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Prélèvements d'environnement dans les établissements 

de santé : Modes opératoires 

D:\travail\hygiène\hh128 

Juin 2001

AVANT PROPOS 

Malgré l’absence d’indicateur permettant de mesurer le rôle de l’environnement hospitalier dans la 

survenue des infections nosocomiales, il est établi que la biocontamination à l’hôpital constitue un 

risque majeur pour les patients fragilisés ainsi que pour certains lieux où sont pratiqués des soins ou 

actes invasifs. La maîtrise de cette contamination dont dépend la sécurité des patients a donc été 

élevée au rang de « vigilance environnementale ». 

Nous assistons depuis quelques années à une montée en charge de la réglementation dans ce domaine, 

néanmoins les textes officiels et les recommandations restent souvent imprécis et il demeure 

difficile de proposer des normes. Le guide des 100 recommandations pour la surveillance et la 

prévention des infections nosocomiales (CTIN 1999) rappelle que l’hygiène de l’environnement 

hospitalier s’inscrit dans un cadre préventif et qu’elle se place sous la responsabilité du CLIN de 

l’établissement. 

Ce guide régionalement sous l’égide de l’ARECLIN s’appuie sur une recherche bibliographique et sur 

l’expérience acquise par des microbiologistes et des hygiénistes hospitaliers, il se propose d’apporter 

une aide méthodologique destinée aux établissements de soins pour la surveillance environnementale. 

Gilles BEAUCAIRE Christian CATTOEN Thierry LEVENT 

D:\travail\hygiène\hh128

SOMMAIRE 

Introduction…………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1 

Objet 

Champ d'application 

Le groupe de travail 

1° Le contrôle microbiologique des surfaces 

Fiche Technique n° 1 : contrôle microbiologique des surfaces………………………………………………..2-3 

2° Le contrôle microbiologique du linge 

Fiche Technique n° 2 : contrôle microbiologique du linge……………………………………………… …..4-5 

Plan d’échantillonage : proposition d’une fiche type ………………………………………………………. ……….6 

3° Le contrôle microbiologique de l'eau 

Eaux et usages : typologie…………………………………………………………………………………………………………………7 

Fiche Technique n° 3 : contrôle microbiologique de l'eau non filtrée……………………………………..8-9 

Fiche Technique n° 4 : contrôle microbiologique de l'eau filtrée……………………………….…………….10-11 

Fiche Technique n° 5 : contrôle microbiologique de la désinfection des endoscopes …….12-13 

Fiche Technique n° 6 : contrôle microbiologique de l'eau des piscines de rééducation …….14-15 

Fiche Technique n° 7 : recherche de Legionella dans une eau ………………………………………………….16-17 

Fiche Technique n° 8 : contrôle microbiologique des eaux d'hémodialyse……………………………… 18-19 

Fiche technique n° 9 : contrôle microbiologique pour la pratique de l’hémo(dia) filtration 20-21 

4° Le contrôle microbiologique de l’air 

Fiche technique n°10 : Le contrôle microbiologique de l’air …………………………………….. ……………. 22-23 

Fiche technique n°11 : risque aspergillaire – surveillance de l’environnement ……………………….24-25-26 

5° Lexique 

Glossaire des milieux de culture utilisés dans les modes opératoires……………………………………..27-28-29 

6° Annexe 1 : les germes de l’hospitalisme 30 

Annexe 2 : Recherche d’une Legionella dans une eau selon la norme NFT 90-431 : 

le mode opératoire 31 


1° Introduction 

Un groupe de travail de microbiologistes issus du réseau des microbiologistes de l'ARECLIN 

(Association Régionale des CLIN du Nord Pas de Calais) en partenariat avec l'Institut Pasteur de Lille 

a réfléchi sur la gestion et la maîtrise du risque infectieux lié à la biocontamination de 

l'environnement dans les établissements de santé. 

Ce groupe a établi une liste de protocoles sous forme de fiches techniques relatives à la surveillance 

microbiologique de l'environnement hospitalier. 

Un des objectifs est de proposer une standardisation des techniques de prélèvement et d'analyses, 

rendant possible l'interprétation des résultats de chaque établissement au sein d'un observatoire 

régional d'hygiène hospitalière. 

2° Objet : 

Chaque protocole précise les modalités de prélèvement, les aspects méthodologiques et les critères 

d'interprétation. 

Le prélèvement est effectué hors présence humaine, si possible. 

Chaque protocole sera actualisé régulièrement, en fonction de l'évolution du cadre réglementaire et 

des éventuelles réflexions du réseau des microbiologistes. 

3° Champ d'application : 

Le protocole est à appliquer par toute personne impliquée dans la surveillance microbiologique de 

l'environnement hospitalier. 

4° Circuit de diffusion : 


• Microbiologistes 

• Médecins hygiènistes 

• Infirmier(e)s hygiènistes 

• Techniciens de laboratoire 

• Président du CLIN 

• ARIH (Association Régionale des Infirmières Hygiénistes) 

• ARECLIN Pharmacien 

5° Groupe de travail 

Laurence BOUILLET 

Michèle CAILLAUX 

Sylvie HENDRICX 

Christiane KREMBEL 

Thierry LEVENT 

Françoise MARSY 

Betty MORIN 

Jean Gabriel PAUL 

Dominique TRIVIER 

Anne VACHEE 

Biologiste - CH de VALENCIENNES 

Biologiste - CH de TOURCOING 

Biologiste - CH de DOUAI 

Médecin Hygièniste - ULIN CHRU de LILLE et Institut Pasteur de Lille 

Médecin Hygièniste - CH de MAUBEUGE 

Institut Pasteur de LILLE 

Institut Pasteur de LILLE 

Biologiste - CH de BOULOGNE SUR MER 

Médecin Hygièniste - CH de LENS et Groupe AHNAC 

Biologiste - CH de ROUBAIX 

Avec la participation de : Sylvie MEMBRE Pharmacien - CH de DUNKERQUE 

Colette SAVAGE, Biologiste, CHRU de LILLE 

Catherine COIGNARD, Biologiste, CH de Tourcoing 

Edith MAZARS, Biologiste, CH de Valenciennes 

1

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES SURFACES 

Quantifier voire qualifier la flore microbienne pour une surface donnée. 


N° de Fiche :1 

Version :1 

Date : Juin 2001 

Pagination :1/2 

Surfaces des zones à risque (risque 4 éventuellement 3, hors activité ou en activité) 

Surfaces des autres zones, en situation épidémique ou en situation particulière 

3° Prélèvements : 

Le plan d'échantillonnage 

La fréquence 

Les modalités 

Le matériel 

Le mode de prélèvement 

Etablir une liste des points critiques (points les plus 

salissables, les plus manipulés, les plus proches du patient) 

A titre indicatif, 8 points pour une salle de bloc opératoire, 5 

points pour une chambre 

Zone à haut risque : 4 fois par an 

Autre zone : fréquence à discuter 

Préciser le secteur, le local, la date et l'heure du prélèvement ainsi que le 

nom du préleveur. 

Indiquer s'il s'agit d'un secteur en activité ou non, la date et l'heure du 

nettoyage, le type de nettoyage (courant ou après sortie) et le type de 

produit utilisé. 

gélose contact contenant 4 neutralisants (Lecithine, 

Polysorbate, Thiosulfate de sodium, L-Histidine). 

