incremento de la eficiencia de la ruta por modificación 

del flujo de precursores de la biosíntesis 

a) Incremento del pool de α-aminoadípico en 

P. chrysogenum mediante interrupción del gen lys2. En 

P. chrysogenum las rutas de biosíntesis de lisina y penicilina 

tienen diversos pasos en común (Figura 3). El ácido 

α-aminoadípico constituye el punto de ramificación donde 

ambas rutas divergen; en la ruta de lisina el ácido α-aminoadípico 

es convertido en α-aminoadipato-δ-semialdehido 

por la enzima α-aminoadipato reductasa [20], mientras 

en la ruta de biosíntesis de penicilina es condensado en el 

tripéptido ACV (Figura 1). El ácido α-aminoadípico tiene 

una función clave en la biosíntesis de penicilina, ya que la 

adición de α-aminoadipato exógeno [21] u otras condiciones 

que incrementen el pool de ácido α-aminoadípico [22] 

incrementan la biosíntesis de penicilina. 

Sería posible incrementar el pool de α-aminoadípico 

disponible para la biosíntesis de penicilina mediante la 

disrupción del gen lys2 que codifica para la α-aminoadipato 

reductasa [23] (Figura 3). Para ello se construyó el 

plásmido pDL10 en el cual un fragmento interno de 200 

bp del gen lys2 fue sustituido por el gen pyrG 

(Figura 4A). Un fragmento lineal de 8.8 kb procedente de 

dicho plásmido fue usado para transformar la cepa 

P. chrysogenum Wis. 54-1255 pyrG. Dicho fragmento 

contiene dos regiones (de 4,3 y 3 kb) homólogas a la 

región genómica donde se encuentra el gen lys2 flanqueando 

el gen pyrG. El cambio del gen lys2 endógeno por el 

fragmento que contiene el gen lys2 mutado produjo un 

cambio en el patrón de restricción (Figura 4B). Como se 

esperaba, en el transformante disrupcionado TD10-195, la 

banda de hibridación de 8.0 kb de la cepa parental se convirtió 

en una banda de 2,1 kb (Figura 4b, carril 2). 

El transformante TD10-195 demostró carecer de 

actividad α-aminoadipato reductasa en comparación con 

la cepa parental Wis. 54-1255. 

‡Pdddd 

cdddddTˆ cdTˆc‡Pdcddc cdTˆc‡Pdcd 

Udddddvc 

cddcs9dI cxdAc8dScddc cQdAc8drcd 

ddˆcsRdc 

cddcc†dd Qddd@‰cddddddc c†9dddSccddddTˆc 

ddAu 

cddddddd xdddrccddddddc xdddrccdddddIc 

dddddTˆc 

cddddddd tdddvccddccddc tdddvccd@wcddc 

sRddIc 

cddc�dd UdddAˆcddccddc c‡8dddIccd�cddc 

dd�cddc 

cddc�dd ctd@c9dIcddccddc cUd@c9dvcdAucddc 

dd�cdSc 

cddddddS ‡8drc†9dcddccddc td@‰cxdAˆdddddSc 

ddddd@‰c 

cdddddH‰ 8ddc�†Rdddccddc dH‰c�dddddddH‰c 

csRdH‰ 

dd 

dc ‡Pd@ dd 

cddc 

dc c‡8d@‰ dd 

cddc 

dc c‡PddddTˆc ‡8d@‰c dd 

cddc 

dc ‡8ddddddIc��c‡8d@‰ dd 

cddc 

dc cy8d@wcs9ddc��‡8d@‰c dd 

cddc 

dc cddddddcdd�cdddddddddrc�†Rdc��c‡8d@‰ dd 

cddc 

dc cddddddcddvctddcdddddS cUd@‰c dd 

cddc 

dc tddccddcQdIcUdddd@‰ddr�dddddc��cddr dd 

cddc 

dc UdSccddcxddcddcddrcQdv�dddddc��cddc dd 

cddc 

dc ddrccddccddddScddccxdAˆc�cddc��cddc dd 

cddc 

dc dd�cddccddd@‰cddc�ddAu�cddc��cddc dd 

cddc 

dc ctddddddSccdddrctddc�QdddddddSc��cddc dd 

cddc 

dc cUdddddH‰ccddS�dddc�†RdddddH‰c��cddc dd 

cddc 

dc cddc�cddr cddc dd 

cddc 

dc cddc�cdddSc cddc dd 

cddc 

dc cddc�cddH‰c cddc dd 

cddc 

dc cddc dd 

cddc 

dc cddc dd 

cddc 

dc cddc dd 

cddc 

dc cddc dd 

cddc 

ddddddTu�cddc�dddc�‡PdTˆc 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddS 

cd dc cddddddc dr dddddddddccddc�dddcc‡8dddAˆ 

cd 

cd�cyPdddTu dc cdddddddddTu dc dddddddddvcddc�dddddccUdddddI 

cd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd�cyPdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddTu dc dddddTˆcdddccs9ddIcddc�dddddccdd@‰ddd 

cd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd�9ddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd��dc ddddddIcdddc�xdddcddc�dddddccddrcddd 

cd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd�†RdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddHwc��dc dd@c9ddcdddc�cdddcddc�d‰dddccddccddd 

cd 

cd�sRdddddc dc cddddddddddHwc dc ddrcxddddddc�cdddcddc�dddccddccddd 

cd 

cd��cddc dc cddddddd dc ddvccddddddc�tdddcddc�dddccddvcddd 

cd 

ddAucddddddccy8ddScddc�dddccddAˆddd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cs9dˆc�d@wc dddddddcdddddddd@‰cddddddddc�dddccQdddddS 

cddc�‡d 

xdIc�ctdr dddddddcdddddddH‰ccddddddddc�dddcc†9ddd@‰ 

cQdc�Ud 

cddc�cUdc dd†RHw †RdH‰c 

cxdv�ctdS 

cQdv�tdSc dd 

dI�cUdr 

cxdI�Udrc dd 

Qd�cddc 

Qdvc�dd 

xdvc�tdSc 

xdIc�ctdS 

cdIc�Udrc 

cQdv�cUdr 

cQdv�dS 

cxdI�cdSc 

cxdIctdr 

Qd�tdrc 

ddcUdc 

xdvcUd 

QdcdSc 

cdAˆdS 

xdddrc 

cQdddr 

cQdd 

cxdddc 

dd 

dddc 

cUdd 

dddc 

cddd 

dddc 

tdddvc 

ctdcdv 

UdcdIc 

cUdcdI 

dScQdc 

tdScQdvc 

ctdrcxdv 

UdrcxdIc 

cUdc�dI 

dd�cQdv 

tdSc�Qdvc 

ctdS�cxdI 

Udrc�xdIc 

cUdr�Qdvc 

dd�cddc 

cdSc�xdIc 

ctdS�cQdv 

tdrc�cddc 

cUdr�cxdI 

Ud�cQdv 

cdSc�Qd 

ctdS�cxdI 

tdrc�xdvc 

y8d‰�dd 

cy8d�cdAu 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

dddddddc dc 

cd 

ddddddddddTu dc 

cd 

cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddTˆ dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

cddddddddddddddddddddddd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddA dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 


cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddHw dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 


ddddddddHw dc cd 

cd 

cyPTuc dddddc dv cd 

cd 

cd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddI 

cd cddc dd dd cd 

cddc 


cddc 


cddc 


cddc 

cd cddc dd dd cdvc 

cddc 

cd cddc ddvc dd cQAˆ 

cddc 

cd cddc QdAˆ dd c†9Aˆc 

cddc 

cd cddc †9dAˆc dd †9Aˆ 

cddc 

cd cddc c†9dAˆ dd c†9Aˆc 

cddc 

cd cddc †9dAˆc dd †9Aˆ 

cddc 

cd cddc c†9dAˆ dd c†9Aˆc 

cddc 

cd cddc †RdAˆc dd †9Aˆ 

cddc 

cd cddc s9Aˆ dd c†9I 

cddc 

cd cddc c†RA dd †9 

cddc 

cddddTˆc 

cdddddAˆ 

dddddTˆc��cdTˆc‡Pdcddc cddc�dI 

c‡PdTˆ 

dddddTˆc ddddddIc��cQdIcUdScddc dd�‡Pdcdc cddc�dS 

‡8dddAˆc 

ddcs9dIc dc�‡ddc��c†9dcddrcddddTˆc Qdcy8drcdc cddddddc 

Ud�cdIc 

dd�†dSc dccy8dSc��xdddSccdddddIc xddddS�ddddTˆ cddddddI 

dd�gddc 

dddddd ddddd@‰c��cddd�cddccddc cQdddr�dddddI cddc�dd 

Qdddd‰ 

ddddddIc ddddH‰ tdddIccddccddc dddc�d@wcdd cddc�dd 

cddddddc 

dd�cddc dc c‡8d†9dvcddccddc ‡8dddv�dc�dd cddddddd 

Ud�cddc 

dd�cddc dc ‡8dScxdAˆddccddc UddddAˆcdIctdd cddddHwc 

dd�cddc 

ddddddSc dc 8dH‰�dddddccddc ctd@ws9dIcdd‡8dS 

QdddddSc 

dddddH‰c cdH‰�†RdcddddH‰ 

†RdddH‰c 

cd 

‡PdTˆcdd�dddc 

c‡8dddIcdd�dddc 

cd 

cUdddddcdd�ddddTu 

cd 

cQdddddcdd‡Pdddddddddc cd 

cd 

dddddcdddd@‰dddddddc cd 

cd 

cd 

cUdddddcdddd�dddccddc 

cd 

cdddcddcddddIcdddccddc 

cQdddddcddcddcdddddddc 

cd 

c†9dddScddcQdddddddddc 

cd 

†RdH‰cddc†RdddddHw cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddSc 

cdrc 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cd 

cddc 

cddc 

cddcdd dd�c‡Pd dd�cddc�cddc 

cddc 

cddcdd dd�cUdS dd�cddc�cddc 

cddc 

cddc cddc dd�cddc�tddc 

cddc 

cddc��c‡Pdddddd‡PTcPdddTˆcdddddddccdddcddddddc‡PdddTcPdT„PdddAˆc‡Pdddddc�dddddTˆcdddddd�dddddc�‡Pdddddd‡PdddTˆctddddTˆcUdd„PdddTˆ 

cddc��cUddddddddddddddddAˆddddddSccddrtdddddd‡8dddddddd†ddddddIcUddddddc�ddddddAˆddddddvcdddddc�UdddddddddddddIcUdddddIcdd†ddddddI 

cddc��cdd@wcddcdd†9ddd‡dddd@wcddrccddcUd@wcdddd@wcsRdddcdd�cddcdd@wcddc�dd@wcdddd@ws9dAˆdd�dd@wcddcdd�cddcdd@wcddcddcddc�dd 

cddc��cddr�ddcddc†9ddd…cddr�dd�tddcddrccddddr�cddddS�cddcddrccddc�ddrccddddr�cddddS�ddrccddddS�cddcddrccddcdddddddddd 

cddc��cddcctddcddcc†RddIcddcctdd�UdScdd�tddddc�cddddc�tddcdd�tddc�ctdd�tddddc�Uddddr�dd�tddddc�tddcdd�tddcdddddddddd 

cddc��cddcy8ddcdddTu�ddcddccUdd�ddrtddcy8ddddccyPddd†9dAuy8ddˆdd�UdSc�cUddcy8ddddc�ddcddc�ddcy8ddddAuy8ddˆddcy8dddd†9ddccddS 

cddc��cdddddddddddddddddcddccQddddddcUdddddd†9ddddddddcxdddddd†ddS�ddrc�cdddddd@c9dddddScddc�dddddd@‰dddddd†dddddd@‰ddcxddddd@‰ 

cddc��cdddddHcRHwsRddddddddcc†Rdddddcdddddddc†RdddHcRd�ddddddcdH‰�dd�cdddddH‰c†RdddH‰cddc�dddddH‰cddddddcdddddH‰cddccddddH‰c 

cddc cddc 

cddc 

cddc tdSc 

cddc 

cddc dH‰c 

cddc 

cddc 

dd�dd dd�‡Pdd 

cddc 

ctddac�dd dd�Uddr 

cddc 

cyPTuyPdTu�cyPdTˆ�yPdTˆc�cyPTuyPdTˆcUd†dTˆc�yPTˆ�cyPdTˆ�cyPTuc�dddv�yPTˆ 

cddc 

cddc��c‡PddddddddddcdddddAcPddddAˆcddddddddddIcdddddIccddcdddddAˆcdddddIc‡PdddddcddcdddddI�dddddAˆc 

cddc��cUdddddddcdddcdd@c9dddd@c9dIcdddddddddddcddddddccddcddddddIcdddˆddcUddddddcddcdd@‰ddvcddddddIc 

cddc��cdd@w‡ddddddddd@‰c†9dd@‰cxddcddccdd@‰dddˆddccddctddcdd�dddW�†dddcddccsRdˆdddd@‰cQdAˆdd�ddSc 

cddc��cddrcUdddddddddr�c†ddrcctddcddccddrcdd†ddSccddcUddddS�dd†dddddddcddc�c†dddddr�cddddS�ddrc 

cddc��cddccddˆ�cddcc‡PdddvccUddddSctddccddcdd�tddcddcddr�ddcddddˆddcddcc‡Pdddcddcc‡8ddddr�dd 

cddc��tddccQdAuyPddddcy8ddddAucddcddrcUdSccddcddAc8dScddcddc�ddcddc†dddcddcy8dcddcddcy8ddcddc�dd 

cddc��UdSccxddddd@c9ddddddddddddScdd�ddrctdScddddddrcddcddcctdScQddddddcQddddScddcQdddddScddcctdS 

cddc��dH‰c�ddddH‰c†RdddHwsRdddH‰cdd�dd�dH‰cdddddd�ddcddccdH‰c†Rdddddc†RddH‰cddc†RdddH‰cddccdH‰ 

cddc 

cddc 

cddc 

cddc 

cddc 

dddddddd 

xddddddr 

cQddddSc 

cxddddrc 

QddS 

xddr 

cddc 

cdddddTˆ dTˆccddddd cdddddTˆ 

‡PdddTˆc 

cddddddI dddddTˆc dTˆc‡Pdcdd xdAucd@‰dd cddddddI 

UdddddIc 

cddc�dd ddddddIc QdIcUdScdd cQddddrcddddTˆ cddc�dd 

dd�sRdc 

cddddddS dd�cddc †9dcddrcddddTˆ c†9ddS�dddddAˆc cddc�dd 

QddTuc 

cddddddc dddddddc cxdddS�dddddI cddc�dd@c9dIc cddddddd 

†RdddTˆc 

cddc�dI dddddddc dddc�dd�dd c‡8ddI�ddrcxddc cddccs9d 

sRddIc 

cddc�dd dd�s9dc ctdddI�dd�dd cUddddvcddvctdSc cddc�cd 

dTˆccddc 

cddddddS dd�c†dc ‡8d†9dvcdd�dd td@wcdAˆddAc8drc cddccy8d 

QdAucddc 

cdddddH‰ dddddddc c‡8dScxdAˆdd�dd UdrccQdddddddS cddddddd 

†9dddddc 

dddddddc c8dH‰ccddddd�dd dd�c†RdddddH‰ 

c†RdHw 

dc 

dc dd cddc dc 

cddc 

dc dd cddc dc 

cddc 

dc dd cddc dc dc 

cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 


cddc 

dc 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

csdw cd dc��sRHw dddd dc dc 

cd@w 

cd�cyPddc dc dddddddTuc dc dc 

cd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd�cyPddddddc dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddTuc dc dc 

yPddddddddddddddddddddddIc 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd�dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd�dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddSc 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd�sRdddddddc dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddHwc dc 

cdrc 

cd�sRdddc dc dddddddd dc 

cd 

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

sRddddddddddddddddddddddddddddddHw 

cddc 

‡Pdc��cyPdTu c‡PddddTˆc 

cddc 

UdSc��dddddddc ‡8ddddddIc 

cddc 

cy8d@wcs9ddc 

dd‰c��dd@c9ddc 

dddd�cdddddddT„dH‰cxddcdd�cddccddddddcdd�‡Pdcddddddrc�†Rdc 

ctddddvctddddddddd`c�tddcdd�cddccddddddcdd�UddˆdddddS 

cddc 

cUddddIcUdddddd‡dd�c‡8dSc�tddccddcddctdd†dd@‰ddr�dddddc 

cddc 

cddccddcddcs9ddd…c�y8d@‰c�UdSccddcQd‡8dScddrcQdv�dddddc 

cddc 

cddccdddddac†RddIc‡Pdd@‰��ddrccddcxddddrcddccxdAˆc�cddc 

cddc 

cddccddd@‚dTuccddcUddd‰c��dd�cddccdddSccddc�ddAu�cddc 

tddccdddrcQddddddcdddddddcdd�ddctddddddSccdddrctddc�QdddddddSc 

dddccddS�†Rdddddcdddddddcdd�ddcUdddddH‰ctddS�dddc�†RdddddH‰c 

cddc 

cddr cddc�c‡8d@‰ 

cddc 

cdddSc cddc�cUddrc 

cddc 

cddH‰c cddc�cddd 

cddc 

cddc 

cddc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddddd�c‡Pddccddc�cddd 

tddddd�‡8dddccddc�cddd 

cddc�dddˆdd�Uddddccdd‡PdddddddTˆ 

cddc��ƒddd�dddddccdddddcddddddI��dc 

cddc�c‡8ddS�dddccdddddcddd†9dd��dc 

cddc�cUdddc�dddccdddddcddd�dd��dc 

tddddIcddc�dddccdddddcddd‡8dd��dc 

Udddddcddc�dddccdd†9ddddddddS 

cddc�ddddddcddc�dddccddc†RddddddH‰ 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

cddc 

dc 

dddc�cdddddTˆ�dddddddcdddddddddd�dd��‡Pdddddc��‡PTˆ c 

c‡PddddTˆcddddddddddddddddc‡PddddTˆcc‡Pddddddccddc�dd�cddddddddddccddd�cddddddddc�cddd�ddddddddc‡PdddTˆ 

c 

cUddHc9dIcddddddddddddddddcUddHc9dAˆcUddHc9ddvcddc�dd�cddddddddddctddd�cddddddddv�tddd�dddddddd„8d@c9dAˆc�cd�ctdddc�tdd@c9dI�dddddddcdddddddddd�dd�c‡8d@c9ddv��UddI 

c 

cddc�†Rdcdd�cddc�cddc�†9dIcddc�†Rddcddc�dd�cddc�dd�Udddvccddc�cddI�Udddvc�cddccfdd@‰c†9dIc�cd�cUdddv�Ud@‰c†Rd�dd�cddc�dd�dd�cUd@‰c†Rddc‡PddTˆcctdddd 

c 

‡PdTcPdc�cddc�dd�cddc�cddc�cxddcddc�cddc�dd�cddc�dd�ctddcdIccddc�cddSctddcdIc�cddc�ddrc�xddc�cd�tddcdI�ddrc�dd�cddc�dd�dd�cddr�‡8ddddIccUddddvc 

c 

Uddddddc�cddc�dddddddd�cddc�cddc�ddcddccdddddcddc�dd�cddc�dd�cUddcddvcddddddd@‰cUddcddv�cddc�dd�cddcdddddddc�Uddcddvcdd�dddddddc�cddc�dd�dd�cddc�Ud@wcddccddccdIc 

c 

dd�ddScddddcddc�dddddddd�cddc�cddc�ddcddccdddddcddc�dd�cddc�dd�cddddddIcddddddd�cddddddI�cddc�dd�cddcdddddddc�ddddddIcdd�dddddddc�cddc�dd�dd�dddddddc�ddrccddctddddddv 

c 

dd�ddrcddddcddc�cddcdd�cddc�cddv�ctdScddv�ddcddc�ddvc�tddc�dd�tdddddddcddc�ddIctdddddddvccddc�ddvc�tddc�cd�ctdddddddcddvc�dddcdd�cddc�dd�dd�dddddddv�c‡PdddvccddcUddddddI 

c 

ddctdd�cQdc�cddcdd�cddc�cQdAucy8drcQdAuc�ddcddc�cgddAucy8dSc�dd�Ud@wcs9ddddc�Qdd‡8d@wcs9dIccddc�QdAucy8dSc�cd�cUd@wcs9ddddAu�ddrcdd�cddc�dd�dd��dAucy8ddddAucddcdd�dd 

c 

Qd‡8dddd�cxddddddScdddddddd�cddc�c†9dddddScc†9ddddddScddddddd‚9ddddd@‰c�dd�ddrc�xddddc�†9ddddrc�xddccddc�†9ddddd@‰c��cddr�cxdd†9dddddS�dddddddc�cddc�dd�dddddd�Qddddd@ws9dddddddS�ddvc 

c 

†Rdddddd�dddddH‰cdddddddd�cddc�†RdddH‰c�†RddddH‰cdddddddc†RdddH‰�dd�dd�cddddc�c†Rddd�cddccddc�c†RdddH‰��cddc�ddc†RdddH‰�dddddddc�cddc�dd�dddddd�†RdddH‰cc†RddHcRH‰�dddc 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

cd 

dcdd��‡8 cd c 

cd�dc 

dcdd�cy8d cd c 

cd�dc 

cd c 

cd�dc‡PdddcddddddddcdddTuyPdddcddddcdddddddddddddddTˆ 

cd c 

cddddddcUd†9dcddcdddddcddddddddddcddddcdddddcddddddd@‰dI 

cd c 

cddddddcddcxdcddcddcdddd�dddd�dcdcddcddc‡ddddcddcdrcdd 

cd c 

cd�dcddctdcddcddcddddvcdddd�dcdcddcddcUddddcddcdvcdd 

cd c 

cd�dcdd‡8dcddcddcddddAˆdddd�dddcddcddcddcddcddcdAˆdd 

cd c 

cd�dcdddddcddcddcdHcRddHwsRddHcdcdddddcdddddcdddddddd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd c 

dd�dd 

cd c 

‡PdTˆc�cyPTucddc‡PdTuyPdTˆc‡PdTˆc 

cd c 

UdddIcddddddddddcUddddddddIcUdddIc 

cd c 

Qddcdcddddcddcddcddcdddddcdcddcddc 

cd c 

cddddcddddcddcddcdddddcddddcdddddc 

cd c 

Udcddcddddcddcddcddcddddcddcddcddc 

cd c 

Qddddcddddcddcddcddddddddddcdddddc 

cd c 

†RdddcddddcddcdddddddHcRdddcdddddc 

c 

cd 

c 

cddddddc 

c 

cQddddSc 

c 

cxddddrc 

c 

QddS 

c 

xddr 

c cddc 

cccccccccc 

c 

dd�dd�cyPddTˆccddd�dddcc‡PdddTˆ�yPddTˆ�ddcddddddddddddddTˆc�cdTˆ�ddddddddc‡PdddTˆ 

c 

dd�dd�ddddddAˆcdddvc�dddc‡8dddddAˆccddddddAˆcddcdddddddddddddddAˆ�tddI�dddddddd„8dddddAˆc 

c 

dd�ddctdd�s9dIcdddIcctdddcUd@wcs9dIctddc�ddIcdd�dd�cddc�s9dI�Udddvc�cddccfdd@wcs9dIc 

c 

dd�ddcUdS�cxddcddddccUdddcddrc�xddcUdSc�dddcdd�dd�cddc�c†dd�ddcdIc�cddc�ddrc�xddc 

c 

ddddddddcddr�ddcddddvcddddcdd�cddcddrc�dd�dd�cddccyPddSctdScddv�cddc�dd�cddc 

c 

ddddddddcddc�ddcddcdAˆddddcdd�cddcdd�dd�dd�cddddddd@‰cUd‰cddI�cddc�dd�cddc 

c 

dd�ddcddv�ddcddcddddcddcdd�cddcddvc�cAˆcdd�dd�cddcs9dd�tddddddd�cddc�dd�cddc 

c 

dd�ddcQdAˆcctddcddcQdddcddcQdvc�tdScQdAˆ�tdIcdd�dd�cddcc†9dAc8d@w�ddvccddc�Qdvc�tdSc 

c 

dd�ddc†9dAuy8dScddcxddScddcxdAucy8drcxddAuy8dScdd�dd�cddc�xdddddrc�QdIccddc�xdAucy8drc 

c 

dd�dd�†9ddddH‰cddccdH‰cddccddddddd�cddddddH‰cdd�dd�cddc�cddddd�†Rdccddc�cddddddd 

sRdHwc�sRdHwc sRdHwc cccccc 

c†RdHw 

dcdd��dd c 

cd�dc 

dcdd��dd cd c 

cd�dc 

cd c 

cd�dcdddddcdddddddTcPddTuyPdddcddddcddddddddddddddddd 

cd c 

cddddddcdd†9dcddcddcdddd@‰dddd†Rdcdcddcdddddcddcddcd@‰dd 

cd c 

cddddddcddcxdcddcddcddddrcdddd�dcddcddc‡ddddcddcdrcdd 

cd c 

cd�dcddctdcddcddcdddd�ddddcyPddcddcddcUddddcddcdvcdd 

cd c 

cd�dcQd‡8dcddcddcddcddddddddddddcddcddcddcddcddcdAˆdS 

cd c 

cd�dc†RdddcddcddcddcdddHwsRddHcdcdddddcdddddcddddddH‰ 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd c 

cyPd�dTuc�dd�cydc�cddc 

cd c 

c‡Pdddc‡PTˆcdddTˆc�yPdddccyduyPdTˆddcyPdTˆc‡PdTuyPdTˆ 

cd c 

‡8dddd‡8ddAˆddddIcdddddddcddddddddddddddddIcUddddddddI 

cd c 

Ud�dddd�ddddcddcdddd†9dcdd�ddcddddcddcddcddcdcddcdd 

cd c 

dd�ddddddddddcddcdddd�dcddctdddddddcdddddcdddddddddd 

cd c 

dd�dddd�ddddcddcdddd‡8dcddcUddcddddcdddddcdcdddddddd 

cd c 

QddddddddddcddcddcdddddddcddcQdddddddddddddcdddddddddd 

cd c 

†RdddHcRdddcddcddcdHcRdddcddc†RdddHcRddddddcdddHcRdddd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cddddddc 

c 

cQddddSc 

c 

cxddd@‰c 

c 

Qddr 

c 

xdSc 

cccccccccc 

c@‰c 

c 

cddc�cddcc‡PdddTˆ�dddc�cddd�‡PdddTˆc�c‡Pd�c‡PdddTˆ�‡PdddTˆccddd�ddcddcdddddddd�dTˆcdddddddd�‡PdddTˆc 

c 

cddc�cddc‡8dddddAˆcdddc�tdddc‡8dddddAˆ�cUddvc�‡8dddddIc‡8dddddAˆcdddvc�ddcddcddddddddctddIcddddddddc‡8dddddIc 

c 

cddc�cddcUd@wcs9dIcdddv�UdddcUd@wcs9dI�tdddIc�Ud�dScUd@wcs9dIcdddAˆ�ddcddc�cddc�cUdddv�cddc�cUd@wcs9dv 

c 

cddc�cddcddrc�xddcdddI�ddddcddr�cxdd�Uddddv�dd�@‰cddr�cxddcddddI�ddcddc�cddc�tddddI�cddc�cddr�cxdI 