Applicateur ou poids de 500 grammes 

Ecouvillon stérile humidifié 

Par contact : 

A l'aide de Gélose contact maintenue sous une pression de 

500 grammes pendant 10 secondes (à l'aide d'un applicateur 

ou d'un poids de 500 grammes) 

Après avoir réalisé le prélèvement, ne pas oublier de 

nettoyer la surface afin d'éliminer les traces de géloses 

résiduelles 

Indirect (écouvillon) : 

non recommandé si on peut utiliser la méthode précédente. 

Cette technique est réservée aux petites surfaces ne 

permettant pas l’utilisation de gélose contact ou les 

surfaces absorbantes ou irrégulières 

écouvillonner approximativement 10 cm 2 . 

Dans les deux cas, transmettre les prélèvements au laboratoire dans les 

meilleurs délais. 

2

4° Le mode opératoire : 

Celui-ci consiste à rechercher les germes de l'hospitalisme et à dénombrer la flore totale selon la 

technique suivante : 

5° La restitution des résultats et leur interprétation : 

5.1 La restitution des résultats : 

Rendre les résultats en UFC/16cm 2 . Si plus de 100 colonies ont été comptabilisées, rendre le résultat 

sous l'intitulé suivant : > 100 UFC/16 cm2. Rendre l'identification des germes de l'hospitalisme 

accompagnée d'une appréciation semi quantitative. 

5.2 Interprétation : 

L'interprétation de la bio-contamination des surfaces doit être réalisée au regard des valeurs 

indicatives définies dans le tableau ci-dessous [1] : 

Hors activité : bio-contamination des surfaces après nettoyage et désinfection : valeurs indicatives 


Secteurs 1 2 3 4 

Surfaces < 5 UFC /cm 2 

< 2 UFC/cm 2 

< 0,2 UFC/cm 2 

< 0,2 UFC/cm 2 

Alors que les modes opératoires, des prélèvements en activité sont les mêmes qu’hors activité, les 

critères d’interprétation restent à définir. 

Bibliographie : 

2 

Les boîtes de contact sont ensemencées sur site. 

Si l'on utilise des écouvillons, les décharger dans 1 ml d'une solution neutralisante 

contenant au moins 3 des 4 inhibiteurs cités dans le tableau ci-dessus. 

Ensemencer 0,1 ml sur une gélose d'un milieu équivalent à celui de la boîte de contact 

(PCA, TCS ou TS…). 

Incuber 24 h à 37°C et relever la présence ou l'absence de germe de l'hospitalisme. 

Incuber à nouveau 2 jours à température ambiante de façon à dénombrer la flore totale. 

Dénombrer le nombre total de colonies sur les 16 cm 2 centraux de la boîte de contact. 

Pour les écouvillons, dénombrer le nombre total de colonies et le ramener en densité 

pour 16cm 2 . 

Identifier les germes de l'hospitalisme par les méthodes standards. 

Annexe : proposition de sectorisation 

Secteur 1 Risques minimes : 

Maison de retraite, bureau … 

Secteur 2 Risques moyens : 

maternité, psychiatrie, service de long et moyen séjour, consultation externe… 

Risques sévères : 

Pédiatrie, soins intensifs, urgences, salles de travail, médecine, radiologie, 

Secteur 3 hémodialyse, réanimation, exploration fonctionnelle, hématologie, 

chimiothérapie, bloc opératoire septique et obstétrical, stérilisation centrale, 

salles d'eau, toilettes, cuisines, biberonnerie… 

Très haut risques : 

Secteur 4 Néonatologie, bloc opératoire aseptique, service de brûlés, immunodéprimés, 

service de greffe, chimiothérapie, oncologie, onco-hématologie… 

[1] Bio-décontamination des surfaces après nettoyage et désinfection. Guide du bio-nettoyage n°5670. 

[2] Décontamination, bio-nettoyage, désinfection, stérilisation. Guide pratique 2 e édition. Editions hospitalières 1995. 

[3] Contrôles de l’environnement dans les zones à haut et très haut risque infectieux. ASPEC juin 1999 

3

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DU LINGE 

(articles textiles traités en blanchisserie) 


Version :1 

Date : juin 2001 


Quantifier voire qualifier la flore microbienne pour une unité de surface donnée d'un article textile. 


En blanchisserie, en secteur de finition au niveau de l’expédition 

Dans les services, pendant l'activité. 



La fréquence 


Le matériel 


Exemples : Les articles textiles compris dans le plan 

d'échantillonnage sont les suivants : 

• Grand plat : draps…. 

• Petit plat : alèses, champs opératoires, torchons….. 

• Linge en forme : tenues personnelles, tenues cuisines, 

Tenues de bloc 

• Linge séché : éponges, linge personnel, couches, 

couvertures…. 

La proportion d'échantillons de chacune des quatre 

Catégories citées est fonction de la proportion de chacune 

d'elle traitée en blanchisserie (en %). Associer au plus petit 

pourcentage le prélèvement de deux boites. 

Associer un facteur de multiplication 2 pour le linge souillé et 

pour le linge fragile lavé à basse température ( < 60°) 

Un exemple d’un plan d’échantillonnage vous est proposé dans le tableau 1, 

page 6. 

Elle est fonction du niveau de maîtrise des process et des bonnes pratiques 

d'hygiène en blanchisserie. 

Préciser le type d'article textile concerné, la date et l'heure 

du prélèvement, le nom du préleveur. 

Utiliser de préférence 2 boîtes par article textile, et 

Prélever sur la surface externe du linge. 

Boîte de contact contenant 4 neutralisants (Lecithine, 

Polysorbate, Thiosulfate de sodium, L-Histidine). 

Applicateur ou poids de 500 grammes 

A l'aide de la boîte de contact maintenue sous une pression 

de 500 grammes pendant 10 secondes (à l'aide d'un 

applicateur ou d'un poids de 500 grammes). 

Tout linge analysé doit être relavé. 

Transmettre les prélèvements au laboratoire dans les 

meilleurs délais 

4

4° Mode opératoire 

Celui-ci consiste à rechercher les germes de l'hospitalisme et à réaliser un dénombrement de la flore 

totale selon la procédure définie ci-dessous : 

Incuber 24 h à 37°C, relever la présence ou l'absence de germes de l'hospitalisme, puis 

incuber à nouveau 2 jours à température ambiante de façon à dénombrer la flore totale. 

Dénombrer le nombre total de colonies sur les 16 cm 2 centraux de la boîte contact. 


5° La restitution des résultats et leur interprétation 

5.1 La restitution des résultats 

Rendre les résultats en UFC par 16 cm 2 . Si plus de 100 colonies ont été comptabilisées, rendre le 

résultat sous l'intitulé suivant : > 100 UFC/16 cm 2 . 

Rendre l'identification des germes de l'hospitalisme accompagnée d'une appréciation semiquantitative. 

5.2 Interprétation 

En fin de traitement, et immédiatement avant expédition : < 8 UFC /16 cm 2 

Cette valeur doit être préservée jusqu’à utilisation (notamment dans les services à haut risque). 