c 

cddddddddcdd�cddcddddctddddcddc�dd�ddcddI�dd�cddc�ddcddcddvcddcddc�cddc�Uddcdd�cddc�cddc�dd 

c 

cddddddddcdd�cddcdddd‡8dcddcddc�ddctddddddvcdd�cddc�ddcddcQdAˆddcddc�cddcctddddddvccddc�cddc�dd 

c 

cddc�cddcddvc�tddcddcddddcddcddv�ctddcUddddddIcdd�ddcddv�ctddcddc†9ddddcddc�cddccUddddddIccddc�cddc�ctdd 

c 

cddc�cddcQdAˆc‡8dScddcdddScddcQdAˆc‡8ddˆddc�cddcdd�ctddcQdAˆc‡8dScddccxddddcddc�cddccddc�cddvcddc�cddc�‡8dS 

c 

cddc�cddc†9dAc8d@‰cddcQddrcddc†9dAc8d@‚ddSc�cdd‡dddTc8dSc†9dAc8d@‰cddc�Qdddcddc�cddctddc�cQdIcddc�cQddTc8d@‰ 

cccccccccc 

cddc�cddcc†RdddH‰�ddc†Rd�dd�†RdddH‰cdH‰c�cddH‚RddddH‰�†RdddH‰ccddc�†Rddcddc�cddcdddc�c†Rdcddc�c†RddddH‰c 

cddddc�dd c 

cd�dc 

c 

cd�dc‡PdTˆccyPTcPTˆc‡PTˆcc‡PTˆc‡PdTˆc‡PTˆ�yPTˆ�cddcyPdTucddc‡PdTˆ 

c 

cd�dcUdddIcdddddddAc8ddAuy8ddIcUdddAc8ddAcPdddIcdddddddddddddcUdddI 

c 

cddddddcdd†9dcddcddcdddd�dddd�dcdd†Rdddccddddcddcddddcddcddcddcd@‰dd��cd 

c 

cd�dcdd�dcddcddcdddd�ddcddddcdd�‡ddccddddcddcddddcdddddcddcd�dd��cd 

c 

cd�dcdd‡8dcddcddcdddd�dddddcdcddcy8ddccddddcddcddddcdddddcddcdAˆdd��cd 

c 

cd�dcQdddScddcddcddcdddddddddd‡ddddddddddcddcddcddddddddddcdd‡ddddS��cd 

c 

cd�dc†RdH‰cddcddcddcdddHwsRdddH‚RdHwsRdddcddcddcdHcRddddddcddH‚RdH‰��cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

cd c 

cd�dd�dd��dc 

cd c 

cd�dd�dd��dv 

cd c 

cdddTˆdd‡PdddddddddddddddIcdddTcPddddcdddTˆc 

cd c 

cdddddddddddddddddddcddddScdddddddcdScddddIc 

cd c 

cd�dddddd�dddd�dddddcdrtddddddddd‰cdddddc 

cd c 

cd�ddddddctdddd�dddddcdcUdddddcddddddddddc 

cd c 

cd�dddddd‡8dddd�ddcddcd‡ddcdddddcddddcdddc 

cd c 

cd�dddHcRdddddd�dddddcdH‚RddddddddHcRddddc 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cddddddc 

c 

cdddddSc 

c 

cQddddrc 

c 

cxdddS 

c 

Qddr 

cccccccc 

†Rdc 

c 

cddc�ddc‡PddddTˆccddd�c‡Pd�‡PddddTˆ�dd�dddddTˆcc‡PdddTˆ�c‡Pddddd�ddcddddddddddddddddc�cddd�ddddddddc‡PdddTˆ 

c 

cddc�ddcUddHc9dAˆcddd�cUdd�UddHc9dAˆcdd�dd@c9dIc‡8d@c9dAˆc‡8d@c9ddvcddcddddddddddddddddv�tddd�dddddddd„8d@c9dAˆc 

c 

cddc�ddcddc�†9dIcdddvccddd�dd�c†9dIcdd�dd�†RdcUd@‰c†9dIcUd@‰c†Rddcdd�dd�cddc�cddI�Udddvc�cddccfdd@‰c†9dIc 

c 

cddc�ddcddc�cxddcdddIctddd�dd�xddcdd�ddAu�ddrc�xddcddrc�dd�dd�cddc�cddSctddcdIc�cddc�ddrc�xddc 

c 

cdddddddddcddc�ddcddddcUddd�dd�cddcdd�dddddTˆcdd�cddcdd�dd�dd�cddddddd@‰cUddcddv�cddc�dd�cddc 

c 

cdddddddddcddc�ddcddddcdddd�dd�cddcdd�csRdddIcdd�cddcdd�dd�dd�cddddddd�cddddddI�cddc�dd�cddc 

c 

cddc�ddcddv�ctdScddcdddddd�ddvc�tdScddcdTˆ�cddcddvc�tddcQdvc�‡Pdcdd�dd�cddc�ddIctdddddddvccddc�ddvc�tddc 

c 

cddc�ddcQdAucy8drcddcdddcdd�QdAucy8drcddcQdAuccddcQdAucy8dScxdAucy8dScdd�dd�cddc�Qdd‡8d@wcs9dIccddc�QdAucy8dSc 

c 

cddc�ddc†9dddddSccddcQddcdd�†9dddddS�ddc†9dddddSc†9ddddd@‰ccQddddd@‰cdd�dd�cddc�†9ddddrc�xddccddc�†9ddddd@‰c 

cccccccccccc 

cddc�dd�†RdddH‰ccddc†Rdcdd�c†RdddH‰�dd�†RdddH‰cc†RdddH‰�c†RdddH‰�dd�dd�cddc�c†Rddd�cddccddc�c†RdddH‰ 

dd cdTu c 

cd�dc 

dd cdddTu�cdTˆ c 

cd�dc 

c 

cd�dc‡PdTˆcddddddddcdddTˆdd‡Pdddc‡PdTˆcdddTˆddddddddddddTˆddAcPdTˆc��cd 

c 

cddddddcUdddIcddddddddcdddddddddddScUdddAˆddddddddddddddddddddddddddIc��cd 

c 

cddddddcdd†9dcddcddcdddd�dddddddd�d@‰ddddcsRdddddcdd�dcdddddcdd†9dc��cd 

c 

cd�dcdd�dcddcddcdddd�ddddcdddIcdccddddc�cddddcddctdddddddcdd�dc��cd 

c 

cd�dcdd‡8dcddcddcdddd�ddddddcddcdAˆddddcyPdddddcddcUdccddddcdd‡8dc��cd 

c 

cd�dcQdddScddcddcdd†9dd@‰ddddddScQddd@c9dddddddddddcQddddddddddddSc��cd 

c 

cd�dc†RdH‰cddcddcddc†RH‰cdHcRdH‰c†RdH‰c†RHwsRHcRdddc†RdddHcRHcRdH‰c��cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd c 

dd�dd�dd�dc 

cd c 

dd�dd�dd�dc 

c 

‡Pdddd‡Pdddcdddddcdd‡PdddcdddddddTuyPdddc‡PdddcdddddcdddTcPddddcdddTˆc��cd 

c 

Uddddddddddcdddddcdddd†9dcddddddddddd†9dcUdcddcddcddcdddddddcdScddddIc��cd 

c 

dd�ddddddddddcddcddddcxdcddcddccddddcxdcdddddcddcddcddddddddd‰cdddddc��cd 

c 

ddctddddddddddcddcddddctdcddcddvcddddctdcdddddcddcddddddddcddddddddddc��cd 

c 

Qd‡8dddd�ddddcddcdddd‡8dcddcQdAˆdddd‡8dcddcddcddcddddcdddddcddddcdddc��cd 

c 

†RdddHcRddHcRdcddcdddddddcddc†RddH‰dddddcdddddcddcdHcRddddddddHcRddddc��cd 

cd c 

cddcdd 

cd c 

cddddd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cddddddc 

c 

cQddddSc 

c 

cxddddrc 

c 

QddS 

c 

xddr 

ccccccccccc 

cddc 

c 

dddddTˆccdddddddddddddddc‡PddddTˆc�c‡PTˆc�dddddTˆccddccdddddTˆ�‡PTˆcddddddddc‡PddddTˆ 

c 

ctdd@c9dIccdddddddddddddddcUddHc9dAˆ�cUddIc�ddddddAˆcddccddddddI�UddIcddddddddcUddHc9dAˆc 

c 

cUd@‰c†Rdccddc�cddc�cddc�†9dI�tddddc�dd�s9dIcddccddc�dd�ddddvc�dd�dd�c†9dIc 

c 

‡PdTcPdc�cddr�cddc�cddc�cddc�cxdd�Uddddv�dd�cxddcddccddc�ddctddddIc�dd�dd�xddc 

c 

Uddddddc�cddc�cddddddd�cddc�cddc�dd�dd�dI�dd�ddcddccddddddScUdccddc�dd�dd�cddc 

c 

ddcs9ddcddddcddc�cddddddd�cddc�cddc�ddctddddddvcdd�ddcddccdddddH‰tddddddv�dd�dd�cddc 

c 

dd�cdScddddcddv�cdddcddc�cddc�cddv�ctdScUddddddIcdd�ctddcddccddc�UddddddI�dd�ddvc�tdSc 

c 

ddc‡8d‰c�cQdAuccddrcddc�cddc�cQdAucy8drtddc�cddcdd�y8dScddccddc�dd�ddvcdd�QdAucy8drc 

c 

Qd‡8dddd�c†9dddddSccddddddd�cddc�c†9dddddScUdSc�cddcdddddd@‰cddccddc�ctdd�QdIcdd�†9dddddS 

ccccccccccc 

†Rdddddd�†RdddH‰ccddddddd�cddc�†RdddH‰cdH‰c�cddddddddH‰ccddccddc�cddd�†Rdcdd�c†RdddH‰ 

yPdcdd��dd c 

‡Pdc��dd 

cd c 

Uddv�cyPTcPTu�yPTˆc‡PTˆcc‡PTˆc‡Pdddc�cyPTˆc‡PdTucddc‡PdTˆ 

cd c 

dddI�ddddddddddcddddAc8ddAuy8ddIcUddddcddddddAc8dddddddcUdddI 

cd c 

ctdcddvcddcddcddddcddcdddd�dddd�dcd@‰ddcdddd@‰ddddcddcddcd@‰dd 

cd c 

cUddddIcddcddcddddcddcdddd�ddcddddcdccddcddddrcdddddddcddcd�dd 

cd c 

tddddddcddcddcddddcddcdddd�dddddcdcdAˆddcdddd�dddddddcddcdAˆdd 

cd c 

Ud�s9dcddcddcddddcddcddcdddddddddd‡dddddcdddddddddddddcdd‡ddddS 

cd c 

dd�c†RdddcddcddddcddcddcdddHwsRdddH‚RdddcddddddHcRddddcddH‚RdH‰ 

cd c 

dd 

cd c 

dd 

c 

cd 

cddd cd c 

cddc��c‡8c 

tdddac cd c 

cddc��y8dc 

c 

cdddddcddddddddddcdddTuyPddddddddddddddTcPddddcdddTc8dd†ddddcdddddddTcPddddcdddTˆccd 

c 

cddcddcdddddcddddcddddddddddddddddddddddddddddcddcddddddddddcdddddddddddcdScddddIccd 

c 

cdddddcd�ddcddddcdccddddccddddcddc‡dddddddccdcQdddˆcdcddddddddc‡ddddddddd‰cdddddccd 

c 

cdddddcd�ddcddddcdccddddctddddcddcUdddddddccd�dddIcdcddddddddcUdddddcddddddddddccd 

c 

cddcddcd�ddcddddcdccdddd‡8ddddcddcQdcdddddccdcUdcddcdcQdccddddcQdcdddddcddddcdddccd 

c 

cdddddcd�ddcddddcdccdHcRddHcRddddc†Rddddddccdcdddddcdc†RddHcRdc†RddddddddHcRddddccd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cd 

c 

cddddddc 

c 

cQddddSc 

c 

cxddd@‰c 

c 

Qddr 

c 

xdSc 

cccc 

c@‰c 

c 

c‡Pddc�cddTˆccddd�ddcddTˆccdddc‡PddddTˆc�cddTˆc�ddddddTˆcdddcddddddTˆccddddccdddddddTcPdddddTˆ 

c 

cUdddv�cdddIctddd�ddcdddAˆcdddcUddddddAˆ�tdddIc�dddddddAˆdddcdddddddIctddddccddddddddddddddddI 

c 

cddddI�cddddcUddd�ddcddddIcdddcdd@wccddI�Uddddc�dddc�ddddddcdddcs9ddcUddddv�dd�cdd@wcs9dd 

c 

c‡PdTcPd�tddddd�cddddcdddd�ddcdddddcddddddr�cQdd�dddddv�dddc�Qdddddcddd�†ddcdddddI�dd�cddr�cxdd 

c 

‡8dddddr�Uddcddvccddddcdddd�ddcddddddddddddc�cxddctddcddI�dddc�xdddddcddddddddcdd†9dd�dd�cddc�dd 

c 

Udcs9ddccddddcdddcddIccddddddddd�ddcddddddddddddc�ctddcUddcddd�dddc�tdddddcdddddddddddc†ddvc�dd�cddv�ctdd 

c 

dd�cddccddddˆdddddddvcddcdddddd�ddcddd†9dddddddv�‡8ddcdddddddvcdddcc‡8dddddcddd�cdddddddIc�dd�cddI�cUdd 

c 

ddvcUddv�fddddddddIcddcdddcdd�ddcdddcxddddcddAuy8dddddddddddIcdddcy8ddddddcddd�tddddddddc�dd�cQdd�cddS 

c 

QdAˆdddI�cdd@wccdddcddcdddcdd�ddcddd�QdddcQdddddd@‰dddccs9ddcddddddd@‰dddcddd�Uddc�cddv�dd�c†9ddddd@‰ 

c 

†RddHcRd�cdH‰�cdddcddcdddcdd�ddcddd�†Rddc†RddddH‰cdddc�†Rdcdddddddrcdddcddd�dddc�cddd�dd�†RdddH‰c 

c 

s9dv 

c 

c†9Aˆc 

c 

†9Aˆ 

c†9Aˆc c 

‡Pd@ 

†9Aˆ c 

c‡8d@‰ 

c†9Aˆc c 

‡8d@‰c 

†9Aˆ c 

c‡8d@‰ 

c†9Aˆc c 

‡8d@‰c 

cyPdcddc��dd c‡8d@‰ c‡PdTˆ�†9Aˆ c 

c‡Pddc��cddc 

‡8d@‰c ‡8dddAˆc�c†9Aˆc c 

cUdddv�cyPTcPTˆ�cyPdTˆc‡PdTˆc‡PdTucyPddd�cyPTˆc‡PdTucddvc‡PdTˆc 

c‡8d@‰ c‡8dddddAˆ�†9Aˆ c 

cddddI�dddddddIcddcdddddAc8dddAc8ddddddddddcddcddddAc8dddddddA„8dddIc 

‡8d@‰c cBdddddddAˆc�c†9Aˆc cddd�‡PdddT„PTˆ�‡Pdc�cddc�cddc�dd c 

tddcdd�ddcddcddcddcddcddddd@‰dddddddddd@‰ddcddcddcdddddcddcdd†dd@‰ddc 

c‡8d@‰ c†9dddddddAˆ�†9Aˆ tddd�Ud@c9dd‰dI�UdSc�‡PTˆ�yPTucddcyPdTucddc‡PdTuyPdTˆc‡PdTˆc c 

Udddddvcddcddcddcddcddcddddd�dddddddddd�ddcddcddcddddddddcddcddccddc 

‡8d@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc Udddvcddrc†Rdcddvcddrc�UddIcdddddddddddddddddddcUddddddddIcUdddIc c 

ddddddIcddcddcddcddcddcdddddAˆddddddddddAˆddcddcddcdddddcddcddcddAˆddc 

c‡8d@‰ c†9dddddddAˆ�†9Aˆ ddcdIcdd�QdAˆdS�ddcdcddddccdcddcddcddcddcddcdddddddcddcddc c 

ctdd�cddcddcddcddcddcddcdddddddddddddddddddddcddcdddddcdddddcddddddddSc 

cUd@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc ctdddddcddvcc‡8cxddddr�ddddcddddccdcddcdddddcddcddddddddddcdddddc c 

cddd�cddcddcddcddcddcddcddHcRddHwsRdddHcRddddcddcdddddcddddddddHcRddH‰c 

td@‰ c†9dddddddAˆ�†9Aˆ cUddddddddAuy8dccQdddc�ctdcdddddddccdcddcddcddcdddddcdddccdddddcddc c 

dd 

c‡8@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc cddc�dd†9ddddSccxddSc�c9dddddddddccdcdddddddScdddddddddddddddddddc c 

dd 

c†9dddddddAˆ�†9Aˆ cddc�ddc†RddH‰c�dH‰c�c†RddHcRdddccdcddHcRdH‰cdddddddHcRdHwsRddddc c 

cddddc�‡8@‰ 

cddddc�c‡8@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc c 

dd 

cddddc�‡8@‰ c†9dddddddAˆ�†9Aˆ c 

dd��‡PTˆ 

cddddc�c‡8@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc c 

dddTcPdTˆc‡Pdddddddcddc‡PdTc8ddAcPdddcdddTuyPddTˆc 

cddddc�‡8@‰ c†9dddddddAˆ�†9Aˆ c 

ddddddddAc8ddddddddcddcUdddddddddddddcddddddddddIc 

cddddc�c‡8@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc dd�‡Eˆc�dddTuc c 

dd@‰dddddddd†9dddddcddcdd†dwcddcdddddcdddd�dddddc 

cddddc�‡8@‰ c†9dddddddAˆ�†9Aˆ ctdd�UdIc�dddddd c 

ddrcddddddddc†dddddcddcddc�cddcdddddcdddddddddddc 

cddddcc‡8@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc ‡PddTuyPdTc8dddd�dddv�dc�dd c 

dd�ddcddddddddddddcddcdd‡Pdcddcddcddddddddddcdddc 

cddddc‡8@‰ c†9dddddddAˆ�†9Aˆ UdddddddddddddddctdcdI�dddddd c 

dd�dddd@c9dddddddddddcQdddScdddddddd‡dddddddddddc 

cdddd‡8@‰c †9dddddddAˆc�c†9Aˆc dd�ddd@cRdddc‡dcUdcdd�dddddd c 

dd�csRH‰c†RdddHcRddddc†RdH‰cddHcRdddH‚RdHwsRddddc 

c†9dddddddAˆ�†9Aˆ ddctdddr�cddcUdcdddddvcdc�dd c 

cdddddd‰ 

†9dddddddAˆc�c†9Aˆc dd‡8ddd‡Pddddcdddd�cdIcdc�dd c 

cddddddddddddddddddddddddd 

c†9dddddddAˆ�†9Aˆ ctdddd@c9ddddddddddd�cQdcdddddS c 


†9dddddddAˆc�c†9Aˆc cUd†RH‰c†RHcRddHwsRd�c†9cddddH‰ c 


c†9dddddddAˆ�†9Aˆ cddc c 


†9dddddddAˆc�c†9Aˆc cddc c 


c†9dddddddAˆ�†9Aˆ c 

‡ddddddc 

†9dddddddAˆc�c†9Aˆc c 

c‡8@‰ddddc 

c†9dddddddAˆ�c‡Eˆ�†9Aˆ c 

‡8@‰cddddc 

†9dddddddAˆccUdI�c†9Aˆc c 

c‡8@‰ccddddc 

c†9dddddddAucddd�†9Aˆ c 

‡8@‰�cddddc 

†9ddddddddddddvc�c†9Aˆc c 

c‡8@‰c�cddddc 

‡8@‰�cddddc c†9dddddddddddIc�†9Aˆ c 

dddc��‡PdTˆc�dddc��dddddc 

c‡8@‰c�cddddc †9dddddddddddv�c†9Aˆc c 

dddc��UdddIc�dddc��dddddc 

‡8@‰�cddddc c†9ddddddddddI�†9Aˆ c 

dddddcddddddT„ddˆddc�dddddcddddddTˆdd 

c‡8@‰c�cddddc xddddddddddd�c†9Aˆc c 

ctdddddcdddddddHwƒddSc�ctdddddcdddddddddddTˆc 

‡8@‰ cdddddddddddvc�†9Aˆ c 

cUddcdddddddddˆc‡8d@‰c�cUddcdddddddddcdddddIc 

c‡8@‰c yPddddddddddddIc�c†9Aˆc c 

cdddcddddccdddIcUdd‰�cdddcddddccddddddccddc 

‡8@‰ c9dddddddddddddddv�†9Aˆ c 

cddScddddddddddcdddddddd�cddScdddddddddddddddSc 

c‡8@‰c c†RddddddddddddddI�c†9Aˆc c 

cdH‰cddd†Rdddddddddddddd�cdH‰cddd†RddddHcRddH‰c 

‡8@‰ sRddddddddddddvc�†9Aˆ c 

cddS��c‡dS�cddS 

c‡8@‰c sRddddddddddIc�c†9Aˆc c 

cdddH‰��cdH‰�cdddH‰ 

csRddddddddc��†9Aˆ c 

‡8@‰ 

csRddddddv��c†9AcPTˆ c 

c‡8@‰c 

sRdddI��xddddI c 

‡8@‰ 

sRdd��tddddd c 

c‡8@‰c 

Uddddd c 

dTc8@‰ 

ddddddvc c 

ctddddrc 

sRdddc c 

cUddddvc 

c 

cdddddDc 

c 

tddddH‰c 

ccccc 

ddHw 

dd�‡Pdc�cddc c 

dddc�‡PTˆ�cddd�‡PddddTˆ 

ctdddc�UddI�cdddvc�UddHc9dAuc ddvc�Udda�cddc c 

cddd�c‡PTˆc�dddc�c‡Pddddd�dddddddcddTˆ�cdddcddc�cddd�cddc�cdddddTˆ�ddddddddcddc�cddcdd�ddddddTˆ�‡PdddTˆc 

cUdddv�ctdddd�tdddIc�dd�c†RddTˆccddc‡PdTˆc�QdIc�dd†ddddTˆddc c 

tddd�cUddIc�dddv�cUd@c9dd�dddddddcdddI�tdddcddc�cdddvccddc�cddddddAˆcddddddddcddc�cddcdd�dddddddIc‡8d@c9dAˆ 

c‡PdTcPd�tddcdI�cUddddvc�Udcddv�dd�cdIccddcUdddIc�xddcctdddddddddddc c 

Udddvc�cddddv�ctdddI�cdd‰c†Rd�dd�dddd�Udddcddc�tdddIccddc�cddccs9dIcdd�cddc�cddcdd�dd�ddcUd@‰c†9dI 

‡8d†9dddac�UddcddvccddccdIcctddcddI�dd�cddccddcddcddc�cddvcUdddd�cddddc c 

‡PdTcPdc�ctddcdIc�tddddI�cUdcddvc�cdddTu�dd�dddd�ddddcddc�Udcddvcddc�cddc�xddcdd�cddc�cddcdd�dd�ddcddr�cxdd 

UdScxdd†dddddcddddddIctddddddvcUddddddcddddcdd�cQddddScQdddd‡PdddcQdIcddc‡ddddddddc c 

c‡8d†9ddda�cUddcddv�Ud�dd�tddcddIc�cdddddTˆ�dddddddcdddd�ddddcddcctddcddIcddc�cddc�cddcdddddddccddddddddcdd�dd�ddcddc�dd 

ddrccddcdddddˆddddddd‡8ddddddAˆddddddd‡ddddcdd�ddcxddddrc†dddddddddcxddcddcUddddddddc c 

cUdScxdd†dddddcddddddIctddddddvcUddddddcdddd�‡ddddAˆcdddddddcddcddddcddcddccUddddddcddc�cddc�cddcdddddddccddddddddcdd�dd�ddcddc�dd 

Qdvctddc�fdd@wcs9dddd�dddd@wcs9dd`�Qd�dd�dddScddd�d@wc�QdddScdd�dddddc c 

cddr�ddcdddddˆddddddd‡8ddddddAˆddddddd‡ddddcdd`�ddIcdd�ddcddddcddcddctdddddddcddc�cddc�tddcdd�cddc�cddcdd�dd�ctddcddv�ctdd 

xdAc8ddd@c�cddr�cxdddS�ddddrc�xddc�xddddddS�Qddrcxdddddr�xdddrcQddddddddc c 

cQdvctdd�cfdd@wcs9ddddc�cdddd@wcs9dd`c�cddc�ddScdd�ddcQdddcddcddcUd@wcs9ddddc�cddccy8dScdd�cddc�cddcdd�dd�y8dScQdAucy8dS 

cddddddH‰c�cddc�ddH‰�dddd�cddc�cdddddH‰�cddc�dddddc�cddd�†Rdddddddc c 

cxdAc8ddd@�ddrc�xddddc�cQdddr�cxdd�cQddddd@‰cdddddddcddcxddScddcddcddrc�xdddddddddcdddddd@‰cddddddddcddc�cddcdd�dddddd@‰c†9ddddd@‰ 

c‡8dSc c 

ddddddH‰�dd�cddddc�c†Rddc�dd�c†RdddH‰�dddddddcdd�dH‰cddcddcdd�cdddddddddcdddddH‰�ddddddddcddc�cddcdd�dddddH‰c�†RdddH‰c 

cc 

c8dH‰c 

c 

c‡P@ 

c 

‡8@‰ 

c 

c‡8@‰c 

cAˆc c 

‡8@‰ 

cQAˆ cddc dd�dcdddd cdTˆ�dd�cd�cd c 

c‡8@‰c 

c†9Aˆc cddc dd�dcdddd cddAˆcdd�cd�cdvc c 

‡8@‰ 

‡PTˆ †9Aˆ cdd‡PdddcdddTˆcdddTˆcdddTcPddddcdd‡PdddcdcddddcdddTuyPdddc�cdddIcdd�cdddddcdcdddddddIcdddTcPddddcdddTˆ c 

c‡8@‰c 

cddc ‡8@‰ c‡8ddAˆc��c†9Aˆc cddddddScd@‰dIcddcdAˆddddddddddcdddddddcdcddddcddddddddddc�cddddcdd�cddcdScdcddcddddScdddddddcdScddddI c 

‡PddTˆ 

cddc c‡8@‰c cUddddAˆ †9Aˆ cddddddccdrcddcdScdddddddddd�dcdddd�dcdcddddcd�ddcddddc�cddddddd�cQdddccdcddcddcdrtddddddddd‰cddddd c 