5

Proposition d’une fiche de contrôle microbiologique des articles textiles 

Plan d’échantillonnage 

Grand plat 

Draps 

Petit plat 

Aléses 

Articles % Nombre de 

Pvts 

Champs opératoires 

Torchons 

Linge en forme 

Tenues personnel 

Tenues cuisine 

Tenues de bloc 

Linge séché 

Eponges 

Linge personnel 

Couches 

Couvertures 

TOTAL 


Linge souillé 

(excrétats) 

Linge fragile 

Lavage < 60°C 

Total 

Aide au remplissage de la fiche 

considérer la répartition des articles textiles 

associer au plus petit pourcentage le prélèvement de 2 boites 

ajuster approximativement le nombre de prélèvements des autres articles au prorata du 

nombre d’articles 

associer un facteur de multiplication 2 pour le linge souillé 

associer un facteur de multiplication 2 pour le linge fragile lavé à basse température 

Exemple de contrôles microbiologiques des articles textiles 

Articles % 

Nbre de 

boites 

Linge souillé 

x 2 

Linge fragile 

X 2 

Grand plat 37 20 20 

Petit plat 8 4 8 8 

(alèses, torchons) 

Linge en forme 10.7 6 6 

Linge séché 20 

Eponges 5 2 2 

Linge personnel 11 6 12 24 24 

Couches 3.2 2 2 

Couvertures 4.2 2 4 4 

TOTAL 66 

Total 

6


EAUX ET USAGES : TYPOLOGIE 

Typologie Utilisation Dénomination 

Eaux potables 

Eaux 

bactériologiquement 

maitrisées 

Eaux stériles 

conditionnées 

Autres eaux à usage 

de soins 

Les eaux techniques 

Bibliographie 

Eaux destinées à 

l'alimentation humaine 

répondant aux normes 

en vigueur 

Eaux destinées aux 

soins 

Eaux exemptes de 

micro-organismes 

vivants, répondant aux 

normes de la 

pharmacopée 

Eau du réseau d'adduction 

Eau embouteillée 

Eau des fontaines réfrigérées 

Eau "propre" 

Eau "ultra propre" 

[1] L'eau dans les établissements de Santé COTEREHOS. DRASS Rhône Alpes mars 1995. 

Eau purifiée stérile 

Eau stérilisée pour préparation injectable 

Eau pour hémodialyse 

Eau des piscines de rééducation ou de 

balnéothérapie 

Eau chaude sanitaire 

Eau de la climatisation 

Eau pour la production de la glace 

7

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU NON 

FILTREE AUX POINTS D’EAU 

N° de Fiche : 3 

Version : 1 



Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans l'eau délivrée par le point d’eau. 

Cette eau doit respecter les critères microbiologiques de l’eau d’adduction publique dans le cadre d’un 

usage courant et ne pas contenir de germes de l’hospitalisme. 


Point d'eau des salles de soins et des postes infirmiers des unités de soins, ainsi que les chambres 

des patients. Consultations externes, points de lavage des mains, biberonneries… 



et la fréquence 

Etablir un plan d'échantillonnage représentatif des points 

d'eau non filtrée du réseau de l'établissement. 

Intervenir au moins une fois par an dans les unités suivantes : 

chirurgie viscérale, traumatologie, urologie, pneumologie, 

néonatologie, réanimation et soins intensifs … 

Réaliser en outre un écouvillonnage des siphons et des 

robinets une fois par trimestre. Ces prélèvements sont des 

indicateurs de la contamination par les germes de 

l’hospitalisme 




Le matériel Flacon stérile contenant du thiosulfate de sodium (10 à 50 mg/ 500 ml) 

Siphons et robinets (indicateur de la contamination par les germes de 

l’hospitalisme) : 

Utiliser un écouvillon sec. 

Eau non filtrée (vérification de l’eau du réseau) : 

Détartrer la robinetterie par grattage et désinfection de 

Celle-ci à l'aide d'une compresse imbibée d'alcool à 95° ou 

d'eau de Javel ou d'un détergent désinfectant. Le temps de 


désinfection est d'au minimum 30 secondes. 

Laisser couler l'eau pendant au minimum une minute. 

Recueillir 500 ml d'eau dans le flacon stérile contenant du 

Thiosulfate de sodium. 

Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le 

prélèvement à basse température (2 à 8°C). Dans tous les 

cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible 

8


Celui-ci consiste à rechercher la présence des germes de l'hospitalisme dans l'eau du réseau non 

filtrée selon la technique suivante : 

Filtrer 100 ml sur membrane à 0,45 microns et la déposer sur PCA ou à défaut BCP 

Déposer la membrane sur le milieu. Incuber 24 heures à 37°C puis 48 heures à 

température ambiante 

Lecture et dénombrement des germes après 24 heures d’incubation à 37°C puis 

48 heures d’incubation à température ambiante 




Celle-ci se fera en UFC/100 ml. 

5.2 L'interprétation : 

Les germes de l'hospitalisme doivent être inférieurs à 1/100ml. 

Annexe : contenu des analyses microbiologiques des échantillons d’eau potable distribuée par un réseau collectif ou privé 


Réduite B1 Sommaire B2 Complète B3 

• Coliformes 

thermotolérants 

• Streptocoques fécaux 

• Coliformes thermotolérants 


• Dénombrement des bactéries 

aérobies revivifiables à 22°et à 

37° C 

• Coliformes totaux et 

thermotolérants 


• Dénombrement des bactéries 

aérobies revivifiables à 22°et à 

37° C 

• Spores de bactéries anaérobies 

sulfito-réductrices 


Décret 89-3 du 3 janvier 1989 modifié relatif aux eaux destinées à la consommation humaine à l'exclusion 

des eaux minérales naturelles. 

9

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU FILTREE 

Quantifier voire qualifier la flore microbiologique de l'eau filtrée. 



Version : 1 


Pagination : 1/2 

Nous retiendrons ici l'eau dite de niveau 2 c'est à dire obtenue par microfiltration terminale à 0,2 

microns absolu. (typologie : cf page n°7) 



La fréquence 


Le matériel 


Prélèvement complémentaire 

Etablir la liste exhaustive des points d’eau filtrée pour les 

services à risques suivants : bloc opératoire, chambre stérile, 

réanimation, stérilisation et service de brûlés. 

Avant toute chose, il est nécessaire : 

• De contrôler si le filtre est bien adapté. 

• De vérifier la fiche de traçabilité d’entretien du filtre 

• De respecter les règles d'utilisation et d'entretien du filtre 

Une fois/trimestre ou au minimum 2 fois/an 

Ponctuellement sur intervention des services techniques. 



Un flacon stérile par point d'eau contenant du thiosulfate de 

sodium (10 à 50 mg/500ml) 

Laisser couler l'eau 3 minutes 

Recueillir 500 ml 

Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le 


cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible. 

Il est conseillé de compléter les prélèvements d'eau par : 

Un écouvillonnage de la face externe du filtre avant le 

prélèvement d’eau si nécessaire 

Un écouvillonnage du siphon. 

Se référer au mode opératoire défini dans la fiche précédente. 

10

4° Mode opératoire : 

Les milieux de culture utilisés seront le PCA ou à défaut le BCP 

Filtrer 100 ml sur une membrane à 0,45 microns et la déposer sur le milieu de culture. 

Incuber 24 heures à 37°C puis 48 heures à température ambiante. Le dénombrement 

se fera à 24 heures et 72 heures. 

Une identification devra être menée en présence de plusieurs colonies identiques ou 

devant toute suspicion de germes de l'hospitalisme. 



Celle ci se fera en UFC pour 100 ml. 

5.2 L'interprétation : 

Les critères microbiologiques retenus sont les suivants : 

Absence de germes de l'hospitalisme(< 1/100ml) et moins de 10 UFC/100ml pour les germes totaux. 

Annexe : Typologie de l'eau bactériologiquement maîtrisée 

L'eau bactériologiquement maîtrisée à l'hôpital est une appellation instaurée par le COTEREHOS (Comité Technique Régional 

de l'Environnement Hospitalier - DRASS Rhône Alpes) pour désigner l'eau à usage hospitalier, produite dans l'établissement à 

partir d'eau d'adduction publique. 

Dénomination Usage Exigences de qualité 

Niveau 1 : "eau propre" Rinçage coloscope et gastroscope 

Toute utilisation dans les services de 

soins 

Secteurs protégés : unité brûlés, 

Niveau 2 : "eau ultra-propre" 

greffés… 

Rinçage bronchoscope 

Lavage chirurgical des mains 

Rinçage arthroscope et coelioscope 

Niveau 3 : "eau stérile" Humidificateur d'oxygène 

Aérosols 



Inférieur ou égal à 100 UFC/100 ml 

après 24h à 37° et 72 h à 22° 

Absence de P. aeruginosa dans 

100 ml 

Inférieur ou égal à 10 UFC /100 ml 

après 24h à 37° et 72 h à 22° 

Absence de P. aeruginosa dans 100 ml 

Eau exempte de micro-organismes vivants, 

répondant aux normes de la pharmacopée. 

[1] L'eau dans les établissements de santé. Commission technique régionale de l'environnement hospitalier. DRASS 

Rhöne-Alpes mars 1995. 

[2] Eau à usage médical. Définition; Interprétation pratique. Groupe eau santé. Janvier 1998 

11

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE LA DESINFECTION 

DES ENDOSCOPES 


Version : 1 



Quantifier, voire qualifier la flore microbiologique de la lumière de l’endoscope après désinfection. 

2°Champ d'application : 

Endoscopes souples (fibroscopes) ou rigides non "stérilisables", les "laveurs-désinfecteurs". 


Etablir un plan d'échantillonnage 

Faire préciser le type de rinçage (eau filtrée, eau stérile, eau 


d'adduction) et le produit désinfectant utilisé 

En cas d'utilisation d'un lave endoscope, réaliser des 

prélèvements d'eau en amont de la machine. 

La fréquence Une fois par trimestre 

Préciser la date et l'heure du prélèvement ainsi que le nom du préleveur. 


Indiquer l'identification de l'endoscope ou du fibroscope contrôlé. 

Gants stériles 

1 flacon stérile (500 ml par endoscope) 

3 flacons stériles par endoscope contenant une solution 

neutralisante pharmacopée (DNP) disponible en flacon de 

Le matériel 

90ml (exemple : AES). Cette solution permet de décoller le 

biofilm (support des micro-organismes) et d'inhiber les 

traces éventuelles de désinfectant 

Une seringue de 60 ml 

Il s'effectue dans le local de stockage. 

Réaliser un lavage simple des mains, enfiler les gants 

Stériles, et saisir l'endoscope. 

Introduire stérilement la seringue à l'extrémité du canal de 

l'endoscope et y injecter les 3 fois 90 ml de la solution 


neutralisante. Récupérer celle-ci stérilement dans le flacon 

stérile en évitant que le tuyau de l'endoscope ne touche 

l'intérieur du flacon. 

Refermer rapidement le flacon et l'adresser le plus 

rapidement possible au laboratoire (sinon, le maintenir à 

4°C°). 

12

4° Le mode opératoire 

Les germes à rechercher : ceux de l'hospitalisme et les bactéries de la cavité explorée. 

La méthodologie : 

Filtrer 200 ml sur une membrane à 0,45µm si le rinçage de l'endoscope a été réalisé en 

eau filtrée ou stérile. 

Filtrer 10 ml si le rinçage de l'endoscope a été réalisé en eau d'adduction. 

Rincer la membrane avec 3X50 ml d'eau stérile et la déposer sur PCA. Incuber 

à 37°C pendant 48 heures. 

Observer les boîtes ayant cultivé et effectuer une première lecture à 24 heures. 

Réaliser la lecture définitive à 48 heures. 



Celle ci se fera en UFC pour 200 ml ou 10 ml selon la quantité filtrée. 

5.2 L'interprétation des critères microbiologiques de l'eau de rinçage 

Type d'eau de rinçage Les critères microbiologiques 

Rinçage en eau filtrée ou 

en eau stérile 


Germes < 20UFC/200 ml 

Absence de bactéries du tube digestif ou des bactéries 

de la cavité explorée 

Absence de germes de l'hospitalisme 

Rinçage en eau d'adduction Germes < 100UFC/10 ml 

Absence de bactéries du tube digestif ou des bactéries 

de la cavité explorée 

Absence de germes de l'hospitalisme 

Bibliographie 

[1] Circulaire DGS/BH n°236 du 02 avril 1996 relative aux modalités de désinfection des endoscopes dans les lieux 

de soins. 

[2] DRASS Rhône-Alpes. COTEREHOS. L'eau dans les établissements de santé. 1995 

[3] CTIN. Désinfection des dispositifs médicaux. Guide des bonnes pratiques. 1998 

[4] Groupe eau-santé. Eau à usage médical. Qualité de l'eau et endoscopie. Mai 1999 

13

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L'EAU 

DES PISCINES DE REEDUCATION 


Version : 1 



Quantifier voire qualifier l'existence de germes dans l'eau des bassins de rééducation. 


Tous les bassins utilisés pour la rééducation ou la balnéothérapie. 



La fréquence Au moins une fois par mois. 

Préciser la date et l'heure du prélèvement ainsi que le nom du 


préleveur. 

Un flacon de 500 ml stérile contenant du thiosulfate de sodium ( 50 

Le matériel 

à 60 mg/500ml ). 

Prélèvement des eaux de bassin dans les flacons stériles à 10 cm 

sous l'eau de surface. 

Le mode de prélèvement Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le 


cas, le délai d'acheminement doit être le plus court possible. 

14

4°Lemode opératoire 

Recherche à effectuer 

Méthode d'ensemencement 

Incubation 

Lecture 



Germes viables à 37°C et à température ambiante 

Coliformes totaux et thermotolérants 

Staphylococcus aureus 

Pseudomonas aeruginosa 

Legionella (si nécessaire) 

Pour la recherche des germes totaux : 

filtrer 1 ml sur membrane à 0,45µm avec 50 ml d'eau stérile puis 

rincer la membrane avec 50 ml d'eau stérile. Sinon, utiliser la 

méthode par inclusion avec 1 ml d'eau sur PCA. 

Pour les autres germes : 

Filtrer 100 ml d'eau sur membrane à 0,45µm . 

Germes totaux : 

Incubation à 37°C pendant 48 heures et incubation à 

température ambiante 

pendant 72 heures sur PCA. 

Coliformes totaux : 

Incubation à 37°C pendant 24 heures puis 48 heures sur 

milieu TTC et TERGITOL 7. 

Coliformes thermotolérants : 

Incubation à 44°C pendant 24 heures puis 48 heures 

sur milieu TTC et TERGITOL 7. 

Staphylococcus aureus : 


milieu CHAPMAN. 

Pseudomonas aeruginosa : 


gélose cetrimide. 

Legionella : 

Voir fiche Legionella. 