UddddAˆc 

‡8@‰ cQdddddAˆc��c†9Aˆc��cddcdddIcdvcddcd�dddddddddd�dcdddd�dcdcddddcd�dddddddc�cdd†9ddd�dddIcdcddcddcdcUdddddcdddddddddd c 

dd�‡dA„Pdddc‡PddTcPdddcdddddddTcPdddTˆddcdddTuyPddd 

c‡8@‰c c†9dddddAˆ †9Aˆ��cddddcddcdAˆddcdAˆdddddcdddd�dcdddd�dddcddddcd�ddddcddv�cddcxddd�cUdcddcdcddcddcd‡ddcdddddcddddcddd c 

ddddd‰ƒdddddcUdddddddddcdddddddddddddddddcdddddddddd 

‡8@‰ †9dddddAˆc��c†9Aˆc��cdddddddcdddddcddddHcRddHcRd�dcdHcRddHcdcddddcd�dddddddd�cddccddd�cdddddcdcddcddcdH‚RddddddddHcRdddd c 

c‡ddddd‰ddddcddccdcddddcddcddccddddccddddcdccddcdddd 

c‡8@‰c c†9dddddAˆ †9Aˆ cd c 

dd…c‡dddddddcddctddddddcddcddvcddddvcddddcdccddddddd 

‡8@‰ †9dddddAˆc��c†9Aˆc cd c 

QdAc8ddddcddcdd‡8dddcddcddcQdAˆddddAˆddddcdccddddcddvc 

c‡8@‰c c†9dddddAˆ †9Aˆ c 

†RdddHcRddddddddddddddddddc†RddH‰ddddHcRdcdccddddddddc 

‡8@‰ †9dddddAˆc��c†9Aˆc c 

cddc 

c‡8@‰c c†9dddddAˆ †9Aˆ c 

cddc 

†9dddddAˆc��c†9Aˆc c 

‡8dr 

c†9dddddAˆ †9Aˆ cddc�cddddTˆc c 

c‡8dSc 

‡8d@‰c †9dddddAˆc��c†9Aˆc cddc�cdddddIc c 

cddc��cd 

c‡8d@‰ c†9dddddAˆ †9Aˆ ddddTcPddddddddddd�sRdc c 

cddc��cdvc 

‡8d@‰c †9dddddAˆc��c†9Aˆc dd†9ddd@cRdddcdddd c 

ddddddddTcPddddcdccdTcPdddddA„PdddcddddTcPdddc 

c‡8d@‰ c†9dddddAˆ †9Aˆ dd�dddr�cdScdddd c 

dd†9ddcdddd†9ddcdccdddd†RH‰d†9dcddcddcddddcddc 

‡8d@‰c †9dddddAˆc��c†9Aˆc ctdd‡8dddcdddd‰cdddd�yPdc c 

ddcxdddddddcxddcdccddddc�cd�ddddcddddccddddc 

c‡8d@‰ c†9dddddAˆ †9Aˆ cUdddddddcddddddd@‰dddddSc c 

dd�ddc‡dddccddcdccddddcyPddcUdddd�‡ddddddddc 

‡8d@‰c †9dddddAˆc�cAˆc�c†9Aˆc cddddHwsRdHcRdddH‰cddddH‰c c 

dd�dd‡8dddddddcddddddddddddcddcdd‡Pd‰ddddcddv 

c†9dddddAˆ�tdIc�†9Aˆ cddc c 

dd�dddHwsRddddcddddHcRddHcRddddddddddHcRddddd��c‡8d@‰ 

†9dddddAˆc�Uddv�c†9Aˆc cddc c 

‡8d@‰c 

c†9dddddAˆctdddI�†9Aˆ c 

c‡8d@‰ 

†9dddddAc8dddd�c†9Aˆc c 

‡8d@‰c 

c†9dddddddddddvc�†9Aˆ c 

c‡8d@‰ 

†9ddddddddddIc�c†9Aˆc c 

‡8d@‰c 

c†9ddddddddddv��†9Aˆ c 

cduy8d@‰ 

†ddddddddddI��c†9Aˆc c 

tdddd@‰c 

yPdddddddddddd��†9Aˆ c 

Uddddr 

‡Pddddddddddddddvc��c†9Aˆc c 

dddddv 

8dddddddddddddddIc��†9AuyPdc c 

ctdddddd 

csRddddddddddddddv��c†9ddddc c 

cUdddHwc 

sRdddddddddddI cddddc c 

cdHw 

c 

sRdddddddddd��c‡8ddddv 

c 

csRdddddddvc��c8dddddI 

sRdd c 

csRdddddIc 

c 

sRdddc 

c 

csdc 

c 

cyPddTˆc�c‡Pd�cyPddTˆc�c‡Pd�dddddTˆc�‡PddTu�cdddddTˆ�ddcddd�dd�cdTˆ 

c 

ddddddAˆ�cUddvc�ddddddAˆ�cUddvc�ddddddAˆc‡8ddddddccddddddAˆcddcdddvc�dd�tddI 

c 

ddˆcs9dI�tdddIcctdd�cddI�tdddIc�dd�s9dIcUd@wccddvcddccs9dIcddcdddAˆ�dd�Udddvc 

c 

ddAucƒdd�UdcddccUdS�cddd�Udcddc�dd�ddcddr�cQdIcddc�cddcddcddddI�dd�ddcdIc 

c 

Qddddd…cctddcQdvcddr�ctddcQdv�dd�y8dScddc�cxddcddccy8dScddcddcddvcddctdScddv 

c 

†RddddAˆcUddc†dIcddc�cUddc†dI�dddddd@‰cddc�ddcdddddd@‰cddcddcQdAˆddcUd‰cddI 

c 

s9dIcdddddddcddv�Aˆcdddddddvcdd†9dd�cddc�ctddcdddddH‰�ddcddc†9ddddcddddddd 

c 

dTˆc�ddcddccs9ddddAˆcctdAˆddccs9dIcddc†9dAˆcddv�‡8dScddc�ddcddccxdddddd@w�ddvc 

cddcc‡Pddddd�‡PddddTˆ�dddddTˆcddddddddcddd�cddcdd�cdddddTˆcddccddc�dd�dTˆc�dd�c‡PTˆc�dTˆc�dd c 

QdAuy8ddddSc�xddcddAuy8ddddSc�xddcdd�†9dIcQdAuy8ddrcddc�ddcddc�Qdddddrc�QdIc 

cddccUd@c9dd�UddddddI�ddddddIcddddddddcdddvccddcdd�tdd@c9dIcddccddc�dd�ddAˆ�dd�cUddIc�ddIc�dd c 

†9dddd@cRH‰c�cddcddddddHcRH‰c�cddcdd�c†Rdc†Rddddddccddc�ddcddc�†Rdddd�†Rdc 

csRdHw cddccdd‰c†Rdctdd�ddvcdd�cddcdd�cdddAˆcddcdd�Ud@‰c†Rdcddccddc�dd�dddI�dd�cddddv�dddv�dd c 

c†RddH‰c��csRdHw 

c 

cddccdddTu�cUdS�QdIcdd�cddcdd�cddddIcddcdd�ddrc�cddccddc�dd�ddddvcdd�tddddI�dddAˆcdd 

c 

cddccdddddTˆcddr�xddcddddddScddddddddcddcddcddcdd�dd�cddccddc�dd�ddddAˆdd�Ud�dd�ddddAˆdd 

c 

cddc�‡ddddAˆddv�tddcdddddH‰cddddddddcddcQddddcdd�dd�cddccddc�dd�dd†9ddddctddddddvc�ddcddddd 

c 

cddccdd`�dddddI�UdScdd�dd�cddc†9dddcdd�ddvc�dddddccddc�dd�ddcxddddcUddddddIc�ddcQdddd 

c 

cddccddc�dd@‰dd�ddrcdd�dd�cddccxdddcdd�QdAu�ddcddccddc�dd�dd�Qdddcddc�cddv�ddc†9ddd 

c 

cddccQddddd@‰cQddddddS�dd�ddddddddcddc�Qddcdd�†9dddddScddccddddddddd�dd�†9ddcddc�cQdI�dd�†9dd 

c 

cddcc†RdddH‰�†RddddH‰�dd�ddddddddcddc�†Rdcdd�c†RdddH‰cddccddddddddd�dd�c†Rddddc�c†Rd�dd�c†Rd 

c 

c‡P@ 

c 

‡8@‰ 

cddc c 

c‡8@‰c 

cddc ‡8@‰ tdrc c 

‡PddTˆ 

cddc c‡8@‰c US Aˆ c 

UddddAˆc 

‡8@‰ ctdr QAˆc c 

dd�‡dA„Pdddc‡PddTcPdddcdddddddTcPdddTˆdddddddc‡Pddd 

c‡8@‰c cUSc †9Aˆ c 

ddddd‰ƒdddddcUdddddddddcddddddddddddddddddddddc8dddd 

‡8@‰ tdrc c†9Aˆc c 

c‡ddddd‰ddddcddccdcddddcddcddccddddccddddddccd�dddd 

c‡8@‰c US��c‡Eˆ�†9Aˆ c 

dd…c‡dddddddcddctddddddcddcddvcddddvcddddddccdcUdddd 

‡8@‰ ctdr��‡8dAˆc�c†9Aˆc c 

QdAc8ddddcddcdd‡8dddcddcddcQdAˆddddAˆddddddccdcddcddvc 

c‡8@‰c cUSc�c‡8dddAˆ�†9Au c 

†RdddHcRddddddddddddddddddc†RddH‰ddddHcRdddccdcddddddc 

‡8@‰ tdrc�cUdddddAˆc�c†9dTˆ c 

cddc 

c‡8@‰c US��cQddddddAˆ�†9dAˆc c 

cddc 

ctdr��c†9ddddddAˆc�c†9dAˆ c 

‡8@‰ 

cUdc��†9ddddddAˆ�†9dAˆc c 

c‡8@‰c 

‡8@‰ tdSc��c†9ddddddAˆc�c†9dAˆ ‡Pdc�cddddcdc cddd c 

dc�dd�dc�cddc 

c‡8@‰c cy8drc †9ddddddAˆ�†RdAˆc Uddv�cddddcdv cdd‰ c 

dc�dd�dc�cddc 

cddddd c†9ddddddAˆc�s9Aˆ dddI�ddddddddddddcddddddddcddddTcPddddddddddTˆcddddddddcddddcdddddc c 

dddddcdddddcdddddcdcdddddcdddddddTcPddddcdddddcdddTuyPdddcddddTcPddd�‡8@‰ 

cdddddvc †9ddddddAˆ�c†9Aˆc ctddddvcd@cRdddddcdrcdddddcddcddcddddcddcdddddcdIcdddddcddcddcdcddcddc c 

dd†9dcddcddcddcddcdcd@‰ddcddddd†9ddd@‰ddcddcddcd@‰ddddcddcddcddddcdd�c‡8@‰c 

cQddddDc c†9ddddddAˆc�†9Aˆ cUddddIcdr�cddddcdccd�‡ddddcddcdddddddcdddddddScdcc‡ddddcQdddcdddddc c 

ddcxdcdddddcddcddcdcdrcddcddcddcxdddrcddcdddddcdrcddcddddcdddddcdddd�‡8@‰ 

cxddd@‰c †9ddddddAˆ�c†9Aˆc��tddddddcdvcddddddcdccd�Uddddcddcddc‡dddcddddccd�dccUddddc†dddddddddc c 

dd�dcdd�dcddcddcdcdvcddcddcddccdddvcddcddc‡dcd�dddddddcc‡dddddddd�c‡8@‰c 

ddH‰ c†9ddddddAˆc�†9Aˆ��Ud�s9dcdAˆddddddcdvcd�ddcddcddcdddd‰ddcddcdddd@cdccddcdddddddddddddc c 

QddddcQddddcddcddcdcdAˆddcddcQddddcdAˆddcdd‡8Scd�ddddcdd‡Pd‰ddddcddvc�‡8@‰ 

dw †9ddddddAˆ�c†9Aˆc��dd�c†RddddHcRdddcddcd�dddddcddcdHcRdddcddcdddH‰cdccddddHcRddHcRddddc c 

†Rdddc†Rdddcddcddcdcdddddcddc†RdddcdddddcdddH‰cd�dddddddddddddddddddcc‡8@‰c 

‡8@‰ c†9ddddddAˆc�†9Aˆ c 

cddcdd 

c‡8@‰c †9ddddddAˆ�c†9Aˆc c 

cddddd 

c†9ddddddAˆc�†9Aˆ c 

‡8@‰ 

†9ddddddAˆ�c†9Aˆc c 

c‡8@‰c 

c†9ddddddAˆc�†9Aˆ c 

‡8@‰ 

†9ddddddAˆ�cddcc†9Aˆc c 

c‡8@‰c 

c‡PddTˆc�cddd�cddddddTˆcc‡PTˆc c†9ddddddAˆc�tddc�†9Aˆ cddddddcdddddd c 

‡8@‰ 

cUddddIc�tddd�cdddddddIccUddIc †9ddddddAˆ�Uddv�c†9Aˆc cyPTˆc‡PTˆ�cyPdcdcsRddcdd c 

c‡8@‰c 

cddccdSc�Udddvccddc�cddctddddc c†9ddddddAucdddI�†9Aˆ ddddAc8ddAcPddddcd�dddd c 

‡8@‰ 

cddddd�ctddcdIccddc�cddcUddddv †9ddddddddddddvc�c†9Aˆc d@‰ddddccddddc‡dcd�dddddddd c 

c‡8@‰c 

cdddddAu�cUddcddvcdddddddScdd�dI c†9dddddddddddIc�†9Aˆ ctdrcddddddddddcUdcd�ctdddd c 

‡8@‰ 

cddcs9ddddddcddddddIcddddddH‰tddddddvc †9dddddddddddc�c†9Aˆc cUdccddddcddcdScddcd�y8dcdd c 

c‡8@‰c 

cddc�ddddddˆdddddddcddc�cUddddddIc c†9ddddddddddv�†9Aˆ cdddddddddddddrcddcdddddScdddddddc c 