Germes viables : 

dénombrement au bout de 24 heures à 37°C et à 72 

heures à température ambiante. 

Autres germes : dénombrement à 48 heures. 


Celle ci se fera en UFC /ml pour les germes totaux et pour 100 ml pour tous les autres (coliformes 

totaux, coliformes thermotolérants..) 

5.2 Les critères microbiologiques 

Bibliographie 

Germes Critères retenus 

Germes totaux < 100/ml 

Coliformes totaux < 10 dans 100 ml 

Coliformes thermotolérants < 1 dans 100 ml 

Staphylococcus aureus < 1 dans 100 ml 

Pseudomonas aeroginosa < 1 dans 100 ml 

Legionella < 10 3 dans 1 litre 

[1] décret 1981 modifié en 1989 et 1991 : règlement des piscines publiques. 

[2] normes NFT 90 401 - 402, 90 414, 90 416,90 420 , 90 421 

[3] norme NF en ISO 6622 

15


RECHERCHE DE LEGIONELLA DANS UNE EAU 

SELON LA NORME NFT 90 431 


Version : 1 



1° Objet : 

Quantifier voire qualifier l'existence de legionelles dans l'eau du réseau de l'établissement. 

2° Champ d'application 

Méthode applicable à tous les types d'eau 

3° Les prélèvements : 

Points critiques à définir avec l'équipe technique. 

Prélèvement effectué dans tous les réservoirs, ballons d'eau 

chaude et installations à risques. 


Au niveau de deux points d'usage par tranche de 100 lits (et 

au minimum 10 points d'usage pour les établissements de 

moins de 500 lits). 

La fréquence Au moins une fois par an. 

Préciser la date, l'heure, et le site du prélèvement ainsi que le nom du 


préleveur. 

2 flacons de 500 ml contenant du thiosulfate de sodium (environ 10 à 

Le matériel 

50mg/500 ml). 

Après décontamination du robinet( flamber l'embouchure du robinet 

ou désinfecter l'extrémité du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel 

ou à l'aide d'un détergent-désinfectant) , laisser couler l'eau chaude 

Le mode de prélèvement pendant une minute au minimum. Prélever alors un litre d'eau. 

Si l'analyse est différée, il est impératif de garder le prélèvement à 

basse température (2 à 8°C). Dans tous les cas, le délai d'acheminement 

doit être le plus court possible 


4.1 La méthode 

Ensemencer par étalement 0,2 ml et 0,2 ml d'une dilution à 1/10 dans du tampon phosphate PBS de 

l'eau à analyser. Filtrer un litre d'eau (le reste) sur membrane de polycarbonate. Mettre la membrane 

dans 5 ml d'eau stérile, et la placer dans une cuve à ultrasons pendant 2 minutes. 

Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB + L.cysteine (GVPC). 

Traitement acide Traitement thermique 

Prélever 2 ml du mélange 

Centrifuger 10 minutes à 60 000 g 

Enlever 1 ml du surnageant 

Agiter puis ajouter 1 ml de tampon PH 2.2* (vérifier le PH 

du tampon tous les 15 jours). 

Agiter doucement 

Laisser en contact 5 minutes 

Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB L.cysteine (GVPC). 

Il est possible de ne pas centrifuger . Dans ce cas , ajouter à 

2 ml d’échantillon , 2 ml de tampon acide. Après un temps de 

contact de 5 min ± 0,5 min , ensemencer immédiatement 0,2 ml 

sur une boite de milieu sélectif ou ensemencer 2 boites avec 

0,1 ml par boite de milieu sélectif . 

Prélever 2 ml du mélange 

Chauffer à 50°C pendant 30 minutes 

Etaler 0,1 ml sur gélose BcyE + ATB + 

L.cysteine (GVPC). 

*Composition du tampon PH 2,2 : HCL 0,2 mol/litre …3,9 ml , KCL 0,2 mol/litre…25 . Ajuster à PH 2,2 avec KOH 1 mol/l 

16

4.2 L'incubation 

Incuber les 5 boîtes à 37°C jusqu'à 10 jours en atmosphère humide (sachet + papier type absorbant 

humidifié). Surveiller après 3 jours d'incubation. 

4.3 La lecture 

Dénombrement de Legionella 

Dénombrement de Legionella 

pneumophila 


5.1 La restitution des résultats des résultats 

Eau non concentrée 


Dénombrer les colonies ayant apparu. 

Repiquer en quartier sur une boîte de milieu BcyE + L.cysteine, 

BcyE et gélose au sang. 

Si 1 < N < 5 : repiquer toutes les colonies 

Si 5 < N < 50 : repiquer 5 à 7 colonies 

Rechercher en fluorescence (cf. annexe 1). 

Les colonies ayant cultivé en milieu selectif BcyE + L.cysteine 

sont mises en contact avec un sérum fluorescent polyvalent 

anti-Legionella pneumophila.. La réaction d’immuno-fluorescence 

est validée par un témoin positif qui est une souche de 

Legionnella pneumophila de sérogroupe 1 et un témoin négatif 

qui est une souche de Pseudomonas fluorescens. 

Déterminer la proportion de Legionella et de Legionella pneumophila. 

Eau non concentrée diluée 

au 1/10 

Eau concentrée 

Nombre de Legionella 

UFC / litre 

N* > 4 N x 10.3/0.2 = Nx5x10.3 

N* > 4 4 < N1 < 100 N +N1/0.22x10.3 

N* non exploitable N non exploitable 

N*= nombre de colonies sur boîte. 

5.2 Interprétation 

N = nombre de colonies 

confirmées le plus élevé 

Absence 

confirmées 

de colonies 

Rendre le nombre de Legionella dont le nombre de Legionella pneumophila. Les recommandations OMS 

sont de moins 10 3 Legionella par litre. 

Bibliographie 

[1] circulaire DGS n° 98-771 du 31 décembre 1998 relative à la mise en œuvre des bonnes pratiques d'entretien des 

réseaux d'eau dans les établissements de santé et aux moyens de prévention du risque lié aux Legionelles dans les 

installations à risque et dans celles des bâtiments recevant du public 

[2] Norme AFNOR NFT 90431 

[3] qualité de l’eau – recherche et dénombrement des legionella – ISO. 11731 :1998 (F) 

Nx50 

< 50 

17

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES EAUX 

D'HEMODIALYSE CONVENTIONNELLE 

Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans les eaux d'hémodialyse. 



Version : 1 



Eau pour hémodialyse : appellation codifiée par une monographie de la pharmacopée Européenne dont 

l'intitulé exact est " eau pour dilution des solutions concentrées pour hémodialyse". 

Cette eau est produite à partir d'eau potable , le plus souvent par des centrales comportant plusieurs 

étapes : filtration, filtration sur charbon actif, adoucissement, osmose inverse et /ou échange d'ions, 

microfiltration et ou ultra filtration…. 

3° Prélèvement : 

Points de contrôle à discuter avec l'ingénieur technique. 

Pour l'eau osmosée, prélever en sortie d'osmoseur, au 


départ et en retour de boucle. 

Si appareil mobile autonome : prélever à la sortie du système 

avant ajout du dialysat. 

Une fois par semaine au maximum ou une fois par mois au 

minimum. 

La fréquence 

Pour l'eau d'adduction, réaliser un prélèvement une fois par 

trimestre et réaliser une analyse de type B2. 



préleveur. 

Le matériel Flacons stériles. 

Le volume minimal à prélever : 

• 500 ml (1 flacon par site de prélèvement) 

• 30 ml (1 flacon pour la recherche d'endotoxines) 

Flamber l'embouchure du robinet ou désinfecter l'extrémité 

du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel ou à l'aide d'un 


détergent-désinfectant. 

Laisser couler l'eau quelques minutes et recueillir le liquide 

dans un flacon stérile de façon aseptique et l'étiqueter en 

mentionnant le site prélevé. 

Prélèvement à conserver entre 4°C et 8°C pendant 2 à 4 

heures maximum. 

18


Rechercher et dénombrer les germes aérobies viables totaux sur milieu trypticase soja et 

rechercher les moisissures et levures sur milieu sabouraud 40g/litre de glucose. 


• Filtrer 100ml d'eau osmosée à analyser sur membrane 0,45 µm. 

• Rincer avec 100ml d'eau stérile. Déposer la membrane sur la gélose. 

• Eventuellement, ensemencer en parallèle 0,1 ml par étalement sur gélose. 

L'incubation : 

• Sabouraud à température ambiante pendant 5 jours. 

• TRYPTO-CASEINE SOJA à 30-35°C pendant 5 jours. 

La lecture : 

• Lecture chaque jour jusqu'à 5 jours. 

• Dénombrement pour 100ml d'eau. 



Dénombrement pour 100 ml d'eau. 

5.2 L'interprétation des résultats 

Les germes aérobies totaux revivifiables doivent être inférieurs à 100 UFC/ml à température 

ambiante et à 30°C. 

Pas d'identification sauf cas particulier (ex : infection ou choc chez le dialysé, intervention 

technique sur le circuit). 

Contrôler l'efficacité des milieux, l'absence d'inhibiteur dans l'eau de dialyse ainsi que la validité de 

la méthode de dénombrement des germes ( cf. annexe). 

Les endotoxines bactériennes ne doivent pas dépasser 0,25 UI/ml . 

Annexe 

Ce contrôle doit être réalisé lors de chaque manipulation. 

Préparer une suspension de germes : E.coli de préférence (souche ATCC) ou S.aureus. 

Culture de 24 heures de la souche (E. coli ou S.aureus) sur gélose TCS. 

Emulsionner la souche dans un tube d'eau distillée pour obtenir 10 

Méthodologie 

8 /ml (soit une valeur Do 

comprise entre 0,2 et 0,3 à la longueur d'onde 620 nm plus ou moins 20 nm). Diluer jusqu'à -6, 

pour obtenir 10 2 /ml. 

Filtrer 100 ml d'eau osmosée à analyser et ajouter 50 ml d'eau stérile contenant 1 ml de la 

suspension à 100 germes par ml. 

Faire un témoin positif (1 ml de suspension à 100 germes par ml + eau stérile) et filtrer sur 

membrane. 

Incubation Incuber à 30 - 35°C. 

Dénombrer en 24 - 48 heures. 

Témoin positif : environ 100 colonies. L'essai est non valable si le nombre de colonies est 

Interprétation 

 

inférieur à 20 ou 30. 

Eau osmosée à analyser : théoriquement voisin de 100 colonies. Il faut au moins 50% de colonies 

par rapport au témoin positif ; si le nombre de colonies est insuffisant, il y a présence 

d'inhibiteur dans l'eau. 

Bibliographie 

[1] pharmacopée Européenne 1997 (paragraphes 2 , 6, 12) 

[2] groupe Eau Santé - eau à usage médical définitions et interprétations pratiques Janvier 1998 


19

1° Objet : 


CONTROLE MICROBIOLOGIQUE POUR LA PRATIQUE DE 

L’HEMO(DIA) FILTRATION 


Version : 1 



Quantifier voire qualifier la flore microbienne dans les eaux destinées à la pratique de 

l’hémo(dia)filtration. 


La circulaire n°2000-311 du 7 juin 2000 définit les conditions de sécurité sanitaire de pratique de 

l’hémofiltration et hémodiafiltration en ligne. 

Dans l’hémofiltration, le transfert des solutés est convectif et la balance volémique du patient est 

maintenue en réinjectant une solution de substitution. 

Dans l’hémodiafiltration , le transfert des solutés est convectif et diffusif et nécessite un dialysat 

et une solution de substitution 

3° Prélèvement : 

Le plan d'échantillonnage Points de contrôle à discuter avec l’ingénieur technique 

La fréquence 

Eau d’alimentation des générateurs de dialyse : contrôle 

microbiologique et endotoxinique une fois par semaine au maximum et une 

fois par mois au minimum 

Dialysat : contrôle microbiologique et endotoxinique, effectué à 

l’entrée du dialyseur sur chaque générateur une fois par mois au minimum. 

Solution de substitution : contrôle microbiologique et endotoxinique 

une fois par mois au minimum et par générateur. L’échantillon est prélevé en 

dehors d’une séance d’hémo(dia) filtration. 



préleveur. 

Le matériel Flacons stériles. 

Le volume minimal à prélever : 

• 30 ml (1 flacon pour la recherche d'endotoxines) 

• 1 l d’eau d’alimentation des générateurs 

• 100 ml de dialysat 

• 50 ml de solution de substitution 

Flamber l'embouchure du robinet ou désinfecter l'extrémité 


du robinet à l'alcool à 95°, à l'eau de Javel ou à l'aide d'un 

détergent-désinfectant. 

Laisser couler l'eau quelques minutes et recueillir le liquide 

dans un flacon stérile de façon aseptique et l'étiqueter en 

mentionnant le site prélevé. 

Prélèvement à conserver entre 4°C et 8°C pendant 2 à 4 

heures maximum. 

20


Rechercher et dénombrer les germes aérobies viables totaux sur milieu pauvre (R2A ou 

PCA ) 


• Filtrer 1 l d'eau sur membrane 0,45 µm. 

• Rincer avec 100ml d'eau stérile. Déposer la membrane sur la gélose. 


• pendant 7 jours à température ambiante 

La lecture : 

• Lecture chaque jour jusqu'à 7 jours. 

• En cas de culture positive, l’identification des germes est indispensable 


Eau d’alimentation des générateurs : les germes aérobies totaux revivifiables doivent être 

inférieurs à 100 UFC/l .. Les endotoxines bactériennes de l’eau d’alimentation des générateurs ne 

doivent pas dépasser 0.25 UI/ml (pharmacopée européenne). 

Dialysat : mêmes normes que l’eau d’alimentation des générateurs . 

Solution de substitution : elle ne doit contenir aucune bactérie dans l’échantillon prélevé et moins de 

0,05 Ul/ml d’endotoxines. 

Bibliographie 

Circulaire DGS/DH/AFSSAPS n ° 2000-311 du 7 juin 2000 relative aux spécifications techniques et à la sécurité 

sanitaire de la pratique de l’hémofiltration et de l’hémodiafiltration en ligne dans les établissements de santé 


21

1° Objet : 


LES PRELEVEMENTS MICROBIOLOGIQUES DE L’AIR 


Version :1 



Quantifier la teneur de l'air en bactéries revivifiables, voire qualifier la flore microbienne pour un 

volume d'air prélevé dans une atmosphère maîtrisée. 