‡8@‰ 

cddcy8d@wccfdd@wcs9ddddc�tddc�cddc cddddddddddI�c†9Aˆc cddddHwsRdHcRd�ddcddddH‰cdddddddc c 

c‡8@‰c 

cQdddd@‰�ddrc�xddddc�UdSc�cddv cy8dddddddddddvc�†9Aˆ cd@w c 

‡8@‰ 

c†RddH‰c�dd�cddddc�dH‰c�cddd cdddddddddddddddIc�c†9Aˆc c@‰c c 

c‡8@‰c 

cddddddddddddddddc�†9Aˆ c 

‡8@‰ 

c9dTuc sRdddddddddddddv�c†9Aˆc c 

c‡8@‰c 

c†RdddTu sRdddddddddddI��†9Aˆ c 

‡8@‰ 

sRdddTuc csRdddddddddvc�c†9Aˆc c 

c‡8@‰c 

csRdddTu csRdddddddIc��†9Aˆ c 

‡8@‰ 

sRdddTuc sRdddddc��c†9Aˆc c 

c‡8@‰c 

csRdddTu sRdddv��†9Aˆ c 

‡8@‰ 

sRdddTuc csRd��c†9Aˆc c 

cdTc8@‰c 

csRdddTu †9Aˆ c 

cddddr 

sRdddTuc c†9Aˆc c 

tddddv 

csRddTuc †9AuyAˆc c 

UddddI 

sRddTu cxddddIc c 

dddddd 

csRddTuc ctdddddc c 

dHwc 

cUdddddc c 

csRdddTu�cdTˆ 

cddddddv c 

sRdddTˆddAˆc 

csRddd c 

csRdddddAˆ 

dddddI c 

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

dc dddddd c 

dc 

dw cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

dc�cddc�dd�‡PdddTˆccddcdddc�cddc�dTˆc�dc 

cd�dddddc�ddddddddcddˆ�cddcdd�c‡ddddˆccddccddc�dd�ddˆc�dd�c‡dd��dddd�c 

dc�cddc�dd�UdddddIccddcdddv�cddcctddIc�dc 

cd�dddddddcddddddddcddI�cddcdd�‡8ddddAˆcddccddc�dd�ddIc�dd�cUddvc�ddddddddc 

dc�cddc�dd�dd�cddccddcdddAˆccddccUdddv�dc 

cd�dd�cddcdd�cdddvccddcdd�Ud@ws9dIcddccddc�dd�dddv�dd�cdddIc�ctdd�ddc 

dc�cddc�dd�dd�gddccddcddddIccddccddcdI�dc 

cd�dd�cddcdd�cdddAˆcddcdd�ddrcc†Rdcddccddc�dd�dddAˆcdd�tddddv�cUdS�ddc 

dc�cddc�dd�Qdddd‰�cddcddcddvcddctdScddvc�dc 

cd�dd�cddcdddddddccddddIcddcdd�dd�cddccddc�dd�ddddIcdd�Ud†9dI�cddr�c 

dc�cddc�dd�†RddddTˆcddcddcQdAˆddcUd‰cddIc�dc 

cd�dddddddcdddddddccddcddcddcdd�dd�cddccddc�dd�ddcddcddctddc†dd�cddc�ddddc 

dc�cddc�dd�csRddIcddcddc†9ddddcdddddddc�dc 

cd�ddddHw�dd�cddcQddddcdd�dd�Aˆcddccddc�dd�ddcQddddcUddddddvc�cddv�ddddc 

dc�cddc�dd�dTˆcc‡ddcddcdd�xdddddd@wccddv�dc 

cd�dd�dd�cddc†9dddcdd�ddvcctdIcddccddc�dd�ddc†9dddcddc�cdIc�cQdAˆcc‡ddc 

dc�cddc�dd�ddAuy8dScddcdd�cQdddddr�cQdI�dc 

cd�dd�dd�cddccxdddcdd�QdAuy8dScddccddc�dd�dd�xdddcdSc�cddv�c†9dAuy8ddc 

dc�cddddddddd�ddddddH‰cddcdd�c†Rddddc�c†Rd�dc 

dddc dc cd�dd�ddddddddcddc�dddcdd�†Rdddd@‰cddccddddddcdd�dd�cddddH‰c�cddd�†Rddddddc 

dc 

cd cddd‰c cddd�c 

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddc 

cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

Figura 3. Esquema de las rutas de biosíntesis de penicilina y lisina en 

P. chrysogenum. Divergencia de dichas rutas a partir del ácido α-aminoadípico. 

Finalmente, el mutante disrupcionado mostró niveles 

de producción de penicilina, en medio definido de producción 

con lisina 4 mM, que fueron el doble de los 

observados en la cepa parental a las 96, 120, y 144 h y 

aproximadamente tres veces superiores a las 168 h. 

(Figura 4C) [24]. 

b) Expresión intracelular de la hemoglobina de 

Vitreoscilla. La biosíntesis de cefalosporina C incluye tres 

reacciones de oxidación. Así el incremento de la concentración 

de oxígeno intracelular, por expresión del gen de 

la hemoglobina de Vitreoscilla (VHb), podría llevar a 

mayores títulos de cefalosporina: i) por incorporación 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c‡PddddTˆc 

‡8ddddddAˆ c 

cdddddddTu 

UddddddddI c 

cddddddddddc 

ctdd@w�cddS c 

cddddddddddc 

cUddrc�cdH‰ c 

cddd�dddc 

cddd c 

cddd�dddc 

cddd c 

cddddddddddc 

cdddvc c 

cddddddddddv 

cQddIc�‡Pdd c 

cddddddddddI 

cxdddccy8ddd c 

cddd�cddd 

QddddddddS c 

cddd�cddd 

†Rdddddd@‰ c 

cddddddddddS 

sRdddH‰c c 

cddddddddd@‰ 

c 

cddddddddH‰c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c 

c‡8c�‡PdTˆc 

c 

y8dcc‡8dddAˆ 

c 

cddddccBdc�dI 

yPTu��cyPTuc ‡Pdc cdH‰dcc†9cctdS c 

c‡Pd 

dc�‡8dr�cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

‡8dd��cddddddc��dddddd��c‡8ddc 

dc�c‡8dSc�cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

c‡8ddd��cddddddc��Qddddd��cUdddc 

dc�‡8dH‰c��cddc d 

cUdddd��cdHw‡ddc��†9ˆddS��tddddc 

c‡8dSc��cxdddc��c‡8ddddc dcc‡8d cddc d 

cdH‰dd 

‡8ddrc��dddI��cUddcddv dccUdddddd��cddc d 

dd 

dd��cddddddI dccddddddd��cddc d 

dd��c‡8ddd 

dTucdd��cddddddS cddc d 

dd��cUdd 

cddr cddc d 

dd��tddddddc��QddddS 

cddc cddc d 

dd��dddddddc��†RddH‰ 

d 

cddc 

d 

cddc 

d 

cddc 

d 

cddc 

d 

cddc 

d 

cddc 

d 

cddc d 

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd cddc d 

dc 

dd c‡8c�‡PdTˆc��cddc d 

dc 

dd ‡8dc�UdddAˆ��cddc d 

dc 

dd c‡8ddcctd@c9dI��cddc d 

dc 

dd c8dddccUdrcxdd��cddc d 

dc 

dd dccddc�dd��cddc d 

dc 

dd dccddc�dd�cddddddddc d 

dc 

dd dccQdv�dd��cddc d 

dc 

dd dccxdAucdS��cddc d 

dc 

dd cyPddTuc��dc�Qddd@‰��cddc d 

dc 

dd yPddddddddTu�dc�†RdH‰c��cddc ‡Pdc d 

dc 

dd ‡Pdddddddddddddc cddc Uddv d 

dc 

dd UddHwc�csRddc cddc ctdddI d 

dc 

dd dHwc�csdc cddc ‡8ddddvc d 

dc 

dd cddc cy8dddddIc d 

dc 

dd cddddddddddTˆc cddc c‡Pddddddddc d 

dc 

dd cdddddddddddIc cddc y8ddHw d 

dc 

dd cdd@wcs9ddcddc cddc yPddHw d 

dc 

dd cddc�cxddcddc cddc ‡PddHw d 

dc 

dd cddAuc�ddcddc cddc cy8d@w d 

dc 

dd cQdddddddddddc cddc cyPddH‰c d 

dc 

dd c†RdddddHcRddc cddc cyPddHwc d 

dc 

dd c‡dddc cddc c‡Pdd@wc d 

dc 

dd y8dddddd cddc y8ddH‰ d 

dc 

dd cddddddddd cddc yPddHw d 

dc 

dd cddddddddd cddc ‡PddHw d 

dc 

dd cddˆ cddc cy8d@w d 

dc 

dd cQdAuc cddc cyPddH‰c d 

dc 

dd dddddddd cddc ‡EˆccyPddHwc d 

dc 

dd cUdddddddd cddc UdAcPdd@wc d 

dc 

dd cdd@wc cddc ctddddddH‰ d 

dc 

dd cddc cddc ‡8dddd@w d 

dc 

dd cddAuc cddc Uddddd d 

dc 

dd cddddddddd cddc ddddddIc d 

dc 

dd gddddddddd cddc cyPddddddddc d 

dc 

dd ddd‰ cddc cyPddHwc d 

dc 

dd dddddTuc ddddTˆ��cddc c‡PddHwc d 

dc 

dd csRdddddTu dd†9dI��cddc y8d@wc d 

dc 

dd sRdddddd ddc†dS��cddc yPddH‰ d 

dc 

dd sRdd dddddc��cddc yPddHw d 

dc 

dd ctdddddI�cddddddddc ‡Pdd@w d 

dc 

dd cddddddddddTˆc�cUdc�dd��cddc cy8ddH‰c d 

dc 

dd cdddddddddddIc�cQdc�dd��cddc cyPddHwc d 

dc 

dd cdd@wcs9ddcddc�cxdddddS��cddc c‡PddHwc d 

dc 

dd cddc�cxddcddc��ddddH‰��cddc y8d@wc d 

dc 

dd cddAuc�ddcddc cddc yPddH‰ d 

dc 

‡PdddddddTuc dd cQdddddddddddc cddc yPddHw d 

dc 

Uddddddddddddd dd c†RdddddHcRddc cddc dd�‡Pdd@w d 

dc 

ddddddddddddddvc dd dddc cddc ctddcy8ddH‰c d 

dc 

dddddddddddddddc dd cddddddddd cddc cUdddddHwc d 

dc 

Qdddddddddddddrc dd cddddddddd cddc tddddd d 

dc 

†9dddddddddddd ddcyAˆ dddTcPdd�cddc cdddddddddvc cddc c‡8dddddvc d 

dc 

dddddddddˆ dddddA dddddddd�cddc ddIc cddc cBdddddddc d 

dc 

cUdddddddddAuc ctddddd‰ dddddddddddddddddc ctddSc cddc dd@w d 

dcc‡PdddTu 

tddddddddddddd cUdddddddddddddddddd�ctddddcdddd@‰ddddddc y8dd‰c cddc cUd@‰c d 

dccUdddddddddddc 

9ddddddddddddd cQdddddddddddddddddd�cUdddddddddccddˆcddc cddddddddddddc cddc td@‰ d 

dccQddddddddddSc 

†9dddddddddddS cxdddd cdddcddddddAˆddAˆddc cddddddddddddc cddc c‡8@‰c d 

dcc†RddddddddH‰c 

c†RdddddddddH‰ ddddd@ cQddddddddddddddddSc cddc ‡8dr d 

dc 

dd†RH‰ c†RddHcRdddddddddH‰c dTuc�cydc cddc c‡8dSc d 

dc 

dd dddTuc�yPddSc cddc cUd@‰c d 

dc 

dd cs9ddddddddddH‰c cddc td@‰ d 

dc 

dd †RdddddddHwc cddc c‡8drc d 

dc 

dd cddc ‡8dS d 

dc 

dd cddc Ud@‰ d 

dc 

dd cddc ctd@‰c d 

dc 

dd cddc ‡8@‰ d 

dc 

dd cddc c‡8drc d 

dc 

dd cddc cUdS d 

dc 

dd yAˆcddddTˆ cddc td@‰ d 

dc 

dd cddd@cdddddI cddc c‡8@‰c d 

dc 

dd tdd@‰cdd†9ddvc��ddddTˆ��cddc ‡8dr d 

dc 

dd Ud@‰�ddcxddIc��ctd@c9dI��cddc c‡8dSc d 

dc 

dd ddrc�dd�Qddc��cUd‰c†dS��cddc cUd@‰c d 

dc 

dd dd�dd�cddc��cddddddc��cddc td@‰ d 

dc 

dd ddvc�UdSc��cdd@c9dI�cddddddddc c‡8drc d 

dc 

dd QdAu�ddrc��cddrcxdd�cddddddddc ‡8dS d 

dc 

dd †9ddTucyPddS��cQdc�dd��cddc Ud@‰ ‡PddTˆ d 

dc 

dd c†9ddddddd@‰��cxdddddS��cddc ctd@‰c UddddAˆc d 

dc 

dd †RdddddH‰c ddddH‰��cddc ‡8@‰ ddddddIc d 

dc 

dd cddc c‡8drc dddddddc d 

dc 

dd cddc cUdS dddddddc d 

dc 

dd cddc td@‰ ddddddddTu d 

dc 

dd cddc c‡8@‰c ctdddddHcRdddTuc d 

dc 

dd cddc ‡8dr ‡8dc�sRdddTuc d 

dc 

dd yd cddc UdSc c‡8dSc�csRdddTu d 

dc 

dd c‡Pddddddd cddc ctd@‰c ‡8d@‰c��csRdddTu d 

dc 

dd cUdddddddd cddc ‡8@‰ c‡8d@‰ sRddTu d 

dc 

dd cddccdd†9dvc cddc c‡8@‰c cUd@‰c sRdddTuc d 

dc 

dd cddvcddccdIc cddc y8dr td@‰ sRdddTuc d 

dc 

dd cddAˆdd‡8ddc cddc ddddSc c‡8@‰c csRdddTu d 

dc 

dd cQddddddddSc cddc ctddd@‰c ‡8dr csRdddTuyPdddTˆc d 

dc 

dd c†RHwsRddH‰c cddc ‡8dddc c‡8dSc csRdddddddddIc d 

dc 

dd cddc UddddI ‡8d@‰c s9dddddddc d 

dc 

dd ‡Pdddddd cddc ctddddddvc Ud@‰ cxdddddddv d 

dc 

dd c‡8ddddddd cddc cddddddddc��ctd@‰c dddddddAuc d 

dc 

dd cUdddddddd cddc cxdd@w ‡8@‰ d@wcs9ddddTu d 

dc 

dd cddc cddc ctd@‰c c‡8drc dr�cxd†RdddTu d 

dc 

dd cddc cddc cUdr ‡8dS cyPddc�dccsRddddTuc d 

dc 

dd cddddddddd cddc tdSc c‡8d@‰ cyPddddddc�dv�sRdddTuc d 

dc 

dd cddddddddd cddc Udrc cUd@‰c cyPdddddHwcsRdT„PddAˆc�sRdddTuc d 

dc 

c‡PddddddTuc dd cdddTˆ�‡Pdccddc�cddc cddddddddd cddc ctdS td@‰ yPdddddHwc�csRHws9dAˆ�csRdddTu d 