L'étude de la contamination bactérienne de l’air n'a d'intérêt que dans les zones sensibles ou 

protégées pour lesquelles la contamination doit être faible. Les prélèvements se limiteront donc aux 

blocs opératoires, aux unités "stériles" (onco-hématologie, service de transplantation, 

conditionnement et stock stériles en stérilisation…) ou tout autre secteur bénéficiant d’air 

microbiologiquement maîtrisé. 



La fréquence 


Le matériel 


Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s) près de la table 

d'opération ou de radiologie interventionnelle (conditionnement et stock 

stérile… 

une fois par trimestre, au minimum 2 fois par an 

après chaque opération nécessitant une interruption du traitement d'air ( 

alerte incendie avec mise en jeu du système de désenfumage, maintenance 

des gaines ou des filtres….) 

l'opérateur doit être en tenue de bloc (pyjama, masque, charlotte) et 

procédera à un lavage des mains avant tout prélèvement 

préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure du 

prélèvement ainsi que le nom de l'opérateur. 

Préciser l'heure du bio-nettoyage et/ou de la désinfection par rapport au 

moment du prélèvement 

Le bio-collecteur : appareil à prélèvement d'air fonctionnant par impaction 

(vitesse d'impaction inférieure à 20m/sec [5] ou à défaut à 100m /sec [2] , 

débit d'aspiration supérieur à 100l/min [5] ou à défaut 50l /min [2] 

Gélose trypto-caséïne soja 

Placer le bio-collecteur à un mètre du sol au niveau de la zone préférentielle 

à prélever, fermer les portes ou le sas. 

L'opérateur devrait quitter la salle et déclencher le bio-collecteur à l’aide 

d’une télé-commande sinon celui-ci restera immobile pendant la durée du 

prélèvement. Il est souhaitable que les prélèvements soient toujours 

effectués par la même personne. 

Se munir de géloses témoins de façon à détecter des contaminations non 

liées au(x) prélèvement(s) 

Prélever au minimum 1m 3 ( 1000 l ) par salle en deux fois ou si nécessaire en 

plusieurs fois 

Se munir de lingettes à usage unique et d'un pulvérisateur contenant un 

détergent décontaminant de façon à traiter le bio-collecteur en cas de 

prélèvements successifs. 

22


Idéalement le(s) prélèvement(s) et la phase d'analyse microbiologique devraient être 

réalisés par la même personne. 

Les géloses ensemencées lors du prélèvement seront incubées rapidement dans un 

incubateur propre et si possible en l’absence des prélèvements cliniques en particulier pour 

une recherche mycologique. En effet, la contamination est facile et peut remettre en cause 

la conformité du résultat. 


Incuber 24h à 37°C puis 48 h à température ambiante 

La lecture : 

Dès 24h, évaluer la flore totale et identifier les levures, moisissures et 

germes de l'hospitalisme. 

Evaluer la flore totale accompagnée des recherches spécifiques éventuelles 



L'étude quantitative est réalisée par numération des colonies sur la boite gélosée,et 

exprimée en PNC/m 3 ou UFC/m 3 (en connaissant le volume analysé) 

L'étude qualitative est réalisée par identification bactériologique de toute colonie 

susceptible d'être incriminée dans un processus infectieux. 


Hors présence humaine : 


haut risque* tres haut risque* 

Bactéries Moisissures Bactéries Moisissures 

Action 500 1 10 1 

Alerte 100 1 5 1 

Cible 10

1° Objet : 


RISQUE ASPERGILLAIRE : SURVEILLANCE 

DE L’ENVIRONNEMENT 


Version :1 



Surveiller et quantifier la présence éventuelle de spores d’Aspergillus dans l’environnement immédiat 

des patients considérés à haut risque d’infection aspergillaire. Les spores ou conidies, forme de 

dissémination du champignon, se retrouvent aussi bien dans l’air que sur divers supports. 

La surveillance associera : 

• Le contrôle de l’air qui appréciera la situation instantanée (qualité de l’air ambiant ou traité) 

• Le contrôle des surfaces qui est le reflet des anomalies survenues dans les jours 

précédents le prélèvement. 


La surveillance est ciblée sur les secteurs où sont hospitalisés les patients à risque d’infection 

aspergillaire (neutropénie profonde et/ou prolongée, allogreffe, corticothérapie élevée et prolongée, 

retransplantation d’organes..) 

En priorité, les secteurs bénéficiant d’un système de traitement d’air avec filtration HEPA 

(flux laminaires ou flux turbulents avec hyper pression) et accueillant des patients à haut 

risque d’aspergillose invasive 

Dans les unités sans traitement d’air ou avec qualité de filtration autre qu’HEPA, l’intérêt d’une 

surveillance mycologique systématique, qui n’a plus un objectif assurance qualité n’est pas 

démontrée. 


3.1 Le contrôle des surfaces 


La fréquence 


Le matériel 

Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s). 

Réaliser 5 à 10 prélèvements par chambre le plus près possible du patient en 

privilégiant les surfaces métalliques horizontales, les appareils électriques, les 

rampes lumineuses et les zones humides. Les bouches d’arrivée et d’extraction 

d’air 

En cas de travaux ou dans un contexte d’aspergillose invasive, élargir aux zones 

frontières entre chantiers et services d’hospitalisation , ainsi qu’aux secteurs 

contigus accueillant les patients à risque. 

Calquée sur celui de la surveillance de l’aérobiocontamination : 

Trimestrielle en routine 

A la demande en cas de travaux ou de survenue d’aspergillose invasive 

nosocomiale 

L'opérateur doit être en tenue identique au service (si nécessaire pyjama, 

masque, charlotte) et procédera à un lavage des mains avant tout prélèvement 

préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure du prélèvement 

ainsi que le nom de l'opérateur. 

Le prélèvement doit être réalisé 4 heures après le bio- nettoyage et/ou la désinfection, si 

possible avant l’entrée d’un nouveau malade 

Boîte de type contact avec milieu adapté à la croissance fongique pour les 

surfaces planes (SABOURAUD, MALT-AGAR) 

Alternative : méthodes par écouvillonnage 

24

3.2 Surveillance de la biocontamination aérienne : 

Le plan d'échantillonnage Définir la zone préférentielle du ou de(s) prélèvement(s) 

Calquée sur celui de la surveillance de l’aérobiocontamination : 

La fréquence 

 

 

Trimestrielle en routine 

A la demande en cas de travaux ou de survenue d’aspergilose invasive 

nosocomiale 


L'opérateur doit être en tenue identique au service (si nécessaire pyjama, 

masque, charlotte) et procédera à un lavage des mains avant tout 

prélèvement 

préciser le service, le local, la zone du local, la date et l'heure du 

prélèvement ainsi que le nom de l'opérateur. 

Le prélèvement doit être réalisé 4 heures après l'heure du bionettoyage 

et/ou de la désinfection 

Le bio-collecteur : appareil à prélèvement d'air fonctionnant par impaction 

(vitesse d'impaction strictement inférieure à 20m/sec et débit d'aspiration 

Le matériel 

supérieur à 100l/mn) 

La durée du prélèvement doit être brève (temps optimal 2 minutes) 

Milieu de culture : gélose Sabouraud ou malt agar 

Le volume d’air à prélever est d’au moins 1000 litres pour les unités 


équipées d’un filtre HEPA. 

Le volume d’air à prélever sera de 250 à 500 litres pour les unités non 

protégées. 


Idéalement, le(s) prélèvement(s) et la phase d'analyse microbiologique devraient être réalisés par 

la même personne. 

Les géloses ensemencées lors du prélèvement seront incubées rapidement dans un incubateur 

propre et si possible en l’absence des prélèvements cliniques en particulier pour une recherche 

mycologique. En effet, la contamination est facile et peut remettre en cause la conformité du 

résultat. 

L’incubation : 

• incuber à température ambiante (reflet de la contamination fongique globale – 

détection d’éventuelles anomalies de filtration). 

• Et/ou à 37° C pour cibler les espèces capables de se développer à température 

corporelle en particulier Aspergillus fumigatus et Aspergillus flavus. 

La lecture : 

• Réaliser une lecture précoce à 48 heures 

• Laisser incuber 5 à 7 jours 


25



L'étude quantitative est réalisée par numération des colonies de champignons 

filamenteux sur la boite gélosée, exprimée en PNC/m 3 ou UFC/m 3 (en connaissant le 

volume analysé) 

L'étude qualitative est réalisée par identification mycologique. 


5.2.1 Blocs opératoires hors présence humaine 

Le risque aspergillaire ne se justifie pas pour les blocs opératoires. 

5.2.2 Chambre d’hospitalisation en présence humaine 

Secteurs protégés HEPA Secteurs non HEPA 

Air Cible 0 UFC / m 3 

- 

Alerte > 1 UFC / m 3 pour A. fumigatus - 

Cible 0 UFC pour 6 points de prélèvement 5 UFC par chambre 

Surface Alerte 1 UFC d’A. fumigatus - 

Bibliographie 

[1] LAJONCHERE JP, FEUILHADE DE CHAUVIN M – contamination aspergillaire : évaluation des mesures de prévention 

et surveillance de l’environnement. Pathol. Biol. 1994 ;42 :718-729 

[2] Groupe CLIOH. Réflexions sur la prophylaxie de l’aspergillose en onco-hématologie. La lettre de l’infectiologue 1995 ; 

14 :553-8 

[3] guidelines for prevention of nosocomial pneumonia. Centers for diseases control and prevention . Respiratory care, 

1994, 39 :1191-1230 

[4] FRIDKIN SK, JARVIS WR- epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev, 1996 ;9 499-511 

[5] GRILLOT R., NOLARD N. – méthodes de surveillance de l’environnement : techniques d’évaluation et utilité. Prévention 

du risque aspergillaire chez les patients immunodéprimés. Conférence de consensus, institut pasteur , Paris , 

21 mars 2000 

[6] Conférence de consensus sur « prévention du risque aspergillaire chez les patients immuno-déprimés (hématologie, 

transplantation ) » - mars 2000 


26


GLOSSAIRE DES MILIEUX DE CULTURE UTILISES DANS LES MODES 

OPERATOIRES 

TCS (trypto-casèine-soja) 

Hydrolysat trypsique de caséine 

Peptone de soja 

Chlorure de sodium 

Agar 

pH = 7.3+ 0.2 

PCA (Plant Count agar-standard méthods agar) 

Hydrolisat trypsique de caséine 

Extrait de levure 

Glucose 

Agar 

pH = 7 

BCP GELOSE (gélose lactosée au bromocrésol pourpre) 

Extrait de viande de bœuf 

Peptone 

Lactose 

Agar 

Bromocrésol pourpre 

pH = 6.8 

TTC + TERGITOL (gélose de base lactosée) 

Peptone 

Extrait de viande 

Lactose 

Bleu de bromothymol 

Agar 

pH = 7.2 + 0,2 

Ajouter : 

• 5ml d’une solution de chlorure de 2-3-5 

triphenyl-tétrazolium (TTC) à 0.05% 

• 5ml d’une solution de tergitol 7 à 0.2% 

15 

5 

5 

15 en grammes par litre 

5 

2.5 

1 


3 

5 

10 


25 en milligrammes par litre 

10 

5 

20 

0.05 

12.75 en grammes par litre 

27

Gélose Cétrimide 

Peptone 

Sulfate de potassium 

Chlorure de magnésium 

Cétrimide 

Agar 

Milieu CHAPMAN 

Peptone 

Extrait de viande 

Chlorure de sodium 

Mannitol 

Rouge de phénol 

Agar 

Milieu BCYE sans L cystéine 

Charbon activé 

Extrait de levure 

Tampon ACES (acide 2 acetamido, 2 

aminoéthane sulfonique) 

Pyrophosphate ferrique 

alphacétoglutarate 

Agar 

Milieu BCYE + L cystéine 

Ajouter au milieu BCYE du chlorhydrate de L 

cystéine 

Milieu BCYE + L cystéine + antibiotiques (GVPC) 

Ajouter au milieu BCYE + L cystéine : 

Glycine 

Vancomycine 

Polymyxine 

Cycloheximide 


10 

10 

1,4 

0,3 

13,6 en grammes par litre 

10 

1 

75 

10 

0,025 


2 

10 

10 

0,250 

1 


0,40 en grammes par litre 

3 

1 

79 200 UI 

80 en milligrammes par litre 

28


Milieu SABOURAUD 

Peptone chapoteaut 

Glucose 

Agar 

pH 6 ± 0,2 

Milieu MALT AGAR 

extrait de malt 

agar 

ph =5.5 + 0,5 

Milieu Gélose R2A 

extrait de levure 

tryptone 

peptone 

glucose 

amidon 

phosphare dipotassique 

sulfate de magnésium 

pyruvate de sodium 

agar 

ph 7. 2 + 0.2 


10 

20 

15 grammes par litre 

30 

12 grammes par litre 

0.5 

0.25 

0.75 

0.5 

0.5 

0.3 

0.024 

0.3 

15.0 grammes par litre 

29


GERMES DE L’HOSPITALISME 

Annexe 1 

Version : 1 



• Staphylococcus aureus méticilline-résistant 

• Entérobactéries productrices de Bétalactamase à spectre étendu 

• Enterocoque résistant à la Vancomycine 

• D’autres germes peuvent être définis en fonction de l’écologie bactérienne et de la politique 

d’isolement des Bactéries multirésistantes aux antibiotiques au sein de chaque établissement 

(Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia…) 

30


RECHERCHE DE LEGIONELLA DANS UNE EAU 

SELON LA NORME NFT 90 431 : LE MODE OPERATOIRE 

Ensemencer 0,2 ml pur et dilution 1/10 sur GVPC 

Filtrer 1 litre d'eau sur membrane 0,45µm 

Eau concentrée 

Mettre la membrane dans 5 ml d'eau stérile 

Placer dans une cuve à ultra-sons pendant 2-10 minutes 

Annexe 2 

Version : 1 



Traitement acide Traitement thermique Pas de traitement 

Porter à pH = 2,2 50°C pendant 30 minutes 

Etaler sur milieu complet (GVPC) 

Incuber 3 - 10 jours à 37°C 

Colonies grisâtres - bacille gram négatif 

Repiquage 

Gélose au sang BCYE sans cystéine BCYE avec cystéine 

Pousse non caractéristique de Legionella 

Eau à analyser 

2 ml 0,1 ml 

2 ml 

0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 

Incuber 3 jours à 37°C 

Pousse non caractéristique de Legionella 

Recherche par immunofluorescence de 

legionella pneumophila 

31

Prélèvements d'environnement dans les établissements ... - NosoBase

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