dc 

‡8dddddddddddTˆc�‡PddddddTu ddcyAˆ tddddI�c‡8ddccddc�cddc cddc cUdr c‡8@‰c��cyPdTˆ�yPdddddHwc †9dAˆc�csRdddTu d 

dc 

UdddddddddddddAˆ�Uddddddddddddc dddddA dddddd�cUdddccdd‡Pdcddddd dddddddddddd cddc tdSc ‡8@‰ d@ws9AucyPdddddHwc c†9dAˆ�csRdddTu d 

dc 

dddddddddddddddI�dddddddddddddc ctddddd‰ ‡ddS�cddddccddddScdddddvc dddddddddddd cddc Udrc��c‡8drc dr�xddddddHwc †RdAuc��sRdddTucc‡PdTˆ d 

dc 

dddddddddddddddd�Qddddddddddddc cUdddddddddddddddddd�c‡8d@‰�cddccddddrcddcddIc ‡Pdc��cddc ctdS ‡8dS dc�cd@w s9dTˆc��sRdddTc8dddAˆc d 

dc 

dddddddddddddddS�†RdddddddHwc cQdddddddddddddddddd�‡8dd‰c�cddccddddvcddcdddc dddddddddddd c‡8ddc��cddc ‡8dr Ud@‰ ctdv�tdrc c†9dAˆ��csRdddddddIc d 

dc 

Qddddddddddddd@‰ cxdddd UddddddddccddccddddIcdddddSc dddddddddddd cUdddc��cddc UdSc��ctd@‰c ‡8dAuy8S †9dAˆc dddddddc d 

dc 

†RdddddddddddH‰c ddddd@ dddddddddccddccdHcRdcddddH‰c tddddc��cddc ctd@‰c��‡8@‰ c‡8dddddH‰ c†9dAˆ dddddddc d 

dc 

sRdddHwc dd†RH‰ ‡dSc c‡8dcddc�cddddddddc cUdr��c‡8@‰c y8d@wc †RdAuc��QdddddSc d 

dc 

dd dH‰c dddddddddddd��cUddcddv�cddddddddc tdSc��‡8dr ‡PddH‰ s9dTˆc��†9ddd@‰c d 

dc 

dd dddddddddddS��cddddddd��cddc Udrc��c‡8dSc��c‡8d@w c†9dAˆ��c†RdH‰ d 

dc 

dd ‡dˆccddc cddr��cddc ctdS��cUd@‰c��‡8d@‰c †9dAˆc d 

dc 

dd c‡8dIccddI cddc��cddc ‡PdTˆc cUdr��td@‰��cy8d@‰ c†9dAˆ d 

dc 

dd cUdddccQddvc cddc c‡8dddAˆ tdSc��c‡8@‰c��c‡PddH‰c †RdAˆc d 

dc 

dd cddc�cxddIc cddc cUdddddAuc��c‡8drc��y8@‰��‡8d@wc s9Au d 

dc 

dd cddv�ddSc cddc cdddddddddTu��y8dS�ddddddrc��c‡8d@‰ c†9dTˆ d 

dc 

dd cQdAuc�ddrc cddc cdddddddddddddddddddddddd‰�ddddddvc��y8d@‰c †9dAˆc d 

dc 

dd c†9ddddddS cddc cdddddd@wc�sRddddddddddddddddddddddddddIc�‡PddH‰ c†9dAˆ d 

dc 

dd †RddddH‰ cddc tddddd@‰��c‡d@wccsRddddddddddddc�c‡8d@w †RdAˆc d 

dc 

dd cddc c‡8d@cRH‰c��cUdr�s9ddddddSc�‡8d@‰c s9Au d 

dc 

dd dddddddddddd cddc ‡8d@‰c tdSc�c†9dddd@‰c�cy8d@‰ c†9dTuyduc d 

dc 

dd dddddddddddd cddc c‡8d@‰ Udrc��†RddH‰�c‡PddH‰c †9dddddTˆc d 

dc 

dd cddc ‡8d@‰c ctdS ‡8d@wc cxd@wcs9Ic d 

dc 

dd cddc c‡8d@‰ cUdr c‡8d@‰ dr�cxdc d 

dc 

dd c‡Pddddddd cddc ‡8d@‰c tdSc y8d@‰c dc�dc d 

dc 

dd cUdddddddd cddc Ud@‰ c‡8drc ‡PddH‰ Qa�dc d 

dc 

dd cddc cddc ctd@‰c cUdS cy8d@w †9TcPddc d 

dc 

dd cQdc cddc ‡8@‰ tddr ‡Pddddd@‰c c†RdHw d 

dc 

dd ddTu cddc c‡8@‰c UdSc U@ws9d@‰ d 

dc 

dd cUdddddddd cddc ‡8@‰ ctd@‰c dr�xdrc d 

dc 

dd cddddddddd cddc c‡8@‰c cUdr dc�cd d 

dc 

dd cddc ‡8@‰ tdSc ctdv�cd d 

dc 

dd ‡PddddTˆ cddc c‡8@‰c Udrc ‡8dA„Pdd d 

dc 

dd c‡8ddddddAˆc cddc ‡8@‰ ctdS c‡8d@‚RHwc d 

dc 

dd cUd@‰dd†9dIc cddc c‡8@‰c cUdr ‡8d@‰c d 

dc 

dd cddrcddccddc cddc ‡8@‰ tdSc��c‡8d@‰ d 

dc 

dd cddvcdd‡8dSc cddc c‡8@‰c c‡8drc��‡8d@‰c d 

dc 

dd cQdAˆdddddrc cddc ‡8@‰ cUdS��c‡8d@‰ d 

dc 

dd c†9ddddddS dddddc��cddc c‡8@‰c tddr��‡8dH‰c d 

dc 

dd †RddddH‰��ctdddddv��cddc ‡8@‰ UdSc��c‡8@wc d 

dc 

dd cdHwc‡dI��cddc c‡8@‰c ctd@‰c��y8@‰ d 

dc 

dd c‡PddTˆc cUdS��cddc ‡8dr cUdr��‡Pd@‰c d 

dc 

dd ‡8ddddAˆ td@‰�cddddddddc c‡8dSc tdSc�c‡8d@‰ d 

dc 

dd Ud@ws9dI cy8@‰c�cddddddddc yPdTucy8d@‰c Udrc�‡8d@‰c d 

dc 

dd ddrccxdd c‡Pd@‰��cddc cddddddddd@‰ ctdS�c‡8d@‰ d 

dc 

dd dd�dd cUdd‰c��cddc cdddddddd@‰c ‡8dr�‡8d@‰c d 

dc 

dd dd�dd cddddddd��cddc cddddddddr UdSc�c‡8d@‰ d 

dc 

dd dd�dd cddc tddddddddc ddrc�‡8d@‰c d 

dc 

dd dddddddddddd cddc c‡8ddddddddddTuc c‡PddS�c‡8d@‰ d 

dc 

dd dddddddddddd cddc ‡8dd†RdH‰ddddddTuc cUdddr�‡8dH‰c d 

dc 

dd cddc c‡8dddvc�tddddddddddddddddddddddTuc�cddddc�c‡8@wc d 

dc 

dd cddc ‡8ddddAucy8d�csRddddddddddddddddddddddddv�‡8@‰ d 

dc 

dd cddc cy8ddddddddddd�sRdddc��c‡dddddI�c‡8@‰c d 

dc 

dd cddc c‡Pdddd@wc sRddTu�cddddddd�y8@‰ d 

dc 

dd cddc ‡8ddddH‰ sRdddTuc��‡Pd@‰c d 

dc 

dd cddc c‡8ddd@w csRddTuc�c‡8d@‰ d 

dc 

dd cddc y8dddH‰c csRdddTu�cyduy8d@‰c d 

dc 

dd cddc ‡Pddd@wc csRdddTcPddddd@‰ d 

dc 

dd cddc c‡8dddH‰ sRdddccs9drc d 

dc 

dd cddc ‡8ddHw s9dc�xd d 

dc 

dd cddc cy8d@w cxdc�td d 

dc 

dd cddc c‡PddH‰c dvc‡8S d 

dc 

dd cddc y8d@wc dA„8@‰ d 

dc 

dd cddc ‡Pdd@‰ csRH‰c d 

dc 

dd cddc cy8ddH‰c d 

dc 

dd cddc c‡Pdd@wc d 

dc 

dd cddc ‡PTu�y8dd@‰ d 

dc 

dd cddc c‡8dddddddd@‰c d 

dc 

dd cddc ‡8dddddddd@‰ d 

dc 

dd cddc UddddddddH‰c d 

dc 

dd cddc dddddddd d 

dc 

dd cddc dd�dd d 

dc 

dd ‡PdTˆc��cddc Qd�dd d 

dc 

dd UdddAˆ��cddc xd�ctdd d 

dc 

dd ctd@wcdI��cddc cQdTc8dS d 

dc 

dd cUdr�dd��cddc c†ddddd‰ d 

dc 

dd cddc�dd�cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

dc 

cddc�dd�cdddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

dddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddddd 

cddc dc dd dd dd cd cd c 

cQdvctdd��cddc 


cxdAc8dS��cddc 


Qddd@‰��cddc 


†RdH‰c��cddc 


cddc 

cddc dc dd dd dd cd cd c cddc 

ccccccc 

‡PddTˆ�c‡Pd c‡8cc‡PddTˆc ddddddTcPddTˆc c‡PdTˆc‡PddTˆc c‡Pd�‡PddTˆc‡PddTˆc��c‡Pd�c‡Pd�‡8 ‡8�c‡Pddd�dddTˆc c 

c‡PddTˆc 

UddddI�cUdd ‡8dccUddddIc ddddddddddddIc ‡8dddAc8ddddIc ‡8dd�UddddIcUddddIc��‡8dd�‡8dd�c‡8d cy8d�‡8dddd�ddddIc c 

cUddddIc 

d@wcdd�tddd c‡8ddccddc‡ddc c‡d@‰ddccddc Ud@wcddddccdSc Uddd�dd�ddcddccddc��Uddd�Uddd�‡8dd dddd�Uddccddddˆcddc c 

cddccddc 

@‰ctddc‡8ddd cUdddccdd‡8dSc cUdrcddctddc dd�tddddddd dddd�ddctddcdSccddc��dddd�ctdddd�Uddd dH‰d�dddddd‡ddAˆddc c 

cddccQdc 

‡8dd„8dddd td@‰dccddddd tdSc�c‡8dSc QdAc8dddddddIc dd�‡8dScdrccddc dd�‡8dcddctd@‰d cd�ddddddd‰dddddv c 

cddccxdc 

c‡8d@‚dddcddvc Ud‰cdvcd@c9dIc Udrc�‡8d@‰c †9dddddd@ws9dc dd�c‡8d@‰cdvccddc dd�Uddcdd‡8d‰cdvc cd�dd�cdddd@c9dI c 

cddcctdc 

‡8d@‰cddddddIc dddddIcd�xddc dS�c‡8d@‰ dddddd�dc dd�‡8d@‰ccdIccddc dd�ddddddddddddIc cd�ddvctddddr�dd c 

cddccUdc 

c‡8dd‰cgddddddSc dddddScdAucddc ctdr�cUdd‰c cUdcddddAuy8dc dd�Udd‰�cddccdSc dd�ddddddddddddSc cd�QdAc8ddddcy8dS c 

cQdccddc 

cUdddddd`c�ddrc drcddddddc cUdc�cddddddc cQddd@cRdddddc dd�ddddddcdddd@‰c dd�dd�cdrc cd�†9ddd@ws9ddd@‰ c 

c†9ddddc 

cddddddd�dd dc�sRHw cddc�cddddddc c†RdH‰�sRHw dd�dddddd�sRH‰ dd�dd�cd cd�c†RdH‰�†RdH‰c ccccccccccccccccccc 

†RHw 

cddddddc�cdTˆ c 

cddd�cddc 

tddcdddc�cQdI c 

cddd�cddc 

UdScdddc�cxdd c 

cddd�cddc 

c 

cddd�cddc‡PddddTˆcddddTcPddddTˆcddddddc�ctddrcddddddTˆ�ddvc 

c 

cddd�cddcUddddddIcddddddddddddIcddddddc�cUdd�dddddddI�QdIc 

c 

cddddddddddcdd@ws9ddcdd@wsRddccdddcddccdSc�cddS�dddccddd�xddc 

c 

cddddddddddcddrccxddcddr�ddddddcddddd‰c�cddr�dddccddd�cddc 

c 

cddd�cddcdd�ddcddc�ddddddddcddddddd�cddc�dddccddd�cddc 

c 

cddd�cddcddvcctddcddc�dd@wcdddcdd†9ddd�cddv�dddccddd�cddc 

c 

cddd�cddcQdAuy8dScddc�dd‰ccddddddc†ddd�cQdI�dddccddd�tddc 

c 

cddd�cddcxddddd@‰cddc�Qddddddd†9dddddS�cxdd�dddccddd�UdSc 

c 

cddd�cddccddddH‰ccddc�†RddHcRdc†RdddH‰�ddvcdddccddd�ddrc 

c 

QdIc�ctdS 

c 

†Rdc�cdH‰ 

Figura 4. A. Esquema del plásmido pDL10 y del proceso de doble recombinación que debe ocurrir para obtener transformantes disrupcionados en el gen lys2. 

B. Patrón de hibridación obtenido por diversas cepas utilizando como sonda un fragmento interno al gen lys2. Carril 1. Cepa P. chrysognum Wis. 54-1255 sin 

transformar; carril 2. transformante disrupcionado TD10-195 y carril 3. transformante con múltiples copias del fragmento utilizado para la transformación. 

C. Producción de penicilina G de la cepa sin transformar con (❍) o sin (●) lisina 4 mM y del transformante TD10-195 (▲).

directa de este oxígeno a la ruta de biosíntesis de cefalosporina 

o ii) por incremento del flujo de oxígeno hacia el 

aparato respiratorio, proporcionando concentraciones 

internas de oxígeno más altas, alterando el estado de 

redox interno, o funcionando como una oxidasa terminal 

eficiente, con incremento final en el metabolismo general, 

incluyendo el metabolismo secundario. 

La expresión del gen de la hemoglobina de 

Vitreoscilla (VHb) en la cepa C10 de A. chrysogenum, 

bajo el promotor del gen TR1 de Trichoderma reesei y 

usando el gen de resistencia a fleomicina como marcador 

resultó en la obtención de algunos transformantes con 

mayor capacidad para producir cefalosporina C que la 

cepa sin transformar. Diversos transformantes y cepas 

control fueron probadas por su crecimiento y producción 

de cefalosporina C en medio definido de producción. 

Usando matraces indentados, dos transformantes produjeron 

4 g/l de cefalosporina C, lo cual representa alrededor 

de 2 veces la producción de la cepa control. La reducción 

de la aireación mediante el uso de matraces lisos resulta 

en menor producción de cefalosporina en todas las cepas, 

indicando que los cultivos estaban en condiciones de oxígeno 

limitante con respecto a la producción de cefalosporina. 

Bajo estas condiciones, la cepa VHb produjo cinco 

veces más cefalosporina C que las cepas control (3 g/l vs 

0,6 g/l). Estos últimos resultados sugieren que el gen VHb 

mejora la productividad del antibiótico bajo condiciones 

de baja aireación [25]. 

De esta manera se puede concluir que el oxígeno 

juega un papel importante en la biosíntesis de cefalosporina 

C. Los pasos de ciclación del tripéptido, expansión del 

anillo e hidroxilación de la desatoxicefalosporina C 

requieren todos ellos oxígeno. Además la regulación por 

oxígeno podría ser más significativa en los últimos pasos 

de la ruta debido a la acumulación de penicilina N en cultivos 

pobres en oxígeno. Es posible que el producto del 

gen VHb beneficie directamente estas reacciones debido a 

su capacidad para proporcionar altos niveles de oxígeno 

intracelular. 

Para determinar finalmente el efecto de la sobreexpresión 

del gen VHb sobre las rutas de biosíntesis de antibióticos 

β-lactámicos podría ser interesante elucidar este 

efecto sobre la producción de penicilina. 

c) Producción de intermediarios de la biosíntesis 

de cefalosporina por cepas recombinantes de P. chrysogenum. 

Las cefalosporinas tienen mayor calidad terapéutica 

que las penicilinas, sin embargo los procesos para la producción 

de 7-ADCA y 7-ACA (intermediarios que son 

modificados mediante la unión de diferentes cadenas laterales 

para obtener cefalosporinas semisintéticas) son complejos 

y costosos. Además la eliminación de la cadena 

Metabolitos secundarios en hongos filamentosos 

Gutiérrez S, et al. 

S59 

lateral natural de D-α-aminoadipil es ineficiente. Así 

Cantwell et al. [26] propusieron que una expandasa (de 

Streptomyces o Acremonium) podría ser modificada para 

expandir la penicilina G a fenilacetil-7-ADCA, a partir del 

cual la cadena lateral aromática puede ser eliminada con 

una penicilina acilasa. Últimamente se ha demostrado que 

la DAOC podría ser producida por transformantes de 

Penicillium conteniendo los genes para la expandasa y 

epimerasa de S. clavuligerus. Basado en estos experimentos 

podría ser posible producir intermediarios de cefalosporinas 

con cadenas laterales de adipilo a partir de cepas 

de P. chrysogenum expresando la expandasa de S. clavuligerus 

o la expandasa-hidroxilasa de A. chrysogenum 

cuando se añade ácido adípico en el caldo de fermentación. 

Cuando el adipato fue añadido a la cepa parental no 

transformada, se produjo adipil-6-APA en niveles del 

47% con respecto al nivel de penicilina V añadiendo fenoxiacetato. 

Los transformantes conteniendo las construcciones 

con el gen de la expandasa de S. clavuligerus 

(pPenFT50) bajo el promotor de los genes pcbC o β-tubulina 

(pTS-2) produjeron un 14% de 6-APA y 17% adipil- 

7-ADCA (relativo al título de penicilina V producida por 

la cepa parental cuando se añade ácido fenoxiacético). Por 

otro lado, transformantes conteniendo las construcciones 

con el gen de la expandasa hidroxilasa de A. chrysogenum 

(pPen/Ceph-1) bajo el promotor del gen pcbC y con los 

genes de la expandasa-hidroxilasa y acetil-transferasa de 

A. chrysogenum (pT8) ambos bajo el promotor del gen 

pcbC, también produjeron adipil-cefalosporinas. 

Transformantes con el pPen/Ceph-1 produjeron, relativo a 

la penicilina V como antes, las siguientes adipil-cefalosporinas: 

15% adipil-6-APA, 2,6% adipil-7-ADCA y 6,7% 

adipil-7-ADCA y transformantes con pT8 produjeron 

15% adipil-6-APA, 2,1% adipil-7-ADCA, 1,4% adipil-7- 

ADCA y 0,6% adipil-7-ACA. 

Estos resultados demuestran que el adipato es 

incorporado realmente como precursor de la cadena lateral 

de la penicilina y que el resultante adipil-6-APA es eficientemente 

usado por la expandasa o por la expandasahidroxilasa 

heterólogas. Sin embargo la producción de 

adipil-cefalosporinas a partir de los transformantes oscila 

desde niveles indetectables a muy altos niveles, probablemente 

debido a la influencia del locus de integración, así 

puede ser interesante comercialmente aplicar tecnologías 

clásicas de mejora de cepas para incrementar el título de 

adipil-cefalosporinas producidas.

S60 


Bibliografía 

1. Martín JF, Aharonowitz Y. Regulation of 

biosynthesis of β-lactam antibiotics. En: 

Antibiotics Containig the β-lactam Structure 

I (pp. 229-254). AL Demain AL, Solomon 

NA (Eds.) Berlín, Springer-Verlag, 1983. 

2. Martín JF, Liras P. Organization and 

expression of genes involved in the biosynthesis 

of antibiotics and other secondary 

metabolites. Annu Rev Microbiol 1989; 43: 

173-206. 

3. Martín JF, Gutiérrez S, Demain AL. "β- 

Lactams". En: Fungal Biotechnology. 

(Chapter 5.1). Anke T (Ed.). Weinheim, 

Chapman & Hall GmbH, 1997: 91-117. 

4. Díez B, Barredo JL, Alvarez E, et al. Two 

genes involved in penicillin biosynthesis 

are linked in a 5.1 kb SalI fragment in the 

genome of Penicillium chrysogenum. Mol 

Gen Genet 1989; 218: 572-576. 

5. Veenstra AE, van Solingen P, Bovenberg 

RAL, Van der Voort LHM. Strain improvement 

of Penicillium chrysogenum by recombinant 

DNA techniques. J Biotechn1991; 

17; 81-90 

6. Gutiérrez S, Velasco J, Fernández FJ, 

Martín JF. The cefG gene of 

Cephalosporium acremonium is linked to 

the cefEF gene and encodes a deacetylcephalosporin 

C acetyltransferase closely 

related to homoserine O-acetyltransferase. 

J Bacteriol 1992; 174:3056-3064. 

7. Matsuda A, Sugiura H, Matsuyama K, 

Matsumoto H, Ichikawa S, Komatsu K-I. 

Molecular cloning of acetyl coenzyme 

A:deacetylcephalosporin C O-acetyltransferase 

cDNA from Acremonium 

chrysogenum: Sequence and expression of 

catalytic activity in yeast. Biochem Biophys 

Res Commun 1992; 182:995-1001. 

8. Skatrud PL, Tietz AJ, Ingolia TD, et al. Use 

of recombinant DNA to improve production 

of cephalosporin C by Cephalosporium 

acremonium. Bio/Technology 1989; 7:476- 

485. 

9. Skatrud PL, Fisher D, Ingolia TD, Queener 

SW. Improved transformation of C. acremonium. 

In "Fifth International Symposium on 

the Genetics of Industrial Microorganisms" . 

M. Alacevic, D Hranueli, Z Toman (Eds.) 

Washington, DC, American Society for 

Microbiology, 1986: 11119. 

10. Skatrud PL, Queener SW, Carr LG, Fisher 

DL. Efficient integrative transformation of 

C. acremonium. Curr Genet 1987; 12:337- 

348. 

11. Barredo JL, Díez B, Alvarez E, Martín JF. 

Large amplification of a 35 kb DNA fragment 

carrying two penicillin biosynthetic 

genes in high penicillin producing strains 

of Penicillium chrysogenum. Curr Genet 

1989; 16:453-459. 

12. Fierro F, Barredo JL, Díez B, Gutiérrez S, 

Fernández FJ, Martín JF. The penicillin 

gene cluster is amplified in tandem repeats 

linked by conserved hexanucleotide 

sequences. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 

92:6200-6204. 

13. Gutiérrez S, Velasco J, Marcos AT, et al. 

Expression of the cefG gene is limiting for 

cephalosporin biosynthesis in Acremonium 

chrysogenum as shown by promoter replacement 

studies. Appl Microbiol Biotechnol 

1997; 48:606-614. 

14. Kennedy J, Turner G. δ-(L-α-aminoadipyl)- 

L-cysteinyl-D-valine synthetase is a rate 

limiting enzyme for penicillin production in 

Aspergillus nidulans. Mol Gen Genet1996; 

253: 189-197. 

15. Fernández-Cañon JM, Peñalva MA. 

Overexpressin of two penicillin structural 

genes in Aspergillus nidulans. Mol Gen 

Genet 1995; 246: 110-118. 

16. Müller WH, Bovenberg RAL, Groothuis 

MH, Kattevilder F, Smaal EB, Verkleij AJ. 

Involvement of microbodies in penicillin 

biosynthesis. Biochim Biophys Acta 1992; 

1116:210-213. 

17. Ramsden M, McQuade BA, Saunders K, 

Turner MK, Haford S. Characterization of a 

loss-of-function mutation in the isopenicillin 

N synthetase gene of Acremonium chrysogenum. 

Gene 1989; 85:267-273. 

18. Gutiérrez S, Díez B, Alvarez E, Barredo 

JL, Martín JF. Expression of the penDE of 

Penicillium chrysogenum encoding isopenicillin 

N acyltransferase in 

Cephalosporium acremonium: production 

of benzylpenicillin by the transformants. 

Mol Gen Genet 1991; 225: 56-64. 

19. Alvarez E, Cantoral JM, Barredo JL, 

Díez B, Martín JF. Purification to homogeneity 

and characterization of acyl coenzyme 

A:6-aminopenicillanic acid 

acyltransferase of P. chrysogenum. 

Antimicrob Agents Chemother 1987; 

31:1675-1682. 

20. Sagisaka S, Shimura K. Mechanism of activation 

and reduction of (α-aminoadipic acid 

by a yeast enzyme. Nature (London) 1960; 

188:1189-1190. 

21. Friedich GC, Demain AL. Uptake and 

metabolism of α-aminoadipate by 

Penicillium chrysogenum. Arch Microbiol 

1978; 119:43-47. 

22. Hönlinger C, Kubicek CP. Regulation of 

δ-(L-α-aminoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine 

and isopenicillin N biosynthesis in 

Penicillium chrysogenum by the α-aminoadipate 

pool size. FEMS Microbiol Lett 

1989; 65:71-76. 

23. Casqueiro J, Gutiérrez S, Fierro F, 

Bañuelos O, Velasco J, Martín JF. 

Characterization of the lys2 gene of 

Penicillium chrysogenum encoding α-aminoadipic 

acid reductase. Mol Gen Genet 

1998; 259:549-556. 

24. Casqueiro J, Gutiérrez S, Bañuelos O, 

Hijarrubia MJ, Martín JF. Gene targeting in 

Penicillium chrysogenum: Disruption of the 

lys2 gene leads to penicillin overproduction. 

J Bacteriol 1999; 181: 1181-1188. 

25. DeModena JA, Gutiérrez S, Velasco J, 

et al. The production of cephalosporin C by 

Acremonium chrysogenum is improved by 

the intracellular expression of a bacterial 

hemoglobin. Bio/Technology 1993; 11:926- 

929. 

26. Cantwell CA, Beckmann RJ, Dotzlaf JE, 

et al. Cloning and expression of a hybrid 

Streptomyces clavuligerus cefE gene in 

Penicillium chrysogenum. Curr. Genet 

1990; 17:213-221.

Los hongos como factorías celulares: biodiversidad de metabolitos ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?